JPS63225400A - フイブリン特異性抗体、モノクロナール抗体の取得法及びフイブリンの測定法及び測定試薬 - Google Patents
フイブリン特異性抗体、モノクロナール抗体の取得法及びフイブリンの測定法及び測定試薬Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はペプチド配列Leu−Ilee −Asp−G
ly−Lys−Me tと特異的に結合性でフィブリン
とフィブリノーゲンとを区別する抗体並びにその製法、
その適用及び該抗体を含有する試薬に関する。
ly−Lys−Me tと特異的に結合性でフィブリン
とフィブリノーゲンとを区別する抗体並びにその製法、
その適用及び該抗体を含有する試薬に関する。
従来技術
フィブリンはフィブリノーゲンから凝固工程の経過に訃
いて生じる。蛋白質分解酵素、例えばトロンビンは可溶
団血漿蛋白質フィブリノーダンから血管内又は血管外ペ
プチドを切断分離する。その際フィブリンモノマーが生
じる。多くのフィブリンモノマーは集まってフィブリン
ポリマー、フィブリン凝集物となる。このことが血管内
でおこると破壊的々結果に導ひく。消費凝固障害症とも
言われる、播種性血管向凝固を有する患者においては、
循環崩液中に溶解性フィブリンが生じる。毛細面前及び
小血管中でこのフィブリンは集まって、光線顕微鏡及び
電子顕微鏡によシ検出司能なフィブリン索を形成する(
Mtiller−Berghaus、G著、Sem1
nars inThrombosis and Hem
osta日1日第6巻;第209〜246頁、1977
年参照)。炎症性の疾患においてもフイブリノーゲンか
ら3導される物質を組織中で面前内又は面前外に検出す
ることができる。
いて生じる。蛋白質分解酵素、例えばトロンビンは可溶
団血漿蛋白質フィブリノーダンから血管内又は血管外ペ
プチドを切断分離する。その際フィブリンモノマーが生
じる。多くのフィブリンモノマーは集まってフィブリン
ポリマー、フィブリン凝集物となる。このことが血管内
でおこると破壊的々結果に導ひく。消費凝固障害症とも
言われる、播種性血管向凝固を有する患者においては、
循環崩液中に溶解性フィブリンが生じる。毛細面前及び
小血管中でこのフィブリンは集まって、光線顕微鏡及び
電子顕微鏡によシ検出司能なフィブリン索を形成する(
Mtiller−Berghaus、G著、Sem1
nars inThrombosis and Hem
osta日1日第6巻;第209〜246頁、1977
年参照)。炎症性の疾患においてもフイブリノーゲンか
ら3導される物質を組織中で面前内又は面前外に検出す
ることができる。
加液、血漿又は組織中のフィブリン全判異的に検出する
ことができることが望まれている。
ことができることが望まれている。
フィブリンはフイブリノーゲンから請導され、かつフィ
ブリノペプチドの欠損という点においてのみフイブリノ
ーゲンとは異なっているので、少し前までは、フィブリ
ンの検出のための定性分析法のみがあった。定性的又は
半定量的方法は例えばエタノール(H,C!、Goda
l 、U、Abi1gaard著、5cancL、、T
、Haematol、第3巻:第342〜650頁、
1966年)、プロタミンスルフニー ト (Prot
aminsulfat : S、Niewia
rowski 、V、GureWiCh著1.T 、
Lab、C11n、Med 、第77巻:第665〜6
76頁、1971年)の添加又は積層した赤崩球又はラ
テックス粒子の凝集反応(R,Largo、 V、H
e1ler、 P、W、5trau’b著、Blood
第47巻:第991〜1002頁、1976年)による
沈殿に起因する。この記載した方法はフィブリンとフィ
ブリノ−ダンとを区別することができない。他の方法は
フィブリンをフイブリノーゲンからクロマトグラフィー
によシ分離することをこころみている( N、Alkj
aeraig、 A−Fletcher 、 R−Bu
rstein著、Am、、T−Obstet。
ブリノペプチドの欠損という点においてのみフイブリノ
ーゲンとは異なっているので、少し前までは、フィブリ
ンの検出のための定性分析法のみがあった。定性的又は
半定量的方法は例えばエタノール(H,C!、Goda
l 、U、Abi1gaard著、5cancL、、T
、Haematol、第3巻:第342〜650頁、
1966年)、プロタミンスルフニー ト (Prot
aminsulfat : S、Niewia
rowski 、V、GureWiCh著1.T 、
Lab、C11n、Med 、第77巻:第665〜6
76頁、1971年)の添加又は積層した赤崩球又はラ
テックス粒子の凝集反応(R,Largo、 V、H
e1ler、 P、W、5trau’b著、Blood
第47巻:第991〜1002頁、1976年)による
沈殿に起因する。この記載した方法はフィブリンとフィ
ブリノ−ダンとを区別することができない。他の方法は
フィブリンをフイブリノーゲンからクロマトグラフィー
によシ分離することをこころみている( N、Alkj
aeraig、 A−Fletcher 、 R−Bu
rstein著、Am、、T−Obstet。
Gynecol、第122巻:第199〜209頁、1
975年; D、L、’Heene、F、R,Matt
hias著、Thromb、Res、第2巻: 137
〜154頁、1976年)。フィブリンがフィブリノー
ゲンから完全に分離されないので、これらの方法も特異
的ではない。フィブリンを溶解して保持するためにはフ
イブリノーゲンが必要である( W、Krell
、 工、Mahn 、 G、Mtiller
−Berghaus 著、ThromlRes、第1
4巻:4299〜310頁、1979年)。
975年; D、L、’Heene、F、R,Matt
hias著、Thromb、Res、第2巻: 137
〜154頁、1976年)。フィブリンがフィブリノー
ゲンから完全に分離されないので、これらの方法も特異
的ではない。フィブリンを溶解して保持するためにはフ
イブリノーゲンが必要である( W、Krell
、 工、Mahn 、 G、Mtiller
−Berghaus 著、ThromlRes、第1
4巻:4299〜310頁、1979年)。
精製したシステム中でフィブリンをフィブリノーゲンか
ら区別する、もう1つの方法はN−末端グリシンの測定
である( P、Kierulf 、、H,O。
ら区別する、もう1つの方法はN−末端グリシンの測定
である( P、Kierulf 、、H,O。
GOdal著、5cand、J、Haematol、、
第9巻:第370〜672頁、1972年)。しかしな
がら、この方法は複雑であシ、かつ多量の出発物質が必
要であるので、テストとして実施することができない。
第9巻:第370〜672頁、1972年)。しかしな
がら、この方法は複雑であシ、かつ多量の出発物質が必
要であるので、テストとして実施することができない。
フィブリンと特異的に反応するが、フイブリノーゲンと
は反応しないモノクロナール抗体を使用する、フィブリ
ンの定性的及び定量的測定法がヨーロッパ特許第015
2’612号明細書から公知である。これらの抗体はフ
ィブリンのα−鎖の末端基のアミノ酸配列に相応するペ
プチドを免疫原として使用することにより得られる。し
かしながら、このためには2種の異なる、フィブリンと
特異的に結合性の抗体が必要であるので、この抗体では
