JP3315405B2 - レセプター誘発結合部位に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

レセプター誘発結合部位に対するモノクローナル抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、リガンドをレセプターに結合してレセプタ
ー−リガンド複合体を形成する際にリガンド上に誘発さ
れる抗体結合部位に関する。更に、そのようなレセプタ
ー誘発結合部位と免疫反応するモノクローナル抗体並び
に関連の治療及び診断方法に関する。
背景技術 リガンドと細胞表面のレセプター分子との相互作用
は、生物学的過程の証明となる。そのような相互作用の
例としては、エイズウイルス（HIV）のエンベロープタ
ンパク質（gp140）の一部により形成されるリガンドと
Ｔ細胞上のCD4レセプターとの結合、免疫系における自
己／非自己判別過程において多数のリガンドと相互作用
する主要な組織適合性複合体のレセプター及びフィブリ
ノーゲンリガンドと血小板上のGP II b−III aとの相互
作用がある。フィブリノーゲン:GP II b−III aリガン
ド−レセプターの組み合わせは、血液凝固、血栓形成に
特に興味深いものであり、リガンドとレセプターの例と
して以下で用いられる。
当該技術は、リガンドとレセプターの結合及び非結合
形態を識別する免疫学的方法を、その能力がレセプタ
ー：リガンド複合体形成により仲介された生理的メカニ
ズムの状態を決定することができるために、長い間探究
してきた。最近まで、免疫学的方法でそのような決定を
する努力は、生物試料が結合（複合）及び遊離両形態の
リガンドとレセプターを含むことがあるために失敗して
いた。
例えば、血栓症にかかっている患者の血管系は、フィ
ブリノーゲンとGP II b−III aの非結合形態及び表面上
にフィブリノーゲン:GP II b−III a複合体を有する血
小板を含有する。フィブリノーゲン:GP II b−III a複
合体は、非結合フィブリノーゲンと非結合GP II b−III
aに共通した抗原決定基を発現するので、現在の免疫学
的方法より血栓状態あるいは血栓部位を確認することを
困難にしている。
最近、Frelinger等、J.Biol.Chem.、263:12397−1240
2（1988）は、GP II b−III aがリガンドに結合された
場合にのみGP II b−III aで発現される抗原決定基を同
定したことを報告している。即ち、Frelinger等によっ
て述べられた抗原決定基は、レセプター：リガンド複合
体のレセプターによって発現されたものである。
人工の非レセプター表面に結合するリガンド上に発現
された抗原決定基と免疫反応するモノクローナル抗体の
調製も報告されている。Soria等、J.Colloid Interface
Sci.、107:204−208（1985）には、プラスチック吸着
フィブリノーゲン及びプラスチック上に吸着されたある
いは溶液中に遊離した、いわゆるフィブリノーゲンＤ断
片に結合する架橋フィブリン断片と免疫化することによ
り誘発されたDSB2と呼ばれる特定のモノクローナル抗体
が記載されている。報告によれば、この抗体は、液相フ
ィブリノーゲンあるいは溶液中の場合のいわゆるフィブ
リノーゲンＥ断片に結合しない。
更に、Nilsson等、Molec.Immunul.、24:487−94（198
7）には、ザイモサンＡに粒子結合した補体C3断片と免
疫反応するが、可溶性C3断片とはしないモノクローナル
抗体の調製が報告されている。ザイモサンＡに結合する
タンパク質の種類は、共有化学結合を含むものである。
他の報告として、Abrams等、Blood（Suppl.1）、70:3
55a（Dec.1987）には、9F9と呼ばれるモノクローナル抗
体が簡単に論じられており、発行されたアブストラクト
の中で血小板結合フィブリノーゲンに結合すると述べら
れている。しかしながら、この簡単な報告は、モノクロ
ーナル9F9の特異的結合性を特徴としていない。
可溶化フィブリノーゲンと免疫反応する多数のモノク
ローナル抗体が報告されている。その１つは、Lindon
等、Blood、68:355−362（Aug.1988）である。その文献
には、市販の抗ヒトフィブリノーゲンモノクローナル抗
体並びにＤ及びＥ断片に対するアフィニティー精製ポリ
クローナル抗体の用途が報告されている。
発明の概要 本発明は、レセプター結合リガンドによって発現され
るレセプター誘発抗体結合部位（RIBS）の存在によっ
て、レセプターに特異的に結合したリガンドと非結合リ
ガンドとを識別することができるという発見を含むもの
である。即ち、そこでリガンドがレセプターに特異的に
結合する場合に決定基は発現されるが、レセプターとリ
ガンドが結合されない場合には発現されないある種の抗
原決定基を発見した。
RIBSは、認識レセプターに結合するリガンドの特異的
相互作用のために、リガンド上に発現される。RIBSは、
タンパク質がプラスチック吸着タンパク質のような別の
表面と非特異的に相互作用する場合あるいはタンパク質
が表面と共有化学結合で相互作用する場合に露出される
抗原決定部位ではない。後者のこれら２種の例は、上記
Soria等及びNilsson等の文献に開示されており、本明細
書で定義したRIBSを生じる特異的レセプターリガンド結
合相互作用を含んでいない。
また、レセプターと結合する場合にはリガンドと免疫
反応するが、相互に特異的に結合しない場合にはレセプ
ターあるいはリガンドのいずれとも免疫反応しない抗体
分子も本発明によって企図される。好ましい実施態様に
おいては、本発明の抗体は、ヒトフィブリノーゲン上に
局在したRIBSを認識する。
このような抗体は、フィブリノーゲンとレセプター、
好ましくは血小板上のGP II b−III aとの相互作用の結
果として誘発されるRIBSを認識する。本発明の抗体は、
過剰量の血漿フィブリノーゲンの存在下でさえも、結合
フィブリノーゲンと選択的に免疫反応する。これらの抗
体のユニークな特性によって、有用な種々の診断系及び
治療方法が提供される。
本発明の好ましい実施態様は、レセプターリガンド複
合体によって発現したレセプター誘発結合部位と免疫反
応するモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体
は、2G5、2F10、3G11及び4G10と称する抗体からなる群
より選ばれることが好ましい。モノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ2G5、ハイブリドーマ2F10、ハイブリド
ーマ3G11及びハイブリドーマ4G10からなる群より選ばれ
たハイブリドーマによって産生される。
本発明のもう１つの実施態様は、細胞培養組成物であ
って、 ａ）GP II b−III a:フィブリノーゲン複合体によって
発現したレセプター誘発結合部位と免疫反応する抗体を
産生するハイブリドーマ2G5、ハイブリドーマ2F10、ハ
イブリドーマ3G11及びハイブリドーマ4G10からなる群よ
り選ばれたハイブリドーマ； ｂ）ハイブリドーマによって分泌された抗体分子；及び ｃ）ハイブリドーマ用培養基； を含む組成物である。
更に、レセプター−リガンド複合体の存在を検出する
方法が企図され、この系は、レセプター−リガンド複合
体によって発現したレセプター誘発結合部位（RIBS）と
免疫反応するモノクローナル抗体を含み、RIBSは非結合
レセプター又は非結合リガンドによって発現しない。レ
セプター複合体は、GP II b−III a:フィブリノーゲン
であることが好ましい。モノクローナル抗体を生体内の
表示手段に結合する方法も好ましい。
本発明のもう１つの態様は、血液試料においてGP II
b−III a:フィブリノーゲン複合体の存在をアッセイす
るキット形態の診断系であって、この複合体によって発
現されたRIBSと免疫反応するモノクローナル抗体を含む
診断系である。
本発明のもう１つの実施態様は、哺乳動物における生
体内血栓の分散方法であって、モノクローナル抗体−プ
ラスミノーゲン活性化酵素複合体におけるモノクローナ
ル抗体領域がGP II b−III a:フィブリノーゲン複合体
によって発現したRIBSと免疫反応する該複合体の有効量
を該哺乳動物に静脈投与することを含む方法である。プ
ラスミノーゲン活性化酵素が組織プラスミノーゲン活性
化因子であり、モノクローナル抗体が2G5、2F10、3G11
及び4G10からなる群より選ばれることが好ましい。
本発明のもう１つの態様は、哺乳動物における血栓の
生体内検出であって、 ａ）血栓を示すGP II b−III a:フィブリノーゲン複合
体によって発現したRIBSと免疫反応するモノクローナル
抗体の有効量を該哺乳動物に静脈投与し； ｂ）投与された哺乳動物を、モノクローナル抗体がGP I
I b−III a:フィブリノーゲン複合体と免疫反応するの
に十分な所定時間維持してその免疫反応生成物を形成さ
せ； ｃ）工程（ｂ）で形成した免疫反応生成物の存在、即
ち、血栓の存在を分析する； を含む検出である。
また、レセプター−リガンド複合体によって発現しる
本RIBSを含むアミノ酸残基配列において対応するポリペ
プチドも企図される。好ましい実施態様においては、ポ
リペプチドは、GP II b−III a:フィブリノーゲン複合
体のRIBSに対応するアミノ酸残基配列を含む。ポリペプ
チドの全配列がヒトフィブリノーゲンのγ鎖の対応RIBS
アミノ酸配列と同一であることが更に好ましい。特に好
ましいポリペプチドは、約40個までのアミノ酸残基を含
み、式： を有するアミノ酸残基配列を包含する。ポリペプチド
は、式： を有することが最も好ましい。
本発明は、また、例えば、ポリペプチドが表面上に固
定化される場合のように、レセプター−リガンド複合体
のリガンド分子のRIBSエピトープに似ている本ポリペプ
チドと免疫反応する抗体である。本発明の抗体は、ま
た、ポリペプチドに対応するアミノ酸残基配列を含むレ
セプター−リガンド複合体と免疫反応することが好まし
い。これに関して特に好ましい抗体は、ATCC受託番号HB
9847を有するハイブリドーマ2G5によって分泌される。
本ポリペプチドと抗体は、多くの治療及び診断プロト
コールを与える。例えば、薬学的に許容しうる賦形剤と
混合する場合のように、患者を本ポリペプチドで治療す
ることにより患者においてレセプター−リガンド複合体
と免疫反応することから本抗体を阻害及び／又は中和す
る方法が予想される。即ち、上記ポリペプチドは、抗体
と競合して免疫反応することにより、患者における遊離
抗体の存在を減少させる。
本ポリペプチドと抗体に対して企図されるもう１つの
使用方法は、抗体を含む溶液において抗体の存在を検出
することである。即ち、その溶液を固定化した本ポリペ
プチドを有する表面上に移すことができ、抗体がポリペ
プチドと反応して検出可能な免疫複合体を形成すること
が好ましい。免疫複合体の存在は、溶液中の抗体の存在
を示している。
更に企図される用途としては、抗体を含む溶液、例え
ば、溶液中の不純物から本抗体を単離することである。
表面上に固定化された本ポリペプチドに抗体含有溶液を
通過させることができ、引き続き抗体が置き換えられ
る。標的抗体は集めることにより、精製される。
図面の簡単な説明 図１は、Mab 2G5の血小板結合フィブリノーゲンに対
する結合を示す。125I−2G5（0.1μＭ）の血小板（１×
108/ml）の結合は、１μＭフィブリノーゲンなし（斜
線）又はあり（黒）で、非賦活化、ADP（10μＭ）賦活
化又はα−トロンビン（0.5単位/ml）賦活化血小板を用
いて行った。実験を平行して、125I−フィブリノーゲン
（0.3μＭ）単独の結合を測定した（白）。
図２は、Mab 2G5と反応するD100のタンパク質分解断
片の単離を示す。D100をプラスミンで消化し、固定化2G
5のアフィニティークロマトグラフィーにかけた。図Ａ
は、280nmにおける吸光度でモニターしたクロマトグラ
ムであり、非結合（Ｆ）と結合（Ｂ）画分を示す。結合
物質をプールし、逆相Vydac C18カラムのHPLC（高圧液
体クロマトグラフィー）にかけた。図Ｂは、280nmにお
けるHPLCクロマトグラムを示す。
A.定義 アミノ酸残基配列：隣接の残基間のペプチド結合によ
り、２個以上の一連のアミノ酸残基を結合してペプチド
又はポリペプチドを形成する。アミノ酸残基配列は、便
宜上、その構成アミノ酸に対して１文字又は３文字略号
で表される。本明細書で用いられるアミノ酸の略号は、
37 C.F.R.§1.822（ｂ）（２）に規定されているもので
あり、次の対応表に転載する： 本明細書においてアミノ酸残基配列を含む個々の残基
は、アミノ酸残基配列を組み込んでいる分子が所望の機
能特性を保持する限り、Ｄ又はＬ異性体であってもよ
い。また、アミノ酸残基配列は、翻訳後に修飾されたア
ミノ酸、例えば、ヒドロキシル化、グリコシル化アミノ
酸残基又はジスルフィド結合により結合された残基を含
めてもよい。更に、アミノ酸残基配列は、修飾されたあ
るいは特殊なアミノ酸を１個以上、例えば、37 C.F.R.
