JPH06505496A

JPH06505496A - 活性因子ｘ１１１の活性化を阻害するための組成物と方法

Info

Publication number: JPH06505496A
Application number: JP4508318A
Authority: JP
Inventors: リード，ガイ・エル; マツエダ，ガリー・アール; ハーバー，エドガー
Original assignee: ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション; ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニー
Priority date: 1991-03-11
Filing date: 1992-03-11
Publication date: 1994-06-23
Also published as: CA2105863A1; WO1992015609A1; EP0577699A4; EP0577699A1; US5620688A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】活性因子ＸＩＩＩの活性化を阻害するための組成物と方法本願は、１９９１年３月１１日に出願された米国特許出願第０７／６６７２９６号の一部継続出願であり、該米国特許出願の開示はすべて本明細書の一部を模本発明は心筋梗塞、深静脈血栓症、肺塞栓、大脳血管血栓症または患者内の何らかの血栓過程の治療に関する。また、より一般的には、本発明はタン１＜り質加水分解的切断によって活性化されなければならない前駆体型で存在する何ら力１のタンパク質（例えばチモーゲン）の阻害に関する。さらに、本発明は活性型の因子ＸＩＩＩを検出する方法に関する。

発明の背景多くの心筋梗塞（心臓発作）の最初の事象はアテローム性動脈硬化斑への出血である。このような出血はしばしば冠状動脈内での血栓（または血塊）の形成をもたらし、これが梗塞域（即ち、血流の妨害がもたらす凝固壊死の領域）を供給する。

この血栓はフィブリンと血小板の組み合わせからなる。フィブリン−血小板塊の形成は重大な臨床的派生効果を有する。ライブ１血小板塊板塊がもたらす閉塞の程度と持続時間は梗塞域の量と損傷の程度を決定する。

心筋梗塞に関する現在の治療の主な目標には閉塞している血栓の迅速な溶解と血流の回復（「再潅流」）が含まれる。好結果な療法とは、その療法の停止後に血塊の再形成が起こらないように、持続的な効果が可能でなければならなＬ）。フィブリン−血小板塊の再形成が可能であるとすれば、冒された動脈は再び閉塞されることになり得る。

循環系の他の部分におけるフイブＩルー血小板塊の形成は抗凝固剤（ヘノ＜１フンなど）の使用によって部分的に防止することができる。残念ながら、血管閉塞の程度（「狭窄」の程度）が７０％以上である心筋梗塞患者、とりわけ重度残渣冠状狭重症の患者中の再閉塞の防止にヘパリンが普遍的に有効であるということは知られていない。

ある個体が医学的な補助を受け得る前にフィブリン−血小板塊を形成させていたとすれば、血栓溶解剤の使用によってその進境を溶解することができる。血栓溶解剤は、フィブリン−血小板血栓を溶解することによって、冒された血管に再び血液を通らせることができる薬物である。そのような薬剤にはストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子が含まれる（ガンツ、ダブリュら、　Ｊ、　７ｕｓｅｒ、　Ｃａ１１．　Ｃａｒｄｉｏｌ、　１　：１２４７−１２５３（１９８３）　；■ ントロブ、ケイ・ピーら、Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｃａｒｄｉｏｌ、　５４＋２９Ｅ −３１Ｅ（１９８４）　；ゴールド、エイチ・ケイら、　Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｃａｒｄｉｏｌ、　５３：１２２Ｃ−１２５Ｃ（１９８４））。

血栓溶解剤による治療はしばしば心筋梗塞を妨害するに足るほど迅速に冠状血流をうまく回復させることができる。残念ながら、溶解したフィブリン−血小板塊は、かなりの数の患者中で、そのような血栓溶解療法の停止後に再形成することが知られている。この再形成は冒された血管の再閉塞をもたらすことがあり、それゆえに重要な関心事である（ゴールド、エイチ・ケイら、Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｃａｒｄｉｏｌ、　５３：１２２Ｃ−１２５Ｃ（１９８４）　；ゴールド、エイチ・ケイら、Ｃｉ、ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　６８：ｌ−５０−Ｉ−５４（１９８３））。

したがって、ストレプトキナーゼ治療は研究された症例の約８５％のフィブリン塊を成功裏に溶解することが知られているが、調査された患者の約２５％に冒された血管の再閉塞が起こることがわかっている（ゴールド、エイチ・ケイら、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　６８：ｌ５Ｏ−Ｅ５４（１’１８３））。

組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）はストレプトキナーゼやウロキナーゼより強い（絶対的ではないが）フィブリンへの特異性を示すので、組織型プラスミノーゲンはストレプトキナーゼやウロキナーゼより望ましい血栓溶解剤と見なされている（フェルストレード、エムらルａｎｃｅｔ　１：１４２（１９８５））。組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は血漿からの迅速な配備速度を伴う進境特異的な血栓溶解剤である。組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は急性心筋梗塞の患者に有効な血栓溶解剤であり、研究された患者の約７０％において４５〜７５分内に冠状再流（即ち、狭窄の減少）をもたらすことが知られている（ゴールド、エイチ・ケイら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７３：３４７−３５２（１９８６））。

ｔ−ＰＡを使用することの恩恵はｔ−ＰＡ療法の停止後に起こる急性再閉塞の自然発生率によってかなり相殺される。ゴールド、エイチ・ケイとその共同研究者らはｔ−ＰＡ療法の停止が研究された患者の約４５％に冒された血管の再閉塞をもたらすことを発見している（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７３：３４７−３５２（１９８６））、　ｔ　−Ｐ　Ａ投与量の増大が冠状動脈再閉塞の傾向を減じるということは知られていない。トロンビン進境再形成の可能性が残渣冠状狭窄症の程度（即ち血管閉鎖の程度）に密接に関連しているということは重要である。

したがって、高程度狭窄症（即ち７０％以上の定量的狭窄症または８０％以上の非定量的狭窄症）が起こった個体では再閉塞の可能性がかなり高い。ｔ−ＰＡの連続的な注入によって血管の再閉塞が抑制されることが知られている（ゴールド、エイチ・ケイら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７３：３４７−３５２（１９８６））。残念ながら、ｔ−ＰＡの比較的短い生物学的半減期と一部の患者で重度の出血を起こす傾向が増大するという潜在的可能性がｔ−ＰＡの連続的注入を多くの心臓発作患者にとって非実用的にしている。

要するに、溶解した血栓がｔ−ＰＡ注入の停止後にしばしば再形成するが（ゴールド、エイチ・ケイら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７３：３４７−３５２（１９８６））、かなり低い投与量であるがかなり長い期間にわたる第２の（「維持Ｊ）ｔ−ＰＡ注入を行うことによって、そのような再閉塞の頻度を最小限にできることが臨床的な研究によって示されている。現在のところ、そのような維持注入を受けている患者にとってヘパリンは適切な付随療法であると認識されている。

したがってｔ−ＰＡによる冠状動脈血栓症（凝固）の治療は、迅速な再潅流を得るための高速の連続的注入と高程度残渣狭窄症の患者における再閉塞を防止するためのより低い投与量での維持注入を必要とする。

進境は様々な比率のフィブリンと血小板で構成される。血液凝固における基本的な反応は可溶性血漿タンパク質（フィブリノーゲン）の不溶性フィブリンへの変換を伴う。フィブリノーゲンのフィブリンへの変換はセリンプロテアーゼである酵素トロンビンによって触媒される。次いでフィブリン分子は因子ＸＩＩＩによって、そのガンマおよびアルファ鎖を介して他のフィブリン分子に広範に架橋される。さらに、α−アンチプラスミンが因子ＸＩＩＩによってフィブリンに架橋される。

これらの架橋事象は共に、血栓溶解に対して高度に耐性な進境をもたらす。進境形成の一般的な作用機序はガノング、ダブリュ・エフによってｒＲｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ＭｅｄｉｃａＩ　ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＪ　、第９版、ランゲ、カリフォルニア州ロス・アルトス、４１１〜４１４頁（１９７９）に概説されている。血小板は血液中に存在する円盤状の構造物であって、フィブリンと共に不溶性塊中に組み込まれること、並びに、追加の因子ＸＩＩＬフィブリンおよびＣ２−アンチプラスミンにフィブリノーゲンのフィブリンへの変換速度の増進作用を与えることによって、進境の形成に寄与する。血小板は心筋梗塞における進境の形成に寄与し、血栓溶解剤を用いる治療によって再潅流している冠状動脈を再閉塞させる進境の主要成分である。

活性型の因子ＸＩＩＩ（フィブリン安定化因子）は血液凝固カスケードの最終段階におけるフィブリン単量体の架橋の原因である。因子ＸＩＩＩはＣ２−アンチプラスミンを血漿進境中のフィブリンに架橋することによって、プラスミンとプラスミノーゲン活性化因子に対して耐性な進境を作る。フィブリンの架橋とフィブリン、フィブロネクチンおよびコラーゲン間の架橋は、進境を安定化させ、創傷治癒を促進する際に重要な役割を果たしているようである。モシャーら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　２５５：１１８１−１１８８（１９８０）。

血漿因子Ｘ　ＩＩＩは二量体として連結している２つのＡサブユニットと２つの弱く結合しているＢサブユニットからなる四量体である。シュワルツら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２８４　：　１３９５−１４０７（１９７３）。

血漿因子ＸＩＩＩは、フィブリンポリマー中の隣接するユニットのγ−鎖問およびこれらサブユニットのα−鎮間にγ−グルタミルーε−リジル結合を導入することによって、フィブリンを架橋する。

チェノら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾６６：４７２ −４７９（１９７０）。

因子ＸＩＩＩのＡサブユニットとＢサブユニットについてはクローン化と配列決定がなされている。イチノセら、　Ｂｉｏｃｈｅｏ＋１ｓｔｒｙ　２５＋６９００−６９０６（１９８６）　：グンドマンら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８３：８０２４−８０２８（１９８６）　＋イチノセら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ奄唐狽窒凵@２５：４６３３−４６３８（１９８６）。

凝固の間、因子ＸＩＩＩのＡサブユニット・チモーゲンは、トロンビンが触媒するアミノ末端ペプチド（４ｋＤａ）の切断によって活性化される。活性化されたＡサブユニットは基質ポリペプチド間のペプチド結合の形成を触媒する。Ｂサブユニットは既知の触媒活性を有しておらず、Ａサブユニットを迅速な分解から保護することがわかっている。

因子ＸＩＩＩはプラスミン、血小板およびある種の組織中に位置する凝固系のプロ酵素である。凝固の末端相で活性化されると、それは凝固の末端相におけるトランスグルタミナーゼとして機能し、フィブリンを化学的に架橋する。因子ＸＩＩ■活性は正常な止血には必須であり、血栓症と創傷治癒において重要な役割を果たしていると思われる。

進境の溶解はインビボではプラスミンによって媒介される。自然の条件下で、プラスミノーゲンは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）によってプラスミンに変換される。活性化はフィブリンの表面上で起こるので、タンパク質加水分解活性は適当な部位に限定される。プラスミンが循環系中に放出されると、それは迅速に天然の阻害因子と組合わされる。プラスミンの不活化は望ましくないタンパク質加水分解から保護する過程において最終の必須段階である。そのようなプラスミン阻害因子にはα−２−アンチプラスミン、α−２−マクログロブリンおよびα−１−アンチトリプシンが含まれ、これらはすべて糖タンノくり質である。α−２−アンチプラスミンはプラスミンに対してα−２−マクログロブリンよりはるかに高い親和性を有し、プラスミンと１．１の比率で特異的に結合する。α−マクログロブリンのより大きい貯蔵はリザーバー阻害因子として作用する。カーノ。

ケイ・ケイ、＾ｎｎ、　Ｃ１１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｓｃｉ、　１４　：４４３−４４９（１９８４）。したがってｔ−ＰＡの投与による進境の溶解は、プラスミン阻害因子による迅速で不可逆的なプラスミンの不活化によって制約される。

