JP2005533001A - インテグリンαｖβ３アンタゴニストを他の物質と併用投与する癌の予防または治療方法 - Google Patents

インテグリンαｖβ３アンタゴニストを他の物質と併用投与する癌の予防または治療方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、癌の治療、管理または予防のために設計された方法および組成物に関する。本発明の方法は、有効量の１種以上のインテグリンαvβ3アンタゴニストを単独で、または癌治療に有用な有効量の１種以上の他の薬剤の投与と組み合わせて投与することを含む。本発明はまた、１種以上のインテグリンαvβ3アンタゴニストおよび／または癌治療に有用な１種以上の他の薬剤を含む医薬組成物を提供する。特に、本発明は、治療的もしくは予防的有効量の１種以上のインテグリンαvβ3アンタゴニストを単独で、または癌の治療もしくは予防のための標準的および実験的治療と組み合わせて投与することによる、癌の治療および予防方法に関する。また、本発明の方法に従って用いることができるエピトープ特異的インテグリンαvβ3アンタゴニストのスクリーニング方法が提供される。更に、動物モデルの生検および臨床研究サンプルにおけるインテグリンαvβ3発現解析におけるインテグリンαvβ3アンタゴニストの使用を容易にする方法も企図される。

Description

本出願は、米国特許仮出願第60/361,859号（2002年３月４日出願）、米国特許仮出願第60/370,398号（2002年４月５日出願）、および米国特許仮出願第60/444,265号（2003年１月30日出願）の優先権を主張する（これらはそれぞれ、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
１．発明の分野
本発明は、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善のための治療法またはプロトコールに関する。そのようなプロトコールは予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3が単独で、または癌治療に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の治療物と併用して投与される。特に本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを単独で、または標準的もしくは実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法と併用して投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを手術とのみ併用して、または標準的もしくは実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法と併用して投与することを含む、方法を提供する。癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するのに使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、ある成分（moiety）（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合していてもしていなくてもよい。本発明の方法は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽細胞腫、卵巣癌、および他の組織（特に骨）に転移する可能性を有するかまたは転移している癌の予防、管理、治療、または改善に特に有用である。本発明はまた、本発明の方法に従って使用できるエピトープ特異的インテグリンαvβ3アンタゴニストのスクリーニング法を提供する。さらに本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するのに使用される医薬組成物およびキットを提供する。
２．発明の背景
癌
新生物または腫瘍は、良性または悪性の異常な抑制不可能な細胞増殖に起因する新生物塊である。良性腫瘍は一般に局在化している。悪性腫瘍はまとめて癌と呼ばれる。「悪性」という用語は、腫瘍が隣接する体の構造体に侵入および破壊し、遠くの部位まで拡散して死滅を引き起こすことを意味する（総説について、RobbinsとAngell、1976, Basic Pathology, 第２版、ダブリュー・ビー・ソンダース社（W.B. Saunders Co.）、フィラデルフィア、68〜122頁を参照）。癌はまた体の多くの部位で発生し、その起源により挙動が異なる。癌細胞はその起源である体の部分を破壊し、次に体の他の部分に広がり、そこで新しい増殖を開始し、さらなる破壊を引き起こす。
毎年120万人以上のアメリカ人が癌を発症する。癌は、アメリカ合衆国の２番目に大きい死因であり、この傾向が続くと、2010年までには死因の第１位になると予測される。アメリカ合衆国の男性では、肺癌と前立腺癌が主要な死因である。アメリカ合衆国の女性では、肺癌と乳癌が主要な死因である。アメリカ合衆国の男性２人に１人は、その生存中のある時期に癌であると診断されるであろう。アメリカ合衆国の女性３人に１人は、その生存中のある時期に癌であると診断されるであろう。
癌に対する治療法は未だ発見されなければならない。現在の治療選択、例えば外科手術、化学療法および放射線療法は、しばしば無効であるか、あるいは深刻な副作用がある。
癌治療法
現在、癌治療法は、患者の新生物細胞を根絶するために手術、化学療法、ホルモン療法、および／または放射線療法を行う（例えば、Stockdale, 1998、「癌患者の管理の原理（Principles of Cancer Patitent Management）」、Scientific American: Medicine, vol. 3, RubernsteinとFederman編、第12章、セクションIVを参照）。最近癌療法に、生物学的療法または免疫療法を行うことがある。これらのアプローチの多くは、患者に大きな不利益を与える。例えば手術は、患者の健康によっては禁忌であり、患者が受け入れることができないことがある。さらに手術では、新生物組織を完全に除去しないことがある。放射線療法は、新生物組織が正常組織より放射線に対する感受性が高い場合にのみ有効であり、かつ放射線療法はしばしば重症の副作用を誘発することがある。ホルモン療法が単独に行われることは珍しく、これは有効ではあるが、他の治療法が癌細胞の大部分を除去した後に癌の再発を防ぐかまたは遅らせるために使用される。生物学的療法／免疫療法は、回数が限定されており、発疹または腫張、インフルエンザ様症状（熱、悪寒、疲労を含む）、消化管障害、またはアレルギー反応を引き起こすことがある。
化学療法については、癌の治療のために種々の化学療法剤が利用できる。大部分の癌化学療法剤は、DNA複製と同時の細胞分裂を防ぐために、DNA合成を阻害することにより直接に、またはデオキシリボヌクレオチド３リン酸前駆体の生合成を阻害することにより間接に作用する（例えば、Gilmanら、GoodmanとGilman：治療薬の薬理学的基礎（Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics）、第８版（パーガモンプレス（Pergamom Press）、ニューヨーク、1990年を参照）。これらの物質（ニトロソ尿素のようなアルキル化剤、メソトレキセートやヒドロキシ尿素のような抗代謝物、およびエトポシド、カンパテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなどの他の物質を含む）は、必ずしも細胞サイクル特異的ではないが、DNA複製に対するその作用のためにS期の細胞を死滅させる。他の物質（具体的にはコルヒチンとビンカアルカロイド、例えばビンブラスチンおよびビンクリスチン）は、微小管集合を妨害して分裂を停止させる。化学療法プロトコールは一般に、化学療法剤を併用して投与して治療の有効性を上昇させる。
種々の化学療法剤を利用できるが、化学療法は多くの欠点を有する（例えば、Stockdale, 1998、「癌患者の管理の原理（Principles of Cancer Patitent Management）」、Scientific America: Medicine, vol. 3, RubernsteinとFederman編、第12章、セクション10を参照）。ほとんどすべての化学療法剤は有害であり、化学療法は、大きくかつしばしば危険な副作用（重症の吐き気、骨髄陥没、免疫抑制などを含む）を引き起こす。さらに化学療法剤を併用投与しても、多くの腫瘍細胞は化学療法剤に対して耐性であるかまたは耐性を獲得する。実際、治療プロトコールで使用される特定の化学療法剤に耐性の細胞は、しばしば他の薬剤（具体的な治療で使用される薬剤の作用機序とは異なる機序で作用する薬剤でも）についても耐性であることがある；この現象は、多面的または多剤耐性と呼ばれる。従って薬剤耐性のために多くの癌は、標準的化学療法プロトコールに対して耐性である。
特に手術、放射線療法、化学療法、およびホルモン療法のような標準的癌治療法に対して耐性である癌の治療のために、代替癌治療法に対する大きなニーズがある。さらに、１つの方法だけで癌が治療されることはまれである。従って、癌治療のための新しい治療薬、および癌治療のための新しくさらに有効な治療法の組合せの開発に対するニーズがある。
３．発明の要約