§1.822（ｂ）（４）で挙げられているものを含めるこ
とができ、これらを参考として本明細書に引用する。ア
ミノ酸残基配列は、その構成アミノ酸に対応した略号で
表すことができ、２つの隣接した略号間のハイフンは、
対応する残基間のペプチド結合を示している。
ペプチド／ポリペプチド：ポリマーは、少なくとも２
個のアミノ酸残基を含み、隣接の残基は、１つの残基の
α−アミノ基と隣接の残基のα−カルボニル基の間のペ
プチド結合で連結されている。ポリペプチドの一次構造
は、ポリマーの一方の末端の第一アミン基ともう一方の
末端のカルボン酸基を有する。即ち、ポリペプチドは、
下記式で表される。
Ｈ−［NH−RCH−Ｃ（Ｏ）］ｉ−OH （式中、Ｒはあるアミノ酸残基に特有の側鎖であり、ｉ
はポリマーを含むアミノ酸残基数であり、２以上であ
る。）ポリペプチドは、１個以上のアミノ酸残基配列を
含むことができる。また、水溶液中のポリペプチドは、
通常、１個以上の双性イオンの形であり、これは溶液の
pHに左右される。
タンパク質：タンパク質は、約50個以上のアミノ酸残
基を含む単一のポリペプチド又はセットの架橋ポリペプ
チドである。タンパク質は、同一ポリペプチド鎖内にあ
るいは隣接したポリペプチド間に化学架橋、即ち、ジス
ルフィド橋を有してもよい。タンパク質は、グリコシル
化することができ、その場合、糖タンパク質と呼ばれ
る。
レセプター：レセプターは、リガンドと呼ばれる他の
分子と特異的に結合してレセプター−リガンドタンパク
質又は糖タンパク質複合体を形成する生物学的に活性な
タンパク質性分子をいう。
リガンド及び認識（Cognate）リガンド：これらのリ
ガンドは、特定のレセプター分子と特異的相互作用によ
り結合する構造タンパク質を含む分子をいう。
抗原決定基又は抗原：抗原決定基又は抗原は、抗体結
合部位と免疫学的に結合する抗原の実際の構造部分を意
味する。これらの用語は、エピトープと同じ意味でも用
いられる。
新抗原（Neo−antigen）：本明細書で定義される新抗
原は、レセプターに結合する前のリガンドによって発現
しないが、リガンド−レセプター複合体によって発現す
る新規な抗原決定基である。
陰性（Cryptic）抗原決定基：認識（特異）レセプタ
ーに結合する際にリガンドタンパク質のコンホーメーシ
ョン変化により形成される新抗原決定基を意味する。即
ち、本明細書で記載されるリガンドは、リガンドがレセ
プターに特異的に結合していない限り、陰性抗原決定基
を発現しない。
レセプター誘発結合部位（RIBS）:RIBSは、レセプタ
ー−リガンド複合体のリガンド部分によって発現される
が、非結合リガンドあるいは非占有レセプターによって
は発現しない新抗原決定基である。RIBSは、“高次（Co
nformational）”あるいは“逐次（Sequential）”であ
ることができる。RIBSは、レセプター結合により誘発さ
れたリガンドの特異的変化の結果、即ち、“陰性抗原決
定基”である。
抗体：文法上種々の形の用語抗体は、本明細書では、
免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的
に活性な部分、即ち、抗体結合部位又はパラトープを含
む分子を意味するために用いられる。具体的な抗体分子
は、無傷（intact）の免疫グロブリン分子、実質的に無
傷の免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の一部
であり、当該技術においてFab、Fab´、Ｆ（ab´）２及
びＦ（Ｖ）として知られるものが挙げられる。
抗体結合部位：抗体結合部位は、抗原と特異的に結合
する（抗原と免疫反応する）重鎖及び軽鎖可変及び超可
変域を含む抗体分子の構造上の部分である。種々の形の
用語免疫反応は、抗原決定基含有分子と、全抗体分子又
はその一部のような抗体結合部位を含む分子との間の特
異結合を意味する。
モノクローナル抗体：文法上種々の形の用語モノクロ
ーナル抗体は、特定の抗原と免疫反応することができる
実質的に１種のみの抗体結合部位を含む抗体分子の集団
を意味する。即ち、モノクローナル抗体は、典型的には
免疫反応する抗原に対して単一の結合親和性を示す。従
って、モノクローナル抗体は、複数の抗体結合部位を有
する抗体分子、各々が異種抗原に対して免疫特異的な、
例えば、二特異性モノクローナル抗体を含んでもよい。
B.レセプター誘発結合部位及びポリペプチド 前に述べたように、リガンド−レセプター複合体形成
は、多くの生物学的過程の中心である。そこでリガンド
−レセプター形成に伴う生物学的機能と共に、更に微妙
な変化が生じることが見出された。その変化は、複合体
形成の際にレセプターと結合相互作用に起因するリガン
ド分子のコンホーメーションにある。リガンドコンホー
メーションの変化は、実質的に複合体の形成の際にのみ
発現される新抗原決定基の形成を生じる。新抗原決定基
は、本明細書においてレセプター誘発結合部位（RIBS）
を意味する。
リガンドとしてのフィブリノーゲンをレセプターとし
てのGP II b−III aに結合することにより形成された複
合体によって発現されるRIBSは、RIBS形成事象の例とし
て本明細書で例示的に用いられる。フィブリノーゲン−
GP II b−III a複合体と免疫反応し、フィブリノーゲン
−GP II b−III a複合体として存在しない場合にはリガ
ンドあるいはレセプターと実質的に反応しないモノクロ
ーナル抗体もまた抗−RIBS（あるいは更に簡単に、RIB
S）モノクローナル抗体の例として本明細書で用いられ
る。
本明細書で詳細に述べる具体的なRIBS及びRIBSモノク
ローナル抗体の他に、更に数種のリガンド−レセプター
複合体が文献に報告されている。本発明は、本明細書で
記載した手法を用いて、そのような複合体もまたRIBSを
形成し、モノクローナル抗体をそのRIBSに生じることを
企図する。そのようなモノクローナル抗体は、リガンド
結合レセプター複合体のリガンド部分とのみ免疫反応
し、遊離レセプター又は遊離リガンドと免疫反応しな
い。そのようなRIBSモノクローナル抗体を用いたもの
は、遊離リガンド及び遊離レセプターのいずれかあるい
は双方の存在下でリガンド−レセプター複合体、即ち、
占有されたレセプター又は占有されたリガンドの存在及
び量を分析することができる。
RIBS形成性リガンド及びレセプターの組み合わせの例
を下記表１に挙げる。これらの組み合わせは、単に例示
するためのものであり、本RIBSを形成することができる
レセプター−リガンドの組み合わせを限定するものでは
ない。
本発明の１実施態様においては、ポリペプチドは、リ
ガンドのRIBSにおけるレセプター−リガンド複合体のリ
ガンドのエピトープに似ていることが予想される。従っ
て、本ポリペプチドは、RIBSの領域にリガンドと対応す
るアミノ酸残基配列を有する。
好ましい実施態様においては、RIBSを定義するヒトフ
ィブリノーゲンのγ鎖にアミノ酸残基配列に対応するア
ミノ酸残基配列を含む。ポリペプチドの全配列は、フィ
ブリノーゲン領域と同一であるが、未変性のフィブリノ
ーゲンの場合にも予想されるポリペプチドの保存的置換
に似ていることが最も好ましい。
従って、本発明の好ましい態様においては、本発明の
ポリペプチドは、下記式で表されるアミノ酸残基配列を
有する。
Ｈ−Xn−Ｙ−Xm−OH （式中、Ｙはヒトγ鎖フィブリノーゲンアミノ酸残基配
列の群より選ばれたアミノ酸残基配列であり;Xnはｎ＝
０の場合存在せず、ｎ＝１の場合約30個までの残基を含
むＮ−末端（リーダーセグメント）アミノ酸残基配列で
あり;Xmはｍ＝０の場合存在せず、ｍ＝１の場合約30個
までの残基を含むＣ−末端（テールセグメント）アミノ
酸残基配列である。） 全ポリペプチドは、約40個までのアミノ酸残基を含
み、約30個までの残基が好ましく、約20個までの残基が
最も好ましい。
Ｙは、残基363前後から残基393前後までのヒトフィブ
リノーゲンのγ鎖のアミノ酸残基配列と対応することが
好ましい。Ｙは、式:Asn−Gly−Ile−Ile−Trp−Ala−T
hr−Trp−Lys−Thr−Arg−Trp−Tyr−Ser−Met−Lys−L
ys−Thr−Thrで示されるアミノ酸残基配列を有すること
が更に好ましい。Ｙは、式:Lys−Thr−Arg−Trp−Tyr−
Ser−Met−Lys−Lys−Thr−Thr−Met−Lysを有すること
が最も好ましい。
Xn又はXmがアミノ酸残基配列である場合、Xn又はXmは
約20個までの残基を含むことが好ましく、約10個までの
残基が更に好ましく、約５個までのアミノ酸残基が最も
好ましい。典型的には、Xn及びXmは、各々ヒトフィブリ
ノーゲンに対応して見られる配列と同一のアミノ酸残基
配列を有する。
更に好ましい実施態様において、本発明のポリペプチ
ドは下記式を有する。
Ｈ−Ｙ−OH （Ｙは上で定義した通りである。） 本発明のポリペプチドは、本明細書で記載した手段に
より、種々の有用な抗体を生成するために用いることが
できる。ポリペプチドの有用性は、下記に示される論理
から明らかになるであろう。
典型的には、本ポリペプチドは、グリコシル化されな
い、即ち、ペプチド合成の標準的手法又は本発明の組換
えDNA分子の原核宿主発現により直接合成される。真核
的に産生された本発明のポリペプチドは、典型的にはグ
リコシル化される。
本ポリペプチドは、得られたポリペプチド分子が所望
の特性を示す限り、挿入、欠失及び保存的又は非保存的
なアミノ酸残基の置換のような種々の変化を組み込むこ
とができる。本明細書で言う“所望の特性”は、ポリペ
プチドが適切な宿主内で免疫原性であり、ポリペプチド
に対して、好ましくは、例えば、血小板上で発現された
GP II b−III a−フィブリノーゲン複合体に対して抗体
を生成することができることを包含する。更に、ポリペ
プチドは抗原性であるので、抗体はポリペプチド、好ま
しくはGP II b−III a−フィブリノーゲン複合体と免疫
反応する。
本ポリペプチドが上記で示したものに対応する配列の
保存的置換を組み込む場合、置換アミノ酸残基は、得ら
れたポリペプチドがフィブリノーゲン配列と異なる（以
外の）アミノ酸残基配列を有するように別の生物学的に
類似したアミノ酸残基に置換される。保存的置換の例と
しては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニ
ンのような疎水残基を別の疎水残基に置換することを包
含する。また、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、
アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン等の極性残
基をこのグループの別の基に保存的に置換することがで
きる。また、置換されたアミノ酸残基が置換されないも
との基のアミノ酸残基に置き換わる場合、保存的置換を
組み込んでいるポリペプチドの別の態様が生じる。置換
アミノ酸の例は、37 C.F.R.§1.822（ｂ）（４）にあ
り、これらの種類を参考として本明細書に引用する。ポ
リペプチドがフィブリノーゲンの配列に対応し、１種以
上の保存的置換を有するアミノ酸残基配列を有する場
合、未変性タンパク質のアミノ酸残基の好ましくは約20
％以上、更に好ましくは約10％以上は置換されない。特
に好ましい保存的に置換されたポリペプチドは、上記で
同定されたもののようなヒトγ鎖アミノ酸残基配列のモ
ノ置換類縁体である。
本発明のポリペプチドは、当業者に既知の任意のペプ
チド合成法により合成することができる。数種の利用で
きる手法の概要は、J.M.Stuard、J.D.Young、“Solid P
hase Peptide Synthesis"、W.H.Freeman、Co.、San Fra
ncisco（1969）、J.Meinhofer、“Hormonal Proteins a
nd Peptides"Vol.2、pp.46、Academic Press（New Yor
k）1983及び米国特許第4,631,211にあり、この説明を参
考として本明細書に引用する。本発明で使用するのに必
要なポリペプチドが比較的短い（長さが約40個より少な
いアミノ酸残基）場合、一般的には、直接ペプチド合成
法が好ましく、通常、メリフィールド法［Merrifield J
ACS、85:2149（1963）］のような固相法が用いられる。
更に、本発明の態様は、本発明のポリペプチドを適切
な医薬賦形剤と、好ましくは単位剤形として混和して含
むポリペプチド組成物である。ポリペプチド組成物は、
本発明のポリペプチドと免疫反応する抗体分子を“中和
する”ために用いることができる。即ち、本ポリペプチ
ド分子と免疫反応する哺乳動物内に存在する抗体分子
は、ペプチドと抗体の複合体形成のために、哺乳動物内
の循環から効果的に取り除くことができる。
本発明の好ましい態様は、抗体がポリペプチド組成物
