JP4318085B2

JP4318085B2 - 抗体およびハイブリドーマ、並びにこれらを用いた免疫学的測定法

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Inventors: 泰男曲
Original assignee: 株式会社キューメイ研究所
Priority date: 2005-09-20
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Publication date: 2009-08-19
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Description

本発明は、ヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と反応し、ヒトフィブリノーゲンおよびヒトフィブロネクチンとは反応しないモノクローナル抗体、ならびに血栓性疾患の患者血漿を用いた免疫学的測定法に関するものである。

「凝固・線浴・キニン」（以下、非特許文献１という）に、「血管内における止血や血栓形成は血液凝固機序の活性化により生じるものである。すなわち、種々の血液凝固活性化のトリガー物質により、外因系または内因系の血液凝固カスケードが活性化を受け、トロンビンが生成する。このトロンビンは、その一部が血液中に存在するアンチトロンビンＩＩＩや血管壁に存在するトロンボモジュリンにより不活性化される一方、この網の目を潜り抜けたトロンビンは血液中に存在するフィブリノーゲンに作用して、連続的にＡα鎖のフィブリノペプタイドＡおよびＢβ鎖のフィブリノペプチドＢを遊離させ、フィブリンモノマー（デスＡＡフィブリンおよびデスＡＡＢＢフィブリン）を形成し、これらは互いに会合して不安定フィブリンを形成する。
さらにトロンビンは血液凝固第ＸＩＩＩ因子を活性化し、この活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子は不安定フィブリンの分子間に架橋形成（共有結合）を行い、酸や尿素に不溶性の安定化フィブリンを作る。さらに活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、フィブロネクチンやα２プラスミンインヒビターをこの安定化フィブリン間にそれぞれ架橋結合を行い、フィブリンマトリックスが完成する。」との記載がある。

生物試料分析（非特許文献２〜５という）に、「トロンビンによって活性化された、活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、血液中のフィブリノーゲンのＡα鎖とフィブロネクチンのＡまたはＢ鎖との間に架橋形成を行い、可溶性のフィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を形成する。この複合体の形成は、不溶性の不安定フィブリンや安定化フィブリンが形成する前段階に生じる。」という記載がある。

臨床検査（非特許文献６という）に、「血管内の血栓形成を示唆するマーカーとしては、トロンビン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体、プロトロンビンフラグメント１＋２、フィブリノペプタイドＡ、可溶性フィブリン（モノマー複合体）などの測定が行われている。」という記載がある。

特開平３−４８１５９（特許文献１）に、「免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスから脾細胞を骨髄腫細胞系（好ましくは細胞系Ｓｐ２／０ＡＧ１４またはＰ３×６３Ａｇ８６５３）（免疫グロブリンを産生しない）と融合する。融合した細胞は選択メディウム中の培養により選択し、ここで融合しない脾細胞および骨髄腫細胞は死亡し、そして骨髄腫細胞と融合する脾細胞（ハイブリドーマ）のみが生き残る。この選択工程後、フィブリン特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ系中で選択する。フィブリン特異的抗体をＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔中に導入し、ここでそれらは増殖しかつ腹水を産生し、この腹水を取り出し、そしてこれは要求されるモノクローナル抗体の精製源として働く。
本発明は、また、前述のフィブリンに対する抗体を調製するために使用できる免疫原に関する。
本発明による抗体は、フィブリノゲンと反応しないが、フィブリンＩ型およびＩＩ型と反応する。この反応の感度は０．１μｇ／ｍｌ程度であり、この感度は２０，０００倍の過剰で存在するフィブリノゲンにより制限されない。
フィブリンＩ型の測定の利点は、凝固においてすべての第１工程がフィブリンＩ型の形成であるということである。「可溶性フィブリン」の測定は非常に最も早期の凝固の検出の正確な指標となるので、フィブリンＩ型に向けられた試験はフィブリンＩＩ型のみ向けられたものよりすぐれた診断の価値を有する。フィブリンＩＩ型の形成はフィブリンＩ型を経て進行する。」という記載がある。
「本発明による抗体のそれ以上の利点は、ｔ−Ｐａ（組織プラスミノゲン活性化因子）によるプラスミノゲンの活性化の促進、すなわち、加速されたプラスミンの形成において参加するフィブリン中にある部位に対して抗体は向けられるということである。この部位と抗体との複合化はその加速と反作用し、こうしてフィブリンが形成する間、血漿中に存在するフィブリンを完全な状態で保持するであろう。これは従来知られているフィブリンに対する抗体では不可能である。」という記載がある。

特開昭６０−１５８３５３（特許文献２）に、「血漿または組織中のフィブリンの測定において、特定のアミノ酸配列したペプチドを使用して抗体を得ることにより、高濃度のフィブリン存在下でもフィブリンを定性的、定量的に測定可能である。」との記載がある。
しかして、本発明によれば、「フィブリンの部分的アミノ酸配列を有するペプチドをマウスに投与し抗体を生成する。この抗体はフィブリンモノマーに陽性反応を示すが、フィブリノゲンに対して免疫応答を示さない。従って播種性血管内凝固の患者等の血液中の可溶性フィブリンを検出できる。」との記載がある。

