ES2197210T3 - Agente antitrombotico y anticuerpos monoclonales contra el factor von willebrand. - Google Patents

Abstract

UN ANTICUERPO MONOCLONAL, QUE TIENE REACCIONA ANTE EL FACTOR VON WILLEBRAND HUMANO, ACTUA PARA INHIBIR LA RIPA (AGREGACION PLAQUETARIA INDUCIDA POR LA RISTOCETINA), BIPA (AGREGACION PLAQUETARIA INDUCIDA POR LA BOTROCETINA) Y SIPA (AGREGACION PLAQUETARIA INDUCIDA POR UN ESFUERZO DE CIZALLAMIENTO) DE PLAQUETAS HUMANAS, Y QUE NO EXPRESA UNA ACCION DE HEMORRAGIA EN UNA DOSIS MEDICINALMENTE EFECTIVA PARA PRESENTAR UNA ACCION ANTITROMBOTICA, SE UTILIZA COMO INGREDIENTE ACTIVO DE UN AGENTE ANTITROMBOTICO.

Description

Agente antitrombótico y anticuerpos monoclonales contra el factor de von Willebrand.

Campo de la técnica

La presente invención hace referencia a un nuevo anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor Willebrand, que causa episodios anti-hemorrágicos a una dosis farmacológicamente eficaz para presentar su acción antitrombótica. La presente invención también hace referencia a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anterior y a un agente antitrombótico que contiene el anticuerpo monoclonal anterior como un ingrediente activo.

Antecedentes de la invención

Cuando, debido a una lesión de las paredes vasculares, se expone el subendotelio en un ser vivo, las plaquetas circulantes en la sangre se adhieren inmediatamente al subendotelio. Esto provoca una serie de procesos de activación de plaquetas incluyendo la agregación de plaquetas y la liberación de gránulos intracelulares, con lo que se forma un trombo, y en consecuencia se para la hemorragia. Según ello, la formación del trombo es necesaria e indispensable para el mecanismo hemostático fisiológico. Sin embargo, por otra parte, el trombo causa enfermedades trombóticas como el infarto de miocardio, la angina de pecho, el infarto cerebral y la trombosis cerebral que está alcanzando los mayores niveles de causa de mortandad proporcionalmente al envejecimiento de la población. Dicha situación es reconocida como un serio problema grave.

Hasta ahora, se han desarrollado muchos agentes antitrombóticos con el fin de curar y prevenir las enfermedades trombóticas. Sin embargo, todavía quedan problemas sin resolver, ya que muchos agentes antitrombóticos convencionales todavía presentan una eficacia curativa pobre en la aplicación clínica, tienen una especificidad baja hacia el trombo y producen una tendencia hemorrágica como efecto secundario. Una de las causas de dichas circunstancias se considera a continuación. A saber, casi todos los agentes antitrombóticos se diseñan únicamente con el propósito de inhibir el proceso de activación de plaquetas. Un procedimiento para cuantificar la agregación plaquetaria in vitro, que proporciona un índice de la actividad, es insuficiente para reflejar el proceso complejo de formación del trombo in vivo.

La formación del trombo se produce de acuerdo con la unión específica entre las glicoproteínas de la membrana plaquetaria y el subendotelio o las proteínas plasmáticas. Especialmente, la glicoproteína IIb/IIa (abreviada como ``GPIIb/IIa) en la membrana plaquetaria funciona como un receptor para el fibrinógeno en la etapa final de formación del trombo. Según ello, se espera que los antagonistas de GPIIb/GPIIa puedan utilizarse como un agente antitrombótico potente. El sitio de unión del fibrinógeno en la GPIIb/IIa incluye una secuencia primaria de aminoácidos RGD. Como resultado de la síntesis y evaluación de muchos derivados RGD, se confirmó que el antagonista de GPIIb/IIa presenta el efecto antitrombótico al inhibir fuertemente la agregación plaquetaria, de acuerdo con modelos animales in vivo y las investigaciones clínicas (Thrombosis and Haemostasis, vol. 69, p. 560, 1993). Sin embargo, surge un problema ya que al suprimirse simultáneamente el mecanismo normal hemostático por los antagonistas de GPIIb/IIa, aparece como consecuencia una mayor tendencia hemorrágica como efecto secundario en comparación con los agentes antitrombóticos convencionales (The Lancet, col. 343, p. 881, 1994; The New England Journal of Medicine, vol., 330, p. 956, 1994).

Por otra parte, las conocidas como proteínas importantes que actúan durante las primeras etapas de formación del trombo incluyen la glicoproteína Ib en la membrana plaquetaria (abreviada aquí como ``GPIb'') y el factor von Willebrand en el plasma sanguíneo (abreviado aquí como ``vWF''). Las lesiones hemorrágicas asociadas con la ocurrencia de un cambio cualitativo y cuantitativo en vWF incluyen la enfermedad de von Willebrand (referida a continuación como ``vWD''). El conocimiento clínico ha demostrado que, en los pacientes vWD, apenas se presenta un sangrado grave en comparación con pacientes de trombastenia (enfermedad hemorrágica debida a la deficiencia de GPIIb/IIa). En consecuencia, existe la posibilidad de que se presente una acción antitrombótica poderosa sin la implicación de una tendencia hemorrágica al inhibirse la interacción entre GPIb y vWF. Sin embargo, únicamente un anticuerpo monoclonal y un compuesto de peso molecular bajo ATA (ácido Aurin Tricarboxílico; Blood, vol. 72, p. 1898, 1988) se conocen como sustancias que inhiben específicamente la interacción entre GPIb y vWF. No se ha confirmado ninguna acción antitrombótica del anticuerpo monoclonal anti-GPIb in vivo. En cambio, se enfatizan los efectos secundarios, ya que el anticuerpo monoclonal anti-GPIb causa trombocitopenia y prolonga el tiempo de sangría (Blood, vol. 70, 344a, 1987; Jpn. Clin. Pathol., vol 40, p. 266, 1992). Además, respecto a los antagonistas de vWF, se ha publicado que el ATA descrito anteriormente y un anticuerpo monoclonal anti-vWF de cerdo, BB3-BD5, presentaron eficacias antitrombóticas en un experimento in vivo con animales (Circulation, vol. 81, p. 1106, 1990). Sin embargo, no se pueden olvidar los efectos secundarios en el caso de ATA y el BB3-BD5. Concretamente, ATA presenta una acción anti-trombótica al inhibir la interacción entre GPIb y vWF, mientras que ATA involucra a la vez y completamente efectos secundarios que incrementan la agregación plaquetaria y la reacción de liberación causada con la ayuda del colágeno, ácido araquidónico, A23817, PAF y TXa_{2} (Thrombosis and Haemostasis, vol. 68, p. 1992). Por otra parte, el BB3-BD5 presenta una fuerte tendencia hemorrágica en su dosis antitrombótica (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol., 84, p. 8100, 1987; SURGERY, vol 112, p. 433, 1992).

Tal como se describió anteriormente, existe un dilema con los actuales agentes anti-trombóticos, ya que la acción anti-trombótica como efecto farmacológico no puede separarse de la tendencia hemorrágica como efecto secundario (no existe ninguna diferencia entre la cantidad eficaz farmacológicamente y la cantidad causante de efectos secundarios).

Últimamente, la agregación plaquetaria inducida por la tensión de cizallamiento (abreviado aquí como ``SIPA'') ha atraído la atención al estar relacionada estrechamente con la formación del trombo en un estado patológico. El diámetro vascular es pequeño, y la circulación sanguínea tiene una gran velocidad en las lesiones arterioscleróticas y pequeñas arterias. En consecuencia, una tensión de cizallamiento y elevada tiene lugar en dichas regiones debido a la interacción entre la pared vascular y la sangre. En tal situación, se activa el vWF en la sangre, cambiando su estructura terciaria. Como resultado, el vWF juega un papel crucial en la formación del trombo. Concretamente, se conoce el siguiente proceso. En primer lugar, el vWF que existe en el subendotelio se une a GPIb en la membrana plaquetaria y así las plaquetas se adhieren a la pared vascular. En segundo lugar, el vWF existente en el plasma sanguíneo entrecruza las glicoproteínas IIb/IIa en la membrana plaquetaria, permitiendo que tenga lugar la reacción de agregación plaquetaria. Finalmente, tiene lugar la formación del trombo.

Se sabe que un antibiótico, ristocetin, o un veneno de serpiente, brotocetin, permiten que el cambio de estructura terciaria del vWF in vitro, equivalente al cambio en condiciones de tensión de cizallamiento y elevada. Es decir, en presencia de ristocetin o botrocetin, el vWF adquiere la capacidad de unión a GPIb. Los procedimientos para cuantificar la actividad fisiológica de vWF in vitro utilizando las características anteriores incluyen la agregación plaquetaria inducida por ristocetin (abreviada aquí como ``RIPA'') y la agregación plaquetaria inducida por botrocetin (referida aquí como ``BIPA''), así como también un procedimiento para cuantificar la unión de vWF a GPIb en presencia de ristocetin o brotocetin. Los procedimientos anteriores son ampliamente utilizados. Debido al progreso de las técnicas experimentales, se ha desarrollado un aparato, en el que se cuantifica la SIPA in vitro aplicando una tensión de cizallamiento. Se ha considerado que un dominio idéntico en el vWF estaba implicado en la unión a GPIb en cualquiera de las reacciones.