本発明は、癌の現在の単一薬剤療法または併用療法よりも優れた予防または治療プロフィールを提供する治療プロトコールを包含する。特に本発明は、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善のためのインテグリンαvβ3のアンタゴニストの使用を包含する。本発明は、インテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体）の予防または治療効果を増強する治療プロトコールを包含する。本発明はまた、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための、成分（例えば治療物質または治療薬）に結合または融合したインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体）の使用を包含する。
本発明は、臓器または組織（例えば骨）に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体）を１回以上投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態において本発明は、骨に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを１回以上投与することを含む方法を提供する。好適な実施形態において本発明は、骨に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に予防的または治療的有効量の１つ以上の抗体またはインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合するその断片を１回以上投与することを含む方法を提供する。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に、成分（例えば治療物質または治療薬）に融合または結合した予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくはインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体、さらに好ましくはVITAXIN（登録商標）もしくはその抗体結合断片）を１回以上投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態において本発明は、臓器または組織（例えば骨）に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に、成分（例えば治療物質または治療薬）に融合または結合した予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを１回以上投与することを含む方法を提供する。好適な実施形態において本発明は、骨に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に、成分（例えば治療物質または治療薬）に融合または結合したインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する、予防的または治療的有効量の１つ以上の抗体またはその断片を１回以上投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において本発明は、骨に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に、成分（例えば治療物質または治療薬）に融合または結合した予防的または治療的有効量のVITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片を１回以上投与することを含む方法を提供する。インテグリンαvβ3のアンタゴニスト（例えば、抗インテグリンαvβ3抗体またはその断片）が融合または結合することができる成分の例には、特に限定されないが、後述のセクション5.5.1に開示の物質がある。
本発明は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストがインテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の治療物（例えば、予防薬または治療薬）と併用して使用される、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善のためのプロトコールを包含する。本発明は一部は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストが、他の癌治療（現在の標準的かつ実験的化学療法を含む）が引き起こす副作用と、相乗作用するか、その有効性を増強するか、その抵抗性を改善するか、および／またはそれを低下させるという認識に基づく。本発明の併用療法は、付加的効力、付加的治療効果、または相乗作用を有する。本発明の併用療法は、被験体のクオリティオブライフを改善しおよび／または予防または治療効果を達成するために、癌の予防、管理、治療、または改善のためにインテグリンαvβ3のアンタゴニストと併用して使用される治療物（例えば、予防薬または治療薬）の用量を低下させることを可能にし、癌を有する該被験体へのそのような予防薬または治療薬の投与頻度を減少させることができる。さらに本発明の併用療法は、被験体のクオリティオブライフを改善しおよび／または予防または治療効果を達成するために、癌を有する被験体への、１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストの用量を低下させることを可能にし、および／または１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストの投与頻度を減少させることができる。さらに本発明の併用療法は、癌のための現在の単一薬剤治療法および／または既存の併用療法の投与に関連する好ましくないかまたは有害な副作用を低下または回避し、これは治療プロトコールへの患者のコンプライアンスを改善する。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、癌またはその１つ以上の症状の予防、治療、管理または改善に有用な、予防的または治療的有効量の１つ以上の治療物を併用して投与することを含む方法を提供する。１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストと併用して使用できる癌治療の例には、特に限定されないが後述のセクション5.6に開示されるものがある。ある実施形態においてインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3のアンタゴニストと同じ機序で作用する別の癌治療と併用して、必要な被験体に投与される。別の実施形態においてインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3のアンタゴニストと異なる機序で作用する別の癌治療と併用して、必要な被験体に投与される。例えば特に限定されないが、癌治療は、アポトーシス誘導性、細胞障害性、抗細胞分裂性、チュブリン安定化、微小管形成阻害性、トポイソメラーゼ活性、抗代謝性、またはDNA相互作用性物質がある。他の実施態様において、インテグリンαvβ3のアンタゴニストとともに投与される癌治療は、遺伝子治療に基づく。他の実施形態において治療は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストではない別の抗体である。
ある実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、標準的または実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法を併用して投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを手術のみと併用して、または標準的または実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法をさらに併用して投与することを含む方法を提供する。これらの実施形態において、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善するのに使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、成分（例えば治療物質または治療薬）に結合または融合してもしていなくてもよく、そのようなアンタゴニストは好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片である。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合するβ抗体）を、癌治療薬ではない１つ以上の治療薬（非癌治療法としても知られている）と併用して投与することを含む方法を提供する。そのような物質の例には、特に限定されないが、抗催吐剤、抗真菌剤、抗細菌剤（例えば抗生物質）、抗炎症剤、および抗ウイルス剤がある。抗催吐剤の非限定例には、メトピマジンとメトクロプラミドがある。抗真菌剤の非限定例には、アゾール剤、イミダゾリル、トリアゾール、ポリエン、アンホテリシンおよびピリミジンがある。抗細菌剤には、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン、セファロスポリン、イミペネム、アキストレオナム、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチオマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、レファンピン、ポリミキシン、アンホテリシンB、ナイスタチン、ケトコナゾール、イソニアジド、メトロニダゾールおよびペンタミジンがある。抗ウイルス剤の非限定例には、ヌクレオチド類似体（例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクリビル、ビダルビン、イドクスリジン、トリフルリジン、リバビリン）、フォスカレット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、インターフェロン（「IFN」）-α、βまたはγ、およびAZTがある。抗炎症剤の非限定例には、非ステロイド抗炎症剤（「NSAID」）、ステロイド抗炎症剤、ベータアゴニスト、抗コリン作動薬、およびメチルキサンジンがある。
