JPS63225400A - フイブリン特異性抗体、モノクロナール抗体の取得法及びフイブリンの測定法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ　−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅ　ｔと特異的に結合性でフィブリン
とフィブリノーゲンとを区別する抗体並びにその製法、
その適用及び該抗体を含有する試薬に関する。

従来技術 フィブリンはフィブリノーゲンから凝固工程の経過に訃
いて生じる。蛋白質分解酵素、例えばトロンビンは可溶
団血漿蛋白質フィブリノーダンから血管内又は血管外ペ
プチドを切断分離する。その際フィブリンモノマーが生
じる。多くのフィブリンモノマーは集まってフィブリン
ポリマー、フィブリン凝集物となる。このことが血管内
でおこると破壊的々結果に導ひく。消費凝固障害症とも
言われる、播種性血管向凝固を有する患者においては、
循環崩液中に溶解性フィブリンが生じる。毛細面前及び
小血管中でこのフィブリンは集まって、光線顕微鏡及び
電子顕微鏡によシ検出司能なフィブリン索を形成する（
　Ｍｔｉｌｌｅｒ−Ｂｅｒｇｈａｕｓ、Ｇ著、Ｓｅｍ１
ｎａｒｓ　ｉｎＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍ
ｏｓｔａ日１日第６巻；第２０９〜２４６頁、１９７７
年参照）。炎症性の疾患においてもフイブリノーゲンか
ら３導される物質を組織中で面前内又は面前外に検出す
ることができる。

加液、血漿又は組織中のフィブリン全判異的に検出する
ことができることが望まれている。

フィブリンはフイブリノーゲンから請導され、かつフィ
ブリノペプチドの欠損という点においてのみフイブリノ
ーゲンとは異なっているので、少し前までは、フィブリ
ンの検出のための定性分析法のみがあった。定性的又は
半定量的方法は例えばエタノール（Ｈ，Ｃ！、Ｇｏｄａ
ｌ　、Ｕ、Ａｂｉ１ｇａａｒｄ著、５ｃａｎｃＬ、、Ｔ
　、Ｈａｅｍａｔｏｌ、第３巻：第３４２〜６５０頁、
１９６６年）、プロタミンスルフニー　ト　（Ｐｒｏｔ
ａｍｉｎｓｕｌｆａｔ　　　：　　　Ｓ、Ｎｉｅｗｉａ
ｒｏｗｓｋｉ　　、Ｖ、ＧｕｒｅＷｉＣｈ著１．Ｔ　、
Ｌａｂ、Ｃ１１ｎ、Ｍｅｄ　、第７７巻：第６６５〜６
７６頁、１９７１年）の添加又は積層した赤崩球又はラ
テックス粒子の凝集反応（Ｒ，Ｌａｒｇｏ、　　Ｖ、Ｈ
ｅ１ｌｅｒ、　Ｐ、Ｗ、５ｔｒａｕ’ｂ著、Ｂｌｏｏｄ
第４７巻：第９９１〜１００２頁、１９７６年）による
沈殿に起因する。この記載した方法はフィブリンとフィ
ブリノ−ダンとを区別することができない。他の方法は
フィブリンをフイブリノーゲンからクロマトグラフィー
によシ分離することをこころみている（　Ｎ、Ａｌｋｊ
ａｅｒａｉｇ、　Ａ−Ｆｌｅｔｃｈｅｒ　、　Ｒ−Ｂｕ
ｒｓｔｅｉｎ著、Ａｍ、、Ｔ−Ｏｂｓｔｅｔ。

Ｇｙｎｅｃｏｌ、第１２２巻：第１９９〜２０９頁、１
９７５年；　Ｄ、Ｌ、’Ｈｅｅｎｅ、Ｆ、Ｒ，Ｍａｔｔ
ｈｉａｓ著、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、第２巻：　１３７
〜１５４頁、１９７６年）。フィブリンがフィブリノー
ゲンから完全に分離されないので、これらの方法も特異
的ではない。フィブリンを溶解して保持するためにはフ
イブリノーゲンが必要である（　　Ｗ、Ｋｒｅｌｌ　　
、　　　工、Ｍａｈｎ　　、　　　Ｇ、Ｍｔｉｌｌｅｒ
−Ｂｅｒｇｈａｕｓ　　著、ＴｈｒｏｍｌＲｅｓ、第１
４巻：４２９９〜３１０頁、１９７９年）。