Hasta ahora, se han obtenido algunos anticuerpos contra el vWF, que inhiben la actividad de vWF in vitro. Sin embargo, muchos de ellos presentan una especificidad de reacción menor y la gran mayoría no inhiben la reacción dependiente de botrocetin, aún cuando sí inhiben la reacción dependiente de ristocetin. Tal como se describió anteriormente, se considera que el sitio de unión a GPIb en el vWF inducido por el ristocetin es homólogo al inducido por el brotocetin. En consecuencia, los anticuerpos anteriores reconocen posiblemente el sitio de unión en el vWF para el ristocetin o botrocetin. En el sentido estricto de la palabra, es posible decir que no inhiben la actividad fisiológica del vWF y por lo tanto tienen especificidades de reacción bajas. En tales circunstancias, se ha publicado que dos anticuerpos, es decir, NMC-4 producido por Fujimara y col., (J.Nara Med. Assoc., vol 36, p. 662, 1985) y RFF-VIIRAG:1 producido por Tuddenham y col., inhiben in vitro la reacción dependiente de ristocetin y botrocetin (Blood, vol. 177, nº 1, p. 113, 1992).

Se ha publicado que existen epitopos para los dos anticuerpos en el sitio de unión a GPIb de la molécula de vWF y que están localizados entre los residuos aminoacídicos 449 y 728 de la secuencia aminoacídica de la molécula del vWF. Además, la unión del NMC-4 marcado con yodina con el vWF se inhibe parcialmente por el RFF-VIIIRAG:1. De acuerdo con ello, se considera que ambos epitopos se localizan en posiciones bastante cercanas una de otra. Además, el RFF-VIIIRAG:1 inhibe la BIPA sólo parcialmente, mientras que el NMC-4 inhibe la BIPA completamente. Por dicha razón, se han realizado estudios concienzudamente en el campo científico de vWF utilizando el NMC-4 y se han obtenido algunos resultados. Entre los animales no humanos, el NMC-4 tiene reactividad únicamente con el vWF de rata.

Cuando un anticuerpo monoclonal contra el vWF humano se prepara con el fin de obtener información sobre el sitio de unión a GPIb, o con el fin de utilizar el anticuerpo monoclonal como un agente preventivo y un agente terapéutico contra enfermedades relacionadas con el vWF, se considera deseable preparar el anticuerpo monoclonal con alta especificidad para el vW humano.

Por otra parte, cuando se desarrolla un nuevo fármaco de forma ordinaria, no está permitido realizar ensayos con humanos sin haberlos realizado previamente en animales. Cuando se realiza un ensayo relacionado con las actividades fisiológicas del vWF y de los anticuerpos anti-vWF monoclonales in vivo, es necesario utilizar un anticuerpo monoclonal que haga posible la realización de un ensayo en animales, es decir, un anticuerpo monoclonal que tenga simultáneamente reactividad con el vWF de un animal no humano. Además, los antagonistas de GPIIb/IIa que suprimen fuertemente la agregación plaquetaria humana producida con ayuda del fibrinógeno, no son eficaces en rata (Thrombosis and Haemostasis, vol. 70, p. 531, 1993). Y los de rata no causan la agregación inducida por ristocetin.

De acuerdo con estos hechos, se considera en general que el mecanismo de formación del trombo difiere en gran manera entre el hombre y la rata. En consecuencia, no tiene sentido evaluar la acción anti-trombótica de ningún anticuerpo anti-vWF utilizando la rata. En cambio, en el caso de la cobaya, la agregación plaquetaria se suprime por los antagonistas de GPIIb/IIa. Además, la agregación inducida por ristocetin también se induce de igual manera en humanos. Así, se considera que el modelo de cobaya es más adecuado como modelo de trombo animal para los experimentos in vivo cuando se evalúa la acción antitrombótica.

De acuerdo con los puntos de vista anteriores, un anticuerpo monoclonal que tenga reactividad con el vWF humano y el de cobaya es útil. Sin embargo, tales anticuerpos monoclonales anti-vWF humano no son conocidos.

Además, no se conoce un anticuerpo monoclonal anti-vWF humano, cuya acción anti-trombótica in vivo se haya confirmado.

Descripción de la invención

La presente invención se ha realizado teniendo en consideración los puntos de vista anteriores. Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar anticuerpos monoclonales contra el factor de von Willebrand y en especial un anticuerpo monoclonal que tenga reactividad tanto con el vWF humano como con el vWF de cobaya y que no presente una acción hemorrágica a una dosis farmacológicamente eficaz y suficiente para expresar la acción anti-trombótica. También es un objetivo de la presente invención el proporcionar hibridomas para la producción de anticuerpos monoclonales y un agente anti-trombótico que contenga como ingrediente activo cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores.

Los presentes inventores han obtenido éxito en la obtención de un anticuerpo monoclonal que tiene reactividad con el factor de von Willebrand y que tiene una acción inhibidora para RIPA y SIPA de plaquetas humanas, mediante la inmunización con vWF humano y fusionando las células del bazo de ratones inmunizados con células de mieloma murino para preparar un hibridoma. Además, los presentes inventores han hallado que el anticuerpo monoclonal presenta una acción anti-trombótica fuerte sin la implicación de hemorragias en un modelo de trombosis in vivo. En consecuencia, se ha cumplimentado la presente invención.

Concretamente, la presente invención hace referencia a un agente anti-trombótico de acuerdo con las reivindicaciones anexadas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal de acuerdo con las reivindicaciones anexadas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un hibridoma para producir un anticuerpo monoclonal que tenga las anteriores propiedades, produciéndose dicho anticuerpo mediante fusión de células del bazo de un ratón inmunizado con el factor de von Willebrand y células de mieloma murino Sp2/0-Ag14.

La presente invención se explicará con más detalle a continuación.

1. Anticuerpo monoclonal de la presente invención

El anticuerpo monoclonal de la presente invención es un anticuerpo monoclonal de acuerdo con las reivindicaciones anexadas.

Una realización específica del anticuerpo monoclonal descrita anteriormente se ejemplifica por un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes propiedades además de las ya citadas:

(e) anticuerpo monoclonal que inhibe la BIPA (agregación plaquetaria inducida por el botrocetin) de plaquetas de rata; y (f) anticuerpo monoclonal que inhibe la BIPA (agregación plaquetaria inducida por el botrocetin) de plaquetas de conejo.

Concretamente, el anticuerpo monoclonal de la presente invención tiene una elevada especificidad de reacción ya que reacciona con el vWF humano, tiene una elevada afinidad por el anterior, e inhibe fuertemente cualquier RIPA, BIPA y SIPA in vitro. Por otra parte, el anticuerpo monoclonal de la presente invención inhibe por lo menos la RIPA y la BIPA de cobaya. Un anticuerpo monoclonal obtenido en los Ejemplos descritos más adelante inhibe la BIPA de rata y conejo in vitro. De acuerdo con un experimento de una sola administración intravenosa a la cobaya, el anticuerpo monoclonal inhibe la RIPA y BIPA ex vivo sin afectar para nada los parámetros hematológicos y de coagulación. El anticuerpo monoclonal prolonga el tiempo requerido para la obstrucción de la arteria femoral en un modelo de trombosis inducida por una reacción fotomecánica basado en la utilización de cobayas y prolonga el tiempo requerido para la obstrucción en un modelo de formación de un cortocircuito arterio-vascular. Además, cuando el anticuerpo monoclonal se utiliza a una dosis eficaz farmacológicamente, su efecto continua durante largo tiempo sin que se manifieste una elongación del tiempo de sangría.

Hasta ahora, no se ha descrito ningún anticuerpo monoclonal que tenga las propiedades descritas anteriormente. El anticuerpo monoclonal de la presente invención es un anticuerpo monoclonal nuevo. El anticuerpo monoclonal de la presente invención tiene claramente epitopos distintos a los del NMC-4 descrito anteriormente, no sólo reacciona con el vWF animal sino que no inhibe para nada la unión del NMC-4 con el vWF (ver los Ejemplos descritos más adelante). El hecho de que el anticuerpo monoclonal de la presente invención haya suprimido fuertemente la formación del trombo sin implicar la tendencia hemorrágica en un modelo de trombosis in vivo, sugiere de forma importante la posibilidad de que el anticuerpo de la presente invención pueda también utilizarse como un agente terapéutico ideal para las enfermedades trombóticas. El anticuerpo monoclonal de la presente invención no es únicamente nuevo, sino que también presente una aplicación industrial.