十分に正確な検出法をイムノアッセイの原理によシ実施
することはできない。
は反応しないモノクロナール抗体を使用する、フィブリ
ンの定性的及び定量的測定法がヨーロッパ特許第015
2’612号明細書から公知である。これらの抗体はフ
ィブリンのα−鎖の末端基のアミノ酸配列に相応するペ
プチドを免疫原として使用することにより得られる。し
かしながら、このためには2種の異なる、フィブリンと
特異的に結合性の抗体が必要であるので、この抗体では
十分に正確な検出法をイムノアッセイの原理によシ実施
することはできない。
イムノアッセイの原理による測定法は広く知られている
。この測定法の利点はその精確さと、非常に僅かな】の
物質を検出することができるという可能性である。測定
の実施のためには均質層でも不均質層でも個々の変法が
可能である。
。この測定法の利点はその精確さと、非常に僅かな】の
物質を検出することができるという可能性である。測定
の実施のためには均質層でも不均質層でも個々の変法が
可能である。
不均質層での実施形においてはレセプターの1、踵を相
体に結合する。
体に結合する。
サン1ζウイツチ法においては、例えばレセプターを担
体に結合し、試験溶液を加え、この際試験溶液中に含有
される、測定すべき抗原がレセプターに結合する。次い
で抗原又は抗原抗体複合体と特異的に反応する、標識付
はレセプタ−’を添加する。次いで、標識付は抗体を介
して抗原のIを計算する。この一般的な原理に関しては
多くの変法の可能性がある。こうして、例えば3a!の
レセプターを用いる測定が行なわれ、この際3種のレセ
プターの1sが不均質層で存在し、他の2mのレセプタ
ーは溶解法であシ、この両方の溶解性のレセプターの1
種は標識されてお9、他方は標識されていない。次いで
、不溶性のレセプターは非標識溶解性レセプターに向け
られている。
体に結合し、試験溶液を加え、この際試験溶液中に含有
される、測定すべき抗原がレセプターに結合する。次い
で抗原又は抗原抗体複合体と特異的に反応する、標識付
はレセプタ−’を添加する。次いで、標識付は抗体を介
して抗原のIを計算する。この一般的な原理に関しては
多くの変法の可能性がある。こうして、例えば3a!の
レセプターを用いる測定が行なわれ、この際3種のレセ
プターの1sが不均質層で存在し、他の2mのレセプタ
ーは溶解法であシ、この両方の溶解性のレセプターの1
種は標識されてお9、他方は標識されていない。次いで
、不溶性のレセプターは非標識溶解性レセプターに向け
られている。
発明が解決しようとする問題点
本発明の課題は、特に非常に僅か彦量のフィブリンの検
出を可能とし、非常に精確に実施することができ、判に
同様に存在するフイブリノーゲン又はその他の人体の崩
液、血漿又は組織中に存在する蛋白質が妨害することな
くフィブリンの和異的検出を可能とする、フイブリンの
判異的定性及び定量測定法を提供することである。
出を可能とし、非常に精確に実施することができ、判に
同様に存在するフイブリノーゲン又はその他の人体の崩
液、血漿又は組織中に存在する蛋白質が妨害することな
くフィブリンの和異的検出を可能とする、フイブリンの
判異的定性及び定量測定法を提供することである。
問題点を解決するための手段
この課題はペプチド配列Leu−Ile.e −Asp
−Gly−Lys−Metと判異的に結合性であり、フ
ィブリンとフイブリノーゲンとを区別することができる
フィブリン特異性抗体により解決する。
−Gly−Lys−Metと判異的に結合性であり、フ
ィブリンとフイブリノーゲンとを区別することができる
フィブリン特異性抗体により解決する。
実験動物の生体中に免疫原として配列Leu−工le−
Asp−Gly−Lys−Met f含有するペプチド
を入れることによって、本発明に使用した抗体を金座 有する抗ぎ渭が得られる。これらの配列を含有する、ア
ミノWI6〜20のペプチドが有利に使用される。式L
eu−Ilee−Asp−G1y−Lys−Metのへ
キサペプチドが有利である。このヘキサペプチドを常法
で、有利に“スペーサー”群の挿入下に、このために好
適な相体ペプチドに結合する。
Asp−Gly−Lys−Met f含有するペプチド
を入れることによって、本発明に使用した抗体を金座 有する抗ぎ渭が得られる。これらの配列を含有する、ア
ミノWI6〜20のペプチドが有利に使用される。式L
eu−Ilee−Asp−G1y−Lys−Metのへ
キサペプチドが有利である。このヘキサペプチドを常法
で、有利に“スペーサー”群の挿入下に、このために好
適な相体ペプチドに結合する。
前記オリゴペプチドは公知法で合成される。
好適な方法は例えばE、テンシュ(Wiinsch )
著、ツーベン・ヴアイル(Houben−Weyl)、
1メト−テン−デル・オルガーニツシエン・ヒエミー(
Methoden der organischen
Chemie ) ” 、第XV/1及び2;デ・ペプ
タイズ(The Peptides、第1巻、1メジヤ
ー・メソツズ・オブ・ペプタイト・ボンド・フォーメー
ション(MajorMethzds of Peptl
e Eond Formation)”、アカデミツク
+1プレス(Academic Press )、19
79年、又は1ルスペクテイーベス・イン嗜ペゾタイド
・ケミストリー(Preepectivesin Pe
ptide Chemistry )”、A、エバーレ
(E’berle )、R,ガイガー(Geiger
)及びT。
著、ツーベン・ヴアイル(Houben−Weyl)、
1メト−テン−デル・オルガーニツシエン・ヒエミー(
Methoden der organischen
Chemie ) ” 、第XV/1及び2;デ・ペプ
タイズ(The Peptides、第1巻、1メジヤ
ー・メソツズ・オブ・ペプタイト・ボンド・フォーメー
ション(MajorMethzds of Peptl
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+1プレス(Academic Press )、19
79年、又は1ルスペクテイーベス・イン嗜ペゾタイド
・ケミストリー(Preepectivesin Pe
ptide Chemistry )”、A、エバーレ
(E’berle )、R,ガイガー(Geiger
)及びT。
ヴイーランド(Wielancl )著、S、カーデル
(Karger )、バーデル、1981年中に記載さ
れている。
(Karger )、バーデル、1981年中に記載さ
れている。
反応に関与すべきでない官能基が好適な方法で保護され
ている、アミノ酸又はペプチド切断片を反応に使用する
。アミノ濯誘導体又はペプチド切断片の遊離のカルボキ
シル基を好適力方法で活性化し、アミノυ誘導体又は部
分保護ペプチド切断片のアミノ基と反応させる。活性化
はDCCノ(ジシクロへキシルカルボジイミド)、DC
Cノ/ HOBt% DCCノ/ヒドロキシサクシンイ
ミド、POCノ3、クロラミン酸エステル又はアジド法
を用いて行なう、Chem、Ber、第103巻、第7
88頁、1970年によるDCCノ/ HOBを法を使
用するのが有利である。
ている、アミノ酸又はペプチド切断片を反応に使用する
。アミノ濯誘導体又はペプチド切断片の遊離のカルボキ
シル基を好適力方法で活性化し、アミノυ誘導体又は部
分保護ペプチド切断片のアミノ基と反応させる。活性化
はDCCノ(ジシクロへキシルカルボジイミド)、DC
