DE102004042124B4 - Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Gegenwart eines Überschusses von kreuzreagierenden Substanzen - Google Patents

Abstract

Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, wobei die quantifzierbare Wechselwirkung zweier Komponenten eines signalbildenden Systems mit der Analyt-Menge korreliert, dadurch gekennzeichnet, dass
a) ein Analy-spezifischer, monoreaktiver Bindungspartner und ein weiterer, polyreaktiver Bindungspartner, der den Analyten und mindestens eine wertere in der Probe enthaltene Substanz bindet, verwendet werden, wobei die beiden Bindungspartner mit jeweils einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert sind,
b) die Probe in einem Volumenverhältnis von 1:1 bis 1:250 verdünnt wird,
c) der polyreaktive Bindungspartner im Verhältnis zur Gesamtmenge aller in der Probe enthaltenen Substanzen, die er binden kann, in 1,5- bis 5fach molarern Überschuss eingesetzt wird und
d) das Signal nach einer Dauer der gemeinsamen Inkubation beider Komponenten des signalbildenden Systems in dem Reaktionsansatz von weniger als 300 Sekunden gemessen wird.

Description

• Die Erfindung betrifft ein homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, in der zusätzlich ein Überschuss einer Substanz enthalten ist, die mit einem der Analyt-spezifischen Bindungspartner kreuzreagiert.
• In der medizinischen Diagnostik, aber auch in der Umweltanalytik und anderen Fachgebieten spielt die quantitative, semiquantitative oder qualitative Bestimmung von Analyten in Proben eine zentrale Rolle. Insbesondere für den Nachweis von Biomolekülen steht eine breite Palette von Bindungstesten zur Verfügung, die durch den Einsatz Analyt-spezifischer Bindungspartner eine spezifische Detektion und exakte Quantifizierung ermöglichen. Beispiele für Bindungsteste sind Immunoassays oder Verfahren, bei denen Nukleinsäuren hybridisiert werden.
• Man unterscheidet heterogene und homogene Verfahren, wobei sich die homogenen Verfahren dadurch auszeichnen, dass keine Wasch- und Separationsschritte erforderlich sind. Demzufolge sind homogene Verfahren für die Anwendung in automatischen Analysegeräten besonders bevorzugt, da sich der Ablauf eines Testes auf ein Minimum an Verfahrensschritten reduziert, wodurch sich erstens die Anzahl möglicher Fehlerquellen und zweitens die Testdauer verringert.
• Eine besondere Kategorie von Bindungstesten sind die sogenannten Sandwichassays, die dadurch gekennzeichnet sind, dass zwei Analyt-spezifische Bindungspartner mit dem Analyten einen „Bindungspartner/Analyt/Bindungspartner"-Komplex bilden. Dabei ist mindestens einer der Bindungspartner mit einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert, die die Messung eines quantifizierbaren, nachweisbaren Signals ermöglicht. Heterogene Sandwichassays sind derart konzipiert, dass vor der Induktion bzw. Messung des Signals eine Abtrennung der freien, ungebundenen Bindungspartner bzw. von ungebundenem Analyt notwendig ist, wie z. B. bei ELISA-Testen. Ausführungsformen für heterogene Verfahren zur Bestimmung eines Analyten sind z. B. in den Patentschriften EP 0 263 401 A1 und DE 195 21 388 A1 beschrieben.
• Homogene Sandwichassays hingegen enmöglichen die Bestimmung des Messsignals, welches durch den „Bindungsparner/Analyt/Bindungspartner"-Komplex zustande kommt, auch in Anwesenheit ungebundener, freier Bindungspartner- bzw. Analyt-Moleküle. Der Testansatz, welcher die Analyt-spezifischen Bindungspartner, die signalbildenden Komponenten und die Probe enthält, wird nach oder sogar während der Bindungsreaktion ohne einen weiteren Trenn- und/oder Waschschritt gemessen und das entsprechende Messsignal bestimmt.
• Beispiele für homogene Sandwichassays [z. B. Boguslaski & Li (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology 7: 401–414] sind viele turbidimetrische oder nephelometrische Methoden, wobei die zum Nachweis verwendeten Analyt-spezifischen Bindungsparner mit Latexpartikeln assoziiert sein können, wie EMIT^®-Teste; CEDIA^®-Teste.
• Eine besondere Ausführungsform eines homogenen Sandwichassays beruht auf der Verwendung eines signalbildenden Systems, bei welchem die Analyt-vermittelte Paarbildung, eine Wechselwirkung zwischen den beiden signallbildenden Komponenten ermöglicht, die dann ein messbares Signal verursacht. Beispiele für derartige Assays sind Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays oder der Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay, kurz LOCI^TM [EP-B1-0 515 194; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 5426–5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry 42: 1518–1526]. Mit Hilfe dieses Verfahrens können zahlreiche Analyten (siehe auch EP-B1-0 515 194, Seiten 7–14) bestimmt und Analytkonzentrationen in einem Bereich von 10^–4 bis 10^–16 M gemessen werden.
• Eine Voraussetzung, die zur Verwendung dieses Sandwich-Verfahrens notwendig ist, ist die Verfügbarkeit von zwei Analyt-spezifischen Bindungspartnern. Damit eine Paarbildung und somit die Signal-induzierende Wechselwirkung stattfinden kann, muss gewährleistet sein, dass beide Bindungspartner gemeinsam an ein Analyt-Molekül binden können. Im Falle von LOCI^TM-Immunoassays wird dies zum Beispiel durch die Verwendung zweier Analyt-spezifischer Antikörper bewerkstelligt, die an zwei unterschiedliche Epitope des Analyten binden. Während einer der Antikörper mit einem Photosensibilisator assoziiert ist, ist der andere Antikörper mit einer Chemilumineszenzverbindung assoziiert. Erst durch die räumliche Nähe der beiden signalgebenden Komponenten wird der Energietransfer vom Photosensibilisator auf die Chemilumineszenzverbindung ermöglicht, so dass die Menge der durch die Paarbildung hervorgerufenen Lumineszenz mit der Analytmenge korreliert.