Concretamente, el anticuerpo monoclonal de la presente invención no es sólo útil para especificar el sitio de unión del vWF con el GPIb, sino que se espera que dicho anticuerpo monoclonal se utilice como medio para analizar la distribución y las formas existentes del vWF in vivo, para buscar la causa de vWD (enfermedad de von Willebrand) y se utilice también como un agente preventivo y agente terapéutico eficaz en las enfermedades trombóticas. Además, el anticuerpo monoclonal de la presente invención puede utilizarse preferentemente para experimentos in vivo, basados en la utilización de cobayas, cuando se evalúa la acción anti-trombótica.

El anticuerpo monoclonal también tiene una acción inhibidora de la adhesión de plaquetas inducida por la tensión de cizallamiento (referido aquí como ``SIPAd'') de plaquetas humanas. La SIPAd también está relacionada con la formación del trombo en un estado patológico. De acuerdo con un experimento basado en la utilización de sangre normal humana, se confirmó que el anticuerpo monoclonal inhibe la SIPAd de forma dependiente de la dosis. Tal inhibición no se ha observado para los antagonistas de GIIb/IIa, que se espera se utilicen en la actualidad como agentes anti-trombóticos.

El anticuerpo monoclonal que tiene las propiedades descritas anteriormente se puede utilizar como un agente farmacológico, incluyendo, por ejemplo, un agente anti-trombótico tal como se describió anteriormente.

2. Producción de hibridomas y anticuerpos monoclonales de la presente invención

El anticuerpo monoclonal de la presente invención se obtiene fusionando células productoras de anticuerpos de un animal inmunizado con el vWF humano con las células de mieloma para formar hibridomas, clonando un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que tenga especificidad de reacción contra el vWF humano e inhiba la RIPA, BIPA y SIPA de las plaquetas humanas y cultivando el hibridoma o una variante de lo mismo.

El anticuerpo monoclonal se obtiene clonando un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que inhiba la RIPA y la BIPA de plaquetas de cobaya y cultivando el hibridoma o una variante de lo mismo.

El hibridoma se puede preparar de acuerdo con un procedimiento de Köhler y Milstein (Nature, p. 495-492, 1975). Más adelante, se explicará un procedimiento para la preparación de hibridomas y un procedimiento para la selección de un hibridoma capaz de producir como objetivo un anticuerpo monoclonal, objetivo de la presente invención.

Las células productoras de anticuerpos se obtienen mediante inmunización de un animal, por ejemplo, ratón Balb/c con vWF humano y preparando a partir del animal las células productoras de anticuerpos, como por ejemplo células del bazo, células de ganglios linfáticos y de sangre periférica. El vWF humano se puede obtener mediante purificación del plasma sanguíneo humano mediante, por ejemplo, filtración en gel.

Las células productoras de anticuerpos se recolectan a partir de animales inmunizados con vWF humano para realizar la fusión celular con las células de mieloma. Para la fusión celular, se pueden utilizar como células del mieloma las cepas celulares originarias de diversos mamíferos. Sin embargo, es preferible utilizar una cepa celular originaria de un animal de la misma especie que el animal utilizado para preparar las células productoras de anticuerpos. Con el fin de diferenciar las células fusionadas de las no fusionadas después de la fusión celular, es preferible utilizar una cepa de mieloma celular que tenga un marcador, de modo que las células no fusionadas no puedan sobrevivir y únicamente puedan proliferar los hibridomas. Por ejemplo, un hibridoma, que se forme mediante fusión celular entre células de mieloma resistentes a la 8-azaguanina y una célula productora de anticuerpos, como una célula normal, es capaz de proliferar en un medio que contenga hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), mientras que la célula del mieloma resistente a la 8-azaguanina muere en el medio HAT y la célula normal productora de anticuerpos no puede cultivarse durante mucho tiempo. En consecuencia, únicamente el hibridoma puede cultivarse selectivamente (Science, vol. 145, p. 709, 1964). Es preferible utilizar, como célula del mieloma, una cepa que no secrete inmunoglobulina inherente, teniendo en cuenta que el anticuerpo, objetivo de la presente invención, se obtiene fácilmente a partir del sobrenadante del cultivo del hibridoma.

La fusión celular se realiza, por ejemplo, de la manera siguiente. Las células del bazo de un ratón inmunizado con vWF humano se mezclan con células de mieloma de ratón, por ejemplo, Sp2/0-Ag14 (resistente a la 8-azaguanina, no secretora de IgG) en la fase de crecimiento logarítmico, de modo que la relación entre células del bazo y células del mieloma es de aproximadamente 10:1 a 1:1. Después de la centrifugación, se añade al precipitado residual polietilén glicol de peso molecular medio de 1.000 a 6.000 para proporcionar una concentración final del 30 al 50%, para que las células se fusionen. La fusión puede realizarse aplicando un pulso eléctrico a una solución mezclada de células, en lugar de la adición de polietilén glicol.

Las células que han sido sometidas a un tratamiento de fusión, se resuspenden en medio HAT, por ejemplo, medio mínimo esencial de Eagle modificado por Dulbecco (abreviado como `` medio DMEM'') que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina y suero bovino fetal al 10%. La suspensión se reparte en placas de microtitulación de 96 pocillos o similares y las células se cultivan a 37ºC con anhídrido carbónico al 5%, de modo que únicamente los hibridomas puedan crecer.

Los hibridomas obtenidos, tal como se describió anteriormente, se proporcionan como un cultivo mixto que contiene un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal, objetivo de la invención, y además hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra otras proteínas contenidas en la preparación de vWF de forma mixta, anticuerpos monoclonales contra los sitios del vWF humano irrelevantes para RIPA, BIPA y SIPA. De acuerdo con ello, se selecciona una cepa que produzca el anticuerpo monoclonal, objetivo de la invención, a partir de los hibridomas anteriores.

El hibridoma, que produce el anticuerpo monoclonal con reactividad con el vWF, puede seleccionarse de acuerdo con el inmunoensayo enzimático basado en la utilización de vWF humano como un antígeno. Una cepa que produce un anticuerpo monoclonal para inhibir tanto RIPA como BIPA mediadas por el vWF humano, se selecciona mediante cuantificación de la actividad inhibidora de RIPA y BIPA utilizando una parte del medio de cada pocillo.

El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la presente invención, se obtiene seleccionando un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal que se una al vWF de un animal como la cobaya, la rata, el conejo, o un anticuerpo monoclonal que inhiba la BIPA o la RIPA de las plaquetas de un animal, tal como se describió anteriormente, de acuerdo con un procedimiento de inmunoensayo enzimático como un ELISA (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima).

Después de confirmar que el hibridoma productor del anticuerpo monoclonal, objetivo de la invención, se halla en el cultivo, este cultivo se transfiere a un medio HT que contiene la misma composición que el medio HAT, excepto que se ha eliminado la aminopterina del medio HAT. A continuación, se cultiva el hibridoma para realizar el clonaje de acuerdo con, por ejemplo, un procedimiento de dilución limitante.

De este modo se obtuvieron los hibridomas AJvW-2 y AJvW-4, tal como se demuestra en los Ejemplos descritos posteriormente. Ambos hibridomas se depositaron el 24 de agosto de 1994 en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana de la Agencia de Ciencias Industriales y Tecnología del Ministerio de Comercio e Industria Internacional (código postal: 305, 1-3 Higashi-Icchome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, Japan) con los números de depósito FERM P-14487 y FERM P-14489, respectivamente en este orden, y luego se transfirieron al depósito internacional, de acuerdo con el Tratado de Budapest, el 29 de septiembre de 1995 con los números de depósito FERM BP-5248 y FERM BP-5250, respectivamente en este orden.

Tal como se demuestra en los Ejemplos descritos posteriormente, el anticuerpo monoclonal producido por AJvW-2 pertenece a la subclase de IgG1, y el anticuerpo monoclonal producido por AJvW-4 pertenece a la subclase de IgG2b. El NMC-4 pertenece a la subclase de IgG1, tal como se ha descrito hasta ahora.

El anticuerpo monoclonal de la presente invención se obtiene cultivando, en un medio adecuado o en fluido ascítico de ratón, el hibridoma obtenido tal como se describió anteriormente, o una variante seleccionada mediante clonaje del hibridoma de acuerdo con el procedimiento de dilución limitante, por ejemplo, una variante del hibridoma que tenga una elevada productividad de anticuerpos. Alternativamente, el anticuerpo monoclonal de la presente invención también se obtiene aislando un gen relacionado con la producción de anticuerpos a partir del hibridoma obtenido, incorporando el gen en un vector de expresión, introduciendo un vector obtenido en un microorganismo como Escherichia coli y cultivando un microorganismo productor de anticuerpos. El hibridoma incluye el AJvW-2 y el AJvW-4, descritos anteriormente, y variantes de lo mismo.