中のポリペプチドを認識する場合であり、血小板上で発
現されるヒトGP II b−III aと免疫複合体を形成したヒ
トフィブリノーゲンのRIBSエピトープを定義する。特に
好ましい実施態様は、前記アミノ酸残基配列又は保存的
に置換されたその配列を含むポリペプチドで中和された
2G5 MAbを使用する。
本発明のもう１つの態様では、本ポリペプチドは、本
明細書で記載した方法でポリペプチドと免疫反応する抗
体を生成するために用いることができる。ポリペプチド
は、単独であるいは別の化学物質群、例えば、キャリヤ
分子と複合して動物を免役するために用いられる。宿主
に許容される任意のキャリヤ群が予想される。
C.モノクローナル抗体 本発明のモノクローナル抗体（MAb）は、リガンドの
レセプター誘発結合部位と免疫反応する抗体分子を含む
ことが特徴である。本発明のMAbは、RIBSと免疫反応す
るが、非結合（遊離）リガンドあるいはレセプターと、
即ち、リガンド又はレセプターが溶液中に遊離している
場合、実質的に免疫反応しないことにより、リガンドの
レセプター結合と非結合形態とを識別することができ
る。本発明のMAbは、リガンド−レセプター複合体との
モノクローナル抗体免疫反応が遊離リガンド又は非結合
レセプターと競合結合することにより、約15％以下、好
ましくはもっと低く阻害される場合には、本明細書に記
載される別の種類と“実質的に”免疫反応しない。
好ましい１実施態様においては、本MAbは、シトアド
ヘシン−リガンド複合体によって発現されたRIBSと免疫
反応する抗体分子を含む。シトアドヘシンは、その全て
がアミノ酸残基配列アルギニン−グリシン−アスパラギ
ン酸又はRGDを含むリガンドに結合するレセプター分子
の上位系に付された名称である。［Plow等、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、83:6002（1986）］。この上位系は、イ
ンテグリンとも名付けられている。［Ruoslahti等、Sci
ence、238:491−497（1987）］。本明細書において具体
的な興味深い個々のシトアドヘシンは、GP II b−III a
であり、血小板フィブリノーゲンレセプターとしても知
られる。
本発明の好ましいモノクローナル抗体は、次のハイブ
リドーマの１種によって分泌（産生）される:ATCC受託
番号HB9847を有するハイブリドーマ2G5、ATCC受託番号H
B9844を有するハイブリドーマ2F10、ATCC受託番号HB984
5を有するハイブリドーマ3G11及びATCC受託番号HB9846
を有するハイブリドーマ4G10。上記ハイブリドーマは、
ブダペスト条約に基づいて1988年９月29日にアメリカン
・タイプ・カルチュア・コレクション（ATCC）、12301
Parklawn Drive、Rockville、MD、20852、USAに寄託さ
れた。
D.モノクローナル抗体組成物の製造方法 本発明は、レセプター誘発結合部位と免疫反応するモ
ノクローナル抗体を形成する方法に関する。この方法
は、次の工程を含むものである。
（ａ）動物にレセプター−リガンド複合体を免疫する。
これは、典型的には、免疫原の免疫学的に有効な量、即
ち、免疫応答を十分生じる量を免疫学的にコンピテント
な哺乳動物に投与することにより行われる。哺乳動物は
ウサギ、ラット又はマウスのような齧歯類が好ましい
が、ヤギ、ウマ及びサルのような他の哺乳動物を用いる
こともできる。次いで、哺乳動物は、レセプター−リガ
ンド複合体と免疫反応する抗体分子を分泌する細胞を産
生するのに十分な時間維持される。
（ｂ）次いで、免疫した哺乳動物から取り出した抗体分
泌細胞の懸濁液を調製する。これは、典型的には、哺乳
動物の脾臓を取り出し、当該技術において周知の方法を
用いて生理学的に許容しうる培地に個々の脾臓細胞を機
械的に分けることにより行われる。
（ｃ）懸濁した抗体産生細胞を形質転換された（“不死
性を獲得された”）細胞系を産生することができる形質
転換物質で処理する。形質転換物質及び不死性を獲得し
た細胞系を産生するそれらの使用は、当該技術において
周知であり、エプスタインバールウイルス（EBV）、シ
ミアンウイルス40（SV40）、ポリオーマウイルス等のDN
Aウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（Mo−MuL
V）、ラウス肉腫ウイルス等のRNAウイルス、P3X63−Ag
8.653、Sp2/O−Ag14等の骨髄腫細胞が挙げられる。
好ましい実施態様においては、形質転換物質で処理す
ると、懸濁脾臓細胞を適切な細胞系のマウス骨髄腫細胞
と適切な融合プロモーターを用いて融合することにより
ハイブリドーマの産生が生じる。好ましい比率は、約10
8脾細胞を含む懸濁液中１骨髄腫細胞に対して約５脾臓
細胞である。好ましい融合プロモーターは、平均分子量
約1000〜約4000を有するポリエチレングリコール（PEG
1000として市販されている）であるが、当該技術におい
て既知の他の融合プロモーターも用いられる。
用いられる細胞系は、非融合骨髄腫細胞が選択培地中
で生存しないが、ハイブリッドは生存するので、いわゆ
る“薬剤耐性”型であるべきであることが好ましい。最
も一般的な種類は、８−アザグアニン耐性細胞系であ
り、これは、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼが欠損しているので、HAT（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジン）培地で支持
されない。また、一般的には、用いられる骨髄腫細胞系
はいわゆる“非分泌”型であって、それ自体抗体を産生
しないが、分泌型が用いられることが好ましい。しかし
ながら、ある場合には、分泌骨髄腫系が選ばれる。
（ｄ）次いで、形質転換細胞を、好ましくはモノクロー
ン性にクローン化する。クローン化は、非形質転換細胞
を支持しない組織培養基中で行われることが好ましい。
形質転換細胞がハイブリドーマである場合、これは、別
の容器で、非融合骨髄腫細胞を支持しない選択培地中の
非融合脾細胞、非融合骨髄腫細胞及び融合細胞（ハイブ
リドーマ）の混合液を非融合細胞を十分死滅することが
できる時間（約１週間）希釈培養することにより行われ
る。希釈及び培養は、別の容器で行われ、希釈は、限界
希釈とし、各々別の容器（例えば、ミクロリットルプレ
ートの各ウェル）中で特定の細胞数（例えば１−４）を
単離するように、希釈容量が統計的に算出される。培地
は、薬剤耐性（例えば、８−アザグアニン耐性）非融合
骨髄腫細胞系を支持しないもの（例えば、HAT培地）で
ある。
（ｅ）クローン化形質転換細胞の組織培養基を遊離リガ
ンドと免疫反応せず、レセプター−リガンド複合体の一
部として存在する場合にリガンドと免疫反応する分泌抗
体分子の存在について評価する。この評価は、後述され
る周知の免疫学的手法を用いて行われる。
（ｆ）所望の形質転換細胞が工程（ｅ）で同定される
と、それが選ばれ、適切な時間適切な組織培養基中で増
殖され、次いで、所望の抗体を培養上清から回収する。
適切な培地及び培養時間の長さも、当該技術において周
知であり、容易に決定される。
極めて高い濃度のわずかに純粋でないモノクローナル
抗体を生産するために、ハイブリドーマが発育できるマ
ウス又は他の哺乳動物、好ましくは同系又は半同系マウ
スに所望のハイブリドーマを注入することができる。適
切なインキュベーション時間の後、ハイブリドーマは抗
体産生腫瘍を形成させ、宿主マウスの血流及び腹腔浸出
液（腹水）に高濃度の所望の抗体（約５−20mg/ml）が
生じる。
これらの組成物の調製に有効な培地及び動物は、当該
技術において周知で市販されており、合成培養基、近交
系マウス等が挙げられる。合成培地の例は、4.5gm/lグ
ルコース、20mmグルタミン及び20％ウシ胎児血清で補足
されたダルベッコの最小必須培地［DMEM;Dulbecco等、V
irol.8:396（1959）］である。近交系マウス株の例は、
Balb/cである。
上記の方法で産生されたモノクローナル抗体は、RIBS
含有免疫反応生成物の形成が所望される、例えば、診断
及び治療法で用いることができ、以下で詳細に述べられ
る。そのような用途としては、例えば、生体試料におい
てフィブリノーゲン結合血小板を検出する本発明の診断
法及び系、例えば、血栓の生体内検出、血栓の分散又は
血栓の画像診断の場合が挙げられる。
RIBSモノクローナル抗体は、典型的には、水性組成物
中で用いられる。この組成物は、入手した組織培養基も
しくは腹水又は希釈された形とすることができる。この
ような組成物は、典型的には、試験管内で用いられる。
生体内で使用する場合、RIBSモノクローナル抗体は、
典型的には、硫酸アンモニウムでの沈澱、アフィニティ
ー精製法等により精製され、次いで、薬学的に許容しう
る希釈剤の水性組成物中で用いられる。RIBSモノクロー
ナル抗体の水性組成物中の濃度は、所望の用途に適する
ように調節される。
E.治療方法及び組成物 前述の任意の寄託ハイブリドーマによって分泌された
モノクローナル抗体及び同様の免疫特異性を有する抗体
は、血餅又は血栓に関する領域で特に有効である。これ
は、抗−RIBSモノクローナル抗体が結合フィブリノーゲ
ンを含む活性化血小板に存在するフィブリノーゲン−GP
II b−III aレセプター複合体と免疫反応し、血小板結
合フィブリノーゲンが血栓形成に関係があるためであ
る。更に、RIBSモノクローナル抗体は、循環血に生体内
で存在する可溶性フィブリノーゲンと免疫反応しないは
ずであるので、１種以上のモノクローナル抗体の使用に
より免疫反応の極端な特異性を有することができる。
本抗体組成物の数種の好ましい用途を下記に述べる。
1.血栓分散 本発明の１態様は、血栓の分散方法である。ここで、
ATCC寄託ハイブリドーマ2G5、2F10、3G11及び4G10の少
なくとも１種によって産生されたモノクローナル抗体の
抗体分子をプラスミノーゲン活性化酵素に化学的に結合
して、複合体の抗体部分のそのRIBSに対する結合が実質
的に損傷されておらず、酵素のプラスミノーゲン活性化
因子活性も損傷されていない複合体を形成する。複合体
の両方の部分の活性が実質的に損傷されていない抗体−
タンパク質複合体の調製方法は、当業者に周知である。
プラスミノーゲン活性化酵素は、体組織の繊維素溶解
又はフィブリノーゲン分解なしで血栓溶解を誘発する組
織プラスミノーゲン活性化因子のようなプロトロンビン
溶解類の繊維素溶解剤群を意味する。企図される他の繊
維素溶解剤は、プロアクチベータープラスミノーゲンと
相互作用するものであり、ストレプトキナーゼ、ウロキ
ナーゼ（ｕ−PA）及び組織プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ−PA）が挙げられるがこれらに限定されない。
本方法によれば、前記複合体の血栓分散量を含む薬学
的に許容しうる水性組成物を分散されるべき血栓を有す
るヒトのような哺乳動物に静脈注射又は注入等により投
与される。このように治療された哺乳動物は、複合体の
抗体部分が血小板結合フィブリノーゲン複合体と免疫反
応し、複合体のプラスミノーゲン活性化酵素部分がプラ
スミノーゲンを活性化するのに十分な時間維持される。
複合体の除去は困難で時間を要する仕事であるので、治
療された哺乳動物はそれ自体が通常の手段で複合体を取
り除くのに十分な時間維持される。
2.血栓形成の阻止 大手術、例えば、冠動脈バイパス手術後の最も重要な
数日間に人のような血栓形成の危険にある動物に対し
て、もう１つの治療方法が予想される。
ここで、薬学的に許容しうる水性組成物に存在するAT
CC寄託ハイブリドーマ2G5、2F10、3G11及び4G10の少な
くとも１種によって産生された抗体分子を含むモノクロ
ーナル抗体の血栓阻止量を血栓形成が阻止されるべきヒ
トのような哺乳動物に投与する。治療された哺乳動物
（投与された哺乳動物）は、投与されたRIBSモノクロー
ナル抗体が通常の手段でその動物から取り除かれるのに
十分な時間維持される。
本方法において、RIBSモノクローナル抗体と結合フィ
ブリノーゲンを含む活性化血小板との免疫反応は、血栓
形成を阻止する。RIBSモノクローナル抗体が血小板上の
フィブリノーゲン−GP II b−III a複合体と免疫反応
し、血中のフィブリノーゲンと免疫反応しないので、治
療された動物の正常な機能が損傷されないことは当然の
ことである。
関連の実施態様においては、血小板含有溶液にATCC寄
託ハイブリドーマ2G5、2F10、3G11及び4G10の少なくと
も１種によって産生されたモノクローナル抗体分子を含
む薬学的に許容しうる水性組成物を投与することを含む
血小板凝集を阻止する方法が企図される。抗体の血小板
凝集阻止量は、血小板凝集阻止が所望される動物の動物
