KR100406072B1

KR100406072B1 - 항혈전제 및 항-폰빌레브란트인자 모노클로날항체

Info

Publication number: KR100406072B1
Application number: KR1019970703619A
Authority: KR
Inventors: 미쓰요 나가노; 히로시 야마모토; 모리카즈 기토; 료타 요시모토; 쓰요시 고바야시
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1994-11-30
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 2004-03-30
Also published as: EP0795608A1; DE69530316D1; NO972253D0; US5916805A; NO319738B1; FI972279A0; ES2197210T3; WO1996017078A1; ATE236993T1; NO972253L; US6793920B2; FI972279A; EP0795608B1; PT795608E; CN1254275C; FI119734B; JP3331377B2; US6280731B1; US20020028204A1; DK0795608T3

Abstract

사람 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)와의 반응성을 나타내고, 사람 혈소판의 RIPA(리스토세틴 유도된 혈소판 응집), BIPA(보트로세틴 유도된 혈소판 응집) 및 SIPA(전단응력 유도된 혈소판 응집) 억제 작용을 지니며, 항혈전성 작용을 나타내는 의학적으로 유효한 용량에서 출혈을 유발시키지 않는 모노클로날 항체가 항혈전제의 활성 성분으로서 사용된다.

Description

항혈전제 및 항-폰 빌레브란트 인자 모노클로날 항체

생체 내에서의 혈관 벽의 손상으로 인해 내피하층이 노출되는 경우, 혈류를 따라 흐르는 혈소판이 이러한 내피하층에 즉시 부착된다. 이로써, 혈소판 응집 및 세포내 과립 방출을 포함한 일련의 혈소판 활성화 과정이 유발된 후, 혈전이 형성되어 출혈이 멈추게 된다. 따라서, 혈전 형성은 생리학적 지혈 기전에 절대적으로 필요하다. 그러나, 또 다른 한편, 이러한 혈전은 심근 경색, 협심증, 뇌경색 및 뇌 혈전증과 같은 혈전성 질환을 유발시키며, 이러한 질환은 사회가 발전함에 따라 사망의 주요 원인으로서 부상하고 있다. 이러한 상황은 심각한 문제로 인식되고 있다.

지금까지 혈전성 질환을 치료하고 예방하기 위한 수 많은 항혈전제가 개발되어 왔다. 그러나, 수 많은 통상의 항혈전제는, 임상적 적용시 여전히 낮은 치료효과를 나타내고 혈전에 대한 특이성이 낮으며 부작용으로서 출혈성 경향을 유발시킨다는 점에서 해결해야할 문제점을 지니고 있다. 이러한 상황의 한 원인으로서 다음을 고려할 수 있다. 즉, 거의 모든 항혈전제가 혈소판 활성화 과정을 억제시킬 목적으로만 고안된 것이다. 혈소판 활성의 지표를 제공해주는, 시험관 내에서의 혈소판 응집의 측정 방법이 생체 내에서의 복잡한 혈전 형성 과정을 반영하기에는 불충분하다.

혈전 형성은 혈소판 막상의 당단백질과 내피하층 또는 혈장내의 단백질간의 특이적 결합에 따라서 진행된다. 특히, 혈소판 막상의 당단백질 IIb/IIIa("GPIIb/ IIIa"로서 약칭 후술됨)는 혈전 형성의 최종 단계에서 피브리노겐에 대한 수용체로서 작용한다. 따라서, GP II b/IIIa-길항제가 강력한 항혈전제로서 사용될 수 있을 것으로 예상된다. GP II b/IIIa상의 피브리노겐 결합 부위는 아미노산의 RGD 1차 서열을 포함한다. 수 많은 RGD 유도체를 합성하고 이를 평가해 본 결과, GP II b/IIIa-길항제는 생체내 동물 모델과 임상학적 연구에 의거해 보면 혈소판 응집을 강력히 억제시킴으로써 항혈전성 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다[참조:Thrombosis and Haemostasis, vol. 69, p. 560, 1993]. 그러나, GP II b/IIIa 길항제는 상기 효과와 동시에 정상의 지혈 기전을 억제시키므로, 부작용으로서의 출혈성 경향이 통상의 항혈전제와 비교하여 더 강하게 나타난다는 문제점을 지니고 있다[참조:The Lancet, vol. 343, p. 881, 1994; The New England Journal of Medicine, vol. 330, p. 956, 1994].

또다른 한편, 혈전 형성의 초기 단계에 작용하는 중요한 단백질로서 공지된것으로는 혈소판 막상의 당단백질 Ib("GP I b"로서 약칭 후술됨) 및 혈장내의 폰빌레브란트 인자("vWF"로서 약칭 후술됨)가 있다. vWF의 정성적 및 정량적 변화의 발생과 연관된 출혈성 병변으로는 폰 빌레브란트 질환이 있다("vWD" 로서 약칭 후술됨). 혈소판 무력증(GP II b/IIIa의 결핍으로 인한 출혈성 질환) 환자와 비교해 블때 vWD 환자에서는 심각한 출혈이 거의 발생되지 않는다는 임상학적 연구 결과가 나타났다. 따라서, GP I b와 vWF간의 상호작용을 억제시킴으로써 출혈성 경향을 수반하지 않으면서도 강력한 항혈전성 작용을 나타낼 수 있다는 가능성이 고려되었다. 그러나, 모노클로날 항체와 저분자량의 화합물 ATA(아우린 트리카복실산; Blood, vol. 72, p. 1898, 1988 참조)만이 GP I b와 vWF간의 상호작용을 특이적으로 억제시키는 물질로서 공지되어 있다. 생체내에서의 항-GP I b 모노클로날 항체의 어떠한 항혈전성 작용도 밝혀진 바 없다. 대신, 항-GP I b 모노클로날 항체가 혈소판 감소증을 유발시키는 부작용이 부각되었으며, 이로 인해 출혈시간이 연장된다[참조: Blood, vol.70, 344a, 1987; Jpn. J. Clin. Pathol., vol. 40, p. 266, 1992]. 추가로, vWF를 길항시키는 제제에 대해서는, 상기 언급된 ATA 및 마우스 항-돼지 vWF 모노클로날 항체 BB3-BD5가 동물 생체내 실험에서 항혈전성 효능을 나타낸다고 보고되었다[참조: Circulation, vol. 81, p. 1106, 1990]. 그러나, ATA와 BB3-BD5 모두의 경우에 있어서 부작용은 무시할 수 없는 정도이다. 즉, ATA는 항-GP I b와 vWF간의 상호작용을 억제시킴으로써 항혈전성 작용을 나타내는 반면, 이와 동시에 완전히 정반대의 부작용을 수반하여 콜라겐, 아라키돈산, A23187, PAF 및 TXA2에 의해 유발된 혈소판 응집과 방출 반응을 증진시켜 준다[참조:Thrombosis and Haemostasis, vol. 68, p. 189, 1992]. 한편, BB3-BD5는 이의 항혈전성 용량에서 강력한 출혈성 경향을 나타낸다[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, p. 8100, 1987; SURGERY, vol. 112, p. 433, 1992].

앞서 기술한 바와 같이, 기존의 항혈전제를 사용하는 경우에는, 의학적 효과로서의 항혈전성 작용이 부작용으로서의 출혈성 경향과 분리될 수 없다는 딜레마가 존재하게 된다(의학적으로 유효한 양과 부작용을 야기시키는 양간에는 차이가 없다).

최근에, 전단 응력 유도된 혈소판 응집("SIPA"로서 약칭 후술됨)이 병리학적 상태의 혈전 형성과 밀접하게 관련이 있는 것으로 관심을 끌고 있다. 혈관 직경은 작고 혈류 속도는 동맥경화증 병변과 소동맥에서 빠르다. 따라서, 혈관벽과 혈액간의 상호작용으로 인해 상기 병변에서 보다 큰 전단 응력이 발생된다. 이러한 상황하에서는, 혈중 vWF가 활성화되고 이의 3차원적 구조가 변한다. 그 결과, vWF는 혈전 형성에 있어서 결정적인 역할을 한다. 즉, 다음 과정이 공지되어 있다. 첫째, 내피하층 위에 존재하는 vWF는 혈소판 막상의 GP I b와 결합하여, 혈소판이 혈관벽에 유착되게 한다. 둘째, 혈장내에 존재하는 vWF는 혈소판 막상의 당단백질 II b/IIIa와 가교결합하여 혈소판 응집 반응이 진행되도록 한다. 결과적으로, 혈전 형성이 최종적으로 일어난다.

일반적으로, 항생제 리스토세틴(ristocetin) 또는 사독 보트로세틴(snake venom botrocetin)이 고 전단 응력하에서의 변화와 동등한 수준으로 vWF의 3차원적 구조를 시험관내에서 변화시킨다는 것은 공지되어 있다. 즉, 리스토세틴 또는 보트로세틴의 존재하에서, vWF는 GP I b에 대한 결합능력을 획득하게 된다. 이상과 같은 특징들을 이용하여 vWF의 생리학적 활성을 시험관내에서 측정하는 방법으로는 리스토세틴 유도된 혈소판 응집("RIPA"로서 약칭 후술됨)과 보트로세틴 유도된 혈소판 응집("BIPA"로서 약칭 후술됨) 뿐만 아니라 리스토세틴 또는 보트로세틴의 존재하에서 GP I b에 대한 vWF의 결합을-측정하는 방법이 있다. 전자의 방법이 광범위하게 이용된다. 실험 기술의 발전으로 인해, 전단 응력을 실제적으로 적용함으로써 SIPA를 시험관에서 측정하는 장치가 또한 개발되었다. vWF상의 동일한 영역이 어떠한 반응에서도 GP I b에 대한 결합과 연관이 있는 것으로 여겨진다.

