PT91888A - Peptides and antibodies that inhibit integrinligand binding - Google Patents

Description

-3- 70 03Θ SCR 0254-SCRF 165.1

Por exemplo, a evidência recente indica que uma Integrina encontrada na superfície das plaquetas e conhecida por GPIIb-IIIa é um dos vários receptores de adesão que têm subunidades alfa úni cas mas que partilham uma subunidade beta semelhante e a propriedade funcional de reconhecer a sequência de resíduos aminoácido tripeptídica Arg-Gly-Asp (usando símbolos literais, RGD), Pytela et al., Science, 231:1559-1562 (1986) e Ruoslahti et al., Cell, 44:517-518 (1986). Para além do GPIIb-IIIa, este grupo de recepto res relacionados inclui o receptor da vitronectina (VnR) e o re-ceptor da fibronectina (FnR) isolado a partir das células de os-teosarcoma. /~Pytela et al., Cell, 40:191-198 (1985) e Pytela et al., Proc. Watl. Acad. Sei. USA, 82:5766-5770 (1985).

As propriedades funcionais, estruturais e antigênicas semelhantes destas proteínas sugerem que o GPIIb-IIIa e VnR são mem bros de uma subfamília de Integrinas para a qual se propôs a designação de "citoadesina". PIouj et al., Proc. Watl. Acad, Sei. USA, 83:6002:6006 (1986). Dentro do grupo da citoadesina, as sub unidades alfa distintas combinam-se com uma subunidade comum ou muito semelhante daí resultando receptores funcionalmente distintos. Ginsberg et al., 3, Biol. Chem., 262:5437-5440 (1987).

Por exemplo, o GPIIb-IIIa é um complexo heterodimérico com preendendo subunidades alfa e beta. Oennings et al., 3. Biol.

Chem., 257:10458-10466 (1982). A subunidade alfa, GPIIb, consiste numa cadeia pesada e numa cadeia leve que estão ligadas por pontes de dissulfureto. A subunidade beta, GPIIIa é uma cadeia polipeptídica única de cerca de 100 kDa. Phillips et al., 3. Biol. Chem., 252:2121-2126 (1977). As moléculas da superfície celular relacionadas imunologicamente com o GPIIb-IIIa têm sido identificadas numa série de tipos celulares. Ver Thiagarajan et al., 3, Clin, Invest., 75:896-901 (1985); PIouj et al., Proc. Natl»

Acad. 5ci, USA, 83:6002-6006 (1986); e Fitzgerald et al., 3,

Biol. Chem., 260:10893-10896 (1985). 0 GPIIb-IIIa contribui para a função das plaquetas através de interacçSes com proteínas contendo RGD, isto é, proteínas contendo uma sequência de resíduos aminoácido Arg-Gly-Asp tal como -4- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 o fibrinogênio /""Bennett et al., Proc. Natl. Açad. Scl. USft. 80: :2417-2421 (l983)_7, a fibronectina /"Ginsberg et al., 0. Clin. Invest., 71:619-624 (l983)__7 e o factor υοη Willebrand /""Ruggeri et al., Proc. Natl. ftcad. Sei. USA, 79:6038-6041 (l982)_7, e des te modo é um componente do receptor da proteína de adesão de plaquetas comum. /""Pytela et al., Science» 231;1559-1562 (1986) e Ploui et al., 3. Biol. Chem., 259:5388-5391 (1984)_7.

Pelo menos 2 outros grupos de receptores de adesão hete-rodimêricos foram identificados como tendo uma subunidade beta comum que se combina com um certo número de subunidades alfa distintas. Nos leucócitos encontra-se um grupo e este tem sido refe rido como a família de adesão dos leucócitos (LeuCam) e inclui LFA-1, Mac-1 e P150.95. Sanchez-Madrid et al., 3. Exp. ^ed.. 158:1785-1803 (1983) e Springer et al., Ciba Found. Symp.. 118: :102-126 (1986). 0 outro grupo é mais frequentemente encontrado e tem sido referido como família VLA. Hemler et al., 3. Biol. Chem. » 262:3300-3309 (1987). A subunidade beta da família l/LA /""Hemler et al., 3. Biol. Chem. , 262: 3300-3309 (1987)^7 da galinha foi clonada, sequenciada e designada por "Integrina" /~*Tam-kum et al., Cell, 46:271-282 (1986)_7. A sequência da Integrina da galinha é semelhante à da GPIIa /""Fitzgerald et al., 3. Biol. Chem.t 262:3936-3939 (l987)_7 e à da subunidade beta da família de adesão dos leucócitos /~Kishimoto et al., Cell, 48:681-690 (1987)__7· Além disso, as sequências parciais das várias subunidades alfa apontam também para semelhanças. Ginsberg et al., 3. Biol. Chem., 262:5437-5440 (1987); Suzuki et al, , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:8614-8618 (1986); e Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:8351-8356 (1986). 0s locais do GPIIb-IIIa, ou de outras citoadesinas, que são cruciais para as suas funçães como receptores de adesão são presentemente desconhecidos. Várias observaçães sugerem que um local funcionalmente significativo no GPIIb-IIIa aproxima-se do epítopo definido pelo anticorpo monoclonal PRI-l. Este anticorpo liga-se à cadeia pesada do GPII-b /""Shadle et al., 3. Cell. Biol.. 99:2056-2060 (1984)_7 e define uma região da GPIIb que está associada a várias actividades funcionais distintas. Por exem- -5- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 plo, o PMI-1 inibe a adesão de plaquetas lavadas ao colagénio. Shadle et al., 3. Cell. Biol., 99:2056-2060 (1984).

Breve sumário da invenção 0 presente invento refere-se a polipéptidos /~aqui também referidos por polipéptidos sujeito_J7 de cerca de 11 a cerca de 90 unidades de aminoácido de comprimento que são caracteriza-dos por terem uma sequência de unidades aminoácido homóloga a uma porção da região de ligação RGD de uma subunidade beta da Integra na. 0 presente invento refere-se também a um anticorpo poli-clonal que imunorreage com um polipéptido sujeito bem como a anti. corpos monoclonais que imunorreagem com um epítopo formado pela região de ligação RGD de uma subunidade beta da Integrina. São também contemplados dentro do alcance do presente invento os hibridomas com a capacidade de produzir um anticorpo mo-noclonal sujeito. São contemplados métodos para modular a adesão, jln vivo, de células exprimindo uma subunidade de Integrina beta às quais correspondem os polipéptidos sujeito. Neste método a adesão celular é modulada usando quer os polipéptidos quer os anticorpos anti-polipéptido do presente invento*

Contempla-se ainda um segmenta nucleotídico compreendendo não mais do que cerca de 12 000 pares de bases de nucledtido incluindo uma sequência definindo um gene estrutural codificando um polipéptido sujeito. Também se contempla uma molécula de ADN recombinante compreendendo um vector operativamente ligado a um segmento de ADN.que define um gene estrutural codificando um poli péptido sujeito.

Breve descrição dos desenhos

Nos desenhos que constituem parte desta descrição:

A Figura 1 ilustra a sequência de bases de nucleótido e a sequência de unidades aminoácido deduzida de um segmento de ADN -6- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 codificando a região de ligação RGD do GPIIIa. As posiçães das unidades aminoácido e das bases de nucleótido são indicadas nas margens esquerda e direita, respectivamente. Fitzgerald et al., 0. Biol. Chem., 262:3936-3939 (1987). A Figura 2 ilustra os resultados das ligaçães cruzadas de um péptido RGD a locais discretos na subunidade beta (GPIIIa) de um receptor de adesão de Integrina. 0 péptido RGD marcado com 125I, Fn-7 (20^\), foi ligado às plaquetas (6 x 108/ml) durante 45 minutos a 222C, e ligado de modo cruzado com BS^ (0,2 mM). As formas de fragmentação após proteólise foram analizadas por SDS--PAGE (Laemmli, Nature, 227:680 (l970)_7 e autoradiografia. A zo, na 1 é uma análise SDS-PAGE típica (7,5$ de gel, condições não re dutoras), mostrando a predominância das ligações cruzadas de 1 nc ^I-Fn-7 à subunidade beta (GPIIIa) e as suas ligações cruzadas em menor quantidade à subunidade alfa (GPIIb) nas plaquetas estimu ladas por trombina. As zonas 2-7, bandas de GPIIIa:Fn-7 foram re tiradas dos geles, sujeitas a proteólise e depois analisadas por SDS-PAGE (15$ de geles, condições redutoras). Para as zonas 2-5 as bandas GPIIIA:Fn-7 foram retiradas e realizaram-se digestões com proteose V/—8 de porções de gel como se descreve em Cleveland et al.f J. Biol. Chem., 252:1102 (1977).

As zonas 2 e 4 são os complexos intactos GPIIIa:Fn-7 de células estimuladas e não estimuladas por trombina, respeetivamen, te.

As zonas 3 e 5 são os digeridos de protease 1/8 (2 mg/ml) de células estimuladas e não estimuladas, respectivamente.

Para as zonas 6 e 7, extraíu-se o GPIIIa:Fn-7 de porções de gel em SDS 2$, 0,2 M Tris, pH 7,8, precipitou-se com acetona 80$ e depois digeriu-se com quimotripsina. A zona 6 é o GPIIIa- -Fn-7 intacto. A zona 7 é o GPIIIa-Fn-7 após digestão com 20 ja.g de quimotripsina durante lha 22SC. Note-se que nenhuma ligação no péptido é susceptível à protease \l8. Se a ligação peptídica 125 tirosil-glicil no I-Fn-7 fosse clivada pela quimotripsina, a radioactividade do resíduo de tirosina manter-se-ía ligada de modo cruzado à GPIIIa através do resíduo de lisina. -7- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 A Figura 3 ilustra resíduos dos locais da ligação cruzada do RGD na porção NH9-terminal de 34 kDa da subunidade beta (GPIIIa) 125 1 0 I-Fn-7 foi ligado de modo cruzado às plaquetas, e as células intactas foram então digeridas com quimotripsina (0,5 mg/ml durajn te 4 horas a 22SC). As células foram recolhidas por centrifugação e analisadas em SDS-PAGE (10% de gel sob condiçães redutoras). 125

As zonas 1 e 2 mostram a posição do péptido I-Fn-7 liga do de forma cruzada a plaquetas baseadas na autoradiografia sem e com digestão com quimotripsina, respectivamente. As zonas 3-8 são "imunoblots" destas plaquetas após transferência para membranas PVDF. As zonas 3, 5 e 7 são de plaquetas não digeridas e as zonas 4, 6 e 8 são de plaquetas digeridas por quimotripsina. Os "imunoblots", desenvolvidos com conjugados de peroxidase de rábano silvestre, foram sondados com um anticorpo monoclonal para o GPIIb-IIIa (zonas 3-4), com um anticorpo monoclonal (22C4) para o GPIlia /"Ginsberg et al., 3. Biol. Chem. , 262:5437 (l987)_J7, (zonas 5 e 6) e com um anticorpo anti-péptido preparado para uma região (unidades aminoácido 636-654) nas regiães COOH-terminais do GPIIIa (zonas 7 e 8). A Figura 4 ilustra a localização da ligação cruzada RGD dentro da subunidade beta (GPIIIa). 0 diagrama ilustra os vários fragmentos proteolíticos do GPIIIa:Fn-7 isolado, as suas sequências de aminoácidos Nh^-terminais determinadas e a sua localização na estrutura do GPIIIa conhecida. No passo 2, a localização do fragmento de 34 kDa NH^-terminal é baseada na clivagem quimo-tríptica de plaquetas intactas (Ver Figura 2). Extraíu-se o GPIIIa :Fn-7 dos geles e concentrou-se como se indica na Figura 2. Solu-bilizou-se GPIIIa:Fn-7 em 1% SDS, PBS, pH 7,3, e digeriu-se depois com quimotripsina numa razão substrato/enzima de 1:1 (p/p), durari te 24 h a 228C. As amostras foram fervidas para inactivar a enzi. ma e depois aplicaram-se a uma coluna C-18 de HPLC de fase inversa e equilibrou-se com ácido trifluoroacético 0,1^ o ditiotreitol 10^aM. Os páptidos foram eluídos com um gradiente de acetonitri-lo contendo ácido trifluoracêtico Qt0Q% e ditiotreitol 10M, Os picos radioactivos foram misturados, concentrados e separados por SDS-PAGE usando 15% de gel sob condiçães redutoras. 0s geles fo- -8- 70 038 5CR 0254-SCRF 165.1 ram transferidos para membranas Pl/DF como se descreve para análise sequencial /"Matsudaira, 3, Biol. Chem», 262:10035 (l987)__7 e depois autoradiografados. As bandas radioactivas, a 23 e 14 kDa do digerido quimotriptico (Passo 3) e a 10 e 8 kDa do digerido da protease V8 (Passo 4) foram isoladas e sujeitas a análise sequencial do terminal NHg num sequenciador em fase gasosa de Applied Biosystem Modelo 475A. Os tamanhos dos fragmentos e as posiçães dos resíduos do terminal de cada fragmento são desenhados à escala relativamente ao GPIIIa. Os triângulos abertos representam locais de glicosilação potenciais, X nas sequências de amino-ácidos indicam resíduos não determinados e a barra grossa indica a localização na região de ligação cruzada RGD. A Figura 5 ilustra os resultados obtidos por cromatogra-fia de afinidade de RGD de plaquetas incubadas na ausência (zonas 1 e 2) e presença (zonas 3 e 4) de quimotripsina. Após incubação, as plaquetas foram solubilizadas em octilglucosídeo e fizeram-se passar numa coluna de afinidade RGD substancialmente como se descreve em Pytela et al., Science, 231:1559 (1986) e Lam et al., 3« Biol Chem., 262:947 (1987). 0 material que passou (zonas 1 e 3) e o material ligado (zonas 2 e 4) foram analisados por SDS--PAGE (7% de gel, condiçães não redutoras). 0s geles foram trans feridos para membranas PVDF e depois sondados com o anticorpo mo-noclonal anti-GPIIIa, 22C4. A Figura 6 ilustra as sequências de aminoácidos deduzidas retiradas das referências Fitzgerald et al., 3, Biol. Chem., 262s :3926 (1987), Kishimoto et al., Cell, 48:681 (1987), Argraves et al. , 3»_Call Biol, 105:1183 (1987), Tamkun et al., Cell, 46:271 (1986) e DeSimone et al., 3. Biol. Chem., 263:5333 (1988) e foram alinhadas pelo programa de computador GAP e PRETTY. Devereux et al,, University of Wisconsin, Seguence Analysis Softuiare Packaoe 1987. A sequência de consenso requer que pelo menos quatro das cinco sequências comparadas se ajustem. 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 -9-