利用可能な血栓溶解剤はすべて未だにかなりの欠点をもっており、それらの欠点には治療的に有効であるためには高い投与量を必要とすること、フィブリン特異性の制約、それらが逆説的に血小板を活性化し、凝固を増大させ得るという事実による出血合併症の点で残存する毒性が含まれる。心血管疾患は未だに疾病の主な原因である。現在の薬剤はすべて治療の間またはその後に血管の血栓的再閉塞を伴う。したがって単独で、もしくは既知の血栓溶解剤と組み合わせて使用することができる新しい薬剤が現在も必要とされている。フィブリノーゲンの分解を最小限にし、また、冒された冠状動脈の再閉塞を防止しつつ、進境の溶解を増進する血栓溶解療法の改善がめられている。

発明の要約本発明の一側面は前駆体タンパク質の活性化および／またはその活性型を阻害するために使用することができる組成物を提供する。これらの阻害組成物は活性化の間に切断される前駆体タンパク質上の部位に結合する。

またインビボおよびインビトロで前駆体タンパク質を阻害または検出するためにこれらの組成物を使用する方法をも提供する。

さらに、阻害組成物として作用するモノクローナル抗体を発生させることができるペプチド抗原をも提供する。

本発明は心筋梗塞や患者内の進境の治療に有用である。

さらに本発明は活性型の因子Ｘ　ＩＩＩの検出法をも提供する。

図面の説明図１は因子ＸＩＩＩの活性型に特異的なモノクローナル抗体の結合特異性を表す本発明の一側面は前駆体タンパク質の活性化および／または活性状態を阻害するための独特の手段を提供する。この手段には前駆体タンパク質の切断部位に結合することができる新規な組成物の使用が含まれる。

本明細書では「前駆体タンパク質」という用語を用いて、正常な細胞過程によってインビボで２またはそれ以上のタンパク質に切断され、少なくともそのうちの１つは特定の生物学的活性を有するというタンパク質を表現する。前駆体タンパク質の切断産物には、いったん切断され、ると認識し得る活性または機能を持たない１またはそれ以上のペプチドが含まれ得る。前駆体タンパク質はそれ自体が生物学的に活性であってもよいし、不活性であってもよい。

特定の生物学的活性を有する前駆体タンパク質の切断産物を、ここでは成熟または活性タンパク質もしくは前駆体タンパク質の活性型と呼ぶ。

前駆体タンパク質は１またはそれ以上の成熟タンパク質に切断され得る。単一の成熟タンパク質を含有する前駆体タンパク質は成熟タンパク質と同じ名前で知られているのが通例である。

前駆体タンパク質の例にはチモーゲン、分泌タンパク質、およびポリシストロン性ｍＲＮＡから誘導される融合タンパク質、信号発生にタンパク質加水分解的切断を必要とする受容体（例えばトロンビン受容体）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

チモーゲンは成熟タンパク質に結合した活性化ペプチドから構成される酵素前駆体タンパク質である。活性化ペプチドを含有するタンパク質は主として不活性である。活性化ペプチドが切断されると成熟タンパク質が活性化される。チモーゲンノ具体例にはヒト凝固因子ＶＩＩ、ｌＸ５ＸＳＸＩ、ＸＩＩ、　ＸＩＩＩ、プロトロンビン、プロティンＣ１トリプシノーゲン、キモトリプシンなどが含まれる。他の前駆体タンパク質には、活性であるために酵素切断を必要とするタンパク質、例えばホルモンまたは薬剤（例；心房性ナトリウム利尿因子、エンドセリン）、活性受容体（例ニトロンビン受容体）あるいは凝固タンパク質（例：フィブリノーゲン）などが含まれる。

チモーゲンと同様に、ここに記述する種類の分泌タンパク質もその前駆体タンパク質状態ではアミノ末端ペプチドを含有しており、これが切断除去されて成熟タンパク質が生成する。しかしシグナルペプチドとして知られている分泌タンパク質のアミノ末端ペプチドは成熟タンパク質の輸送／分泌を容易にする。シグナルペプチドが切断されないと、（例えば抗体について報告されているように）そのタンパク質の機能が損なわれ得る。

ポリンストロン性ｍＲＮＡの翻訳産物は前駆体タンパク質の第３の形態である。

このタイプは翻訳過程の結果としてその末端で融合した２またはそれ以上の成熟タンパク質から構成される。これら前駆体タンパク質の翻訳後の切断によって個々の成熟タンパク質が放出される。多くの原核タンパク質およびウィルスタンパク質はこのような方法でポリシストロン性ｍＲＮＡから生産される（フライフィールド、ディ、　Ｍｏ１ｅｃｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　；　Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｆｏｎ　ｔｏ　Ｐｒ盾汲≠窒凵B ｔｅｓ　ａｎｄ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ、　４７８〜４８０頁、ジョーンズ・アンド・バートレット、インコーボレテッド編（１９８３）　；ピンカス、ｘス・イーら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＲＮＡ、　１７５〜１８０頁、エム・イノウニおよびビー・ニス・ドユドック編（１９８７）を参照のこと）。この種類の前駆体タンパク質の具体例にはポリオウィルスポリプロティンなどが含まれる。

本明細書において前駆体タンパク質の活性化とは、少なくとも１つの活性タンパク質を含む各成分部分への切断を意味する。前駆体タンパク質の切断される領域（実際の切断部位といずれかの側に隣接するアミノ酸配列を含む）を本明細書では切断部位という。前駆体タンパク質は１またはそれ以上の切断部位を有し得る。

本発明は前駆体タンパク質の切断部位またはその近傍を結合することができる組成物を提供する。即ち、本組成物は切断部位、切断部位のアミノ末端側またはカルボキシ末端側、あるいは活性部位に対して空間的に密接に近接するアミノ酸にさえ結合することができる。本明細書ではこれらの組成物を阻害剤（阻害因子）、阻害剤組成物および阻害組成物とも呼ぶ。これらの組成物にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂなどを含む）、単一鎖抗体などを含むが、これらに限定されない。このような阻害剤は、標的タンパク質の切断部位の配列を模倣するアミノ酸配列であって、活性化酵素にとって代替的な阻害基質として作用するアミノ酸配列からなってもよい。

前駆体タンパク質に対する阻害剤組成物の結合は、酵素の切断部位への接近を遮断し得る。そのように作用する場合、この遮断は前駆体タンパク質の切断を減じ、本発明組成物の阻害効果を少なくとも部分的には説明し得る。しかしこの阻害効果の原因を他の作用機序に帰することができ、本発明がいかなる特定の作用機序にも限定されないことは認識されるところである。

本発明の阻害組成物は前駆体タンパク質の成熟型をも直接妨害し得る。この妨害は、前駆体タンパク質の成熟型が保持している切断部位のアミノ酸配列に対する阻害剤組成物の結合の結果として潜在的に起こり得る。しかし上述のように他の阻害作用機序も考え得る。

さらに本発明は本発明の阻害剤組成物を獲得もしくは生成させる際に有用なペプチドをも提供する。これらのペプチドは抗原として作用して本発明の阻害剤組成物である抗体を発生させるものであり、ここではこれらをペプチド抗原と呼ぶ。

上述のようにペプチド抗原は前駆体タンパク質の切断部位もしくはその近傍に対応する。好ましくは、阻害を所望する成熟タンパク質中に保持される切断部位のアミノ酸配列が含まれる。

切断部位または他の部位を模倣するペプチドであればどのような長さであっても本発明の阻害剤組成物である抗体を発生させるためのペプチド抗原として使用することができる。一般にこれらのペプチド抗原は約６アミノ酸ないし約２０アミノ酸からなり、より一般的には約８アミノ酸ないし約１０アミノ酸からなる。

本発明のペプチド抗原は、当業者がよ（知っている標準的なタンパク質単離法およびタンパク質分画法を用いて、前駆体タンパク質または成熟タンパク質から直接得ることができる。

別法として、０．１〜１．０ｍＭｏｌアミン／ｇ−ポリマーを含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いて、メリフィールド、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ＋ａ、　Ｓｏｃ、　８５：２１４９（１９６２）やステユアートおよびヤングがｒｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓＪ　（フリーマン、サンフランシスコ、　１９６９）の２７〜６２頁に記述している公知の固相ペプチド合成によって本発明のペプチド抗原を合成することもできる。

化学合成が完結したら、０℃で約１／４−１時間の液体ＨＦ−１０％アニソール処理によって、ペプチドを脱保護し、ポリマーから切断することができる。試薬の留去後、１％酢酸溶液を用いてペプチドをポリマーから抽出し、次いでそれを凍結乾燥することによって粗製物質を得る。これは通常、５％酢酸を溶媒として用いるセファデックスＧ−１５でのゲル濾過などの技術で精製することができる。このカラムの適当な画分を凍結乾燥して均一なペプチドもしくはそれらの誘導体を得、次いでそれをアミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光分析、モル旋光度、溶解度、および固相エドマン分解による定量を用いて特徴づける（マツエダ、ジー・アール、ハーバ−、イーおよびマーゴリース。

エム・エヌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０：２５７１（１９８１））。

合成と単離の技術は上述の文献や米国特許第４２６９８２７号（これは参考文献として本明細書の一部を構成する）に詳細に記述されている。合成の間または合成後に、システィンを３．４−ジメチルベンジル（ＤＭＢ）で、アルギニンとヒスチジンをトシル（ＴＯ８）で、アスパラギン酸とグルタミン酸をベンジル（Ｂｚｌ）で、またリジンを２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル（２−ＣＢＺ）で遮断することが好ましいということに注意すべきである。他の保護遮断基もよく知られており、本発明で使用することができる。

合成ペプチド抗原については実際の切断配列をいずれかの１または数アミノ酸残基で置換してもよく、それでも本発明の抗体を発生させるであろう。したがって本発明はそのような機能的に等価な配列をも包含する。

様々な長さのペプチド抗原は（Ｎ末端の）遊離アミンもしくはその酸付加塩の形態であり得る。一般的な酸付加塩はハロゲン化水素酸塩、即ちＨＢｒ、ＨＩ、より好ましくはＨＣＩである。

当業者には理解されるであろうように、ペプチド抗原のアミノ酸残基は保護された形態でも非保護の形態でも存在し得る。また、適当なアミノ保護基またはカルボキシ保護基を用いることもできる。またペプチド抗原をそのＮ末端領域またはカルボキン末端領域で伸長させて、切断部位の追加のアミノ酸残基を含有さゼてもよいことは認識されるところである。

切断部位のアミノ酸配列は多くの前駆体タンパク質について利用可能である。

これらの部位に対応するペプチド抗原は上述の技術に従って合成することができる。そのような前駆体タンパク質の例には因子ＶＩＩＩ、プロティンＣ（フォスクーら、　ＰＮＡＳ　ＵＳ＾８２：４６７３（１９８５））、因子ＩＸ（ヨシタケら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４：３７３６（１９８５））、因子Ｘ（ｖクマレンら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２：２８７５（１９８３））、プロトロンビン（デジエンら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２：２０８７（１９８５））および因子ＶＩＩＩ（ヴエハーら、Ｎａｔｕｒｅ　３］２：３３７（１９８４））が含まれるが、こわらに限定されない。

切断部位のアミノ酸配列が利用できない場合には、当業者に公知の標準的なアミノ酸配列決定技術でそれを得ることができる（エドマン、ビーら、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１　：８Ｏ−９１（１９６７））。切断部位が既知でない場合には、前駆体タンパク質のアミノ酸配列をその切断生成物、とりわけ成熟タンパク質と比較することによってそれを決定することができる。また活性化酵素の切断特異性を知ることによって、タンパク質のｃＤＮＡ配列から切断部位を限定することもできる。

必要な情報を得たら、これらの部位に対応する抗原を上述の技術に従って合成することができる。

感作および／または免疫化、細胞融合、腹水生産、混合したハイブリドーマの選別、もしくはモノクローナルハイブリドーマのサブクローニングの技術を用いて本発明の抗体阻害剤組成物を発生させるために、本発明のペプチド抗原を使用することができる。これらの技術は当該技術分野で一般的によく知られている。