精製したシステム中でフィブリンをフィブリノーゲンか
ら区別する、もう１つの方法はＮ−末端グリシンの測定
である（　Ｐ、Ｋｉｅｒｕｌｆ　、、Ｈ，Ｏ。

ＧＯｄａｌ著、５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、、
第９巻：第３７０〜６７２頁、１９７２年）。しかしな
がら、この方法は複雑であシ、かつ多量の出発物質が必
要であるので、テストとして実施することができない。

フィブリンと特異的に反応するが、フイブリノーゲンと
は反応しないモノクロナール抗体を使用する、フィブリ
ンの定性的及び定量的測定法がヨーロッパ特許第０１５
２’６１２号明細書から公知である。これらの抗体はフ
ィブリンのα−鎖の末端基のアミノ酸配列に相応するペ
プチドを免疫原として使用することにより得られる。し
かしながら、このためには２種の異なる、フィブリンと
特異的に結合性の抗体が必要であるので、この抗体では
十分に正確な検出法をイムノアッセイの原理によシ実施
することはできない。

イムノアッセイの原理による測定法は広く知られている
。この測定法の利点はその精確さと、非常に僅かな】の
物質を検出することができるという可能性である。測定
の実施のためには均質層でも不均質層でも個々の変法が
可能である。

不均質層での実施形においてはレセプターの１、踵を相
体に結合する。

サン１ζウイツチ法においては、例えばレセプターを担
体に結合し、試験溶液を加え、この際試験溶液中に含有
される、測定すべき抗原がレセプターに結合する。次い
で抗原又は抗原抗体複合体と特異的に反応する、標識付
はレセプタ−’を添加する。次いで、標識付は抗体を介
して抗原のＩを計算する。この一般的な原理に関しては
多くの変法の可能性がある。こうして、例えば３ａ！の
レセプターを用いる測定が行なわれ、この際３種のレセ
プターの１ｓが不均質層で存在し、他の２ｍのレセプタ
ーは溶解法であシ、この両方の溶解性のレセプターの１
種は標識されてお９、他方は標識されていない。次いで
、不溶性のレセプターは非標識溶解性レセプターに向け
られている。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、特に非常に僅か彦量のフィブリンの検
出を可能とし、非常に精確に実施することができ、判に
同様に存在するフイブリノーゲン又はその他の人体の崩
液、血漿又は組織中に存在する蛋白質が妨害することな
くフィブリンの和異的検出を可能とする、フイブリンの
判異的定性及び定量測定法を提供することである。

問題点を解決するための手段 この課題はペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ．ｅ　−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔと判異的に結合性であり、フ
ィブリンとフイブリノーゲンとを区別することができる
フィブリン特異性抗体により解決する。

実験動物の生体中に免疫原として配列Ｌｅｕ−工ｌｅ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ　ｆ含有するペプチド
を入れることによって、本発明に使用した抗体を金座 有する抗ぎ渭が得られる。これらの配列を含有する、ア
ミノＷＩ６〜２０のペプチドが有利に使用される。式Ｌ
ｅｕ−Ｉｌｅｅ−Ａｓｐ−Ｇ１ｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔのへ
キサペプチドが有利である。このヘキサペプチドを常法
で、有利に“スペーサー”群の挿入下に、このために好
適な相体ペプチドに結合する。

前記オリゴペプチドは公知法で合成される。

好適な方法は例えばＥ、テンシュ（Ｗｉｉｎｓｃｈ　）
著、ツーベン・ヴアイル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）、
１メト−テン−デル・オルガーニツシエン・ヒエミー（
Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　
Ｃｈｅｍｉｅ　）　”　、第ＸＶ／１及び２；デ・ペプ
タイズ（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、第１巻、１メジヤ
ー・メソツズ・オブ・ペプタイト・ボンド・フォーメー
ション（ＭａｊｏｒＭｅｔｈｚｄｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｌ
ｅ　Ｅｏｎｄ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）”、アカデミツク
＋１プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）、１９
７９年、又は１ルスペクテイーベス・イン嗜ペゾタイド
・ケミストリー（Ｐｒｅｅｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎ　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）”、Ａ、エバーレ
（Ｅ’ｂｅｒｌｅ　）、Ｒ，ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ　
）及びＴ。