Descrição detalhada do invento A. Definiçães

Resíduo aminoâcido: os resíduos aminoácidos que aqui se descrevem estão preferivelmente na forma isomérica "L". Contudo os resíduos na forma isomárica "D" podem substituir qualquer resíduo aminoâcido L, desde que a propriedade funcional desejada seja retida pelo polipêptido. Nf^ refere-se ao grupo amino livre presente na extremidade amino do polipêptido. CQOH refere-se ao grupo carboxilico livre presente na extremidade carboxilo do poli. péptido. Para se manter a nomenclatura convencional dos polipépti dos, 3. Biol. Chem., 243:3557-59 (1969), as abreviaturas para os resíduos aminoâcido estão indicadas na Tabela de Correspondências seguinte: TABELA DE CORRESPONDÊNCIA SÍMBOLO AMINOÂCIDO 1 letra 3 letras Y Tyr tirosina G Gly glicina P Phe fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser serina I Ile isoleucina L Leu leucina T Thr treonina V Mal valina P Pro prolina K Lis lisina H His histidina Q Gin glutamina E Glu ácido glutamico W T rp triptofano R Arg arginina -10- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1

AMINOACIDO

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA SÍMBOLO 1 letra 3 letras ácido aspártico asparagina cisteina

J

Deve notar-se que todas as sequências ds resíduos amino-ácido são aqui representadas por fórmulas cuja orientação da esquerda para a direita está na direcção convencional do terminal amino para o terminal carboxilo. Além disso, deve notar-se que um traço no início ou fim de uma sequência de resíduos aminoáci-do indica uma ligação peptidica a uma outra sequência de um ou mais resíduos aminoácido, ou a um grupo IHg do terminal amino ou a um grupo COOH do terminal carboxilo.

Polipéptido e péptido: Polipéptido e péptido são termos aqui utilizados intermutalvelmente para designar uma série linear de não mais do que 90 resíduos aminoácido ligados uns aos outros por ligaçSes peptídicas entre os grupos alfa-amino e carboxilo de resíduos adjacentes.

J D Asp N Asn C Cys lucleosido e núcleo tido : É uma unidade monomérica de ADI ou de ABN consistindo de uma porção açúcar (pentose), dum fosfato e de uma base heterocíclica azotada. A base está ligada à porção açúcar por um carbono de glicásido (carbono 1' da pentose) e essa combinação de base e de açúcar é um núcleo sido. Quando o nucleó-sido contem um grupo fosfato ligado a uma posição 3’ ou 5' da pentose e designado por nucleótido.

Par de Base (pb): É uma associação, por uma ligação de hidrogénio, de adenina (A) com timina (T) ou de citosina (C) com guanina (G) numa molécula de ADI de cadeia dupla.

Beceptor: Beceptor e proteína receptora são termos que são aqui utilizados para designar uma molécula proteína biologicamente activa que se liga especificamente a (ou com) outras molé cuias, designadas por ligandos, para formar um complexo proteico -11- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 receptor-liganào.

Ligando ; Ligando refere-se a uma molécula que contem uma porção estrutural que se liga, por uma interacção específica, a uma proteína receptora particular. Um ligando e um receptor representativos são o fibrinògénio e a glicoproteína GPUb-IIIa de plaquetas. B. Polipéptido s

Um polipéptido do presente invento tem pelo menos cerca de 11, e não mais do cerca de 90 resíduos aminoacido . Adicionalmente, um polipéptido sujeito é caracterizado por ter uma sequência de resíduos aminoácido homóloga em relação a, i.e., derivada da região funcional da região de ligação RGB do GPIIIa entre os resíduos 110-170 como se mostra na Pigura 1.

Em concretizaçSes preferidas, um polipéptido sujeito tem pelo menos cerca de 60 resíduos aminoácido e tem uma sequência de resíduos aminoácido que corresponde e é de preferência idêntica à fórmula que se mostra na Tabela 1.

Tabela 1 Fórmula

Designaç3o Sequência de substituintes aminoácido

Pl p2 P 3

DYPl/DI YYLMDLS YSMKDDLWSIQNLGTKL-ATQMRKL.TSNLRIGFGAFVDKPWSPYMYISPPE DYPIDLYYLMDLSYSMKDDLENl/KSLGTDL- MNEMRRITSDFRIGFGSFl/EKTl/MPYISTTP GYPIDLYYLMDLSYSMLDDLRNVKKLGGDL- LRALNEITESGRIGFGSFVDKTl/LPFVNTHP

Noutra concretização preferida, um polipéptido sujeito tem uma sequência que inclui uma sequência de resíduos aminoácido representada pela fórmula: -12- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 -DDSKNFSiqVRqVEDYPt/-, -EDYPVDIYYLM-, -LMDLSYSMKDDL-, -DDLWSIQNLGTKL-, -TKLATQMRKLTS-, -LTSNLRIGFGAFÍ/D-, -AFl/DKPVSPYMYIS-, ou -YISPPEALENPCYD-. E exemplo desta concretização um polipéptido com uma sequência de substituintes aminoácido que corresponda e que é preferencialmente idêntico h fórmula que se mostra na Tabela 2.

Tabela 2

Designação Origem da se, da fórmula quência no GPIIIa Sequência de resíduos aminoâcidos

p4 095-112 DDSKNFSIQVRQVEDYPV p5 108-118 EDYPl/DI YYLM pó 117-128 LMDLSYSMKDDL p7 126-138 DDLWSIQNLGTKL p8 136-147 TKLATQMRKLTS p9 145-158 LTSNLRTGFGAFl/D plO 155-168 AFl/DKPl/SPYMYIS pll 166-179 YISPPEALENPCYD

Em concretizações preferidas um polipéptido sujeito á ai_n da caracterizado pela sua capacidade de inibir competitivamente a adesão celular mediada pela Integrina tal como a agregação das plaquetas, a adesão de fibroplastos a uma matriz e similares. Is, to é, um polipéptido sujeito preferido é capaz de inibir competitivamente a ligação da Integrina a um ligando nativo, isto é, um ligando a que a Integrina se liga in vivo.

Em concretizações preferidas um polipéptido sujeito é aijn da caracterizado pela sua capacidade, quando usado num inóculo, em induzir a produção de anticorpos policlonais ou de anticorpos mo-noclonais do presente invento. *•13·* 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1

Os resíduos aminoácido presentes num polipéptido sujeito, para além de uma sequência correspondente à fórmula acima descrita, podem ser quaisquer resíduos que não afectem materialmente as características básicas e novas de um polipéptido tal como as que aqui se discutem. Tais resíduos adicionais são usualmente adicio nados a uma ou ambas as extremidades de um péptido referido e podem incluir repetições ou repetições parciais de uma sequência peptídica referida ou resíduos contíguos da sequência da proteína da subunidade beta da Integrina.

Um polipéptido sujeito tem .uma sequência de resíduos aminoácido que corresponde a uma porção da região de ligação RGD de uma sequência da subunidade beta da Integrina. Como tal, um polipéptido do presente invento não necessita de ser idêntico à sequência de resíduos aminoácido da porção de ligação RGD de uma subunidade beta da Integrina, desde que ele seja capaz de exibir pelo menos uma das características anteriores preferidas de um polipéptido sujeito. Como tal, um polipéptido sujeito pode ser submetido a várias modificações, tais como, inserções, eliminações e substituições, quer conservativas quer não conservativas, quando tais mudanças trouxerem certas vantagens para o seu uso.

As substituições conservativas são aquelas onde um resíduo aminoácido é substituído por outro resíduo biologicamente semelhante, São exemplos de substituições conservativas, a substituição de um resíduo hidrofóbico tal como a isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro ou a substituição de um resíduo po. lar por outro tal como entre a arginina e a lisina, entre os ácidos glutâmico e aspártico ou entre a glutamina e asparagina e similares. 0 termo "substituição conservativa"também inclui o uso de um aminoácido substituído em vez de um aminoácido original não substituído, desde que tal polipéptido revele também a actividade ligante, ou de inóculo, necessária.

Quando um polipéptido do presente invento tem uma sequê^n cia que não é idêntica à sequência de uma subunidade beta da Inte grina por se terem efectuado uma ou mais substituições, conservativas ou não conservativas, normalmente substituem-se não mais do que cerca de 20$ e mais habitualmente não mais que 10$ de resíduos -14- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 aminoâcido. Uma excepção é quando os resíduos adicionais são adji cionados a qualquer das extremidades para efeitos de se dispôr de um "ligante" através do qual os polipêptidos deste invento podem ser convenientemente fixados a uma marca ou a uma matriz sólida, ou a um veículo antigênico. Descrevem-se aqui seguidamente as marcas, matrizes sólidas e veículos que podem ser lesados com os polipêptidos deste invento.

Os ligantes de resíduos aminoácido são normalmente pelo menos um resíduo e podem ser 40 ou mais resíduos mais vulgarmente 1 a 10 resíduos. Os resíduos aminoácido típicos usados para liga ção são a tirosina, a cisteína, a lisina, os ácidos glutâmico e aspártico ou similares. Um ligante representativo é um tripépti-do Cys-Gly-Gly (CGG-) ligado a extremidade amino do polipéptido sujeito pelo terminal carboxilo do resíduo glicina do ligante, tal como se mostra no Exemplo 2. Adicionalmente, uma sequência polipeptídica deste invento pode diferir da sequência natural através da modificação da sequência por acilação do terminal NH2, por exemplo acetilação ou amidação com ácido tioglicólico, por ami dação do terminal carboxilo, por exemplo com amónia, metilamina, etc..

Quando acoplado a um veículo através de um ligante para formar o que se conhece na arte por conjugado transportador-hapte no, um polipéptido sujeito é capaz de induzir anticorpos que imu-norreagem com a subunidade beta da Integrina a qual corresponde a sequência de resíduos aminoácido do polipéptido. De acordo com o princípio já bem estabelecido de reactividade imunológiGa cruzada, o presente invento contempla assim variantes, relacionadas antiqe nicamente, de um polipéptido com uma sequência de resíduos aminoácido correspondente a um polipéptido com uma fórmula que se mostra na Tabela 1 ou 2. Uma variante relacionada antigenicamente é um polipéptido que imunorreage com um anticorpo induzido por um polipéptido de acordo com a fórmula que se mostra na Tabela 1 ou 2.

Um polipéptido sujeito pode ser sintetizado por qualquer técnica conhecida dos peritos na arte dos polipeptídeos. Um resu- -15- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 mo excelente das muitas técnicas disponíveis pode ser encontrado em 3.M. Steu/ard e O.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, e 0. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983 para síntese de péptidos em fase sólida e E. Schroder e K. Kubke, "The Peptides", l/ol. 1, Academic Press, (Nem York), 1965 para síntese clássica em solução. C. Inóculo

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Noutra concretização, um polipéptido deste invento, de preferência um péptido correspondendo à fórmula qué se mostra na Tabela 1 ou 2 ou uma variante antigenicamente relacionada dai derivada, é utilizado numa composição de diluente aquoso farmaceuti camente aceitável de modo a formar um inóculo que, quando administrado numa quantidade eficaz, é capaz de induzir anticorpos que imunorreagem com uma subunidade beta da Integrina à qual corresponde a sequência de resíduos aminoácido do polipéptido. A palavra "inóculo" nas suas várias formas gramaticais é aqui usada para descrever a composição contendo um polipéptido deste invento como um ingrediente activo, para a preparação de ajn ticorpos contra uma subunidade beta da Integrina.