具体的な実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、癌治療薬ではない予防的または治療的有効量の１つ以上の治療薬と併用して投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、癌治療薬ではない予防的または治療的有効量の１つ以上の治療薬と、および標準的または実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法とを併用して投与することを含む方法を提供する。これらの実施形態において被験体は、手術を受けるかまたはすでに受けていてもよく、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するために使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしなくてもよい。
ある実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、予防的または治療的有効量の１つ以上の化学療法のみと併用して、または随時、インテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の、予防的または治療的有効量のホルモン療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法の１回以上の投与とを併用して投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、予防的または治療的有効量の１つ以上のホルモン療法のみと併用して、または随時、インテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の、予防的または治療的有効量の化学療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法の１回以上の投与とを併用して投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、予防的または治療的有効量の１つ以上の生物学的療法／免疫療法のみと併用して、または随時、インテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の、予防的または治療的有効量の化学療法、ホルモン療法、および／または放射線療法の１回以上の投与とを併用して投与することを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、予防的または治療的有効量の１つ以上の放射線療法のみと併用して、または随時、インテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の、予防的または治療的有効量の化学療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法の１回以上の投与とを併用して投与することを含む方法を提供する。これらの実施形態において被験体は、手術を受けるかまたはすでに受けていてもよく、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するために使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしなくてもよい。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、インテグリンαvβ3のアンタゴニストを手術と併用して投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを手術と併用して投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、成分（治療物質または治療薬）に結合または融合した予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、手術と併用して投与することを含む方法を提供する。これらの実施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストは、好ましくはインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体であり、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片である。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、(a) 必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体またはその断片）と予防的または治療的有効量の１つ以上の抗癌治療物を投与し；および(b) 以後１回以上、該インテグリンαvβ3アンタゴニストを投与して、インテグリンαvβ3活性を継続して阻止する好ましいレベル（例えば、約0.1〜約100μg/ml）にアンタゴニストの血漿濃度を維持する、ことを含む方法を提供する。具体的な実施形態においてアンタゴニストの血漿濃度は、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、または50μg/mlで維持される。
具体的な実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくはVitaxin（登録商標）、またはその抗原結合断片）を、予防的または治療的有効量の１つ以上の化学療法剤（特に限定されないが、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル、タキサン類（例えば、ドセタキセルとパクリタキセル）、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、ビンブラスチン、ダカルバジン、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチンとロムスチン）、ビンカアルカロイド、白金化合物、シスプラチン、ミトマイシン、ビノレルビン、ゲンシタビン、カルボプラチン、ヘキサメチルメラミンおよび／またはトポテカン）の１回以上の投与とを併用して投与することを含む方法を提供する。そのような方法は、随時、予防的または治療的有効量の他の癌治療物（例えば特に限定されないが、放射線療法、生物学的療法、ホルモン療法、および／または手術）を１回以上投与することをさらに含む。別の実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト、好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片の１回以上の投与を、予防的または治療的有効量の１つ以上の癌治療薬（ここで、癌治療薬は癌化学療法剤ではない）の１回以上の投与と併用して投与することを含む方法を提供する。
具体的な実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、インテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくはVitaxin（登録商標）、またはその抗原結合断片）を、１つ以上の免疫調節剤（特に限定されないが、サイトカインおよび抗体を含む）と併用して投与することを含む方法を提供する。好適な実施形態において免疫調節剤は、免疫抑制剤である。ある実施形態において免疫調節剤は、癌化学療法剤である。他の実施態様において免疫調節剤は、化学療法剤以外の物質である。さらに別の実施形態において免疫調節剤は、インターロイキンまたは造血因子（例えば、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、M-CSF、G-CSF、IL-3およびエリスロポエチン）以外の物質である。
別の具体的な実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくはVitaxin（登録商標）、またはその抗原結合断片）１回以上の投与を、予防的または治療的有効量の１種類以上の免疫調節剤、例えば外部放射線療法、ラジオアイソトープ（I-125、パラジウム、およびイリジウム）の間質性移植、ストロンチウム-89のようなラジオアイソトープ、胸部放射線療法、腹腔内P-32放射線療法、および／または全腹部および骨盤放射線療法の１回以上の投与と併用して投与することを含む方法を提供する。そのような方法は、随時、予防的または治療的有効量の他の癌治療、例えば特に限定されないが、化学療法、生物学的療法／免疫療法、ホルモン療法、および手術の１回以上の投与をさらに含む。