El medio para el cultivo del hibridoma incluye, por ejemplo, un medio basado en el medio DMEM y además contiene suero bovino fetal, L-glutamina, glucosa, sodio piruvato, 2-mercaptoetanol y un antibiótico (por ejemplo, penicilina G, estreptomicina y gentamicina). El hibridoma de la presente invención se cultiva generalmente en el medio a 37ºC durante 2 a 4 días con una fase gaseosa que contiene anhídrido carbónico al 5% y aire al 95%. Alternativamente, el hibridoma se cultiva durante aproximadamente 10 a 15 días en una cavidad abdominal del ratón Balb/c pretratado con 2,6,10,14-tetrametilpentadecano [por ejemplo, Prisane (nombre comercial) producido por Sigma]. Así, se produce el anticuerpo monoclonal en una cantidad capaz de someterse a purificación.

El anticuerpo monoclonal así producido se puede separar y purificar de acuerdo con un procedimiento general adoptado para el aislamiento y purificación de proteínas del sobrenadante del cultivo, o del fluido ascítico.

Tal procedimiento incluye, por ejemplo, la centrifugación, la diálisis, precipitación con sales y sulfato de amonio y cromatografía en columna utilizando, por ejemplo, DEAE-celulosa, hidroxiapatita, proteína-A agarosa y proteína-G-agarosa.

3. Agente anti-trombótico de la presente invención

El agente anti-trombótico de la presente invención contiene, como ingrediente activo, el antisuero monoclonal de la presente invención.

Cuando el anticuerpo monoclonal originario del ratón se aplica como un agente anti-trombótico a un humano, es deseable que el anticuerpo monoclonal esté modificado a uno del tipo humano, debido a los problemas de antigenicidad y de vida media en sangre. Las regiones variables de los anticuerpos se pueden convertir en las de tipo humano sin perder la especificidad de reacción de acuerdo con los procedimientos descritos por Jones y col., (Nature, vol., 321:p. 522, 1986) y Queen y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p. 10029, 1989). Recientemente, también está disponible el procedimiento del clonaje del repertorio descrito por Winter y Lerner y col., (J. Mol. Biol., vol 222, p. 581, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 88, p. 2432, 1991).

Los fragmentos F(ab')_{2}, Fab' y Fab que se pueden obtener mediante digestión del anticuerpo monoclonal anterior con una enzima proteolítica como la tripsina, la papaína y la pepsina, seguido de una purificación, también pueden utilizarse como agentes anti-trombóticos siempre que estos fragmentos tengan propiedades equivalentes con los anticuerpos monoclonales anteriores.

El tipo o la forma del agente anti-trombótico de la presente invención incluye, por ejemplo, el inyectable, la tableta sublingual, el emplasto dérmico, las tabletas o píldoras, la cápsula, los gránulos, el jarabe, los supositorios, la pomada y la instilación. De entre ellos, el inyectable, la tableta sublingual y la pomada dérmica son los preferidos. Dependiendo del tipo de agente, el agente anti-trombótico puede estar mezclado con excipientes adecuados farmacéuticamente, por ejemplo, lactosa, almidón de patata, carbonato cálcico y alginato sódico. En el caso de un inyectable, los utilizados como solventes incluyen, por ejemplo, el agua para inyección, solución salina fisiológica y solución de Ringer. El solvente puede ser añadido con un agente dispersante. Además, se pueden utilizar conjuntamente con un componente anti-trombótico distinto a los anticuerpos monoclonales anti-vWF.

La dosis de administración del agente anti-trombótico de la presente invención difiere dependiendo de, por ejemplo, la edad y la condición de un paciente. Sin embargo, en general, en el caso de la administración intravenosa, se puede esperar un efecto predeterminado utilizando el agente anti-trombótico de la presente invención, preferentemente en un intervalo de 0,1 \mug/Kg a 1000 mg/Kg, más preferentemente de 1 \mug/Kg a 100 mg/Kg por un día y por adulto, representado por la cantidad de anticuerpo monoclonal utilizado como ingrediente activo.

El agente anti-trombótico de la presente invención puede utilizarse en las aplicaciones generales relacionadas con agentes anti-trombóticos. Es decir, el agente anti-trombótico de la presente invención puede aplicarse para prevenir o tratar las enfermedades relacionadas con la adhesión y agregación de plaquetas. Específicamente, por ejemplo, el agente anti-trombótico de la presente invención es eficaz en el tratamiento del accidente isquémico cerebral transitorio, la angina de pecho inestable, el infarto cerebral, el infarto de miocardio y la enfermedad oclusiva de arterias periféricas y es eficaz en la prevención de la reoclusión después de PTCA y oclusión del injerto de derivación de la arteria coronaria, y es eficaz en el tratamiento del reemplazo de la válvula de la arteria coronaria y en la trombocitemia esencial.

Descripción resumida de las figuras

La Fig. 1 muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 2 y del Anticuerpo 4 referentes a los ejemplos de la presente invención y del NMC-4 como un control comparativo, cuantificado en la RIPA basada en la utilización de PRP (plasma rico en plaquetas) humano.

La Fig. 2 (comparativa) muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 1 y del Anticuerpo 3 referentes a los ejemplos de la presente invención y al NMC-4 como control comparativo, cuantificado en la RIPA basada en la utilización de PRP humano.

La Fig. 3 muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 2, del Anticuerpo 4 y del NMC-4, cuantificadas en RIPA basada en la utilización de PRP de cobaya.

La Fig. 4 muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 2, del Anticuerpo 4 y del NMC-4, cuantificadas en BIPA basada en la utilización de PRP humano.

La Fig. 5 (comparativa) muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 1, del Anticuerpo 3 y del NMC-4, cuantificadas en BIPA basada en la utilización de PRP humano.

La Fig. 6 muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 2, del Anticuerpo 4 y del NMC-4, cuantificadas en BIPA basada en la utilización de PRP de cobaya.

La Fig. 7 muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 2, del Anticuerpo 4 y del NMC-4, cuantificadas en BIPA basada en la utilización de PRP de rata.

La Fig. 8 muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 2, del Anticuerpo 4 y del NMC-4, cuantificadas en BIPA basada en la utilización de PRP de conejo.

La Fig. 9 (comparativa) muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 1, del Anticuerpo 3 y del NMC-4, cuantificadas en BIPA basada en la utilización de PRP de conejo.

La Fig. 10 muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 2, del Anticuerpo 4 y del NMC-4, cuantificadas en SIPA basada en la utilización de PRP humano.

La Fig. 11 (comparativa) muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 1, del Anticuerpo 3 y del NMC-4, cuantificadas en SIPA basada en la utilización de PRP humano.

La Fig. 12 muestra las actividades inhibidoras del Anticuerpo 2, del Anticuerpo 4 y del NMC-4, en la unión de vWF con las plaquetas humanas inmovilizadas (en presencia de ristocetin).

La Fig. 13 (comparativa) muestra las influencias del Anticuerpo 1, del Anticuerpo 3 y del NMC-4 en la unión del vWF con las plaquetas humanas inmovilizadas (en presencia de ristocetin).

La Fig. 14 muestra las influencias del Anticuerpo 2, del Anticuerpo 4 y del NMC-4 en la unión del vWF con las plaquetas humanas inmovilizadas (en presencia de brotocetin).

La Fig. 15 (comparativa) muestra las influencias del Anticuerpo 1, del Anticuerpo 3 y del NMC-4 sobre la unión del vWF con las plaquetas humanas inmovilizadas (en presencia de brotocetin).

La Fig. 16 muestra los efectos de los anticuerpos monoclonales respectivos sobre la unión de AJvW-1 biotinilados con el vWF inmovilizado.

La Fig. 17 muestra los efectos de los anticuerpos monoclonales respectivos sobre la unión de AJvW-2 con el vWF inmovilizado.

La Fig. 18 muestra los efectos de los anticuerpos monoclonales respectivos sobre la unión de AJvW-3 con el vWF inmovilizado.

La Fig. 19 muestra los efectos de los anticuerpos monoclonales respectivos sobre la unión de AJvW-4 con el vWF inmovilizado.

La Fig. 20 muestra los efectos de los anticuerpos monoclonales respectivos sobre la unión del NMC-4 biotinilado con el vWF inmovilizado.

La Fig. 21 muestra los efectos inhibidores del Anticuerpo 2 y del Anticuerpo 4, cuantificados ex vivo de RIPA en cobaya.

La Fig. 22 muestra los efectos inhibidores del Anticuerpo 4 cuantificados ex vivo de BIPA en cobaya.

La Fig. 23 muestra un efecto del Anticuerpo 2 sobre el tiempo de oclusión en un modelo de PIT en cobaya.

La Fig. 24 muestra un efecto del Anticuerpo 4 sobre el tiempo de oclusión en un modelo de PIT en cobaya.

La Fig. 25 muestra un efecto del Anticuerpo 2 sobre el tiempo de oclusión en un modelo de derivación A-V en cobaya.

La Fig. 26 muestra un efecto del Anticuerpo 2 sobre el tiempo de sangría en un modelo de tiempo de sangría en cobaya.