지금까지는 vWF의 활성을 시험관내에서 억제시키는, vWF에 대한 몇몇 항체가 수득되어 왔다. 그러나, 이들 항체중 대다수는 반응 특이성 측면에서 열등하고, 이들 항체가 리스토세틴 의존성 반응을 억제시키긴 하지만 거의 모든 항체는 보트로세틴 의존성 반응을 억제시키지 못한다. 앞서 기술한 바와 같이, 리스토세틴에 의해 유도된 vWF상의 GP I b-결합 부위는 보트로세틴에 의해 유도된 것과 상동성인 것으로 여겨진다. 따라서, 상기 항체는 리스토세틴 또는 보트로세틴에 대한 vWF상의 결합 부위를 인식할 수 있다. 엄밀하게 말하자면, 이들 항체는 vWF의 생리학적 활성을 억제시키지 못하므로, 이들의 반응 특이성이 낮은 것으로 언급할 수 있다. 이러한 상황하에서, 2가지 항체, 즉 후지무라(Fujimura) 등에 의해 생성된 NMC-4[참조: J. Nara Med. Assoc., vol. 36, p. 662, 1985]와 두덴함(Tuddenham) 등에 의해 생성된 RFF-VIIIRAG:1이 시험관내에서 리스토세틴과 보트로세틴 둘다에 의존하여 상기 반응을 억제시키는 것으로 문헌[참조: Blood, vol. 177, No. 1, p. 113,1992]에 보고되었다.

상기 2가지 항체에 대한 에피토프가 vWF 분자의 GP I b-결합 부위에 존재하며 이들은 vWF 분자의 아미노산 서열의 449번째 아미노산 잔기와 728번째 아미노산 잔기 사이에 위치한다. 추가로, vWF로의 요오드-표지된 NMC-4의 결합이 SFF-VIIIRAG:1에 의해 부분적으로 억제된다. 이러한 사실에 의거해 보면, 두 에피토프가 서로 상당히 근접한 위치에 존재하는 것으로 여겨진다. 더우기, RFF-VIIIRAG:1는 BIPA를 부분적으로만 억제시키는 반면, NMC-4는 BIPA를 완전히 억제시킨다. 이러한 이유로 인해, NMC-4를 사용하는 연구가 vWF의 과학 분야에서 활발히 이루어져 왔으며 이로써 특정의 결과가 수득되었다. 사람 이외의 동물에서는 NMC-4가 랫트 vWF와의 반응성만을 지닌다.

사람 vWF에 대한 모노클로날 항체를 제조하여 사람 vWF의 GP I b-결합 부위에 관한 정보를 수득하거나, 또는 이러한 모노클로날 항체를 vWF 관련 질환에 대한 예방제 및 치료제로서 사용하고자 하는 경우에는, 상기 모노클로날 항체가 사람 vWF에 대해 고 특이성을 지니도록 하는 것이 바람직한 것으로 여겨진다.

또다른 한편, 통상의 방법으로 신규 의약을 개발하는 경우에는, 먼저 동물 시험을 수행하지 않고서 어떠한 사람 대상 시험을 수행하는 것은 허용되지 않는다. vWF의 생리학적 활성과 항-vWF 모노클로날 항체에 관한 시험을 생체내에서 수행하는 경우에는, 동물을 대상으로 한 시험을 수행할 수 있는 모노클로날 항체, 즉 동시에 사람 이외의 동물의 vWF과 반응성을 나타내는 모노클로날 항체를 사용하는 것이 필요하다. 이러한 방식에 따르면, 피브리노겐의 보조하에 사람 혈소판 응집을강력하게 억제시키는 GP II b/IIIa 길항제가 랫트에 대해서는 유효하지 못하다[참조: Thrombosis and Haemostasis, vol. 70, p. 531, 1993]. 추가로, 랫트는 리스토세틴 유도된 응집을 유발시키지 않는다. 이러한 사실에 따르면, 랫트와 사람간의 혈전 형성 기전은 대체로 상당히 상이한 것으로 여겨진다. 따라서, 랫트를 이용하여 항-vWF 항체의 항혈전성 작용을 평가하는 것은 거의 의미가 없다. 이와는 달리, 기니아 피그의 경우에는, 혈소판 응집이 GP II b/IIIa 길항제에 의해 억제된다. 추가로, 리스토세틴 유도된 응집이 또한 사람과 동일한 방식으로 유도된다. 따라서, 기니아 피그가 항혈전성 작용을 평가하기 위한 생체내 실험용 동물 혈전 모델로서 가장 적합하다.

상기와 같은 관점에 근거해 보면, 사람 vWF과의 반응성만을 지닌 어떠한 모노클로날 항체, 및 사람 vWF와 기니아 피그 vWF 모두와 반응성을 지닌 모노클로날 항체가 유용하다. 그러나, 이러한 항-사람 vWF 모노클로날 항체는 공지되어 있지않다.

추가로, 생체내에서 항혈전성 작용을 지니는 것으로 밝혀진 항-사람 vWF 모노클로날 항체도 공지되어 있지 않다.

본 발명은 항혈전성 작용을 나타내고, 의학적으로 유효한 용량에서 출혈성 사건을 야기시키지 않는, 사람 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)에 대한 신규한 모노클로날 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마, 및 활성 성분으로서 상기 모노클로날 항체를 함유하는 항혈전제에 관한 것이다.

도 1은 사람 PRP를 사용하여 RIPA에서 측정한, 본 발명의 실시예에 관한 항체 2 및 항체 4의 억제 활성과 비교용 대조군으로서의 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 2는 사람 PRP를 사용하여 RIPA에서 측정한, 본 발명의 실시예에 관한 항체 1 및 항체 3의 억제 활성과 비교용 대조군으로서의 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 3은 기니아 피그 PRP를 사용하여 RIPA에서 측정한, 항체 2, 항체 4 및NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 4는 사람 PRP를 사용하여 BIPA에서 측정한, 항체 2, 항체 4 및 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 5는 사람 PRP를 사용하여 BIPA에서 측정한, 항체 1, 항체 3 및 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 6은 기니아 피그 PRP를 사용하여 BIPA에서 측정한, 항체 2, 항체 4 및 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 7은 랫트 PRP를 사용하여 BIPA에서 측정한, 항체 2, 항체 4 및 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 8은 래빗트 PRP를 사용하여 BIPA에서 측정한, 항체 2, 항체 4 및 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 9는 래빗트 PRP를 사용하여 BIPA에서 측정한, 항체 1, 항체 3 및 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 10은 사람 PRP를 사용하여 SIPA에서 측정한, 항체 2, 항체 4 및 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 11은 사람 PRP를 사용하여 SIPA에서 측정한, 항체 1, 항체 3 및 NMC-4의 억제 활성을 도시한 것이다.

도 12는 (리스토세틴의 존재하에서) 고정화된 사람 혈소판으로의 vWF의 결합에 대한 항체 2, 항체 4 및 NMC-4의 영향을 도시한 것이다.

도 13은 (리스토세틴의 존재하에서) 고정화된 사람 혈소판으로의 vWF의 결합에 대한 항체 1, 항체 3 및 NMC-4의 영향을 도시한 것이다.

도 14는 (보트로세틴의 존재하에서) 고정화된 사람 혈소판으로의 vWF의 결합에 대한 항체 2, 항체 4 및 NMC-4의 영향을 도시한 것이다.

도 15는 (보트로세틴의 존재하에서) 고정화된 사람 혈소판으로의 vWF의 결합에 대한 항체 1, 항체 3및 NMC-4의 영향을 도시한 것이다.

도 16은 고정화된 vWF으로의 비오틴화된 AJvW-1의 결합에 대한 각각의 모노클로날 항체의 효과를 도시한 것이다.

도 17은 고정화된 vWF으로의 비오틴화된 AJvW-2의 결합에 대한 각각의 모노클로날 항체의 효과를 도시한 것이다.

도 18은 고정화된 vWF으로의 비오틴화된 AJvW-3의 결합에 대한 각각의 모노클로날 항체의 효과를 도시한 것이다.

도 19는 고정화된 vWF으로의 비오틴화된 AJvW-4의 결합에 대한 각각의 모노클로날 항체의 효과를 도시한 것이다.

도 20은 고정화된 vWF으로의 비오틴화된 NMC-4의 결합에 대한 각각의 모노클로날 항체의 효과를 도시한 것이다.

도 21은 생체외 기니아 피그 RIPA에서 측정한, 항체 2 및 항체 4의 억제 효과를 도시한 것이다.

도 22는 생체외 기니아 피그 BIPA에서 측정한, 항체 4의 억제 효과를 도시한 것이다.

도 23은 기니아 피그 PIT 모델에서의 폐색 시간에 대한 항체 2의 효과를 도시한 것이다.

도 24는 기니아 피그 PI7 모델에서의 폐색 시간에 대한 항체 4의 효과를 도시한 것이다.

도 25는 기니아 피그 A-V 측로 모델에서의 폐색 시간에 대한 항체 2의 효과를 도시한 것이다.

도 26은 기니아 피그 출혈 시간 모델에서의 출혈 시간에 대한 항체 2의 효과를 도시한 것이다.

도 27은 기니아 피그 출혈 시간 모델에서의 출혈 시간에 대한 항체 4의 효과를 도시한 것이다.

발명을 수행하기 위한 최선의 양태

본 발명은 다음 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예로 제한되지는 않는다.

본 발명은 앞서 언급한 바와 같은 측면들을 고려하여 이루어졌으며, 본 발명의 목적은 항혈전성 작용을 나타내기에 충분히 의학적으로 유효한 용량에서 출혈을 유발시키지 않는, 사람 폰 빌레브란트 인자에 대한 모노클로날 항체, 특히 사람 vWF과의 반응성만을 지닌 모노클로날 항체 및 사람 vWF 뿐만 아니라 기니아 피그vWF와의 반응성을 지닌 모노클로날 항체; 이러한 모노클로날 항체를 생산하기 위한 하이브리도마; 및 활성 성분으로서 상기 모노클로날 항체중의 어느 하나를 함유하는 항혈전제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 마우스를 사람 vWF로 면역시킨 다음 이와 같이 면역시킨 마우스의 비장 세포를 마우스 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킴으로써, 사람 폰 빌레브란트 인자와의 반응성을 지니고 사람 혈소판의 RIPA, BIPA 및 SIPA 억제 작용을 나타내는 모노클로날 항체를 수득하는데 성공하였다. 추가로, 본 발명자들은 당해 모노클로날 항체가 생체내 혈전 모델에서 출혈을 수반하지도 않으면서 강력한 항혈전성 작용을 나타낸다는 사실을 밝혀내었다. 이로써 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 사람 혈소판의 RIPA(리스토세틴 유도된 혈소판응집), BIPA(보트로세틴 유도된 혈소판 응집) 및 SIPA(전단응력 유도된 혈소판 응집) 억제 작용을 지니고 항혈전성 작용을 나타내기에 의학적으로 유효한 용량에서 출혈을 유발시키지 않는, 사람 폰 빌레브란트 인자와의 반응성을 갖는 모노클로날 항체를 활성 성분으로서 포함하는 항혈전제에 있다.