具体的な実施形態において本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニストの１回以上の投与を、インテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の予防的または治療的有効量の１つ以上の生物学的療法／免疫療法またはホルモン療法の１回以上の投与とを併用して投与することを含む方法を提供する。そのような方法は随時、予防的または治療的有効量の他の癌治療（例えば特に限定されないが放射線療法、化学療法、および／または手術）の１回以上の投与をさらに含む。そのような生物学的療法／免疫療法の例には、特に限定されないが、タモキシフェン、ロイプロリドまたは他のLHRHアゴニスト、非ステロイド抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド）、ステロイド抗アンドロゲン（酢酸シプロテロン）、エストロゲン（DES、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、結合エストロゲンU.S.P.、DES-ジホスフェート）、アミノグルテチミド、ヒドロコーチゾン、フルタミド離脱、プロゲステロン、ケトコナゾール、プレドニソン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子−アルファ、およびメルファランがある。生物学的療法はまた、サイトカイン、例えば特に限定されないが、アポトーシスを誘導するTRAIL抗癌アゴニストのようなTNFリガンドファミリーメンバー、DR4およびDR5（デスドメイン含有受容体4と5（Death Domain Containing Receptors 4 and 5))としても知られているTRAIL受容体1と2に結合するTRAIL抗体、ならびにDR4とDR5がある。TRAILとTRAIL抗体、リガンドおよび受容体は当該分野で公知であり、US Patent No. 6,342,363、6,284,236、6,072,047、および5,763,223に記載されている。
ある実施形態において本発明の方法で使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片である。好適な実施形態において本発明の方法で使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、LM609抗体、またはそこから得られるインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体（例えば、キメラおよびヒト化LM609、例えば抗体Vitaxin（登録商標））である。そのような抗体は、国際特許公報WO89/05155、WO98/33919およびWO00/78815ならびにUS Patent No. 5,753,230に記載されている（これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。具体的な実施形態において本発明の方法で使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3への結合において、LM609またはVitaxin（登録商標）、またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその断片である。この実施形態においてインテグリンαvβ3への結合において、LM609またはVitaxin（登録商標）、またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその断片は、モノクローナル抗体D12や、国際特許公報WO98/40488に開示されているその抗原結合断片を含まない。
別の実施形態において本発明は、Ecr（内皮細胞と黒色腫細胞の両方の表面上に見いだされるRGD指令接着受容体）と免疫反応する抗体を提供する。接着受容体を含有する細胞が、ビトロネクチン、フィブロネクチンまたはフォンウィルブラント因子からなる内皮下マトリックスに接着する能力を阻害するのに有用な抗体が、本発明に包含される。また、インテグリンαvβ3の機能活性を阻害するか、またはインテグリンαvβ3介在病理を阻害する抗体も、本発明に包含される。従って本発明は、血管形成の阻害、またはインテグリンαvβ3に仲介されるかまたは影響される他の機能（特に限定されないが、細胞増殖、細胞付着、細胞遊走、顆粒化組織成長、ある炎症）の阻害に有用な抗体を提供する。そのような抗体は、国際特許公報WO89/05155、WO98/33919およびWO00/78815、ならびにUS Patent No. 5,753,230に記載されている（これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
本発明は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストを単独で、または他の癌もしくは非癌治療物と併用して、必要な被験体に投与するプロトコールを提供する。本発明の併用療法の治療物（例えば、予防薬または治療薬）は、同時または逐次的に被験体に投与することができる。本発明の併用療法の治療物（例えば予防薬または治療薬）はまた、循環して投与することもできる。循環療法は、治療（例えば、薬剤）の１つに対する耐性の出現を低下させるために、治療（例えば、薬剤）の１つの副作用を回避するかまたは低下させるために、および／または治療の効力を改善するために、ある期間の第１の治療（例えば、第１の予防薬または治療薬）の投与と、次にある期間の第２の治療（例えば、第２の予防薬または治療薬）とを含み、この逐次的投与（すなわちサイクル）を繰り返す。
本発明の併用療法の治療物（例えば、予防薬または治療薬）は、被験体に同時に投与することができる。用語「同時に」は、正確に同時の治療物（例えば、予防薬または治療薬）の投与に限定されず、むしろ、インテグリンαvβ3のアンタゴニストと別の治療物）が被験体に、連続してかつある時間範囲内（インテグリンαvβ3が他の治療物と一緒に作用して、これらを同時でなく投与した場合より利点が増強するように）で投与されることを意味する。例えば各治療物は被験体に、同時にまたは逐次的に、異なる時点で任意の順序で投与されるが、同時ではなくでも、所望の治療効果または予防効果を提供するように、充分に近い時間に投与すべきである。各治療物は被験体に別々に、任意の適切な型でかつ任意の適当な経路で投与することができる。種々の実施形態において治療物（例えば、予防薬または治療薬）は、被験体に15分未満に、30分未満に、１時間未満離れて、約１時間離れて、約１時間〜２時間離れて、約２時間〜３時間離れて、約３時間〜４時間離れて、約４時間〜５時間離れて、約５時間〜６時間離れて、約６時間〜７時間離れて、約７時間〜８時間離れて、約８時間〜９時間離れて、約９時間〜時10間離れて、約10時間〜11時間離れて、約11時間〜時12間離れて、24離れて、48時間離れて、72時間離れて、または１週間離れて投与される。好適な実施形態において、患者の１回の通院で２または３つの治療物（例えば、予防薬または治療薬）が投与される。
併用療法の予防薬または治療薬は、同じ医薬組成物中で被験体に投与することができる。あるいは併用療法の予防薬または治療薬は、同時に別の医薬組成物中で被験体に投与することができる。予防薬または治療薬は、被験体に同じかまたは異なる投与経路で投与される。
本発明は、１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。本発明はまた、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合した１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。本発明は、インテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の１つ以上の予防薬または治療薬と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物の使用を包含する。本発明は、１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト、インテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善に有用な１つ以上の予防薬または治療薬、および薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合した１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト、インテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善に有用な１つ以上の予防薬または治療薬、および薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善のために、本発明の方法に従って使用される。好ましくは本発明の医薬組成物は無菌であり、癌を有する被験体への特定の投与法に適した形である。
本発明の方法と組成物は、特に限定されないが後述のセクション5.1.1.1に開示した癌を含む癌の予防、管理、治療、または改善に有用である。本発明で予防、管理、治療、または改善することができる癌の具体例には、特に限定されないが、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸または他の消化管、胃、脾臓、平滑筋、皮下組織、前立腺、乳房、卵巣、精巣または他の生殖臓器、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または中枢神経系の癌がある。具体的な実施形態において本発明の方法と組成物は、インテグリンαvβ3を発現する原発性または続発性癌の予防、管理、治療、または改善に使用される。別の実施形態において本発明の方法と組成物は、インテグリンαvβ3を発現しない原発性または続発性癌の予防、管理、治療、または改善に使用される。好適な実施形態において方法と組成物は、他の組織または臓器（例えば骨）に転移する可能性を有するかまたは転移している癌の予防、管理、治療、または改善に使用される。好適な実施形態において本発明の方法と組成物は、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、骨癌または乳癌の予防、管理、治療、または改善に使用される。