体に生体内投与されるか又は血小板含有溶液、例えば血
漿又は血液と試験管内で混合される。RIBSモノクローナ
ル抗体と血小板上のフィブリノーゲン−GP II b−III a
複合体との免疫反応は、血小板凝集を阻止する免疫反応
生成物を形成する。
前述の単一RIBSモノクローナル抗体は、上記方法の各
々で用いることができるし、１種以上を含む混合液を用
いることもできる。即ち、４種のATCC寄託ハイブリドー
マによって産生されたモノクローナル抗体の各々はRIBS
モノクローナルである特性を共有するが、各抗体結合部
位は同一のエピトープと免疫反応しない。従って、モノ
クローナル抗体の混合物（単独又は複合体として）を用
いるので結合部位の単一結合フィブリノーゲン分子に対
する複数結合が生じることができることによる利点が得
られる。
上記２つの方法はフィブリノーゲン−GP II b−III a
複合体と特異的に免疫反応するRIBSモノクローナル抗体
によって記載されているが、RIBSを含む他のリガンド−
レセプター複合体の場合、同様の方法が適用できる。
有効成分として抗体分子を含む薬学的に許容しうる水
性組成物の調製は、当該技術において十分に理解され
る。典型的には、そのような組成物は、液剤又は懸濁液
剤のように注射用剤として調製されるが、注射の前に水
性液に溶解又は懸濁するのに適した固体も調製すること
ができる。製剤を乳化することもできる。
複合体又はモノクローナル抗体単独は、たいてい、周
知である薬学的に許容しうる且つ複合体又はモノクロー
ナル抗体と適合しうる賦形剤と混合される。適切な賦形
剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロ
ール、エタノール等及びその組み合わせである。更に、
場合によって、組成物は有効成分の有効性を高める補助
物質、例えば湿潤又は乳化剤、pH緩衝剤の少量を含むこ
とができる。
複合体又はモノクローナル抗体は、中和された薬学的
に許容しうる塩として上記水性組成物に処方することが
できる。薬学的に許容しうる塩としては、無機酸例えば
塩酸又はリン酸あるいは有機酸、例えば、酢酸、酒石
酸、マンデル酸等と生成される酸付加塩（酵素又は抗体
分子の遊離アミノ基と生成される）が挙げられる。遊離
カルボキシル基と生成される塩もまた、無機塩基、例え
ば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル
シウム又は第２鉄及び有機塩基、例えば、イソプロピル
アミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノー
ル、ヒスチジン、プロカイン等から誘導することができ
る。
治療用抗体分子含有組成物は、慣用的には、例えば、
単位用量の注射により、静脈投与される。組成物は、投
薬処方と適合しうる方法でまた治療的に、即ち、血栓分
散又は血栓阻止に有効な量で投与される。
3.抗体中和 本発明のポリペプチドと免疫反応する抗−RIBS抗体を
“中和”又は阻害する治療方法も予想される。従って、
抗体が過度に血小板凝集を阻害する場合のように、容認
できない高レベルで患者に存在する抗体の濃度は、前述
のポリペプチドの治療的に有効な量を患者に投与するこ
とにより効果的に低下させることができる。典型的に
は、ポリペプチドは無菌医薬組成物としてまた本明細書
に記載される単位剤形で投与される。
4.投与法 本発明の接種物に関する“単位用量”は、動物に対す
る単位投薬として適切な物理的に分離している単位を意
味し、各々の単位は、要求される希釈剤、即ち、キャリ
ヤ又は賦形剤と共に所望の免疫原作用を生じるように算
出された活性物質の所定量を含有する。本発明の新規な
単位用量の基準が定められ、本明細書で詳細に開示され
る（ａ）活性物質のユニークな特徴及び達成されるべき
具体的な免疫原作用並びに（ｂ）動物において免疫用の
活性物質を配合する当該技術の固有の制約に直接的に左
右され、これらは本発明の特徴である。
単位剤形は、典型的には、水性組成物を生成するため
に、凍結又は乾燥抗体から水、食塩水又はリン酸塩緩衝
食塩水のような生理的に許容しうる（容認しうる）希釈
剤又は賦形剤に分散することにより調製される。そのよ
うな希釈剤は、当該技術において周知であり、例えば、
Remington's Pharmaceutical Sciences、16th Ed.、Mac
k Publishing Company、Easton、PA（1980）p.1465−14
67に述べられている。
剤形には、希釈剤の一部としてアジュバントを含める
こともできる。完全フロイントアジュバント（CFA）、
不完全フロイントアジュバント（IFA）及びミョウバン
のようなアジュバントは、当該技術において周知の材料
であり、数社から市販されている。
投与されるべき抗体組成物の量は、特に、治療される
べき動物種、動物の大きさ、血栓のサイズ（既知の場
合）、存在するフィブリノーゲン結合血小板の量及び複
合体又はモノクローナル抗体を使用する患者の能力に左
右される。投与されるべき必要な複合体又はモノクロー
ナル抗体の正確な量は、実施者の判断にかかっており、
特にヒトが治療される動物である場合、各個体に特有の
ものである。しかしながら、投薬範囲は、治療的に有効
な血液濃度を特徴とすることができ、本発明の抗体含有
複合体又は抗体単独の濃度から、約0.01〜約100μＭ、
好ましくは約0.1〜10μＭの範囲とすることができる。
開始投与及び追加注射の適切な用法も変化しうるが、
典型的には、開始投与後、引き続き注射又は他の投与に
より１時間以上の間隔で繰り返し投与される。また、血
中の治療的に有効な濃度を維持するのに十分な連続静脈
注入も予想される。
F.診断系 本発明のキット形態の診断系は、少なくとも１回の分
析に十分な量で、本発明のRIBSモノクローナル抗体、例
えば４種のATCC寄託ハイブリドーマの１種によって産生
されたものを別個のパッケージ試薬として含む。RIBSと
RIBSモノクローナル抗体との免疫反応の存在を表示する
標識も、同一又は別のパッケージに含めることが好まし
い。パッケージ試薬の使用書も典型的には含められる。
使用書には、典型的には、試薬濃度又は少なくとも１
回の分析方法のパラメーター、例えば、混合されるべき
試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物の維持時間、温
度、バッファー条件等を記載する実質的な方法が含まれ
る。
本発明の１実施態様は、血液又は血漿のような血小板
含有血液試料中のフィブリノーゲン結合血小板を分析す
るキット形態の診断系である。系は、レセプターリガン
ド複合体によって発現されるRIBSと免疫反応するモノク
ローナル抗体を含むパッケージを含む。モノクローナル
抗体の抗RIBS抗体分子は、次のハイブリドーマ：ハイブ
リドーマ2G5、ハイブリドーマ2F10、ハイブリドーマ3G1
1及びハイブリドーマ4G10の１種によって産生されたも
のであることが好ましい。抗体分子は、１個以上の特定
のモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物
として存在することが好ましい。更に、抗体分子が放射
性核種標識、好ましくは125I−標識に結合するキットが
好ましい。有効な標識は後述される。
もう１つの実施態様においては、本発明の診断系は、
生体内血栓の存在を分析するのに適切である。系は、レ
セプター−リガンド複合体によって発現されるRIBSと免
疫反応するモノクローナル抗体分子を含むパッケージを
含む。存在する抗体分子は、2G5、2F10、3G11及び4G10
からなる群より選ばれたハイブリドーマによって分泌さ
れたものであることが好ましい。抗体分子は、生体内標
識又は表示手段に結合されることが好ましい。
生体内画像診断用キットは、たいてい、試験管内分析
に用いられるが、逆が当てはまる必要がないことは理解
される。例えば、生体内研究に用いられるモノクローナ
ル抗体は、水性組成物及び試薬の任意の緩衝塩であるべ
きであるように発熱原因物質を除くべきである。発熱原
因物質含量を除くことは、試験管内分析には必要ない。
更に、生体内画像診断に有効な表示手段は、後述される
試験管内で用いられるものと典型的に異なる。即ち、分
析系は、生体内画像診断に適切であり、適切な緩衝塩、
水溶液及び表示手段は、同一又は別のパッケージ中キッ
トの一部として備えられる。
好ましい実施態様においては、本発明の診断系は、更
に本発明の抗体分子を含む免疫反応複合体の形成を指示
することができる標識又は表示手段を包含する。
本明細書で用いられる文法上種々の形の用語標識及び
表示手段は、複合体の存在を示す検出しうるシグナルの
発生に直接的にあるいは間接的に関与するシグナル原子
及び分子を意味する。生体内標識又は表示手段は、ヒト
体内で有効なものであり、111In、99Tc、67Ga、186Re及
び132Iが挙げられる。
任意の標識又は表示手段は、本発明の複合体又はモノ
クローナル抗体組成物の一部である抗体分子に結合又は
組み込むことができ、それらの原子又は分子は、単独で
又は別の試薬と連結して用いることができる。そのよう
な標識はそれら自体臨床診断化学において周知であり、
別の新規なタンパク質方法及び／又は系で用いられる限
りにおいては、本発明の一部を構成する。
標識の抗体への結合、即ち、標識化は、当該技術にお
いて周知のことである。例えば、ハイブリドーマによっ
て産生された抗体分子は、培養基中に成分として与えら
れた放射性同位元素含有アミノ酸の代謝取り込みにより
標識することができる。例えば、Galfre等、Meth.Enzym
ol.、73:3−46（1981）参照。活性化官能基によるタン
パク質複合又は結合法が特に適用しうる。例えば、Aura
meas等、Scan d.J.Immunol.、Vol.8 Suppl.7:7−23（19
78）、Podwell等、Biotech.、3:889−894（1984）及び
米国特許第4,493,795号参照。
試験管内診断系には、好ましくは別のパッケージとし
て、特異的結合物質を含めることもできる。“特異的結
合物質”は、本発明のモノクローナル抗体を選択的に結
合することができる分子成分であるが、本発明の抗体分
子自体ではない。具体的な特異的結合物質は、第２抗体
分子、補体タンパク質又はその断片、S.アウレウスプロ
テインＡ等である。本発明のRIBSモノクローナル抗体が
リガンド−レセプター複合体との免疫複合体の一部とし
て存在する場合、特異的結合物質はそのモノクローナル
抗体と結合する。好ましい実施態様においては、特異的
結合物質は標識される。しかしながら、診断系が標識さ
れない特異的結合物質を含む場合、特異的結合物質は、
典型的には、増幅手段又は試薬として用いられ、標識し
た第２試薬が特異的結合物質（増幅手段）に結合する。
これらの実施態様においては、増幅手段がRIBSモノクロ
ーナル抗体含有免疫複合体に結合される場合、標識第２
試薬は増幅手段と特異的に結合することができる。
本発明の診断用キットは、血清、血漿又は尿のような
体液試料中のリガンド−レセプター複合体、例えば、フ
ィブリノーゲン結合血小板の存在又は量を検出するため
に、“ELISA"法で用いることができる。“ELISA"は、酵
素結合免疫吸着剤検定を意味し、試料中に存在する抗原
又は抗体量を検出及び定量するために、固体支持体及び
酵素−抗原又は酵素−抗体を形成する固相マトリックス
に結合された抗体又は抗原（ここでは、RIBS含有リガン
ド−レセプター複合体）を使用する。ELISA法の説明
は、1982年にLos Altos、CAのLange Medical Publicati
onsにより出版されたD.P.Sites等、Basic and Clinical
Immunologyの第４版、第22章並びに米国特許第3,654,0
90号、同第3,850,752号及び同第4,016,043号にあり、こ
れらを全て参考として本明細書に引用する。
好ましいELISAキット実施態様においては、本診断系
において別にパッケージされる固体支持体を形成するた
めに、本発明の抗体分子は固体マトリックスに付着され
る。抗体は、典型的には、水性培地から吸着により固体
マトリックスに付着するが、当業者に周知の他の付着方
法も用いられる。
リガンド−レセプター複合体又はその成分の１つに結
合する標識特異的結合物質又は非標識特異的結合物質と
特異的結合物質に結合する標識第２試薬もまた、キット
中に１個又は２個の別のパッケージとして各々含まれ
る。マトリックス結合抗体の例としてATCC寄託ハイブリ
ドーマの１種によって産生されたモノクローナル抗体の
１種を用いた市販されている標識抗フィブリノーゲン抗
体は、特異的結合物質の例である。
有効な固体マトリックスは、当該技術において周知で
ある。そのような材料としては、Pharmacia Fine Chemi