例えばコブロウスキーら、米国特許第４１７２１２４号、コブロウスキーら、米国特許第４１９６２６５号、ワンズら、米国特許第４２７１１４５号またはｒＣｏ叩Ｃｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｏｇｙＪ第１Ｉ巻、エル・シュワルツ編（１９８１）中のドゥイラード、ジェイ・ワイおよびホフマン、ティ、Ｂａ５ｉｃ　Ｆａｃｔｓ　ａｂｏｕｔ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（これらの文献は参考文献として本明細書の一部を構成する）などが注目を引く。

一般に、精製されたユピトーブペプチドは、連結橋を介して免疫原性タンパク！（例えばマレイミドベンゾイル化した（ＭＢ）キーホール・リムベット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）など）にそのペプチド抗原を一方回的に結合させるために、そのＣ−またはＮ−末端にシスティンを結合している。例えばアルブミンなどの他の免疫原性複合体も使用できる。さらに、グルタルアルデヒドやカルボジイミドビスジアゾ化ベンズアミジンなどの他の結合技術によって、ペプチド抗原を他の担体タンパク質に結合させることもできる（バーロー、イーおよびレーン、ディ、　Ａｎｔｉｂ。

ｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８８））。得られた構造物は１つのタンパク質分子に連結した数個のペプチド構造をとり得る。

適当な免疫化技術によって、本発明のペプチド抗原に対して免疫化された体細胞系を得ることができる。通常は、上述のようにタンパク質複合体の形態にある抗原を、適当な方法で（好ましくは腹腔内、静脈内、皮下注射で、もしくは足内バッドによって）投与することにより宿主を感作する。その免疫化プロトコールにアジュバントを含めてもよい。ウィルス、細菌または他の細胞も使用できる。

抗原を結合したタンパク質による最初の免疫化に続けて数回の追加免疫注射を数週間の間隔で定期的に行うことができる。次に、当業者がよく知っている手法によって、宿主から免疫化された体細胞を定期的に得る。次に、各宿主の血漿中に含有される抗体を標的前駆体タンパク質に対するその特異性について試験することができる。通常、最も高い抗前駆体タンパク質応答を有する宿主が、抗体分泌体細胞の供給源として最も望ましい。ペプチド−タンパク質複合体の追加量を静脈内および／または腹腔内経路で繰り返し注射することによって、超免疫を達成することができる。

次に、前駆体タンパク質活性を阻害することができる抗前駆体タンパク質特異的抗体を分泌することができるハイブリドーマを作成するために、免疫化された体細胞（好ましくは肺臓細胞）をもう１つの細胞系と融合しなければならない。融合用のもう１つの細胞系を選択する際に考慮すべき因子のいくつかは、迅速で均一な成長特性、成長培地の特定の成分中での成長のための代謝的欠損、および良好な融合頻度についての潜在的能力である。悪性細胞はとりわけ融合に適していることがわかっている。

このような細胞系が由来する種も重要な因子である。マウス、ラット、ハムスターおよびヒト骨髄腫系を含むいくつかの細胞系が利用可能であり、これらはハイブリドーマの作成にとって好ましい。様々な融合剤を使用することによって細胞融合を誘発することができる。ポリエチレングリコールおよびウィルスが誘発する融合は特に効率がよく、好ましい薬剤である。

体細胞融合と７ゾブリドーマ細胞系の樹立にとって好ましい条件はコーラ−およびミリスタイン、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　２５６：４９６（１９７５）に報告されているものであり、上記文献は参考文献として本明細書の一部を構成する。

体細胞の生産にとって好ましい宿主はマウス、とりわけＢＡＬＢ／ｃまたはＡＪである。体細胞融合によってハイブリドーマ細胞系を樹立する目的にとってとりわけ適している悪性細胞は骨髄腫細胞系、特にＳｐ２／’ＯおよびＮ５−１系である。

適当なハイブリッドの迅速な同定はあらゆるハイブリドーマ実験において重要な手法である。ハイブリドーマ抗体の初期検出は適当な検定法のいずれかによって行うことができ、特に好ましいものは放射線免疫検定法や酵素免疫検定法などである。

ハイブリドーマの維持は適当な選択成長培地を使用することによって達成される。通常、支持細胞と共に標準的な組織培養培地が好まれる。ハイブリッドを馬または生血清中もしくは血清非含培地中などで成長させることができる。

融合によって得られたハイブリッドは不均質なコロニーである。ある与えられた機能を発現させる均一な細胞系を得るためには、これらのコロニーをクローン化することが好ましい。クローン化とは単一の親細胞からの細胞系の成長（即ちモノクローナル拡張）を達成する過程を意味する。このようなりローン化は、アガロース技術によるなど、適当な技術のいずれかを用いて達成することができる。

組織培養フラスコ中で成長した抗体を分泌するハイブリッドは、通常約１〜３０ μｇ／ｍｌの範囲内にある様々な抗体濃度の上清を与える。したがって、好ましくは炎症性腹水を伴う動物中にハイブリッドを移すことによって、より高い収量を得る。ハイブリドーマの腹腔内注射か、もしくは他の適当な方法によって腹水を誘発することが好ましい。

ハイブリドーマの保存は重要であり、適当な技術のいずれかによって達成することができる。好ましい方法は、サブクローニングすること、あるいは融合後初期のハイブリドーマの適当量を凍結すること、並びに、必要に応じてその細胞集団を再クローニングすることである。

本明細書で用いられる「ハイブリドーマ」という用語は本明細書に記述する体細胞融合の技術によって得られるハイブリッド細胞を意味し、そのようにして得られたハイブリッドは因子ＸＩＩＩ活性を阻害することができる抗因子ＸＩＩＩ抗体を生産する能力を有している。

本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、単一の親ハイブリドーマから誘導されたクローン化された細胞コロニーの均一な系によって生産される抗体を意味する。

上述したモノクローナル抗体を得る方法の他にも、抗体または抗体断片を生産する他の方法がある。このような方法のいずれを使用しても本発明の抗体を作成し得ることは認識されるところである。例えばバーロウおよびレーン、＾ｎｔｉｂｏｄｉｅＳ：八Ｌａｂｏｒａｔｏｒへ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ−（１９８８）　；ディビスら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：１６５−１６９（１９９１）　；ブクナーおよびラドルフ、ＢｉｏＴｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ　９：１５７−１６２（１９９１）およびこれらに引用されている文献を参照のこと。

モノクローナルハイブリドーマを調製し終えたら、その上清から所望の抗体を単離することは当該技術分野では日常的な実験の問題に過ぎない。塩沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのよく知られている技術を用いて実質上純粋な形態で抗体を得ることができる。「実質上純粋な形態」という表現は、他のタンパク質、異なる特異性を有する他の抗体、核酸、多糖、細胞断片などの非モノクローナル抗体不純物をその抗体が基本的に含有していないことを意味する。抗体は可溶型でも使用できるし、あるいは水性および可溶性固相上に固定化して不溶化した抗体を得ることもできる。

本明細書で用いる「エピトープ」という用語は、配列が、それらが現れる時の配置にある該配列に対して特異的に結合する抗体を発生させることができる特有の配置で並べられている、あるタンパク質に特有の特定のアミノ酸配列を意味する。発生させる抗体は同じアミノ酸配列であってもそれらが異なる配置または順序で現れる時にはそれを結合することができない。

組換えまたは他の技術によってポリクローナルまたはモノクローナルの抗体を「擬人化」（即ちヒト中で非免疫原性に）することができる。例えば抗体の免疫原性部分を、対応するけれども非免疫原性の部分で置換することによって擬人化抗体を製造することができる。そのようなキメラ抗体に関する議論については、例えばロビンソンら、公開ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２２６９、アキラら、ＥＰＡ１８４１８７、タニグチ、エム、ＥＰＡ１７１４９６、モリソンら、ＥＰＡ１７３４９４、ヌウベルガーら、ＰＣＴ　Ｗｏ　８６１０１５３３、カビリーら、ＥＰＡ１２５０２３、ペターら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１−１０４２（１９８８）　：リウら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　tＳ＾８３：３４３９−３４４３（１９８７）、ウッドら、　Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４４６−４４９およびシャクら、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａ■ ｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　８０：１５５３−１５５９（１９８ｇ）を参照のこと。「擬人化」キメラ抗体の一般的概説はモリソン、ニス・エル、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２−１２０７（１９８５）およびディら、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４（１９８６）に述べられている。

本発明の方法によって製造される本発明の抗体阻害剤は、このような抗体について普通に記述される無数の応用のいずれにも使用することができる。例えば、前駆体タンパク質に関する放射線免疫検定法や酵素結合免疫検定法の開発にこれらの抗体を使用することができる。前駆体タンパク質を精製するための免疫親和性リガンドとしてこれらの抗体を使用することもできる。さらに、臨床的試料などの中の前駆体タンパク質または活性化されたタンパク質種をインビトロで検出するためにこれらの抗体を使用することもできる。

本発明のモノクローナル抗体を結合させることができ、前駆体タンパク質の存在を検出する際に使用できる担体は数多くある。よく知られている担体にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のセルロース、修飾したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的にとって、担体の性質はある程度可溶性であってもよいし、不溶性であってもよい。当業者はモノクロナール抗体を結合するのに適した他の担体を数多（知るであろうし、日常的な実験を用いてそれを確かめることができるであろう。

本発明で用いる「抗体」という用語は、完全な抗体と共に、抗原を結合することができるその断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）２などを包含するものとする。

当業者に知られている異なるラベルとラベル化法は数多くある。本発明で使用することができるラベルの種類の例には酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物および金属キレート剤が含まれる。当業者はモノクローナル抗体への結合に適した他のラベルを知っているであろうし、また日常的な実験を用いてそれを確かめることができるであろう。さらに、モノクローナル抗体に対するこれらのラベルの結合は当業者にはなじみの深い標準的な技術を用いて行うことができる。

本発明のモノクローナル抗体を検出可能にラベルする方法の１つはモノクローナル抗体を酵素に連結することである。次にこの酵素は、後にその基質にさらされた時に、例えば分光光度測定法や蛍光測定法などによって検出することができる化学的部分を生成するような様式で基質と反応するであろう。検出可能にラベルするために使用することができる酵素の例はマレート・デヒドロゲナーゼ、スタフィロコツカル・ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド・イソメラーゼ、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロホスフェート・デヒドロゲナーゼ、トリオセ・ホスフェート・イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ベーターガラクトンダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリン・エステラーゼである。

検出可能にラベルされたモノクローナル抗体の存在はモノクローナル抗体を放射性同位体でラベルすることによっても検出することができる。次いで放射性同位体の存在をガンマ計数器やシンチレーション計数器などの手段で決定することカテキル。特ｉ：有用す同位体１ｔ”Ｈ，＋２’　１　％　”’　Ｉ　、　３２Ｐｓ　３ｓＳ％　”Ｃ１”Ｃｒ。

ｓａ（］、５ｔＣｏ、５１１（：ｏ、５ａｐｅおよび？３ｓｅである。

モノクローナル抗体を蛍光化合物でラベルすることによって、検出可能にラベルされたモノクローナル抗体の結合を検出することもできる。蛍光的にラベルされたモノクローナル抗体を適切な波長の光にさらすと、その色素の蛍光ゆえにその存在を検出することができる。最も一般的に使用される蛍光ラベル化合物のなかにはフルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンがある。

１！１２Ｅｕやその他のランタニド系列などの蛍光発光金属を用いて本発明のモノクローナル抗体を検出可能にラベルすることもできる。これらの金属はジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いてモノクローナル抗体に結合させることができる。

モノクローナル抗体を検出可能にラベルすることができるもう１つの方法は、それを化学発光化合物に結合させることである。次いで、化学反応の過程で生じる発光（ルミネセンス）の存在を検出することによって、化学発光標識モノクローナル抗体の存在を決定することができる。特に有用な化学発光ラベル化合物の例はルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。

同様に、生物発光化合物を用いてモノクローナル抗体をラベルすることもできる。生物発光は生物系に認められる特殊な種類の化学発光であり、生物発光においては触媒的タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる。生物発光でラベルされたモノクローナル抗体の存在は発光（ルミネセンス）の存在を検出することによって決定することができる。ラベル化の目的にとって重要な生物発光化合物はルンフエリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。