Cノ/ HOBt% DCCノ/ヒドロキシサクシンイ
ミド、POCノ3、クロラミン酸エステル又はアジド法
を用いて行なう、Chem、Ber、第103巻、第7
88頁、1970年によるDCCノ/ HOBを法を使
用するのが有利である。
部分保護オリがペプチドの合成は段階的にC−末端部か
ら、又は切断片結合によシ行なうことができる。例えば
ポリオキシエチレン又は架橋ポリスチロールのような可
溶性又は不溶性ポリマー担体上への段階的合成も可能で
ある。アミノ酸又はペプチド切断片のα−アミノ官能基
のための保護基としてはをブチルオキシカルボニル(B
oc ) % フルオレニルメトキシカルボニル(F’
moc ) 、ベンジルオキシカルボ二ル(Z)、α、
α−ジメチルー3,5−ジメトキシベンジルオキシカル
ボニル、2−ビフェニリル−(4)−ソロビル−(2)
−オキシカルボニル及ヒドリチルを挙げることができる
。Boa 、 Fmoc及びz’6使用するのが有利で
ある。
ら、又は切断片結合によシ行なうことができる。例えば
ポリオキシエチレン又は架橋ポリスチロールのような可
溶性又は不溶性ポリマー担体上への段階的合成も可能で
ある。アミノ酸又はペプチド切断片のα−アミノ官能基
のための保護基としてはをブチルオキシカルボニル(B
oc ) % フルオレニルメトキシカルボニル(F’
moc ) 、ベンジルオキシカルボ二ル(Z)、α、
α−ジメチルー3,5−ジメトキシベンジルオキシカル
ボニル、2−ビフェニリル−(4)−ソロビル−(2)
−オキシカルボニル及ヒドリチルを挙げることができる
。Boa 、 Fmoc及びz’6使用するのが有利で
ある。
アミノ酸及びペプチド・切断片のα−カルボキシ基のた
めの保護としてはアルカノール又は芳香族脂肪族アルコ
ールでのエステル化を使用する。メチルエステル、ベン
ジルエステル及ヒterをブチルエステルが有利である
。
めの保護としてはアルカノール又は芳香族脂肪族アルコ
ールでのエステル化を使用する。メチルエステル、ベン
ジルエステル及ヒterをブチルエステルが有利である
。
使用したオリゴペプチドのN−末端は、蛋白質を傷つけ
ることなくペプチド−蛋白質機合体の保護基脱離が行な
われるように、担体蛋白質への結合の際に明らかな反応
進行に対して保護されていなければならがい。このため
にはアルカリ条件下に脱離されるFmoc保護基及び比
較的緩和な酸性条件下に脱離することのできる2−(ビ
フェニル−(4)−ゾロリルー(2)−オキシカルボニ
ル−1α、α−ジメチル−3゜5−ジメトキシベンジル
オキシカルボニル−、Boa−及びトリチル基が好適で
ある。
ることなくペプチド−蛋白質機合体の保護基脱離が行な
われるように、担体蛋白質への結合の際に明らかな反応
進行に対して保護されていなければならがい。このため
にはアルカリ条件下に脱離されるFmoc保護基及び比
較的緩和な酸性条件下に脱離することのできる2−(ビ
フェニル−(4)−ゾロリルー(2)−オキシカルボニ
ル−1α、α−ジメチル−3゜5−ジメトキシベンジル
オキシカルボニル−、Boa−及びトリチル基が好適で
ある。
”スペーサー”基としては酵素の固定においても使用さ
れるような、ペプチド配列において通常使用される橋構
成員を挙げることができる。
れるような、ペプチド配列において通常使用される橋構
成員を挙げることができる。
相応する試薬は、例えば炭素原子2〜8個を有するアル
キレン基の末端に2つの同−又は異なる反応性基を有し
てお夛、この際反応性基としてはアミノ酸の官能基と共
有結合することのできるような基を挙げることができる
。好適であるのはグルタルアルデヒドのようなジアルデ
ヒド、1,6−へキサメチレンジイソシアネートのよう
なジイソシアネート、1,6−へキサメチレンジアミン
のようなジアミン又はε−アミノカプロン酸のよりなω
−アミノカルボン酸である。これらの二官能性試薬は、
場合によシ活性化の後、一方では公知法でオリプペプチ
ドと、かつ他方では担体と結合する。担体としては基本
的に任意の蛋白質を挙げることができる。交叉反応を惹
起しない担体蛋白質を選択するのが有利である。好適で
あるのは、例えば牛崩清アルブミンのようなアルブミン
又はキーホール−リンペット・ヘモシアニン(Keyh
ole limpethemocyanins )のよ
うなヘモシアニンである。
キレン基の末端に2つの同−又は異なる反応性基を有し
てお夛、この際反応性基としてはアミノ酸の官能基と共
有結合することのできるような基を挙げることができる
。好適であるのはグルタルアルデヒドのようなジアルデ
ヒド、1,6−へキサメチレンジイソシアネートのよう
なジイソシアネート、1,6−へキサメチレンジアミン
のようなジアミン又はε−アミノカプロン酸のよりなω
−アミノカルボン酸である。これらの二官能性試薬は、
場合によシ活性化の後、一方では公知法でオリプペプチ
ドと、かつ他方では担体と結合する。担体としては基本
的に任意の蛋白質を挙げることができる。交叉反応を惹
起しない担体蛋白質を選択するのが有利である。好適で
あるのは、例えば牛崩清アルブミンのようなアルブミン
又はキーホール−リンペット・ヘモシアニン(Keyh
ole limpethemocyanins )のよ
うなヘモシアニンである。
このようにして得られた抗原を用いて、実験動物、例え
ばねずみ、ラッテ、兎又はヤギを公知法で免疫化し、こ
のようにしてポリクロン抗体を有する抗崩清が得られる
。有利な実施形においては、同様々方法でモノクロン抗
体eG。
ばねずみ、ラッテ、兎又はヤギを公知法で免疫化し、こ
のようにしてポリクロン抗体を有する抗崩清が得られる
。有利な実施形においては、同様々方法でモノクロン抗
体eG。
ケーラー(K5hler )及びC,ミルシュタイン(
Milstein )の方法[: Nature 、第
256巻、第495〜497頁、1975年〕にょシっ
くる。
Milstein )の方法[: Nature 、第
256巻、第495〜497頁、1975年〕にょシっ
くる。
従って、ペプチド配列IL+eu−Ile−Asp−G
ly−Lys−Metと特異的に結合可能であるモノク
ロナール抗体を取得するための方法も本発明の課題であ
シ、該方法はアミノ酸配列Leu−Ilee−Asp−
Gly−Lys−Met f有するペプチドでマウスを
免疫化し、免疫化動物の脾臓からのB+ +772球を
骨髄腫細胞と融合し、生じた雑種細胞をクロン化し、配
列Leu−Ilee −A8I)−G17−L78−M
etと結合性のクロンを単離し、培養し、これにより形
成されたモノクロン抗体を取得する。
ly−Lys−Metと特異的に結合可能であるモノク
ロナール抗体を取得するための方法も本発明の課題であ
シ、該方法はアミノ酸配列Leu−Ilee−Asp−
Gly−Lys−Met f有するペプチドでマウスを
免疫化し、免疫化動物の脾臓からのB+ +772球を
骨髄腫細胞と融合し、生じた雑種細胞をクロン化し、配
列Leu−Ilee −A8I)−G17−L78−M
etと結合性のクロンを単離し、培養し、これにより形
成されたモノクロン抗体を取得する。
自体全く免疫グロブリンを生産しない細胞系を使用する
のが特に有利である。
のが特に有利である。
本発明によシ得られるモノクロナール抗体はフイブリノ
ーゲンとは反応しないが、aesAA−フィブリン(フ
ィブリン型り、desAABB−7・イブリン(フィブ