또다른 국면에서, 본 발명은 다음 특성을 갖는 모노클로날 항체를 제공하는 것이다:

(a) 당해 모노클로날 항체는 사람 폰 빌레브란트 인자와의 반응성을 지니고;

(b) 당해 모노클로날 항체는 사람 혈소판의 RIPA(리스토세틴 유도된 혈소판 응집), BIPA(보트로세틴 유도된 혈소판 응집) 및 SIPA(전단응력 유도된 혈소판 응집)을 억제시키고,

(c) 당해 모노클로날 항체는 기니아 피그 혈소판의 RIPA(리스토세틴 유도된 혈소판 응집) 및 BIPA(보트로세틴 유도된 혈소판 응집)을 억제시키며;

(d) 당해 모노클로날 항체는 기니아 피그에서 강력한 생체내 항혈전성 작용을 나타내지만, 출혈을 야기시키지는 않는다.

또한 또다른 국면에서, 본 발명은 다음 특성을 갖는 모노클로날 항체를 제공하는 것이다.

(A) 당해 모노클로날 항체는 사람 폰 빌레브란트 인자에 대한 반응 특이성을 지니며 ;

(B) 당해 모노클로날 항체는 사람 혈소판의 RIPA(리스토세틴 유도된 혈소판 응집), BIPA(보트로세틴 유도된 혈소판 응집) 및 SIPA(전단응력 유도된 혈소판 응집)을 억제시키고;

(C) 당해 모노클로날 항체는 랫트, 기니아 피그 및 래빗트의 폰 빌레브란트 인자와는 반응하지 않는다.

본 발명의 다른 국면에서, 본 발명은 폰 빌레브란트 인자로 면역시킨 마우스의 비장 세포와 Sp2/O-Ag14 마우스 골수종 세포간의 융합에 의해 생성된, 앞서 언급한 특성들을 갖는 모노클로날 항체를 생산하기 위한 하이브리도마를 제공하는 것이다.

본 발명은 다음에 보다 상세히 설명될 것이다.

<1> 본 발명의 모노클로날 항체

본 발명의 모노클로날 항체의 제1양태("제1 모노클로날 항체"로서 후술됨)는 다음 특성들을 갖는 모노클로날 항체에 있다:

상기 언급된 모노클로날 항체의 구체적인 양태는 앞서의 특성 이외에도 다음 특성을 추가로 지닌 모노클로날 항체로 예시된다:

(e) 당해 모노클로날 항체는 랫트 혈소판의 BIPA(보트로세틴 유도된 혈소판 응집)을 억제시키며;

(f) 당해 모노클로날 항체는 래빗트 혈소판의 BIPA(보트로세틴 유도된 혈소판 응집)을 억제시킨다.

즉, 본 발명의 제1 모노클로날 항체는 이것이 사람 vWF와 반응성이고 이에 대한 친화도가 높으며 RIPA, BIPA 및 SIPA중 어떠한 것도 시험관내에서 강력하게 억제시킨다는 점에서 높은 반응 특이성을 지닌다. 또다른 한편, 본 발명의 제1 모노클로날 항체는 적어도 기니아 피그의 RIPA와 BIPA를 억제시킨다. 나중에 기술될실시예에서 수득한 모노클로날 항체는 랫트와 래빗트의 BIPA를 시험관내에서 추가로 억제시킨다. 기니아 피그에게 1회 정맥내 투여한 실험에 따르면, 당해 모노클로날 항체는 혈액학적 파라미터와 응고 파라미터에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 RIPA와 BIPA를 생체외에서 억제시킨다. 당해 모노클로날 항체는 기니아 피그의 사용을 기본으로 하는 광화학적으로 반응-유도된 혈전증 모델에서 대퇴 동맥 폐색에 요구되는 시간을 연장시키고, 동정맥 측로 형성 모델에서 폐색에 요구되는 시간을 연장시킨다. 더욱이, 당해 모노클로날 항체를 이의 의학적으로 유효한 용량으로 사용하는 경우, 이의 효과는 출혈 시간을 연장시키지 않으면서 장기간 지속된다.

상기 언급된 특성을 지닌 어떠한 모노클로날 항체도 지금까지 공지된 바 없다. 본 발명의 제1 모노클로날 항체는 신규한 모노클로날 항체이다. 본 발명의 제1 모노클로날 항체는 이의 에피토프가 동물 vWF와 반응할 뿐만 아니라 vWF에 대한 NMC-4의 결합을 전혀 억제시키지 않는다는 점에서 상기 언급된 NMC-4의 에피토프와는 명백히 상이하다(후술될 실시예 참조). 본 발명의 모노클로날 항체가 생체내 혈전증 모델에서 출혈 경향을 수반하지 않으면서 혈전 형성을 강력히 억제한다는 사실은 본 발명의 모노클로날 항체가 혈전증에 대한 이상적인 치료제로서 이용될 수도 있다는 가능성을 강력히 제시하고 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는 신규할 뿐만 아니라 산업적으로 이용가능하다.

즉, 본 발명의 제1 모노클로날 항체는 vWF의 GP I b-결합 부위를 특정화하는 데 유용할 뿐만 아니라, 생체 내에서의 vWF의 분포 및 현존 형태를 분석하고 vWD(폰 빌레브란트 질환)의 원인을 조사하기 위한 수단으로서 사용되고 혈전증에 대해유효한 예방제 및 치료제로서 이용될 것으로 예상된다. 추가로, 본 발명의 제1 모노클로날 항체는 항혈전성 작용을 평가할 때, 기니아 피그를 대상으로 하는 생체내 실험에 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체의 제2 양태("제2 모노클로날 항체"로서 후술됨)는 다음 특성들을 갖는 모노클로날 항체이다:

즉, 본 발명의 제2 모노클로날 항체는 사람 vWF와 반응성이고 이에 대한 친화도가 높다. 추가로, 제2 모노클로날 항체는 RIPA, BIPA 및 SIPA중 어떠한 것도 시험관내에서 강력하게 억제시킨다. 그 밖에도, 제2 모노클로날 항체는 랫트, 기니아 피그 및 래빗트의 어떠한 vWF와도 반응하지 않는다. 이러한 관점에서 보면, 제2 모노클로날 항체는 NMC-4의 특이성 보다 더 높은 특이성을 지닌다.

상기 언급된 특성을 지닌 어떠한 모노클로날 항체도 지금까지 공지된 바 없다. 본 발명의 제2 모노클로날 항체는 신규한 모노클로날 항체이다. 본 발명의 제2 모노클로날 항체는 이의 에피토프가 랫트 vWF와 반응하지 않을 뿐만 아니라 vWF에대한 NMC-4의 결합을 전혀 억제시키지 않는다는 점에서 상기 언급된 NMC-4의 에피토프와는 명백히 상이하다(후술될 실시예 참조). 본 발명의 모노클로날 항체가 사람 이외의 동물의 vWF, 예를 들면, 랫트의 vWF와는 반응하지 않는다는 사실에 근거해 보면, 본 발명의 모노클로날 항체는 사람에 대해 특이적인 특정의 항원성 결정기를 인식하며 이러한 항원성 결정기는 진화 과정동안 보존되지 않는 것으로 추측된다. 이러한 사실은 본 발명의 모노클로날 항체의 높은 특이성을 뒷받침해주는 것으로 여겨진다. 본 발명의 모노클로날 항체는 신규할 뿐만 아니라 산업적으로 이용가능하다.

본 발명의 제2 모노클로날 항체는 혈소판 막상에서의 사람 vWF와 GP I b간의 결합을 특이적이고도 강력하게 억제시킨다. 따라서, 제2 모노클로날 항체는 제1 모노클로날 항체와 동일한 방식으로, 사람 vWF의 GP I b-결합 부위를 특정화하고, 생체 내에서의 사람 vWF의 분포 및 현존 형태를 분석하고 vWD(폰 빌레브란트 질환)의 원인을 조사하기 위한 수단으로서 이용될 수 있다. 어떠한 생체내 혈전 형성-억제 실험도 동물의 사용을 기본으로 하여 수행하지는 않았는데, 이는 제2 모노클로날 항체가 사람 이외의 동물의 vWF와는 반응하지 않기 때문이다. 그러나, 후술될 실시예에서 나타낸 바와 같이, vWF를 인식하는 제2 모노클로날 항체에 대한 에피토프는 제1 모노클로날 항체에 의해 인식된 에피토프에 근접하여 위치한다. 따라서, 제2 모노클로날 항체는 제1 모노클로날 항체에 의해 인식된 것과 동일한 에피토프를 매우 잘 인식할 수 있다. 따라서, 제2 모노클로날 항체는 제1 모노클로날 항체와 동등한 수준의 생체내 효과를 갖는 것으로 추측된다. 제2 모노클로날 항체는 혈전성질환에 유효한 예방제 및 치료제로서 이용될 것으로 예상된다.

제1 및 제2 모노클로날 항체는 또한 사람 혈소판의 전단 응력 유도된 혈소판 유착("SIPAd"로서 후술됨)을 억제시키는 작용을 지닌다. SIPAd는 또한 병리학적 상태의 혈전 형성에 관한 것이다. 정상의 사람 혈액을 사용한 실험에 따르면, 제1 및 제2 모노클로날 항체가 용량-의존적 방식으로 SIPAd를 억제하는 것으로 확인되었다. 이러한 억제는 현재 항혈전제로서 사용될 것으로 예상되는 G II b/IIIa 길항제의 경우에서는 관찰되지 않았다.