• Es ist jedoch bekannt, dass die Bestimmung verschiedener Analyten mit Hilfe homogener Verfahren, bei welchen das Signal aufgrund einer Paarbildung zustandekommt, problematisch ist. Es handelt sich dabei um Analyten, für die nur ein Analyt-spezifischer, monoreaktiver Bindungspartner verfügbar ist, während ein zweiter zur Verfügung stehender Bindungspartner zwar Analyt-spezifisch, aber polyreaktiv ist.
• Monoreaktiv im Sinne der vorliegenden Erfindung heißt, dass der Bindungspartner gegenüber anderen Substanzen in der Probe keine oder eine zu vernachlässigende Affinität aufweist und mit hoher Spezifität an den Analyten bindet. Ein Analyt-spezifischer, polyreaktiver Bindungspartner hingegen bindet zwar den Analyten aber auch an mindestens eine weitere Substanz, die in der Probe enthalten ist.
• Die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, die wahrscheinlich den Analyten enthält und zusätzlich einen hohen Überschuss einer mit dem polyreaktiven Bindungspartner interagierenden Substanz, ist dadurch erschwert, dass die kreuzreagierende Substanz eine übermäßige bis vollständige Bindung aller polyreaktiven Bindungspartner-Moleküle bewirkt, die somit nicht mehr für die Bindung an den Analyten zur Verfügung stehen. Der Erhöhung der Menge an polyreaktivem Bindungspartner, wodurch diesem Effekt entgegengewirkt werden kann, sind Grenzen gesetzt, da sich mit dieser Maßnahme die Sensitivität des Testes signifikant verschlechtert. Die Anwesenheit von sehr hohen Konzentrationen an Photosensibilisator- bzw. Chemilumineszenzverbindung-gekoppelten Bindungspartnern ruft zunehmend unspezifische Signale hervor, wodurch eine zuverlässige Bestimmung der Analyt-Konzentration unmöglich ist.
• Ein Beispiel für das vorliegende technische Problem ist die Bestimmung der Prothrombin-Fragmente F₁₊₂ bzw. F₂, kurz F₂/F₁₊₂ in Blut- oder Plasmaproben.
• Prothrombin ist das Proenzym von Thrombin, dem zentralen Enzym der Blutgerinnungskaskade. Das Prothrombin-Protein ist modular aufgebaut und besteht aus einem N-terminalen F₁₊₂-Anteil und einem C-terminalen Thrombin-Anteil. Durch die proteolytische Aktivität des Faktors Xa wird Prothrombin gespalten, so dass je Prothrombin-Molekül (70 kD) ein Thrombin-Molekül (30 kD) unter Freisetzung eines Prothrombin-Fragmentes F₁₊₂ (35 kD) entsteht. Durch die autokatalytische Spaltung von Prothrombin durch Thrombin kann es des weiteren zur Spaltung der Fragmente F₁ und F₂ kommen. Da Thrombin in freier Form im Blut nicht vorkommt, sondern unmittelbar im Anschluss an seine Bildung an Inhibitoren und an Fibrin gebunden wird, muss das Ausmaß der Thrombinbildung indirekt erfasst werden, z. B. durch die Bestimmung der Aktivierungsmarker F₁₊₂ und/oder F₂. Eine Möglichkeit zum Nachweis oder zum Ausschluss einer gesteigerten Thrombinbildung in vivo ist demnach die Bestimmung der F₂/F₁₊₂-Konzentration im Plasma.
• Generell tritt bei F₂/F₁₊₂-Testen die Schwierigkeit auf, dass Prothrombin in Plasmaproben im Vergleich zu F₂/F₁₊₂ in großem Überschuss vorliegt. Die Prothrombin-Konzentration im Plasma gesunder Individuen variiert zwischen 1 bis 2 μmol/l, während die F₁₊₂-Konzentration in der Regel zwischen 60 und 200 pmol/l liegt und bei akuten venösen Thromboembolien Werte von bis zu 9,5 nmol/l erreichen kann. Das bedeutet, dass verglichen mit der F₁₊₂-Konzentration ein 1000 bis 10000facher molarer Überschuss an Prothrombin in Plasmaproben vorliegt.
• Der immunologische Nachweis von F₂/F₁₊₂ in Gegenwart von Prothrombin wird dadurch erschwert, dass die freigesetzten Prothrombinfragmente F₂/F₁₊₂ gegenüber intaktem, ungespaltenem Prothrombin nur über ein einziges F₂/F₁₊₂-spezifisches, antigenes Epitop verfügen und zwar den nach der Abspaltung von Thrombin entstehenden Carboxyterminus des F₂/F₁₊₂-Peptids (Neoantigen). Ausschließlich Antikörper, die gegen den carboxyterminalen Bereich des F₂/F₁₊₂-Peptids gerichtet sind, sind in der Lage spezifisch an die Prothrombinfragmente F₂/F₁₊₂ zu binden, ohne gleichzeitig eine Spezifität für intaktes Prothrombin aufzuweisen. Alle anderen Epitope des F₁₊₂-Fragmentes sind, soweit bislang bekannt, ebenso spezifisch für intaktes Prothrombin.
• Im Stand der Technik sind monoklonale wie auch polyklonale Antikörper bekannt, die gleichermaßen an F₂/F₁₊₂ und Prothrombin binden, aber auch solche die ausschließlich an F₂/F₁₊₂ binden und nicht mit Prothrombin reagieren (EP-B1-303 983, EP-B1-594 576, US 6,541,275 ). Diese Antikörper eignen sich zur Bestimmung der F₂/F₁₊₂-Konzentration in Plasmaproben in heterogenen Immunoassays, bevorzugt in Form eines Sandwich-ELISA-Verfahrens. Dazu werden die F₂/F₁₊₂-Neoantigen-spezifischen Antikörper an eine Festphase gekoppelt und mit der Probe inkubiert, so dass die F₂/F₁₊₂-Peptide an die immobilisierten Antikörper binden können. Durch einen Waschschritt werden ungebundene Proteine, insbesondere Prothrombin, entfernt, bevor durch Zugabe einer Antikörperlösung, der zweite, F₂/F₁₊₂- und Prothrombin-bindende Antikörper appliziert wird. In der Regel ist dieser Zweitantikörper mit einer signalbildenden Komponente assoziiert, die eine Quantifizierung der F₂/F₁₊₂-Konzentration erlaubt.
• Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein sensitives homogenes Verfahren bereitzustellen, das die Bestimmung von Analyten ermöglicht, für welche nur ein monoreaktiver Bindungspartner zur Verfügung steht und die in einer Probe bestimmt werden sollen, die zusätzlich einen Überschuss mindestens einer Substanz enthält, die mit einem zweiten Analyt-spezifischen, aber polyreaktiven Bindungspartner kreuzreagiert.
• Die Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung der in den Ansprüchen beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und Gegenstände.
• Insbesondere wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass einer Probe, die vermutlich den Analyten enthält, ein Analyt-spezifischer, monoreaktiver Bindungspartner und ein Analyt-spezifischer, polyreaktiver Bindungspartner zugegeben wird, wobei der polyreaktive Bindungspartner im Hinblick auf die Summe aller Substanzen, die eine Reaktion mit ihm eingehen, in 1,5 bis 5fach molarem Überschuss, bevorzugt in 2 bis 3fach molarem Überschuss, eingesetzt wird. Die Summe aller Substanzen, die eine Reaktion mit dem Analyt-spezifischen, polyreaktiven Bindungspartner eingeht, setzt sich aus der üblicherweise zu erwartenden Analyt-Menge (mol/l) und der Gesamtmenge kreuzreagierender Substanzen (mol/l), die üblicherweise in dem jeweiligen Probenmaterial enthalten sind, zusammen. Ferner sind die Analyt- spezifischen Bindungspartner mit je einer signalbildenden Komponente assoziiert, die durch die Bildung eines Bindungspartner/Analyt/Bindungspartner-Komplexes in räumliche Nähe gebracht werden und infolgedessen in eine nachweisbare, quantifizierbare Wechselwirkung treten.
• Unter einem „Bindungspartner" ist ein Mitglied eines Bindungspaares zu verstehen. Bei den Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaares handelt es sich um zwei Moleküle, die jeweils mindestens eine zu einer Struktur des anderen Moleküls komplementäre Struktur aufweisen, wobei die beiden Moleküle sich über eine Bindung der komplementären Strukturen zu binden vermögen. Der Begriff Molekül umfasst auch Molekülkomplexe wie z. B. Enzyme, die aus Apo- und Coenzym bestehen, Proteine, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, Lipoproteine bestehend aus Protein und Lipiden etc. Spezifische Bindungspartner können natürlich vorkommende aber auch z. B. mittels chemischer Synthese, mikrobiologischer Techniken und/oder gentechnologischer Verfahren hergestellte Substanzen sein, wie z. B. Antikörper, Rezeptoren, Enzyme oder Polynukleotide.
• Die Reaktion eines monoreaktiven oder polyreaktiven Bindungspartners mit dem Analyten ist eine spezifische Bindung, der z. B. eine wechselseitige Erkennung von komplementären Oberflächenstrukturen oder eine Wechselwirkung von polaren oder apolaren Gruppen zugrundeliegen kann. Beispiele für spezifische Bindungsreaktionen sind Antikörper/Antigen-, Antikörper/Hapten-, Rezeptor/Ligand-, Enzym/Substrat-, DNA/DNA-, DNA/RNA-; Operator/Repressor, Nuclease/Nukleotid, Biotin/Avidin, Lektin/Polysaccharid, Hormon/Hormonrezeptor und andere Interaktionen.
• Der polyreaktive Bindungspartner im Sinne der vorliegenden Erfindung reagiert neben dem Analyten mit mindestens einer weiteren Substanz, die in der Probe enthalten ist. Diese Reaktion kann ebenfalls auf einer spezifischen Bindung beruhen, z. B. wenn die Substanz über identische Oberflächenstrukturen verfügt wie der Analyt bzw. wenn der polyreaktive Bindungspartner den Analyten und die weitere kreuzreagierende Substanz aufgrund eines ihnen gemeinsamen Merkmals oder einer gemeinsamen Eigenschaft erkennt und bindet. Beispiele für polyreaktive Bindungspartner mit Spezifität für mehr als einen Analyten sind z. B. Antikörper, die gegen solche Epitope eines Proenzyms gerichtet sind, welche auf den proteolytischen Spaltprodukten des Vorläufermoleküls erhalten bleiben.
• Ferner ist es möglich, dass der polyreaktive Bindungspartner spezifisch an den Analyten bindet und eine unspezifische Wechselwirkung mit einer oder mehreren weiteren Substanzen eingeht. Derartige unspezifische Reaktionen sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie unabhängig von komplementären Oberflächenstrukturen auftreten können.
• In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Analyt-spezifischen Bindungspartner monoklonale oder polyklonale Antikörper.
• Unter dem Begriff „Antikörper" ist im Sinne dieser Erfindung ein Immunglobulin, z. B. ein Immunglobulin der Klasse bzw. Subklasse IgA, IgD, IgE, IgG₁, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃, IgG₄, IgM, zu verstehen. Darunter sind nicht nur komplette Antikörper zu verstehen, sondern ausdrücklich auch Antikörperfragmente, wie z. B. Fab, Fv, F(ab')₂, Fab', sofern die Bindungseigenschaften an das Antigen bzw. den Analyten erhalten sind.
• Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines Analyten beruht ferner auf der Verwendung Analyt-spezifischer Bindungspartner, die mit je einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert sind, wobei es sich wenigstens bei einer Komponente um ein nachweisbares Label handelt.
• Als Label ist jedes Molekül zu verstehen, das selbst ein Signal produziert oder die Produktion eines Signals induzieren kann, wie z. B. eine fluoreszierende Substanz, eine radioaktive Substanz, ein Enzym oder eine chemilumineszierende Substanz. Das Signal kann beispielsweise anhand der Enzymaktivität, der Lumineszenz, der Lichtabsorption, der Lichtstreuung, der ausgestrahlten elektromagnetischen oder radioaktiven Strahlung oder einer chemischen Reaktion nachgewiesen oder gemessen werden.