本発明の方法と組成物は、未治療の癌患者のみでなく、現在の標準的および実験的癌治療法（特に限定されないが、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、放射線療法、および手術を含む）に部分的または完全に抵抗性の癌患者の管理または治療にも有用である。具体的な実施形態において本発明の方法と組成物は、インテグリンαvβ3アンタゴニストの投与を含む治療以外の治療に抵抗性または非応答性であることが証明されている癌の、予防、管理、治療、または改善に有用である。好適な実施形態において本発明の方法と組成物は、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片の投与を含む治療に抵抗性または非応答性であることが証明されている癌の、予防、管理、治療、または改善に有用である。本発明の方法と組成物は、望ましくない、または有害な副作用のためにインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくはインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片、好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）以外の治療を許容しない患者の、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善に有用である。
本発明はまた、インテグリンαvβ3のアンタゴニストのスクリーニング法を提供する。ある実施形態において、例えばインテグリンαvβ3のリガンド特異性を変化させおよび／またはサブユニット鎖のヘテロダイマー化を破壊するために、インテグリンαvβ3のサブユニットにアミノ酸置換が行われる。具体的な実施形態においてそのようなアミノ酸置換は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストとインテグリンαvβ3エピトープとの特異的相互作用を破壊する。好適な実施形態においてアミノ酸置換は、リガンド結合特異性、好ましくはLM609および／またはVitaxin（登録商標）のリガンド結合特異性を与えるインテグリンサブユニットの領域内に行われる。具体的な実施形態において、Vitaxin（登録商標）への結合を破壊するために、ヒトβ3サブユニットのアミノ酸171、173および174は、好ましくはそれぞれGln、IleおよびLysで置換される。別の好適な実施形態において、β3 サブユニットのアミノ酸171、173、174、179、および182にそれぞれGln、Ile、Lys、ThrおよびSerを用いて、アミノ酸置換が行われる。従って、アミノ酸置換されたインテグリンαvβ3のサブユニットは、野生型インテグリンαvβ3には結合するが変異型には結合しないモノクローナル抗体を同定することにより、特定のエピトープに対する特異的親和性を有する抗体をスクリーニングするのに使用することができる。別の実施形態において本発明の方法は、ヘテロダイマーのヒトβ3 鎖のアミノ酸164〜202の領域に結合するアンタゴニストのスクリーニングを含む。さらに本発明は、ヘテロダイマー化αvβ3に結合するが、ヘテロダイマー中に含まれない時αvまたはβ3鎖に結合しないモノクローナル抗体を同定するための方法を与える。そのようなスクリーニング法を使用して同定される抗体は、単独または他の治療と併用して、インテグリンαvβ3介在疾患またおよび障害またはその１つ以上の症状（特に限定されないが、癌、炎症性疾患、および自己免疫疾患を含む）の予防、治療、管理または改善に使用することができる。好ましくはこれらの抗体は、LM609、Vitaxin（登録商標）、D12、または１つ以下、２つ以下、５個以下、８個以下、10個以下のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する、LM609、Vitaxin（登録商標）、またはD12のCDRを有する抗体もしくは抗原結合断片ではない。
本発明は、検出可能な物質に結合または融合した１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を使用して、癌の進行を検出、診断および／または追跡する方法を提供する。特に動物モデルおよび臨床試験の生検中のインテグリンαvβ3の分析におけるインテグリンαvβ3アンタゴニストの使用を促進する方法も提供される。
本発明は、癌の予防、治療、管理、改善、検出、追跡または診断で使用される、１つ以上の容器中の、検出可能な物質、治療物質または治療薬に結合または融合した１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を含むキットを提供する。本発明はまた、癌の予防、治療、管理、改善、検出、追跡または診断で使用される、第１のバイアル中に１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を含み、第２のバイアル中にインテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の１つ以上の予防薬または治療薬とを含むキットを提供する。本発明はまた、本発明はまた、癌の予防、治療、管理、改善、検出、追跡または診断で使用される、第１のバイアル中に、治療物質または治療薬に結合または融合した１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を含み、第２のバイアル中にインテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の１つ以上の予防薬または治療薬とを含むキットを提供する。キットはさらに、包装材料および／または説明書を含有してもよい。
本発明はまた、製造物品を提供する。
3.1. 技術用語
本明細書中で用いる「補助」なる用語は、「組み合わせて（in combination）」または「組み合わせの（combinatorial）」と相互変換可能に用いられる。こうした用語は、２以上の治療薬または予防薬が同じ疾患の治療または予防に影響する場合にも用いられる。
本明細書中で用いる、タンパク性剤（proteinaceous agent）（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および抗体）に関する「類似体」なる用語は、第2のタンパク性剤と類似したまたは同じ機能を保持するタンパク性剤をさすが、必ずしも第2のタンパク性剤と類似したまたは同じアミノ酸配列から構成されず、または第2のタンパク性剤と類似したまたは同じ構造を保有しない。類似したアミノ酸配列をもつタンパク性剤は、以下の少なくとも１つを満たす第2のタンパク性剤をさす：(a) 第2のタンパク性剤のアミノ酸配列に対して少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク性剤；(b) 少なくとも5個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少なくとも60個連続したアミノ酸残基、少なくとも70個連続したアミノ酸残基、少なくとも80個連続したアミノ酸残基、少なくとも90個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、少なくとも125個連続したアミノ酸残基、または少なくとも150個連続したアミノ酸残基の第2のタンパク性剤をコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるタンパク性剤；および(c) 第2のタンパク性剤をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一であるヌクレオチド配列によりコードされるタンパク性剤。第2のタンパク性剤と類似した構造をもつタンパク性剤とは、第2のタンパク性剤と類似した二次、三次または四次構造をもつタンパク性剤のことである。タンパク性剤の構造は当業者に公知の方法により決定することができ、かかる方法として、限定するものではないが、ペプチドのアミノ酸配列決定、X線結晶学、核磁気共鳴、円偏光二色性、および結晶電子顕微鏡が挙げられる。
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適な比較のために配列同士をアラインメントする（例えば、第2のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第1のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のある位置が第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、それらの分子はその位置で同一となる。2つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝重なり合う同一位置の数／位置の総数×100％）。ある実施形態では、2つの配列が同じ長さである。