国際公開番号ＷＯ９５／０１２６１７（特許文献３）に、「本発明は、可溶性フィブリンを簡便に、正確にそして再現性よく測定する方法を開発すべく鋭意研究した結果、デスＡＡＢＢフィブリン又はデスＡＡフィブリンがフィブリノゲンと結合したフィブリン・フィブリノゲン複合体、すなわちヒト可溶性フィブリンが形成される際にフィブリン分子内に新たに出現するネオ・アンチジェンと反応し、ヒトフィブリノゲンとは反応しないモノクローナル抗体を見出し、これらのモノクローナル抗体の１種あるいは２種の組合せを用いると、血漿中の可溶性フィブリンをチオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）等のタンパク変性剤で前処理することなく、迅速にかつ正確に、しかも検体中に共存するフィブリノゲン、各種フィブリノゲンフラグメント（Ｘ、Ｙ、Ｄ、Ｅ）、各種フィブリンフラグメント（Ｘ、Ｙ、Ｄ、Ｅ）および安定化フィブリンの各種プラスミン分解物の妨害を受けずに、特異的に測定することができることを見出した。従って、本発明の目的は、前記の新規モノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマおよびそのモノクローナル抗体を用いる免疫学的定量方法を提供することにある。」という記載がある。
「精製した尿素可溶化ヒトフィブリンモノマー免疫原溶液を用いて哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマ）をインビボ免疫法により免疫する。具体的には、例えば、精製した尿素可溶化ヒトフィブリンモノマー免疫原溶液を等量のフロインド氏完全アジュバンド又は不完全アジュバンドと乳化するまで混合する。この混合液を、例えばマウスの皮下に投与する（第１回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ステンレススチールメッシュ等で押しつぶして脾臓細胞を調製し、細胞融合工程に用いる。ハイブリドーマを常法によって培養した培養液から、あるいは本発明のハイブリドーマを投与した適当な哺乳動物（例えばマウス又はラット）の腹水から、目的とする本発明のモノクローナル抗体を分離し精製することができる。このようにして製造された培養液又はマウスの腹水からモノクロナール抗体を分離、精製する場合にはタンパク質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いることが可能である。」という記載がある。

特開平３−４８１５９号公報特開昭６０−１５８３５３号公報国際公開番号ＷＯ９５／０１２６１７号公報青木延雄、岩永貞昭著「凝固・線浴・キニン」、中外医学者社、１９７９年曲泰男、他３名、インビボおよびインビトロにおける可溶性フィブリンモノマー複合体の構造解析、生物試料分析、生物試料分析科学会、平成１１年１２月、第２２巻、第５号、Ｐ．４０９〜４２０曲泰男、他５名、健常者血漿およびＮＩＤＤＭ患者血漿からの可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の精製とその成分解析、生物試料分析、生物試料分析科学会、平成１２年６月、第２３巻、第３号、Ｐ．２４３〜２５１曲泰男、他５名、健常者および患者血漿中可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の新しいＥＬＩＳＡ法、生物試料分析、生物試料分析科学会、平成１２年９月、第２３巻、第４号、Ｐ．３２５〜３３４曲泰男、他５名、２ステップＥＬＩＳＡ法を用いた種々の疾患の患者血漿中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体濃度の測定とその生成メカニズム、生物試料分析、生物試料分析科学会、平成１２年１２月、第２３巻、第５号、Ｐ．４３１〜４４２猪狩淳、他５名、血栓症と血小板凝固線溶検査、臨床検査、医学書院、平成８年１０月、第４０巻、１１巻、Ｐ．１１７〜１２７

しかし、非特許文献１に示した血液中のフィブリン生成経路の中には、安定化フィブリン（固相）のα鎖にフィブロネクチンやα２プラスミンインヒビターが活性化血液凝固ＸＩＩＩ因子の作用で共有結合するとの記載があるが、血液中（液相）でフィブリノーゲンとフィブロネクチンが活性化血液凝固ＸＩＩＩ因子の作用で共有結合するとの記載はない。

非特許文献２〜６に示した血液中における可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の発見とポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法については、既に曲らにより報告されている。但し、この測定系は、固相抗体として抗ヒトフィブリノーゲンウサギポリクローナル抗体を使用しているため、共存する血液中のフィブリノーゲンにも反応性を有し、従ってこれらの影響をなくすために検体の高率倍数の希釈操作や長時間の反応時間について改善することが望まれた。

非特許文献６のマーカーは、いずれも直接トロンビン生成を示唆するマーカーであるため、採血操作そのものに不良があると、血液凝固機序の活性化に伴うトロンビンの生成が頻繁に生じて、擬陽性反応が生じることが最大の欠点である。

特許文献１のモノクローナル抗体はフィブリンに特異性が高いものの、採血操作そのものが不良であると、血液凝固機序の活性化に伴うトロンビンの生成が頻繁に生じて、フィブリンが生成し、結果として擬陽性反応を生じることが問題である。