リン型II)、ペプチド複合体及び合成ペゾチFと反応
する。更に、モノクロナール抗体はフイブリノーゲン又
はフィブリンのプラスミン生産分解生成物と反応しない
。
ーゲンとは反応しないが、aesAA−フィブリン(フ
ィブリン型り、desAABB−7・イブリン(フィブ
リン型II)、ペプチド複合体及び合成ペゾチFと反応
する。更に、モノクロナール抗体はフイブリノーゲン又
はフィブリンのプラスミン生産分解生成物と反応しない
。
本発明のもう1つの課題は本発明によるフィブリン特異
性抗体を用いるフイブリンの定性及び定】測定である。
性抗体を用いるフイブリンの定性及び定】測定である。
配列Leu−Ilee−Asp−GE−y−Lys−M
etと特異的に結合性である、本発明によるフィブリン
特異性抗体を使用する場合、フィブリンとは特異的に結
合し、フイブリノーゲンとは結合しないということが意
外にも判明した。こうして、この抗体の使用下に体液又
は体組織中のフィブリンを特異的に検出することが可能
である。
etと特異的に結合性である、本発明によるフィブリン
特異性抗体を使用する場合、フィブリンとは特異的に結
合し、フイブリノーゲンとは結合しないということが意
外にも判明した。こうして、この抗体の使用下に体液又
は体組織中のフィブリンを特異的に検出することが可能
である。
第1のレセプターR1は同相に存在し、フィブリンと、
又はフィブリンとレセプターとからの複合体と結合性で
あフ、フィブリンと、又はフイブリンとレセプターとか
らの複合体と結合性である他のもうIFlのレセプター
R2は水相中に溶解して存在してj?シ、かつこの際レ
セプターR2は標識を有している、そのような少なくと
も2種の異なるレセプターと共に恒温保持し、液相から
固相を分離し、該相の一方の標識を測定することにより
、イムノアツセイの原理によ・シ、本発明のフィブリン
特異性抗体を使用してフイブリンを選択的に測定するた
めの方法において、レセプターの1種としてペプチド配
列Leu−Ilee −Asp−11y−Lys−Me
tと特異的に結合性であり、フイブリンとフイブリノー
ゲンとを区別するフィブリン特異性抗体を使用すること
を特徴とするフィブリンの測定法が得られる。
又はフィブリンとレセプターとからの複合体と結合性で
あフ、フィブリンと、又はフイブリンとレセプターとか
らの複合体と結合性である他のもうIFlのレセプター
R2は水相中に溶解して存在してj?シ、かつこの際レ
セプターR2は標識を有している、そのような少なくと
も2種の異なるレセプターと共に恒温保持し、液相から
固相を分離し、該相の一方の標識を測定することにより
、イムノアツセイの原理によ・シ、本発明のフィブリン
特異性抗体を使用してフイブリンを選択的に測定するた
めの方法において、レセプターの1種としてペプチド配
列Leu−Ilee −Asp−11y−Lys−Me
tと特異的に結合性であり、フイブリンとフイブリノー
ゲンとを区別するフィブリン特異性抗体を使用すること
を特徴とするフィブリンの測定法が得られる。
この方法を実施するためには少なくとも二種の異なるレ
セプターを使用する。これらのレセツターの1つはペプ
チド配列Leu−Ilee−Aep−Gly−L7θ−
Metと特異的に結合性である。少なくとも1種の他の
抗体は同様にフィブリンと、又はフィブリンとレセプタ
ーとからの複合体と結合性でなければならない。ここで
はフイプリント非峙異的に結合し、フィブリノーゲンと
も結合する抗体を使用することもできる。しかしながら
、例えばヨーロッパ判許公開第0152612号公報か
ら公知であるフイブリンと特異的に結合性であるレセプ
ターを使用することが有利である。
セプターを使用する。これらのレセツターの1つはペプ
チド配列Leu−Ilee−Aep−Gly−L7θ−
Metと特異的に結合性である。少なくとも1種の他の
抗体は同様にフィブリンと、又はフィブリンとレセプタ
ーとからの複合体と結合性でなければならない。ここで
はフイプリント非峙異的に結合し、フィブリノーゲンと
も結合する抗体を使用することもできる。しかしながら
、例えばヨーロッパ判許公開第0152612号公報か
ら公知であるフイブリンと特異的に結合性であるレセプ
ターを使用することが有利である。
両方のレセプターの1力は固相に結合している。固相へ
の結合は自体公知法で行なわれ、専門家に公知である。
の結合は自体公知法で行なわれ、専門家に公知である。
更に、溶解した形で存在する、少なくとも1つの他のレ
セプターを使用する。この少なくとも1つの他のレセプ
ターは標識を有する。多くの他のレセプターR2t’使
用する場合、これらのレセプターの1′sのみが標識を
有する。し化ブタ−の標識は常法で行なわれ、専門家に
公知である。
セプターを使用する。この少なくとも1つの他のレセプ
ターは標識を有する。多くの他のレセプターR2t’使
用する場合、これらのレセプターの1′sのみが標識を
有する。し化ブタ−の標識は常法で行なわれ、専門家に
公知である。
標識は自体公知法で有利に放射性化合物、酵素、化学発
光性又は螢光性化合物によシ行なわれる。酵素での標識
、特にベルオギシダーゼ又はホスファターゼでの標識が
鉤に有利である。
光性又は螢光性化合物によシ行なわれる。酵素での標識
、特にベルオギシダーゼ又はホスファターゼでの標識が
鉤に有利である。
方法の判に有利彦実施形においてはフィブリンと非特異
的に結合性のレセプター又は有利にフィブリンと特異的
に結合性のレセプターが固相に結合している。この固相
に結合したレセプターを、引き続き測定すべきフィブリ
ンを含有する溶液と、及びペプチド配列Leu−Ile
e−Aep−Gly−Lys−Metと特異的に結合性
であり、溶けた形で存在し、かつ標vj1.ヲ有する抗
体と共に恒温保持する。固相に結合したレセプターはフ
ィブリンと非特異的に結合性であるので、固相にはフィ
ブリン分子だけでなく、フィブリノーゲン分子も積層す
る。ペプチド配列Leu−Ilee−Asp−Gly−
Lys−Metと特異的に結合性である第2の抗体はフ
ィブリンにのみ積層するので、フィブリン分子のみが標
識抗体ヲ峙異的に有し、一方フイプリノーデン分子は標
識されない。このようにして、液相から固相を分離した
後、標識の測定を介してフィブリンの含量を測定するこ
とが可能である。
的に結合性のレセプター又は有利にフィブリンと特異的
に結合性のレセプターが固相に結合している。この固相
に結合したレセプターを、引き続き測定すべきフィブリ
ンを含有する溶液と、及びペプチド配列Leu−Ile
e−Aep−Gly−Lys−Metと特異的に結合性
であり、溶けた形で存在し、かつ標vj1.ヲ有する抗
体と共に恒温保持する。固相に結合したレセプターはフ
ィブリンと非特異的に結合性であるので、固相にはフィ
ブリン分子だけでなく、フィブリノーゲン分子も積層す
る。ペプチド配列Leu−Ilee−Asp−Gly−
Lys−Metと特異的に結合性である第2の抗体はフ
ィブリンにのみ積層するので、フィブリン分子のみが標
識抗体ヲ峙異的に有し、一方フイプリノーデン分子は標
識されない。このようにして、液相から固相を分離した
後、標識の測定を介してフィブリンの含量を測定するこ
とが可能である。
固相に結合するレセプターとして、例えばヨーロッパ特
許公開第0152612号公報から公知の、フ−(f
!Jンと特異的に結合性のレセプターを使用する場合、
フィブリンのみが固相に特異的に結合し、かつ溶解性抗