본 발명의 모노클로날 항체의 제3 양태는 사람 vWF와의 반응성을 지니고, 제3 모노클로날 항체가 제1 또는 제2 모노클로날 항체와 공존하는 경우 제1 또는 제2 모노클로날 항체와 vWF 인자간의 결합을 억제시키는 작용을 지닌 모노클로날 항체이다. 후술될 실시예에서 나타낸 바와 같이, 제1 및 제2 모노클로날 항체중의 하나는 서로 가까이 위치한 에피토프를 사용하거나 동일한 에피토프를 사용하여 vWF에 대한 다른 항체의 결합을 상호 억제시킨다. 추가로, 제1 모노클로날 항체는 생체내 혈전 모델에서 출혈성 경향을 수반하지 않으면서 혈전 형성을 강력하게 억제시킨다. 이러한 사실에 따르면, 제1 및 제2 모노클로날 항체가 지닌 특성들, 즉 상기 항체들이 RIPA, BIPA 및 SIPA를 억제시키고, 출혈을 야기시키지 않으면서 항혈전성 작용을 나타내는 것은 이들 항체에 의해 인식된 에피토프(들)로부터 기원된 것으로 여겨진다. 따라서, vWF 인자와 제1 및 제2 모노클로날 항체간의 결합을 억제하는 작용을 지닌 모노클로날 항체가 또한 본 발명의 항혈전제의 활성 성분으로서 존재할 수 있다.

상기 언급된 특성을 지닌 모노클로날 항체를 약제로서 사용할 수 있다. 이러한 약제의 구체적인 예로는 후술될 항혈전제가 있다.

<2> 본 발명의 하이브리도마 및 모노클로날 항체의 생산

본 발명의 모노클로날 항체는 사람 vWF로 면역시킨 동물의 항체-생성 세포와 골수종 세포간에 세포 융합을 수행하여 하이브리도마를 형성시키고, 사람 vWF에 대한 반응 특이성을 지니고 사람 혈소판의 RIPA, BIPA 및 SIPA를 억제시키는 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 클로닝한 다음, 이러한 하이브리도마 또는 이의 변이체를 배양함으로써 수득한다.

각 유형의 모노클로날 항체는 다음과 같이 수득한다. 즉, 제1 모노클로날 항체는 기니아 피그 혈소판의 RIPA 및 BIPA를 억제시키는 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 클로닝한 다음 이러한 하이브리도마 또는 이의 변이체를 배양함으로써 수득한다. 제2 모노클로날 항체는 랫트, 기니아 피그 및 래빗트의 vWF와는 반응하지 않는 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 클로닝한 다음 이러한 하이브리도마 또는 이의 변이체를 배양함으로써 수득한다.

상기 하이브리도마는 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, pp. 495-492, 1975]의 방법에 따라서 제조한다. 하이브리도마 제조 방법, 및 목적하는 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마의 선별 방법은 다음에 설명될 것이다.

항체-생산 세포는 특정 동물, 예를 들면, Balb/c 마우스를 사람 vWF로 면역시키고, 상기 동물로부터 비장 세포, 임파선 세포 및 말초 혈액 등의 항체-생산 세포를 제조한다. 사람 vWF는, 예를 들면, 겔 여과를 통해 사람 혈장으로부터 정제시킴으로써 수득할 수 있다.

사람 vWF로 면역시킨 동물로부터 항체-생산 세포를 수집하여 골수종 세포와의 세포 융합을 수행한다. 각종 포유동물로부터 기원한 세포종을 세포 융합에 사용될 골수종 세포로서 이용할 수 있다. 그러나, 항체-생산 세포를 제조하기 위해 사용된 동물의 것과 동일한 종의 동물로부터 기원한 세포종을 사용하는 것이 바람직하다. 세포 융합 후에 융합된 세포와 융합되지 않은 세포를 구별하기 위해서는, 융합되지 않은 골수종 세포는 생존할 수 없고 하이브리도마만이 증식할 수 있도록 마커를 갖는 골수종 세포종을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 8-아자구아니딘 내성 골수종 세포와 정상 세포로서의 항체-생산 세포간의 세포 융합에 의해 형성된 하이브리도마는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배지(HAT 배지)에서 증식할 수 있는 반면, 8-아자구아니딘 내성 골수종 세포는 HAT 배지에서 사멸되고 정상의 항체-생산 세포는 장기간 배양될 수 없다. 따라서, 하이브리도마만이 선택적으로 배양될 수 있다[참조: Science, vol. 145, p.709, 1964]. 목적하는 항체가 하이브리도마의 배양 상등액으로부터 용이하게 수득된다는 측면에서 보면, 고유의 면역글로불린을 분비시키지 않는 세포종을 골수종 세포로서 사용하는 것이 바람직하다.

세포 융합은, 예를 들면, 다음과 같이 수행한다.

사람 vWF로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 대수 성장기의 마우스 골수종 세포, 예를 들면, Sp2/O-Ag14(8-아자구아니딘 내성; IgG를 분비시키지 않음)와 배합하는데 비장 세포 대 골수종 세포의 비가 약 10:1 내지 1:1이 되도록한다. 원심분리시킨 후, 잔류하는 침전물을 평균 분자량이 1,000 내지 6,000인 폴리에틸렌 글리콜과 함께 가하여 상기 세포들이 융합되도록 30 내지 50%의 최종 농도를 수득한다. 융합은 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하는 것 대신 세포의 배합 용액에 전기 펄스를 적용시킴으로써 수행할 수 있다.

융합 처리시킨 세포를 HAT 배지, 예를 들면, 하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 및 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 둘벡코 변형 이글스 최소 필수 배지("DMEM"로서 약칭 후술됨)에 현탁시킨다. 이 현탁액을 분산시키고 96-웰 미세역가판 등에 따라 부은 다음, 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소 중에서 배양하여 하이브리도마만이 성장하도록 한다.

상기 언급된 바와 같이 수득된 하이브리도마는 사람 vWF 제제에 혼합 방식으로 함유된 다른 단백질에 대한 모노클로날 항체, 또는 RIPA, BIPA 및 SIPA와 무관한 사람 vWF의 부위에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마에 덧붙여, 목적하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 함유하는 혼합된 배양물로서 제공된다. 따라서, 목적하는 모노클로날 항체를 생산하는 세포종이 상기 하이브리도마로부터 선택된다.

사람 vWF와의 반응성을 지닌 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 항원으로서 사람 vWF를 사용하는 효소 면역검정에 따라서 선별할 수 있다. 사람 vWF에 의해 매개된 RIPA 및 BIPA 모두를 억제시키는 모노클로날 항체를 생산하는 세포종은 각 웰중의 배지 일부를 사용하여 RIPA 및 BIPA에 대한 억제 활성을 측정함으로써 선별한다.

본 발명의 제1 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 기니아 피그, 랫트 및 래빗트 등의 동물의 vWF와 결합하는 모노클로날 항체, 또는 상기 언급된 바와 같은 동물의 혈소판의 RIPA 또는 BIPA를 억제시키는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 ELISA(효소 결합된 면역흡착 검정) 방법 등의 효소 면역검정법에 따라 선별함으로써 수득한다. 본 발명의 제2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 사람 이외의 동물(예: 래빗트)의 vWF와 반응성을 나타내지 않는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별함으로써 수득한다.

목적하는 모노클로날 항체를 생산하기 위한 하이브리도마가 배양물내에 함유되어 있다는 사실을 확인한 후, 이 배양물을, 아미노프테린이 HAT 배지로부터 제거된다는 것을 제외하고는 HAT 배지와 동일한 조성을 갖는 HT 배지에 옮긴다. 상기 하이브리도마를 추가로 배양하여, 예를 들면, 제한 희석법에 따라서 클로닝을 수행한다.

이로써, 후술될 실시예에서 나타낸 바와 같이 하이브리도마 AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 및 AJvW-4를 수득하였다. 이들 모두는 1994년 8월 24일에 국제기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry; 우편번호:305, 1-3 Higashi-Icchome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan]에 수탁번호 FERM P-14486, FERM P-14487, FERM P-14488 및 FERM P-14489로 각각 기탁되었으며, 1995년 9월 29일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁으로 이관하여 수탁번호 FERM BP-5247, FERM BP-5248, FERM BP-5249 및 FERM BP-5250으로 각각 기탁되었다. 이러한 하이브리도마 중에서, AJvW-2 및 AJvW-4는 제1 모노클로날 항체를 생산하고 AJvW-1 및 AJvW-3은 제2 모노클로날 항체를 생산한다.

후술될 실시예에서 나타낸 바와 같이, AJvW-1 및 AJvW-3에 의해 생산된 모노클로날 항체는 아부류 IgG2a 아이소타입(isotype)에 속하고, AJvW-2에 의해 생산된 모노클로날 항체는 아부류 IgG1에 속하며, AJ4W-4에 의해 생산된 모노클로날 항체는 아부류 IgG2b에 속한다. NMC-4는 지금까지 보고되온 바와 같이 IgG1에 속한다.

본 발명의 모노클로날 항체는 상기 언급된 바와 같이 수득된 하이브리도마 또는 이러한 하이브리도마를 제한 희석법에 따라서 클로닝하여 선별한 변이체, 예를 들면, 높은 항체 생산성을 지닌 하이브리도마의 변이체를 적당한 배지 또는 마우스 복수액에서 배양함으로써 수득한다. 또다른 방법으로는, 본 발명의 모노클로날 항체는 또한, 상기와 같이 수득한 하이브리도마로부터 항체 생산과 관련된 유전자를 분리시키고, 이러한 유전자를 발현 벡터내로 혼입시키며, 수득된 벡터를 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)와 같은 미생물에 도입한 다음, 수득된 항체-생산 미생물을 배양시킴으로써 수득한다. 하이브리도마로는 상기 언급된 AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 및 AJvW-4, 및 이들의 변이체가 있다.

하이브리도마를 배양하기 위한 배지로는, 예를 들면, 태아 송아지 혈청, L-글루타민, 글루코즈, 나트륨 피루베이트, 2-머캅토에탄올 및 항생제(예: 페니실린 G, 스트렙토마이신 및 젠타마이신)를 추가로 함유하는 DMEM 배지를 기본으로 하는 배지가 있다. 본 발명의 하이브리도마는 통상적으로 5% 이산화탄소와 95% 공기를 포함하는 기체상을 이용하여 상기 배지중에서 37℃하에 2 내지 4일 동안 배양한다.또다른 방법으로는, 하이브리도마를 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸[예를 들면, Sigma가 제조한 프리스탄(상표명)]로 예비처리시킨 Balb/c 마우스의 복강내에서 약 10 내지 15일 동안 배양한다. 이로써, 정제될 수 있을 정도의 양의 모노클로날 항체가 생산된다.

이로써 생산된 모노클로날 항체는 배양 상등액 또는 복수액으로부터 단백질의 분리 및 정제에 적합한 통상의 방법에 따라서 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들면, 원심분리, 투척, 황산암모늄를 사용한 염석, 및 DEAE-셀룰로즈, 하이드록시아파타이트, 단백질-A 아가로즈 및 단백질-G 아가로즈를 사용한 칼럼 크로마토그래피가 있다.