特許文献２はフィブリノペプチドＡ開裂に生じるα鎖の新アミノ末端からのペプチドを免疫源として使用して動物を免疫することにより誘導される抗体を用いて、フィブリンを測定するＥＬＩＳＡ法を記載している。しかし、この抗体も採血操作そのものが不良であると、血液凝固機序の活性化に伴うトロンビンの生成が頻繁に生じて、フィブリンが生成し、結果として擬陽性反応が生じる。更に、この抗体は、同じ抗原決定基を有するフィブリンのプラスミン分解物、並びにフィブリンフラグメントＸ、Ｙ、ＤおよびＥと反応するという欠点もある。

特許文献３は可溶性フィブリンを簡便に、正確にそして再現性よく測定する方法ではあるが、やはり採血操作そのものが不良であると、血液凝固機序の活性化に伴うトロンビンの生成が頻繁に生じて、可溶性フィブリンが生成し、結果として擬陽性反応の出現頻度が高いことが欠点である。

本発明は、新規のモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ること、およびそのモノクローナル抗体を用いる、高率倍数の希釈操作を必要としない、短時間の反応で検出できる、擬陽性反応のない免疫学的定量方法を提供することにある。

本願発明者は、可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を簡便に且つ、再現性よく測定する方法を開発すべく研究に励んだ結果、可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の分子内に新たに出現するネオ・アンチゲンと反応し、ヒトフィブリノーゲンやヒトフィブロネクチンとは反応しないモノクローナル抗体を見出し、これらのモノクローナル抗体の１種あるいは２種の組み合わせを用いると、血漿中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を、高率倍数の希釈操作を必要とせず、迅速にかつ正確に、しかも検体中に共存するフィブリノーゲン、各種フィブリノーゲン分解産物（Ｘ，Ｙ、Ｄ、Ｅ）、各種フィブリン分解産物（Ｄ−Ｘ−Ｄ／Ｙ−Ｙ、Ｙ−Ｄ／Ｄ−Ｙ、Ｄ−Ｄ／Ｅ）、およびフィブロネクチンの妨害を受けずに、特異的に測定できることを見出した。
すなわち、ヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と反応し、ヒトフィブリノーゲンおよびヒトフィブロネクチンとは反応しない新規の抗体を得るとともに、可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体が、トロンビンをさらに作用した活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子が生成する産物であるため、トロンビン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体、プロトロンビンフラグメント１＋２、フィブリノペプタイドＡ、および可溶性フィブリン（モノマー複合体）より生成時期がかなり遅いため、採血操作不良に伴う擬陽性反応がほとんどない、従って上記課題を解決した。

本発明のモノクローナル抗体は、デスＡＡＢＢフィブリン又はデスＡＡフィブリンがフィブリノーゲンと会合したフィブリン・フィブリノーゲン複合体（以下、可溶性フィブリンまたはＳＦともいう。）と、フィブリノーゲン分解産物（Ｘ，Ｙ、Ｄ、Ｅ）と、フィブリン分解産物（Ｄ−Ｘ−Ｄ／Ｙ−Ｙ、Ｙ−Ｄ／Ｄ−Ｙ、Ｄ−Ｄ／Ｅ）と、ヒトフィブリノーゲンと、ヒトフィブロネクチンとのいずれとも反応しない、活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子の作用のもとに、ヒトフィブロネクチンのＡ鎖および／またはＢ鎖とヒトフィブリノーゲンのＡα鎖とが共有結合したヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と特異的に反応する。

本発明のヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定法は、前記のモノクローナル抗体を第１抗体として不溶性担体に固定し、この固定化した第１抗体と被検試料とを接触させ、続いてヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と特異的に反応しない抗体に標識を付けた第２抗体と被検試料とを接触させ、標識の信号を検出することを特徴とする。

本発明の血管内凝固症候群または血栓性疾患の患者血漿を試料とした免疫学的測定法は、前記に記載のヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定の方法によって検出することからなる。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と反応し、ヒトフィブリノーゲンおよびヒトフィブロネクチンとは反応しないものである。
さらに、本発明は、血漿中のヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を前記の免疫学的測定法によって検出することからなるＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）および血栓性疾患の診断および病理研究に有用な手段を提供するものである。

本モノクローナル抗体を１次抗体として用いることにより、血漿試料の前処理や高率倍数の希釈操作を行わなくても、血漿中のフィブリノーゲン、フィブロネクチン、フィブリノーゲンのプラスミン分解産物、フィブリンフラグメント、並びに安定化フィブリンのプラスミン分解産物の干渉を受けることなく、患者血漿中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を、特異的、且つ迅速に、また擬陽性反応がほとんど無くＥＬＩＳＡ法により測定することができる。