cals（Piscataway、NJ）から商標SEPHADEXとして入手で
きる架橋デキストラン；アガロース;North Chicago、IL
のAbbott Laboratoriesから入手できる約１μから約5mm
径までのポリスチレンビーズ；ポリ塩化ビニル、ポリス
チレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース−
又はナイロンベースのシート、ストリップ又はパドルの
ようなウェブ；又はポリスチレン又はポリ塩化ビニル製
等のチューブ、プレート又はミクロリットルプレートの
ウェルが挙げられる。
本明細書で記載される任意の診断系のモノクローナル
抗体（標識又は非標識）、標識特異的結合物質又は増幅
試薬は、液状分散液又は実質的な乾燥末、例えば、凍結
乾燥体として溶液に供給することができる。表示手段が
酵素である場合には、酵素の基質も、キット系の別のパ
ッケージとして備えられる。前記マイクロタイタープレ
ートのような固体支持マトリックス及び１種以上のバッ
ファーもまた、本診断用アッセイ系において別のパッケ
ージ品として含められる。
診断系に関して本明細書で述べたパッケージは、診断
系で慣用的に利用されるものである。そのようなパッケ
ージとしては、ガラス及びプラスチック（例えば、ポリ
エチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート）ビ
ン、バイアル、プラスチック及びプラスチックホイル積
層外包等が挙げられる。
G.分析法 本発明は、例えば、血栓又はフィブリノーゲン結合血
小板、好ましくはGP II b−III a:フィブリノーゲンに
あるレセプター−リガンド複合体を検出方法に関する。
この方法は、レセプター誘発結合部位（RIBS）の発現と
レセプター−リガンド複合体のリガンド部分のRIBSと免
疫反応するが、非結合レセプター又は非結合リガンドと
反応しないモノクローナル抗体分子を利用する。そのよ
うな免疫複合体を形成するために用いられる周知の多く
の臨床診断化学があることを、当業者は理解するであろ
う。即ち、具体的な分析法を本明細書で述べるが、本発
明がそのように限定されるものではない。
1.血栓検出 更に詳細には、ヒトのような哺乳動物において血栓の
存在を検出する方法が企図される。生体内表示手段に結
合される抗体分子を含む本発明のモノクローナル抗体の
画像診断有効量を含む水性組成物をその治療を必要とし
ている哺乳動物、例えば、ヒトに静脈投与する。
投与された哺乳動物は、標識抗体分子が血栓の一部と
して血小板結合フィブリノーゲン複合体と免疫反応する
のに十分な所定時間維持される。次いで、形成された任
意の標識免疫複合体の存在、好ましくは位置について、
本哺乳動物を分析することにより、血栓が検出され、好
ましくは位置が確認される。標識RIBSモノクローナル抗
体が、通常、標識又は表示手段として放射性核種を含有
する場合、画像診断分析は、よく知られている通常の放
射線画像診断技術により行われる。このような技術は、
血栓の相対的に高い濃度の放射能標識と相対的に低い体
組織量の放射能標識とを識別することができる。相対的
に長命の放射性同位元素を使用する場合、投与された哺
乳動物は、標識モノクローナル抗体の実質的な体組織ク
リアランスが放射能標識の自然放射能シグナルの相対的
に一層低い量を与えるのに十分な時間維持される。
2.生体試料中のフィブリノーゲン結合血小板の検出 血小板含有及び／又は遊離フィブリノーゲン含有生体
試料、好ましくは血液又は血液の血小板含有部分のよう
な体液試料中のフィブリノーゲン結合血小板の存在、好
ましくは量を検出する競合的あるいは非競合的な種々の
異種及び同種分析プロトコールを用いることができる。
例えば、ヘパリン保存（凝固していない）血液試料と前
述の寄託RIBS抗体分子の１種の125I標識形態を混合す
る。意味のある結果が得られるように血液試料の量及び
濃度並びに標識モノクローナル抗体が用いられることは
当然のことである。このように生成された免疫反応混合
物は、試料中に存在するフィブリノーゲン結合血小板が
標識抗体と免疫反応し、標識免疫反応生成物を生成する
のに十分な時間生物分析条件下で維持される。次いで、
標識免疫反応生成物が存在する場合、存在してもよい非
反応標識抗体から分離する。同種分析においては、分離
は、典型的には試料に存在する血小板の全てを十分ペレ
ット化する遠心分離による。ELISAのような異種分析に
おいては、免疫反応生成物は固体支持体に結合され、分
離は典型的には非結合RIBS抗体が捨てられ固体支持体結
合免疫反応生成物が残る洗浄工程で行われる。
RIBS含有リガンド−レセプター複合体と免疫反応させ
るために、非標識RIBSモノクローナル抗体が用いられる
場合、第２の混合物が前述の分離された免疫複合体と標
識結合試薬又は増幅手段として用いられる非標識結合試
薬との間で生成される。この反応混合物は、第２結合複
合体が最初に生成された免疫複合体と特異的結合試薬と
の間で生成するのに十分な時間生物学的条件下で維持さ
れる。
特異的結合試薬が抗体分子を含む場合、その第２結合
複合体は第２免疫複合体である。S.アウレウスプロテイ
ンＡが用いられる場合、第２結合複合体は、結合が抗体
結合部位によらず、その複合体は結合複合体と呼ばれる
ことが最良である。免疫複合体は特異的結合複合体であ
るので、特異的結合試薬と最初に名付けられた免疫複合
体との間で生成された複合体は第２結合複合体である。
第２結合複合体は、その後、前述の技術により、存在し
てもよい未反応特異的結合試薬から分離され、標識の存
在により免疫複合体の存在が決定され、好ましくは定量
される。
特異的結合試薬を標識せず、増幅手段として用いられ
る場合、存在する場合には上記の分離第２結合複合体と
標識含有第２結合試薬から第３混合物が生成される。標
識試薬が混合されなかった上記方法において、第２結合
複合体の標識の存在が求められないことは当然のことで
ある。本方法の態様として、前記維持及び分離工程が繰
り返され、標識含有第３結合複合体が形成され、保持さ
れる。その後、標識の存在、好ましくは量が求められ
る。
即ち、本分析の上記態様の各々において、標識の存
在、好ましくは量は、フィブリノーゲン結合血小板の存
在、好ましくは量を求めるための基準を示している。
上記分析を行う研究者は、存在する標識の量が求めら
れるまで、通常、１種以上の免疫複合体又は結合複合体
が実際に生成されたかどうかがわからないことは留意さ
れる。しかし、RIBS含有複合体が実際に存在するかのよ
うに一定の分析方法の工程全てが行われる。
RIBSモノクローナル抗体のユニークな特異性のため
に、上記分析はフィブリノーゲン結合血小板用及び前記
画像診断分析は血栓用とすることができ、好ましくは遊
離血小板と遊離フィブリノーゲンの双方、即ち、非複合
化血小板及びフィブリノーゲンの存在下で行われる。結
果として、生体試料の分離及び洗浄工程のような特殊な
処理操作は、分析においてその試料を使用する前には行
う必要がない。この特徴は、RIBSモノクローナル抗体を
用いる全ての分析に共通である。
3.抗体検出 本抗体を、例えば、血液試料中に検出する方法も予想
される。この方法は、下記工程を含む。
（ａ）抗体を含むことが疑われる水溶液を表面、例え
ば、セファロースカラム上に固定化された本発明のポリ
ペプチドに加え； （ｂ）抗体−ポリペプチド免疫複合体が形成されるよう
に十分な時間及び所定の反応条件下で抗体を固定化ポリ
ペプチドと接触させて維持し； （ｃ）試験された溶液中の抗体の存在に関係がある形成
された免疫複合体の存在を求める。検出は、周知である
抗体の放射能標識化、結合抗体のELISA分析等によるこ
とができる。
生物検定の条件は、本発明の抗体分子の生物活性及び
分析されるべきフィブリノーゲン結合血小板又は他のRI
BS含有複合体を維持するものである。それらの条件とし
ては、約４〜約45℃、好ましくは約37℃の温度範囲、約
５〜９、好ましくは約７のpH値範囲及び蒸留水から約１
モルの塩化ナトリウムまで変動し、好ましくは生理的食
塩水程度のイオン強度が挙げられる。このような条件を
最適化する方法は、当該技術において周知のことであ
る。
実施例 下記実施例は、具体的な説明であるが、本発明の範囲
を限定するものではない。
実施例１ ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の産生 標準ハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗
体を産生した。簡単に言えば、Balb/cマウスを免疫し、
引き続き、Cierniewski等、Thromb.Haemostas.、48:33
−37（1982）に記載されているように実質的に調製した
フィブリンＤ−二量体免疫原のマウス１匹につき約50ミ
クログラム（μｇ）を３回追加免疫した。
引き続いて、抗体が免疫原と免疫反応した免疫マウス
１匹からの1.23×108脾細胞を2.46×107P3Ag8653.1マウ
スミエローマ細胞と細胞融合プロモーターポリエチレン
グリコール4000の存在下で混合した。こうして形質転換
した抗体産生細胞を１ウェルにつき約３×104細胞密度
で96ウェルマイクロタイターに移し、培養した。
培養約14日後に生存可能なハイブリドーマを含むと思
われる235ウェルからの組織培養上清を抗−RIBSの存在
についてラジオイムノアッセイによりスクリーンした。
簡単に言えば、１μg/mlのフィブリノーゲンあるいは低
密度リポタンパク質（LDL）を含むリン酸塩緩衝食塩水
（PBS）100ミクロリットル（μｌ）（対照）を固相マト
リックスとして平底96ウェルポリビニルマイクロタイタ
ープレートのウェルに混合した。次いで、プレートを４
℃で約16〜20時間維持して固体支持体を形成するために
ウェルの表面にフィブリノーゲン又はLDLを吸着させ
た。被覆溶液を振盪により除去し、ウェルを洗浄し、10
0μｌの阻止溶液（５％正常ヤギ血清を含むPBS）を各ウ
ェルに混合して過剰のタンパク質結合部位を封鎖した。
ウェルを37℃で約30分間維持した後、阻止溶液を除去
した。次いで、各ウェルに100μｌの（ａ）PBSで1:10に
希釈したハイブリドーマ組織培養上清又は（ｂ）競合阻
害剤としてフィブリノーゲン100μg/mlを含むPBSで1:10
に希釈したハイブリドーマ上清を混合した。こうして生
成した免疫反応混合液を室温において約16〜20時間４℃
で維持して固相結合免疫反応生成物及び非結合モノクロ
ーナル抗体分子を含む液相を形成した。
次いで、各ウェルに100μｌの125I−標識ヤギ抗マウ
スIgGを混合した。こうして生成した標識免疫反応混合
液を４℃で約６〜20時間維持して125I−標識固相免疫反
応生成物を生成した。固相及び液相を分けて非結合125I
−標識ヤギ抗マウスIgGを除いた。各ウェルに対して125
I−結合量をγシンチレーションにより求めた。
フィブリノーゲン被覆ウェル中のLDL−被覆ウェルか
ら求めた少なくとも約３倍量の非特異的結合125Iの存在
は、組織培養上清中の抗フィブリノーゲン抗体の存在を
示した。免疫反応混合液中液相フィブリノーゲン競合阻
害剤の存在による［上記（ｂ）］固相結合125Iの約15％
以下の減少は、組織培養上清中抗RIBS抗体の存在を示し
た。
上記スクリーニング操作により、フィブリノーゲン:G
P II b−III a複合体と結合する抗体RIBS抗体を作成す
る2G5、2F10、3G11及び4G10と称する４種のハイブリド
ーマの同定が得られた。ハイブリドーマは次のATCC寄託
番号を有する:2G5（HB9847）、2F10（HB9844）、3G11
（HB9845）及び4G10（HB9846）。
４種の上記ハイブリドーマの各々を限界希釈により２
回クローン化し、引き続き腹水液を作成するために用い
た。次いで、プロテインＡセファロースを用いて腹水液
から抗体を単離した。
Mage等、Methods in Enzymology、70:142−50（198
0）の方法に従って、プロテインＡセファロース−単離M
ab 2F10をパパインで（MAbのパパインに対する重量200:
1）37℃で６時間消化して、モノクローナル抗体（MAb）
のFab断片を含む組成物を調製した。プロテインＡセフ
ァロースのクロマトグラフィーにより、消化されない抗
体とFc断片をFab断片から除いた。セファロースから得
られたFab断片を集めて2F10 Fab標品を形成した。
実施例２ 活性化血小板上のフィブリノーゲン:GP II b−III aRIB
Sの検出 ハイブリドーマ2G5、2F10及び3G11により作成したモ
ノクローナル抗体、即ち、各々MAb 2G5、MAb 2F10及びM
Ab 3G11を細胞表面結合RIBSとの免疫反応能について試
験した。４種のモノクローナルの各々を標準クロラミン
−Ｔ法を用いて125I標識した。Greenwood等、Bio.Chem.