やはりかなり高い感度をもたらし得るもう１つの技術は、抗体を低分子量のハプテンに結合することからなる。次いで第２の反応を利用することによってこれらのハプテンを特異的に検出することができる。例えばビオチン（アビジンと反応する）やジニトロフェノール、ピリドキサールおよびフルオレサミン（特異的抗ハブテン抗体と反応する）などのハプテンをこの方法で使用することが一般的である。

医薬的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って、例えば医薬的に許容される担体賦形剤と混合することなどによって、抗体もしくは抗体断片の形態にある本発明の阻害剤組成物を製剤化することもできる。適当な賦形剤とそれらの製剤は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒ＋ｗａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ（第１６版、オソル、エイ編。

マック、ペンンルバニア州イーストン（１９８０））などに記述されている。効果的な投与に適する医薬的に許容される組成物を形成させるために、そのような組成物はハプテン結合分子または血栓溶解剤の有効量を単独で、もしくは適当な量の担体賦形剤と共に含有するであろう。

さらなる医薬的方法を用いて作用の持続時間を制御することができる。放出が制御された調製物は、本発明の抗体または抗体断片−阻害剤組成物を錆化もしくは吸収するためにポリマーを使用することによって達成され得る。送達の制御は適当な巨大分子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）を選択することによって達成することができる。薬物放出の速度はそのような巨大分子の濃度を変化させることによっても制御することができる。作用の持続時間を制御するためのもう１つの考え得る方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテート共重合体などのポリマー物質の粒子中に治療剤を組み込むことからなる。別法として、例えばコアセルベーション技術や界面重合によって（それぞれ例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルまたはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルの使用によって）調製されたマイクロカプセル、あるいはコロイド薬物送達系、例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル、あるいはマクロエマルジョン中に治療剤を封入することもできる。このような教示はＲｅ＋ｏｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｂ＋ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃ’１ｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。

本発明の阻害組成物が治療的に有効な量で個体に投与されるであろうことは予期されることである。即ち、標的タンパク質の活性化を阻害するに足る量である。

阻害組成物の有効量は個体の体重、性別、年齢および医学的経緯によって変化するであろう。有効量に影響を与えるその他の因子には患者の状態の重篤度、特定の個体または標的組織中の阻害されるべき標的タンパク質の濃度、阻害組成物および標的タンパク質の安定性、阻害組成物と標的タンパク質の間の相互作用の速度論、活性化酵素の濃度、活性化酵素阻害因子の存在、阻害化合物に対する過去の暴露、腎臓病などが含まれ得るが、これらに限定されない。一般に阻害組成物は約１５から約５０μｇ／ｍｌ／血液までの範囲の投与量で、より一般的には約１５μｇ／ｍｌ／血液から約３０μｇ／ｍｌ／血液までの範囲の投与量で投与されるであろう。

医薬的に調製された本発明の阻害組成物は当該技術分野でよ（知られている手段で患者に与えることができる。そのような導入手段には経口手段、鼻孔内手段、皮下手段、筋肉内手段、静脈内手段、動脈内手段または非経口手段が含まれる。

注射可能なポーラスを調製するために、何らかの生理学的に許容される液体に本発明の阻害分子を溶解することができる。標準的食塩水に該分子を溶解することによってそのようなポーラスを調製することが好ましい。

上述のように、本発明の抗体分子にはモノクローナル抗体とその断片の両方が含まれる。ある状況下では免疫グロブリンのＦｃ部分が引き起こす免疫学的反応を最小限にするために、そのような抗体のＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片を使用することが好ましいこともある。

モノクローナル抗体の形態にある本発明の阻害組成物はキットの調製に理想的に適している。そのようなキットはバイアル、チューブなどの１またはそれ以上の容器手段を入れてしっかりと固定するために区画された担体手段からなり、該容器手段のそれぞれは使用される免疫検定法または画像化法の別個の要素を含む。

キットの形態に組み込むことができる免疫検定法の種類は数多い。本発明の抗体を使用することができる免疫検定法のいくつかの典型例は競争的検定法および免疫測定的またはサンドイッチ免疫検定法である。

本発明はとりわけ心筋梗塞と患者内の進境を治療する際に有用な阻害組成物に向けられる。本発明に従って治療することができる進境には肺血栓塞栓症、深静脈血栓症、大脳塞栓症、腎静脈および末梢動脈血栓症などが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの組成物は凝固因子の阻害剤、とりわけ因子ＸＩＩＩの阻害剤からなる。因子ＸＩＩＩの活性を阻害することができるモノクローナル抗体は阻害組成物としてとりわけ有用である。より具体的には、これらの抗体は因子ＸＩＩＩＡの架橋活性を阻害することができる。したがって本発明の阻害剤およびモノクローナル抗体はフィブリンγ−二量体の形成を阻害し、進境の溶解を支援する。

因子ＸＩＩＩ阻害分子は因子Ｘ　ＩＩＩ活性を阻害することができる分子、とりわけ抗体、モノクローナル抗体およびその断片を包含する。因子ＸＩＩＩに特異的に結合し、その活性を阻害するモノクローナル抗体を生じさせることは困難であったが、本発明はそのような抗体を作成する方法を提供する。

因子ＸＩＩＩに特異的な抗体を生じさせることができるペプチドを合成した。これらのペプチドは因子ＸＩＩＩのトロンビン切断部位またはその切断部位に近接する部位を模倣するものである。

抗因子ＸＩＩＩ抗体（これも本発明によるものである）を発生させるのに有用な本発明の代表的化合物には下記の式で示されるものが含まれる。

ＮＲ２−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃ−ＣＯＲ寛［ここにＧはｇｌｙを表し、■はｖａｌを表し、Ｎはａｓｎを表し、Ｌはｌｅｕを表し、Ｑはｇｉｎを表し、Ｅはｇｌｕを表し、Ｆはｐｈｅを表し、Ｃはｃｙｓを表し、Ｒ１はＲ２、−１ｙｓ−Ｃｏ−Ｒ２、−１ｙｓ−ａｒｇ−Ｃｏ−Ｒ２または一１ｙｓ−ａｒｇ−ｇＩ　ｕ−Ｃｏ−Ｒ２を表し、Ｒ２は−ｃｙｓ−Ｃｏ−Ｒ３、ＯＨ，ＯＭまたはＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ３はＯＨ，ＯＭまたはＮＲ４Ｒ５を表し、Ｍは医薬的に許容されるカチオンもしくは低級（Ｃ，〜Ｃｏ）分枝または非分枝アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一であるか、もしくは異なり、Ｈまたは低級アルキル基からなる群から選択される。］トロンビン切断部位のアミノ末端側もしくはカルボキシ末端側に対するモノクローナル抗体を得るためには、その部位に対応するアミノ酸のいずれかの配列、例えばＸ、−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｅ−Ｑ−Ｆ−Ｘ２などを使用することができる（ここに、Ｘ、は上記配列をさらに約１０アミノ酸までのＮ末端アミノ酸で伸長できることを表し、Ｘ２は上記配列をさらに約１０アミノ酸までの他のＣ−末端アミノ酸で伸長できることを表し、Ｐはプロリンを表し、Ｒはアルギニンを表し、Ｇはグリシンを表し、■はバリンを表し、Ｎはアスパラギンを表し、Ｅはグルタミン酸を表し、Ｑはグルタミンを表し、Ｆはフェニルアラニンを表す）。

先に記述した標準的な技術により、上述のペプチド抗原を用いて、本発明の抗因子ＸＩＩＩ抗体を産生ずるハイブリドーマを得ることができる。所望のハイブリドーマの同定には、因子Ｘ　ＩＩＩ被覆微量滴定ウェルを抗体にさらし、次いでその抗原抗体複合体を放射線ラベルした抗Ｆａｂ断片抗体にさらす放射線免疫検定法が好ましいくクリンマンら、＾ｎｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（Ｐａｒｉｓ）１２７Ｃ：４８９（１９７６）　；この文献は参考文献として本明細書の一部を構成する）。

また本発明は心筋梗塞および患者内の進境を治療するための凝固因子のモノクローナル抗体阻害剤または抗体断片阻害剤の使用にも向けられる。この方法はモノクローナル抗体またはその断片を単独で、もしくは血栓溶解剤と組み合わせて受容患者に投与することを伴う。このような抗体断片には例えばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ“）２、ＦｖまたはＦ（ａｂ）分子が含まれる。

単独で投与した場合、本発明の抗体阻害剤はフィブリン−フィブリンおよびα２ −アンチプラスミン−フィブリン架橋を有意に阻害することによってインビボでの血栓溶解を増進する。

単独で使用する場合、患者に与えられた時に因子ＸＩＩＩを阻害することができ、それによって進境の溶解を増進することができる因子ＸＩＩＩ阻害分子の量を「治療的に有効な」量とする。進境の溶解を増進し、進境の再形成を防止するためには、約１５μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌ（患者の血液体積）までを与えることが望ましい。ある態様として、この投与量を連続的な静脈内注入によって約２０ないし約２４０分の期間にわたって投与することができる。別法として、該分子を約１５μｇないし約１５０μｇ／ｍｌ／血液体積の投与量で、最も好ましくは約１５ないし約３０μｇ／ｍｌ−患者の血液体積の投与量で、静脈内に注射可能なポーラスで与えることができる。この方法で該分子を与える場合、−回のポーラスで潜在的な進境再形成を防止するのに充分である。

別法として、因子ＸＩＩＩ阻害分子を血栓溶解剤と共に投与する。この態様では、該分子と本発明の血栓溶解剤を受容者に同時投与するものとする。

「同時投与」という用語は、因子ＸＩＩＩ阻害分子（抗体分子またはその断片）と血栓溶解剤のそれぞれが、それぞれの薬学的活性の期間が重複するような時間枠中に投与されることを表すものとする。これら２つの薬剤を同時に投与してもよいし、逐次的に投与してもよいが、それらを同時に投与することが好ましい。

「血栓溶解剤」という用語は、フィブリン−血小板塊を溶解するが、もしくはそのような進境の形成を阻害することができる薬剤を意味する。血栓溶解剤の例にはストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子が含まれる。これらの目的のためにｔ−ＰＡを使用することはとりわけ好ましい。天然のｔ−ＰＡを使用することもできるが、組換えｔ−ｐＡを使用することが好ましい。さらに本発明では、一本鎖つロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｓｃｕ−ＰＡ）とその活性断片を含む上記血栓溶解剤のハイブリッド、生理学的に活性な断片、突然変異種またはキメラ型を使用することもできる。本明細書で用いる「組織型プラスミノーゲン活性化因子」という用語は、そのようなハイブリッド、断片および突然変異種と共に天然に由来するプラスミノーゲン活性化因子や組換えによるプラスミノーゲン活性化因子を包含するものとする。

因子ＸＩＩＩ阻害分子を血栓溶解剤と共に同時投与する場合、約１５μｇ／ｍｌないし約１５０μｇ／ｍｌ−患者の血液体積を与えることが望ましい。−態様として、この投与量を連続的な静脈内注入によって約２０ないし約２４０分の期間にわたって投与することができる。別法として、抗体またはその断片を約１５１１ｇないし約１５０μｇ／ｍｌ／血液体積の投与量で、また最も好ましくは約１５ないし約３０μｇ／ｍｌ−患者の血液体積の投与量で、静脈内に注射可能なポーラスとして与えることもできる。

このような溶解を引き起こすことができる血栓溶解剤の量を「治療的に有効な」量とする。患者の体重１ｋｇあたり約０．５ないし約１．５ｍｇの投与量で本発明の血栓溶解剤を与えることが好ましい。−態様として、血栓溶解剤を長期間（即ち約１８０ないし約１４４０分）にわたって与える。好ましい態様では本発明の血栓溶解剤を約１５μｇ／ｍｌないし約１５０μｇ／ｍ！−血液体積、また最も好ましくは約１５μｇないし約３０μｇ／ｍｌ−血液体積を含有する静脈内注射ポーラスとして与える。注射可能なポーラスを調製するために生理学的に許容される何らかの液体に本発明の血栓溶解剤を溶解することができる。しかし、標準的食塩水中に血栓溶解剤を溶解することによって、そのようなポーラスを調製することが好ましい。