<3> 본 발명의 항혈전제

본 발명의 항혈전제는 사람 폰 빌레브란트 인자와의 반응성을 지니고, 사람 혈소판의 RIPA(리스토세틴 유도된 혈소판 응집), BIPA(보트로세틴 유도된 혈소판 응집) 및 SIPA(전단응력 유도된 혈소판 응집) 억제 작용을 지니며 항혈전성 작용을 나타내기에 의학적으로 유효한 용량에서 출혈을 유발시키지 않는 모노클로날 항체를 활성 성분으로서 함유한다. 이러한 모노클로날 항체의 구체적인 예로는 본 발명의 제1 모노클로날 항체 및 제2 모노클로날 항체가 있다. 상기 언급된 바와 같이, 제1 모노클로날 항체 및 제2 모노클로날 항체와 공존하는 경우에 제1 및 제2 모노클로날 항체와 vWF 인자와의 결합을 억제시키는 작용을 갖는 모노클로날 항체는 또한 제1 및 제2 모노클로날 항체와 동일한 작용을 지니는 것으로 예상되며 이러한 모노클로날 항체는 본 발명의 항혈전제의 활성 성분으로서 사용된다.

마우스로부터 기원한 모노클로날 항체를 항혈전제로서 사람에게 투여하는 경우에는, 항원성과 혈중 반감기에 있어서의 문제점 때문에 상기 모노클로날 항체를 사람형 중의 한가지 형으로 변형시키는 것이 바람직하다. 항체의 가변 영역을 문헌[참조: Jones et al., Nature, vol. 321, p. 522, 1986; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p. 10029, 1989]에 기술된 방법에 따라서 반응 특이성을 상실하지 않고서도 사람형의 가변 영역으로 전환시킬 수 있다. 최근에는, 윈터(Winter) 등 및 레너(Lerner) 등에 의해 기술된 레퍼토리 클로닝 방법이 또한 이용가능하다[참조: J. Mol. Biol., vol. 222, p. 581, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, p. 2432, 1991].

앞서의 모노클로날 항체를 트립신, 파파인 및 펩신 등의 단백질분해 효소로 분해시킨 다음 정제시켜 수득할 수 있는 단편 F(ab')2, Fab' 및 Fab가 상기 모노클로날 항체와 등등한 수준의 특성을 지닌다면 이들 단편을 또한 항혈전제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 항혈전제의 유형 또는 형태로는, 예를 들면, 주사제, 설하 정제, 피내 습포제, 정제 또는 환제, 캅셀제, 과립제, 시럽, 좌제, 연고 및 점적주입제가 있다. 이들 중에서, 주사제, 설하 정제 및 피내 습포제가 바람직하다. 당해 항혈전제의 유형에 따라서, 상기 제제를 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 락토즈, 감자 전분, 탄산칼슘 및 나트륨 알기네이트와 배합할 수 있다. 주사제의 경우에는, 용매로서 사용된 것, 예를 들면, 주사용수, 생리학적 식염수 및 링거액이 있다. 이러한 용매를 분산제와 함께 가할 수도 있다. 추가로, 항-vWF 모노클로날 항체 이외의 항혈전성 성분을 함께 사용할 수도 있다.

본 발명의 항혈전제의 투여량은, 예를 들면, 환자의 연령 및 상태에 따라서 상이하다. 그러나, 일반적으로, 정맥내 투여인 경우에는, 활성 성분으로서 작용하는 모노클로날 항체의 양으로 나타낸 바와 같은 본 발명의 항혈전제를 바람직하게는 성인 1일 0.1μg/kg 내지 1000mg/kg, 더욱 바람직하게는 1μg/kg 내지 100mg/kg 사용함으로써 예정된 효과를 획득할 수 있다.

본 발명의 항혈전제는 항혈전제에 관한 일반적 적용분야에 적용할 수 있다. 즉, 본 발명의 항혈전제는 혈소판 유착 및 응집과 관련된 질환을 예방하거나 치료하는데 적용할 수 있다. 구체적으로 언급하면, 예를 들면, 본 발명의 항혈전제는 일시적인 뇌 허혈성 발작, 불안정한 협심증, 뇌 경색, 심근 경색 및 말초 동맥 폐색증의 치료에 유효하고, PTCA 후의 재폐색과 관상 동맥 바이패스 이식의 폐색의 예방에 유효하며 관상 동맥판 교체와 필수 혈소판혈병의 치료에 유효하다.

<1> 모노클로날 항체의 제조

(1) 면역감작화 및 세포 융합

정제된 사람 vWF를 등량의 보조제(MPL+TDM EMULSION: 상표명 RIBI)와 혼합하고, 수득된 혼합물을 1마리 마우스당 vWF 100μg의 양에 상응하는 양으로 Balb/c 숫컷 마우스(면역화 개시시 8주생임)에 피하 투여한다(프라이밍 면역화). 21일 후, 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 피하 투여함으로써 면역화를 수행한다(부스터 면역화). 상기 부스터로부터 19일 또는 30일 후에, 250μg/㎖의 농도를 가지도록사람 vWF를 PBS(Nissui가 제조한 인산염-완충된 생리학적 식염수)로 희석시켜 수득한 제제 200㎕를 상기 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 투여한다(최종 면역화).

최종 면역시킨지 3일 후에 마우스로부터 비장을 절단시키고 이를 단일 세포로 나눈다. 이어서, 비장 세포를 DMEM 배지로 세척한다. 한편, 대수 증식기의 마우스 골수종 세포 Sp2/O-Ag14를 수집하고 이들을 DMEM 배지로 세척한다. 비장 세포와 마우스 골수종 세포를 세포수 10:1의 비율로 플라스틱 튜브에서 충분히 혼합한 다음, 50%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(Boehringer Mannheim가 제조함, 평균 분자량:4000)을 첨가하여 37℃에서 7분 동안 세포 융합을 수행한다.

상등액을 원심분리하여 제거하고, 잔사를 HAT 배지(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘과 함께 첨가된 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 DMEM 배지)와 함께 가한다. 비장 세포의 농도가 5×10⁶세포수/㎖가 되도록 상기 잔사를 현탁시킨다. 이러한 세포 현탁액을 분산시키고, 하나의 웰이 현탁액 100㎕를 함유하도록 96-웰 플라스틱판에 따라 부은 다음, 5% 이산화탄소중에서 37℃하에 배양한다. HAT 배지를 2일째 및 5일째 되는 날에 50㎕/웰의 양으로 보충한다. 이후, 배지의 절반 용량을 하이브리도마 증식에 부합하여 매 3일 또는 4일 마다 교환한다.

(2) 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝

본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 vWF가 보유하는 생리학적 활성에 대한 당해 모노클로날 항체의 억제 활성을 지표로서 사용하여 스크리닝한다. 하이브리도마의 증식이 완료된 후에 각 웰중의 배지 일부를 샘플링하여,이를 대상으로 RIPA 및 BIPA에 대한 억제 활성을 측정한다. 2개의 반응을 강력히 억제시키는 하이브리도마 클론을 선별한다.

기니아 피그, 래빗트 및 랫트의 vWF와 반응성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 상기 선별된 클론으로부터 선별한다. 이로써 수득된 하이브리도마를, 아미노프테린을 HAT 배지로부터 제거시킨 것을 제외하고는 HAT 배지와 동일한 HT 배지에 옮기고 이를 추가로 배양한다. 제한 희석법에 따라서 클로닝을 2회 수행한다. 이로써 안정한 하이브리도마를 수득한다. 최종적으로 수득된 2개의 하이브리도마를 AJvW-2 및 AJvW-4로 명명한다.

또다른 한편, 기니아 피그, 래빗트 및 랫트의 vWF와 반응성을 나타내지 않는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 상기 언급된 RIPA 및 BIPA의 반응들을 강하게 억제시킨 클론으로부터 선별한다. 이로써 수득된 하이브리도마를, 아미노프테린을 HAT 배지로부터 제거시킨 것을 제외하고는 HAT 배지와 동일한 HT 배지에 옮기고 이를 추가로 배양한다. 제한 희석법에 따라서 클로닝을 2회 수행한다. 이로써 안정한 하이브리도마를 수득한다. 최종적으로 수득된 2개의 하이브리도마를 AJvW-1 및 AJvW-3으로 명명한다.

AJvW-2 및 AJvW-4는 본 발명의-제1 모노클로날 항체를 생산하였고 AJvW-1 및 AJvW-3은 본 발명의 제2 모노클로날 항체를 생산하였다.

<2> 모노클로날 항체의 생산 및 정제

(1) 모노클로날 항체의 생산

2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(상표명:프리스탄, Sigma 제조, 0.5㎖)을 6 내지 8주생인 Balb/c 암컷 마우스에게 복강내 주사한다. 10 내지 20일 후에, AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 및 AJvW-4의 세포(1×10⁶내지 10⁷세포)를 PBS에 현탁시키고 이들을 상기 마우스에게 복강내 접종한다. 7 내지 10일 후에, 마우스를 희생시키고 복부를 절단하여, 이로부터 생성된 복수액을 수집한다. 이 복수액을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 수거한 다음 -20℃에서 저장한다.

(2) 모노클로날 항체의 정제

Hi-Trap 단백질-A 항체 정제 키트(Pharmacia가 제조한 상표명)를 사용하여 상기 언급된 복수 상등액으로부터 IgG를 정제한다. 즉, 복수액(2㎖)을 용액 A(1.5M 글리신, 3M NaCl, pH 8.9, 8㎖)와 함께 가하고 공극 크기가 45㎛인 여과용 필터(밀리포어 제조)를 사용하여 여과시킨다. 이후, 이로써 수득된 여액을, 용액 A로 충분히 평형시킨 단백질 세파로즈 HP(Pharmacia 제조)가 충전된 칼럼(칼럼 용량: 1㎖)에 적용하고 이 칼럼을 칼럼 용량의 10배 량의 용액 A로 세척한다. 이어서, IgG 분획을 칼럼 용량의 10배 량의 용액 B(0.1M 글리신, pH 2.8)로 용출시킨다. 용출된 IgG 분획을 PBS에 대하여 투석시키고 이를 정제된 샘플로서 사용한다.

AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 및 AJvW-4에 의해 생산된 모노클로날 항체는 각각 "항체 1", "항체 2", "항체 3" 및 "항체 4"로서 후술될 것이다.

비교용 대조군으로서 사용될 샘플을 수득하기 위해서 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 NMC-4를 함유하는 마우스 복수액으로부터 NMC-4를 정제한다.

<3> 모노클로날 항체의 아부류의 결정

본 발명의 모노클로날 항체를 대상으로 하여, 시판중인 아부류-결정 키트(상표명: Mono Ab-ID EIA Kit A, Zymed 제조)를 통해 상기 항목 <2> 에서 수득한 정제된 항체를 사용하여 이들의 IgG 아부류를 결정한다. 이러한 방법은 ELISA 방법을 기준으로 한 것이다. 그 결과, 항체 1, 항체 2, 항체 3 및 항체 4 모두가 IgG 부류에 속하였다. 항체 1과 항체 3의 아부류는 IgG2a 아이소타입이고 항체 2의 아부류는 IgG1 아이소타입이며 항체 4의 아부류는 IgG2b 아이소타입이다. NMC-4는 지금까지 보고된 바와 같이 IgG1에 속한다.

<4> 혈소판 응집에 대한 본 발명의 모노클로날 항체의 억제 활성

(1) RIPA에 대한 억제 활성

정상의 사람 공여자로부터 수득한 혈액을 3.8% 나트륨 시트레이트와 9:1의 비율로 혼합한 다음 이를 1100rpm에서 10분 동안 원심분리시켜 혈소판 풍부한 혈장(PRP)을 제조한다. PRP(3×10⁸혈소판수/㎖, 225㎕)를 37℃에서 3분 동안 각종 농도의 모노클로날 항체(2㎕)와 반응시킨다. 이후, 이에 리스토세틴(Sigma 제조)을 가하여 1.5mg/㎖의 최종 농도를 수득한다. 혈소판 응집 능력을 측정하기 위한 장치(상표명: HEMATRCER, Niko Bioscience 제조)를 사용하여 혈소판 응집을 37℃에서 10분간 모니터한다. 혈소판 응집 정도는 광학적 투과성의 변화로 나타낸다. 혈소판 응집에 대한 억제 활성은, DMEM 또는 샘플 용해용 완충액을 첨가함으로써 수득한 최대 응집을 대조군으로서 사용함으로써 결정한다.

결과는 도 1(항체 2, 4)과 도 2(항체 1, 3)에 나타내었다. 어떠한 항체 1,항체 2, 항체 3, 항체 4 및 NMC-4도 용량-의존적 방식으로 사람 RIPA를 억제시킨다. IC₅₀값은 항체 1의 경우 0.8μg/㎖이고, 항체 2의 경우 3.5μg/㎖이고, 항체 3의 경우 1.0μg/㎖이고, 항체 4의 경우 2.0μg/㎖이고, NMC-4의 경우 0.7μg/㎖이다.

기니아 피그의 PRP는 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 제조하고, 이에 리스토세틴을 가하여 1.75mg/㎖의 최종-농도를 수득하며 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 측정을 수행한다. 항체 1(최종 농도: 80μg/㎖), 항체 3(최종 농도: 80μg/㎖) 및 NMC-4(최종 농도: 27μg/㎖)는 기니아 피그의 RIPA를 전혀 억제시키지 못한 반면, 항체 2와 항체 4는 용량-의존적 방식으로 기니아 피그 RIPA를 억제시킨다(도 3). IC50 값은 항체 2의 경우 0.4μg/㎖이고, 항체 4의 경우 1μg/㎖이다.

(2) BIPA에 대한 억제 활성

BIPA를 측정하기 전에, 사독, 즉 보트로세틴을 보토롭스 자라라카(Botherops jararaca)로부터 수득된 조 사독 제제(Sigma 제조)로부터 정제한다. 즉, 조 사독 제제 1g을 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.4)에 용해시키고 불용성 물질을 300rpm에서 원심분리시켜 제거한다. 수득된 상등액을 세파덱스 G-75(5×90cm, Pharmacia 제조)를 사용하여 겔 여과시킨다. 480 내지 570㎖의 용출 용량 범위에 상응하는 분획을 수집하고 수득된 용액을 한외여과 농축 장치(DIAFLO YM-10, Amicon 제조)를 사용하여 20㎖의 용량으로 농축시킨다. 이어서, 이와 같이 농축시킨 용액을, DEAE-TOYOPEARL-650M(1.6 × 32cm, Pharmacia 제조)을 사용하여이온 교환 칼럼에 적용시킨 다음, 0 내지 0.3M NaCl의 농도 구배를 적용시켜 용출시킨다. 600 내지 640분 사이에 용출된 분획을 수집하고, 수득된 용액을 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 4㎖의 용량으로 농축시킨다. 그 다음, 이와 같이 농축된 용액을, 0.15M NaCl를 함유하는 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.4)을 용매로서 사용함으로써 겔 여과 칼럼(세파덱스 G-75, 2.6 ×90cm, Pharmacia 제조)에 적용시킨다. 강력한 혈소판 응집 활성을 갖는 분획을 수거하고 합한 용액을 정제된 샘플로서 사용한다.

사람 PRP(3×10⁸혈소판수/㎖, 225㎕)를 37℃에서 3분 동안 각각의 농도의 모노클로날 항체(2㎕)와 반응시킨다. 이후, 반응 혼합물을, 앞서 언급한 바와 같이 수득된 보트로세틴과 함께 가하여 5μg/㎖의 최종 농도를 수득하고 상기 항목(1)에서 기술된 바와 동일한 방법에 따라서 혈소판 응집을 측정한다. 결과는 도 4(항체 2, 4)와 도 5(항체 1, 3)에 나타내었다. 어떠한 항체 1, 항체 2, 항체 3, 항체 4및 NMC-4도 용량-의존적 방식으로 사람 BIPA를 억제시킨다. IC₅₀값은 항체 1의 경우 0.8μg/㎖이고, 항체 2의 경우 2.0μg/㎖이고, 항체 3의 경우 1.0μg/㎖이고, 항체 4의 경우 5.6μg/㎖이고, NMC-4의 경우 2.0μg/㎖이다.

기니아 피그의 PRP는 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 제조하고, 이에 보트로세틴을 가하여 2μg/㎖의 최종 농도를 수득하며 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 측정을 수행한다. 항체 1(최종 농도: 80μg/㎖), 항체 3(최종 농도: 80μg/㎖) 및 NMC-4(최종 농도: 27μg/㎖)는 BIPA를 전혀 억제시키지 못한 반면, 항체 2와 항체 4는 용량-의존적 방식으로 BIPA를-억제시킨다(도 6). IC₅₀값은 항체 2의 경우 3.1μg/㎖이고, 항체 4의 경우 3.5μg/㎖이다.

시트레이트 첨가된 랫트의 혈액을 1300rpm으로 10분간 원심분리시켜 PRP를 제조한다. PRP(5×10⁸혈소판수/㎖)에 보트로세틴을 가하여 0.08μg/㎖의 최종 농도를 수득하며 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 측정을 수행한다. 항체 1(최종 농도: 80μg/㎖) 및 항체 3(최종 농도: 80μg/㎖)는 랫트의 BIPA를 전혀 억제시키지 못한 반면, 항체 2, 항체 4 및 NMC-4는 용량-의존적 방식으로 BIPA를 억제시킨다(도 7). IC50 값은 항체 2의 경우 1.2μg/㎖이고, 항체 4의 경우 5.0μg/㎖이고 NMC-4의 경우에는 2.2μg/㎖다.

시트레이트 첨가된 래빗트의 혈액을 1200rpm으로 10분간 원심분리시켜 PRP를 제조한다. PRP(5×10⁸혈소판수/㎖)에 보트로세틴을 가하여 0.075μg/㎖의 최종 농도를 수득하며 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 측정을 수행한다. 결과는 도 8(항체 2, 4)과 도 9(항체 1, 3)에 나타내었다. 항체 1(최종 농도: 80μg/㎖), 항체 3(최종 농도: 80μg/㎖) 및 NMC-4(최종 농도: 27μg/㎖)는 래빗트의 BIPA를 전혀 억제시키지 못한 반면, 항체 2 및 항체 4는 용량-의존적 방식으로 BIPA를 억제시킨다. IC₅₀값은 항체 2의 경우 5.0μg/㎖이고, 항체 4의 경우 1.8μg/㎖이다.

(3) SIPA에 대한 억제 활성

사람 PRP(2.5×10⁸혈소판수/㎖, 360㎕)를 실온에서 10분 동안 각각의 농도의 모노클로날 항체(40㎕)와 반응시킨다. 이후, 세포 융합을 측정하기 위한 장치(Toray 제조)를 사용하여 전단응력에 의해 유도된 혈소판 응집을 측정한다. 즉, 반응 혼합물을 대상으로 0초에서 15초 기간 동안에는 6dyne/㎠의 일정한 전단을 적용하고, 15초에서 105초 기간 동안에는 6→12dyne/㎠의 저-전단 구배를 적용하며, 105초에서 225초 기간 동안에는 12→108dyne/㎠의 고-전단 구배를 적용하며, 350초까지의 기간 동안에는 108dyne/㎠의 일정한 전단를 적용한다. 혈소판 응집 활성 정도는 광학적 투과도의 변화로 나타낸다. 혈소판 응집에 대한 억제 활성은, DMEM 또는 샘플 용해용 완충액을 첨가함으로써 수득한 최대 응집을 대조군으로서 사용함으로써 결정한다.

결과는 도 10(항체 2, 4)과 도 11(항체 1, 3)에 나타내었다. 어떠한 항체 1, 항체 2, 항체 3, 항체 4 및 NMC-4도 용량-의존적 방식으로 사람 SIPA를 억제시킨다. IC₅₀값은 항체 1의 경우 0.7μg/㎖이고, 항체 2의 경우 1.1μg/㎖이고, 항체 3의 경우 0.9μg/㎖이고, 항체 4의 경우 1.5μg/㎖이고, NMC-4의 경우 1.5μg/㎖이다.