ヴイーランド（Ｗｉｅｌａｎｃｌ　）著、Ｓ、カーデル
（Ｋａｒｇｅｒ　）、バーデル、１９８１年中に記載さ
れている。

反応に関与すべきでない官能基が好適な方法で保護され
ている、アミノ酸又はペプチド切断片を反応に使用する
。アミノ濯誘導体又はペプチド切断片の遊離のカルボキ
シル基を好適力方法で活性化し、アミノυ誘導体又は部
分保護ペプチド切断片のアミノ基と反応させる。活性化
はＤＣＣノ（ジシクロへキシルカルボジイミド）、ＤＣ
Ｃノ／　ＨＯＢｔ％　ＤＣＣノ／ヒドロキシサクシンイ
ミド、ＰＯＣノ３、クロラミン酸エステル又はアジド法
を用いて行なう、Ｃｈｅｍ、Ｂｅｒ、第１０３巻、第７
８８頁、１９７０年によるＤＣＣノ／　ＨＯＢを法を使
用するのが有利である。

部分保護オリがペプチドの合成は段階的にＣ−末端部か
ら、又は切断片結合によシ行なうことができる。例えば
ポリオキシエチレン又は架橋ポリスチロールのような可
溶性又は不溶性ポリマー担体上への段階的合成も可能で
ある。アミノ酸又はペプチド切断片のα−アミノ官能基
のための保護基としてはをブチルオキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ　）　％　フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆ’
ｍｏｃ　）　、ベンジルオキシカルボ二ル（Ｚ）、α、
α−ジメチルー３，５−ジメトキシベンジルオキシカル
ボニル、２−ビフェニリル−（４）−ソロビル−（２）
−オキシカルボニル及ヒドリチルを挙げることができる
。Ｂｏａ　、　Ｆｍｏｃ及びｚ’６使用するのが有利で
ある。

アミノ酸及びペプチド・切断片のα−カルボキシ基のた
めの保護としてはアルカノール又は芳香族脂肪族アルコ
ールでのエステル化を使用する。メチルエステル、ベン
ジルエステル及ヒｔｅｒをブチルエステルが有利である
。

使用したオリゴペプチドのＮ−末端は、蛋白質を傷つけ
ることなくペプチド−蛋白質機合体の保護基脱離が行な
われるように、担体蛋白質への結合の際に明らかな反応
進行に対して保護されていなければならがい。このため
にはアルカリ条件下に脱離されるＦｍｏｃ保護基及び比
較的緩和な酸性条件下に脱離することのできる２−（ビ
フェニル−（４）−ゾロリルー（２）−オキシカルボニ
ル−１α、α−ジメチル−３゜５−ジメトキシベンジル
オキシカルボニル−、Ｂｏａ−及びトリチル基が好適で
ある。

”スペーサー”基としては酵素の固定においても使用さ
れるような、ペプチド配列において通常使用される橋構
成員を挙げることができる。

相応する試薬は、例えば炭素原子２〜８個を有するアル
キレン基の末端に２つの同−又は異なる反応性基を有し
てお夛、この際反応性基としてはアミノ酸の官能基と共
有結合することのできるような基を挙げることができる
。好適であるのはグルタルアルデヒドのようなジアルデ
ヒド、１，６−へキサメチレンジイソシアネートのよう
なジイソシアネート、１，６−へキサメチレンジアミン
のようなジアミン又はε−アミノカプロン酸のよりなω
−アミノカルボン酸である。これらの二官能性試薬は、
場合によシ活性化の後、一方では公知法でオリプペプチ
ドと、かつ他方では担体と結合する。担体としては基本
的に任意の蛋白質を挙げることができる。交叉反応を惹
起しない担体蛋白質を選択するのが有利である。好適で
あるのは、例えば牛崩清アルブミンのようなアルブミン
又はキーホール−リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈ
ｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｓ　）のよ
うなヘモシアニンである。

このようにして得られた抗原を用いて、実験動物、例え
ばねずみ、ラッテ、兎又はヤギを公知法で免疫化し、こ
のようにしてポリクロン抗体を有する抗崩清が得られる
。有利な実施形においては、同様々方法でモノクロン抗
体ｅＧ。