当業者には明白であろうように、抗因子ＸＩＩＩ抗体または血栓溶解剤の必要Ｉは、患者の状態の重篤度や患者の身長、体重、性別、年齢および医学的経緯などの基準に依存するであろう。

本発明の抗体またはその断片および血栓溶解剤を、医薬的に有用な組成物を調製するための上述のような既知の方法に従って製剤化することができる。

上述のような当該技術分野でよく知られている手段によって、血栓溶解剤または抗体もしくはその断片を患者に与えることができる。最も好ましい心筋梗塞治療法では、約１５μｇ／ｍ＋ないし約３０μｇ／ｍ、Ｉ−患者の血液体積を含有するポーラス（静脈内に注射される）を患者に与える。

一般に本明細書に報告する結果は、前駆体タンパク質（具体的には凝固酵素）の触媒機能を中和するために阻害組成物（具体的にはモノクローナル抗体）を使用できるということを立証するものである。この方法は酵素によって厳しく管理されている生物学的過程に適用することができる。凝固は血栓溶解酵素（一般にセリンプロテアーゼ）の効果が他の凝固酵素（因子ＸＩＩＩなど）の効果と競争するという精密に平衡化された系であるので、凝固の病的な変化は血栓溶解酵素の活性を増大させるか、もしくは凝固酵素を中和することによって治療され得る。

本発明の方法を用いて、タンパク質の活性型に特異的に結合し、チモーゲンや前駆体タンパク質には結合しない他の抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）を開発できるということは認識されるところである。したがって本発明はこれらの抗体または抗体断片にも関連する。例えば活性な因子ＸＩＩＩのみに結合する抗体を作成することができる。これらの抗体は上述したチモーゲンや前駆体タンパク質には交差反応または結合しない。活性な因子ＸＩＩＩに特異的な抗体は上述の技術によって作成することができる。具体的には、ペプチド免疫原Ｇ−Ｖ −Ｎ−■、−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃを用い、上述の技術によってモノクローナル抗体３９４を作成した。このような抗体はインビトロまたはインビボで活性酵素を検出もしくは測定するのに有用である。

因子ＸＩＩＩの活性型に特異的な抗体がモノクローナルの形態である場合には、そのような検出手段を上述のようにキットに組み込むことができ、かつ／または、免疫検定法で使用することができる。一般に免疫検定法は、検定される抗原性物質と抗体の間の複合体であって、その複合体の１または他の要素が検出可能にラベルされていてもよいものの形成に基づく技術を含む。競争的免疫検定技術では、試験される試料液体中の抗原性物質が既知量の抗体結合部位と競合する。抗体に結合するラベルされた抗原の量は試料中の抗原の量に逆比例する。

反対に、はとんどの免疫測定検定法ではラベルされた抗体を使用する。このような検定法では、複合体に伴うラベルされた抗体の量が液体試料中の抗原性物質の量に直接比例する。

サンドイッチ免疫測定検定法では、試験する液体には不溶性の固体支持体にラベルされていない抗体のある量を結合する。この固定化された抗体をまず試験する試料と接触させて２成分の抗原−抗体複合体を形成させる。適当なインキュベーション期間後に、その固相を洗浄して未結合の抗原を除去し、次いで既知量の第２抗体を含有する溶液と接触させる。次いで第２のインキュベーション期間後に、固体支持体を再び洗浄して未反応の抗体を除去する。次に第２の抗体に対するラベルされた抗抗体を加えて充分な時間インキュベートし、次いでその複合体を洗浄する。次に洗浄した固体支持体を試験して、例えば放射能ラベルの輻射を測定することによって、ラベルされた抗体の存在を検出および定量する。検出されたラベル化抗体の量を陰性対照試料のものと比較する。抗原がその表面上の異なる位置に結合した２つの抗体を有するので、この種類の検定法はしばしば二部位検定法またはサンドイッチ検定法と呼ばれる。ディピッドら、米国特許第４３７６１１０号を参照のこと。

活性因子ＸＩＩＩの存在について試験するために同時検定法と逆検定法を用いることもできる。同時検定法は固体支持体に結合した抗体とラベルした抗体の両方を試験する試料に同時に加えるという１回のインキュベーション段階を含む。インキュベーション後、固体支持体を洗浄して未結合の分析物と未結合の抗体を除去し、結合した抗体−分析物〜ラベルされた抗体「サンドイッチ」を従来の「順方向」サンドイッチ検定法の場合と同様に検出する。逆検定法は、まずラベルされた抗体の溶液を液体試料に加え、次いで適当なインキュベーション後に、固体支持体に結合させた未ラベルの抗体を加えるという段階的な添加を含む。第２のインキュベーション後、固相を従来の方法で洗浄し、ラベルされた複合体の量を上述のように検出する。

リーゼらの米国特許第４２７９８８５号は、抗原またはハブテンを検定することができる固相競争タンパク質結合検定法について記述している。この方法は、固体支持体に固定化された限定された数の受容体または結合部位に関する、分析物とそのラベルされた形態の間の競争を含む。この検定法は各成分を同時に混合しても逐次的に混合しても行うことができる。逐次的な検定法は、固定化された受容体または抗体を含有する支持体と分析物の溶液を接触させ、次いでその混合物をトレーサーに接触させることを含む。このトレーサーはラベルまたはタッグを含有する分析物またはその類縁体であり得る。

上述の競争的検定法、免疫測定検定法およびサンドイッチ検定法に加えて、これらの検定法の他の変法が存在し、それらはすべて日常的な技術に過ぎない。

ここに本発明を概説したので、指定しない限り本発明の限定を意図するものではなく、例示のみを目的としてここに記載するいくつかの特定の例を参照することによって、本発明がよりよく理解されるであろう。

材料は下記の供給者から得た：因子ＸＩＩＩ非含有フィブリノーゲン、ヒト因子ＸＩＩＩ（アメリカン・ダイアゴノスチ力、コネチカット州グリーンウィッチ）；アフィニティー精製したヤギ抗（マウスＦ　ａ　ｂ’ＸＧＡＭＦ　ａ　ｂ）、カッペル・ラボラトリーズ（ペンンルバニア州マルベーン）；高分子量および低分子量タンパク質標品、ファルマシア（スウェーデン国つプサラ）；予備染色したタンパク質標品（パイオーラッド、カリフォルニア州すッチモンド）：　ＢＡＬＢ／Ｃマウス（チャールズ・リバー、マサチューセッツ州つイルミングトン）：牛トロンビン、パーク−ディビスにュージャージー州モリス・ブレインズ）；フロインドアジュバント（ディフコ、ミンガン州デトロイト）；キーホール・リンペット・ヘモシアニン、Ｄ〜フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−し−アルギニンクロロメチルケトン／ＰＰＡＣＫ／（カルバイオケム、カリフォルニア州う・ジョラ）：ポリビニリデンジフルオライド転写膜（ミリポア、マサチューセッツ州ベトフォード）；ヨードアタミド、ＲＩＡ−グレード牛血清アルブミン、プロティンＡ、Ｎ、Ｎ’−ジメチルカゼイン（シグマ。

ミズーリ州セント・ルイス）；ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ジエネンテツク、カリフォルニア州すウス・サン・フランシスコ）；胎盤因子ＸＩＩＩ、因子ＸＩＩＩのＡサブユニットに対するウサギ抗血清（ディグノスチ力・スターゴ、フランス・ビア・アメリカン・ディグノスチ力、ニューシャーシー州パルシバニー）。他の化学品はすべて試薬等級またはそれ以上のものであった。マサチュセッツ・ゼネラル・ホスピタル（マサチュセッツ州ボストン）への無作為な供給者から新鮮凍結血漿を得た。

因子ＸＩＩＩのトロンビン活性化部位に対する抗体を作成するために、トロンビンによって活性化された因子ＸＩＩＩのＡサブユニットのアミノ末端のアミノ酸配列を模倣するペプチドを合成した。このトロンビン切断部位（Ｔｅ３）ペプチドはＮＨ２−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃ−ＣＯＯＨという配列を有し、この配列は残基３８〜４４のＡサブユニットアミノ酸配列の複製である。カルボキシ末端のシスティンはＡサブユニット配列の部分ではなく、化学結合のためにこのペプチドに加えたものである。著者らが過去に記述した改良メリフィールド法（フオザードら。

ｆ”Ｔｈｅ　Ｈｅａｒｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ＳｙｓｔｅｍＪ　（編）、ラーベン・プレ７、、−ニーヨーク（１９８６）中のリッジら、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を用いて手作業で上記ペプチドを合成した。免疫化のために、ヘテロ三官能性架橋試薬ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって、このペプチドをキーホール・リムベット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に化学結合させた。上記ペプチドのアミノ酸配列とＬＫＨに対するその化学結合をウォータース・ピコタグ・システムでのアミノ酸分析によって立証した。結合の後、充分な透析によって遊離のペプチドをＫＬＨ−ペプチド複合体から分離した。

完全フロインドアジュバント中に乳化したＫＬＨ−ペプチド複合体１５μｇを用いて皮下的にＣＡＦマウスを免疫化し、１力月後とそれ以降の３力月毎に体細胞融合まで免疫化した。体細胞融合に先立って、固相放射線免疫検定法でペプチドに対する抗体力価を決定した。ＴＣＳペプチドをポリビニルクロリドプレートのウェルに加えた（１０μｇ／ｍ１．１ウェルあたり２５μｍ）。１〜２時間後にペプチドを洗浄除去し、非特異的結合部位を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間遮断した。マウス抗血清の１０倍連続的希釈液（２５μｌ）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。各ウェルを再度洗浄し、ヤギ抗（マウスＦａｂ’２ＸＧＡＭ）２５μｌを加え、１時間インキュベートした。ＣＡＭを除去し、プレートを洗浄した。結合した抗体の量をγ−シンチレーション計数器中で計数した。最も高い抗体力価を有するマウスからの細胞を体細胞融合に使用し、その体細胞融合をガルフレとその共同研究者が記述した方法（ガルフレら、　５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔ、　１９：４４３−４４８（１９７７））に従って行った。ニスバーが記述しているように（ニスバー、ゼット、　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（編j＝３ −４１（１９８５））ＣＡＭを用いる逆固相放射線免疫検定法によって、ペプチド特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを選択した。次に、放射線ラベルされたＣＡＭ（上記参照）を用いる固相ＲＩＡで、抗ＴＣＳペプチド抗体を産生ずるハイブリドーマを精製された因子ＸＩＩＩに対するそれらの結合についてスクリーニングした。

これらの検定法からモノクローナル抗体（ＭＡｂ）３０９をさらなる特徴づけのために選択した。

特異性検定抗体の結合特異性を決定するために、カルボキシ末端のシスティン残基以外は因子ＸＩＩＩチモーゲンのＡサブユニットの構造を模倣するＮＨ２−Ｐ−Ｒ−Ｇ− Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃ−ＣＯＯ）（という配列を含有するペプチドを合成した。このペプチドは、チモーゲンには存在するが活性化された因子ＸＩＩＩには存在しないＮＨ２末端アミノ酸が２つ多く存在する点を除いてＴＣＳペプチドと同一である。したがってこのペプチドはトロンビン切断部位をまたぐ（ｓｐａｎ）ことになる。Ｆ−ｍ。

Ｃ化学を用いてミリジエン９０５０ペプチド合成装置でこのペプチドを合成した。

ウォータース４４１システムでの高性能液体クロマトグラフィーによってこのペプチドが均一であることを決定した。ウォータース・ピコタグ・システムでのアミノ酸分析によってこのペプチドの組成を確認した。

ＭＡｂ３０９がトロンビンによって切断された因子ＸＩＩＩを特異的に結合することができるかどうかを確かめるために、ＴＣＳペプチドに対するＭＡｂの結合と上記の貫通（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ペプチドに対するＭＡｂの結合とを放射線免疫検定法で比較した。微量滴定プレートのウェルをＴＣＳペプチド（５０μｇ／ｍＬ溶液２５μｌ）で１〜２時間コートした。非特異的タンパク質結合部位を１％ＢＳＡで１時間遮断した。洗浄した後、消費したハイブリドーマ上清を培養培地で逐次希釈し、別々のウェルに加えて１時間インキュベートした。次に各ウェルを洗浄し、１２５　Ｉ−ＧＡＭＦＡｂ（約５００００ｃｐｍ）と共に１時間インキュベートした。