J.、89:114−123（1963）。
ヒルジン（Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO）を1m
lにつき0.06単位（U/ml）の処方濃度で含む5mlのACD
（0.065Mクエン酸、0.085Mクエン酸ナトリウム、２％デ
キストロース）に６ミリリットル（ml）のヒト全血を集
め、120×ｇで15分間遠心した。得られた血小板を多く
含む血漿を示す上清を回収し、単離し、更に1200×ｇで
遠心して単離した血小板のペレットを形成した。
単離した血小板を1mg/mlのウシ血清アルブミン（BS
A）及び1mg/mlのデキストロースを含む2mlのカルシウム
を含まないタイロードバッファー（0.13M NaCl、0.0026
M KCl、0.002M MgCl2−6H2O、5mM Hepes、0.012M NaHCO
3、pH7.2）に懸濁した。次いで、同一のタイロードバッ
ファーで平衡化したセファロースCL2Bカラム（全床容量
40ml;Pharmacia Inc.、Piscataway、NJ）に血小板懸濁
液を加えた。洗浄血小板をCL2Bカラムの空隙から最終容
量約４〜5mlで回収した。
次いで、アデノシンジホスフェート（ADP）と10マイ
クロモル（μＭ）の濃度まであるいはトロンビンと0.1
単位/mlの濃度まで混合して洗浄血小板の試料を賦活化
した。ADP−賦活化血小板の数試料をフィブリノーゲン
とフィブリノーゲン濃度1mMまで混合した。
非賦活化対照数試料を含む血小板の各試料に125I−標
識ＭAbを10ナノモル（nM）の濃度まで混合した。こうし
て生成した免疫反応混合液を22℃で30分間維持して免疫
反応生成物を形成した。0.3mlの20％スクロースにより
遠心分離して、免疫反応生成物を非結合125I−MAbから
分離した。血小板ペレットに結合した125I−MAbの量を
シンチレーション分光測定により求めた。
下記表２に示される本実験の結果は、抗RIBSモノクロ
ーナル抗体が非賦活化血小板と実質的に免疫反応しない
ことを示す。しかしながら、血小板をADP又はトロンビ
ンのようなアゴニストで賦活化すると、細胞上にＭAbと
フィブリノーゲン:GP II b−III a複合体との著しい免
疫反応が得られる。血小板のADP又はトロンビンによる
賦活は、血小板内在性フィブリノーゲンの分泌及びGP I
I b−III aによる表面結合を生じる。外在性フィブリノ
ーゲンの添加は、125I−MAbの賦活化血小板への結合を
中和（阻害）しないので、ＭAbがRIBS特異性であること
を示す、即ち、これらは溶液中で遊離フィブリノーゲン
と免疫反応しない。同様の結果がMAb 4G10で得られた。
外在的に添加されたフィブリノーゲンが細胞結合でな
く（即ち、細胞レセプター−リガンド複合体の一部では
ない）、MAb 2G5、2F10、3G11及び4G10とフィブリノー
ゲン:GP II b−III a複合体との免疫反応性を中和しな
い点を強調するために、２〜3mg/mlのフィブリノーゲン
を含有する血小板を多く含む血漿を用いてＭAbと血小板
との免疫反応性を試験した。
下記表３に示されるように、極めて過剰の遊離フィブ
リノーゲンにもかかわらず、４種の125I−MAbは、血小
板表面上でフィブリノーゲン:GP II b−III a RIBSと免
疫反応した。
４種の寄託ＭAbのRIBSに対する特異性を示したよう
に、GP II b−III a血小板糖タンパク質レセプターを有
する血小板よりむしろMac−１を含む細胞を用いて、類
似のＭAb結合実験を行った。Mac−１及びGP II b−III
a共にレセプター−リガンド型のフィブリノーゲンに特
異的に結合するが、この２つの相互作用は異なった生物
学的結果を生じる。この結合実験においては、４種の寄
託RIBSはフィブリノーゲン−Mac−１複合体との免疫反
応を示さないが、フィブリノーゲンGP II b−III a複合
体中のフィブリノーゲンとは免疫反応する。従って、試
験した４種のＭAbは、GP II b−III aを含む複合体で発
現されたフィブリノーゲン上のRIBSと特異的に免疫反応
するが、Mac−１と複合体を形成した場合フィブリノー
ゲン上のRIBSとは免疫反応しない。
実施例３ RIBS抗体による血小板凝集阻止 実施例２で調製した200μｌの単離血小板をBSAとデキ
ストロース（各1mg/ml）、フィブリノーゲン（1mM）、
カルシウム（5mM）及び実施例２で調製した下記表４に
示される種々の量で存在するMAb 2F10のFab断片を含む1
90μｌのタイロードバッファーと混合した。次いで、10
μｌのADP（タイロードバッファー中80μＭ）を混合し
て血小板凝集を促進した。この混合液を37℃で維持する
とともに混合液の光透過の経時変化をDual Sample Aggr
egation Meter（Mode1 DP−247E、Sienco Inc.、Morris
on、CO）を用いてモニターした。
200μｌのPRP及び200μｌのタイロードバッファーを
含む溶液を用いて凝集メーターを検定して光透過の低い
ベースラインを対照凝集の場合５％に、抗体存在下の凝
集の場合10％に設定した。100mlのPRP及び300μｌのタ
イロードバッファーの混合液を用いて100％光透過の上
限を一様に設定した。
抗体による血小板凝集阻止を測定した際に得られた結
果を表４に示し、ADPを混合した約３〜４分後に測定し
た際に抗体を存在させずに得られた光透過（100％）の
％として表す。
表４の結果は、MAb 2F10断片が用量依存性の血小板凝
集を生じることを示している。即ち、結果は、フィブリ
ノーゲンGP II b−III a複合体に特異的なRIBSと免疫反
応する本発明の抗体を用いた場合、血小板凝集を阻止す
るのに有用な有効用量及び血栓形成のような血小板凝集
に関与する過程を示している。
実施例４ 2G5 MAbの特性 2G5と称するモノクローナル抗体は、κ軽鎖を含むサ
ブクラスのIgGである。精製抗体の産生、精製及び特徴
は、別に記載されている［Zamarron等、Thromb Haemos
t、64:41（1990）］。精製抗体を標準法［Guesdon等、J
Histochem Cytochem、27:1131（1979）］に従ってビオ
チン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Calbio
chem、La Jolla、CA）で、クロラミンＴ変法［McConahe
y等、Int Arch Allergy Apl Immunol、29:181（197
9）］により125Iで比活性約１μCi/μｇに標識した。抗
体のFab断片を酵素の基質に対する比率1:100（2/2）の
パパイン消化（Sigma Chem.Co.、St.Louis、MO）により
37℃で６時間調製した［Porter、Biochem J、73:119（1
959）］。非消化抗体及びFc断片をプロテインＡセファ
ロース（Pharmacia、AB、Uppsala、Sweden）のクロマト
グラフィーで除いた。抗体の完全な消化Fab標品の精製
をSDS−PAGEで確認した。本実験で用いるフィブリノー
ゲンに対する他のモノクローナル抗体をフィブリンＤ二
量体で免疫したマウスから誘導し、2G5と同一プロトコ
ールにより腹水から精製した。
フィブリノーゲンを新鮮なヒト血液からエタノール示
差沈殿で精製し［Doolittle等、Arch Biochem Biophy
s、118:456（1967）］、前述のように125Iで放射能標識
した［McConahey等、Int Arch Allergy Apl Immunol、2
9:181（1966）］。フィブリノーゲンのプラスミン消化
を記載されているプロトコールに従って行った［Veradi
等、Biochemistry、25:519（1986）］。5mM Ca2+を含む
0.15M NaCl、0.05M Tris、pH7.4中フィブリノーゲン（2
mg/ml）をまず、プラスミノーゲン（20μg/ml、最終濃
度）及びストレプトキナーゼ（Sigma）（200単位/ml、
最終濃度）を加えて生成したプラスミンで37℃において
１時間消化した。この消化物中の優性物質D100（分子量
約100,000の断片）を2G5カラムのアフィニティークロマ
トグラフィーで単離した（下記参照）。5mM Ca2+の代わ
りに5mM EGTA｛［エチレン−ビス（オキシエチレンニト
リロ）］四酢酸｝を含むトリスバッファーに試料を透析
し、プラスミノーゲン／ストレプトキナーゼ混合液と37
℃で４時間インキュベートして追加の消化を行った。選
択実験として、単離D100を更にCa2+を存在させずにプラ
スミンで37℃で24時間消化し、８時間後プラスミンの第
２添加により補足した。トラシノール（FBA Pharmaceut
ical、New York、NY）（200カリクレイン阻害単位/ml）
を加えてタンパク質分解を終結させた。
実施例５ 血小板結合性実験 0.1％ウシ血清アルブミンを含有する２価のイオンを
含まないタイロードバッファー、pH7.3中で示差遠心分
離し、次いで、セファロース2Bによりゲルろ過して、血
小板を新鮮なヒト血液から単離した［Marguerie等、J B
iol Chem、255:154（1980）］。抗体の血小板に対する
結合を次のように行った。血小板を２価のイオンを含ま
ないタイロードバッファーに１×108/mlで懸濁した。Ca
Cl2、最終濃度1mM及び賦活物質、10μM ADP又は0.5単位
/mlα−トロンビンを血小板に加えた。賦活物質として
トロンビンを用いた場合、トロンビンを加えて５分後に
30nM Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニ
ンケトン（Calbiochem）を加えて酵素を不活化した。次
いで、125I−標識抗体を最終濃度0.1μＭで加え、１μ
Ｍフィブリノーゲンなし又はありで結合性を測定した。
平行して、細胞に結合する125I−フィブリノーゲンを0.
3μＭのリガンドで［Marguerie等、J Biol Chem、255:1
54（1980）］に記載されているように測定した。反応混
合液の50μｌ分量を20％スクロースにより遠心分離し
て、血小板結合リガンドを遊離リガンドから分離し、結
合されたリガンド分子を比活性に対して計算した。
実施例６ 血小板結合性の検討 ヒトフィブリノーゲン（0.3μＭ）及びCaCl2（1mM）
の存在下で血小板を37℃で攪拌した。次いで、異なった
濃度（０〜２μＭ）の2G5、そのFab断片又は匹敵するサ
ブクラスの対照抗体を加え、10μM ADPを加えて凝集を
開始させた。二試料アグレゴメータ（Sienco、Inc.、Mo
rrison、CO）を用いて、血小板懸濁液による光透過の変
化として凝集をモニターした。
実施例７ 酵素結合免疫吸着剤検定法（ELISA） ポリビニルマイクロタイターウェルを２μg/mlの濃度
の100μｌタンパク質で４℃において一晩被覆した。１
％ウシ血清アルブミンを含むPBS（0.25M NaCl、0.01Mリ
ン酸塩バッファー、pH7.3）でポストコートし、次い
で、PBS−0.05％トゥイーン20で洗浄し、非標識又はビ
チオニル化抗体と２時間インキュベートした。次いで、
プレートをPBS−トゥイーン20で広範囲にわたって洗浄
し、アルカリ性ホスファターゼ（Calbiochem）に結合し
た第２抗体又はアビジンと１時間インキュベートした。
洗浄後、基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートを用い、
405nmの吸光度を測定して、結合を定量した。競合実験
を行う場合には、競合物質を抗体と22℃で15分間インキ
ュベートした後、マイクロタイタープレートのウェルに
加えた。
実施例８ ペプチド合成及びタンパク質のアミノ酸配列決定 フィブリノーゲンγ鎖のセグメントに対する配列に対
応するペプチドを、Applied Biosystemsから購入したフ
ェニルアセトアミドメチル樹脂とｔ−ブトキシカルボニ
ルアミノ酸を用いてApplied Biosystems 430型ペプチド
シンセサイザー（Foster City、CA）による固相合成に
より調製した。C18μ Bondapakカラムを用いたHPLCで0.