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Quando se usa um polipéptido para induzir anticorpos, deve entender-se que o polipéptido pode ser usado isoladamente ou ligado a um transportador na forma de um conjugado, ou como um pci límero polipeptídico, mas, para facilidade de expressão, as várias concretizações dos polipéptidos deste invento são colectivamen. te aqui referidas pelo termo "polipéptido'.' e pelas suas várias fojç mas gramaticais.

Como já anteriormente se referiu podem adicionar-se um ou mais resíduos aminoácido adicionais às extremidades amino ou car-boxilo do polipéptido para auxiliar a ligação do polipéptido a um transportador. Os resíduos cisteína adicionados às extremidades amino ou carboxilo do polipéptido revelaram ser particularmente úteis na formação de conjugados através de ligações de dissulfurjj to. Contudo, podem usar-se também outros métodos bem conhecidos -16- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 no ramo para preparar conjugados. Processos de ligação adicionais exemplares incluem o uso dos produtos de reacção de adição de Michael, dialdeldos tais como o glutaraldeido, Klipstein et al., 3. Infect. Pis., 147, 318-326 (1983) e similares, ou o uso de tecnologia da carbodiimida, tal como o uso do carbodi-imida solúvel em água para formar ligaçães amida com o transportador. Para uma revisão da conjugação de proteínas ou acoplamento através de grupos funcionais activados, ver Aurameas, et al., Scand. 3. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978),

Os veículos úteis são bem conhecidos na arte e são geral-mente eles próprios proteínas. São exemplos de tais veículos, a hemocianina de lapa Fissurela (KLH) a edestina, a tiroglobulina, albuminas tal como a albumina de soro de bovino (BSA) qu a albumina de soro humano (HSA), os glóbulos vermelhos tais como os eri trocitos de carneiro (SRBC), a toxóide do tétano, a toxóide da có lera bem como poliaminoácidos tais como poli(D-lisina: ácido D--glutâmico) e similares. A escolha do veiculo está mais dependente do uso último do inóculo e está baseada em critérios não particularmente envolvidos no presente invento. Por exemplo, deverá seleccionar-se um veiculo que não gere uma reacção secundária no animal particular a ser inoculado. 0 presente invento contém uma quantidade eficaz e imunogjé nica de um polipéptido deste invento, tipicamente na forma de um conjugado ligado a um transportador. A quantidade eficaz de poli, péptido ou de proteína por dose unitária depende, entre outros factores, da espécie de animal inoculado, do peso do corpo do ani mal e do regime de inoculação escolhido, como é bem conhecido na arte. Os inóculos contêm tipicamente concentraçães de polipéptido ou de proteína de cerca dB 10 microgramas a cerca de 500 miligramas por inóculação (dose), preferencialmente, cerca de 50 microgramas a cerca de 50 miligramas por dose. 0 termo "dose unitária" tal como é utilizado em relação ao inóculo do presente invento, refere-se a unidades fisicamente discretas, adequadas como doses unitárias para animais, cada uni- -17- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 dade contendo uma quantidade predeterminada de material activo, calculada para produzir o efeito imunogênico desejado, em associação com o diluente requerido; isto é» transportador ou veiculo. As especificaçSes para a nova dose unitária de um inóculo do presente invento são ditadas por, e são directamente dependentes (a) das caracteristicas únicas do material activo e do efeito imu nológico particular a atingir e (b) das limitaçães inerentes na arte da preparação de composiçSes deste material activo para uso imunológico em animais, tal como aqui se descreve em pormenor, sendo estes aspectos do presente invento. |h· lc

Os inóculos são tipicamente preparados a partir dos conj gados de polipéptido sólidos secos dispersando o conjugado de pol pêptido num diluente ou veículo fisiologicamente tolerável (aceitável) tal como água, soro ou soro tamponizado com fosfato de modo a formar uma composição aquosa.

Estes diluentes são bem conhecidos na especialidade e são discutidos, por exemplo, em Reminoto^s Pharmaceutical Sciences. 16§. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) nas págs. 1465-1467.

Os inóculos podem também incluir um adjuvante como parte do diluente. Os adjuvantes tal como o adjuvante de Freund comple to (CFA), adjuvante de Freund incompleto são materiais bem conhecidos no ramo, e estão disponíveis comercialmente de várias fontes. D. Anticoroos anti-páptido policlonais e monoclonais 0 termo "anticorpo" nas suas várias formas gramaticais é aqui usado para designar moléculas de imunoglobulina e porçães imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um local de combinação de um anticorpo ou um paratopo. São exemplos de moléculas de anticorpo as moléculas de imunoglobulina intactas, as moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e aquelas porçães de uma molécula de imunoglobulina que contêm o paratopo, incluindo as porçães conhecidas na arte como Fab, Fab’, Fíab'^ e F(v). -18- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1

Um"local de combinação de um anticorpo" é a porção estrutural de uma molécula de anticorpo compreendendo regiães variáveis e hipervariáveis de cadeia leve ou pesada que se ligam especifica mente (imunorreagem) com um antigênico. 0 termo imunorreage nas suas várias formas significa ligação entre uma molécula contendo um determinante antigênico e uma molécula contendo um local de com binação de anticorpo tal como uma molécula de anticorpo completa ou uma sua porção. 0 termo "determinante antigênico" refere-se à porção estru tural real do antigénio que se liga imunologicamente a um local de ligação do anticorpo. 0 termo também é usado intermutavelmen-te com "epítopo". 1. Anticorpos policlonais

Um anticorpo policlonal do presente invento imunorreage com um polipéptido sujeito, preferivelmente um polipêptido corres. pondendo em relação à sequência de resíduos aminoácido a uma fórmula que se mostra na Tabela 1 ou 2. Um anticorpo policlonal sujeito é ainda caracterizado por não imunorreagir substancialmente com qualquer subunidade alfa da Integrina ou com um polipéptido com uma sequência de resíduos aminoácido idêntica aos 50 resíduos do terminal carboxilo da Integrina à qual corresponde a sequência de resíduos aminoácido do polipéptido sujeito.

Um anticorpo policlonal preferido é caracterizado por ter uma capacidade de imunorreagir com uma subunidade beta da Integri na e de inibir a capacidade da Integrina de se ligar especifica-mente ao seu ligando por interacção com uma proteína contendo RGD.

Como tal, um anticorpo policlonal preferido que imunorrea^ ge com um polipéptido sujeito cuja sequência é derivada da região de ligação RGD do GPIIIa, tem a capacidade de inibir os acontecimentos mediados pelo complexo ligando-receptor fibrinogénio-GPIIb--Illa, tais como a agregação de plaquetas e a formação de trom-bos.

Um anticorpo policlonal do presente invento é produzido -19- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 tipicamente por imunização de um mamífero com um inóculo do presente invento, de preferência um inóculo contendo um péptido cor respondendo a uma fórmula que se mostra na Tabela 1 ou 2, e como tal induz no mamífero moléculas de anticorpo possuindo a imunoes-pecificidade de polipêptido apropriada. As moléculas de anticorpo são então recolhidas do mamífero e isoladas até ao grau deseja, do por técnicas bem conhecidas tais como, por exemplo, cromatogra fia de imunoafinidade usando o polipêptido imunizante na fase sólida. 0 anticorpo monoclonal assim produzido pode ser usado em, inter alia, métodos e sistemas de diagnóstico do presente invento para distinguir as plaquetas activadas e não activadas ou as célu. las nucleadas e em métodos terapêuticos com o objectivo de modular a adesão celular, por exemplo, inibindo a adesão de plaquetas. 2. Anticorpos monoclonais

Um anticorpo monoclonal do presente invento é caracteriza. do por imunorreagir com um epltopo formado pela região de ligação RGD de uma subunidade beta da Integrina que é homóloga dos resíduos 110-170 do GPIIIa. Preferencialmente, um anticorpo monoclo-nal suj8ito é ainda caracterizado ,por imunorreagir com um polipêptido sujeito de preferência um polipêptido correspondente a uma fórmula que se mostra na Tabela 1 ou 2.

Um anticorpo monoclonal preferido é também caracterizado por ter a capacidade de inibir a ligação específica entre o GPIIIa seu e o/ligando fibrinogénio tal como anteriormente se descreveu para os anticorpos policlonais.

Como tal, numa concretização do presente invento contempla -se um anticorpo monoclonal compreendendo moléculas de anticorpo que imunorreagem a) com o GPIIIa e b) com um polipêptido correspondente h fórmula: DYPl/DIYYLMDLSYSMKDDLWSIQNLGTKLATQMRKLTSNLR-IGFGAFVDKPUSPYMYISPPE.

Uma concretização relacionada contempla um anticorpo mono, clonal compreendendo moléculas de anticorpo monoclonal que imunojr reagem a) com a subunidade beta da Integrina LeuCam e b) com um polipêptido correspondente à fórmula: GYPIDLYYLMDLSYSMLDDLRNVKKLG- -20- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 GDLLRALNEITESGRIGFGSFl/DKTVLPFVNTHP.

Outra concretização relacionada contempla um anticorpo monoclonal compreendendo moléculas de anticorpo que imunorreagem a) com a subunidade beta da Integrina VLA e b) com um polipépti-do correspondente à fórmula: DYPIDLYYLMDLSYSMKDDLEIWKSLGTDLMNE-MRRITSDFRIGFGSFVEKTVMPYISTTP. A expressão"anticorpo monoclonal" nas suas várias formas gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contém apenas uma espécie de local de combinação de anticorpo capaz de imunorreagir com um antigênio particular. Uma composição de anticorpo monoclonal revela assim, tipicamente, uma afinidade de ligação única por qualquer antigênio com o qual imunorreja ge. Uma composição de anticorpos monoclonais pode deste modo coji ter uma molécula de anticorpo possuindo uma pluralidade de locais de combinação de anticorpo, cada um imunoespecífico para um anti-génio diferente, por exemplo, um anticorpo monoclonal biespecífi-co.

Um anticorpo monoclonal é tipicamente composto por anticorpos produzidos por clones de uma célula única designada por hi. bridoma que segrega (produz) apenas um tipo de molécula de anticor, po. A célula de hibridoma é formada por fusão de uma célula produtora de anticorpos com um mieloma ou com outra linha celular auto-perpetuante. Tais anticorpos foram inicialmente descritos por Kohler e Milstein, Mature 256:495-497 (1975), descrição que é aqui incorporada para referência. 3. Métodos para produção de um anticorpo monoclonal 0 presente invento contempla um processo de preparação de um anticorpo monoclonal que (a) imunorreage con um polipêpti-do sujeito e (b) com uma subunidade beta da Integrina à qual corresponde a sequência de resíduos aminoácido. 0 método compreende os passos seguintes: (a) imunização de um animal com uma subunidade beta da Integrina ou com um polipéptido sujeito. Isto é tipicamente realizado por administração de uma quantidade imunologicamen- -21- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 te eficaz» isto é> uma quantidade suficiente para produzir uma imuno-resposta» do imunogénio a um mamífero imunologicamente competente. De preferência, o mamífero é um roedor tal como um coelho, um ratinho ou uma ratazana, 0 mamífero é então mantido por um período de tempo suficiente para que o mamífero produza células segregando moléculas de anticorpo que imunorreagem com o imunogénio. (b) Prepara-se então uma suspensão de células produtoras de anticorpos retiradas do mamífero imunizado. Isto é tipicamente realizado por remoção do baço de um mamífero e por separação mecânica das células de baço individuais num meio fisiologicamen-te toleráv/el, usando métodos bem conhecidos na arte. (c) As células produtoras de anticorpos em suspensão são tratadas com um agente de transformação capaz de produzir uma linha celular transformada ("imortalizada"). °s agentes de transformação e o seu uso para produzir linhas celulares imortalizadas são bem conhecidas na arte e incluem vírus de ADN, tais como o Ví rus de Epstein Bar (EBV), o Vírus Simian 4D (SV40), Vírus Polioma e similares, Vírus de RNA tais como o Vírus da leucemia dos ratinhos Moloney (Mo-MuLV), Vírus do Sarcoma de Rous e similares» células de mieloma tais como P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4 e similares.