• Ein „signalbildendes System" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst Komponenten, die bei räumlicher Nähe miteinander in eine nachweisbare Wechselwirkung treten können, z. B. in Form von Energiespendern und Energieempfängern wie beispielsweise Photosensibilisator und chemolumineszierende Substanzen (EP-A2-0 515 194), Photosensibilisator und Fluorophore (WO 95/0687 A1) radioaktives Iod¹²⁵ und Fluorophore [Udenfriend et al_: (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672–8676], Fluorophore und Fluorophore [Mathis (1993) Clin. Chem. 39: 1953–1959] oder Fluorophore und Fluoreszenz-Quencher ( US 3,996,345 ).
• Unter. einer Wechselwirkung zwischen den Komponenten ist die direkte Übertragung von Energie zwischen den Komponenten, z. B. durch Licht- oder Elektronenstrahlung sowie über kurzlebige reaktive chemische Moleküle, miteingeschlossen. Ferner umfasst sind hiervon auch Vorgänge, bei denen die Aktivität einer Komponente durch eine oder mehrere andere inhibiert oder verstärkt wird, beispielsweise die Hemmung oder Steigerung der Enzymaktivität oder die Hemmung, Steigerung oder Veränderung (z. B. Wellenlängenverschiebung, Polarisation) des von der beeinflussten Komponente ausgesendeten elektromagnetischen Strahlung. Die Wechselwirkung zwischen den Komponenten umfasst auch Enzymkaskaden. In diesem Fall sind die Komponenten Enzyme, von denen mindestens eines das Substrat für ein anderes liefert, so dass eine maximale oder minimale Reakionsgeschwindigkeit der gekoppelten Substratumsetzung resultiert.
• Eine effektive Wechselwirkung zwischen den Komponenten findet in der Regel statt, wenn diese räumlich benachbart vorliegen, also z. B. innerhalb eines Abstandsbereiches von wenigen μm, insbesondere innerhalb eines Abstandbereiches von unter 600 nm, bevorzugt unter 400 nm, ganz besonders bevorzugt von unter 200 nm.
• In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der monoreaktive Bindungspartner mit einer Chemolumineszenzverbindung und der polyreaktive Bindungspartner mit einem Photosensibilisator assoziiert oder umgekehrt.
• Beispiele für Chemolumineszenzverbindungen und für Substanzen, die sich als Photosensibilisatoren eignen, sind in EP-B1-0 515 194 beschrieben (Chemilumineszenzverbindungen siehe Seite 22, Zeile 42 bis Seite 34, Zeile 15; Photosensibilisatoren siehe Seite 17, Zeilen 26–50).
• Der Begriff „assoziiert" ist breit zu verstehen und umfasst beispielsweise eine kovalente und eine nicht-kovalente Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung, die Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluß in eine Vertiefung oder einen Hohlraum etc. Bei einer kovalenten Bindung sind die Antikörper oder Bindungspartner über eine chemische Bindung an die Festphase oder an das Label gebunden. Beispiele für eine nicht-kovalente Bindung sind die Oberflächenadsorption, der Einschluss in Hohlräume oder die Bindung von zwei spezifischen Bindungspartnern. Neben einer direkten Bindung an die Festphase oder das Label können die Antikörper oder Bindungspartner auch indirekt über spezifische Wechselwirkung mit anderen spezifischen Bindungspartnern an die Festphase oder das Label gebunden sein (s. a. EP-A2-0 411 945). Dies soll anhand von Beispielen näher illustriert werden: Ein biotinylierter Antikörper kann über labelgebundenes Avidin an das Label gebunden werden; oder es kann ein Fluorescein-Antikörperkonjugat über festphasengebundene Anti-Fluorescein-Antikörper an die Festphase gebunden werden; oder der Antikörper kann über Immunglobulinbindende Proteine an die Festphase oder das Label gebunden werden.
• In einer weiteren besonderen Ausführungsform sind die Analyt-spezifischen Bindungspartner mit suspendierbaren Teilchen assoziiert, die mit einer Komponente eines signalbildenden Systems gekoppelt sind, bevorzugt mit einer Chemolumineszenzverbindung und einem Photosensibilisator.
• Diese suspendierbaren Teilchen umfassen Mikropartikel, bevorzugt Latexpartikel, die selbst beispielsweise mit Farbstoffen, Sensibilisatoren, fluoreszierenden Substanzen, chemilumineszierenden Substanzen, Isotopen oder anderen nachweisbaren Labeln assoziiert sein können. Unter suspendierbaren Teilchen sind im Sinne dieser Erfindung Teilchen zu verstehen, die einen ungefähren Durchmesser von wenigstens 20 nm und nicht mehr als 20 μm aufweisen, üblicherweise zwischen 40 nm und 10 μm, bevorzugt zwischen 0,1 und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 5 μm, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,15 und 2 μm. Die Mikropartikel können regelmäßig oder unregelmäßig geformt sein. Sie können Kugeln, Spheroide, Kugeln mit mehr oder weniger großen Kavitäten oder Poren darstellen. Die Mikropartikel können aus organischem, aus anorganischem Material oder aus einer Mischung oder Kombination von beiden bestehen. Sie können aus einem porösen oder nicht porösen, einem schwellfähigen oder nicht schwellfähigen Material bestehen. Prinzipiell können die Mikropartikel jegliche Dichte haben, bevorzugt sind jedoch Partikel mit einer Dichte, die der Dichte des Wassers nahe kommt wie etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml. Die bevorzugten Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbar und möglichst lange suspensionsstabil. Sie mögen durchsichtig, teilweise durchsichtig oder undurchsichtig sein. Die Mikropartikel können aus mehreren Schichten bestehen wie beispielsweise die sogenannten „core-and-shell" Partikel mit einem Kern und einer oder mehreren umhüllenden Schichten. Der Begriff Mikropartikel umfasst beispielsweise Farbstoffkristalle, Metallsole, Silica-Partikel, Glaspartikel, Magnetpartikel, Polymerteilchen, Öltropfen, Lipidpartikel, Dextran, und Proteinaggregate. Bevorzugte Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbare und aus wasserunlöslichem Polymermaterial bestehende Partikel, insbesondere aus substituierten Polyethylenen. Ganz besonders bevorzugt sind Latexpartikel z. B. aus Polystyrol, Acrylsäurepolymeren, Methacrylsäurepolymeren, Acrylnitril-Polymeren, Acrylnitril-Butadien-Styrol, Polyvinylacetat-Acrylat, Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat. Von besonderem Interesse sind Latexpartikel mit reaktiven Gruppen an ihrer Oberfläche wie beispielsweise Carboxyl-, Amino- oder Aldehydgruppen, die eine kovalente Bindung z. B. von spezifischen Bindungspartnern an die Latexpartikel erlauben. Die Herstellung von Latexpartikeln ist beispielsweise in EP-B1-0 080 614, EP-B1-0 227 054 und EP-B1-0 246 446 beschrieben.
• Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in einem Volumenverhältnis von 1:1 bis 1:250 verdünnt wird und der Analyt-spezifische, polyreaktive Bindungspartner im Verhältnis zur Summe aller Substanzen, an die er binden kann, in 1,5 bis 5fach molarem Überschuss eingesetzt. wird.
• So kann z. B. mit Hilfe eines Vorversuchs die maximale Konzentration des polyreaktiven Bindungspartners ermittelt werden, die eingesetzt werden kann, ohne dass ein Analyt-unabhängiges, unspezifisches Hintergrundsignal erzeugt wird. Anschließend wird die Probe verdünnt, um die Konzentration der kreuzreagierenden Substanz zu reduzieren bis die Verdünnung proportional zum entstehenden Messsignal ist. Auf diese Weise wird die optimale Kombination von polyreaktivem Bindungspartner und Probenverdünnung ermittelt (siehe Beispiele 5 und 6).
• In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Proben, wie z. B. Blut- oder Plasmaproben, in einem Volumenverhältnis von 1:2 bis 1:100, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 1:4 bis 1:32 verdünnt.
• Unter einer „Probe" ist im Sinne der Erfindung das Material zu verstehen, das den nachzuweisenden Analyten vermutlich enthält. Der Begriff Probe umfasst beispielsweise biologische Flüssigkeiten oder Gewebe insbesondere von Menschen und Tieren wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Exudat, bronchoalveoläre Lavage, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Feces, Urin, Liquor, Haare, Haut, Gewebeproben oder -schnitte. Ferner werden umfasst Zellkulturproben, pflanzliche Flüssigkeiten oder Gewebe, forensische Proben, Wasser- und Abwasserproben, Nahrungsmittel, Arzneimittel. Gegebenenfalls müssen die Proben vorbehandelt werden, um den Analyten für das Nachweisverfahren zugänglich zu machen oder um störende Probenbestandteile zu entfernen. Solche Vorbehandlung von Proben mag die Abtrennung und/oder Lyse von Zellen beinhalten, das Präzipitieren, die Hydrolyse oder die Denaturierung von Probenbestandteilen wie z. B. Proteinen, die Zentrifugation von Proben, das Behandeln der Probe mit organischen Lösungsmitteln wie z. B. Alkohole, insbesondere Methanol, das Behandeln der Probe mit Detergenzien.
• Des weiteren ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Signal nach einer Dauer der gemeinsamen Inkubation beider Komponenten des signalbildenden Systems in dem Reaktionsansatz von weniger als 300 Sekunden, bevorzugt weniger als 200 Sekunden und besonders bevorzugt weniger als 160 Sekunden gemessen wird.
• Überraschenderweise ermöglicht die Beschränkung der Inkubationszeit auf weniger als 300 Sekunden die Messung eines Signals hoher Spezifität und ausreichender Stärke, wodurch eine präzise Quantifizierung des Analyten möglich ist. Durch diese Maßnahme wird das Dilemma zweier gegenläufiger Effekte gelöst. Einerseits geht mit einer Verlängerung der Inkubationszeit eine Erhöhung des spezifischen Signals einher, wodurch eine zuverlässige Messung des Signals ermöglicht wird. Andererseits setzt mit der fortgesetzten Inkubation auch eine Verminderung der Signalstärke ein, so dass die Summe an gemessenem Signal nicht mehr mit der Analyt-Menge korreliert. Der Signal-erniedrigende Effekt ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die im Überschuss vorliegende Substanz durch übermäßige Bindung an den polyreaktiven Bindungspartner, die mit dem polyreaktiven Bindungspartner assoziierte Komponente des signalbildenden Systems abschirmt und so die für die Bildung des Signals erforderliche Wechselwirkung mit der zweiten Komponente des Systems behindert.
• Mit Hilfe des vorliegenden homogenen Verfahrens können verschiedenste Analyten bestimmt werden, wie z. B. Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Steroide und andere. Bevorzugt sind Bestandteile des Gerinnungs- oder Fibrinolysesystems. Besonders bevorzugt sind alle Aktivierungsmarker der Gerinnung, die durch proteolytische Spaltung aktiviert werden, wie z. B. proteolytische Spaltprodukte der Gerinnungsfaktoren Faktor IX, Faktor X und Faktor XI, bevorzugt die Spaltprodukte von Faktor II (= Prothrombin) F₂ bzw. F₁₊₂. proteolytische Spaltprodukte des Fibrinogens, wie z. B. Fibrinopeptid A oder B, oder Fibrinogendegradationsprodukte, wie z. B. Fragment X, Fragment Y, Fragment D, Fragment E, die eine Beurteilung des Gerinnungsstatus erlauben.
• Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht die Bestimmung von Analytkonzentrationen bis zu etwa 10^–12 mol/l in Anwesenheit von einem beispielsweise 10000fach molaren Überschuss einer mit dem polyreaktiven Bindungspartner kreuzreagierenden Substanz.
• Die im folgenden beschriebenen Beispiele dienen der Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens und sind nicht als Einschränkung zu verstehen.