以下、本発明をモノクローナル抗体、ハイブリドーマおよび免疫学的測定方法を順次説明する。
〔可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体〕
免疫原として用いるヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体は、例えば、曲らの方法〔生物試料分析、生物試料分析科学会、平成１２年６月、第２３巻、第３号、Ｐ．２４３〜２５１、および生物試料分析、生物試料分析科学会、平成１２年６月、第２３巻、第３号、Ｐ．２４３〜２５１〕に従って調整することができる。
健常者希釈血漿のみまたは健常者血漿に終濃度で３．３ｍＭの塩化カルシウムを添加し、３７℃ ９０分間で生成させた可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体に富む希釈血漿に、終濃度で５ＡＴＵ／ｍＬのヒルジンおよび５ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａを加えトロンビンと活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子を不活化した希釈血漿をゼラチンセファロースカラムを通し、フィブロネクチンと可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を吸着後、１Ｍの臭化ソーダを含む０．０５Ｍの酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で溶出する。次にこの溶出画分中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体をさらに抗ヒトフィブリノーゲン抗体を結合させたアフィゲル１０カラムで吸着させ、十分洗浄後、６Ｍ尿素を含む０．２Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８で回収する。

回収して得られたものを非還元のＳＤＳ電気泳動を用いて測定した結果、分子量約８００ＫＤのバンドとして確認された。フィブリノーゲン（３４０ＫＤ）とフィブロネクチン（４５０ＫＤ）が活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子の作用で共有結合した複合体であることがわかる（図１左）。
一方、還元のＳＤＳ電気泳動の結果を図１右に示す。２８０ＫＤのバンドが確認されていることから、活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子の作用で共有結合したフィブリノーゲンのＡα鎖（６８ＫＤおよび６５ＫＤ）とフィブロネクチンのＡまたはＢ鎖（２２０ＫＤ）の共有結合した複合体であることがわかる。これを可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体（可溶性ＦＧ−ＦＮと略すことがある）という。

精製可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体、精製フィブリノーゲンおよび精製フィブロネクチン溶液を、０．０５ＭＴｒｉｓ０．２ＭＮａＣｌｐＨ７．５の緩衝液で平衡化したＴＳＫ−Ｇ４０００ＳＷカラム（東ソー）に注入し、０．５ｍＬ／分の流速でゲル濾過を行った。各溶出フラクションをＥＬＩＳＡ法で測定した結果を図２に示す。溶出時間２９〜３１分に可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体のピークが、また、溶出時間３３〜３５には精製フィブリノーゲンのピークが、３５〜３７には精製フィブロネクチンのピークが出現した。

可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の概念図を図３に示す。すなわち、血管内で内因系および外因系の血液凝固機序が活性化されると、最終的に生成したトロンビンにより、血液凝固第ＸＩＩＩ因子が活性化を受け、活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子を生ずる。このトラングルタミナーゼ酵素作用により、血液中のフィブリノーゲンＡα鎖とフィブロネクチンＡまたはＢ鎖間に共有結合が生じ、可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体が生成する。

この精製された可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を免疫原または免疫学的測定法の標準品として使用する。
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマは、このヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を免疫原として調整する。

〔ハイブリドーマ〕
精製した可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の免疫原溶液を用いて哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、ウサギ、ヤギ）をインビボ免疫法により免疫する。具体的には、例えば、精製した可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の免疫原溶液と、等量のフロインド氏の完全アジュバンド又は不完全アジュバンドとをエマルジョン化するまで混合する。この混合液を、例えばマウスの皮下に投与する。以後、２〜４週間の間隔で皮下投与の操作を行い、追加免疫を数回行う。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ナイロンメッシュ等を通し、脾細胞を分散させて調整する。

これを免疫脾細胞として細胞融合に用いる。細胞融合のもう一方の親細胞であるミエローマ細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞株、例えば、ＮＳ−１株，Ｐ３−Ｕ１株，ＭＰＣ−ＩＩ株、および＋ＳＰ２株などを使用する。

免疫脾細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例えば、公知の融合促進剤（ポリエチレングリコールやジメチルスルホキシドなど）を用いて行う。免疫脾細胞とミエローマ細胞とを混合比率（５〜１０対１）に混合し、これを、細胞融合用のメディウムとしては、例えば、４０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレンブリコールを含むダルベッコ改変イーグルメディウム（ＤＭＥＭ）を用いて培養する。

続いて、選択用のメディウム（例えば、ＨＡＴメディウム）を用いてハイブリドーマ以外の細胞を除去する。ハイブリドーマ培養上清の抗体産生の有無を、例えばＥＬＩＳＡ法などによって測定する。目的の抗体を産生するハイブリドーマを分離する。こうして得られたハイブリドーマを、通常のメディウムで継代培養することができる。また、液体窒素などの中で長期間保存することができる。

また、前記のハイブリドーマを培養するメディウムとしては、ハイブリドーマの培養に適した任意のメディウムを用いることができ、ＤＭＥＭにウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン等）を含むメディウムが好適に用いられる。前記のハイブリドーマのメディウムは、インビトロの場合には例えばメディウム中で５〜７ｖｏｌ％ＣＯ_２濃度および３７℃で約３〜５日間、またインビボ例えばマウスの腹腔内で培養する場合は約１４〜２０日実施するのが好ましい。このハイブリド−マが、ヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と反応し、ヒトフィブリノーゲンやヒトフィブロネクチンとは反応しないモノクローナル抗体を分泌産生する。
〔モノクローナル抗体〕