Em concretizaçães preferidas, o tratamento com o agente de transformação resulta na produção de um hibridoma por fusão de cé lulas de baço suspensas com células de mieloma de ratinho de uma linha celular adequada através do uso de um promotor de fusão adei quado. A razão preferida é de cerca de 5 células de baço por cé-lula de mieloma. Usa-se um volume total de cerca de 10 espleno-citos. A linha celular usada deverá .ser de preferência da tipo chamado "resistente a drogas", de modo a que as células de mieloma não fundidas não sobrevivam num meio selectivo, enquanto que os híbridos sobrevivem. A classe mais comum é a das linhas celulares resistentes à 8-azaguanina, à qual falta a enzima hipoxanti naguanina-fosforibosiltransferase e como tal não serão suportadas por um meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). Prefere- -22- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 -se também geralmente que a linha celular de mielomas usada seja do tipo "não-segregante", no aspecto em que não produza ela própria qualquer anticorpo, embora se possam usar tipos segregantes. Em certos casos, contudo, pode preferir-se linhas de mielomas segregantes. Embora o promotor de fusão preferido seja o polietile no glicol com um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 4000 (disponível comercialmente como PEC 1000, etc.), podem empre gar-se outros promotores de fusão conhecidos na arte. (d) As células transformadas são então clonadas, prefe rencialmente de um modo monoclonal. A clonação é preferencialmen, te realizada num meio de cultura de tecidos que não suporta células não-transformadas. Quando as células transformadas são hibri. domas, isto é tipicamente realizadas por diluição e cultura, em re cipientes separados, da mistura de células de baço não fundidas, das células de mieloma não fundidas e das células fundidas (hibri domas), num meio selectivo que não suporte as células de mieloma não fundidas, durante um tempo suficiente para permitir a morte de células não fundidas (cerca de uma por semana). A diluição pode ser do tipo limitante, na qual o volume de diluente é estatisticamente calculado para isolar um certo número de células (por ex. 1-4) em cada recipiente separado (por ex. cada cavidade de uma placa de microtitulação). 0 meio ê tal (por ex. meio HAT) que não suporta a linha celular de mieloma não fundido resistente a drogas (por ex. resistente à 8-azaguanina). (e) 0 meio de cultura de tecidos dos transformantes clo-nados é avaliado para determinar a presença de moléculas de anticorpo segregadas que imunorreagem com o imunogénio e o seu poli-péptido sujeito ou a subunidade beta da Integrina correspondente. (f) Assim que se identifica o transformante desejado no passo (e), este é seleccionado e cultivado num meio de cultura de tecidos adequado durante um período de tempo adequado, a que se segue a recuperação do anticorpo desejado do sobrenadante da cultura. 0 meio adequado e o tempo de cultura adequado são conhecidos ou são facilmente determinados.

Para produzir uma concentração maior de anticorpo monoclo -23- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 nal ligeiramente menos puro, o hibridoma desejado pode ser injec-tado em ratinhos, de preferência islánhos consanguíneos ou semi-con-sanguineos. 0 hibridoma causará a formação de tumores produtores de anticorpos após um tempo de incubação adequado, o qual resulta, rá numa concentração alta do anticorpo desejado (cerca de 5-20 mg/ ml) na corrente sanguínea e no exudato peritoneal (ascite) do ratinho hospedeiro.

Os meios úteis para preparação destas composiçães são ambos bem conhecidos na arte e são comercialmente adquiríveis e inclu em meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e similares. Um meio sintético exemplificativo é o meio essencial mínimo de Dulbecco /""DMEM; Dulbecco et al., l/irol. 8:396 (l959)_7 suplemejn tado com 4,5 g/l de glucose, 20 mm de glutamina e 20$ de soro de vitelo fetal. Uma estirpe exemplar de ratinho consanguíneo é a Balb/c.

Um anticorpo monoclonal do presente invento pode também ser ainda purificado por métodos bem conhecidos de cromatografia de imunoafinidade usando na fase sólida um polipéptido sujeito com o qual o anticorpo imunorreage.

Pode usar-se um anticorpo monoclonal produzido pelo método anterior, por exemplo, em modalidades de diagnóstico e terapia em que se pretende a formação de um produto imunorreacção da sub-unidade beta da Integrina. 0s produtos de reacção incluem, por exemplo, um produto da imunorreacção contendo GPIIIa. E. Hibridomas e métodos de preparação

Os hibridomas do presente invento são caracterizado por terem a capacidade de produzir um anticorpo monoclonal sujeito.

Um hibridoma preferido do presente invento é caracterizado por produzir moléculas de anticorpo que também imunorreagem com uma citoadesina, de preferência GPIIIa. 0s métodos para produzir hibridomas produtores (segregan-tes) de moléculas de anticorpos possuindo uma imunoespecificidade desejada, isto é, possuindo a capacidade de imunorreagirem com uma proteína particular, com um epitopo identificável ou numa pro -24- 70 03Β SCR 0254-SCRF 165.1 teína particular e/ou com um polipéptido, são bem conhecidos na * arte. E particularmente aplicável a tecnologia dos hibridomas descrita por Niman et al·, Proc. Natl. flcad. Sei. USA, 80:4949--4953 (1983), e por Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981), cujas descriçães são aqui incorporadas para referência. F. Métodos e composições terapêuticas

Um polipéptido sujeito pode ser usado para modular a adesão irj vivo de células exprimindo a subunidade beta da Integrina a qual corresponde o polipéptido.

Por exemplo, um polipéptido sujeito correspondendo à fórmula pl pode ser usado numa composição farmaceuticamente aceitável que, quando administrada a um sujeito humano numa quantidade eficaz, é capaz de inibir competitivamente a agregação de plaquetas. Essa inibição é suposta resultar num decréscimo da velocida de de formação de trombos.. Como tal, a administração iri vivo de um polipéptido sujeito pode ser usado para modular qualquer resposta fisiológica iniciada por adesão tal como a coagulação e algumas respostas inflamatórias.

Noutra concretização, a agregação das plaquetas pode ser inibida por administração intravenosa de uma quantidade eficaz de uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um anticorpo policlonal sujeito que imunorreage com um polipéptido correspondendo a uma porção de região de ligação RGD de GPIIIa, tal como um polipéptido de acordo com a fórmula pl, ou fórmula que se mostra na Tabela 2.

Um método preferido de modulação da adesão de plaquetas contempla a administração de uma quantidade inibidora da agregação de plaquetas de um anticorpo monoclonal sujeito que imunorre,a ge com a região de ligação RGD (resíduos 110-170) do GPIIIa. Mais preferencialmente, o anticorpo monoclonal usado num método terapêutico de inibição da agregação de plaquetas é ainda caracteriza. do por imunorreagir com um polipéptido correspondendo à fórmula pl, ou às fórmulas que se mostram na Tabela 2. -25- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1

No que diz respeito h utilização de anticorpos policlo-nais e monoclonais em terapia para modular os acontecimentos mediados pela adesão celular, o presente invento também contempla o uso de um polipéptido sujeito como antídoto para neutralizar os efeitos modulatérios dos anticorpos terapeuticamente administrados.

Nesta concretização, o reagente terapêutico contendo o ari ticorpo anti-trombético é inicialmente administrado a um paciente para modular a adesão celular, agregação plaquetária ou formação de trombos. Como tal, depois do inicio de uma complicação hemorrágica, ou quando se torna necessário neutralizar os efeitos anti -trombóticos do anticorpo administrado, administra-se uma quantidade de polipéptido sujeito que seja eficaz para imunorreagir com o anticorpo administrado e que assim neutraliza os efeitos modula dores do anticorpo. A escolha do polipéptido a administrar como antídoto depende do anticorpo a ser neutralizado, e requer que o polipéptido administrado tenha a capacidade de imunorreagir com o anticorpo administrado.

As composições contendo a molécula de polipéptido ou de anticorpo administradas têm a forma de soluções ou suspensões e, contudo, os polipêptidos podem também estar na forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação controlada ou pés. Em qualquer dos casos, as composições contenda o polipéptido contêm tipicamente cerca de 0,1 a cerca de 1,0 M de polipéptido como ingrediente activo, de preferência cerca de 1,0 a cerca de 10 milimolar (mM), enquanto as composições contendo as molê. cuias de anticorpo, contêm tipicamente cerca de 10^g/ml a cerca de 20 mg/ml de anticorpo como ingrediente activo, de preferência cerca de 1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml. A preparação de uma composição terapêutica que contenha polipêptidos ou moléculas de anticorpo como ingredientes activ/os é bem conhecida na arte. Tipicamente estas composições são prep.a radas como injectáveis, quer como soluções líquidas quer como sujs pensões, mas contudo podem preparar-se formas sélida^feidequadas pja -26- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 ra solubilização ou suspensão num liquido antes da injecção. A preparação pode também estar na forma de uma emulsão. 0 ingrediente terapêutico activo é muitas vezes misturado com excipientes que sejam farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo tal como é bem conhecido. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, eta-nol ou similares e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tampão que aumentem a eficácia do ingrediente activo.

Um polipéptido ou anticorpo pode ser formulado numa comp£ sição terapêutica na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis neutralizados. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipéptido ou da molécula de anticorpo) que são formados com ácido inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou fér, ricos, e de bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilami na, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e similares.

As composições terapêuticas contendo o polipéptido ou o anticorpo são convencionalmente administradas intravenosamente, por exemplo, por injecção de uma dose unitária, 0 termo "dose unitária" quando usado em referência a uma composição terapêutica do presente invento refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como doses unitárias para humanos, cada dose conteri do uma quantidade pré-determinada de material activo calculada p_a ra produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o di. luente requerido, isto é, veículo ou transportador.

As composições são administradas de uma forma compatível com a formulação da dosagem e numa quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a tra tar, da capacidade do sujeito de utilizar o ingrediente activo, e -27- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1

J do grau de inibição da ligação raceptor-ligando desejado. As quantidades precisas de ingrediente activo necessárias para administração dependem do julgamento do especialista e são caracterís ticas de cada indivíduo. Contudo, gamas de dosagem adequadas são da ordem de um a vários miligramas de ingrediente activo, por indivíduo, por dia, dependendo da via de administração. Os regimes adequados para a administração inicial e doses de reforço são tajn bém variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida por doses repetidas em intervalos de uma ou mais horas, por uma injecção subsequente ou outra administração. Alternativa mente, contempla-se uma infusão intravenosa continua suficiente para manter concentraçSes terapêuticamente eficazes no sangue. Pa ra um polipéptido sujeito, as concentraçães no sangue terapêutica mente eficazes estão na gama de cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM, de preferência cerca de 1,0 mM. As concentraçSes no sangue tera-peuticamente eficazes de moléculas de anticorpo do presente inverj to estão na gama de cerca de 0,1 ^M a cerca de 10 yuM, preferencialmente 1,0 yi*M. G. Sistemas de diagnóstico

J

Um sistema de diagnóstico na forma de um conjunto de diagnóstico do presente invento inclui, numa quantidade suficiente para pelo menos uma determinação, um polipéptido, um anticorpo p.o liclonal ou um anticorpo monoclonal do presente invento, como um reagente embalado separadamente. Incluem-se também tipicamente instruçães para utilização dos reagentes embalados. "Instruçães para uso" incluem tipicamente uma expressão tangível descrevendo a concentração de reagente ou pelo menos um parâmetro de determinação do método tal como as quantidades relativas de reagente e amostra a serem misturadas, períodos de tempos de manutenção das misturas reagente/amostra, temperatura, Gondi-çães tampão e idênticos.

Numa concretização, um sistema de diagnóstico para a determinação das plaquetas activadas numa amostra de fluido vascular contendo plaquetas, tal como sangue ou plasma, compreendendo uma embalagem contendo um anticorpo policlonal sujeito que imuno£ -28- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 reage com um polipéptido correspondendo à fórmula pl ou uma fórmula que se mostra na Tabela 2. Noutra concretização, um sistema de diagnóstico para a determinação de plaquetas acti\/adas numa amostra de fluido vascular contendo plaquetas» compreende uma embalagem contendo um anticorpo monoclonal sujeito que imunorrea-ge com um epltopo formado pela região de ligação RGD (resíduos 110-170) do GPIIIa e de preferência, que também imunorreage com * um polipéptido correspondente a fórmula pl ou a uma fórmula que se mostra na Tabela 2. Preferem-se ainda os conjuntos de diagnós. tico em que as moléculas de anticorpo dos anticorpos policlonais ou monoclonais estão ligados a uma marca.

Como tal» em eoncretizaçães preferidas, um sistema de diagnóstico do presente invento inclui ainda um marcador ou meio de detecção capaz de assinalar a formação de um complexo contendo as moléculas de anticorpo de um anticorpo policlonal ou monoclonal do presente invento. A palavra "complexo" tal como é aqui utilizada refere-se ao produto de uma reacção de ligação especifica tal como uma rea£ ção anticorpo-antigénio ou receptor-ligando. São exemplos de com plexos os produtos de uma imunorreacção.

Tal como usado aqui, o termo "marcador" e "meio de detec-ção" nas suas várias formas gramaticais referem-se a átomos e moléculas isolados que estão quer directa quer indirectamente envol. vidos na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Os marcadores ou meios de detecção in vivo são aqueles que são úteis dentro do corpo de um sujeito humano e . , 111T 99_ 67 186D 132T _ . incluem In, Tc, Ga, Re, e I. Qualquer marcador ou meio de detecção pode ser ligado ou incorporado numa proteína polipéptido ou molécula de anticorpo expressos que seja parte de um anticorpo ou de uma composição de anticorpos monoclonais do presente invento, ou pode ser usado separadamente, e esses átomos ou moléculas podem ser usados isoladamente ou em eonjunção com reagentes adicionais. Estes marcadores são eles próprios bem conhecidos na química de diagnóstico clínico e constituem uma parte deste invento apenas no que se refere à sua utilização com outros métodos e/ou sistemas proteicos novos. -29- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 A ligação dos marcadores, isto é, marcação de polipépti-dos e de proteínas é conhecida na arte. Por exemplo, as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radioisotopos fornecidos como componentes do meio de cultura. Ver, por exemplo, Meth. Enzvmol. , 73:3-46 (1981). As técnicas de conjugação ou acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas et al., Scand. 3. Immunol.» Vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978), Roduiell et al. Biotech, 3:889-894 (1984) e U.S. Pat. N9. 4 493 795.