ウェルを再度充分に洗浄した後、γンンチレーション計数器中で計数することによって抗体結合を検出した。

最大結合の約半分を与えるハイブリドーマ上清の希釈度を決定し、それを以降の阻害研究に用いた。これらの実験では、様々な量の可溶性ＴＣＳペプチドまたは貫通ペプチドをＭＡｂ３０９ハイブリドーマ上清と混合し、ＴＣＳペプチドでコートした微量滴定プレートに加えることによって抗体の結合を阻害した。室温で２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、結合した抗体を１２５１．− にＡＭＦＡｂで上述のように検出した。阻害剤の非存在下での結合と比較した阻害剤の存在下での結合の分数として阻害百分率を計算した。

親和力測定Ｔｅ３−ペプチドに対するＭＡｂ３０９の親和性を決定するために、親和性実験を行づた。上述のようにヘテロ三官能性試薬ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルを用いてＴＣＳペプチドをＢＳＡに結合させた。充分に透析することによって未結合のペプチドを除去した後、アミノ酸分析を行った。その分析によってＢ５Ａｌモルあたり２．３モルのＴＣＳペプチドが結合していることが明らかになった。次にそのＢＳＡ−ペプチド複合体をクロラミン−Ｔ法（グリーンウッドら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　８９　：　１１４−１２３（１９６３））によって放射線ラベルした。ヨウ素化したタンパク質をＰＤ−１０カラム上で遊離のヨウ素から分離した。５０％エタノール：水中でのペーパークロマトグラフィーによって比放射能を３連で決定した。

平衡飽和結合検定法を行うことによってＭＡｂの親和性を決定した。これらの検定法では、抗体濃度が予測されるＫｄ未満になるようにＭＡｂハイブリドーマ上清を培養培地で希釈した。放射線ラベルした配位子を０．０２％アジドの入ったＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水ＣＨＢＳＡ）でＫｄの約１０倍および約１／１０濃度に希釈した。試験管内で、希釈した抗体１００μｍを様々な濃度の放射線ラベル化配位子１００μｍおよびＨＢＳＡ１００μｍと混合した。これらの試験管を４℃ で終夜インキュベートした。磁性粒子に結合したヤギ抗マウス抗体５０μｌを各試験管に加え、４℃で９０分間インキュベートした。次に氷冷したＨＢＳＡ２ｍｌを各試験管に加え、４℃で３００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離することによって、結合した放射線ラベル化配位子を遊離の配位子から分離した。同じイソタイプの対照ＭＡｂ（抗ジグオキシン４Ｏ−１６０）を用いて同じ実験を平行して行うことによって、バックグラウンドの初期評価値を得た。ゼニス・マイクロコンピュータ−でリガンド・プログラムを用いて親和性を計算した。

ＭＡｂ３０９の精製培養上清を集め、プロティンＡ−セファロースカラムでＭＡｂ３０９を精製した。３ＭＮａＣ１中の１．５Ｍグリシン（ｐＨ８，９）と培養上清を混合しく比率１．１）、カラム上で１時間インキュベートした。０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３，５）を用いて抗体をカラムから溶出させ、１Ｍ）リスＨＣＩ（ｐＨ９，１）で中和し、濃縮した。

精製した因子ＸＩＩＩに対するＭＡｂ３０９の結合濃度２（ｂ１ｇ／ｍｌの胎盤因子ＸＩＩＩ（Ａ２）または血漿因子ＸＩＩＩ（ＡｚＢｚ）２５μｍでプレートをコートした。遮断した後、ＭＡｂ３０９を含む培養上清を抗原と共１ニインキユベートした。５００００ｃｐｍ／つｘ）しの菫”Ｉ−ＧＡＭＦＡｂを加え、残存する放射能をγンンチレーション計数器で測定した。

トランスグルタミナーゼ活性に関する検定ローランドが記述した濾紙検定法（ローランドら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５０　：６２３−６３１（１９７２））に下記のわずかな改良を加えて、牛α−カゼインへの１４Ｃ−ブトレセイン（ｐｕｔｒｅｓｃｅｉｎｅ）の取り込みによってヒト因子ＸＩＩＩのＡサブユニット活性を測定した。

無作為に選択した少なくとも４人の供給者から得た新鮮凍結ヒト血漿を因子ＸＩＩＩの供給源として使用した。フィブリノーゲンの熱不活化後に、トロンビン０，０８ＩＪ、３．５ｍＭ　ＣａＣ１および０．２Ｍ　ＤＴＴ（最終濃度）と共に３７℃で３０分間インキュベートすることによって因子ＸＩＩＩを活性化した。

因子ＸＩＩＩ活性化に対するＭＡｂの相対的効果を決定するために、トロンビンによる因子Ｘ　ＩＩＩの活性化の前または後に最終濃度１ｍｇ／ｍｌのＭＡｂ３０９または対照ＭＡｂ（抗ジグオキシン４Ｏ−１６０）を加えた。因子ＸＩＩＩのトロンビン活性化を停止させるために、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ブロイル −アルギニン−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）を最終濃度１０−’Ｍで加えた。トロンビンによる因子ＸＩＩＩの活性化後、上述のようにカゼインへの１４Ｃ−プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）の取り込みによって因子ＸＩＩＩ　トランスグルタミナーゼ活性を測定した。３０分間のインキュベーション後、ヨードアセタミド（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を加えることによって反応を停止させ、各試料の２０μｌをワットマン濾紙上にスポットし、シンチレーシジン計数器で計数した。

因子ＸＩＩＩａによるフィブリノーゲンのγ−γ架橋に対するＭＡｂ３０９の効果胎盤因子ＸＩＩＩ（０，０３ｕ　ｇ／ｍ　Ｉ　）５　ｕ　ｌをＭＡｂ３０９（２ｍｇ／ｍ１）２５μｌと共に予備インキュベートした。３０分後、トロンビン（０，０１ｔＪ）５λと１０ｍＭ　ＣａＣ＋２５μｍを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。次に因子ＸＩＩＩを含まないフィブリノーゲン（１０μｇ）を加え、異なる時間インキュベートした。９Ｍ尿素を加え、その直後に試料を煮沸することによってフィブリン架橋を停止させた。次に還元条件下で７．５％ゲルでの５Ｏ８−ＰＡＧＥによって試料を分析した。ゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルーで染色し、乾燥した。

進境溶解検定新鮮凍結血漿を微量の１２５１−フィブリノーゲン（約２００００ｃｐｍ）と混合した。２０ｍＭ　ＣａＣｌ２２５．ＣＺＩによる凝固の前に、血漿（２５，ｃｚｌ）をＭＡｂ３０９または対照（０，０２％アジドを含むトリス緩衝化食塩水）と共に３０分間インキュベートした。３０分後、ヨードアセタミド（１ｍｇ／ｍｌ溶液２０μｌ）で凝固を停止させた。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（５Ｕ）を各チューブ中の進境に加えた。３０分と６０分後に、上清２００μｌを採取し、γ−シンチレーション計数器で計数することによって進境溶解率を決定した。進境溶解の百分率を、フィブリン分解産物として上清に放出された放射能を進境中に取り込まれた最初の放射能で割った商として計算した。

精製された血漿因子ＸＩＩＩ　５μ＋　（０，５μｇ）をＭＡｂ３０９（または対照としての抗ジグオキシンＭＡｂ８２ｍｇ／ｍＩ）１５μｍと共に３０分間予備インキュベートした。０．０２１Ｕのトロンビン１０　ｕ　ｌ　（１，５ｍＭ　Ｃａ　ＣＩ　Ｚ中）で９．５．１０．１５．２０および２５分間３７℃で因子ＸＩＩＩを活性化した。試料緩衝液１０μｌを加えて煮沸することにより、即座に反応を停止させた。調製した試料を６％の非還元ゲルで電気泳動し、半乾燥技術によって電気泳動的にＰＶＤＦニトロセルロース紙に転写した。その膜を０．３％ツウイージーＴＢＳ中で洗浄し、１％Ｂ　Ｓ　Ａ−Ｔ　Ｂ　Ｓ　Ａ緩衝液で遮断した。

いくつかの実験では、−次抗体としてのヒト因子ＸＩＩＩのサブユニットに対するウサギ抗血清（１・１００に希釈）と検出剤としての１２５１−プロティンＡ（１，５ｘ　１０’ｃ　ｐｍ）でニトロセルロースプロットをプローブした。他の実験では、トロンビン活性化の間に切断除去される因子ＸＩＩＩのアミノ末端に対するモノクローナル抗体でニトロセルロースプロットをプローブした。これらの実験では１２５１−ＧＡＭＦａｂ（１，５Ｘ１０’ｃｐｍ）を用いて、結合した一次抗体を検出した。

洗浄と乾燥の後、ニトロセルロース膜をオートラジオグラフィーにかけた。さらに、因子Ｘ　ＩＩＩのＮ−末端ペプチドに対するモノクローナル抗体を使用した場合には、ニトロセルロースプロットを等しい小片に切断し、結合している放射能の量をγ−シンチレーション計数によって測定した。

結果１匹の免疫化したマウスの牌細胞の体細胞融合から、３０のハイブリドーマがＴｅ３−ペプチドに対する抗体を産生ずると考えられた。Ｔｅ３−ペプチドに対する見かけ上の親和性と、固相検定法における因子Ｘ　ＩＩＩに対する結合に基づいて、ＭＡｂ３０９をさらなる研究のために選択した。対照抗体と比較すると、ＭＡｂ３０９は濃度依存性の様式で因子ＸＩＩＩに結合した。

ＭＡｂ３０９の結合特異性をさらに特徴づけるために、Ｔｅ３−ペプチドとトロンビン切断部位をまたぐペプチド（貫通ペプチド）を用いる放射線免疫検定法を行った。微量滴定プレートのウェルをＴＣＳペプチドでコートした。次に、約５０％の結合を与えるように希釈したＭＡｂ３０９培養上清を様々な濃度のＴｅ３または貫通ペプチドと混合し、微量滴定プレートウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、１２５１−ＣＡＭを加えて結合した抗体を検出した。両ペプチドは共に等価な濃度で平行した様式でＭＡｂ３０９の結合を阻害した。このことは、ＭＡｂ３０９は大部分がトロンビン切断部位に対して遠位のまたはＣ末端側のアミノ酸を認識し、結合に遊離のグリシンアミドを必要としないことを示している。さらに、これらの結果は、配列のみに基づいて、おそらく活性化された因子ＸＩＩＩとそのチモーゲンの両方に等しく充分にＭＡｂ３０９が結合することを示している。

他のタンパク質と比較して因子ＸＩＩＩに対するＭＡｂ３０９の結合特異性を試験するために、全ヒト血小板を用いた免疫プロッティング実験を行った。この実験では、貯蔵ヒト血小板を富血小板血漿から分別遠心分離によって単離し、洗浄した。次に血小板をＳＤＳおよび還元剤と混合し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ＰＶＤＦ−ニトロセルロースへの電気泳動的な転写の後、ＭＡｂ３０９をプローブとして免疫プロッティングを行った。免疫プロットは因子ＸＩＩＩのＡ鎖車量体に対応する〜７５０００Ｍｒの単一バンドにＭＡｂ３０９が結合することを示した。精製された血漿因子ＸＩＩＩと、可溶化し、電気泳動したヒト血小板を用いたこれらの実験は、因子ＸＩＩＩのＡ鎖に対するＭＡｂ３０９の結合特異性を確認するものである。