体と共に恒温保持する際に、これも再びフィブリンと特
異的に反応する。こうして、固相へのフィブリノーゲン
の結合は実質的に全く起こらないので、この方法は更に
特異的であシ、非常に正確な測定を行なうことができる
。
許公開第0152612号公報から公知の、フ−(f
!Jンと特異的に結合性のレセプターを使用する場合、
フィブリンのみが固相に特異的に結合し、かつ溶解性抗
体と共に恒温保持する際に、これも再びフィブリンと特
異的に反応する。こうして、固相へのフィブリノーゲン
の結合は実質的に全く起こらないので、この方法は更に
特異的であシ、非常に正確な測定を行なうことができる
。
本発明による方法の、もう1つの物に有利な実施形にお
いては、ペプチド配列Leu−Ilee −Asp−G
ly−Lys−Metに対して特異的に結合性の抗体を
担体上に固定する。次いで、この固定抗体と共に、測定
すべきフィブリンを含有する溶液及びフィブリンと結合
性のレセプター、特に)・fプリンと特異的に結合性の
レセプターと恒温保持する。この際、固相に実質的にフ
ィブリンのみが結合し、フィブリノーゲンは溶液中に残
る。
いては、ペプチド配列Leu−Ilee −Asp−G
ly−Lys−Metに対して特異的に結合性の抗体を
担体上に固定する。次いで、この固定抗体と共に、測定
すべきフィブリンを含有する溶液及びフィブリンと結合
性のレセプター、特に)・fプリンと特異的に結合性の
レセプターと恒温保持する。この際、固相に実質的にフ
ィブリンのみが結合し、フィブリノーゲンは溶液中に残
る。
更に、標識付けした、可溶性の、フィブリンと結合性の
抗体がフィブリンに積層する。液相から固相を分離した
後、再び標識を介してフィブリンの含量が非常に正確に
測定される。
抗体がフィブリンに積層する。液相から固相を分離した
後、再び標識を介してフィブリンの含量が非常に正確に
測定される。
三種のレセプターを用いる専門家に公知のその他の変法
は同様にペプチド配列Leu−Ileθ−Asp−Gl
y−Lys−Metと特異的に結合性の抗体を使用して
可能であり、このための詳細な説明は必要ない。
は同様にペプチド配列Leu−Ileθ−Asp−Gl
y−Lys−Metと特異的に結合性の抗体を使用して
可能であり、このための詳細な説明は必要ない。
本発明による方法を実施するために使用する抗体の少な
くともi 、mがモノクロナール抗体であるのが有利で
ある。レセプターとしてモノクロン抗体のみを使用する
のが竹に有利である。
くともi 、mがモノクロナール抗体であるのが有利で
ある。レセプターとしてモノクロン抗体のみを使用する
のが竹に有利である。
本発明のもう1つの課題はフィブリン、又はフィブリン
とレセプターとからの複合体と結合性である、固相に結
合するレセプターR1及びフィブリン、又はフィブリン
とレセプターとからの複合体と結合性である、可溶性用
に存在する少なくとも1種のレセプターR2を含有し、
かつこの際可溶性のレセプターR2は標識を有する、フ
ィブリンを選択的に測定するための試薬であシ、これは
レセプターの11がペプチド記列Leu−工]、e−A
sp−Gly−Lys−Metと特異的に結合すること
を特命とする。
とレセプターとからの複合体と結合性である、固相に結
合するレセプターR1及びフィブリン、又はフィブリン
とレセプターとからの複合体と結合性である、可溶性用
に存在する少なくとも1種のレセプターR2を含有し、
かつこの際可溶性のレセプターR2は標識を有する、フ
ィブリンを選択的に測定するための試薬であシ、これは
レセプターの11がペプチド記列Leu−工]、e−A
sp−Gly−Lys−Metと特異的に結合すること
を特命とする。
ペノチF配列Leu−Ilee−Asp−Gly−Ly
s−Metと特異的に結合性の抗体は固相に結合して存
在していてもよいし、可溶性の標識又は未標識レセプタ
ーとして使用することもできる。これらの抗体がモノク
ロナール抗体であるのが有利である。
s−Metと特異的に結合性の抗体は固相に結合して存
在していてもよいし、可溶性の標識又は未標識レセプタ
ーとして使用することもできる。これらの抗体がモノク
ロナール抗体であるのが有利である。
すべての使用したレセプターがモノクロナール抗体であ
るのが肴に有利である。
るのが肴に有利である。
更に本発明によるフィブリン特異性抗体はへ崩液循環器
・系中のフィブリン及びフィブリン凝集物の定量測定に
有利に使用することができる。
・系中のフィブリン及びフィブリン凝集物の定量測定に
有利に使用することができる。
本発明によるフィブリン特異性抗体、特に本発明によシ
製造したモノクロナールフィブリン特異性抗体を標識付
けし、血液循環器中に注入し、好適な処置で可視とする
ことは更に有利である。
製造したモノクロナールフィブリン特異性抗体を標識付
けし、血液循環器中に注入し、好適な処置で可視とする
ことは更に有利である。
患者に、放射性に標識付けした本発明によるフイブリン
特異性抗体を注入することが竹に有利である。抗体は血
栓に集まり、かつγ−カメラで検出することができる。
特異性抗体を注入することが竹に有利である。抗体は血
栓に集まり、かつγ−カメラで検出することができる。
このようにして血栓の位置だけでなく、その大きさをも
知ることができる。
知ることができる。
更に、相応する薬剤を抗体に結合することによシ、フィ
ブリン凝集物、例えば血栓を溶解することのできる薬剤
をこれらの凝集物に導びぐために、フィブリン特異性抗
体を使用することができる。溶痔性物質としては、例え
ば組織−プラスミノーゲン−賦活体、ウロキナーゼ又は
ストレプトキナーゼを使用することができる。
ブリン凝集物、例えば血栓を溶解することのできる薬剤
をこれらの凝集物に導びぐために、フィブリン特異性抗
体を使用することができる。溶痔性物質としては、例え
ば組織−プラスミノーゲン−賦活体、ウロキナーゼ又は
ストレプトキナーゼを使用することができる。
本発明によシ使用した抗体はフィブリノーゲンと反応し
ないので、該治療は従来の溶解治療において常に生じた
結果である崩漿フ、イブリノーrンの明らかな減少には
導びか々い。
ないので、該治療は従来の溶解治療において常に生じた
結果である崩漿フ、イブリノーrンの明らかな減少には
導びか々い。
フィブリンと特異的に反応し、フィブリノーゲンと結合
しない抗体が本発明によフ提供される。該抗体を用いて
、血液中のフイブリンtW異的に定性的及び定量的に検
出することが可能である。本発明による抗体は血液のフ
ィブリン含量に関する正確な報告を可能とし、他方では
進管中に生じ、血管閉塞に導ひく血栓を検出することを
可能とする。更に、形成された血栓を特異的に溶解する
ことを可能とする。
しない抗体が本発明によフ提供される。該抗体を用いて
、血液中のフイブリンtW異的に定性的及び定量的に検
出することが可能である。本発明による抗体は血液のフ
ィブリン含量に関する正確な報告を可能とし、他方では
進管中に生じ、血管閉塞に導ひく血栓を検出することを
可能とする。更に、形成された血栓を特異的に溶解する
ことを可能とする。
実施例
次に本発明を図面並びに実施例につき詳細に説明する。
第1図はトロンビンの添加によシ生じた、血漿中の可溶
性フ・rプリンの測定の際得られた結果を表わすグラフ
図である。トロンビンを全く添加しない対照血漿は1:
20の希釈において、414 nmにおける吸光度0.