ケーラー（Ｋ５ｈｌｅｒ　）及びＣ，ミルシュタイン（
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）の方法［：　Ｎａｔｕｒｅ　、第
２５６巻、第４９５〜４９７頁、１９７５年〕にょシっ
くる。

従って、ペプチド配列ＩＬ＋ｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合可能であるモノク
ロナール抗体を取得するための方法も本発明の課題であ
シ、該方法はアミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ　ｆ有するペプチドでマウスを
免疫化し、免疫化動物の脾臓からのＢ＋　＋７７２球を
骨髄腫細胞と融合し、生じた雑種細胞をクロン化し、配
列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ　−Ａ８Ｉ）−Ｇ１７−Ｌ７８−Ｍ
ｅｔと結合性のクロンを単離し、培養し、これにより形
成されたモノクロン抗体を取得する。

自体全く免疫グロブリンを生産しない細胞系を使用する
のが特に有利である。

本発明によシ得られるモノクロナール抗体はフイブリノ
ーゲンとは反応しないが、ａｅｓＡＡ−フィブリン（フ
ィブリン型り、ｄｅｓＡＡＢＢ−７・イブリン（フィブ
リン型ＩＩ）、ペプチド複合体及び合成ペゾチＦと反応
する。更に、モノクロナール抗体はフイブリノーゲン又
はフィブリンのプラスミン生産分解生成物と反応しない
。

本発明のもう１つの課題は本発明によるフィブリン特異
性抗体を用いるフイブリンの定性及び定】測定である。

配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ−Ａｓｐ−ＧＥ−ｙ−Ｌｙｓ−Ｍ
ｅｔと特異的に結合性である、本発明によるフィブリン
特異性抗体を使用する場合、フィブリンとは特異的に結
合し、フイブリノーゲンとは結合しないということが意
外にも判明した。こうして、この抗体の使用下に体液又
は体組織中のフィブリンを特異的に検出することが可能
である。

第１のレセプターＲ１は同相に存在し、フィブリンと、
又はフィブリンとレセプターとからの複合体と結合性で
あフ、フィブリンと、又はフイブリンとレセプターとか
らの複合体と結合性である他のもうＩＦｌのレセプター
Ｒ２は水相中に溶解して存在してｊ？シ、かつこの際レ
セプターＲ２は標識を有している、そのような少なくと
も２種の異なるレセプターと共に恒温保持し、液相から
固相を分離し、該相の一方の標識を測定することにより
、イムノアツセイの原理によ・シ、本発明のフィブリン
特異性抗体を使用してフイブリンを選択的に測定するた
めの方法において、レセプターの１種としてペプチド配
列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ　−Ａｓｐ−１１ｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅ
ｔと特異的に結合性であり、フイブリンとフイブリノー
ゲンとを区別するフィブリン特異性抗体を使用すること
を特徴とするフィブリンの測定法が得られる。

この方法を実施するためには少なくとも二種の異なるレ
セプターを使用する。これらのレセツターの１つはペプ
チド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ−Ａｅｐ−Ｇｌｙ−Ｌ７θ−
Ｍｅｔと特異的に結合性である。少なくとも１種の他の
抗体は同様にフィブリンと、又はフィブリンとレセプタ
ーとからの複合体と結合性でなければならない。ここで
はフイプリント非峙異的に結合し、フィブリノーゲンと
も結合する抗体を使用することもできる。しかしながら
、例えばヨーロッパ判許公開第０１５２６１２号公報か
ら公知であるフイブリンと特異的に結合性であるレセプ
ターを使用することが有利である。

両方のレセプターの１力は固相に結合している。固相へ
の結合は自体公知法で行なわれ、専門家に公知である。

更に、溶解した形で存在する、少なくとも１つの他のレ
セプターを使用する。この少なくとも１つの他のレセプ
ターは標識を有する。多くの他のレセプターＲ２ｔ’使
用する場合、これらのレセプターの１′ｓのみが標識を
有する。し化ブタ−の標識は常法で行なわれ、専門家に
公知である。

標識は自体公知法で有利に放射性化合物、酵素、化学発
光性又は螢光性化合物によシ行なわれる。酵素での標識
、特にベルオギシダーゼ又はホスファターゼでの標識が
鉤に有利である。