本発明のハイブリドーマを培養した培養液から、あるいは本発明のハイブリドーマを投与した適当な哺乳動物（例えばマウス又はラット）の腹水から、目的とする本発明のモノクローナル抗体を分離し精製する。培養液又はマウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する方法には、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥等の方法がある。

この精製したモノクローナル抗体とマイクロプレートにコーティングした種々のフィブリノーゲン誘導体、フィブリン誘導体、フィブロネクチン、および可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体との反応性特異性を、酵素標識抗マウスイムノグロブリンを用いたＥＬＩＳＡ法で調べた。その結果、本発明のモノクローナル抗体は、活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子の作用で共有結合したヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と反応し、ヒトフィブリノーゲンやヒトフィブロネクチンとは反応しない。また、デスＡＡＢＢフィブリン又はデスＡＡフィブリンがフィブリノーゲンと会合したフィブリン・フィブリノーゲン複合体、フィブリノーゲン分解産物（Ｘ，Ｙ、Ｄ、Ｅ）、およびフィブリン分解産物（Ｄ−Ｘ−Ｄ／Ｙ−Ｙ、Ｙ−Ｄ／Ｄ−Ｙ、Ｄ−Ｄ／Ｅ）とは反応しないことが判明した。

〔免疫学的測定方法〕
サンドイッチＥＬＩＳＡ法による本発明の免疫学的定量方法では、具体的には、前記の本発明によるモノクローナル抗体を適当な不溶性担体に固定化する。次に、次に不溶性担体と検体試料との非特異的な結合を避けるために、適当なブロッキング剤（例えばウシ血清アルブミンやスキムミルク等）で不溶性単体の表面を被覆する。続いて、検体試料を加えて一定時間（例えば５分〜１時間）および一定温度（例えば４〜４０℃）で接触させ反応させる（１次反応）。続いて、前期以外の抗フィブリノーゲンモノクローナル抗体または抗フィブロネクチンモノクローナル抗体に標識を付けた第２抗体を加えて一定時間（例えば５分〜１時間）および一定温度（例えば４〜４０℃）で接触させ反応させる（２次反応）。これを洗浄液（例えば界面活性剤を含む生理食塩液）で洗浄してから、不溶性担体の表面に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、検体試料中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の量を算出することができる。また、１次反応と２次反応を同時に行うことも可能である。

〔擬陽性の判定〕
健常者の測定結果が正常参考値以上の値が検出される場合、陽性と判定されるときを擬陽性の判定といい、測定系の反応を擬陽性反応という。
採血業務が不慣れな医療技術者により、健常者の腕正中静脈から、血球算定用ＥＤＴＡ−３Ｋ入り真空採血管（二プロ）を用い、３ｍＬを１５秒間隔で連続５本採血する。十分に転倒混和した後、２５００Ｇで１０分間遠心した後、それぞれ血漿を分離した。これらの血漿中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の濃度を測定する。
いずれの濃度も２〜５．６μｇ／ｍＬの範囲内にあり、１本目群と５本目群においても濃度の差異が認められなかった。このことは、擬陽性反応が認められないことを示す証左である。
一方、同一の検体を、従来の測定法であるＴＡＴ濃度（正常参考値４ｎｇ／ｍＬ以下）、ＳＦ濃度（正常参考値６μｇ／ｍＬ以下）を用いて測定すれば、正常参考値以上の値が検出される。

本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡ法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ニトロセルロース、アガロース、紙およびこれらの組み合わせなどを例に示すことができる。

標識の物質としては、酵素、蛍光物質または発色物質およびラテックスを使用する。酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β―Ｄ―ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としてはフルオレッシンイソチオシアネ−ト等、また発光物質としてはルシフェリンやアクリジニウムエステル化合物を使用することができる。ラテックスとしては市販のラテックスであり、可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と凝集するものが好ましい。変成ポリスチレンラテックス、変成ポリシリコーンラテックスなどはとくに好ましい。
以上のように、血液中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を測定することにより、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、および種々の血栓性疾患の診断や治療後の経過観察に利用することができる。

〔可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の精製〕
免疫原として用いる可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体は、例えばヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を免疫原として調整することができる。免疫原として用いるヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体は、例えば、曲らの方法〔生物試料分析、生物試料分析科学会、平成１２年６月、第２３巻、第３号、Ｐ．２４３〜２５１、および生物試料分析、生物試料分析科学会、平成１２年６月、第２３巻、第３号、Ｐ．２４３〜２５１〕に従って調整することができる。すなわち、健常者希釈血漿のみまたは健常者血漿に終濃度で３．３ｍＭの塩化カルシウムを添加し、３７℃、９０分間で生成させた可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体に富む希釈血漿に、終濃度で５ＡＴＵ／ｍＬのヒルジンおよび５ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａを加え、トロンビンと活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子を不活化した希釈血漿をゼラチンセファロースカラムに通し、フィブロネクチンと可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体を吸着後、０．０５Ｍのトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５（平衡化液）で十分洗浄後、１Ｍの臭化ソーダを含む０．０５Ｍの酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で溶出した。次にこの溶出画分中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体をさらに抗ヒトフィブリノーゲン抗体を結合させたアフィゲル１０カラムで吸着させ、平衡化液で十分洗浄後、６Ｍ尿素を含む０．２Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８で溶出することで精製した。この精製された可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体（以下可溶性ＦＧ−ＦＮと称することがある）を免疫原または免疫学的測定法の標準品として使用した。