094 を示した。
性フ・rプリンの測定の際得られた結果を表わすグラフ
図である。トロンビンを全く添加しない対照血漿は1:
20の希釈において、414 nmにおける吸光度0.
094 を示した。
次の実施例においては次の省略形を用い九:Asp
L−アスパラで7酸 Eoc t −7’チルオキシカルボニルDCC
ノ ジシクロへキシルカルボジイミドdesAA−フ
ィブリン 型I aeaAABB−フィブリン 型n KLIle3A 酵素イムノアッセイ(enzyme
linkedimmunosorbent assa
y )Fmoc フルオレニルメトキシカルボニル
Gly グリシン Ho5t、 1−ヒFロキシー1H−ベンゾトリア
ゾールlIle L−イソロイシン KLE(キーホールやリンベット ヒョシアミンLeu
L−ロイシン Lys L−リジン Met L−メチオニン PB8 燐醪塩緩衝食塩溶液 R8A 牛崩清アルブミン 2 ベンジルオキシカルボニル モノクロナール抗体の製造 例1 担体蛋白質としてのKLT(に結合した、配列Leu−
Ice−Aap−Gly−Lys−Met f有するペ
プチドをPBB中に溶かし、フロイント補助液と同量部
ずつ混合する。この混合吻合100μyを生後6〜8週
間のBa1b / cマウスに腹腔内及び皮下注射した
。この注射を6〜4週間の間隔で2回縁シ返す。結合ペ
プチド(R8A%KLH)を用いて前記工程によシ免疫
化したマウスに、膵臓摘出3日間にPES中に溶かした
結合ペプチド100μgを静脈内注射した。
L−アスパラで7酸 Eoc t −7’チルオキシカルボニルDCC
ノ ジシクロへキシルカルボジイミドdesAA−フ
ィブリン 型I aeaAABB−フィブリン 型n KLIle3A 酵素イムノアッセイ(enzyme
linkedimmunosorbent assa
y )Fmoc フルオレニルメトキシカルボニル
Gly グリシン Ho5t、 1−ヒFロキシー1H−ベンゾトリア
ゾールlIle L−イソロイシン KLE(キーホールやリンベット ヒョシアミンLeu
L−ロイシン Lys L−リジン Met L−メチオニン PB8 燐醪塩緩衝食塩溶液 R8A 牛崩清アルブミン 2 ベンジルオキシカルボニル モノクロナール抗体の製造 例1 担体蛋白質としてのKLT(に結合した、配列Leu−
Ice−Aap−Gly−Lys−Met f有するペ
プチドをPBB中に溶かし、フロイント補助液と同量部
ずつ混合する。この混合吻合100μyを生後6〜8週
間のBa1b / cマウスに腹腔内及び皮下注射した
。この注射を6〜4週間の間隔で2回縁シ返す。結合ペ
プチド(R8A%KLH)を用いて前記工程によシ免疫
化したマウスに、膵臓摘出3日間にPES中に溶かした
結合ペプチド100μgを静脈内注射した。
免疫化したマウスの膵臓の細胞的108を骨髄腫細胞(
x 68− Sp 8−655、全く免疫グロブリンを
合成しない系;入手The Ba1k工n5titut
e 、 QelIC1stri’bution Cen
ter 。
x 68− Sp 8−655、全く免疫グロブリンを
合成しない系;入手The Ba1k工n5titut
e 、 QelIC1stri’bution Cen
ter 。
Elan Diego CA 92112、USA )
5 x 10’とポリエチレングリコール(MG 3
400 )の存在下に融合する。融合した細胞を、それ
ぞれ24個の窪みを有する4枚のプレート上に播種する
。
5 x 10’とポリエチレングリコール(MG 3
400 )の存在下に融合する。融合した細胞を、それ
ぞれ24個の窪みを有する4枚のプレート上に播種する
。
それぞれの窪みはヒポキサンチン、アミノゾテリン及び
チミジンを含有する培養基中の、免疫化していない同系
マウスの膵臓細胞5X10フを含有している。
チミジンを含有する培養基中の、免疫化していない同系
マウスの膵臓細胞5X10フを含有している。
これらの融合細胞(雑種細胞)10〜14日後EL工S
Aを用いて、次の抗原に対するその判異性に関して試験
する:フイブリノーゲン、dθ5AA−フィブリン、d
esAABE−フィブリン及び非結合ペプチド。
Aを用いて、次の抗原に対するその判異性に関して試験
する:フイブリノーゲン、dθ5AA−フィブリン、d
esAABE−フィブリン及び非結合ペプチド。
フィブリンに対して及び合成ペプチドに対してのみ向い
たモノクロナール抗体を得るために、その上澄がフイブ
リノーゲンに全く向いていない抗体を含有しない雑種細
胞を2回クロン化する。
たモノクロナール抗体を得るために、その上澄がフイブ
リノーゲンに全く向いていない抗体を含有しない雑種細
胞を2回クロン化する。
モノクロナールフィブリン特異性抗体を用いる血漿中の
可溶性フィブリンの測定 例2 血漿中の可溶性フィブリンをEL工SAを用いて測定す
る。このためには、PBS中に漕げており、FJ(7,
2、かつ配列Leu−工]−e−Asp−Gly−Ly
s−Met を有するペプチドに向いている、例1によ
う得られ九モノクロナールフィブリン鉤異性抗体を担体
としてのポリスチロール上に固定する。洗浄工程の後、
可溶性フィブリンを含有する希釈血漿を更に加える。該
血漿’i EDTA 5 m mob、KAcA 2
fi mol、アブロチニア200 K/ノ及びツウイ
ーン200.2%を含有するPBSの緩衝液中で希釈す
る。この可溶性フィブリンを血漿に小量のトロンーンを
添加することによシ製造した。トロンビン処理を、血漿
が全く濁り入来 びフィブリンiを示さないように選択する、すなわち生
じたフィブリンは可溶性フィブリンとして存在するよう
に選択する。トロンビン処理をヒルジン(血漿1dあた
り5単位)の添加(でよシ停止し虎。ツウイーン200
.1%含有FBS中での洗浄工程の後、抗体に結合した
フィブリンをポリクロナール抗体と室温で1時間恒温保
持するが、この際該ポリクロナール抗体はフィブリンと
もフイブリノーゲンとも結合し、かつホスファターゼに
結合しており、ツウイーン200.2%を含有し、pH
7,2であるPBS中に溶解している。新たな洗浄工程
の後、p−二トロフェニルホスフエー) −シー Na
−ヘキサヒトレートの添加によシ、モノクロナール抗体
がその中で可溶性フィブリンと反応する反応容器中の光
学密度の変化を測定する。結果を第1図に示す。
可溶性フィブリンの測定 例2 血漿中の可溶性フィブリンをEL工SAを用いて測定す
る。このためには、PBS中に漕げており、FJ(7,
2、かつ配列Leu−工]−e−Asp−Gly−Ly
s−Met を有するペプチドに向いている、例1によ
う得られ九モノクロナールフィブリン鉤異性抗体を担体
としてのポリスチロール上に固定する。洗浄工程の後、
可溶性フィブリンを含有する希釈血漿を更に加える。該
血漿’i EDTA 5 m mob、KAcA 2
fi mol、アブロチニア200 K/ノ及びツウイ
ーン200.2%を含有するPBSの緩衝液中で希釈す
る。この可溶性フィブリンを血漿に小量のトロンーンを
添加することによシ製造した。トロンビン処理を、血漿
が全く濁り入来 びフィブリンiを示さないように選択する、すなわち生
じたフィブリンは可溶性フィブリンとして存在するよう
に選択する。トロンビン処理をヒルジン(血漿1dあた
り5単位)の添加(でよシ停止し虎。ツウイーン200
.1%含有FBS中での洗浄工程の後、抗体に結合した