2つの配列間の同一性パーセントはまた、数学的アルゴリズムを使っても決定することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好適な非限定的例は、KarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877に記載されるように改変された、KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264-2268に記載のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはAltschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメーターセット（例えば、スコア＝100、ワード長＝12）を用いて行うことにより、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラムパラメーターセット（例えば、スコア＝50、ワード長＝3）を用いて行うことにより、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップを挿入したアラインメントを得るためには、Gapped BLASTをAltschulら, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されるように使用する。あるいはまた、PSI-BLASTを用いて、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うこともできる（同上）。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターが使用される（例えば、NCBIウェブサイトを参照のこと）。配列比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的例は、MyersおよびMiller, 1988, CABIOS 4: 11-17に記載のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用する場合は、PAM120加重残基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティー12、およびギャップペナルティー4が用いられる。
2つの配列間の同一性パーセントは、上述したものと類似の技法を用いて、ギャップを挿入してまたは挿入しないで決定することができる。同一性パーセントを計算するには、典型的には、正確な一致（マッチ）だけを数える。
本明細書中で用いる、非タンパク性類似体に関する「類似体」なる用語は、第1の有機もしくは無機分子と類似したまたは同じ機能を有し、かつ第1の有機もしくは無機分子と構造上類似している第2の有機もしくは無機分子をさす。
本明細書中で用いる「アンタゴニスト」とは、別の分子の機能、活性および／または発現を遮断し、阻害し、抑制し、または中和する任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体（peptidomimetic）、糖タンパク質、抗体、抗体断片、炭水化物、核酸、有機分子、無機分子、大分子、または小分子をさす。様々な実施形態において、アンタゴニストは、別の分子の機能、活性および／または発現を、リン酸緩衝溶液（PBS）のような対照と比べて、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％低減させる。
本明細書中で用いる「抗体」なる用語は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fvs (scFv)、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド架橋Fvs (sdFv)、および抗イディオタイプ（抗Id）抗体 (例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、ならびに前記抗体のエピトープ結合断片をさす。特に、抗体には免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片（すなわち抗原結合部位を含む分子）が含まれる。免疫グロブリン分子はどのようなタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスのものであってもよい。
本明細書中で用いる「抗インテグリンαvβ3抗体」および「インテグリンαvβ3抗体」なる用語は、下記のセクション5.4に記載の抗体をいう。
本明細書中で用いる、タンパク性剤（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および抗体）に関する「誘導体」なる用語は、アミノ酸残基の置換、欠失および／または付加の導入により改変されたアミノ酸配列を含んでなるタンパク性剤をさす。本明細書中で用いる「誘導体」とは、そのタンパク性剤への任意のタイプの分子の共有結合により修飾されたタンパク性剤のことも意味する。例えば、限定するものではないが、抗体は、グリコシル化、アセチル化、ペグ(PEG)化、リン酸化、アミド化、誘導体化（公知の保護基／ブロッキング基による）、タンパク質加水分解による切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって修飾することができる。タンパク性剤の誘導体は当業者に公知の技法を用いて化学的修飾により調製することができ、例えば、限定するものではないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれる。さらに、タンパク性剤の誘導体は１個以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。タンパク性剤の誘導体はそれが誘導されたもとのタンパク性剤と類似のまたは同一の機能を保持している。
本明細書中で用いる、非タンパク性誘導体に関しての「誘導体」なる用語は、第1の有機または無機分子の構造に基づいて形成される第2の有機または無機分子をさす。有機分子の誘導体には、限定するものではないが、例えば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシルまたはアミノ基の付加または欠失により、修飾された分子が含まれる。有機分子はまた、エステル化、アルキル化および／またはリン酸化で修飾してもよい。
本明細書中で用いる「障害」および「疾患」なる用語は、相互交換可能に使用され、被験者の状態または症状をさす。ある種の状態または症状は２以上の障害として特性付けされることがあり得る。
本明細書中で用いる「有効量」なる用語は、癌またはその１以上の症状の重篤度、持続期間および／または進行を低下または改善するか、癌の１以上の症状を改善するか、癌の進展を予防するか、癌の退縮を引き起こすか、癌またはその１以上の症状の再発、発達、または発症を予防するか、あるいは別の治療（例えば予防薬または治療薬）の予防効果または治療効果を増大または改善するために十分な治療（例えば予防薬または治療薬）の量をいう。
本明細書中で用いる「エピトープ」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの体内で抗原または免疫原活性を有するポリペプチドまたはタンパク質の断片をさす。免疫原活性のあるエピトープは、動物の体内で抗体応答を引き出すポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原活性のあるエピトープは、当業者に公知の方法（例えば、イムノアッセイ、下記セクション5.2.1.2参照）で測定したとき、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性のあるエピトープが必ずしも免疫原性である必要はない。
本明細書中で用いる「断片」なる用語は、別のポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも5個の連続したアミノ酸残基、少なくとも10個の連続したアミノ酸残基、少なくとも15個の連続したアミノ酸残基、少なくとも20個の連続したアミノ酸残基、少なくとも25個の連続したアミノ酸残基、少なくとも40個の連続したアミノ酸残基、少なくとも50個の連続したアミノ酸残基、少なくとも60個の連続したアミノ酸残基、少なくとも70個の連続したアミノ酸残基、少なくとも80個の連続したアミノ酸残基、少なくとも連続した90個のアミノ酸残基、少なくとも連続した100個のアミノ酸残基、少なくとも連続した125個のアミノ酸残基、少なくとも連続した150個のアミノ酸残基、少なくとも連続した175個のアミノ酸残基、少なくとも連続した200個のアミノ酸残基、または少なくとも連続した250個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはポリペプチドをさす。特定の実施形態においては、タンパク質またはポリペプチドの断片はそのタンパク質またはポリペプチドの機能を少なくとも１つ保持している。別の実施形態においては、タンパク質またはポリペプチドの断片は、タンパク質またはポリペプチドの２つ、３つ、４つ、または５つの機能を保持している。好ましくは、抗体の断片は、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する能力を保持する。
本明細書中で用いる「融合タンパク質」なる用語は、第1のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドその機能性断片、類似体もしくは誘導体のアミノ酸配列と、異種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（すなわち、第1のタンパク質またはその断片、類似体もしくは誘導体とは異なる第2のタンパク質もしくはポリペプチド、またはその断片、類似体もしくは誘導体）のアミノ酸配列とを含んでなるポリペプチドをさす。一つの実施形態では、融合タンパク質は異種のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに融合された予防薬もしくは治療薬を含む。この実施形態によれば、異種のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは異なるタイプの予防薬もしくは治療薬であっても、異なっていなくても良い。例えば、免疫調節活性を有する2つの異なるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを融合して融合タンパク質を形成しても良い。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに融合させる前のもとのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの活性と比べて、改善された活性を有しているか、あるいは保持している。