方法の判に有利彦実施形においてはフィブリンと非特異
的に結合性のレセプター又は有利にフィブリンと特異的
に結合性のレセプターが固相に結合している。この固相
に結合したレセプターを、引き続き測定すべきフィブリ
ンを含有する溶液と、及びペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ
ｅ−Ａｅｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性
であり、溶けた形で存在し、かつ標ｖｊ１．ヲ有する抗
体と共に恒温保持する。固相に結合したレセプターはフ
ィブリンと非特異的に結合性であるので、固相にはフィ
ブリン分子だけでなく、フィブリノーゲン分子も積層す
る。ペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性である第２の抗体はフ
ィブリンにのみ積層するので、フィブリン分子のみが標
識抗体ヲ峙異的に有し、一方フイプリノーデン分子は標
識されない。このようにして、液相から固相を分離した
後、標識の測定を介してフィブリンの含量を測定するこ
とが可能である。

固相に結合するレセプターとして、例えばヨーロッパ特
許公開第０１５２６１２号公報から公知の、フ−（ｆ　
！Ｊンと特異的に結合性のレセプターを使用する場合、
フィブリンのみが固相に特異的に結合し、かつ溶解性抗
体と共に恒温保持する際に、これも再びフィブリンと特
異的に反応する。こうして、固相へのフィブリノーゲン
の結合は実質的に全く起こらないので、この方法は更に
特異的であシ、非常に正確な測定を行なうことができる
。

本発明による方法の、もう１つの物に有利な実施形にお
いては、ペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ　−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔに対して特異的に結合性の抗体を
担体上に固定する。次いで、この固定抗体と共に、測定
すべきフィブリンを含有する溶液及びフィブリンと結合
性のレセプター、特に）・ｆプリンと特異的に結合性の
レセプターと恒温保持する。この際、固相に実質的にフ
ィブリンのみが結合し、フィブリノーゲンは溶液中に残
る。

更に、標識付けした、可溶性の、フィブリンと結合性の
抗体がフィブリンに積層する。液相から固相を分離した
後、再び標識を介してフィブリンの含量が非常に正確に
測定される。

三種のレセプターを用いる専門家に公知のその他の変法
は同様にペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅθ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性の抗体を使用して
可能であり、このための詳細な説明は必要ない。

本発明による方法を実施するために使用する抗体の少な
くともｉ　、ｍがモノクロナール抗体であるのが有利で
ある。レセプターとしてモノクロン抗体のみを使用する
のが竹に有利である。

本発明のもう１つの課題はフィブリン、又はフィブリン
とレセプターとからの複合体と結合性である、固相に結
合するレセプターＲ１及びフィブリン、又はフィブリン
とレセプターとからの複合体と結合性である、可溶性用
に存在する少なくとも１種のレセプターＲ２を含有し、
かつこの際可溶性のレセプターＲ２は標識を有する、フ
ィブリンを選択的に測定するための試薬であシ、これは
レセプターの１１がペプチド記列Ｌｅｕ−工］、ｅ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合すること
を特命とする。

ペノチＦ配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性の抗体は固相に結合して存
在していてもよいし、可溶性の標識又は未標識レセプタ
ーとして使用することもできる。これらの抗体がモノク
ロナール抗体であるのが有利である。

すべての使用したレセプターがモノクロナール抗体であ
るのが肴に有利である。

更に本発明によるフィブリン特異性抗体はへ崩液循環器
・系中のフィブリン及びフィブリン凝集物の定量測定に
有利に使用することができる。

本発明によるフィブリン特異性抗体、特に本発明によシ
製造したモノクロナールフィブリン特異性抗体を標識付
けし、血液循環器中に注入し、好適な処置で可視とする
ことは更に有利である。

患者に、放射性に標識付けした本発明によるフイブリン
特異性抗体を注入することが竹に有利である。抗体は血
栓に集まり、かつγ−カメラで検出することができる。

このようにして血栓の位置だけでなく、その大きさをも
知ることができる。

更に、相応する薬剤を抗体に結合することによシ、フィ
ブリン凝集物、例えば血栓を溶解することのできる薬剤
をこれらの凝集物に導びぐために、フィブリン特異性抗
体を使用することができる。溶痔性物質としては、例え
ば組織−プラスミノーゲン−賦活体、ウロキナーゼ又は
ストレプトキナーゼを使用することができる。

本発明によシ使用した抗体はフィブリノーゲンと反応し
ないので、該治療は従来の溶解治療において常に生じた
結果である崩漿フ、イブリノーｒンの明らかな減少には
導びか々い。