Os sistemas de diagnóstico podem também incluir, de preferência numa embalagem separada, um agente de ligação específica. Um "agente de ligação específica" é uma entidade molecular capaz de se ligar selectivamente a uma espécie reagente do preseri te invento mas não é ela própria um produto de expressão de proteína, um polipéptido ou uma molécula de anticorpo do presente iji vento. Exemplos de agentes da ligação específica são as moléculas de anticorpo, as proteínas complemento ou os seus segmentos, a proteína A e similares. De preferência, o agente de ligação es. pecífico pode ligar-se a molécula de anticorpo ou pilipéptido des, te invento quando está presente como parte de um complexo.

Em concretizações preferidas o agente de ligação especifi ca está marcado. Contudo, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específica que não está marcado, o agente é tipicamente usado como meio ou reagente de amplificação. Nestas concretizações, o agente de ligação especifica marcado é capaz de se ligar especificamente aos meios de amplificação quando os meios de amplificação estão ligados a um complexo contendo as espécies reagentes.

Os conjuntos de diagnóstico do presente invento podem ser usados num formado "ELISA" para detectar a presença ou a quantida, de de plaquetas ligadas a fibrinogênio numa amostra de fluido cor; poral tal como soro, plasma ou urina. "ELISA" refere-se a ensaio de imuno-sorvante ligado a enzima que empregam um anticorpo ou um antigénio ligado a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigénio -30- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 ou enzima-anticorpos para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio ou de um anticorpo presentes numa amostra. Encontra -se uma descrição da técnica ELISA no Capitulo 22 da 4â. edição de Basic and Clinicai Immunoloav por D.P. Sites et al., publicada por Lange Medicai Publications de Los Altos, CA, E.U.A., em 1982 e nas Patentes americanas N9. 3 654 090; Í\I9. 3 850 752 e NS. 4 016 043 que são aqui todas incorporadas para referência.

Assim, em concretizações preferidas a proteína, o poli-péptido ou molécula de anticorpo do presente invento expressos po, dem ser fixados a uma matriz sólida de modo a formar um suporte sólido que é embalado separadamente nos sistemas de diagnóstico referidos. 0 reagente ê tipicamente fixado à matriz sólida por adsor, ção a partir de um meio aquoso embora se possam usar outros meios de fixação bem conhecidos dos especialistas na arte.

As matrizes sólidas úteis são bem conhecidas na arte. Estes materiais incluem dextramo com ligações cruzadas disponível sob a marca comercial de SEPHAOEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataiuay, N3, E.U.A.), agaroseí esferas de poliestireno, com cerca de 1 micron até cerca de 5 milímetros de diâmetro adquiríveis a partir dos Laboratórios Abbott de North Chicago, IL, E.U. A.; poli-cloreto de vinilo, poliestireno, poliaerilamida de ligações cruzadas, redes baseadas em nitrocelulose ou nilão tais como folhas, tiras ou pensos; ou tubos, placas ou as cavidades de uma placa de microtitulação tal como as que são feitas de poli estireno ou de poli-cloreto de vinilo.

As espécies reagentes, o agente de ligação especifico mar cado ou o reagente de amplificação de qualquer sistema de diagnós. tico aqui descrito podem ser fornecidas em solução, na forma de uma dispersão líquida ou como um pó substancialmente seco, por ex*, na forma liofilizada. Nos casos em que o meio de detecção é uma enzima, o substrato da enzima pode também ser fornecido numa embalagem separada de um sistema. Pode também incluir-se um suporte sólido tal como a placa de microtitulação anteriormente descrita e um ou mais tampões como elementos embalados separada- -31- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 mente neste sistema de determinação de diagnóstico.

As embalagens aqui discutidas relacionadas com os sistemas de diagnóstico são as que são normalmente utilizadas em sistemas de diagnóstico. Estas embalagens incluem garrafas de vidro e de plástico (por ex.» polietileno, polipropileno e policarbonato), frascos, envelopes de plástico e de plástico laminado a alumínio e similares. H. Métodos de determinação 0 presente invento contempla qualquer método que resulte na detecção de subunidade beta da Integrina, é particularmente o GPIIIa, por produção de um complexo contendo uma molécula de anti corpo contida num anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal do presente invento. Os especialistas na arte entenderão que existem numerosos procedimentos de química de diagnóstico clinico bem conhecidos que podem ser usados para a formação destes complexos. Embora se descrevam aqui métodos de determinação exemplificativos, a invenção não é por eles limitada.

Por exemplo, uma amostra de sangue preservada com hepari- na (não coagulada) é misturada com moléculas de anticorpo marca- 125 das com I. A mistura imunorreacção assim formada é mantida sob condiçães de determinação imunológica durante um período de tempo suficiente para qualquer plaqueta activada imunorreagir com os anticorpos marcados e formar um produto de imunorreacção marca do. Os produtos de imunorreacção marcados são então separados dos anticorpos marcados não reagidos, tipicamente por centrifugação suficiente para sedimentar todas as plaquetas presentes na amostra. A quantidade de produto de imunorreacção marcado formada é então determinada.

As condiçães de determinação imunológica são aquelas que mantêm a actividade imunológica das moléculas de anticorpo contidas num anticorpo policlonal ou monoclonal deste invento e as moléculas de Integrina que se pretende determinar. Essas condiçães incluem uma gama de temperaturas de cerca de 4 graus C a cerca de 45 graus C, de preferência cerca de 37 graus C, um valor de pH na -32- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 gama de cerca de 5 a cerca de 9, preferencialmente 7 e uma força iónica variando desde a da água destilada até à de uma solução mo lar de cloreto de sódio» preferencialmente perto da do soro fisio lógico. Os métodos de optimização destas condiçães são bem conhe eidos na arte.

I. Segmentos de ADN

Nos organismos vivos a sequência de resíduos aminoácido de uma proteína ou polipéptido está directamente relacionada com o código genético com a sequência de ácido desoxirribonucleico (AON) do gene estrutural que codifica a proteína. Como tal, um gene estrutural pode ser definido em termos da sequência de resíduos aminoácido, isto é, proteína ou polipéptido, que ele codifica.

Uma faceta importante e bem conhecida do código genético é a sua redundância. Isto é, para a maior parte dos aminoácidos usados para compor proteínas, mais do que um tripleto de nucleotí. dos de codificação (codão) pode codificar ou designar um resíduo aminoácido particular. Deste modo, um número de sequências de nucleotldos diferentes pode codificar uma sequência de resíduos aminoácido particular. Tais sequências nucleotldos são consideradas funcionalmente equivalentes uma vez que resultam na produção da mesma sequência de resíduos aminoácido em todos os organis mos. Ocasionalmente, uma variante metilada de uma purina ou piri midina pode ser incorporada numa dada sequência de nucleotídos. Contudo, tais metilaçoes não afectam a relação de codificação de nenhuma forma.

Um segmento de ADN do presente invento inclui um gene estrutural que codifica um polipéptido sujeito contendo uma sequêji cia de resíduos aminoácido da subunidade beta da Integrina homóloga da sequência GPIIIb localizada entre os substituintes 110--170 como se mostra na Figura 1,

Um segmento de ADN preferido do presente invento inclui uma sequência de ADN que codifica uma sequência de resíduos amino ácido correspondente a, e preferencialmente idêntica a, uma sequêji -33- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 cia representada por um polipêptido com uma fórmula que ae mostra na Tabela 1 ou 2. Preferencialmente, a sequência de ADN está presente na forma de uma série linear não interrompida do cadão em que cada codão codifica um resíduo aminoácido que se encontra nas sequências de resíduos aminoácido acima descritas, isto é, uma sequência de ADN que não contêm intrães.

Assim um segmento de ADN consistindo essencialmente da s.e quência de nucleotídos que se mostra na figura 1 desde cerca da base 423 até cerca da base 611 constitui uma concretização do pre sente invento.

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Um segmento de ADN do presente invento pode facilmente ser sintetizado por técnicas químicas, por exemplo, pelo método do fosfotriester de Matteucci et al., 3. Am, Chem. Soc., 103:3185 (1981). Claro que, sintetizando quimicamente a sequência de cod.i ficação, podem fazer-se quaisquer modificaçães desejadas simplesmente por substituição das bases que codificam a sequência original de resíduos aminoácido pelas bases apropriadas. Contudo, pre ferem-se as moléculas de ADN incluindo as sequências exactamente homólogas das que se mostram na Figura 1.

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As moléculas de ADN do presente invento têm tipicamente extremidades coesas, isto ê, porções de cadeia única,,penduradasM que se estendem para lá da porção de cadeia dupla da molécula. Prefere-se a presença de terminais coesos nas moléculas de ADN do presente invento.

Também são contemplados no presente invento os equivalentes de ácido ribonucleico (ARN) dos segmentos de ADN anteriormen-te referidos. 3. Moléculas de ADN recombinantes

Uma molécula de ADN recombinante do presente invento pode ser produzida por ligação operacional de um vector a um segmento de ADN do presente invento, de preferência a um segmento de ADN codificando um polipêptido sujeito correspondente à fórmula que se mostra na Tabela 1 ou 2. -34- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1

Tal como ê aqui usado o termo "vector" refere-se a uma mo lécula de ADN capaz de replicação autónoma numa célula e a qual se pode ligar operativamente um outro segmento de ADN de modo a originar a replicação do segmento ligado. Os vectores capazes de dirigir a expressão dos genes codificando para proteínas com sequências de resíduos aminoácido relacionadas com GPIIIa são aqui referidos como “vectores de expressão”. Como tal a molécula de ADN recombinante (ADNr) é uma molécula de ADN híbrida compreejn dendo pelo menos duas sequências de nucleotídos normalmente não encontradas juntas na natureza. A escolha do vector ao qual o segmento de ADN do presente invento está operativamente ligado depende direetamente, como é bem conhecido na arte, das propriedades funcionais desejadas, por ex., da expressão proteina e da célula hospedeira a ser transformada, sendo estas limitações inerentes à arte da construção de mo léculas de ADN recombinantes. Contudo, um vector contemplado pelo presente invento é pelo menos capaz de dirigir a replicação e de preferência também a expressão, do gene codificando um poli-péptido possuindo uma sequência de resíduos aminoácido relacionada com a subunidade beta da Integrina incluída nos segmentos de ADN aos quais está operativamente ligada.

Em concretizações preferidas, um vector contemplado pelo presente invento inclui um replicão procaridtico, isto é, uma sequência de ADN com a capacidade de dirigir a replicação autónoma e manutenção da molécula de ADN recombinante, extra-cromosomica-mente numa célula hospedeira procariótica, tal como uma célula hojs pedeira bacteriana, assim transformada. Estes replicões são bem conhecidos na arte. Adicionalmente, as concretizações que incluem um replicão procaridtico incluem também um gene cuja expressão confere resistência às drogas a um hospedeiro bacteriano assim transformado. Tipicamente os genes bacterianos de resistência às drogas são aqueles que conferem resistência à ampicilina ou tetra ciclina.

Os vectores que incluem um replicão procariótico podem também incluir um promotor procaridtico capaz de dirigir a expres. -35- 70 038 5CR 0254-SCRF 165.1

J são (transcrição e a tradução) do gene codificando uma sequência de resíduos aminoácido relacionada com GPIIb numa célula de hospedeiro bacteriano, tal como a E. coli assim transformado. Um promotor é um elemento de controlo de expressão formado por uma sequência de ADN que permite a ocorrência da ligação da polimera-se de ARN e da transcrição. As sequências de promotor compatíveis com os hospedeiros bacterianos são tipicamente fornecidas em vectores plasmlo contendo sítios de restrição convenientes para a inserção dum segmento de ADN do presente invento. Vectores plas-midos típicos são o pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329 adquiríveis a paj? tir de Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, E.U.A.) e pPL e PKK223 adquiríveis a partir de Pharmacia , Piscatauiay, NU, E.U.A..

Podem também usar-se vectores de expressão compatíveis com células eucariéticas, de preferência os que são compatíveis com células de vertebrados, para formar as moléculas de ADN recom binante do presente invento. Os vectores de expressão das células eucariéticas são bem conhecidos na arte e estão disponíveis em várias fontes comerciais. Tipicamente, estes vectores são for necidos contendo locais de restrição convenientes para a inserção dos segmentos de ADN desejados. Exemplos típicos destes vectores são o pSVL e pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Bio, technologies, Inc.), e o PTDT1 (ATCC,^31255).

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Em concretizações preferidas os vectores de expressão da célula eucariética utilizados para construir as moléculas de ADN recombinante do presente invento incluem um marcador de selecção que é eficaz numa célula eucariética, de preferência um marcador de selecção resistência a drogas. Um marcador de resistência a drogas preferido é o gene cuja expressão resulta na resistência à neomicina, isto é o gene da neomicinafosfotransferase (neo). Southern et al., 3, Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982). 0 uso de vectores de expressão retrovirais para formar os ADNsr do presente invento é também contemplado. Tal Gomo é aqui utilizado o termo "vector de expressão retroviral” refere-se a uma molécula de ADN que inclui uma sequência promotora derivada da região de repetição terminal longa (LTR) do genoma de um re-trovirus. -36- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1

Em concretizaçães preferidas» o v/ector de expressão é tipicamente um vector de expressão retrov/iral que é preferencialmeji te incompetente na replicação em células eucarióticas. A constru ção e uso dos vectores retrovirais tem sido descrita por Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984).