〔免疫〕
可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体（可溶性ＦＧ−ＦＮ：Ａ２８０ｎｍ＝０．２２）を等量のフロインド氏完全アジュバンドとエマルジョンかするまで混合し、その混合液２００μＬをＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部皮下に投与することにより免疫を行った（初回免疫）。３週間後前記と同様の免疫操作をマウスの背部に行い、さらに２週間毎にこの免疫操作３回繰り返した。さらに２週間後、可溶性ＦＧ−ＦＮを等量の生理食塩水で希釈した免疫原を、前記マウスの腹腔内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日後、脾臓を無菌的に取り出し、細胞融合の材料とした。

〔細胞融合〕
無菌的に採取したマウス脾臓を、１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭメディウム５ｍＬを入れたシャーレに入れ、無鈎ピンセットを用いて脾細胞を解したのち、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を５０ｍＬの遠心管に集め、１０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を吸引除去した。この様にして得られた脾細胞に０．１６Ｍの塩化アンモニウム液を加え、３７℃で１０分間放置することにより脾細胞中に存在する赤血球膜を破壊した。さらにＤＭＥＭメディウムで十分洗浄後、１０ｍＬの同メディウムで残った脾細胞を懸濁させ、生きている脾細胞数を算定した。

一方、予め培養し、細胞数を調整しておいたマウスミエローマ細胞（ＮＳ−１）の約１．５×１０^７個に前記洗浄脾細胞１×１０^８個を加え、ＤＭＥＭメディウム中でよく混和した後、１０００ｒｐｍ、５分間で遠心分離による洗浄操作を３回行った。最終洗浄の上清を吸引除去し、さらにペレットを十分解きほぐした後、３７℃に保温した４０ｖｏｌ％ポリエチレングリコール溶液０．５ｍＬを加え、遠心管を手に取り円を描くように緩やかに回転させた。次に、ＤＭＥＭメディウムを１ｍＬ加え、同様に回転させ、以下この操作を９回繰り返した。最後に１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭメディウムを加えて、洗浄操作を数回行った。この融合細胞の細胞数を測定し、２×１０^５個／ｍＬとなるように調整し、９６ウエルの細胞培養プレートの各ウエルに１００μＬずつ分注して、５〜７ｖｏｌ％炭酸ガスを含む培養器を用い３７℃で培養を開始した。翌日、１／５０のＨＡＴメディウムを含む１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清加ＤＭＥＭメディウムを各ウエルに１００μＬを添加しハイブリドーマの選択を行った。ＨＡＴ加メディウムの交換は４日おきに行い、それぞれ１００μＬずつを新しいメディウムと交換し、ハイブリドーマの生育状況を観察すると共に、２０日後より後期のＥＬＩＳＡ法により、可溶性ＦＧ−ＦＮに反応する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行った。

〔ハイブリドーマの樹立〕
ハイブリドーマ培養上清における抗体産生のチェックはＥＬＩＳＡ法により行った。すなわち９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｎｎｃ）の各ウエルに前記の、可溶性ＦＧ−ＦＮ免疫原溶液、フィブリノーゲン溶液、およびフィブロネクチン溶液をＡ２８０ｎｍ＝０．０２となるように生理食塩水で希釈し、それぞれ各ウエルに１００μＬずつ分注し、４℃で１２時間放置することによりコーティイングを行った。次に０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した後、各ウエルの培養上清１００μＬを加え、３７℃で３０分反応させた。次に３回洗浄した後、０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社）１００μＬを各ウエルに添加し、３７℃で２０分間反応させた。反応終了後、０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した後、０．００５ｖｏｌ％過酸化水素水を含む１７ｍＭオルトフェニレンジアミン２塩酸塩溶液１００μＬを各ウエルに加え、３７℃で２０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオラッド）を用い測定した。その結果、９６０ウエル中、２ウエルにフィブリノーゲン、およびフィブロネクチンとは反応せず可溶性ＦＧ−ＦＮとのみ反応性を示すクローンが認められた。この２ウエルのハイブリドーマを直ちに、限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、無血清メディウム（コージンバイオ）を用い９６ウエルの培養プレートに０．８個／１００μＬとなるように分注し、５ｖｏｌ％炭酸ガス下、３７℃で２０日間培養した。
その結果、各ハイブリドーマにつき、１０〜２０個の抗体産生クローン得られた。これらのクローンの中から抗体分泌量が高く、また増殖能が高いクローンを選び、１種類の抗可溶性ＦＧ−ＦＮ抗体産生ハイブリドーマクローンＦＧ−ＦＮ００１を樹立した。