<5> 사람 vWF에 대한 본 발명의 모노클로날 항체의 친화도

(1) 사람 vWF에 대한¹²⁵I-표지화

요오도겐(Pierce 제조, 1mg/㎖) 및 디클로로메탄 용액(1㎖)을 폴리프로필렌 튜브에 가하고 이로부터, 질소 스트림을 사용하여 용매를 제거한다. 사람 vWF(0.43mg/㎖)의 용액을 폴리프로필렌 튜브에 붓고 이에 Na¹²⁵I 용액(15.9MBq, 8.6㎕)을 가하여 실온에서 2분 동안 반응을 수행한다. 이러한 반응 후, 반응 용액을 10% BSA(소의 혈청 알부민) 2㎖를 함유하는 TBS 용액(트리스-완충된 식염수)으로 미리 블록시키고 TBS 100㎖로 세척시킨 PD10 칼럼(Pharmacia 제조)에 적용시킨다. TBS를 사용하여 용출을 수행한다. 용출된 용액을 각각 500㎕ 용량의 분획으로 분획화한다. 각각의 용출된 분획의 분취량(2㎕)을 대상으로 γ-계수기(계수 시간: 1분)를 사용하여 이의 방사능을 측정한다. 계수같이 높은 분획을 수집하고 합한 분획(1㎖)을¹²⁵I-표지된 사람 vWF(¹²⁵I-vWF) 용액(0.3mg/㎖ 사람 vWF, 220630cpm/㎕)으로 지칭한다.

(2) 고정화된 혈소판의 제조

상기 항목 <4> (1)에서 기술된 바와 동일한 방법으로 수집한 사람 PRP를 가하고 동일한 용량의 2% 파라포름알데히드 용액과 혼합한 다음, 4℃에서 밤새 정치시켜 둔다. 그 다음날, 고정화된 혈소판을 수거하고 원심분리를 통해 PBS로 3회 세척한다. 그 다음, 고정화된 혈소판을, 수집시 PRP에 대한 것과 동일한 용량을 갖는 PBS에 재현탁시키고 수득된 현탁액을 고정화된 혈소판 현탁액으로서 사용한다.

(3) vWF의 혈소판-결합 특성에 대한 본 발명의 모노클로날 항체의 작용

고정화된 혈소판 현탁액, 각종 농도의 항체 용액, 및 리스토세틴 또는 보트로세틴 용액을 분산시키고, 1% BSA를 함유하는 PBS로 미리 블록시킨 96-웰 여과 필터판에 따라 붓고 이에¹²⁵I-vWF 용액을 가한 다음, 실온에서 30분간 정치시켜 둔다. 상기 판을 정치시켜 둔후, 고정화된 혈소판에 결합되지 않은¹²⁵I-vWF를 흡인여과시켜 제거하고 필터를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 세척한다. 필터상에 잔존하는¹²⁵I를 γ-계수기(첨가 시간: 1분)를 사용하여 측정함으로써 고정화된 혈소판에 대한 사람 vWF의 결합양을 결정한다. 당해 항체의 부재하에서 고정화된 혈소판에 대한 사람 vWF의 결합양에 대한, 항체 존재하에서의 고정화된 혈소판에 대한 사람 vWF의 결합양의 비는 결합 비율(%)로서 지칭된다.

리스토세틴의 존재하에서 수득된 결과를 도 12(항체 2, 4)와 도 13(항체 1, 3)에 나타내었다. 보트로세틴의 존재하에서 수득된 결과는 도 14(항체 2, 4)와 도 15(항체 1, 3)에 나타내었다. 항체 1, 항체 2, 항체 3, 항체 4 및 NMC-4는 모두 용량-의존적인 방식으로 상기 혈소판에 대한 vWF의 리스토세틴-의존성 결합과 보트로세틴-의존성 결합을 억제하였다. 리스토세틴-의존성 반응에서의 IC50 값은 항체 1의 경우 0.37μg/㎖이고, 항체 2의 경우 1.1μg/㎖이고, 항체 3의 경우 20.0μg/㎖이고, 항체 4의 경우 0.95μg/㎖이고, NMC-4의 경우 0.35μg/㎖이다. 보트로세틴-의존성 반응에서의 IC₅₀값은 항체 1의 경우 1.2μg/㎖이고, 항체 2의 경우 0.9μg/㎖이고, 항체 3의 경우 2.1μg/㎖이고, 항체 4의 경우 0.9μg/㎖이고, NMC-4의 경우 0.3 μg/㎖이다.

<6> 항체 1, 항체 2, 항체 3 및 항체 4의 에피토프와 NMC-4의 에피토프와의 비교

항체 1, 항체 2, 항체 3 및 항체 4의 에피토프와 NMC-4의 에피토프를 비교하기 위해서, 고정화된 사람 vWF로의 NMC-4의 결합에 대한 항체 1, 항체 2, 항체 3및 항체 4의 억제 효과를 조사한다.

정제된 항체 1, 항체 2, 항체 3, 항체 4 및 NMC-4를, 비오틴화 키트(Amersham의 상표명)를 사용하여 비오틴화하여 비오틴화 항체 1, 비오틴화 항체 2, 비오틴화 항체 3, 비오틴화 항체 4 및 비오틴화 NMC-4의 각각의 샘플을 수득한다. 즉, PBS 용액에 대해 투석시킨 모노클로날 항체 각각의 용액을 비오틴-스페이서 암-N-하이드록시석신이미드 에스테르 용액과 함께 가하여 반응을 실온에서 1시간 동안 수행한 다음, 세파덱스 G25(Pharmacia 제조)의 칼럼을 사용하여 정제시킨다.

PBS 용액중에 용해된 사람 vWF(5μg/㎖)를 50㎕의 양으로 E.I.A. 미세역가측 정판(Linbro/Titertek 제조)의 각각의 웰에 가한 다음, 4℃에서 밤새 정치시켜 둔다. 이로써 사람 vWF가 고정화된다. 그 다음날, 각각의 웰을 세척 용액(0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS)으로 3회 세척하고 이에 0.5% BSA를 함유하는 PBS 용액을 가한 다음, 실온에서 1.5시간 동안 정치시켜 둔다. 이로써 어떠한 단백질도 유착되지 않은 부분을 블록시킨다.

비오틴화된 항체 각각을 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 비오틴화 되지 않은 항체 1, 항체 2, 항체 3, 항체 4 또는 NMC-4와 혼합하고, 수득된 용액 각각을 상기 언급된 사람 vWF-고정화된 웰의 각각에 50㎕의 양으로 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양을 수행한다. 웰을 세척한 후, 각각의 웰을, 0.05% 트윈 20 및 1% BSA를 함유하는 0.05M TBS로 500배 희석시킨 스트렙트아비딘-알칼린 포스파타제(Amersham 제조) 용액 50㎕와 함께 가한 다음, 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행한다.

웰을 세척한 후, 각각의 웰을 발색 시약, 즉 p-니트로페닐 포스페이트(Sigma 제조) 100㎕와 함께 가한 다음, 20분간 정치시켜 둔다. 405nm에서의 흡광도를 기준으로 하여 사람 vWF에 결합된 비오틴화 항체를 측정한다. 상기 언급된 바와 동일한 방법으로 과량(100배)의 비오틴화 되지 않은 항체의 존재하에서 비-특이적 결합을 측정한다. 후자 측정법에서 측정된 값을 전자 측정법에서 측정된 값으로부터 삭감하여 특이적 흡수로서 지칭된 값을 수득한다.

결과는 도 16 내지 20에 나타내었다. 항체 1, 항체 2, 항체 3 및 항체 4는 고정화된 vWF에 대한 비오틴화 NMC-4의 결합을 전혀 억제시키지 못한 반면, 고정화된 vWF에 대한 비오틴화 항체 1, 비오틴화 항체 2, 비오틴화 항체 3 및 비오틴화 항체 4의 결합을 서로 억제시켰다. 한편, NMC-4는 고정화된 vWF에 대한 비오틴화 항체 1, 비오틴화 항체 2, 비오틴화 항체 3 및 비오틴화 항체 4의 결합을 전혀 억제시키지 못하였다. 이들 결과에 따르면, 항체 1, 항체 2, 항체 3 및 항체 4에 대한 에피토프는 vWF상의 상호 인접한 위치에 존재하지만, NMC-4에 대한 에피토프와는 상이하다는 것이 입증되었다.

<7> 기니아 피그(생체외)에서 혈소판 응집에 대한 억제 효과

상기 항목 <2>에서 정제시킨 항체 2 및 항체 4를 PBS를 사용하여 각종 농도를 지니도록 조정하고 이들을 100μg/kg 또는 300μg/kg의 용량으로 기니아 피그(암컷, 430 내지 600g)에게 정맥내 주사한다(1 그룹: 4마리 기니아 피그). PBS를 위약 대조군으로서 사용한다. 5분 후, 시트르산을 이용하여 에테르마취하에 복부 동맥으로부터 혈액을 수집하고, 이로부터 PRP(혈소판 수: 3.0 × 10⁸혈소판/㎖)를 제조하여 상기 항목 <4>에 기술된 바와 동일한 방법에 따라서 RIPA 또는 BIPA를 측정한다. 혈소판 응집에 대한 각 항체의 억제율은 PBS-투여된 그룹에서의 최대 응집비를 100%로 간주한다는 조건하에 산정한다.

결과는 도 21 및 도 22에 나타내었다. 항체 2와 항체 4는 용량-의존적 방식으로 RIPA를 억제하였다. ED50 값(혈소판 응집을 50% 억제시키는 값)은 항체 2의 경우 70μg/kg이고 항체 4의 경우에는 90μg/kg이다. BIPA에서, 항체 4의 ED₅₀값은 55μg/kg이다. RIPA 및 BIPA를 억제하는 항체 2 및 항체 4의 강력한 작용은 투여후 6시간 까지는 지속적으로 관찰되었으며 48시간 후에 소멸되었다.

상기 시험과는 별도로, 당해 항체를 투여한지 5분 후에 시트르산으로 수집한 완전한 혈액에 관한 혈액학적 파라미터를, 자동화 혈액 분석기(Sysmex E-2000, Toa Medical Electronics 제조)를 사용하여 측정한다. 항체 2 또는 항체 4를 100μg/kg 또는 300μg/kg의 투여량으로 투여한다. 어떠한 경우에서도, 총 혈소판수, 총 적혈구수, 총 백혈구수, 헤모글로빈 농도, 헤마크릿트값, 혈구 개개의 평균 체적, 평균 혈구 개개의 헤모글로빈량, 평균 혈구 개개의 헤모글로빈 농도, 적혈구 분포폭, 혈소판 분포폭, 평균 혈소판 체적, 백혈구 대세포 비율 및 혈소판 헤마크릿트값에 있어서의 상당한 변화가 관찰되지 않았다.