フィブリンと特異的に反応し、フィブリノーゲンと結合
しない抗体が本発明によフ提供される。該抗体を用いて
、血液中のフイブリンｔＷ異的に定性的及び定量的に検
出することが可能である。本発明による抗体は血液のフ
ィブリン含量に関する正確な報告を可能とし、他方では
進管中に生じ、血管閉塞に導ひく血栓を検出することを
可能とする。更に、形成された血栓を特異的に溶解する
ことを可能とする。

実施例 次に本発明を図面並びに実施例につき詳細に説明する。

第１図はトロンビンの添加によシ生じた、血漿中の可溶
性フ・ｒプリンの測定の際得られた結果を表わすグラフ
図である。トロンビンを全く添加しない対照血漿は１：
２０の希釈において、４１４　ｎｍにおける吸光度０．
０９４　を示した。

次の実施例においては次の省略形を用い九：Ａｓｐ　　
　Ｌ−アスパラで７酸 Ｅｏｃ　　　　ｔ　−７’チルオキシカルボニルＤＣＣ
ノ　　ジシクロへキシルカルボジイミドｄｅｓＡＡ−フ
ィブリン　　型Ｉ ａｅａＡＡＢＢ−フィブリン　　型ｎ ＫＬＩｌｅ３Ａ　　酵素イムノアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ
　ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａ
ｙ　）Ｆｍｏｃ　　　フルオレニルメトキシカルボニル
Ｇｌｙ　　　グリシン Ｈｏ５ｔ、　　　１−ヒＦロキシー１Ｈ−ベンゾトリア
ゾールｌＩｌｅ　　　Ｌ−イソロイシン ＫＬＥ（キーホールやリンベット　ヒョシアミンＬｅｕ
　　　Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ　　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　　Ｌ−メチオニン ＰＢ８　　　燐醪塩緩衝食塩溶液 Ｒ８Ａ　　　牛崩清アルブミン ２　　　ベンジルオキシカルボニル モノクロナール抗体の製造 例１ 担体蛋白質としてのＫＬＴ（に結合した、配列Ｌｅｕ−
Ｉｃｅ−Ａａｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ　ｆ有するペ
プチドをＰＢＢ中に溶かし、フロイント補助液と同量部
ずつ混合する。この混合吻合１００μｙを生後６〜８週
間のＢａ１ｂ　／　ｃマウスに腹腔内及び皮下注射した
。この注射を６〜４週間の間隔で２回縁シ返す。結合ペ
プチド（Ｒ８Ａ％ＫＬＨ）を用いて前記工程によシ免疫
化したマウスに、膵臓摘出３日間にＰＥＳ中に溶かした
結合ペプチド１００μｇを静脈内注射した。

免疫化したマウスの膵臓の細胞的１０８を骨髄腫細胞（
ｘ　６８−　Ｓｐ　８−６５５、全く免疫グロブリンを
合成しない系；入手Ｔｈｅ　Ｂａ１ｋ工ｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ　、　ＱｅｌＩＣ１ｓｔｒｉ’ｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎ
ｔｅｒ　。

Ｅｌａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ　９２１１２、ＵＳＡ　）
　５　ｘ　１０’とポリエチレングリコール（ＭＧ　３
４００　）の存在下に融合する。融合した細胞を、それ
ぞれ２４個の窪みを有する４枚のプレート上に播種する
。

それぞれの窪みはヒポキサンチン、アミノゾテリン及び
チミジンを含有する培養基中の、免疫化していない同系
マウスの膵臓細胞５Ｘ１０フを含有している。

これらの融合細胞（雑種細胞）１０〜１４日後ＥＬ工Ｓ
Ａを用いて、次の抗原に対するその判異性に関して試験
する：フイブリノーゲン、ｄθ５ＡＡ−フィブリン、ｄ
ｅｓＡＡＢＥ−フィブリン及び非結合ペプチド。

フィブリンに対して及び合成ペプチドに対してのみ向い
たモノクロナール抗体を得るために、その上澄がフイブ
リノーゲンに全く向いていない抗体を含有しない雑種細
胞を２回クロン化する。