1％トリフルオロ酢酸中アセトニトリルの直線勾配によ
り、ペプチドの均質性を分析し、＞85％均質であること
が判明した。6N HCl中で24時間の加水分解物によるペプ
チドのアミノ酸組成を求め、結果は理論収量と一致し
た。
SDS−PAGEのクーマシーブルー染色によって確認され
た選択バンドに対して、タンパク質のアミノ酸配列を求
めた。問題のバンドをゲルから切り取り、［Matsudair
a、J Biol Chem、262:10035（1987）］に記載されてい
るように直接気相シークエネーター（Applied Biosyste
ms 475A型）のNH2−末端アミノ酸配列分析にかけた。ヒ
ト、ウシ及びラットフィブリノーゲンの個々の連鎖のア
ミノ酸配列の線列をRixon等、Biochemistry 22:3237（1
983）;Chung等、Biochemistry 22:3244（1983）;Chung
等、Biochemistry 22:3250（1983）;Crabtree等、Cell
31:159（1982）及びジーンバンクデータベースより入手
した。
実施例９ 分析操作 製造業者の指示書に従って、精製抗体をCNBr活性化セ
ファロース4B（Pharmacia）に結合することにより、2G5
のアフィニティークロマトグラフィーを行った。置換度
は、沈降ゲル1mlに対して結合される抗体1mgとした。22
℃においてPBS−0.04％アジドで平衡化した1.1×4.5cm
のカラムでアフィニティークロマトグラフィーを行っ
た。試料をカラムに加え、結合物質を1Mの水酸化アンモ
ニウム（pH11.5）で溶離した。SDS−PAGEをレムリ［Lae
mli、Nature、227:280（1970）］のバッファー系で垂直
スラブゲルにより行った。ウェタンブロット分析の場
合、タンパク質試料をSDS−PAGEで分解し、イモビロンP
VDF膜（Millipore、Bedford、MA）に電気泳動的に移し
た。移動物をビオチニル化形態の抗体（５μg/ml）でプ
ローブし、アビジン（Calbiochem）及び酵素基質ブロモ
クロロインドリルホスフェート及びニトロブルーテトラ
ゾリウム（Sigma）に結合したアルカリ性ホスファター
ゼで可視化した。タンパク質溶液の１滴を直接イモビロ
ン膜に加えてドットブロット分析を行った。吸着タンパ
ク質との抗体反応性を［Zamarron等、Thromb Haemost、
64:41（1990）］に記載されているように可視化した。
実施例10 実施例１〜９の検討 2G5によって認識された血小板結合フィブリノーゲンに
よるRIBSの発現 以前の研究においては［Zamarron等、Thromb Haemos
t、64:41（1990）］、プラスチックマイクロタイタープ
レート又はろ紙に固定化したフィブリノーゲンと反応す
る2G5モノクローナル抗体が証明されたが、2G5は可溶性
フィブリノーゲンと反応しなかった。本実験で提起され
た最初の問題は、血小板の表面上のGP II b−III a、そ
のレセプターに対するフィブリノーゲンの結合が認識さ
れたエピトープも露出したかどうか；即ち、レセプター
の占有がフィブリノーゲンリガンド内のコンホーメーシ
ョン変化を誘発してRIBSエピトープを誘発するかどうか
であった。
図１は、GP II b−III aのフィブリノーゲンとの変化
しうる占有を生じる条件下で放射能標識抗体の洗浄ヒト
血小板に対する結合を示している。フィブリノーゲンは
非賦活化血小板への結合が最少であり、抗体もまた、外
在的に添加されたフィブリノーゲンのあり又はなしで細
胞に結合することができない。血小板のADP賦活は、GP
II b−III aを潜在状態からフィブリノーゲンを結合す
るのに適格な状態に転換する。フィブリノーゲンなしで
のフィブリノーゲンの賦活は、抗体結合のわずかな増加
しか誘発しなかった。
しかしながら、フィブリノーゲンが存在する場合、AD
P賦活細胞に対して多くの抗体結合が観察された。フィ
ブリノーゲンの存在下でADPに結合する抗体の増加分
は、約17倍であった。これらの同一実験条件下で３人の
異なるドナーの血小板を用いたこの増加分は、17.2±2.
4倍であった。添加フィブリノーゲンの0.1％しか混合液
中で血小板結合されないと考えると、抗体の細胞結合フ
ィブリノーゲンの結合は非常に選択的である。血小板結
合フィブリノーゲンの識別も、細胞が異種のアゴニスト
（トロンビン）で賦活される場合に生じた。トロンビン
賦活血小板はまた、外在的に添加されたフィブリノーゲ
ンの存在下で抗体を結合した。抗体のトロンビン賦活血
小板に対する適度な結合は、添加フィブリノーゲンなし
でさえも観察され、分泌される内在フィブリノーゲンへ
の抗体の結合を表すことができ、細胞表面上のGP II b
−III aに結合されるようになる［Courtois等、Eur J B
iochem、159:61（1986）］。纏めて考えると、これらの
観察は、血小板上のGP II b−III aへのフィブリノーゲ
ンの結合が2G5によって認識されたエピトープを露出す
ることを示している。
血小板凝集に関する2G5の作用 フィブリノーゲンのその血小板レセプターに対する結
合は、血小板凝集に必要な段階である。初期の研究にお
いては、この細胞−細胞相互作用について無傷2G5の作
用は、添加フィブリノーゲンの存在下ADPで賦活した洗
浄血小板を用いて分析された。下記表５に示されるよう
に、最終濃度１μＭにおいて、2G5は血小板凝集を完全
に消滅させた。フィブリノーゲンに対して他の３種の抗
体を対照として試験した。これらの抗体の２種、抗−Fg
−88及び抗−Fg−85は、血小板凝集に影響しなかった。
３番目の対照抗体、抗−Fg−128も血小板凝集を消滅さ
せた。抗−Fg−128の阻止活性の基準は、血小板に結合
するフィブリノーゲンの阻害によるものとすることがで
き、即ち、0.6μＭ濃度の抗−Fg−128は125I−フィブリ
ノーゲン結合を阻止した。
血小板凝集について2G5の作用を更に調べた。抗体のF
ab断片は、血小板凝集の阻止力を保持した。Fab断片の
阻止活性は用量依存性であり、この機能応答の完全な阻
止は、２μＭ濃度の断片で得られた。Fab断片は、それ
以後の凝集応答を阻害するにもかかわらず、血小板の形
状変化が生じることによって示されるように血小板賦活
を妨害しない。
2G5エピトープの局在化 2G5エピトープは、以前には、フィブリノーゲンγ鎖
及びフィブリノーゲンの高分子量（Mr＝100,000）プラ
スミン分解産物、D100によって発現されることが知られ
ていた［Zamarron等、Thromb Haemost、64:41（199
0）］。即ち、エピトープは、フィブリノーゲンのＤド
メインのγ鎖セグメント中に残る。D100は、２つの形
態、D1A及びD1で存在することが知られており、γ鎖セ
グメントのアミノ末端基でのみ異なっている。これらの
D100断片は、共にγ鎖のカルボキシ末端（残基411）を
含むが、D1Aはγ65で開始し、D1はγ85で開始する［Ver
adi等、Biochemistry、25:519（1986）］。
初期段階として、認識されたエピトープがγ65〜85セ
グメントに関係するかを求めることを必要とした。フィ
ブリノーゲンをCa2+のあり（消化物１）又はなし（消化
物２）のプラスミンで消化した。これらの消化物を固定
化2G5のアッフィニティークロマトグラフィーにかける
と非結合（消化物１及び２から各々F1及びF2）と塩基性
pHで溶離する結合画分（B1及びB2）を得た。これらの画
分をSDS−PAGE、次いで電気泳動移動後、クーマシーブ
ルー染色又はウェスタンイムノブロッティングで分析し
た。Ｄ断片の最も高い分子量のものだけがアフィニティ
ーカラム及びイムノブロッティングにより2G5と反応し
た。Mr＝85−91,000の低分子量Ｄ断片は消化物２の中に
検出されたが、これらは抗体と反応せず、エピトープの
D100に対する制限が証明された。還元条件下でSDS−PAG
Eにかけると、B1及びB2は類似パターン:Mr＝40,000の二
重バンド（β及びγ鎖残鎖）及びMr＝14,000の単一バン
ド（α鎖残鎖）を示し、［Varadi等biochemistry 25:51
9（1986）;Southan等J Biol Chem 260:13095（1985）］
に記載されている報告と一致した。
Mr＝40,000バンドをゲルから切り出し、NH2−末端ア
ミノ酸配列分析にかけた。得られた配列は、B1及びB2画
分のMr＝40,000バンドに対して各々AIQLTY及びSRKMLで
あった。両配列共にフィブリノーゲンγ鎖の中に見ら
れ、最初の配列はγ鎖残基65〜70に対応し、二番目は残
基85〜89に対応する。フィブリノーゲンβ鎖の残基134
〜138に対応する配列DNENVも存在した。これらの結果
は、2G5によって認識されたエピトープがγ65〜85の中
にないことを示している。更に、低分子量Ｄ断片が抗体
と反応しないことは、γ鎖のカルボキシ末端がエピトー
プ発現に対してそのままの形でなければならないことを
示している［Varadi等Biochemistry 25:519（198
6）］。
次の実験においては、アフィニティーカラムからの結
合画分を更にプラスミンで消化してD100全てが低分子量
形に分解することを確実にした。次いで、この消化物を
アフィニティーカラムに再び加え、結合物質を塩基性pH
で溶離した。280nmでモニターしたクロマトグラムを図2
Aに示す。カラムに加えた物質の大部分を結合画分とし
て回収した。しかし、SDS−PAGE（7.5〜20％勾配アクリ
ルアミドゲル）で分析すると、クーマシーブルー染色バ
ンドは検出されなかった。次いで、結合物質をプール
し、リン酸で中和し、逆相Vydac C18カラムのHPLCで分
別した。280nmでモニターしたHPLCプロファイルを図2B
に示す。保持時間約４分で１本の主要ピークのみが検出
された。
異なる溶離時間からの画分を集め、凍結乾燥し、PBS
に再溶解し、次いでELISA法で2G5の固定化フィブリノー
ゲンに対する結合の阻害能を試験した。阻止活性を有す
る画分（No.1）のみが４分のHPLCカラムから溶離するも
のに対応し、280nm吸光度ピークを含んだ。対照とし
て、アフィニティーカラムからの溶離バッファーをリン
酸で中和し、HPLCカラムに加えた。No.1に等価な画分を
集め、ELISA法で試験すると、阻止活性は検出されなか
った。このアッセイにおいては、D100の血漿消化物は活
性を保持し、更に血漿消化でのエピトープRIBS−Ｉの安
定性が証明された。
次いで、選択されたHPLC画分をNH2−末端アミノ酸配
列分析にかけた。収量は低かった（１〜２ピコモル範
囲）が、これはプロセシングである遮断が生じたことを
示しており、次の配列:GGTYが得られた。これらの４種
の残基は、フィブリノーゲンγ鎖の351〜354に対応す
る。これらの結果は、2G5が残基351からγ鎖のカルボキ
シ末端に向かって伸びているセグメントの中にあること
を示している。
2G5エピトープの合成 2G5エピトープのフィブリノーゲンγ鎖のカルボキシ
末端領域に対する局在化を証明するために、更にその構
造を定義するために、γ鎖の残基340〜411に対応する一
組の重なりペプチドを合成した。これらのペプチドに対
する抗体の直接結合をまず評価した。マイクロタイター
プレートをペプチド（PBS中10μg/ml）でコートし、ア
ルカリ性ホスファターゼ結合の第２抗体を用いて、2G5
（50μg/ml）の結合を求めた。表６に示されるように、
抗体は２つのペプチド、P3及びP4と強く反応した。これ
らのペプチドは、重なっており、γ鎖の残基365〜383
（P3）と残基373〜385（P4）に対応する。GP II b−III
aに対する対照のモノクローナル抗体は、これらの２種
又は他の任意のペプチドと反応しなかった。反応が可溶
性D100又はその血漿消化物で阻害されたので、P3及びP4
に結合する2G5の特異性が証明され、P4の場合、D100又
はその血漿消化物のIC50値は、各々150μg/ml及び30μg
/mlであった。
もう１組の実験においては、マイクロタイタープレー
トをアフィニティー精製D100で被覆し、2G5の本断片に
対する結合の合成ペプチドの阻害能を評価した。P4は固
定化したD100に結合する抗体を阻害したが、P2は効果が
なかった。（P3は異常なふるまいをし、恐らくP3ペプチ
ドの固定化断片に対する結合のため、阻害よりむしろ増
加するか又は反応に影響しなかった。）P4の阻止活性
は、可溶性D100又はその血漿消化物で観察されたものと
極めて似ていた。
P4ペプチドもまた、アフィニティークロマトグラフィ
ーにより2G5と反応することがわかった。P4（PBS1ml中1
mg）を抗体カラムに加え、カラムを広範囲に洗浄した
後、結合ペプチドを塩基性pHで溶離し、その回収物を定
量した。280nmにおける吸光度により、44μモルのペプ
チドがカラムに結合されたことが推定された。カラム中
の26μモルの抗体全てが完全に機能したとすると、ペプ
チドの回収は、抗体１モル当たり結合したペプチド２モ
ルの理論限度に近かった。同一条件下でP2ペプチドをカ
ラムに加えた場合には、検出しうる物質はカラムから溶
離されなかった。更に、P4をアルブミン−セファロース
カラムに加えた場合にも、ペプチドはカラムに結合され
なかった。
2G5エピトープを確定する際の特定のアミノ酸及びタン
パク質コンホーメーションの役割 2G5とウシ及びラットフィブリノーゲンとの反応性の