フィブリンをポリクロナール抗体と室温で1時間恒温保
持するが、この際該ポリクロナール抗体はフィブリンと
もフイブリノーゲンとも結合し、かつホスファターゼに
結合しており、ツウイーン200.2%を含有し、pH
7,2であるPBS中に溶解している。新たな洗浄工程
の後、p−二トロフェニルホスフエー) −シー Na
−ヘキサヒトレートの添加によシ、モノクロナール抗体
がその中で可溶性フィブリンと反応する反応容器中の光
学密度の変化を測定する。結果を第1図に示す。
二種の異なるフィブリン特異性抗体を用いる血漿中の可
溶性フィブリンの測定 例3 ヨーロッパ特許公開第0152612号公報によシ得ら
れる、フイブリンのα−鎖アミノ末端部に対して向いて
いるフィブリン特異性抗体を、例2に記載されたように
担体に固定する。
溶性フィブリンの測定 例3 ヨーロッパ特許公開第0152612号公報によシ得ら
れる、フイブリンのα−鎖アミノ末端部に対して向いて
いるフィブリン特異性抗体を、例2に記載されたように
担体に固定する。
洗浄工程の後、可溶性フィブリンを含有する血漿を、例
2と同じ条件下にモノクロナール抗体と共に恒温保持す
る。もう1回洗浄工程を行なった後、配列Leu−Il
ef3−A8p−01=7−178−Metに向いてい
る、第2の本発明によるフィブリン特異性モノクロン抗
体によシ可溶性のフィブリンを検出する。この第2のフ
ィブリン特異性抗体はペルオキシダーゼ全共有結合して
有する。洗浄工程の後、ペルオキシダーゼの基質として
のASTSを添加することによシ、光学密度の変化を測
定する。
2と同じ条件下にモノクロナール抗体と共に恒温保持す
る。もう1回洗浄工程を行なった後、配列Leu−Il
ef3−A8p−01=7−178−Metに向いてい
る、第2の本発明によるフィブリン特異性モノクロン抗
体によシ可溶性のフィブリンを検出する。この第2のフ
ィブリン特異性抗体はペルオキシダーゼ全共有結合して
有する。洗浄工程の後、ペルオキシダーゼの基質として
のASTSを添加することによシ、光学密度の変化を測
定する。
例4
例乙に記載したと同様に行なうが、第2のフィブリン特
異性抗体に酵素のかわフにビオチンを結合した。基質添
加の前にペルオキシダーゼ結合アビジン又はペルオキシ
ダーゼ結合ストレプタビジンを添加した。このように選
択された可溶性フィブリンの測定は全く特異的にフィブ
リンだけを測定することを可能にする。フイブリンを溶
液中に保持するために、フィブリンと結合しているフィ
ブリノ−ダンは本発明によるフィブリンの測定を妨害し
ない。
異性抗体に酵素のかわフにビオチンを結合した。基質添
加の前にペルオキシダーゼ結合アビジン又はペルオキシ
ダーゼ結合ストレプタビジンを添加した。このように選
択された可溶性フィブリンの測定は全く特異的にフィブ
リンだけを測定することを可能にする。フイブリンを溶
液中に保持するために、フィブリンと結合しているフィ
ブリノ−ダンは本発明によるフィブリンの測定を妨害し
ない。
例5
配列Leu−Ilee−Asp−Gly−Lys−Me
tに向いている、例1によシ得られたフィブリン特異性
抗体を放射性に標識化する。この標識した抗体をトロン
ビンによシ製造した凝集物を含有する、PH8中の1%
BSA l液に添加した。凝集物に結合した抗体のil
ヲシンチレーションカウンター中で測定した。比較のた
めに、凝集物を含有する緩衝溶液にフィブリン又はフィ
ブリノ−ダンと反応筒1図 しない、放射性に標識し光抗体を添加し虎。シンチレー
ション法の結果の比較は、本発明による抗体が凝集物に
特異的に結合し、一方対照抗体は凝集物と全く結合しな
いことを示した。
tに向いている、例1によシ得られたフィブリン特異性
抗体を放射性に標識化する。この標識した抗体をトロン
ビンによシ製造した凝集物を含有する、PH8中の1%
BSA l液に添加した。凝集物に結合した抗体のil
ヲシンチレーションカウンター中で測定した。比較のた
めに、凝集物を含有する緩衝溶液にフィブリン又はフィ
ブリノ−ダンと反応筒1図 しない、放射性に標識し光抗体を添加し虎。シンチレー
ション法の結果の比較は、本発明による抗体が凝集物に
特異的に結合し、一方対照抗体は凝集物と全く結合しな
いことを示した。
第1図はトロンビンの添加によシ生じた、血漿中の可溶
性フィブリンを例2によシ測定した結果を示すグラフ因
である。
性フィブリンを例2によシ測定した結果を示すグラフ因
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ペプチド配列Leu−Ile−Asp−Gly−L
ys−Metと特異的に結合性であり、フイブリンとフ
イブリノーゲンとを区別するフイブリン特異性抗体。 2、ペプチド配列Leu−Ile−Asp−Gly−L
ys−Metと特異的に結合性であり、フイブリンとフ
イブリノーゲンとを区別するモノクロナール抗体を取得
するための方法において、マウスをアミノ酸配列Leu
−Ile−Asp−Gly−Lys−Metを有するペ
プチドで免疫化した動物の脾臓からのB−リンパ球を骨
髄腫細胞と融合し、生じた雑種細胞をクロン化し、配列
Leu−Ile−Asp−Gly−Lys−Metと結
合性のクロンを単離し、フイブリンとフイブリノーゲン
との区別に関して選択し、培養し、これにより形成され
るモノクロナ−ル抗体を取得することを特徴とするモノ
クロナール抗体の取得法。 3、自体免疫グロブリンを全く生産しない骨髄腫細胞を
使用する請求項2記載の方法。 4、配列Leu−Ile−Asp−Gly−Lys−M
etを含有するアミノ酸6〜20を有するペプチドがス
ペーサーを介して結合している担体ペプチドからなる複
合体を免疫原として使用する請求項2又は3記載の方法
。 5、配列Leu−Ile−Asp−Gly−Lys−M
etを有するペプチドがスペーサーを介して担体ペプチ
ドに結合している複合体を免疫原として使用する請求項
4記載の方法。 6、アルブミン又はヘモシアニンを担体ペプチドとして
使用する請求項4又は5記載の方法。 7、フイブリンを選択的に定性及び/又は定量測定する
方法において請求項1のフイブリン特異性抗体を使用す
るフイブリンの測定法。 8、第1のレセプターR_1は固相に存在し、フイブリ
ンと、又はフイブリンとレセプターとからの複合体と結
合性であり、フイブリンと、又はフイブリンとレセプタ
ーとからの複合体と結合性である他のもう1種のレセプ
ターR_2は水相中に溶解して存在しており、かつこの
際レセプターR_2は標識を有している、そのような少
なくとも2種の異なるレセプターと共に恒温保持し、液
相から固相を分離し、該相の一方の標識を測定すること
により、イムノアツセイの原理により、フイブリンを選
択的に測定するための方法において、レセプターの1種
としてペプチド配列Leu−Ile−Asp−Gly−
Lys−Metと特異的に結合性であり、フイブリンと
フイブリノーゲンとを区別するフイブリン特異性抗体を
使用することを特徴とするフイブリンの測定法。 9、固相に結合する抗体としてペプチド配列Leu−I
le−Asp−Gly−Lys−Metと特異的に結合
性である抗体を使用し、かつ溶解性レセプターとして標
識を有する、フイブリンと結合性の他の抗体を使用する
請求項8記載の方法。 10、固相に結合するレセプターとしてフイブリンと結
合性のレセプターを使用し、可溶性レセプターとしてペ
プチド配列Leu−Ile−Asp−Gly−Lys−