La Fig. 27 muestra un efecto del Anticuerpo 4 sobre el tiempo de sangría en un modelo de tiempo de sangría en cobaya.

Mejor método para llevar a cabo la invención

A continuación, la presente invención se explicará más específicamente gracias a ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a los ejemplos descritos más adelante.

Ejemplos

<1.> Preparación de los anticuerpos monoclonales (1.) Inmunosensibilización y fusión celular

El vWF humano purificado se mezcló con una cantidad equivalente de un adyuvante (MPL + TDM EMULSION: nombre comercial de RIBI) y se obtuvo una mezcla que se administró subcutáneamente a ratones Balb/c machos (8 semanas después del inicio de la inmunización) en una cantidad que correspondía con la cantidad de vWF de 100 \mug por ratón (inmunización de cebado). Al cabo de 21 días, se realizó la inmunización mediante administración subcutánea de la misma manera que la descrita anteriormente (inmunización de refuerzo). Al cabo de 19 o 30 días después del refuerzo, se administró a los ratones, por las venas de la cola, 200 \mul de una preparación obtenida mediante dilución del vWF humano con PBS (solución fisiológica de fosfato salino, producida por Nissui) para obtener una concentración de 250 \mug/ml (inmunización final).

Se extrajeron los bazos de los ratones al cabo de 3 días de la inmunización final y se disgregaron en células individuales. A continuación, las células del bazo se lavaron con medio DMEM. Por otra parte, se obtuvieron células de mieloma de ratón Sp2/0-Ag14 en la fase de crecimiento logarítmica y se lavaron con medio DMEM. Las células del bazo y las de mieloma de ratón se mezclaron suficientemente en un tubo de plástico a una proporción de 10:1 (número de células), luego se les añadió polietilén glicol al 50% (p/v) (producido por Boehringer Mannheim, peso molecular medio: 4000) para realizar la fusión celular a 37ºC durante 7 minutos.

Mediante centrifugación se eliminó la solución del sobrenadante y se añadió al sedimento medio HAT (medio DMEM con suero bovino fetal al 10% con hipoxantina, aminopterina y timidina). El sedimento celular se resuspendió de modo que la concentración de las células del bazo fuera de 5x10^{6} células/ml. Esta suspensión celular se dispensó en placas de plástico de 96 pocillos, de modo que cada pocillo contenía 100 \mul de la suspensión y se prosiguió con el cultivo a 37ºC con anhídrido carbónico al 5%. Los días 2 y 5 se añadieron 50 \mul de medio HAT por pocillo. Después de ello, se cambió la mitad del volumen del medio cada 3 o 4 días de acuerdo con la proliferación de los hibridomas.

(2.) Cribaje y clonaje de hibridomas

Los hibridomas, que producían el anticuerpo monoclonal de la presente invención, se rastrearon utilizando, como índice, la actividad inhibidora del anticuerpo monoclonal sobre la actividad fisiológica del vWf. Además, después de finalizarse la proliferación, se tomaron muestras del medio de cada pocillo para cuantificar las actividades de RIPA y BIPA. Y se seleccionaron los clones de hibridomas, que inhibían fuertemente ambas reacciones.

A partir de los clones seleccionados, se seleccionaron los hibridomas que producían anticuerpos monoclonales que presentaban reactividad con el vWF de cobaya, conejo y rata. Los hibridomas obtenidos se transfirieron a medio HT, idéntico al medio HAT excepto que la aminopterina se había eliminado del medio HAT, y se cultivaron posteriormente. El clonaje se realizó dos veces de acuerdo con el procedimiento de dilución limitante, obteniéndose así hibridomas estables. Por último, se obtuvieron dos hibridomas que se denominaron AJvW-2 y AJvW-4.

Por otra parte, los hibridomas que producían anticuerpos monoclonales sin presentar reactividad con el vWF de cobaya, conejo y rata, se seleccionaron a partir de los clones que inhibían fuertemente las reacciones de RIPA y BIPA descritas anteriormente. Los hibridomas obtenidos se transfirieron a medio HT, idéntico al HAT excepto que la aminopterina se había eliminado del medio HAT, y se cultivaron posteriormente. El clonaje se realizó dos veces de acuerdo con el procedimiento de dilución limitante, obteniéndose así hibridomas estables. Por último, se obtuvieron dos hibridomas que se denominaron AJvW-1 y AJvW-3.

AJvW-2 y AJvW-4 produjeron los anticuerpos monoclonales de la presente invención y AJvW-1 y AJvW-3 produjeron anticuerpos monoclonales fuera del ámbito de la presente invención.

<2.> Producción y purificación de anticuerpos monoclonales (1.) Producción de anticuerpos monoclonales

En ratones Balb/c hembras de 6 a 8 semanas de edad, se inyectaron 0,5 ml de 2,6,10, 14-Tetrametilpentadecano (nombre comercial: Pristane, producido por Sigma). Al cabo de 10-20 días, se inoculó intraperitonealmente a los ratones células AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 y AJvW-4 resuspendidas en PBS. Al cabo de 7-10 días, se sacrificaron los ratones y se sometieron a una operación abdominal, recogiéndose el fluido ascítico producido. Dicho fluido se centrifugó para eliminar materias insolubles y se recuperó el sobrenadante que se guardó a -20ºC.

(2.) Purificación de anticuerpos monoclonales

Se purificó la IgG del sobrenadante del fluido ascítico descrito anteriormente, utilizando el equipo de purificación de anticuerpos Hi-Trap Protein-A (nombre comercial, producido por Pharmacia). Es decir, al fluido ascítico se le añadieron 8 ml de la solución A (1,5 ml de glicina, NaCl 3M, pH 8,9) y se filtró con un filtro de tamaño de poro de 45 \mum (producido por Millipore). Después de lo cual, se obtuvo un filtrado que se aplicó a una columna (volumen de la columna 1 ml) cargada con Protein Sepharose HP (producida por Pharmacia) suficientemente equilibrada con Solución A y la columna se lavó con Solución A con una cantidad de 10 veces del volumen de la columna. A continuación, se eluyó la fracción de IgG con la Solución B (glicina 0,1 M, pH 8,2) en una cantidad de 10 veces el volumen de la columna. La fracción de IgG eluida se dializó con PBS y se utilizó como una muestra purificada.

Los anticuerpos monoclonales producidos por AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 y AJvW-4 serán referidos aquí en adelante como ``Anticuerpo 1'', ``Anticuerpo 2'', ``Anticuerpo 3'' y ``Anticuerpo 4'', respectivamente en este orden.

El NMC-4 se purificó del fluido ascítico que contenía NMC-4 de igual manera que la descrita anteriormente, para obtener una muestra para utilizar como un control comparativo.

<3.> Determinación de subclases de anticuerpos monoclonales

Se determinó la subclase de IgG a la que pertenecían los anticuerpos monoclonales de la presente invención, utilizando los anticuerpos purificados obtenidos en el anterior punto <2>, mediante el equipo de determinación de subclases disponible comercialmente (nombre comercial: Mono Ab-ID EIA KitA, producido por Zymed). Este procedimiento está basado en el ensayo ELISA. Como resultado, todos los anticuerpos 1, 2, 3 y 4 pertenecían a la clase de IgG. Se determinó que la subclase del Anticuerpo 1 y del Anticuerpo 3 era el isotipo IgG2a, la subclase del Anticuerpo 2 era el isotipo IgG1 y la subclase del Anticuerpo 4 era el isotipo IgG2. El NMC-4 pertenecía a la subclase IgG1, como ya se indicó anteriormente.

<4.> Actividades inhibidoras de los anticuerpos monoclonales de la presente invención sobre la agregación plaquetaria (1.) Actividades inhibidoras de RIPA

La sangre obtenida de un donante humano normal se mezcló con citrato sódico al 3,8% a una proporción de 9:1, luego se centrifugó a 1100 rpm durante 10 minutos para preparar la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP). Se hicieron reaccionar 225 \mul de PRP (3x10^{8} plaquetas/ml) a 37ºC durante 3 minutos con 2 \mul del anticuerpo monoclonal a varias concentraciones. Después, se añadió ristocetin (Sigma) a una concentración final de 1,5 mg/ml. Se controló la agregación plaquetaria a 37ºC durante 10 minutos utilizando un aparato para cuantificar la capacidad de agregación plaquetaria (nombre comercial: HEMATRCER, producido por Niko Bioscience). La magnitud de la agregación plaquetaria se expresó por los cambios en la transmitancia óptica. La actividad inhibidora sobre la agregación plaquetaria se determinó utilizando, como control, la agregación máxima obtenida añadiendo DMEM o el tampón de disolución de la muestra.