本明細書中で用いる「宿主細胞」なる用語は、ある核酸分子でトランスフェクトまたは形質転換された特定の対象細胞およびそのような細胞の子孫または潜在的子孫を含む。そのような細胞の子孫は、後の世代で起こりうる突然変異もしくは環境上の影響のため、あるいは核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組込みのため、その核酸分子でトランスフェクトまたは形質転換された親細胞と同一でなくてもよい。
本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件のことであり、これらの条件のもとでは、典型的には、互いに少なくとも30％（好ましくは35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または98％）同一であるヌクレオチド配列同士が互いとハイブリダイズしたままで存在する。そのようなストリンジェント条件は当業者に公知であり、また、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に載っている。一つの非限定的例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中約45℃でのハイブリダイゼーション、続いて、0.1X SSC、0.2% SDS中約68℃での１回以上の洗浄からなる。好ましい非限定的例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6XSSC中約45℃でのハイブリダイゼーション、続いて、0.2X SSC、0.1% SDS中約50〜65℃での１回以上の洗浄（すなわち、50℃、55℃、60℃または65℃での１回以上の洗浄）からなる。本発明の核酸は、これらの条件下で、AまたはTヌクレオチドのみからなるヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸分子を含まないことが理解される。
本明細書中で用いる「免疫調節薬」なる用語およびその複数形、「免疫調節剤」または「イミュノモジュラント」を含むがそれに限らない変形語は、宿主の免疫系を調節する薬剤（作用薬）をさす。特定の実施形態において、免疫調節薬は被験者の免疫応答の一態様をシフトさせる薬剤である。ある実施形態において、免疫調節薬は被験者の免疫系を抑制または低下させる薬剤（すなわち免疫抑制薬）である。他の特定の実施形態では、免疫調節薬は被験者の免疫系を活性化または上昇させる薬剤（すなわち免疫刺激薬）である。本発明によれば、本発明の併用療法で用いる免疫調節薬にはインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体が含まれない。免疫調節薬としては、限定するものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えば、限定するものではないがアンチセンスヌクレオチド配列、トリプルヘリックス、および生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAおよびRNAヌクレオチド）、抗体、合成もしくは天然の無機分子、ミメチック薬剤、および合成もしくは天然の有機分子が挙げられる。
本明細書中で用いる「抗原と免疫特異的に結合する」なる用語および同様の用語は、ある抗原または断片と特異的に結合するが、他の抗原とは特異的に結合しないペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、および抗体もしくはその断片をさす。抗原と免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体は、例えば、イムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野で公知の他のアッセイで測定したとき、より低い親和性でもって他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と結合してもよい。抗原と免疫特異的に結合する抗体または断片は、関連した抗原と交差反応してもよい。好ましくは、抗原と免疫特異的に結合する抗体または断片は他の抗原とは交差反応しないものである。
本明細書中で用いる「インテグリンαvβ3と免疫特異的に結合する」なる用語および同様の用語は、インテグリンαvβ3またはその断片と特異的に結合するが、他の抗原とは特異的に結合しないペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、および抗体またはその断片をさす。インテグリンαvβ3と免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または抗体、またはその断片は、イムノアッセイ、BIAcore、または当分野で公知の他のアッセイによって測定して、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とより低い親和性でもって結合してもよい。インテグリンαvβ3と免疫特異的に結合する抗体またはその断片は、関連抗原と交差反応するものであってもよい。好ましくは、インテグリンαvβ3またはその断片と免疫特異的に結合する抗体または断片は、他の抗原とは交差反応しないものである。インテグリンαvβ3と免疫特異的に結合する抗体またはその断片は、例えば、イムノアッセイ、BIAcore、または当業者に公知の他の技法を用いて同定することが可能である。抗体またはその断片は、ラジオイムノアッセイ（RIA）および酵素結合免疫検定法（ELISA）等の実験技法を用いて測定して任意の交差反応性抗原に対するよりも高い親和性でインテグリンαvβ3またはその断片と結合する場合、インテグリンαvβ3またはその断片と特異的に結合する。抗体の特異性に関する議論については、例えば、Paul編、1989、Fundamental Immunology 第２版、Raven Press、New York、第332-336頁を参照のこと。
「αvβ3」または「インテグリンαvβ3」なる用語は、インテグリンサブユニットαvおよびインテグリンサブユニットβ3のヘテロ二量体をいい、そのヘテロ二量体のサブユニットの類似体、誘導体もしくは断片、および、ヘテロ二量体インテグリンαvβ3、ヘテロ二量体のサブユニットの類似体、誘導体または断片を含む融合タンパク質を含む。インテグリンαvβ3はいかなる種由来のものであっても良い。インテグリンαvβ3のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、文献中または公共のデータベースに見出すことができ、あるいはヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、当業者に公知のクローニングおよび配列決定技術を用いて決定することができる。例えば、ヒトインテグリンαvβ3のヌクレオチド配列は、GenBankデータベース中に見つけることができる（例えばαvについて登録番号No.NM_002210、β3について登録番号No.L28832を参照のこと）。ヒトαvβ3のアミノ酸配列はGenBankデータベース中に見つけることができる（例えばαvについて登録番号No.AAA61631、β3について登録番号No.S44360を参照のこと）。好ましい実施形態において、インテグリンαvβ3はヒトインテグリンαvβ3、その類似体、誘導体または断片である。
本明細書中で用いる用語「インテグリンαvβ3アンタゴニスト」および「インテグリンαvβ3のアンタゴニスト」なる用語は、の機能、活性および／または発現を遮断、阻害、低減または中和する任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、糖タンパク質、抗体、抗体断片、炭水化物、核酸、有機分子、無機分子、大分子、または小分子をいう。インテグリンαvβ3アンタゴニストとしては、特定の実施形態においてLM609抗体、および同様にインテグリンαvβ3を認識するそれ由来の抗体および抗原結合断片、例えばLM609のキメラ型およびヒト化型、例えばMEDI-522（VITAXIN(登録商標)、MedImmune, Inc.）抗体および結合においてLM609またはVITAXIN(登録商標)と競合する抗体、並びにインテグリンαvβ3と結合する他の抗体が挙げられる。本明細書中で用いるインテグリンαvβ3アンタゴニストはまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４に対応するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列によってコードされる分子およびその断片をいう。このような抗インテグリンαvβ3抗体は、参照によりその全体が組み込まれる国際公開WO 89/0515155号、WO 98/33939号およびWO 00/78815号、および米国特許第5,753,230号に記載されている。更なる実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストはまた、本発明のスクリーニング方法によって同定される特定のエピトープに免疫特異的な抗体を含む。種々の実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストは、インテグリンαvβ3の機能、活性および／または発現を、リン酸緩衝食塩水（PBS）等の対照と比較して少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％低減させる。