モノクロナールフィブリン特異性抗体を用いる血漿中の
可溶性フィブリンの測定 例２ 血漿中の可溶性フィブリンをＥＬ工ＳＡを用いて測定す
る。このためには、ＰＢＳ中に漕げており、ＦＪ（７，
２、かつ配列Ｌｅｕ−工］−ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｍｅｔ　を有するペプチドに向いている、例１によ
う得られ九モノクロナールフィブリン鉤異性抗体を担体
としてのポリスチロール上に固定する。洗浄工程の後、
可溶性フィブリンを含有する希釈血漿を更に加える。該
血漿’ｉ　ＥＤＴＡ　５　ｍ　ｍｏｂ、ＫＡｃＡ　２　
ｆｉ　ｍｏｌ、アブロチニア２００　Ｋ／ノ及びツウイ
ーン２００．２％を含有するＰＢＳの緩衝液中で希釈す
る。この可溶性フィブリンを血漿に小量のトロンーンを
添加することによシ製造した。トロンビン処理を、血漿
が全く濁り入来 びフィブリンｉを示さないように選択する、すなわち生
じたフィブリンは可溶性フィブリンとして存在するよう
に選択する。トロンビン処理をヒルジン（血漿１ｄあた
り５単位）の添加（でよシ停止し虎。ツウイーン２００
．１％含有ＦＢＳ中での洗浄工程の後、抗体に結合した
フィブリンをポリクロナール抗体と室温で１時間恒温保
持するが、この際該ポリクロナール抗体はフィブリンと
もフイブリノーゲンとも結合し、かつホスファターゼに
結合しており、ツウイーン２００．２％を含有し、ｐＨ
７，２であるＰＢＳ中に溶解している。新たな洗浄工程
の後、ｐ−二トロフェニルホスフエー）　−シー　Ｎａ
−ヘキサヒトレートの添加によシ、モノクロナール抗体
がその中で可溶性フィブリンと反応する反応容器中の光
学密度の変化を測定する。結果を第１図に示す。

二種の異なるフィブリン特異性抗体を用いる血漿中の可
溶性フィブリンの測定 例３ ヨーロッパ特許公開第０１５２６１２号公報によシ得ら
れる、フイブリンのα−鎖アミノ末端部に対して向いて
いるフィブリン特異性抗体を、例２に記載されたように
担体に固定する。

洗浄工程の後、可溶性フィブリンを含有する血漿を、例
２と同じ条件下にモノクロナール抗体と共に恒温保持す
る。もう１回洗浄工程を行なった後、配列Ｌｅｕ−Ｉｌ
ｅｆ３−Ａ８ｐ−０１＝７−１７８−Ｍｅｔに向いてい
る、第２の本発明によるフィブリン特異性モノクロン抗
体によシ可溶性のフィブリンを検出する。この第２のフ
ィブリン特異性抗体はペルオキシダーゼ全共有結合して
有する。洗浄工程の後、ペルオキシダーゼの基質として
のＡＳＴＳを添加することによシ、光学密度の変化を測
定する。

例４ 例乙に記載したと同様に行なうが、第２のフィブリン特
異性抗体に酵素のかわフにビオチンを結合した。基質添
加の前にペルオキシダーゼ結合アビジン又はペルオキシ
ダーゼ結合ストレプタビジンを添加した。このように選
択された可溶性フィブリンの測定は全く特異的にフィブ
リンだけを測定することを可能にする。フイブリンを溶
液中に保持するために、フィブリンと結合しているフィ
ブリノ−ダンは本発明によるフィブリンの測定を妨害し
ない。