Los resultados se muestran en la Fig. 1 (Anticuerpos 2, 4) y Fig. 2 (Anticuerpos 1,3). Cualquiera de los anticuerpos Anticuerpo 1, Anticuerpo 2, Anticuerpo 3 y Anticuerpo 4 y el NMC-4 inhibieron la RIPA humana de forma dependiente de la dosis. Los valores de IC_{50} fueron de 0,8 \mug/ml para el Anticuerpo 1, de 3,5 \mug/ml para el Anticuerpo 2, de 1,0 \mug/ml para el Anticuerpo 3, de 2,0 \mug/ml para el Anticuerpo 4 y de 0,7 \mug/ml para el NMC-4.

Se preparó PRP de cobaya de igual manera que la descrita anteriormente, al que se añadió ristocetin a una concentración final de 1,75 mg/ml y se realizaron las cuantificaciones como las descritas anteriormente. El Anticuerpo 1 (concentración final: 80 \mug/ml) y el NMC-4 (concentración final: 27 \mug/ml) no inhibieron para nada la RIPA de cobaya, mientras que el Anticuerpo 2 y el Anticuerpo 4 inhibieron la RIPA de cobaya de forma dependiente de la dosis (Fig. 3). Los valores del IC_{50} fueron de 0,4 \mug/ml para el Anticuerpo 2 y de 1 \mug/ml para el Anticuerpo 4.

2. Inhibición de las actividades de BIPA

Antes de la cuantificación de BIPA, se purificó un veneno de serpiente, botrocetin, a partir de una preparación de veneno cruda (Sigma) obtenida de Bothorops jaraca. Concretamente, se disolvió 1 \mug de la preparación de veneno cruda con tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) y NaCl 0,15 M, eliminándose las partículas insolubles mediante centrifugación a 3000 rpm. El sobrenadante obtenido se sometió a filtración en gel utilizando Sephadex G-75 (5x90 cm, producido por Pharmacia). Se recogieron las fracciones que correspondían a un intervalo de volumen de elución entre 480-570 ml, la solución obtenida se concentró a un volumen de 20 ml utilizando un aparato concentrador por ultracentrifugación (DIAFLO YM-10, producido por Amicon). Después, la solución concentrada se aplicó a una columna de intercambio iónico de DEAE-TOYOPEARL-650M (1,6 x 32 cm, producida por Pharmacia), seguido de elución aplicando un gradiente de concentración de 0 a 0,3 M de NaCl. Se recogieron las fracciones eluidas entre los 600-640 minutos. La solución obtenida se concentró a un volumen de 4 ml de igual manera que la descrita anteriormente. Después, la solución concentrada se aplicó a una columna de filtración en gel (Sephadex G-75, 2,6 x 90 cm, producida por Pharmacia) utilizando como solvente, el tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) con NaCl 0,15 M. Se recuperaron las fracciones que presentaban actividades importantes de agregación plaquetaria y la solución combinada se utilizó como una muestra purificada.

Se hicieron reaccionar 225 \mul de PRP humano (3 x 10^{8} plaquetas/ml) a 37ºC durante 3 minutos con 2 \mul del anticuerpo monoclonal a las concentraciones respectivas. Luego, se añadió, a la mezcla de reacción, botrocetin obtenido tal como se describió anteriormente a una concentración final de 5 \mug/ml y se cuantificó la agregación plaquetaria de acuerdo con el mismo procedimiento descrito anteriormente en el punto (1). Los resultados se muestran en la Fig. 4 (Anticuerpos 2, 4) y Fig. 5 (Anticuerpos 1, 3). Ninguno de los anticuerpos, Anticuerpo 1, Anticuerpo 2, Anticuerpo 3, Anticuerpo 4, ni el NMC-4 inhibieron la BIPA de forma dependiente de la dosis. Los valores de IC_{50} fueron de 0,8 mg/ml para el Anticuerpo 1, de 2,0 \mug/ml para el Anticuerpo 2, de 1,0 \mug/ml para el Anticuerpo 3, de 5,6 \mug/ml para el Anticuerpo 4 y de 2,0 \mug/ml para el NMC-4.

El PRP de cobaya se preparó de igual forma que la descrita anteriormente, se le añadió botrocetin a una concentración final de 2 \mug/ml y se realizaron cuantificaciones al igual que antes. El Anticuerpo 1 (concentración final de 80\mug/ml), Anticuerpo 3 (concentración final de 80 \mug/ml) y el NMC-4 (concentración final de 27 \mug/ml) no inhibieron para nada la BIPA de forma dependiente de la dosis (Fig. 6). Los valores de IC_{50} fueron de 3,1 \mug/ml para el Anticuerpo 2 y de 3,5 \mug/ml para el Anticuerpo 4.

El PRP se preparó centrifugando la sangre de rata a 1300 rpm durante 10 minutos. Se añadió botrocetin al PRP (5 x 10^{8} plaquetas/ml) a una concentración final de 0,08 \mug/ml y se realizaron cuantificaciones de la misma manera que la descrita anteriormente. El Anticuerpo 1 (concentración final: 80\mug/ml) y el Anticuerpo 3 (concentración final: 80 \mug/ml) no inhibieron la BIPA de rata, mientras que el Anticuerpo 2, el Anticuerpo 4 y el NMC-4 inhibieron la BIPA de forma dependiente de la dosis (Fig. 7). Los valores del IC_{50} fueron de 1,2 \mug/ml para el Anticuerpo 2, de 5,0 \mug/ml para el Anticuerpo 4 y de 2,2 \mug/ml para el NMC-4.

El PRP se preparó centrifugando la sangre de conejo a 1200 rpm durante 10 minutos. Se añadió el botrocetin al PRP (3x10^{8} plaquetas/ml) a una concentración final de 0,075 \mug/ml y se realizaron las cuantificaciones de la misma manera que la descrita anteriormente. Los resultados se muestran en la Fig. 8 (Anticuerpos 2, 4) y la Fig. 9 (Anticuerpos 1,3). El Anticuerpo 1 (concentración final: 80 \mug/ml), el Anticuerpo 3 (concentración final: 80\mug/ml) y el NMC-4 (concentración final: 27 \mug/ml) no inhibieron la BIPA para nada, mientras que el Anticuerpo 2 y el Anticuerpo 4 inhibieron la BIPA de forma dependiente de la dosis. Los valores del IC_{50} fueron de 5,0 \mug/ml para el Anticuerpo 2 y de 1,8 \mug/ml para el Anticuerpo 4.

(3.) Actividades inhibidoras de la SIPA

Se hicieron reaccionar 360 \mul del PRP humano (2,5 x 10^{8} plaquetas/ml) a temperatura ambiente durante 10 minutos con 40 \mul del anticuerpo monoclonal a las concentraciones respectivas. Después, se cuantificó la agregación plaquetaria inducida por una tensión de cizallamiento utilizando un aparato para cuantificar la función celular (producido por Toray). Es decir, la mezcla de reacción se aplicó con tensión de cizallamiento de 6 dinas/cm^{2} durante un período de 0 a 15 segundos, con un gradiente de baja tensión de 6 \rightarrow 12 dinas/cm^{2} durante un período de 15 a 105 segundos, con un gradiente de alta tensión de 12 \rightarrow 108 dinas/cm^{2} durante un período de 105 a 222 segundos y una tensión de cizallamiento de 108 dinas/cm^{2} durante un período de 350 segundos. La magnitud de la actividad de agregación plaquetaria se representó por el cambio de transmitancia óptica. La actividad inhibidora de la agregación plaquetaria se determinó utilizando, como un control, la agregación máxima obtenida al añadir DMEM o el tampón de disolución de muestras.

Los resultados se muestran en la Fig. 10 (Anticuerpos 2, 4) y la Fig. 11 (Anticuerpos 1,3). Cualquiera de los anticuerpos Anticuerpo 1, 2, 3, 4 y el NMC-4 inhibieron la SIPA en el hombre de forma dependiente de la dosis. Los valores del IC_{50} fueron de 0,7 \mug/ml para el Anticuerpo 1, de 1,1 \mug/ml para el Anticuerpo 2, de 0,9 \mug/ml para el Anticuerpo 3, de 1,5 \mug/ml para el Anticuerpo 4 y de 1,5 \mug/ml para el NMC-4.

<5.> Afinidad de los anticuerpos monoclonales de la presente invención contra el vWF (1.) Marcaje del vWF humano con I^{125}

En un tubo de propileno, se añadieron Iodogen (producido por Pierce, 1mg/ml) y una solución de diclorometano (1 ml), eliminándose el solvente mediante chorro de nitrógeno. Se vertió una solución de vWF humano (0,43 mg/ml) en el tubo de polipropileno al que se añadió una solución de Na^{125} (15,9 MBq, 8,6 \mul) para llevar a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 2 minutos. Una vez acabada la reacción, la solución resultante se aplicó a una columna de PD10 (Pharmacia), bloqueada previamente con una solución de TBS (solución salina tamponada con Tris) que contenía 2 ml de BSA (albúmina sérica bovina) al 10% y se lavó con 100 ml de TBS. La elución se realizó con TBS. La solución eluida se fraccionó en fracciones de 500 \mul de volumen. Se cuantificó la radioactividad de una alícuota (2 \mul) de cada una de las fracciones eluidas con una contador \gamma (tiempo de contaje: 1 minuto). Las fracciones que tuvieron valores de contaje elevados se recogieron y una fracción combinada (1 ml) se denominó vWF humano marcado con I^{125 }(vWF-I^{125}) (0,3 mg/ml de vWF humano, 220630 cpm/\mul).