Ｍａｂ３０９の結合親和性ＭＡｂ３０９の結合親和性を評価するために、Ｔｅ３−ペプチドを用いる平衡飽和結合実験を行った。因子ＸＩ工Ｉに関する抗体の結合親和性の見積もりを混乱させ得る因子ＸＩＩＩの不完全なトロンビン切断、考え得る第２部位のトロンビン切断、Ｂ鎖のモル過剰などといった潜在的な困難を回避するために、ペプチド結合親和性を因子ＸＩＩＩ結合親和性の見積もりとして選択した。これらの実験ではＭＡｂ３０９を希釈してＫｄ未渦の濃度にした。次に抗体を様々な濃度の配位子と共に４℃で終夜インキュベートした。冷たい緩衝液で洗浄した後、ポリクローナルヤギ抗マウス抗体との結合によって、ＭＡｂ３０９に結合している配位子を遊離の配位子から分離した。次にこれらの結合実験をＬＩＧＡＮＤプログラムを用いる非線形最小二乗分析にかけた。これらの実験で、ＭＡｂ３０９が１，７５±０．３５Ｘ１０’Ｍ−１の親和性を持つことがわかった。

血漿中の因子ＸＩＩＩトランスグルタミナーゼ活性に対するＭＡｂ３０９の効果ＭＡｂ３０９がトロンビン活性化部位で因子ＸＩＩＩチモーゲンに結合したので、それがトロンビンによる因子ＸＩＩＩの活性化を阻害するがもしれないという仮説を立てた。これを試験するために、ローランドが最初に記述した検定法の改良法を用いて血漿試料中の因子ＸＩＩＩ活性を測定した。この検定法ではＭＡｂ３０９と対照抗体を、カゼインへのｌ４ｃｍプトレシンの因子ＸＩＩＩ触媒に対するそれらの効果について比較した。因子ＸＩＩＩをＭＡｂ３０９と予備インキュベートした場合には因子ＸＩＩＩ活性の９９％が阻害された。Ｆａｂ３０９もトロンビンによる因子ＸＩＩＩの切断を阻害し、完全なＭＡｂ３０９による因子ＸＩエエの免疫沈降の可能性を排除した。様々な濃度の異なるトロンビン阻害剤（ＰＰＡＣＫ、ＴＬＣＫ）は有意に異なる結果を示さなかった。

進境溶解に対するＭＡｂ３０９の効果血漿因子ＸＩＩＩにとって最も重要な天然の基質はフィブリノーゲンである。フィブリノーゲンの存在下では因子ＸＩＩＩの活性化の進行が異なるということも知られている。同様にフィブリノーゲンに対する因子ＸＩ工Ｉの結合はトロンビン切断部位に対するＭＡｂの結合を阻害するかもしれない。凝固の間の生理学的な因子ＸＩＩＩ活性に対する本抗体の効果を決定するために、ＭＡｂ３０９または対照抗体の存在下で形成させた進境を分析した。トロンビンおよびカルシウムと共に胎盤因子ＸＩＩＩをインキュベートした後、因子ＸＩＩＩフィブリノーゲンを添加すると対照試料中で７−γ架橋が起こった。しかし因子ＸＩＩＩをＭＡｂ３０９と共に予備インキュベートすると、フィブリンのγ−γ二量体の形成が防止された。このようにＭＡｂ３０９は、小さい基質と大きい基質（フィブリン）の両方に対する因子ＸＩＩＩの触媒活性を阻害した。

先の実験は精製した試薬を用いてＭＡｂ３０９が因子ＸＩＩＩを阻害することを立証した。血漿中でのその効果を調べるために、進境溶解に対する上記ＭＡｂの効果を研究した。血栓溶解療法はフィブリンγ−γ鎖とα−α架橋の量に依存することが示された。これらの検定では放射線ラベルしたフィブリノーゲンと混合しておいた血漿にＭＡｂ３０９を加えるか、もしくは抗体を加えなかった。次に３７℃で３０分間再石灰化することによって血漿を凝固させた。次に組織プラスミノーゲン活性化因子（５１Ｕ）を各チューブに加え、進境溶解の量を時間の関数として決定した。ｔＰＡ添加の３０分後にＭＡｂ３０９を伴わない対照が５１％であったのに対してＭＡｂを有する進境は８３％の溶解を示した。さらにｔＰＡの６０分後では、対照が７１％であったのに対してＭＡｂ３０９を伴う進境試料は９１％の溶解を示した。

モノクローナル抗体３０９は因子ＸＩＩＩのトロンビン切断を阻害するモノクローナル抗体３０９はある意味では因子ＸＩＩＩのトロンビン活性化を阻害するために誘導された。これがその阻害作用機序であることを立証するために、因子ＸＩＩＩのトロンビン切断速度に対するＭＡｂ３０９または対照抗体の効果を研究した。ＭＡｂ３０９または対照の存在下で因子ＸＩＩＩを様々な時間活性化した。活性化された因子ＸＩＩＩを活性化後の因子ＸＩＩＩの移動度の変化（即ち免疫プロット上で８５０００から８１０００へのＭＷ減少）によって検出した。トロンビンおよびカルシウム処理の１０．１５および２０分後に、対照中（抗ジグオキシンＭＡｂの場合）では因子ＸＩＩＩ（Ａ２Ｂｚ）が活性化されたが、ＭＡｂ３０９の場合はＡ、Ｂ、が活性化されなかった。対照では因子ＸＩＩＩの活性化の過程でトロンビンが４ｋＤａペプチドを切断したが、ＭＡｂ３０９の場合はトロンビンとカルシウム効果の５．１０．１５および２０分後にＡ鎖が変化していなかった。それぞれＭＡｂ３０９が、因子ＸＩＩＩの活性化を阻害し、Ａ、Ｂ、からの活性化ペプチドの放出を保護したことになる。

ＭＡｂ３０９に関する考察ＭＡｂ３０９は因子ＸＩＩＩ　Ａサブユニットのトロンビン活性化配列を模倣するペプチドに対して開発されたものである。因子ＸＩＩＩとその活性型因子ＸＩＩＩａに対するその機能的効果を立証するために、小さい基質を用いる因子ＸＩＩＩ検定法（ローランド検定法）と天然の基質フィブリンを用いる因子ＸＩＩＩ検定法でＭＡｂ３０９を試験した。

ＭＡｂ３０９と共に予備インキュベートしたところ、血漿因子ＸＩＩＩのトロンビン活性化が９９％阻害された。ＭＡｂ３０９は、チモーゲンを活性化する４ｋＤａペプチドのトロンビン切断を阻害することによって、因子ＸＩＩＩの活性化を防止した。その結果、ＭＡｂ３０９は血漿の凝固過程におけるフィブリンチー二量体の形成を阻害し、血漿進境の溶解を促進した。

ローランドら、Ｉｎ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈａｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　５：２４５−２９０（１９W ０）は因子ＸＩＩＩの既得の阻害剤を３種類に分類した。Ｉ型阻害剤は、トランスアミダーゼ活性を阻害することなく、因子ＸＩＩＩの因子ＸＩＩＩａへの変換を選択的に妨害する。ＩＩ型阻害剤はフィブリンに結合し、フィブリンが因子ＸＩＩＩａと適切に反応することを防止するものであり、ＩＩＩ型阻害剤は因子ＸＩＩＩａのフィブリン安定化活性に影響を与えるものである。モノクローナル抗体３０９はＩ型阻害剤に属する。

本明細書の開示は、因子ＸＩＩＩのトロンビン切断を阻害する、因子ＸＩＩＩのＡ鎖に対するモノクローナル抗体を初めて報告するものである。血栓溶解療法はそのような阻害剤を必要としている。さらにこれらの因子ＸＩＩＩ阻害剤は、他の凝固因子の阻害剤、より一般的にはあらゆる前駆体タンパク質の阻害剤を作成するための原型として役立つものである。

活性な因子ＸＩＩＩに特異的な抗体因子ＸＩＩＩの活性型のみに結合し、因子ＸＩＩエチモーゲンには結合しない代表的なモノクローナル抗体を作成するために、既に記述した遺伝子ペプチド免疫原（Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃ−）を用いてＭＡｂ３９４を作成した。使用した選別法により、活性な因子ＸＩＩＩのみに結合し、その前駆体チモーゲンには結合しないＭＡｂが得られた。これらのＭＡｂは、トロンビンによって切断された因子ＸＩ工Ｉの「新しい」アミノ末端に相当する活性化ペプチド（Ｇ−Ｖ −Ｎ−Ｌ−Ｒ−Ｅ−Ｆ−Ｃ）に対して高い親和性（２，３±０．４　Ｘ　１０１Ｍ−１）で結合する。代表的なＭＡｂについて図１に示すように、これらのＭＡｂは因子ＸＩＩＩチモーゲンの配列を表すペプチド（Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ− Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃ］、：は結合シナイテアロウ。コレラノＭＡｂは因子ＸＩＩＩチモーゲンには結合しないが、トロンビンによって切断されたタンパク質には結合するであろう。これらＭＡｂの精妙な結合特異性ゆえに、これらのＭＡｂは活性化された因子ＸＩＩＩをインビトロおよびインビボの両方で検出するための試薬として有用である。

！−匹ＭＡｂ３０９は１９９１年３月１１日にアメリカ合衆国２０８５２メリーランド、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１番のＡＴＣＣに寄託された。

この寄託はブダペスト条約の要求を満たすように変更されている。ＭＡｂ３０９はＡＴＣＣ指定番号ＨＢ１０７０２を与えらている。

ＭＡｂ３９４はブダペスト条約に基づいて１９９２年３月６日にアメリカ合衆国２０８５２メリーランド、ロックビル、バークローン・ドライブ１２３０１番のＡＴＣＣに寄託された。ＭＡｂ３９４にはＡＴＣＣの指定番号ＨＢ１０９８１が与えられている。

上述した本発明の実施方法の改良法であって、医学、免疫学、ハイブリドーマ技術、薬学および／または関連する分野の当業者にとって自明であるようなものは、後述の請求の範囲に包含されるものとする。

本明細書で言及したすべての刊行物と特許出願は本発明が関係する分野の当業者の技術水準を示すものである。すべての刊行物と特許出願は、参考文献とすることを特に個別に明示した各刊行物または特許出願と同等に、参考文献として本明細書の一部を構成するものである。

明確に理解してもらうために例証および例示を目的として上述の発明をある程度詳細に記述したが、添付の請求の範囲内でいくらかの変化や改変を実施し得ることは明らかであろう。また、この発明には多くの応用が存在し、その一部を本明細書に記述した。他の応用は当業者には容易に明らかになるであろう。

微生物（寄託機関の名称）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（寄託機関の住所）アメリカ合衆国２０８５２メリーランドロツクビル、バークローン・ドライブ１２３０１番（寄託日）　（受託番号）１９９１年　３月１１日　ＨＢ１０７０２（追加表示）マウス・ハイブリドーマ細胞、ＭＡｂ３０９微生物（寄託機関の名称）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（寄託機関の住所）アメリカ合衆国２０８５２メリーランドロツクビル、バークローン・ドライブ１２３０１番（寄託日）　（受託番号）１９９２年　３月６日　ＨＢ１０９８１（追加表示）マウス・ハイブリドーマ細胞、ＭＡｂ３９４ＭＡｂ３９４の結合特異性阻害剤ペプチドの濃度国際調査報告フロントページの続き（７２）発明者　リード、ガイ・エルアメリカ合衆国マサチューセッツ０１８９０、ウィンチェスタ−、パイン・ストリート３０番（７２）発明者　マツエダ、ガリー・アールアメリカ合衆国ニューシャーシー０８５４０、プリンストン、パルコート・ドライブ１３７番（７２）発明者　ハーバ−、エドガーアメリカ合衆国ニューハンプシャー０３２６８、サリスバリー、サウス・ロード、ボックス１６１番