Foi desenvolvida uma v/ariedade de métodos para ligar opera tivamente o ADN a vectores através das extremidades coesas comple mentares. Por exemplo, tractos de homopolimero complementares po, dem ser adicionados ao segmento de ADN a ser inserido e ao vector ADN. 0 vector e segmento de ADN são então juntos por ligação de hidrogénio entre as extremidades homopolimérias complementares de modo a formar moléculas de ADN recombinantes.

Os ligantes sintéticos contendo um ou mais locais de restrição constituem um método alternativo de ligação do segmento de ADN a vectores. Um segmento de ADN possuindo extremidades coesas é tratado com ADN-polimerase de bacteriofago T4 ou ADN-polimerase I de E» coli» enzimas que removem as extremidades de uma só cadeia salientes 3' com as suas actividades exonucleoliticas 3'-5' e que enchem as extremidades 3' interrompidas com as suas actividades polimerizadoras. A combinação destas actividades gera como resul tado segmentos de ADN de extremidades rombas. Os segmentos de e.x tremidades rombas são então incubados com um grande excesso molar de moléculas de ligante na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação das moléculas de ADN de extremidades rombas, tal como a ADN ligase do bacteriofago T4. Assim os produtos da reacção são segmentos de ADN possuindo sequências de ligantes po. liméricos nas suas extremidades. Estes segmentos de ADN são então clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vector de expressão que foi clivado com uma enzima que produz extremidades compatíveis com as dos segmentos de ADN.

Os ligandos sintéticos contendo uma variedade de locais de endonuclease de restrição estão comercialmente disponíveis a partir de um número de fontes incluindo International Biotechnolo gies, Inc., Neui Haven, CN, E.U.A.. -37- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 São também contemplados pelo presente invento os equivalentes de ARN das moléculas de AON recombinante anteriormente des. cxitas. K. Células transformadas e culturas 0 presente invento também se refere a uma célula hospedei ra transformada com uma molécula de ADN recombinante do presente invento. A célula hospedeira pode ser quer procariética quer eu-caridtica. As células bacterianas são de preferência células hos. pedeiras procarióticas e são tipicamente uma estirpe de E. coli tal como, por exemplo a estirpe de E. coli DH5 disponível a partir de Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD, E.U.A.. As células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem células de levedura edb mamíferos, de preferência células de vertebrados tais como as linhas de células fibroblasticas de ratinho, de ratazana, de macaco ou humanas. As células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem as células de ovários de "Hamster” chinês (CHO) dis poniveis na ATCC como CCL61 e células de embrião de ratinho Suiço NIH, NIH/3T3, disponíveis a partir de ATCC como CRL 1658. A transformação das células de hospedeiro apropriadas com uma molécula de AON recombinante do presente invento é realizada por métodos bem conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vector usado. No que diz respeito à transformação de células de hospedeiros procarióticas, ver, por exemplo Cohen et al., Proc. Natl. Açad. Sçj. USA, 69:2110 (1972)5 e Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratorv Mammal, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). No que diz respeito h transformação de células de vertebrados com vectores retrovirais contendo ADNr, ver por exemplo, Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984); Graham et al., l/irol., 52:456 (1973); e Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:1373-76 (1979).

As células transformadas com sucesso, isto é, células que contêm uma molécula de ADN recombinante do presente invento, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as células resultantes da introdução de um ADNr do presente in- -38- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 vento podem ser clonadas para produzir colónias monoclonais. As células dessas colónias podem ser recolhidas, lisadas e pode examinar-se o seu conteúdo de AON para determinar a presença do ADNr usando um método tal como o que é descrito por Southern, 3. Mol. Biol.. 98:503 (1975) ou Berent et al., Biotech.» 3:208 (1985).

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Para além da determinação directa da presença de ADNr, a transformação com sucesso pode ser confirmada por métodos imuno-lógicos bem conhecidos quando o ADNr é capaz de dirigir a expressão do polipéptido sujeito. Por exemplo, as células transformadas com sucesso com um ADI\!r sujeito contendo um vector de expressão produzem um polipéptido que revela uma característica de anti genicidade. Amostras de culturas contendo células suspeitas de terem sido transformadas são recolhidas e testadas no que diz respeito a um polipéptido sujeito usando anticorpos específicos para esse antigênio polipéptidico, tal como aqueles produzidos por um hibridoma do presente invento.

Assim, para além das próprias células hospedeiras transformadas, o presente invento contempla também uma cultura dessas células, de preferência uma cultura monoclonal (clonalmente homogénea), ou uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, num meio nutriente. De preferência, a cultura também contém uma proteína revelando antigenicidade da subunidade beta da Integrina.

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Os meios nutrientes úteis para a cultura de células hospedeiras transformadas são bem conhecidos na arte e podem ser obtidos a partir de várias fontes comerciais. Em concretizaçães em que a célula hospedeira é de um mamífero,usa-se preferivelmente um meio "isento de soro". L. Métodos para produção de um polipéptido sujeito

Outro aspecto do presente invento refere-se a um processo de preparação de um polipéptido sujeito útil para cultivar anticorpos que podem ser usados nos sistemas e nos métodos de diagnós. tico do presente invento. 0 presente processo compreende a iniciação de uma cultura -39- SCR 0254-SCRF 165.1 compreendendo o meio nutriente contendo as células hospedeiras trans formadas com uma molécula de ADIM recombinante do presente invento que é capaz de exprimir um gene que codifique um polipêptido sujeito, de preferência um polipêptido correspondendo a uma fórmula que se mostra na Tabela 1 ou 2. A cultura é mantida durante um período de tempo suficiente para que as células transformadas exprimam o polipêptido sujeito. 0 polipêptido expresso é então recuperado da cultura.

Os métodos para recuperar o polipêptido expresso de uma cultura são bem conhecidos na arte e incluem o fraccionamento da porção da cultura contendo o polipêptido usando técnicas bioquími cas bem conhecidas. Por exemplo, os métodos de filtração em gel, cromatografia em gel, ultrafiltração, electroforese, permuta ióni ca, cromatografia de afinidade e similares, tal como são aplicados nos fraccionamentos de proteínas, podem ser usados para isolar as proteínas expressas que se encontram na cultura. Adicionalmente, os métodos imunoquímicos, tais como imunoafinidade, imunoabsorção e similares, podem ser realizados usando métodos bem conhecidos.

Exemplos

Os seguintes exemplos são supostos ilustrar mas não limitar, o presente inv/ento. 1. Identificação de um local de ligação proteína de adesão numa Inteorina A ligação química cruzada tem sido usada extensivamente pa ra estudar as interacçães dos ligandos contendo RGD com o GPIIb--Illa. Bennett et al., 3. Biol. Chem., 257:8049 (1982). Muito recentemente, a ligação cruzada tem sido usada para examinar a interacção de pequenos pêptidos RGD de seia a catorze aminoácidos com GPIIb-IIIa como um meio para caracterizar a topografia do local de reconhecimento RGD. Santero et al., Cell. 48:867 (1987) e D'Souza et al., 3. Biol. Chem.. 263:3943 (1988). Estes estudos têm mostrado que a activação de plaquetas com agonista, um aconte cimento necessário para a ligação de proteínas adesivas tais como o fibrinogénio e a fibromectina ao GPIIb-IIIa, aumenta marcada e -40- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 selectivamente as ligaçães cruzadas dos péptidos RGD à GPIIIa, a subunidade beta da Integrina GPIIb-IIIa.

Um estudo recente define um local discreto no GPIIIa ao qual um pequeno péptido RGD pode estar quimicamente ligado por uma ligação cruzada. Esse local é suposto definir o local funci£ nal para a ligação do ligando à Integrina, e é aqui designado por região de ligação RGD. A sequência de substituintes aminoácido desta região é conservada noutros membros da família Integrina (Figura 6) indicando que desempanha um papel critico na função desta família de receptores de adesão.

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A. Preparação do péptido RGD

J 0 péptido RGD usado neste estudo, designado por Fn-7, tem a sequência de resíduos aminoácido, KYGRRGDS. Este péptido foi construído para conter um resíduo lisina (K) para facilitar as li gações cruzadas e um resíduo (Y) para fornecer um local para radio iodação. 0 Fn-7 foi preparado por síntese de fase sólida num sin tetizador de péptidos da Applied Biosystems modelo 430 usando resinas de peptidilglicinamono-oxigenase de amidação na posição ot e aminoácidos t-Boc comprados na Applied Biosystems. 0 péptido foi analisado quanto à sua homogeneidade por cromatografia líquida de alta eficiência usando uma coluna Bondapak/coní um gradiente linear de 0-60% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético 0,1% e o valor encontrado foi superior a 85% de homogeneidade. A composição de aminoácidos do péptido foi determinada após um período de 24 horas, a hidrólise foi realizada numa solução 6 N de HC1. e os resultados foram consistentes com os rendimentos teóricos.

Os péptidos foram dissolvidos em solução salina tamponizada com fosfato (PBS) antes do uso e o pH foi ajustado a 7,2. 0 Fn-7 foi radioiodfdo pelo método da lactoperoxidase- -glucoseoxidase modificado, ver Lam et al., 3. Biol. Chem., 268: :947-950 (1987). Resumidamente, a radioiodação realiza-se por filtração em gel, da glucose (20 wg em 40 mL de fosfato de sódio \ 125 ^ ' 0,2 M, pH 7,4), do Na I sem transportador e dos outros reagentes numa coluna BioGel P-2. As condiçães para radioiodação foram seleccionadas para minimizar a heterogeneidade do ligando, e, -41- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 usando este protocolo mais do que 80$ do péptido iodado estava na forma monoiodotirosinada. A concentração da péptido marcado foi determinada por absorvância a 280 nm, usando coeficientes de extinção determinados a partir das composições de aminoácidos. A aGtividade especifica do péptido foi de 5-8 mCi/mg. B. Preparação de plaquetas e lioacão química cruzada do péptido Fn-7 a locais discretos no GPIIIa

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As plaquetas foram isoladas a partir de sangue humano fresco recolhido em ácido/citrato/dextrose por centrifugação dife rencial seguida por filtração em gel em Sepharose 2B num tampão Tyrode isento de iões divalentes, pH 7,3, contendo 0,1$ de albumi na de soro bovino. Ver, Marguerie et al., 3. Biol, Chem., 225: :154-161 (l98Q). A ligação às plaquetas do Fn-7 seguiu os protocolos antes descritos para medir as interacções das plaquetas com as proteínas adesivas e com este e com outros péptidos. Ver, Ginsberg et al., 3. Biol. Chem.. 260:3931-3936 (1985); Lam et al., Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol., 44:1126 (1985); e Marguerie et al., suora« Resumidamente as plaquetas foram suspensas a 4 x lO^/ral em tampão de albumina de Tyrode isento de iões divalentes. Salvo 2+

J especificação em contrário, adicionou-se Ca até uma concentração final de 1 mM. 0 estímulo das plaquetas usado foi de 0,5 uni dades/ml de alfatrombina. 0 péptido radiomarcado foi então adi-cionado a 6 x 10 cêlulas/ml de plaquetas estimuladas ou não esti. muladas numa concentração de 20 ^M, e a ligação continuou durante 45 min a 229C. Adicionou-se então o agente de ligação cruzada sjí leccionado. 0 agente de ligação cruzada usado neste estudo sube-rato de bis(sulfosuceinimidilo) (BS”5), comprado na Pierce Chemical Co» foi dissolvido em PBS iraediatamente antes do uso e misturado com as plaquetas até uma concentração final de 0,2 mM. As reacções de ligação cruzadas foram terminadas após 10 minutos a 229C por adição de Tris 10 mM, pH 7,0.

0 ligando ligado a célula foi recolhido por centrifugação através de 20$ de sacarose e as células foram extraídas em PBS -42- 70 038 SCR 0254-SCRF 165*1 contendo 1$ de Wonidet P40 e 10 mM de N-etilmaleimida (Sigma).