(2.) Preparación de plaquetas inmovilizadas

El PRP humano recogido de la misma manera que la descrita anteriormente en el punto <4> (1) se añadió y se mezcló con un volumen equivalente de solución de paraformaldehído al 2% y a continuación se dejó a 4ºC durante toda la noche. Al día siguiente, las plaquetas inmovilizadas se recogieron y lavaron tres veces con PBS mediante centrifugación. Después de lo cual, las plaquetas inmovilizadas se resuspendieron en PBS con un volumen equivalente al de la recogida de PRP y se obtuvo una suspensión que se utilizó como una suspensión de plaquetas inmovilizadas.

(3.) Acción de los anticuerpos monoclonales de la presente invención sobre la propiedad de unión a plaquetas de vWF

La suspensión de plaquetas inmovilizadas, una solución del anticuerpo a diversas concentraciones y una solución de ristocetin o de botrocetin se dispensaron en una placa de filtro de 96 pocillos previamente bloqueada con PBS y BSA al 1% en donde se añadió la solución de vWF-I^{125}. A continuación, la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, el vWF-I^{125} no unido a las plaquetas inmovilizadas se eliminó mediante filtración por succión y el filtro se lavó con PBS y Tween-20 al 0,05%. El I^{125} que permaneció en el filtro se cuantificó con una contador-\gamma (tiempo de contaje: 1 minuto) para determinar la cantidad de vWF humano unido a las plaquetas inmovilizadas. La proporción de la cantidad de vWF humano unido a plaquetas en presencia de anticuerpo respecto a la cantidad de vWF humano unido a plaquetas en ausencia de anticuerpo se denominó cociente de unión (%).

Los resultados obtenidos en presencia de ristocetin se muestran en la Figura 12 (Anticuerpos 2, 4) y Fig. 13 (Anticuerpos 1, 3). Los resultados obtenidos en presencia de botrocetin se muestran en la Fig. 14 (Anticuerpos 2, 4) Y Fig. 15 (Anticuerpos 1, 3). Todos los anticuerpos Anticuerpo 1, Anticuerpo 2, Anticuerpo 3, Anticuerpo 4 y NMC-4 inhibieron la unión dependiente de ristocetin y la unión dependiente de brotocetin del vWF con las plaquetas de forma dependiente de la dosis. Los valores de IC_{50} en la reacción dependiente de ristocetin fueron de 0,37 \mug/ml para el Anticuerpo 1, de 1,1 \mug/ml para el Anticuerpo 2, de 20,0 \mug/ml para el Anticuerpo 3, de 0,95 \mug/ml para el Anticuerpo 4 y de 0,35 \mug/ml para el NMC-4. Los valores de IC_{50} en la reacción dependiente de botrocetin fueron de 1,2 \mug/ml para el Anticuerpo 1, de 0,9 \mug/ml para el Anticuerpo 2, de 2,1 mg/ml para el Anticuerpo 3, de 0,9 \mug/ml para el Anticuerpo 4 y de 0,3 \mug/ml para el NMC-4.

<6.> Comparación de los epitopos del Anticuerpo 1, Anticuerpo 2, Anticuerpo 3 y Anticuerpo 4 con el epitopo de NMC-4

Con el fin de comparar los epitopos del Anticuerpo 1, Anticuerpo 2, Anticuerpo 3 y Anticuerpo 4 con un epitopo de NMC-4, se investigaron los efectos inhibidores del Anticuerpo 1, Anticuerpo 2, Anticuerpo 3 y Anticuerpo 4 sobre la unión del NMC-4 con el vWF humano inmovilizado.

Los Anticuerpos 1, 2, 3, 4 y NMC-4 se biotinilaron utilizando el Equipo de Biotinilación (nombre comercial de Amersham) para preparar las muestras respectivas del Anticuerpo 1 Biotinilado, Anticuerpo 2 Biotinilado, Anticuerpo 3 Biotinilado, Anticuerpo 4 Biotinilado y NMC-4 Biotinilado. Concretamente, una solución de cada uno de los anticuerpos monoclonales dializada con PBS se añadió junto con una solución de biotina-brazo espaciador- éster de N-hidroxisuccinimida para realizar una reacción a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se realizó una purificación con una columna Sephadex G25 (producida por Pharmacia).

Se añadieron 50 \mul de vWF humano (5 \mug/ml) disuelto con una solución de PBS en cada uno de los pocillos de la placa de microtitulación E.I.A. (producida por Linbro/Titertek) y se dejó reposar durante toda la noche a 4ºC, inmovilizándose de este modo el vWF humano. Al día siguiente, se lavaron cada uno de los pocillos tres veces con una solución de lavado (PBS con Tween-20 al 0,05%). Se añadió una solución de PBS con BSA al 0,5% y los pocillos se dejaron reposar durante 1,5 h a temperatura ambiente. De esta manera se bloquearon las porciones en donde se había adherido ninguna proteína.

Cada uno de los anticuerpos biotinilados se mezclaron con el Anticuerpo 1, el Anticuerpo 2, el Anticuerpo 3, el Anticuerpo 4 o el NMC-4 en un tubo Eppendorf, añadiéndose 50 \mul a cada uno de los pocillos con el vWF humano inmovilizado, descrito anteriormente, para realizar la incubación a 37ºC durante 1 hora. Después de lavar los pocillos, se añadió a cada uno de ellos 50 \mul de una solución de estreptavidina-fosfatasa alcalina (producida por Amersham) diluida 500 veces con TBS 0,05 M y Tween-20 al 0,05% y BSA al 1%, dejándose actuar durante 1 hora a 37ºC.

Después de lavar los pocillos, se añadió a cada uno de ellos 100 \mul de un sustrato productor de color, es decir, p-nitrofenil fosfato (producido por Sigma) y se dejó actuar en reposo durante 20 minutos. El anticuerpo biotinilado unido al vWF humano se cuantificó mediante la absorbancia a 405 nm. La unión inespecífica se cuantificó en presencia de una cantidad en exceso (100 veces) de anticuerpo no-biotinilado, de igual forma a la descrita anteriormente. Se sustrajo un valor cuantificado en la anterior cuantificación, de un valor cuantificado en la primera cuantificación para obtener un valor que se designó como la absorción específica.

Los resultados se muestran en las Figs. 16 a 20. El Anticuerpo 1, Anticuerpo 2, Anticuerpo 3 y Anticuerpo 4 no inhibieron la unión del NMC-4 biotinilado con el vWF inmovilizado, mientras que sí inhibieron la unión del Anticuerpo 1 Biotinilado, Anticuerpo 2 Biotinilado, Anticuerpo 3 Biotinilado y Anticuerpo 4 Biotinilado con el vWF inmovilizado. Por otra parte, el NMC-4 no inhibió la unión del Anticuerpo 1 Biotinilado, Anticuerpo 2 Biotinilado, Anticuerpo 3 Biotinilado y Anticuerpo 4 Biotinilado con el vWF inmovilizado. De acuerdo con los resultados anteriores, se demostró que los epitopos para el Anticuerpo 1, Anticuerpo 2, Anticuerpo 3 y Anticuerpo 4 están presentes en posiciones adyacentes en el vWF, sin embargo, son diferentes del epitopo para el NMC-4.

<7.> Efecto inhibitorio sobre la agregación plaquetaria en la cobaya (ex vivo)

El Anticuerpo <2> y el Anticuerpo 4 purificados como en el punto anterior (2) se ajustaron a diversas concentraciones con PBS y se inyectaron intravenosamente a cobayas (hembras, 430 a 600 g) a una dosis de 100 \mug/Kg o de 300 \mug/Kg (un grupo: 4 cobayas). El PBS se utilizó como control placebo. Al cabo de 5 minutos, se extrajo sangre de la aorta abdominal del animal anestesiado con éter y se recogió en tubos con ácido cítrico. De esta sangre, se preparó el PRP (número de plaquetas: 3,0 x 10^{8} plaquetas/ml) para cuantificar la RIPA o la BIPA de acuerdo con el mismo procedimiento descrito anteriormente en el punto <4>. El valor en % de inhibición de cada anticuerpo sobre la agregación plaquetaria se calculó considerando que la máxima proporción de agregación en el grupo administrado con PBS era del 100%.