Claims

【特許請求の範囲】１．前駆体タンパク質の活性化、前駆体タンパク質の活性型もしくはその両方を阻害することができる阻害剤であって、該前駆体タンパク質の切断部位もしくはその部位に空間的に密接に関連する部位に結合することができる阻害剤。２．該前駆体タンパク質がチモーゲンである請求項１の阻害剤。３．該チモーゲンが凝固因子である請求項２の阻害剤。４．該凝固因子が因子ＶＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩＩＩ、プロトロンビン、フィブリノーゲン、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩおよびプロテインＣからなる群から選択される請求項３の阻害剤。５．該凝固因子がヒトの因子ＸＩＩＩである請求項４の阻害剤。６．該阻害剤がタンパク質である請求項１の阻害剤。７．該タンパク質が抗体である請求項６の阻害剤。８．該抗体がモノクローナル抗体である請求項７の阻害剤。９．該モノクローナル抗体が前駆体タンパク質の切断部位のアミノ酸配列を模倣するペプチドに対して生ぜしめたモノクローナル抗体である請求項８の阻害剤。１０．該モノクローナル抗体を切断部位のアミノ末端側またはカルボキシ末端側のアミノ酸配列を模倣するペプチドに対して生ぜしめる請求項８の阻害剤。１１．該前駆体タンパク質がチモーゲンである請求項９または請求項１０の阻害剤。１２．該チモーゲンが凝固因子である請求項１１の阻害剤。１３．該凝固因子が因子ＶＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩＩＩ、プロトロンビン、フィブリノーゲン、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩおよびプロテインＣからなる群から選択される請求項１２の阻害剤。１４．該凝固因子がヒトの因子ＸＩＩＩである請求項１３の阻害剤。１５．該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体３０９である請求項１４の阻害剤。１６．前駆体タンパク質の活性化、前駆体タンパク質の活性型もしくはその両方を阻害することができる阻害剤を生じさせる際に有用なペプチドであって、該阻害剤が該前駆体タンパク質の切断部位もしくはその部位に空間的に密接に関連する部位に結合できることを特徴とするペプチド。１７．該ペプチドが前駆体タンパク質の切断部位のアミノ酸配列を模倣するものである請求項１６のペプチド。１８．該ペプチドが５〜２０アミノ酸の長さを有する請求項１７のペプチド。１９．該前駆体タンパク質がチモーゲンである請求項１６のペプチド。２０．該チモーゲンが凝固因子である請求項１９のペプチド。２１．該凝固因子が因子ＶＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩＩＩ、プロトロンビン、フィブリノーゲン、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩおよびプロテインＣからなる群から選択される請求項１９のペプチド。２２．該凝固因子が因子ＸＩＩＩである請求項２１のペプチド。２３．該配列が因子ＸＩＩＩのトロンビン活性化部位である請求項２２のペプチド。２４．下記の式で示されるペプチドからなる群から選択される請求項２３のペプチド：（１）Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃ−ＣＯ−Ｒ１［ここにＧはｇｌｙを表し、Ｖはｖａｌを表し、Ｎはａｓｎを表し、ＬはＩｅｕを表し、Ｑはｇｌｎを表し、Ｅはｇｌｕを表し、Ｆはｐｈｅを表し、Ｃはｃｙｓを表し、Ｒ１はＲ２、−ｌｙｓ−ＣＯ−Ｒ２、−ｌｙｓ−ａｒｇ−ＣＯ−Ｒ２、または−ｌｙｓ− ａｒｇ−ｇｌｕ−ＣＯ−Ｒ２を表し、Ｒ２は−ｃｙｓ−ＣＯ−Ｒ３、ＯＨ、ＯＭまたはＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ３はＯＨ、ＯＭまたはＮＲ４Ｒ５を表し、Ｍは医薬的に許容されるカチオンもしくは低級（Ｃ１〜Ｃ６）分枝または非分枝アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一もしくは異なり、Ｈまたは低級アルキル基からなる群から選択される］（２）上記ペプチドの酸付加塩、および（３）上記ペプチドの機能的誘導体。２５．Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃ−ＣＨまたはその機能的誘導体である請求項２４のペプチド。２６．該配列が因子ＸＩＩＩの切断部位のアミノ末端側のアミノ酸配列である請求項２２のペプチド。２７．下記の式で示されるペプチドからなる群から選択される請求項２６のペプチド：Ｈ２Ｎ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−ＣＯ−Ｒ′［ここにＰはｐｒｏを表し、Ｒはａｒｇを表し、Ｇはｇｌｙを表し、Ｖはｖａｌを表し、Ｎはａｓｐを表し、Ｅはｇｌｕを表し、Ｑはｇｌｎを表し、Ｆはｐｈｅを表し、Ｒ′はＲ２、−ｌｙｓ−ＣＯ−Ｒ２、−ｌｙｓ−ａｒｇ−ＣＯ−Ｒ２または−ｌｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ＣＯ−Ｒ２を表し、Ｒ２は−ｃｙｓ−ＣＯ−Ｒ３、ＯＨ、ＯＭまたはＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ３はＯＨ、ＯＭまたはＮＲ４Ｒ５を表し、Ｍは医薬的に許容されるカチオンもしくは低級（Ｃ１〜Ｃ６）分枝または非分枝アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一もしくは異なり、Ｈまたは低級アルキル基からなる群から選択される］（２）上記ペプチドの酸付加塩、および（３）上記ペプチドの機能的誘導体。２８．Ｈ２Ｎ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−ＣＨまたはその機能的誘導体である請求項２７のペプチド。２９．さらにキーホール・リムペット・ヘモシアニンを含む請求項２４または請求項２７のペプチド。３０．医学的障害を伴う患者を治療する手段として前駆体タンパク質の活性化もしくは前駆体タンパク質の活性型を阻害する方法であって、該患者に阻害剤の治療的有効量を投与することからなり、該阻害剤が該前駆体タンパク質の切断部位もしくはその近傍に結合することができることを特徴とする方法。３１．該医学的障害が心筋梗塞または血塊であり、該阻害剤が血液凝固因子を阻害することができる請求項３０の方法。３２．該凝固因子が因子ＶＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩＩＩ、プロトロンビン、フィブリノーゲン、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩおよびプロテインＣからなる群から選択される請求項３１の方法。３３．該凝固因子が因子ＸＩＩＩである請求項３２の方法。３４．該阻害剤が抗因子ＸＩＩＩ抗体である請求項３３の方法。３５．該抗体がモノクローナル抗体である請求項３４の方法。３６．活性化の間にトロンビンによって切断される因子ＸＩＩＩの切断部位を模倣する合成ペプチドに対して該モノクローナル抗体を生ぜしめる請求項３５の方法。３７．該ペプチドが下記の配列からなる請求項３６の方法：Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ｖ−Ｎ −Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃ−ＣＯＯＨ［ここにＧはｇｌｙを表し、Ｖはｖａｌを表し、Ｎはａｓｎを表し、Ｌはｌｅｕを表し、Ｑはｇｌｎを表し、Ｅはｇｌｕを表し、Ｆはｐｈｅを表し、Ｃはｃｙｓを表す］。３８．因子ＸＩＩＩの切断部位のアミノ末端側のアミノ酸配列を模倣する合成ペプチドに対して該モノクローナル抗体を生ぜしめる請求項３５の方法。３９．該ペプチドが下記の配列からなる請求項３８の方法：Ｈ２Ｎ−Ｘ−Ｐ−Ｒ −Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｘ−ＣＨ［ここにＸはこの配列を伸長させてもよいことを意味し、Ｐはｐｒｏを表し、Ｒはａｒｇを表し、Ｇはｇｌｙを表し、Ｖはｖａｌを表し、Ｎはａｓｐを表し、Ｅはｇｌｕを表し、Ｑはｇｌｕを表し、Ｆはｐｈｅを表す］。４０．さらに血栓溶解剤の治療的有効量を同時投与することからなる請求項３２から請求項３９までのいずれかの方法。４１．凝固因子の活性を阻害することができるモノクローナル抗体。４２．該凝固因子が因子ＶＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩ、因子ＸＩＩ、因子ＸＩＩＩ、プロトロンビン、フィブリノーゲン、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩおよびプロテインＣからなる群から選択される請求項４１のモノクローナル抗体。４３．該抗体が因子ＸＩＩＩに特異的であり、該抗体が因子ＸＩＩＩの活性を阻害することができる請求項４２のモノクローナル抗体。４４．活性化の間にトロンビンによって切断される因子ＸＩＩＩの切断部位を模倣する合成ペプチドに対して該抗体を生ぜしめる請求項４３の抗体。４５．該モノクローナル抗体がＡＴＣＣに指定番号ＨＢ１０７０２として寄託されているモノクローナル抗体３０９である請求項４４のモノクローナル抗体。４６．前駆体タンパク質の活性化、前駆体タンパク質の活性型もしくはその両方を阻害することができ、かつ、該前駆体タンパク質の切断部位またはその近傍に結合することができるモノクローナル抗体を生産する方法であって、下記の段階からなる方法：（ａ）前駆体タンパク賃上の切断部位を同定し、（ｂ）該切断部位もしくは該切断部位に空間的に密接に関連する部位を模倣するペプチドを用意し、（ｃ）該ペプチドに対して免疫化した体細胞系を得、（ｄ）段階（ｃ）の該体細胞を融合で第２の細胞系と組み合わせることによって該前駆体タンパク質に対して特異的な抗体を分泌することができるハイブリドーマを作成し、（ｅ）該ハイプリドーマを培養し、（ｆ）該前駆体タンパク質に対して特異的な分泌された抗体を単離する。４７．該体細胞系が脾臓細胞からなる請求項４６の方法。４８．該脾臓細胞がマウス脾臓細胞である請求項４７の方法。４９．該第２の細胞系が悪性細胞からなる細胞系である請求項４８の方法。５０．１またはそれ以上の容器を入れてしっかりと固定するために区画された担体からなる前駆体タンパク質の検出用キットであって、該容器が該前駆体タンパク質に特異的で検出可能にラベルされたモノクローナル抗体を含むキット。５１．該前駆体タンパク質が因子ＸＩＩＩである請求項５０のキット。５２．該キットが、該因子ＸＩＩＩと反応する未結合の、もしくは担体に結合した、第２のモノクローナル抗体を含有する第２の容器をも含む請求項５１のキット。５３．（１）因子ＸＩＩＩ阻害分子の治療的有効量を含有する第１の容器、および、（２）血栓溶解剤の治療的有効量を含有する第２の容器、を含む２またはそれ以上の容器手段を入れてしっかりと固定するために区画されている、請求項４０の方法を実施する際に有用なキット。５４．該因子ＸＩＩＩ阻害分子が抗因子ＸＩＩＩモノクローナル抗体である請求項５３のキット。５５．該モノクローナル抗体がＡＴＣＣに指定番号ＨＢ１０７０２として寄託されているモノクローナル抗体３０９である請求項５４のキット。５６．活性な因子ＸＩＩＩに結合することができるモノクローナル抗体。５７．該抗体がＡＴＣＣ指定番号ＨＢ１０９８１を有するＭＡｂ３９４である請求項５６の抗体。５８．１またはそれ以上の容器を入れてしっかりと固定するために区画された担体からなる活性な因子ＸＩＩＩを検出するためのキットであって、該容器が該活性な因子ＸＩＩＩに特異的で検出可能にラベルされたモノクローナル抗体を含むキット。５９．該モノクローナルがＡＴＣＣに指定番号ＨＢ１０９８１として寄託されているモノクローナル抗体３９４である請求項５８のキット。６０．試料中の活性な因子ＸＩＩＩを検出するための免疫検定法であって、活性な因子ＸＩＩＩを含有すると疑われる試料を活性な因子ＸＩＩＩに特異的なモノクローナル抗体と接触させ、該抗体が該因子ＸＩＩＩに結合するかどうかを検出することからなる方法。６１．該免疫検定法が競争的免疫検定性、免疫原性免疫検定性またはサンドイッチ免疫検定法である請求項６０の免疫検定法。６２．活性な因子ＸＩＩＩに結合することができるモノクローナル抗体を生産する方法であって、下記の段階からなる方法：（ａ）活性な因子ＸＩＩＩのアミノ酸配列の少なくとも一部に相当するペプチドを用意し、（ｂ）該ペプチドに対して免疫化した体細胞系を得、（ｃ）段階（ｂ）の該体細胞を融合で第２の細胞系と組み合わせることによって該因子ＸＩＩＩに対して特異的な抗体を分泌することができるハイブリドーマを作成し、（ｄ）該ハイプリドーマを培養し、（ｅ）該因子ＸＩＩＩに対して特異的な分泌された抗体を単離する。６３．該ペプチドがトロンビンによって切断される因子ＸＩＩＩのアミノ末端に相当する請求項６２の方法。６４．該ペプチドがアミノ酸配列Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｅ−Ｆ−Ｃで表される請求項６２の方法。