〔モノクローナル抗体の培養および精製法〕
今回作製したマウスハイブリドーマクローンＦＧ−ＦＮ００１を無血清メディウム（コージンバイオ）中で、３７℃、５ｖｏｌ％炭酸ガス下で大量培養を行った。次に培養上清１Ｌ当り固形の硫酸アンモニウムを５０ｗｔ％飽和となるように添加し、４℃で２時間静置した後、９０００Ｇで２０分間遠心し、沈渣を得た。得られた沈渣を少量の０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、同じ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ２００カラムにその一部を注入し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。次に回収したモノクローナル抗体に富む画分を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡセファロース４Ｂカラムにアプライした。十分洗浄後、０．２Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８０で溶出し、直ちに、５００倍量の０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５０で４℃、一晩透析し抗可溶性ＦＧ−ＦＮマウスモノクローナルＩｇＧ抗体を得た。

〔本発明のモノクローナル抗体のサブクラスの同定〕
本発明のモノクローナル抗体（クローンＦＧ−ＦＮ００１）のサブクラスはＥＬＩＳＡ法で行った。まず、抗ＦＧ−ＦＮ抗体を０．１Ｍ炭酸・重炭酸緩衝液ｐＨ９．５で１０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、それぞれ１００μＬずつを９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｎｎｃ）に４℃で１６時間コーティングする。次に０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した後、１０００〜２０００倍に希釈したペルオキシダーゼを標識した抗マウスＩｇＧ１（ＭＢＬ）、抗マウスＩｇＧ２ａ（ＭＢＬ）、および抗マウスＩｇＧ３（ＭＢＬ）溶液を加え３７℃ ２０分間反応させた。その結果、このモノクローナル抗体の免疫グロブリンサブクラスは、ＩｇＧ１であった。

〔本発明のモノクローナル抗体の反応特異性の同定〕
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性の同定はＥＬＩＳＡ法により行った。すなわち９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｎｎｃ）の各ウエルに前記の、可溶性ＦＧ−ＦＮ免疫原溶液、フィブリノーゲン溶液、フィブリノーゲンのプラスミン分解産物、フィブリンのプラスミン分解産物、フィブロネクチンおよび可溶性フィブリンをＡ２８０ｎｍ＝０．０２となるように生理食塩水で希釈し、それぞれ各ウエルに１００μＬずつ分注し、４℃で１６時間放置することによりコーティイングを行った。次に０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬに調整した上記本発明のモノクローナル抗体１００μＬを加え、３７℃で３０分反応させた。

次に３回洗浄した後、０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社）１００μＬを各ウエルに添加し、３７℃で２０分間反応させた。反応終了後、０．０５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した後、０．００５ｖｏｌ％過酸化水素水を含む１７ｍＭオルトフェニレンジアミン２塩酸塩溶液１００μＬを各ウエルに加え、３７℃で２０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオラッド）を用い測定した。

その結果、本発明のモノクローナル抗体は、活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子の作用で共有結合したヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と反応し、ヒトフィブリノーゲンやヒトフィブロネクチンとは反応しない。また、デスＡＡＢＢフィブリン又はデスＡＡフィブリンがフィブリノーゲンと会合したフィブリン・フィブリノーゲン複合体、フィブリノーゲン分解産物（Ｘ，Ｙ、Ｄ、Ｅ）、およびフィブリン分解産物（Ｄ−Ｘ−Ｄ／Ｙ−Ｙ、Ｙ−Ｄ／Ｄ−Ｙ、Ｄ−Ｄ／Ｅ）とは反応しないことが判明した。
また、本発明のモノクローナル抗体と種々のフィブリノーゲン誘導体、フィブリン誘導体、フィブロネクチン、可溶性フィブリンおよび可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体との反応性特異性をＥＬＩＳＡ法で調べた成績を表１に示す。

〔ＥＬＩＳＡ法を用いた可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の測定〕
（１）固相プレートの調整
精製抗可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体マウスモノクローナル抗体（ＦＧ−ＦＮ００１）の蛋白濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように０．０１Ｍ炭酸・重炭酸緩衝液ｐＨ９．５０で希釈し、その１００μＬずつを９６ウエルＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウエルに分注し、４℃で１６時間静置した。
（２）標識抗体の調整
抗ヒトフィブロネクチンウサギポリクローナルＩｇＧ抗体を、常法に従いホースラディシュペルオキシダーゼで標識し、ＨＲＰ標識抗体を得た。

（３）測定
上記の当該抗体コーティングプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で３回洗浄した後、前記実施例１−（１）で作製した精製可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体溶液を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で希釈して、５．０、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６μｇ／ｍＬに調整した標準物質および上記生理食塩水で１０倍に希釈した健常者および患者血漿１００μＬずつを各ウエルにまき、３７℃で１０分間反応させた。
次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で３回洗浄した後、同液で５００倍希釈した抗ヒトフィブロネクチンＨＲＰ標識抗体１００μＬを各ウエルにまき、３７℃で１０分間反応させた。
次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加生理食塩水で３回洗浄した後、０．００５％過酸化水素水を含む１７ｍＭオルトフェニレンジアミン２塩酸塩溶液１００μＬを各ウエルに加え、３７℃、１０分間暗所で反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオラッド）を用い測定し、検量線を作成した（図１）。検体中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の濃度は、検量線より求め、希釈倍数を乗じて血漿中の濃度とした（図４）。