Los resultados se muestran en las Figs. 21 y 22. El Anticuerpo 2 y el Anticuerpo 4 inhibieron la RIPA de forma dependiente de la dosis. Los valores de ED_{50} (valores del 50% de inhibición de la agregación plaquetaria) fueron de 70 \mug/Kg para el Anticuerpo 2 y de 90 \mug/Kg para el Anticuerpo 4. En la BIPA, el Anticuerpo 4 tenía un valor de ED_{50} de 55 \mug/Kg. Las fuertes acciones del Anticuerpo 2 y del Anticuerpo 4 en la inhibición de RIPA y BIPA se observaron de forma continua hasta 6 horas después de la administración y desaparecieron a las 48 horas.

Además del anterior análisis, se cuantificaron parámetros hematológicos relacionados con la sangre completa recogida con ácido cítrico al cabo de 5 minutos de la administración del anticuerpo, utilizando un analizador hematológico automatizado (Sysmex E-2000, producido por Toa Medical Electronics). El Anticuerpo 2 o el Anticuerpo 4 se administraron a una dosis de 100 \mug/Kg o de 300 \mug/Kg. En ningún caso se observó una variación significativa en el recuento de plaquetas total, recuento de glóbulos rojos total, recuento de leucocitos total, concentración de hemoglobina, valor del hematocrito, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media, concentración de hemoglobina corpuscular media, anchura de distribución de glóbulos rojos, anchura de distribución plaquetaria, volumen plaquetario medio, proporción de leucocitos grandes y valor del hematocrito plaquetario.

El plasma sanguíneo se separó mediante centrifugación de la sangre extraída 5 minutos después de la administración del anticuerpo, de igual forma que la descrita anteriormente. El tiempo parcial de tromboplastina, el tiempo de tromboplastina y la concentración de fibrinógeno se cuantificaron para el plasma sanguíneo utilizando un aparato cuantificador de parámetros de coagulación (Sysmex CA-3000, producido por Toa Medical Electronics). Como resultado, no se observaron variaciones significativas en los parámetros respectivos, aún cuando el Anticuerpo 2 o el Anticuerpo 4 se administraran a una dosis de 1000 \mug/día.

<8.> Efecto preventivo de la formación del trombo de los anticuerpos monoclonales de la presente invención en cobaya (in vivo) (1) Evaluación de los efectos preventivos sobre la formación del trombo en un modelo de trombo inducido fotoquímicamente en la arteria carótida de cobaya (modelo PIT)

Se permitió la formación de un trombo oclusivo en la arteria carótida de la cobaya de acuerdo con un procedimiento de Nakajima y col., (Thrombosis Research, vol. 67, p. 435, 1992) de modo que el tiempo de formación del trombo se cuantificó con o sin la administración del Anticuerpo 2 o el Anticuerpo 4.

La arteria carótida de la cobaya se expuso y dilató bajo anestesia con uretano, por donde se instaló una sonda de medición del flujo sanguíneo de pulso Doppler. Se administró el Anticuerpo 2, Anticuerpo 4 o una solución salina a una cantidad de 30, 100 o 300 \mug/Kg a través de una cánula unida a la arteria carótida. Al cabo de 5 minutos, se administró una sustancia fotosensibilizadora, p.ej., rosa de bengala a una cantidad de 10 mg/Kg a través de la misma cánula. Simultáneamente, se irradiaron los vasos sanguíneos localizados cadena arriba del sitio de instalación de la sonda (localizada en un lado del corazón) con luz verde excitadora a 540 nm utilizando una fuente de luz productora de trombos (producida por Hamamatsu Photonics) para cuantificar el tiempo (tiempo de oclusión) del vaso sanguíneo y parada de la circulación sanguínea debida a la formación del trombo.

Los resultados se muestran en las Figs. 23 y 24. El Anticuerpo 2 y el Anticuerpo 4 prolongaron de forma significativa el tiempo de oclusión a una dosis de administración no inferior a 100 \mug/Kg. El análisis estadístico se realizó utilizando el test U de Mann-Whiteny. En las Figs. 23 y 24, un símbolo * indica p<0,05 y un símbolo ** indica una p<0,01.

(2) Evaluación del efecto preventivo sobre la formación del trombo basado en un modelo de derivación A-V

Se insertó un tubo de polietileno en la vena yugular izquierda de la cobaya bajo anestesia con uretano, por el que se administró el Anticuerpo 2 o la solución salina a una dosis de 30, 100 o 300 \mug/Kg. Después de 5 minutos, se insertó el lado opuesto del tubo en la vena yugular derecha para producir una derivación y se abrió de nuevo la circulación sanguínea. El tiempo de parada de la circulación (tiempo de oclusión) se midió utilizando un aparato medidor de flujo sanguíneo de pulso Doppler.

Los resultados se muestran en la Fig. 25. El Anticuerpo 2 prolongó de modo significativo el tiempo de oclusión a una dosis de administración no inferior a 100 \mug/Kg. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el test U de Mann-Whiteny. En la Fig. 25, un símbolo * indica una p<0,05 y un símbolo ** indica una p<0,01.

(3) Evaluación de la prolongación del tiempo de sangría

El Anticuerpo 2, el Anticuerpo 4 o la solución salina fisiológica se administraron intravenosamente a la cobaya a una dosis de 100 o 300 \mug/Kg bajo anestesia con pentobarbital. Al cabo de 5 minutos, se incisó la arteria planta con un corte de 5 mm de longitud. La presencia o ausencia de sangrado de la herida se confirmó cada 15 s utilizando, como índice, un colorante sanguíneo unido a un papel de filtro. Y se cuantificó el tiempo requerido desde la incisión a la parada del sangrado.

Los resultados se muestran en las Figs. 26 y 27. El Anticuerpo 2 y el Anticuerpo 4 prolongaron el tiempo de sangrado a una dosis de 1000 \mug/Kg. El Anticuerpo 2 y el Anticuerpo 4 no afectaron al tiempo de sangrado a una dosis de administración de 300 \mug/Kg, en la que sí presentaron un efecto de prolongación del tiempo de oclusión en el modelo PIT y en el modelo de derivación A-V descrito anteriormente. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el test U de Mann-Whiteny. En las Figs. 26 y 27, un símbolo * indica una p<0,05 y un símbolo ** indica una p<0,01.

De acuerdo con los resultados experimentales descritos anteriormente, se ha demostrado que tanto el Anticuerpo 2 como el Anticuerpo 4 presentan una fuerte acción inhibidora de la formación de trombos sin que se exprese la tendencia hemorrágica, que podría causar problemas clínicos, cuando se administra a un ser vivo.

Aplicación industrial

El anticuerpo monoclonal obtenido de acuerdo con la presente invención tiene una fuerte afinidad y una elevada especificidad de reacción para el vWF, tiene un epitopo distinto a los epitopos de los anticuerpos monoclonales contra el vWF hasta ahora conocidos y puede utilizarse como un ingrediente activo de un agente anti-trombótico. Se espera que el agente anti-trombótico de la presente invención pueda utilizarse como un agente preventivo y un agente terapéutico extremadamente eficaz en las enfermedades relacionadas con el vWF (por ejemplo, las enfermedades trombóticas y la angina de pecho inestable). Además, se puede obtener una información muy útil sobre el sitio de unión-GPIb del vWF utilizando el anticuerpo monoclonal de la presente invención.

Además, el anticuerpo monoclonal de la presente invención tiene una reactividad con el vWF de cobaya y por lo tanto es posible realizar, por ejemplo, análisis de las actividades fisiológicas y de los efectos secundarios utilizando la cobaya.

Claims (6)

1. Anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes propiedades:

(a)

anticuerpo monoclonal que reconoce un epitopo de los factores de von Willebrand humanos y de cobayas, en donde el epitopo es reconocido por los anticuerpos producidos por el hibridoma FERM BP-5248 (AJvW-2) o FERM BP-5250 (AJvW-4).

(b)

anticuerpo monoclonal que inhibe la RIPA (agregación plaquetaria inducida por ristocetin), la BIPA (agregación plaquetaria inducida por botrocetin) y la SIPA (agregación plaquetaria inducida por la tensión de cizallamiento) de plaquetas humanas;

(c)

anticuerpo monoclonal que inhibe la RIPA (agregación plaquetaria inducida por ristocetin) y la BIPA (agregación plaquetaria inducida por botrocetin) de plaquetas de cobayas; y

(d)

anticuerpo monoclonal que presenta una acción anti-trombótica in vivo en cobaya, pero que no causa hemorragia.

2. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, que se produce mediante un hibridoma formado por la fusión entre células de mieloma de ratón y células del bazo de un ratón inmunizado con el factor de von Willbrand humano.

3. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el hibridoma es el FERM BP-5248 (AJvW-2) o el FERM BP-5250 (AJvW-4).

4. Hibridoma para la producción del anticuerpo monoclonal definido en la reivindicación 2, que está formado por la fusión entre las células de mieloma de ratón Sp2/0-Ag14 y las células del bazo de un ratón inmunizado con el factor de von Willebrand.

5. Hibridoma de acuerdo con la reivindicación 4, que es el FERM BP-5248 (AJvW-2) o el FERM BP-5250 (AJvW-4).

6. Agente anti-trombótico que comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo monoclonal definido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.