As proteínas extraídas foram precipitadas com ácido tricloroacéti co a 10$ e o sedimento obtido após centrifugação foi lavado três vezes com etanol a 85$ frio. As amostras com ligações cruzadas foram analisadas por electroforese (SDS-PAGE) em placas de gel de poliacrilamida verticais no sistema tampão de Laemmli, Nature, 227:680-635 (1970). Para a redução das ligações dissulfureto, as amostras foram tratadas com 2-mercaptoetanol 5$. 0s geles foram secos e fizeram-se autoradiogramas com filmes Kodak X-Omat AR. 0s pesos moleculares foram estimados com base na mobilidade elec-troforêtica relativamente a standards obtidos a partir de Sigma Chemical ou de Bethesda Research Laboratories. C. Procedimentos de imunomancha

As amostras de ligação cruzada foram imunoprecipitadas usando um anticorpo monoclonal designado por 22C4, que reconhece o GPIIIa, Ginsberg et al., J, Biol. Chem., 262:5437 (1987). 0s precipitados com ácido lavados, obtidos a partir de amostras com ligações cruzadas tal como se descreveu anteriormente, foram dissolvidos em 250 de tampão de iraunoprecipitação (IPB) o qual continha 0,15 M de NaCl, 0,01 M de EDTA, 10 mM de benzamidina-HCl, inibidor da tripsina da soja (10 g/ml), fluoreto de fenilmetanos^ sulfonilo 0,2 mM, Triton X-1QQ 1$ (v/v), Tu/een 20 0,05$, NaN^ 0,02$ e Trasylol (5 unidades/ml) em Tris-HCl 0,02 M, pH 7,4. 0 IPB revelou dissociar o complexo GPIIb-IIIa. As amostras foram pré-clarifiçadas por adição de 15^1 de soro de coelho normal ina£ tivado pelo calor, seguida da adição do reagente proteína A (Pan-sorbin, Behring Diagnostics). 0s lisados clarificados foram então suplementados com 1$ de albumina de soro de boi e 150 yul de IPB contendo 10 do anticorpo monoclonal acima referido. As amostras foram incubadas de um dia para o outro a 4SC e adicionotJ -se depois Pansorbin. Apôs lha 222C, as amostras foram centri-fugadas e os imunoprecipitados recolhidos foram lavados três vezes por centrifugação em IPB. 0s precipitados foram solubiliza-dos por calor durante 3 minutos a 1009C em tampão de amostra Laem mli e depois submeteram-se a SDS-PAGE como se descreveu anterior- -43- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 mente. Para a análise por imunomancha, as amostras de proteína foram resolvidas por SDS-PAGE como se indica anteriormente. Apôs electroforese, as proteínas resolvidas foram transferidas por mem branas de poli-difluoreto de vinilideno (PVDF). As transferências foram sondadas com o anticorpo monoclonal anti-GPIIIa, 22C4, com um anticorpo policlonal anti-GPIIIa, ou com um anti-soro de coelho dirigido a um péptido com uma sequência correspondente aos resíduos 636-654 do GPIIIa, Os anticorpos ligados foram detecta-dos usando IgG anti-ratinho conjugada com peroxidase de rábano silvestre (Bio-Rad) e 4-cloro-l-naftol como substrato. D. Fraomentacão auimotrlptica do GPIIIa A clivagem quimotríptica das plaquetas degrada a subunidja de GPIIIa de 100 kDa libertando aproximadamente um terço de molécula da célula e formando um núcleo consistindo de um produto de degradação de 66 kDa que pode então ser ainda decomposto em fragmen tos de 55-66 kDa que se mantêm associados à célula. Kornecki et al., 3. Biol. Chem. , 258:8349 (1983), McGouian et al., 3. Biol.

Chem.. 258:11243 (1983) e McGregor et al., Eur. 3. Biochem.. 148: :97 (1985).

Realizaram-se estudos iniciais para determinar se a ligação cruzada do Fn-7 ao GPIIIa com BS^* foi retida ou libertada da 125 célula pela quimotripsina. 0 I-Fn-7 foi ligado por ligação cruzada ou plaquetas estimuladas pela trombina como aqui se descreveu anteriormente no Exemplo 1B. As células com ligaçães cruzadas foram então misturadas com quimotripsina (0,5 mg/ml de concentração final) e mantidas durante 4 horas a 229C. A radioacti-vidade libertada das células foi quantificada.

Em cada um dos quatro digeridos quimotripticos, libertou -se das plaquetas 50-7Q$ do I-Fn-7 associado às células por tratamento com quimotripsina. Quando o sobrenadante das plaquetas digeridas foi tratado com ácido tricloroacético a. 10$ apenas precipitou 6-8$ da radioactividade, indicando que Fn-7 foi libertado em associação com pequenos péptidos. Quando o sobrenadante ou o seu precipitado com ácido foi analisado por SDS-PAGE em geles de acrilamida a 15$, a radioactividade migrou mais rapidame_n -44- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 te do que um padrão de peso molecular 8 kDa. A radioactividade associada às células após tratamento com quimotripsina foi recuperada por centrifugação e analisada por SDS-PAGE como anteriormente se descreveu. Como se mostrou na Figura 2 (zona 2), a única zona radioactiva detectada nas plaquetas digeridas era a incorporada no GPIIIa residual. A quimotripsina diminuiu a radioactividade do Fn-7 associada com GPIIIa mas não gerou produtos de degradação radioactiva discretos, particularmente na posição 66 kDa. A imunomancha (Figura 3) do mesmo digerido quer com um antissoro policlonal em relação ao GPIIb-IIIa (zona 4) quer com um anticorpo monoclonal em relação ao GPIIIa (zona 6) demonstrou que a enzima tinha gerado derivados importantes nas posiçães 66 e 55 kDa. Como nenhuma destas bandas era radioactiva, o local de ligação cruzada de Fn-7 não se situa no domínio 66 kDa do GPIIIa e ê libertado da célula por clivagem quimotriptica.

Como o domínio de envolvimento da membrana putativa do GPIIIa se encontra próximo da sua extremidade C00H, os fragmentos 66 kDa sujeitos a imunomancha com um anticorpo antipéptidico diri gido a uma sequência de aminoácidos de GPIIIa (resíduos 636-654), próximo da região de envolvimento da membrana putativa (comepando no resíduo 693). Como tal, o local de ligação cruzada do Fn-7 não está presente na região terminal CQOH 66 kDa do GPIIIa e encontra-se na região do terminal NH2 de 34 kDa da subunidade, como se mostra em diagrama na Figura 4 (passos 1 e 2).

Como se mostrou anteriormente na Figura 2, a clivagem quimotriptica do GPIIIa isolado fornece dois fragmentos Fn-7 marcados. Para determinar a origem desses fragmentos no GPIIIa, as suas sequências de resíduos aminoáeido l\lterminais foram identi ficadas. Para isto, realizou-se a ligação cruzada preparativa de 125 I-Fn-7 com plaquetas estimuladas pela trombinaj e, posterior-mente, o complexo GPIIIasFn-7 de 6 unidades de sangue foi isolado por SDS-PAGE seguido de eluição. 0 produto isolado foi digerido com quimotripsina e sujeito a cromatografia de HPLC em fase inveje sa numa coluna C18. A radioactividade foi distribuída por duas -45- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 fracçSes enriquecidas nos fragmentos 23 ou 14 kDa, cada uma das quais foi sujeita a SDS-PAGE num gel a 15% sob condiçães redutoras e transferida para membranas de poli-difluoreto de vinilideno (PVDF).

Os autoradiogramas dos transferidos contendo os fragmentos 125 de GPIIIa marcados com I-Fn-7 são mostrados na Figura 4 (passo 3) e ambos os fragmentos de 24 e 14 kDa são aparentes. As bandas foram cortadas dos transferidos e sujeitas a uma análise da sequência do terminal NH2 usando tecnologia automática convencional de sequenciação de aminoácidos.

Uma sequência única predominante foi obtida para o fragmeri to 23 kDa (Figura 4). Os resíduos identificados nas primeiras quatro posiçães representaram 72 a Q7% do rendimento total destas posiçães. Em todas as posiçães determinadas nos nove ciclos realizados, os aminoácidos eram idênticos à sequência NH2 terminal do GPIIIa. Isto coloca o local de ligação cruzada do Fn-7 dentro da região NH2 terminal 23 kDa do GPIIIa.

No fragmento de 14 kDa, uma sequência mais importante predominou durante 22 ciclos e coincidiu com os resíduos 91-12 do GPIIIa. (Uma segunda sequência foi detectada num rendimento mais baixo mas era idêntica a uma sequência interna com quimotripsina). 0 resíduo na posição 90 do GPIIIa ê a leucina, um local de clivagem preferencial da quimotripsina. Em 14 kDa, o fragmento menor do GPIIIa é previsto estender-se aos resíduos 200-220 da glicopro teína e um fragmento de 23 kDa que se estende do terminal NH2 deveria também terminar dentro da mesma região do GPIIIa. Como tal, estes posicionamentos do local de ligação cruzada Fn-7 são consis tentes um com o outro e com a localização da região de 34 kDa NH2~ -terminal libertada, das plaquetas intactas, pela quimotripsina. E. Fragmentação pela protease \l8 do GPIIIa.

Adoptou-se uma aproximação semelhante para caracterizar os fragmentos de protease 1/8 do GPIIIa contendo o local de ligação cruzada do Fn-7. Apés os passos de digestão enzimática do complexo GPIIIa:Fn-7, cromatografia de HPLC, SDS-PAGE e transfe- -46- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 rência, observou-se o dupleto da 8 e 10 kDa no autorradiograma do transferido (Figura 4, passo 4). Estas bandas foram separadas do transferido e sequenciadas saparadamente. 0 fragmento 10 kDa resultou numa sequência Nl^ terminal única que se estendia por 16 resíduos. Esta sequência corresponde precisamente à que foi prevista para os resíduos 109-124 do GPIIIa. 0 resíduo aminoácido na posição 108 do GPIIIa é o ácido glutâmico, um sítio de clivagem preferencial da protease 1/8. Interessantemente, embora se obtivesse um sinal forte para a metionina na posição 124, não se obtje ve sinal no resíduo seguinte, que se previu ser a lisina. Como tal, a lisina na posição 125 é um candidato para ligação cruzada directa à lisina no Fn-7.

Prevê-se que o fragmento de 10 kDa prolongando-se a partir do resíduo 109 termine na vizinhança do resíduo 200. 0 sinal de sequência do fragmento de-8 kDa não era tão forte como o do dje rivado de 10 kDa» mas as primeiras quatro posiçães eram claras e idênticas às do fragmento de 10 kDa. Com o mesmo terminal no resíduo 109 mas sendo 2 kDa mais pequeno, o fragmento de 8 kDa djs veria terminar na região 170-180; ocorreram dois ácidos glutâmi-cos nesta cadeia de 10 aminoácidos. Deve notar-se que a sequência NH2 terminal dos fragmentos de 8 e de 10 kDa foi também deteç; tada na sequência determinada para o fragmento quimiotriptico de 14 kDa, fornecendo uma confirmação independente da localização do sítio de ligação cruzada de Fn-7. Como tal, o sitio de ligação cruzada do Fn-7 é localizado, por estes estudos de fragmentação, numa região definida pelos resíduos 109 e pelos primeiros resíduos de ácido glutâmico na posição 171 na região 170-180 do GPIIIa.

F, Localização do sítio de ligação RGD

As observaçBes acima indicam que o sítio de ligação cruzada de Fn-7 se situa na região terminal Nl·^ do GPIIIa. Foram reja lizadas experiências de croraatografia de afinidade para determinar se o sítio de ligação RGD também se situava nesta região. Estudos prévios documentaram que o GPIIb-IIIa pode ser selectiva-mente ligado a colunas de afinidade RGD proveniente de extractos de detergente de plaquetas e especificamente aluídos por um pépti -47- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 do RGD livre. Pytela et al. , Science, 231:1559 (1986).

As plaquetas não foram tratadas ou foram digeridas com quimiotripsina. As condiçães de quimiotripsina foram escolhidas de modo a que aproxiroadamente 50^ do GPIIIa fosse degradado no d_e rivado de 66 kDa.

As duas preparaçães de plaquetas foram então solubilizadas com octilglucósido, e os extractos foram passados sobre uma coluna de afinidade RGD. Após lav/agem para obter uma fracção que atravessou a coluna» a coluna foi eluída com pêptido RGD livre. A fracção atravessante e o eluido foram sujeitos a SDS-PAGE em gje les a lia sob condiçães não redutoras, transferidos e sujeitos a imunomancha com um anticorpo monoclonal, 22C4, de GPIIIa.

Como se mostra na Figura 5 observou-se GPIIIa intacto na fracção atravessante das plaquetas não digeridas e a mistura de GPIIIa intacto e do fragmento 66 kDa do GPIIIa estava presente na fracção atravessante das plaquetas tratadas com quimiotripsina. Nos eluidos RGD de ambas as colunas apenas o GPIIIa absorvido foi detectado. Como tal, o fragmento de 66 kDa não foi retido na coluna de afinidade RGD. 0 resultado é compatível com a interpreta ção de que o sítio ao qual os péptidos RGD se ligam, e com o qual efectuam ligaçães cruzadas, coincide e se situa na região terminal Nl·^ do GPIIIa. Esta conclusão ê também consistente com um relatório sobre inibição plaquetária por um anticorpo monoclonal à região NHg terminal do GPIIIa. Calvete et al., Biochem. 3.« 250:697 (1988). G. Relação entre o sítio de lioacão cruzada RGD no GPIIIa e outras Inteorinas 0 GPIIIa é uma proteína com 762 aminoácidos de comprimento. Fitzgerald et al., 3. Biol. Chem. 262:3926 (1987), Com base na sequência de resíduos de aminoácidos dos fragmentos quimiotrípti cos e de protease V8 0 sítio de ligação cruzada RGD foi confinado a uma região de cerca de 63 aminoácidos (o primeiro resíduo ácido glutâmico na. região 170-180 do GPIIIa), estendendo-se na di-recção do . G00H a partir do resíduo 109. -48- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1

No que diz respeito ao local identificado por ligação cru, zada a fragmentos proteolíticos, acredita-se que as fronteiras exactas do local de ligação RGD podem variar tanto como cerca de 8 a 15 resíduos aminoácido. Como tal, o sitio será referido por conveniência, como uma região de ligação RGD compreendendo os re slduos de desde cerca da posição 110 a cerca da posição 170.