〔種々の血栓性疾患における可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の血漿中濃度〕
種々の血栓性疾患［播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）２８例、急性心筋梗塞症および脳梗塞症３０例、深部静脈血栓症１２例、大動脈瘤症８例、閉塞性動脈硬化症１１例］、糖尿病３２例および健常者４０例の血漿中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の濃度を実施例７に準じてＥＬＩＳＡ法により測定した成績を図５に示す。

〔擬陽性の判定〕
採血業務が不慣れな医療技術者２名により、健常者２０例の腕正中静脈から、血球算定用ＥＤＴＡ−３Ｋ入り真空採血管（二プロ）を用い、３ｍＬを連続５本採血し、十分転倒混和後、２５００Ｇで１０分間遠心した後、それぞれ血漿を分離した。これら２０名の血漿中の可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の濃度を実施例７に準じて測定し、１本目と５本目の測定結果について比較検討した。また、併せて分離した健常者血漿中のＴＡＴ（エンザイグノストＴＡＴキット、デイドベーリング）およびＳＦ（ヤトロＳＦキット）を同様に測定し、１本目と５本目の測定結果について比較検討した結果を図６に示す。
結果コメント：
採血業務が不慣れな医療技術者が採血しても、１本目群に擬陽性反応（５．６μｇ／ｍＬを超える）は認められず、さらに５本目群においても擬陽性反応は認められなかった。

〔比較例１〕
実施例９の検体を、ＴＡＴキットを用いて、測定した。結果を図７に示す。
結果コメント：
採血業務が不慣れな医療技術者が採血すると、１本目群においてもＴＡＴの擬陽性反応
（４．１ｎｇ／ｍＬ以上）が高頻度に認められ、さらに５本目群においては擬陽性反応の出現頻度がさらに高くなった。

〔比較例２〕
実施例９の検体を、ＳＦキットを用いて、測定した。結果を図８に示す。
結果コメント：
採血業務が不慣れな医療技術者が採血すると、１本目群においても擬陽性反応（６．１
μｇ／ｍＬ以上）が高頻度に認められ、さらに５本目群においては擬陽性反応の出現頻度がさらに高くなった。

精製可溶性ＦＧ−ＦＮ、精製フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果である。精製した可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンである。精製可溶性ＦＧ−ＦＮ、精製フィブリノーゲンおよび精製フィブロネクチンのＴＳＫ４０００ＳＷカラムによるゲルろ過後の各フラクション中の可溶性ＦＧ−ＦＮ、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの各抗原量をそれぞれのＥＬＩＳＡ法を用いて測定した結果である。精製した可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体のゲルろ過法による解析結果である。可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の概念図である。本発明のＥＬＩＳＡ法により得られた可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の検量線である。種々の血栓性疾患における可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の血漿中濃度である。採血業務が不慣れな医療技術者が連続採血した健常者２０例の１本目と５本目の血漿中の可溶性ＦＧ−ＦＮ濃度の推移である。採血業務が不慣れな医療技術者が連続採血した健常者２０例の１本目と５本目の血漿中のＴＡＴ濃度の推移〔比較例１〕である。採血業務が不慣れな医療技術者が連続採血した健常者２０例の１本目と５本目の血漿中のＳＦ濃度の推移〔比較例２〕である。

Claims

デスＡＡＢＢフィブリン又はデスＡＡフィブリンがフィブリノーゲンと会合したフィブリン・フィブリノーゲン複合体と、フィブリノーゲン分解産物（Ｘ，Ｙ、Ｄ、Ｅ）と、フィブリン分解産物（Ｄ−Ｘ−Ｄ／Ｙ−Ｙ、Ｙ−Ｄ／Ｄ−Ｙ、Ｄ−Ｄ／Ｅ）と、ヒトフィブリノーゲンと、ヒトフィブロネクチンとのいずれとも反応しない抗体であって、活性化血液凝固第ＸＩＩＩ因子の作用のもとに、ヒトフィブロネクチンのＡ鎖および／またはＢ鎖とヒトフィブリノーゲンのＡα鎖とが共有結合したヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と特異的に反応するモノクローナル抗体。
請求項１に記載のモノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ。
請求項１に記載のモノクローナル抗体を第１抗体として不溶性担体に固定し、この固定化した第１抗体と被検試料とを接触させ、続いてヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体と特異的に反応しない抗体に標識を付けた第２抗体と被検試料とを接触させ、標識の信号を検出することを特徴とするヒト可溶性フィブリノーゲン−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定法。
請求項３によって検出することからなる血管内凝固症候群または血栓性疾患の患者体液を用いた免疫学的測定法。