例５ 配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅ
ｔに向いている、例１によシ得られたフィブリン特異性
抗体を放射性に標識化する。この標識した抗体をトロン
ビンによシ製造した凝集物を含有する、ＰＨ８中の１％
ＢＳＡ　ｌ液に添加した。凝集物に結合した抗体のｉｌ
ヲシンチレーションカウンター中で測定した。比較のた
めに、凝集物を含有する緩衝溶液にフィブリン又はフィ
ブリノ−ダンと反応筒１図 しない、放射性に標識し光抗体を添加し虎。シンチレー
ション法の結果の比較は、本発明による抗体が凝集物に
特異的に結合し、一方対照抗体は凝集物と全く結合しな
いことを示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はトロンビンの添加によシ生じた、血漿中の可溶
性フィブリンを例２によシ測定した結果を示すグラフ因
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌ
   ｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性であり、フイブリンとフ
   イブリノーゲンとを区別するフイブリン特異性抗体。 ２、ペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌ
   ｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性であり、フイブリンとフ
   イブリノーゲンとを区別するモノクロナール抗体を取得
   するための方法において、マウスをアミノ酸配列Ｌｅｕ
   −Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔを有するペ
   プチドで免疫化した動物の脾臓からのＢ−リンパ球を骨
   髄腫細胞と融合し、生じた雑種細胞をクロン化し、配列
   Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔと結
   合性のクロンを単離し、フイブリンとフイブリノーゲン
   との区別に関して選択し、培養し、これにより形成され
   るモノクロナ−ル抗体を取得することを特徴とするモノ
   クロナール抗体の取得法。 ３、自体免疫グロブリンを全く生産しない骨髄腫細胞を
   使用する請求項２記載の方法。 ４、配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍ
   ｅｔを含有するアミノ酸６〜２０を有するペプチドがス
   ペーサーを介して結合している担体ペプチドからなる複
   合体を免疫原として使用する請求項２又は３記載の方法
   。 ５、配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍ
   ｅｔを有するペプチドがスペーサーを介して担体ペプチ
   ドに結合している複合体を免疫原として使用する請求項
   ４記載の方法。 ６、アルブミン又はヘモシアニンを担体ペプチドとして
   使用する請求項４又は５記載の方法。 ７、フイブリンを選択的に定性及び／又は定量測定する
   方法において請求項１のフイブリン特異性抗体を使用す
   るフイブリンの測定法。 ８、第１のレセプターＲ＿１は固相に存在し、フイブリ
   ンと、又はフイブリンとレセプターとからの複合体と結
   合性であり、フイブリンと、又はフイブリンとレセプタ
   ーとからの複合体と結合性である他のもう１種のレセプ
   ターＲ＿２は水相中に溶解して存在しており、かつこの
   際レセプターＲ＿２は標識を有している、そのような少
   なくとも２種の異なるレセプターと共に恒温保持し、液
   相から固相を分離し、該相の一方の標識を測定すること
   により、イムノアツセイの原理により、フイブリンを選
   択的に測定するための方法において、レセプターの１種
   としてペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
   Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性であり、フイブリンと
   フイブリノーゲンとを区別するフイブリン特異性抗体を
   使用することを特徴とするフイブリンの測定法。 ９、固相に結合する抗体としてペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉ
   ｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合
   性である抗体を使用し、かつ溶解性レセプターとして標
   識を有する、フイブリンと結合性の他の抗体を使用する
   請求項８記載の方法。 １０、固相に結合するレセプターとしてフイブリンと結
   合性のレセプターを使用し、可溶性レセプターとしてペ
   プチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
   Ｍｅｔと特異的に結合性であり、標識を有する抗体を使
   用する請求項８記載の方法。 １１、標識が放射性化合物、酵素、化学発光性又は螢光
   性化合物である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の
   方法。 １２、ペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
   Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性である抗体がモノクロ
   ナール抗体である請求項８〜１１のいずれか１項に記載
   の方法。 １３、人血液循環器系及び組織中のフイブリン及びフイ
   ブリン凝集物を定性的及び定量的に測定する方法におい
   て、請求項１による抗体を使用するフイブリンの測定法
   。 １４、ペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
   Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合性であり、かつフイブリ
   ンとフイブリノーゲンとを区別する抗体を標識し、人血
   液循環器中に注入し、該標識を好適な処置で可視とする
   請求項１３による方法。 １５、請求項１のフイブリン特異性抗体を使用し、該フ
   イブリン特異性抗体に溶解性物質を結合し、かつこの複
   合体を血液循環器系中に注入することを特徴とする血栓
   の溶解法。 １６、フイブリン、又はフイブリンとレセプターとから
   の複合体と結合性である、固相に結合するレセプターＲ
   ＿１及びフイブリン、又はフイブリンとレセプターとか
   らの複合体と結合性である、可溶性相に存在する少なく
   とも１種のレセプターＲ＿２を含有し、かつこの際可溶
   性のレセプターＲ＿２は標識を有する、フイブリンを選
   択的に定量測定するための試薬において、レセプターの
   １種がペプチド配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
   Ｌｙｓ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつフイブリンとフ
   イブリノーゲンとを区別する抗体であるフイブリンの測
   定試薬。