• Die folgenden Beispiele betreffen die erfindungsgemäße Bestimmung des Prothrombin-Fragmentes F₁₊₂ in Humanplasmaproben, wobei die F₁₊₂-spezifischen Bindungspartner mit suspendierbaren Polystyrolpartikeln (Beads) assoziiert sind, an welche wiederum ein anregbarer Photosensibilisator bzw. eine Chemolumineszenzverbindung gekoppelt ist. Die mit einem Photosensibilisator-gekoppelten Polystyrolpartikel werden auch als Sensibeads, die mit einer Chemolumineszenzverbindung-gekoppelten Polystyrolpartikel als Chemibeads bezeichnet. Bei den Beads handelt es sich um Dextran-beschichtete Polystyrolpartikel, wobei die Sensibeads mit Phtalocyanin und die Chemibeads mit Europiumchelat gelabelt sind. Die Herstellung der Beads wurde gemäß Ullman et al. (1996) Clin. Chem: 42(9): 1518–1526 und den darin zitierten Referenzen bzw. gemäß WO 01/67105 A1 durchgeführt.
• In diesem besonderen Beispiel wurden Streptavidin-beschichtete Sensibeads verwendet, die über eine Streptavidin/Biotin-Bindung die Assoziation des biotinylierten Bindungspartners an die Sensibeads ermöglichen. Der Photosensibilisator ist durch Licht einer Wellenlänge von 680 nm anregbar und produziert dann Singulett-Sauerstoff, der wiederum die Chemolumineszenzverbindung anzuregen vermag, wodurch ein Chemolumineszenzsignal entsteht, welches gemessen werden kann und mit der Menge von F₁₊₂ in der Probe korreliert.
• Als polyreaktiver Bindungspartner, der sowohl F₁₊₂ wie auch intaktes Prothrombin bindet, wurde ein monoklonaler Antikörper verwendet (anti-Prothrombin-MAK), der von der Hybridomzelllinie 92-195/097 produziert wird, die bei der DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, unter der Eingangsnummer DSM ACC2607 hinterlegt ist.
• Als monoreaktiver Bindungspartner mit Spezifität für das carboxyterminale Neoantigen von F₁₊₂ wurde ebenfalls ein monoklonaler Antikörper verwendet (anti-F₁₊₂-MAK). Die Herstellung eines solchen Antikörpers ist aus dem Stand der Technik bekannt.
• Beispiel 1: Herstellung der für den homogenen Assay notwendigen Reagenzien
• a) Biotinylierung des polyreaktiven anti-Prothrombin-MAK
• Der anti-Prothrombin-Antikörper wurde für die Biotinylierung zunächst in eine 100 mM NaHCO₃-Lösung umgepuffert und der IgG-Gehalt der Lösung wurde photometrisch bestimmt. In DMSO gelöstes Biotin-PEO₄-NNS (EZ-Link^TMNHS-PEO₄-Biotin, Pierce, IL, USA) wurde mit der Antikörperlösung gemischt, so dass ein mehrfacher molarer Überschuss des Biotins gegenüber IgG im Reaktionsansatz entstand. Nach Inkubation des Reaktionsansatzes bei Raumtemperatur wurde der biotinylierte anti-Prothrombin-Antikörper über Sephadex^® G25 (Amersham Biosciences Europe GmbH, Deutschland) aufgereinigt und in einem geeigneten Puffer auf eine Konzentration von 2 mg/ml eingestellt.
• b) Kopplunp des monoreaktiven anti-F₁₊₂-Antikörpers an Chemibeads
• Eine anti-F₁₊₂-Antikörper-Lösung wurde über Sephadex^® G25 aufgereinigt, in 50 mM MES-Puffer (pH 6,0) aufgenommen, photometrisch quantifiziert und auf eine IgG-Konzentration von 20 mg/ml eingestellt. 50 mg der Europiumchelat-gekoppelten Chemibeads wurden durch mehrfache Sedimentation und Resuspension in MES-Puffer (pH 6,0) gewaschen und schließlich auf eine Chemibead-Konzentration von 100 mg/ml eingestellt.
• 500 μl der anti-F₁₊₂-Antikörper-Lösung wurden mit 500 μl Chemibead-Lösung, 2 μl 4 %iger Tween^® 20-Lösung sowie 24 μl NaBH₃CN-Lösung (25 mg NaBH₃CN/ml) gemischt und 60 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 50 μl 0,5 M CMO-Lösung zugegeben und weitere 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Abschließend wurde der Reaktionsansatz zur Abtrennung ungebundenener Reaktionspartner sowie zur Homogenisierung der Partikel mit Ultraschall behandelt.
• Die Chemibeads wurden durch Zentrifugation sedimentiert, in MES-Puffer (pH 6,0) resuspendiert und mit Ultraschall behandelt. Dieser Waschschritt und die anschließende Beschallung wurden mit MES-Puffer und zweimal mit CB-Puffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Dextran T-500, 12,5 μg/ml Dextran Sulfat, 16 mg/ml BSA, 2 mg/ml bovines γ-Globulin, 0,1 % [w/v] Triton X 405, 0,15 [v/v] Proclin 300, 0,1 mg/ml Neomycin Sulfat, pH 7,2) wiederholt.
• Nach dem letzten Waschschritt wurden die anti-F₁₊₂-Antikörper-beschichteten Chemibeads mit CB-Puffer auf eine Konzentration von 50 mg/ml eingestellt und einer letzten Ultraschallbehandlung unterworfen.
• Beispiel 2: LOCI^TM zur Quantifizierung des F₁₊₂-Gehaltes von Humanplasmaproben
• Soweit nicht anders angegeben wurden die Reagenzien in folgenden Konzentrationen verwendet: 75 μg/ml anti-F₁₊₂-Chemibeads in CB-Puffer (pH 7,2), gemäß Beispiel 1a) hergestellter biotinylierter anti-Prothrombin-Antikörper in BA-Puffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA;, 1 mg/ml Dextran T-500, 0,1 % [w/v] Triton X 405, 0,15 % [v/v] Proclin 300, 0,1 mg/ml Neomycin Sulfat, pH 7,2) 1:66 verdünnt, 1 mg/ml Streptavidin-beschichtete Sensibeads in SB-Puffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Dextran T-500, 16 mg/ml BSA, 2 mg/ml bovines γ-Globulin, 0,1 % [w/v] Triton X 405, 0,15 % [v/v] Proclin 300, 0,1 mg/ml Neomycin Sulfat, pH 7,2).