No que diz respeito à larga utilização da especificidade de reconhecimento RGD dentro da família da Integrina, uma compara ção da estrutura primária desta região nas três subunidades beta das Integrinas humanas tem um interesse considerável.

Um alinhamento da sequência de resíduos aminoácido desta região das subunidades beta das subfamllias LeuCam, VLA e Citoad.e sina é mostrado na Figura 6. Adicionalmente, incluem-se as sequêri cias deduzidas das subunidades beta das Integrinas de aves e de Xe nopus. A sequência de aminoácidos dentro desta região das Integri nas é conservada, não apenas nas proteínas humanas mas também nas proteínas das aves e anfíbios. Na sequência consensual exigindo uma identidade do aminoácido em cada posição em pelo menos quatro ou cinco proteínas, 47 dos 63 resíduos (75$) são especificados. 0 GPIIIa adapta-se a esta sequência consensual em 38 dos 63 resíduos. A natureza conservada desta região das Integrinas excede grandemente a identidade global entre as Integrinas. Tal conservação é claramente compatível com uma contribuição desta região para a função destas Integrinas como receptores de adesão.

Como notado, os membros de cada uma das três famílias das Integrinas humanas /""Pytela et al., Science. 231:1559 (1986), Rouslahti et al., Cell. 44:517 (1986), Pytela et al., 3. Cell Biol.. 102:442 (1986) e Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 84 (l987)_7 e Integrinas de aves /^Horiuitz et al., 3. Cell

Biol., 103:2421 (1986)_7 podem ligar ligandos através da especifi cidade de reconhecimento RGD. A localização do local de ligação cruzada RGD no GPIIIa a esta região é a primeira implicação direçt ta da região na função da Integrina. Dentro desta cadeia de 63 aminoácidos do GPIIIa, há quatro resíduos lisina que poderão es- -49- 70 03Θ SCR 0254-SCRF 165.1 tar directamenta envolvidos na reaeção de ligação cruzadaj e, ba seada na análise da sequência de aminoácidos do fragmento 10 kDa da protease V8, a lisina na posição 125 é um grande candidato para essa função.

J

Os membros da família LeuCam exibem aparentemente a afini dade mais baixa das três famílias da Integrina humana pelos pépti dos RGD e podem ligar ligandos a que faltem sequências RGD £I--CAM, um ligando para LFA-1, a que falta uma sequência RGD Horuiitz et al., 0. Cell Biol., 103:2421 (1986)_7. A cadeia beta do LeuCam é a única das 5 sequências das cadeias beta determinadas que não tem uma lisina na posição correspondente ao resíduo 125 do GPIIIaj uma substituição não conservativa da lisina pela leucina ocorre. E também notado que comparando a sequência do GPIIIa às outras Integrinas que uma região não conservada, resíduos 129-149 do GPIIIa, é flanqueada por duas regiões altamente conservadas.

Esta região não conservada é um candidato claro para conferir fun ções ao GPIIb-IIIa, tal como a sua alta afinidade por ligandos múltiplos RGD, que a distinguem das outras Integrinas.

J

Mais ainda, deve ser notado que o local de ligação cruzada RGD no GPIIIa certamente não necessita de constituir o(s) sl-tio(s) de reconhecimento completo(s) envolvidos na ligação das proteínas adesivas tais como fibrinogénio a GPIIb-IIIa ou outras Integrinas. De facto, tem sido sugerido que o fibrinogénio pode ligar-se a regiões adicionais do GPIIb-IIIa /""Kornecki et al., 3. Biol. Chem., 258:8349 (1983), Parise et al., Blood Suppl., 70: :357a (l987)_J7 através das sequências não RGD, nomeadamente os aspectos das extremidades terminais C00H da cadeia gama do fibrinogénio Kloczemiak et al., Biochemistry, 23:1767 (1984). Embora péptidos de cadeia gama possam inibir a ligação e ligação cruzada dos péptidos RGD ao GPIIIa, Santoro et al., f~Cell. 48:867 (l987)_7 mostrou que estes péptidos se tornam ligados de modo cruzado ao GPIIb. 0s presentes estudos confirmaram estes resultados. 2. Síntese polipéptidica

Uma série de oito polipêptidos sobrepostos da região de ligação RGD identificada, foi sintetizada usando a técnica clás- -50- SCR 0254-SCRF 165.1 sica de fase sólida descrita por Merrifield, Adv. Enzvmol., 32: :221-96 (1969) adapta para utilização com um modela 430 de sinte tizadar de péptidos automático (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os polipéptidos, mostrados na Tabela 2, foram sintetizados com um tripéptido Cys-Gly-Gly (CGG) adicional (não mostrados na Tabela 2) com um ligante ligado entre a extremidade amino de cada polipéptido e a extremidade earbaxOo da glicina do tripéptido, de modo a permitir o acoplamento tiol do polipéptido a uma proteína veículo. Resinas polipeptldicas foram clivadas pelo fluoreto de hidrogénio, extraídas e analisadas quanto à sua pureza por croma-tografia líquida de alta precisão (HPLC) usando uma coluna C18 de fase reversa fabricada por Waters Associates, Milford, MA. 3, Preparação do antisoro policlonal

Os polipéptidos sintéticos preparados no Exemplo 2 foram acoplados a Ixemocianina de lapa fissurella (KLH) através do resíduo tiol presente no resíduo cisteína ligante para formar conjugados polipéptido-KLH. Rafâdhos Balb/c foram imunizados com 100 microgramas (y*g) de conjugado primeiro intraperitonialmente (IP) em adjuvante de Freund completo, e reforços foram então dados subcutaneamente e/ou intraperitonealmente em adjuvante de Freund incompleto.

Após três ou mais reforços, o antisoro é recolhido de ratl nhos que reagiram. 0 antisoro recolhido contém moléculas de anticorpos policlonais que imunorreagem com os polipéptidos imunizado, res.

Esta especificação, incluindo as concretizações e exemplos específicos, é suposta ser ilustrativa do presente invento e não deve ser tomada como limitante. Numerosas outras variantes e modificações podem ser realizadas sem se sair do espírito e alcance verdadeiros do presente invento.

Claims (7)

1. 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 -51- R E I 1/ I N Ο I C A Ç Õ E S 1 - Processo de preparação de um polipéptido com não mais do que 90 resíduos aminoácidos de comprimento com uma sequência que inclui uma sequência de resíduos aminoácidosrepresentada pela fórmula:. -DDSKNFSIQVRQVEDYPt/-, -EDYPl/DIYYLM, -LMDLSYSMKDDL-, -DDLWSIQNLGTKL-, -TKLATQMRKLTS-, -LTSNLRIGFGAFl/D-, -AFUDKPVSPYMYIS-, ou -YISPPEALENPCYD-, caracterizado por compreender os passos de: (a) reacção de uma resina de mono-oxigenase alfa-amidan-te de peptidilglicina com o grupo carboxilo de um aminoácido, com o grupo amino bloqueado, para formar um aminoácido, com o grupo amino bloqueado, ligado h resina; (b) separação da resina reagida de quaisquer aminoácidos, com o grupo amino bloqueado, não reagidos; (c) remoção do grupo bloqueador de amino para formar um grupo amino livre de um aminoácido ligado à resina; (d) separação da resina reagida contendo o grupo amino livre do meio reaccional; (e) acoplamento do grupo carboxilo de outro aminoácido com o grupo amino bloqueado com a resina contendo o grupo amino livre para formar uma ligação amida entre o grupo amino livre na resina e o grupo carboxilo do último aminoácido referido e um péptido ligado à resina; (f) separação do péptido ligado à resina, acoplado por uma ligação amida, de qualquer aminoácido, com o grupo amino blo queado, não reagido; -52- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 (g) repetição dos passos (c) a (f) até se preparar o péptido ligado à resina desejado; (h) clivagem do péptido da resina; e (i) recuperação do péptido.
2. 2 -Processo de preparação de um polipéptido com cerca de 60 a 90 resíduos aminoácidos em comprimento com uma sequência homóloga à da sequência de resíduos aminoácidos do GPIIIa representada pela fórmula: DYPI/DIYYLMDLS YSMKDDLWSIQNLGTKLATQMRKLTSNLRIGFGAR/DKPI/SPYMYISPPE caracterizado por compreender os passos de: (a) reacção de uma resina de mono-oxigenase alfa-amidaji te de peptidilglicina com o grupo carboxilo de um aminoácido, com o grupo amino bloqueado, para Formar um aminoácido, com o grupo amino bloqueado, ligado à resina; (b) separação da resina reagida de quaisquer aminoácidos, com o grupo amino bloqueado, não reagidos; (c) remoção do grupo bloqueador de amino para formar um grupo amino livre de um aminoácido ligado à resina; (d) separação da resina reagida contendo o grupo amino livre do meio reaccional; (e) acoplamento do grupo carboxilo de outro aminoácido com o grupo amino bloqueado com a resina contendo o grupo amino livre para formar uma ligação’ amida entre o grupo amino livre na resina e o grupo carboxilo do último aminoácido referido e um péptido ligado a resina; (f) separação do péptido ligado à resina, acoplado por uma ligação amida, de qualquer aminoácido, com o grupo amino blo queado, não reagido; (g) repetição dos passos (c) a (f) até se preparar o péptido ligado ã resina desejado; (h) clivagem do péptido da resina; e -53- 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 (i) recuperação do péptido.
3. 3 - Processo de preparação de um polipéptido correspondente em sequência de resíduos aminoácido à fórmula: (i) DYPVDIYYLMDLSYSMKDDLWSIQNLGTKLATQMRKLT-SNLRIGFGAFI/DKPVSPYMISPPE, (ii) GYPIDLYYLMDLSYSMLDDLRNVKKLGGDLLRALNEIT-ESGRIGFGSFl/DKTl/LPFVNTHP, ou (iii) DYPIDLYYLMDLSYSMKDDLENVKSLGTDLMNEMRRIT- SDFRIGFGSFMEKTl/MPYISTTP, caracterizado por compreender os passos de: (a) a reacção de uma resina de estireno-divinilbenzeno reticulada clorometilada com o grupo carboxilo de um aminoácido com o grupo amino bloqueado para formar um aminoácido, com o gru po amino bloqueado, ligado h resina; (b) separação da resina reagida de quaisquer aminoáci-dos, com o grupo amino bloqueado, não reagidos; (c) remoção do grupo bloqueador de amino para formar um grupo amino livre de um aminoácido ligado à resina; (d) separação da resina reagida contendo o grupo amino livre do meio reaccional; (e) acoplamento do grupo carboxilo de outro aminoácido com o grupo amino bloqueado com a resina contendo o grupo amino livre para formar uma ligação amida entre o grupo amino livre na resina e o grupo carboxilo do último aminoácido referido e um péptido ligado à resina; (f) separação do péptido ligado à resina, acoplado por uma ligação amida, de qualquer aminoácido, com o grupo amino blo queado, não reagido; (g) repetição dos passos (c) a (f) até se preparar o péptido ligado a resina desejado; (h) clivagem do péptido da resina; e (i) recuperação do péptido. -54- SCR 0254-SCRF 165.1
4. 4 - Processo de preparação de um segmento de nucleótidos compreendendo não mais do que cerca de 12 000 pares de bases de nucleótido incluindo uma sequência definindo um gene estrutural codificando um polipéptido de acordo com as reivindicaçães 1 ou 2, caracterizado por compreender a síntese química do referido segmento de-nucleótidos pelo método do fosfotriester.
5. 5 - Processo de preparação de uma composição terapêutica adequada para modular a adesão celular» caracterizado por compre ender os passos de: (a) preparação de um polipéptido de acordo com os processos das reivindicaçães 1 ou 2» b (b) mistura do polipéptido preparado no passo (a) com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
6. 6 - Processo de preparação de uma composição terapêutica adequada para modular a adesão celular, caracterizado por compreender os passos de: (a) fornecimento de um anticorpo policlonal que imunor-reage com um polipéptido preparado de acordo com a reivindicação 15 e (b) mistura do anticorpo policlonal do passo (a) com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
7. 7 - Processo de preparação de uma composição terapêutica adequada para modular a adesão celular, caracteriza-do por compreender os passos de: (a) fornecimento de um anticorpo monoclonal que imunor-reage com (i) um polipéptido preparado de acordo com o processo das reivindicaçães 1 ou 2, e (ii) com a subunidade beta da Inte-grina à qual corresponde a sequência de resíduos aminoácido do polipéptido; e com um (b) mistura do anticorpo monoclonal do passo (a) excipiente farmaceuticamente aceitável. 70 038 SCR 0254-SCRF 165.1 -55- Lisboa, -3. OliT. dí? Por SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION - 0 AGENTE OFICIAL -

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