Metと特異的に結合性であり、標識を有する抗体を使
用する請求項8記載の方法。 11、標識が放射性化合物、酵素、化学発光性又は螢光
性化合物である請求項8〜10のいずれか1項に記載の
方法。 12、ペプチド配列Leu−Ile−Asp−Gly−
Lys−Metと特異的に結合性である抗体がモノクロ
ナール抗体である請求項8〜11のいずれか1項に記載
の方法。 13、人血液循環器系及び組織中のフイブリン及びフイ
ブリン凝集物を定性的及び定量的に測定する方法におい
て、請求項1による抗体を使用するフイブリンの測定法
。 14、ペプチド配列Leu−Ile−Asp−Gly−
Lys−Metと特異的に結合性であり、かつフイブリ
ンとフイブリノーゲンとを区別する抗体を標識し、人血
液循環器中に注入し、該標識を好適な処置で可視とする
請求項13による方法。 15、請求項1のフイブリン特異性抗体を使用し、該フ
イブリン特異性抗体に溶解性物質を結合し、かつこの複
合体を血液循環器系中に注入することを特徴とする血栓
の溶解法。 16、フイブリン、又はフイブリンとレセプターとから
の複合体と結合性である、固相に結合するレセプターR
_1及びフイブリン、又はフイブリンとレセプターとか
らの複合体と結合性である、可溶性相に存在する少なく
とも1種のレセプターR_2を含有し、かつこの際可溶
性のレセプターR_2は標識を有する、フイブリンを選
択的に定量測定するための試薬において、レセプターの
1種がペプチド配列Leu−Ile−Asp−Gly−
Lys−Metと特異的に結合し、かつフイブリンとフ
イブリノーゲンとを区別する抗体であるフイブリンの測
定試薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19873701812 DE3701812A1 (de) | 1987-01-22 | 1987-01-22 | Fibrinspezifischer antikoerper, verfahren zur seiner herstellung und seine verwendung |
DE3701812.4 | 1987-01-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63225400A true JPS63225400A (ja) | 1988-09-20 |
Family
ID=6319319
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63009755A Pending JPS63225400A (ja) | 1987-01-22 | 1988-01-21 | フイブリン特異性抗体、モノクロナール抗体の取得法及びフイブリンの測定法及び測定試薬 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0276008B1 (ja) |
JP (1) | JPS63225400A (ja) |
AT (1) | ATE96177T1 (ja) |
DE (2) | DE3701812A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0348159A (ja) * | 1989-05-01 | 1991-03-01 | Nederland Centr Org Toegepast Natuur Onder | フイブリンに対する抗体;抗体の調製に適当な免疫原ペプチド、フイブリンを決定する方法および抗体に基づく製剤 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4242736A1 (de) * | 1992-12-17 | 1994-06-23 | Behringwerke Ag | Synthetische Peptide, Antikörper dagegen und ihre Verwendung |
ES2300102T3 (es) * | 1993-11-02 | 2008-06-01 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Anticuerpos anti-fibrina soluble humana, hibridoma que los produce y procedimiento de inmunoensayo. |
US5487892A (en) * | 1994-02-24 | 1996-01-30 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Method for treating thrombotic disease using a fibrin specific monoclonal antibody |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3400434A1 (de) * | 1984-01-09 | 1985-09-26 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Bestimmung von fibrin mit fibrin-spezifischen antikoerpern |
-
1987
- 1987-01-22 DE DE19873701812 patent/DE3701812A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-01-21 DE DE88100877T patent/DE3884972D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-01-21 EP EP88100877A patent/EP0276008B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-21 AT AT88100877T patent/ATE96177T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-01-21 JP JP63009755A patent/JPS63225400A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0348159A (ja) * | 1989-05-01 | 1991-03-01 | Nederland Centr Org Toegepast Natuur Onder | フイブリンに対する抗体;抗体の調製に適当な免疫原ペプチド、フイブリンを決定する方法および抗体に基づく製剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0276008A3 (en) | 1989-09-06 |
DE3701812A1 (de) | 1988-08-04 |
DE3884972D1 (de) | 1993-11-25 |
EP0276008A2 (de) | 1988-07-27 |
ATE96177T1 (de) | 1993-11-15 |
EP0276008B1 (de) | 1993-10-20 |
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