分析は、RIBS−Ｉに対する詳細な構造上の要求に洞察を
与えた。ドットブロット分析により、ラットとウシフィ
ブリノーゲンを1mg/mlでろ紙に加えると、抗体と反応し
なかったが、同一分析において10mg/mlでヒトフィブリ
ノーゲンとの反応が示された。
表７に示されるように、ラット及びウシフィブリノー
ゲンγ鎖中に対応する配列を有するγ鎖のP4配列、Lys3
73−Lys385の線列は、１個のアミノ酸のみの相違を示し
た。即ち、ヒトフィブリノーゲンのリシン381はラット
フィブリノーゲンではグルタミンに置き換えられ、ヒト
フィブリノーゲンのトレオニン374はウシフィブリノー
ゲンではセリンに置き換えられる。
ラット及びウシγ鎖配列に対応するペプチドを合成
し、マイクロタイタープレートに固定化し、抗体との反
応性をELISA法で評価した。ラット及びウシペプチドの
いずれも抗体と反応しないが、同一アッセイにおいてヒ
トペプチドとの反応が観察された（表７）。無関係の対
照抗体は、同一アッセイにおいてヒトペプチド及び他の
２種のペプチドとも検出しうるシグナルを得ることがで
きなかった。
ヒトフィブリノーゲンの2G5の発現に関して、還元、
アルキル化及び／又は変性の影響も分析した。ウェスタ
ンイムノブロッティングで評価されたように、分子を6M
グアニンHClで変性するか、ジチオトレイトールで還元
するか又はヨード酢酸でアルキル化した場合、エピトー
プは維持された。対照的に、変性剤のあり又はなしでフ
ィブリノーゲンが還元及びアルキル化された場合、エピ
トープはもはや検出されなかった。対照実験において
は、フィブリノーゲンのエピトープを阻害する同一の条
件下で合成P4ペプチドを還元及びアルキル化した。マイ
クロタイターに固定化すると、処理及び未処理のP4と2G
5との反応性は同一であった。即ち、還元及びアルキル
化フィブリノーゲンのRIBS−Ｉのロスは、Lys373−Lys3
85の直線配列の外側で起こる変化によると思われる。
検討 GP II b−III aは、複数のコンホーメーション状態で
存在することができる［Plow等、Progress in Hemostas
is and Thrombosis、Vol.9（Coller、B.S.、ed）、pp.1
17−156（1989）］。ある種のコンホーメーショントラ
ンジションは、GP II b−III aを潜在状態から、リガン
ドと結合することがコンピテントであるものへ転換する
血小板アゴニストで誘発される。また、他のコンホーメ
ーショントランジションは、占有レセプターの生物物理
学的及び分光学的特性の変化［Parise等、J Biol Che
m、262:12597（1987）］及びLIBSエピトープの露出［Fr
elinger等、J Biol Chem、263:12397（1988）;Frelinge
r等、J Biol Chem、265:6346（1990）］により証明され
ているレセプターに結合するリガンドによって誘発され
る。RIBSエピトープの発現は、レセプターに結合する際
にコンホーメーションが変化することも示し、レセプタ
ー占有後の事象の動的種類の証明となる。そこでリガン
ド結合が全GP II b−III aから複数のLIBSエピトープを
誘発することもわかったのと同様に［Frelinger等、J B
iol Chem、265:6346（1990）］、フィブリノーゲンがこ
のレセプターに結合する際に数種の異なるRIBSエピトー
プが誘発されることを仮定することは論理的なことであ
る。2G5及び9F9［Abrams等、Blood、75:128（1990）］
は、RIBSエピトープの異なる２つの例であ。
RIBS仮説の論理的な延長としては、これらのエピトー
プが:1）フォンビルブラント因子又はフィブロネクチン
のような他のリガンドがGP II b−III aに結合する場
合;2）フィブリノーゲンが他のインテグリン（例えば、
αｖβ３［Cheresh等、Cell、58:945（1989）］又はMAC
−１［Altieri等、J Cell Biol、107:1893（1988）］又
は非インテグリンレセプター［Levesque等、J Biol Che
m、265:328（1990）］に結合する場合；及び３）リガン
ドが他のインテグリン又は非インテグリンに結合する場
合に誘発される可能性が挙げられる。このような予想に
対する最初の支持は、GP II b−III aに結合する複数の
リガンド及びGP II b−III a以外のインテグリンに結合
するリガンドによって、LIBSエピトープが誘発される証
明から得ることができる［Frelinger等、J Biol Chem、
265:6346（1990）;O' Toole等、Cell Requl、1:883（19
90）］。
2G5によって認識されたRIBSは、局在化すべき最初のR
IBSエピトープである。γ鎖残基365〜383に対応するP3
ペプチド及びγ鎖残基373〜385に対応するP4ペプチドの
両方が2G5に結合した。即ち、エピトープの少なくとも
一部は、γ鎖の残基373〜383の中になければならない。
残基377〜395に対応するP5ペプチドは抗体と反応しない
ので、2G5エピトープを定義する際に、４種の残基（37
3）KTRW（376）は重要な要素である。
残基374に対応する位置のトレオニンをセリンに置き
換える単一の保存的置換は、抗体反応性を無効にするの
に十分である。タンパク質分解断片化の分析は、γ鎖の
残基351とカルボキシ末端との間の領域にこのエピトー
プを制限したり、無関係な局在化の確証を与える。抗体
反応性に対してγ373〜376のKTRW残基が重要であるにも
かかわらず、2G5エピトープはかなりの複雑さを示す。3
81の位置のアミノ酸置換もまたエピトープを阻害した。
更に、フィブリノーゲンの二次及び三次構造は、エピト
ープに著しく寄与している。即ち、P4ペプチドと還元剤
及びアルキル化剤との反応が抗体とペプチドとの反応に
影響しないとしても、フィブリノーゲンの還元及びアル
キル化は2G5エピトープを破壊した。これらの結果は、
抗体と反応するコンホーメーション内のγ373〜385の直
線配列をフィブリノーゲンの二次、三次及び四次構造の
少なくとも１つが安定化しなければならないか又は分子
のコンホーメーションの折りたたみにより接近するよう
になったフィブリノーゲンの第２領域もエピトープの一
部であってもよいことを示している。
二次構造の予想［Chou等、Biochemistry、13:222（19
74）］は、α−ヘリックスからβ−シートまでのトラン
ジションが残基Lys373で始まり、γ鎖がGly395で再びヘ
リックスコンホーメーションをとり始めることを示して
いる。このような二次構造のトランジションは、たいて
いタンパク質分子のエピトープを形成する［Todd等、Tr
ends Biochem Sci、7:212（1982）］。更に、ヒドロパ
シープロットにおいては［Hopp等、Natl Acad Sci US
A、78:3824（1981）］、この領域は特性上親水性である
と予想されるので、抗原性に対する本基準に合っている
［Berzofsky、Science、229:932（1985）］。アミノ酸
の親水性範囲の芳香族アミノ酸の存在は、ペプチド内の
抗原性の追加決定基であり［Appel等、J Immunol、144:
976（1990）］、γ373〜383はトリプトファンとチロシ
ンの両方を含んでいる。従って、γ373〜383はフィブリ
ノーゲン分子内にエピトープを形成する確立が高い。し
かし、この領域は未変性分子の2G5抗体に近づくことが
できない。電子顕微鏡によるフィブリノーゲンモデルに
おいては［Weisel等、Science、230:1388（1985）］、
γ鎖のこの領域は関係のない球状ドメインの中にあり、
この構成は抗体をエピトープに無理に近づけてもよいと
思われる。この説明は、RIBS抗体を産生する一般方法に
関してある意味を含んでいる。これは、限られたタンパ
ク質分解の緩和な変性により誘発されたようなリガンド
の変容形態が抗−RIBSを誘発するための免疫原型を与え
てもよいことを示している。2G5 RIBSの場合には、フィ
ブリノーゲンのタンパク質分解断片が抗体を誘発した。
フィブリノーゲンのγ鎖のカルボキシ末端領域は、フ
ィブリノーゲンのγ275〜330領域の中の重合欠損による
単一のアミノ酸置換の局在化によって証明されるように
フィブリン重合に重要な役割を果たしている［Terukina
等、Blood、74:2681（1989）;Reber等、Thromb Haemos
t、56:401（1986）;Reber等、Blood、67:1751（1986）;
Bantia等、Blood、75:1659（1990）;Bantia等、Blood、
76:2279（1990）］。更に、Varadi及びScheragaによる
研究［Varadi等、Biochemistry、25:519（1986）］は、
領域γ356〜405がフィブリン重合に関与するが、タンパ
ク質コンホーメーションがこの機能を仲介する際に重要
な役割を果たしていることを示している［Cierniewski
等、J Biol Chem、261:9116（1986）］。
2G5抗体の血小板凝集及びフィブリン重合両方の阻害
能［Zamarron等、Thromb Haemost、64:41（1990）］
は、フィブリノーゲン分子の２つの機能の間に以前には
認識されなかった結合を示している。血小板凝集の最も
簡単なモデルにおいては、単一のフィブリノーゲン分子
は、その二量体構造及びその複数のGP II b−III a相互
作用部位によって、隣接の血小板上のレセプター間に直
接架橋し、それにより凝集を誘発する。そのような直接
架橋モデルは、特定の血小板標品（ホルムアルデヒド固
定化［Peerschke等、Blood、57:663（1981）］又は不応
性血小板［Peerschke、J Lab Clin Med、106:111（198
5）］がフィブリノーゲンのGP II b−III aに対するそ
れらの正常な結合にもかかわらず凝集しない理由を説明
することができない。直接架橋モデルとのこれらの不一
致は、レセプター占有後の事象が血小板凝集に必要であ
ることを示している。
本発明は、説明とその実施例によって詳細に記載され
ているが、ある種の変更が前記特許請求の範囲の範囲内
で行われることは明白であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 プラウ エドワード エフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ ラウス スト リート 4359 (72)発明者 ジンズバーグ マーク エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ レノールト プレイス 2944 (56)参考文献 米国特許4455290（ＵＳ，Ａ) 国際公開90／4634（ＷＯ，Ａ１) Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｖｏｌ．64，Ｎ ｏ．１（1990）ｐ．41−４ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： に対応するアミノ酸残基配列を含む20個までのアミ酸残
    基からなるポリペプチド。
  2. 【請求項２】式： を有する請求項１記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】式： に対応するアミノ酸残基配列を含む20個までのアミノ酸
    残基からなるポリペプチド。
  4. 【請求項４】式： を有する請求項３記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】式： を有するアミノ酸残基配列を含む40個までのアミノ酸残
    基からなるポリペプチド又は式： に対応するアミノ酸残基配列を含む20個までのアミノ酸
    残基からなるポリペプチドと、医薬賦形剤とを含む、レ
    セプターと結合したときにリガンド上に誘発される抗体
    結合部位に対する抗体を中和するためのポリペプチド組
    成物。
  6. 【請求項６】式： を有するアミノ酸残基配列を含む40個までのアミノ酸残
    基からなるポリペプチド又は式： に対応するアミノ酸残基配列を含む20個までのアミノ酸
    残基からなるポリペプチドと免疫反応する抗体と、血小
    板−フィブリノーゲン複合体との免疫反応を阻害するた
    めの組成物であって、式： を有するアミノ酸残基配列を含む40個までのアミノ酸残
    基からなるポリペプチドの治療的に有効な量を含有する
    ことを特徴とする組成物。
  7. 【請求項７】式： を有するアミノ酸残基配列を含む40個までのアミノ酸残
    基からなるポリペプチド又は式： に対応するアミノ酸残基配列を含む20個までのアミノ酸
    残基からなるポリペプチドと免疫反応する抗体を、該抗
    体を含む溶液から単離する方法であって、 該溶液を表面上に固定化された式： を有するアミノ酸残基配列を含む40個までのアミノ酸残
    基からなるポリペプチドに供し；及び 該固定化ポリペプチドから該抗体を置き換えることによ
    り、抗体を単離する；ことを含む方法。
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