혈장을 상기 언급된 바와 동일한 방법으로, 당해 항체를 투여한지 5분 후에 수득된 혈액으로부터 원심분리에 의해 혈장을 분리시킨다. 이러한 혈장을 대상으로하여 응고 파라미터 측정 장치(Sy

mex CA-3000, Toa Medical Electronics 제조)를 사용하여 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 프로트롬빈 시간 및 피브리노겐 농도를 측정한다. 그 결과, 항체 2 또는 항체 4를 1000μg/kg의 투여량으로 투여하는 경우일지라도 각각의 파라미터에서 어떠한 상당한 변화도 관찰되지 않았다.

<8> 기니아 피그(생체내)에서 본 발명의 모노클로날 항체의 혈전 형성에 대한 예방 효과

(1) 기니아 피그 경동맥의 광화학적으로 유도된 혈전 모델(PIT 모텔)에서의 혈전형성에 대한 예방 효과의 평가

폐색성 혈전을 문헌[참조: Nakajima et al., Thrombosis Research, vol. 67, p. 435, 1992]의 방법에 따라서 기니아 피그의 경동맥에 형성되도록 하여 항체 2 또는 항체 4를 투여하거나 투여하지 않을 경우의 혈전 형성 시간을 측정한다.

기니아 피그의 경동맥을 노출시키고 우레탄 마취하에 박탈(exfolation)시키며, 이에 펄스 도플러 혈류계의 탐침을 설치한다. 항체 2, 항체 4 또는 생리학적 식염수를 경동맥에 부착된 캐뉼라를 통해 30, 100 또는 300μg/kg의 양으로 투여한다. 5분 후에, 광감작성 물질, 즉 로즈 벵갈(rose bengal)을 동일한 캐뉼라를 통해 10mg/kg의 양으로 투여한다. 이와 동시에, 상기 탐침이 설치된 부위(심장의 측면상에 위치함)로부터 상부에 위치한 혈관에, 혈전-생성 광원(Hamamatsu Photonics가 제조)을 사용함으로써 540nm하의 여기 상태의 녹색 광을 조사하여 혈전 형성으로 인한 혈관 폐색과 혈류 중단 시간(폐색 시간)을 측정한다.

결과는 도 23 및 도 24에 나타내었다. 항체 2와 항체 4는 100μg/kg 이상의투여량에서 폐색 시간을 상당히 연장시켰다. 만-휘트니(Mann-Whiteny) U 시험을 사용하여 통계학적 과정을 수행한다. 도 23 및 24에서, 부호 *는 p < 0.05를 지시하고 부호 **는 p < 0.01을 지시한다.

(2) A-V 측로 모델를 기준으로 한 혈전 형성에 대한 예방 효과의 평가

폴리에틸렌 튜브를 우레탄 마취하에 기니아 피그의 좌경정맥에 삽입하고, 이를 통해 항체 2 또는 생리학적 식염수를 30, 100 또는 300μg/kg의 용량으로 투여한다. 5분 후에, 상기 튜브의 반대쪽 면을 우경정맥에 삽입하여 측로를 형성한 다음, 혈류를 다시 개방한다. 혈류 중단 시간(폐색 시간)을 펄스 도플러 혈류계로 측정한다.

결과는 도 25에 나타내었다. 항체 2는 100μg/kg 이상의 투여량에서 폐색 시간을 상당히 연장시켰다. 만-휘트니 U 시험을 사용하여 통계학적 과정을 수행한다. 도 25에서, 부호 *는 p < 0.05를 지시하고 부호 **는 p < 0.01을 지시한다.

(3) 출혈 시간의 연장에 관한 평가

항체 2, 항체 4 또는 생리학적 식염수를 펜토바비탈 마취하에 100 또는 300 μg/kg의 용량으로 기니아 피그에게 정맥내 투여한다. 5분 후에, 발바닥 동맥을 5mm의 길이에 걸쳐 절개한다. 이러한 상처 부위로부터 출혈이 있었는지의 여부는 여과지에 유착된 혈흔을 지표로 사용하여 매 15초 마다 확인한다. 절개로부터 출혈 중단까지의 시간을 측정한다.

결과는 도 26 및 27에 나타내었다. 항체 2와 항체 4는 1000μg/kg의 용량에서 출혈 시간을 연장시켰다. 항체 2와 항체 4는 300μg/kg의 투여량에서는 출혈 시간에 전혀 영향을 미치지 못하였으며, 이러한 용량에서는 상기 항체들은 상기 언급된 PIT 모델 및 A-V 측로 모델에서 폐색 시간-연장 효과를 나타내었다. 만-휘트니 U 시험을 사용하여 통계학적 과정을 수행한다. 도 26 및 27에서, 부호 *는 p < 0.05를 지시하고 부호 **는 p < 0.01을 지시한다.

상기 언급된 실험 결과에 따르면, 항체 2와 항체 4 모두는 이들을 생체내로 투여하는 경우, 임상적 문제점을 야기시킬 수도 있는 출혈성 경향을 유발시키지 않으면서 혈전 형성에 대하여 강력한 억제 작용을 나타낸다는 것이 입증되었다.

본 발명에 따라서 수득된 모노클로날 항체는 vWF에 대하여 강한 친화도와 높은 반응 특이성을 나타내며, 지금까지 공지되어 온 vWF에 대한 모노클로날 항체의 에피토프와는 상이한 에피토프를 지니고 항혈전제의 활성 성분으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 항혈전제는 vWF와 관련된 질환(예: 혈전성 질환 및 불안정한 협심증)에 매우 유효한 예방제 및 치료제로서 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 추가로, vWF의 GP I b-결합 부위에 관해 상당히 유용한 정보가 본 발명의 모노클로날 항체를 사용함으로써 수득될 수 있다.

더우기, 본 발명의 제1 모노클로날 항체는 기니아 피그 vWF와 반응성을 지니기 때문에, 예를 들면, 생리학적 활성에 관한 시험 및 기니아 피그 사용에 의한 부작용에 관한 시험을 수행할 수 있다.

Claims

하이브리도마 FERM BP-5247 (AJvW-1), FERM BP-5248 (AJvW-2), FERM BP-5249 (AJvW-3) 또는 FERM BP-5250 (AJvW-4)에 의해 생산되는 항체에 의해 인식되는 사람 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)의 에피토프를 인식하고, 사람 혈소판의 RIPA(리스토세틴-유도된 혈소판 응집), BIPA(보트로세틴-유도된 혈소판 응집) 및 SIPA(전단응력-유도된 혈소판 응집)를 억제하는 작용을 가지며, 항혈전 작용이 발휘되는 용량에서 출혈 작용을 나타내지 않는 모노클로날 항체를 활성 성분으로서 포함하는 항혈전제.
제1항에 있어서, 모노클로날 항체가, 마우스 골수종 세포와 사람 폰 빌레브란트 인자로 면역시킨 마우스의 비장 세포간의 융합으로 인해 형성된 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체인 항혈전제.
제2항에 있어서, 하이브리도마가 AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 또는 AJvW-4인 항혈전제.
(a) 하이브리도마 FERM BP-5248 (AJvW-2) 또는 FERM BP-5250 (AJvW-4)에 의해 생산되는 항체에 의해 인식되는 사람 및 기니아 피그 폰 빌레브란트 인자의 에피토프를 인식하고;

(b) 사람 혈소판의 RIPA(리스토세틴-유도된 혈소판 응집), BIPA(보트로세틴-유도된 혈소판 응집) 및 SIPA(전단응력-유도된 혈소판 응집)을 억제시키고;

(c) 기니아 피그 혈소판의 RIPA(리스토세틴-유도된 혈소판 응집) 및 BIPA(보트로세틴-유도된 혈소판 응집)을 억제시키며;

(d) 기니아 피그에서 생체내 강력한 항혈전 작용을 나타내지만, 출혈을 야기시키지는 않는 특성을 갖는 모노클로날 항체.
제4항에 있어서, 마우스 골수종 세포와 사람 폰 빌레브란트 인자로 면역시킨 마우스의 비장 세포간의 융합으로 인해 형성된 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체.
제5항에 있어서, 하이브리도마가 AJvW-2 또는 AJvW-4인 모노클로날 항체.
(A) 하이브리도마 FERM BP-5247 (AJvW-1) 또는 FERM BP-5249 (AJvW-3)에 의 해 생산되는 항체에 의해 인식되는 사람 폰 빌레브란트 인자의 에피토프를 인식하고;

(B) 사람 혈소판의 RIPA(리스토세틴-유도된 혈소판 응집), BIPA(보트로세틴-유도된 혈소판 응집) 및 SIPA(전단응력-유도된 혈소판 응집)을 억제시키며;

(C) 랫트, 기니아 피그 및 래비트의 폰 빌레브란트 인자와는 반응하지 않는 특성을 갖는 모노클로날 항체.
제7항에 있어서, 마우스 골수종 세포와 사람 폰 빌레브란트 인자로 면역시킨 마우스의 비장 세포간의 융합으로 인해 형성된 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체.
제8항에 있어서, 하이브리도마가 AJvW-1 또는 AJvW-3인 모노클로날 항체.
사람 폰 빌레브란트 인자와의 반응성을 나타내고; 제6항 또는 제9항에서 정의된 바와 같은 모노클로날 항체와 공존시키는 경우에는 이들 모노클로날 항체와 폰 빌레브란트 인자간의 결합을 억제시키는 작용을 지닌 모노클로날 항체.
Sp2/O-Ag14 마우스 골수종 세포와 폰 빌레브란트 인자로 면역시킨 마우스의 비장 세포간의 융합으로 인해 형성된, 제5항에서 정의된 바와 같은 모노클로날 항체를 생산하기 위한 하이브리도마.
제11항에 있어서, AJvW-2 또는 AJvW-4인 하이브리도마.
Sp2/O-Ag14 마우스 골수종 세포와 폰 빌레브란트 인자로 면역시킨 마우스의 비장 세포간의 융합으로 인해 형성된, 제8항에서 정의된 바와 같은 모노클로날 항체를 생산하기 위한 하이브리도마.
제13항에 있어서, AJvW-1 또는 AJvW-3인 하이브리도마.