• Testablauf
• 10 μl einer mit Ag-Puffer (1,2 g Tris, 3,73 g Titriplex III, 2,93 g NaCl, 3,45 ml Mergal K9N, 100 000 KIU Trasylol, 10 % [v/v] Polygelin pro Liter, pH 7,25) verdünnten Plasmaprobe (1:20) wurden mit 15 μl anti-F₁₊₂-Chemibead-Lösung gemischt und 417 Sekunden bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss wurden 15 μl einer Lösung, welche biotinylierten anti-Prothrombin-Antikörper enthielt, zum Reaktionsansatz gegeben und erneut inkubiert (414 Sekunden, 37 °C). Danach wurden dem Ansatz 25 μl der Sensibead-Lösung zugegeben und 154 Sekunden bei 37 °C inkubiert. Nach Auffüllen des Reaktionsansatzes mit Assay-Puffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Dextran T-500, 16 mg/ml BSA, 0,5 % [w/v] Zwittergent 3–14, 0,15 % [v/v] Proclin 300, 0,1 mg/ml Neomycin Sulfat, pH 7,2) auf ein Gesamtvolumen von 250 μl erfolgte die Messung. Dazu wurde der Ansatz mit Licht einer Wellenlänge von 680 nm angeregt und das entstehende Chemilumineszenzsignal wurde gemessen.
• Beispiel 3: Erstellung einer Kalibrationskurve zur Bestimmung des F₁₊₂-Gehalts von Plasmaproben
• Zur Quantifizierung der F₁₊₂-Konzentration in Humanplasmaproben wurde eine Standardkurve erstellt, indem gereinigtes F₁₊₂-Antigen mit Ag-Puffer auf eine Konzentration von 1000 pmol/l eingestellt wurde. Von dieser Stammlösung wurde eine geometrische Verdünnungsreihe (Faktor 2) hergestellt. Die Standardproben wurden wie in Beispiel 2 beschrieben getestet, d. h. sie wurden wie auch die Plasmaproben vor Durchführung des Testes in einem Verhältnis von 1:20 vorverdünnt. Die Auftragung des Logarithmus der erreichten Signalhöhe der einzelnen Standards gegen den Logarithmus der in den Standards enthaltenen F₁₊₂-Konzentrationen ergibt die in 1 dargestellte Kalibrationskurve.
• Beispiel 4: Erhöhung der Assay-Sensivität durch Verkürzung der Inkubationsdauer
• Standard Human Plasma (SHP; Dade Behring Marburg GmbH, Deutschland) wurde durch Zugabe von gereinigtem F₁₊₂-Antigen auf eine niedrige (169 pmol/l) bzw. eine hohe (3204 pmol/l) F₁₊₂-Konzentration eingestellt. Die Proben und eine Assay-Puffer-Kontrolle ohne F₁₊₂-Antigen wurden gemäß Beispiel 2 getestet, wobei die Inkubationszeit nach Zugabe der Sensibeads in einem Bereich von etwa 20 bis 450 Sekunden variiert wurde. Die gemessenen Signalhöhen nach unterschiedlichen Inkubationszeiten sind in 2 logarithmisch zusammengestellt.
• Die Signalentwicklung bei der Probe mit hoher F₁₊₂-Konzentration zeigt das zu erwartende Verhalten. Je länger die Inkubationszeit, desto höher die erreichten Signale. Bei der Probe mit niedriger F₁₊₂-Konzentration zeigt sich ein gegenläufiger Effekt. Je länger die Inkubationszeit, desto niedriger die erreichten Signale. Kürzere Inkubationszeiten ermöglichen die Messung maximaler Signalhöhen.
• Für die Inkubationsdauer kann ein Optimum gewählt werden, das weniger als 300 Sekunden beträgt, wodurch zum einen eine quantifizierbare Signalhöhe im Bereich hoher Analyt-Konzentrationen und zum anderen eine große Sensitivität im Bereich niedriger Analyt-Konzentrationen gewährleistet ist.
• Beispiel 5: Erhöhung der Assay-Sensivität durch Erhöhung der Menge an biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörper im Reaktionsansatz
• Standard Human Plasma wurde durch Zugabe von gereinigtem F₁₊₂-Antigen auf definierte Konzentrationen eingestellt und mit drei verschiedenen Verdünnungsstufen des gemäß Beispiel 1 hergestellten biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörpers getestet (siehe Beispiel 2). Die Messreihe mit der höchsten anti-Prothrombin-Antikörper-Konzentration (MAK 1:10) zeigt verglichen mit der mittleren MAK-Konzentration (MAK 1:100) niedrigere Signale im Bereich hoher Analyt-Konzentrationen. Dieser Effekt ist durch die Blockade der Sensibeads durch den biotinylierten anti-Prothrombin-MAK zu erklären. Bei der geringsten MAK-Konzentration (MAK 1:1000) wurden die niedrigsten Signalhöhen erreicht. Die ermittelten Daten sind in 3 zusammengefasst.
• Aufgrund der hohen Prothrombinkonzentration in den Plasmaproben wird ein Großteil des biotinylierten anti-Prothrombin-Antikörpers blockiert und steht dadurch für die Bildung eines „Bindungspartner/Analyt/Bindungspartner"-Komplexes nicht mehr zur Verfügung. Aus diesem Grund ist die Konzentration dieses Bindungspartners möglichst hoch zu wählen. Eine zu hohe Konzentration des anti-Prothrombin-Antikörpers führt jedoch zu einer Minimierung der Signalhöhen im Bereich hoher Analyt-Konzentrationen.
• Beispiel 6: Erhöhung der Assay-Sensivität durch Verdünnung der Plasmaproben
• Humanplasmaproben verschiedener F₁₊₂-Konzentration (< 30 pmol/l, 109 pmol/l bzw. 169 pmol/l) wurden mit Assay-Puffer in Verhältnissen von 1:1 bis 1:1024 verdünnt und gemäß Beispiel 2 getestet. Die Messergebnisse sind in 4 dargestellt.
• Die Verdünnung der Plasmaproben vermindert den Einfluss von Prothrombin auf den Assay. Durch einen ca. 10000fachen molaren Überschuss von Prothrombin gegenüber F₁₊₂ wird der Großteil des biotinylierten anti-Prothrombin-Antikörpers durch Prothrombinmoleküle blockiert. Betrachtet man das molare Verhältnis zwischen biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörper und Prothrombin im Reaktionsansatz bei Messung einer unverdünnten Plasmaprobe, so liegt das Prothrombin bei einer Normalkonzentration von 100 mg/ml in einem ca. 6fach molaren Überschuss zum Antikörper vor. Durch eine Verdünnung der Plasmaproben verschiebt sich das molare Verhältnis von biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörper zu Prothrombin zugunsten des Antikörpers.
• Bei einer 1:1 O Verdünnung der Plasmaprobe liegt das Verhältnis von Prothrombin zu Antikörper im Reaktionsansatz bei 2:3. Der Antikörper liegt somit im Überschuss zum Prothrombin vor.
• Die ermittelten Kurvenverläufe spiegeln den oben beschriebenen Einfluss des Prothrombins auf den Assay wider. Im Bereich der niedrigen Verdünnungsstufen steigen die Signale zunächst an, da der anti-Prothrombin-MAK nicht mehr in dem Maße wie bei unverdünnten Proben von Prothrombinmolekülen blockiert wird. Erst bei höheren Verdünnungen beginnen die Signalhöhen aufgrund der abnehmenden F₁₊₂-Konzentrationen abzufallen. Im Bereich niedriger Verdünnungen wird der Assay also durch das im Überschuss enthaltene Prothrombin dominiert. Mit zunehmender Verdünnung gelangt man in einen Bereich der Verdünnungsechtheit, in welchem die Signalstärke mit der F₁₊₂-Konzentration korreliert.
• Figuren
• 1 Kalibrationskurve zur Quantifizierung des F₁₊₂-Gehaltes in Plasmaproben. Die gemessenen Signalhöhen (Messeinheit: counts) der einzelnen Standards wurden logarithmisch gegen den Logarithmus der in den Standards enthaltenen F₁₊₂-Antigen-Konzentrationen [pmol/l] aufgetragen. Die 1:20 Vorverdünnung, in denen die Plasmaproben im Assay eingesetzt werden, wurde bei den F₁₊₂-Standardproben ebenfalls durchgeführt. Die hier angegebenen Konzentrationen entsprechen somit nicht dem wirklichen F₁₊₂-Gehalt, sondern sind zusätzlich durch den Vorverdünnungsfaktor 20 zu dividieren.
• 2 Signalentwicklung bei Variation der Inkubationszeit nach Zugabe der Sensibeads zum Reaktionsansatz. Auf der X-Achse sind die Inkubationszeiten (Sekunden) und auf der Y-Achse der Logarithmus der Signalhöhen [counts] aufgetragen. Die Legende gibt die F₁₊₂-Konzentrationen an. Die Negativkontrolle ohne F₁₊₂ diente der Messung des Hintergrundsignales.
• 3 Signalentwicklung in Abhängigkeit von der Menge an biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörper. Logarithmische Auftragung der gemessen Signale [counts] gegen den Logarithmus der F₁₊₂-Konzentration der Plasmaproben [pmol/l]. Die Legende gibt die verwendeten Verdünnungsstufen der Stammlösung an biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörper (MAK) an.
• 4 Signalentwicklung bei Verdünnung von Plasmaproben unterschiedlicher F₁₊₂-Konzentrationen in Assay-Puffer. Auf der X-Achse ist die Verdünnungsstufe der Plasmaproben aufgetragen, auf der Y-Achse der Logarithmus der Signale [counts]. Die Legende gibt die F₁₊₂-Konzentrationen der Proben an.

Claims (8)

1. Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, wobei die quantifzierbare Wechselwirkung zweier Komponenten eines signalbildenden Systems mit der Analyt-Menge korreliert, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein Analy-spezifischer, monoreaktiver Bindungspartner und ein weiterer, polyreaktiver Bindungspartner, der den Analyten und mindestens eine wertere in der Probe enthaltene Substanz bindet, verwendet werden, wobei die beiden Bindungspartner mit jeweils einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert sind, b) die Probe in einem Volumenverhältnis von 1:1 bis 1:250 verdünnt wird, c) der polyreaktive Bindungspartner im Verhältnis zur Gesamtmenge aller in der Probe enthaltenen Substanzen, die er binden kann, in 1,5- bis 5fach molarern Überschuss eingesetzt wird und d) das Signal nach einer Dauer der gemeinsamen Inkubation beider Komponenten des signalbildenden Systems in dem Reaktionsansatz von weniger als 300 Sekunden gemessen wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in einem Volumenverhältnis von 1:2 bis 1:100, bevorzugterweise in einem Verhältnis von 1:4 bis 1:32 verdünnt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal nach einer Dauer der Inkubation beider Komponenten des signalbildenden Systems in dem Reaktionsansatz von weniger als 200 Sekunden, besonders bevorzugt von weniger als 160 Sekunden gemessen wird.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass einer der Bindungspartner mit einer Chemolumineszenzverbindung und der zweite mit einem Photosensibilisator assoziiert ist.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyt-spezifischen Bindungspartner mit suspendierbaren Teilchen, bevorzugt Latexpartikeln, assoziiert sind, die mit Komponenten eines signalbildenden Systems gekoppelt sind.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Analyt-spezifischen Bindungspartnern um monoklonale oder polyklonale Antikörper handelt.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Bestimmung eines Bestandteils des Gerinnungssystems oder des Fibrinolysesystems, bevorzugt zur Bestimmung von Aktivierungsmarkern der Gerinnung, verwendet wird.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Bestimmung des Prothrombin-Fragments F₂ oder F₁₊₂verwendet wird.