本明細書中で用いる「併用」または「組合せ」なる用語は2種以上の治療（therapy）（例えば2種以上の予防薬および／もしくは治療薬）を使用することを意味する。「併用」または「組合せ」なる用語の使用は、癌を有する被験者に治療（例えば予防薬または治療薬）を投与する順序を制限するものではない。第1の治療は、癌を有する被験者に第2の治療を投与する前（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間前）、投与すると同時、または投与した後（例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間後）に投与することができる。
化合物に関して本明細書中で用いる「単離された」なる用語は、化学合成された場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない化合物をいう。特定の実施形態において、化合物は、他の異なる化合物を60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％含まない。
タンパク性剤（例えばペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質または抗体）に関して本明細書中で用いる「単離された」なる用語は、それが由来した細胞または組織源からの細胞性物質または混入タンパク質を実質的に含まないか、それが化学合成されたものであるときは化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないタンパク性剤をさす。「細胞性物質を実質的に含まない」という用語には、タンパク性剤が、それが単離されるか、組換え的に生産される細胞の細胞成分から分離されているタンパク性剤の調製物が含まれる。こうして、細胞性物質を実質的に含まないタンパク性剤には、異種タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または抗体（「混入タンパク質」ともいう）を約30％、20％、10％または5％（乾燥重量基準）より少ない量で含有するタンパク性剤の調製物が含まれる。タンパク性剤が組換えにより生産されたものであるときは、培地をも実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培地はタンパク質調製物の体積の約20％、10％または5％未満となるようにする。タンパク性剤が化学合成により調製されたものであるときは、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、タンパク性剤の合成に伴う化学前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、そのようなタンパク性剤の調製物は、対象のタンパク性剤以外の化合物または化学前駆体を約30％、20％、10％または5％（乾燥重量基準）より少ない量で含有する。好ましい実施形態において、本発明の抗体は単離されたものである。
核酸分子に関して本明細書中で用いる「単離された」なる用語は、その核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子をさす。さらに、cDNA分子のような「単離された」核酸分子は、組換え法により生産された場合には他の細胞性物質もしくは培地を実質的に含まず、また、化学的に合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。好ましい実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸分子は単離されたものである。
本明細書中で用いる「低い耐性（low tolerance）」なる語句は、患者に治療の副作用が現れ、患者がその有害作用のために治療から利益を得られない、および／または治療を継続できない状態をいう。
本明細書中で用いる「管理する」および「管理」なる用語は、被験者が疾患の治癒をもたらさない治療（例えば予防薬または治療薬）から引き出す有益な効果を意味する。特定の実施形態において、被験者は疾患の進行または悪化を防止するように疾患を管理するための１種以上の治療（例えば予防薬または治療薬）を投与される。
本明細書中で用いる「不応性」および「抵抗性」なる用語は、癌と関連した１以上の症状を治療または緩和するのに臨床上十分でない、現在利用可能な癌治療（例えば化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法および／または生物学的治療／免疫療法）で治療された患者を説明する。典型的には、そのような患者は持続的に活動性の重症疾患を患っており、これらの癌と関連した症状を緩和するための更なる治療を必要としている。この用語はまた、治療に応答するが、副作用、再発、耐性の発達等に苦しむ患者をも説明する。種々の実施形態において、「不応性／抵抗性」とは、癌細胞の少なくともある程度の有意な部分が死滅していないか、その細胞分裂が停止されていないことを意味する。癌細胞が「不応性／抵抗性」であるか否かの決定は、こうした文脈において当分野で受け入れられている「抵抗性」の意味を用い、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で公知の任意の方法によってin vivoまたはin vitroで行うことができる。種々の実施形態において、癌は、癌細胞の数が有意に低減しなかったか、増加した場合に「不応性／抵抗性」である。
本明細書中で用いる「強化する（potentiate）」なる用語は、一般の、または承認された投与量における治療（例えば治療薬）の効力の改善をいう。
本明細書中で用いる「予防薬」なる用語は、癌の再発または広がりの防止に使用され得るあらゆる薬剤をさす。特定の実施形態において、「予防薬」なる用語はインテグリンαvβ3アンタゴニスト（例えばVITAXIN（登録商標）等の抗インテグリンαvβ3抗体）をさす。特定の他の実施形態では、「予防薬」なる用語はインテグリンαvβ3アンタゴニストを意味しない。更に別の実施形態において、「予防薬」なる用語は、インテグリンαvβ3アンタゴニストおよびインテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の癌治療をいう。好ましくは、予防薬は癌の開始、発達、進行および／または重篤度を防止したり遅らせたりするために、有用であることが知られているか、使用されていたか、あるいは現在使用されている薬剤である。
本明細書中で用いる「予防する」および「予防」なる用語は、治療（例えば予防薬または治療薬の投与）、併用療法（例えば予防薬または治療薬の併用投与）により結果的に生じる、被験者における癌またはその１以上の症状の再発、発症または発達の防止を意味する。
本明細書中で用いる「予防的有効量」とは、癌またはその１以上の症状の発達、再発または発症を防止するのに、あるいは別の治療（例えば予防薬）の予防効果を増大または改善するのに十分な治療（例えば予防薬）の量のことである。予防的有効量は、限定するものではないが、癌に罹患しやすいか、または以前に発癌物質に暴露されたことのある者を含む、患者における癌の再発もしくは広がりまたは癌の発症を防止するのに十分な治療（例えば予防薬）の量であり得る。予防的有効量はまた、癌の防止において予防的効果を提供する治療（例えば予防薬）の量であり得る。更に、本発明の予防薬に関して予防的治療量は、癌の防止において予防的効果を提供する、予防薬単独、あるいは他の薬剤との併用における量を意味する。インテグリンαvβ3のアンタゴニストの量に関連して使用する場合、この用語は、総体的予防を改善するか、または他の治療（例えば予防薬）の予防的効力を増大させるか、もしくはこれと相乗作用する量を包含し得る。薬剤の予防的有効量の好適な投与量の例は、下記のセクション5.8.2に記載する。
本明細書中で用いる「予防プロトコル」とは、１種以上の治療（例えば１種以上の予防薬）を投与して予防効果を達成する際の用量およびタイミングの計画をさす。
本明細書中で用いる「プロトコル」には投薬スケジュールおよび投薬レジメが含まれる。ここにおいてプロトコルは使用方法のことであり、予防および治療上のプロトコルを含む。
本明細書中で用いる「副作用」とは、治療（例えば予防または治療薬）の望ましくない不利な作用を包含する。副作用は常に望まれていないが、望まれない作用が必ずしも不利とは限らない。予防または治療薬からの不利な作用は有害であったり、不快であったり、危険であったりする。化学療法の副作用としては、限定するものではないが、初期および後期の下痢（early and late forming diarrhea）および膨満、悪心、嘔吐、食欲不振、白血球減少症、貧血、好中球減少症、無力症、腹部の痙攣、熱、痛み、体重減少、脱水症、脱毛症、呼吸困難、不眠症、めまい感、粘膜炎、口内乾燥症、および腎不全、並びに便秘、神経および筋肉作用、腎臓および膀胱への一時的または永久的損傷、フルー様症状、流体停滞、および一時的または永久的不妊症が挙げられる。放射線療法の副作用としては、限定するものではないが、疲労、口内乾燥、および食欲減退が挙げられる。他の副作用としては、限定するものではないが、初期および後期の下痢、および膨満等の胃腸毒性、悪心、嘔吐、食欲不振、白血球減少症、貧血、好中球減少症、無力症、腹部の痙攣、熱、痛み、体重減少、脱水症、脱毛症、呼吸困難、不眠症、めまい感、粘膜炎、口内乾燥症、および腎不全が挙げられる。生物学的治療／免疫療法の副作用としては、限定するものではないが、投与部位における発疹または腫脹、熱、悪寒および疲労等のフルー様症状、消化管の問題およびアレルギー反応が挙げられる。ホルモン療法の副作用としては、限定するものではないが、悪心、受精能の問題、抑うつ症、食欲減退、眼の問題、頭痛、および体重変動が挙げられる。患者が典型的に経験する更なる望ましくない作用は数多く、当分野において知られている。その多くはPhysicians' Desk Reference（第57版、2003）に記載されている。
本明細書中で用いる「小分子」および同様の用語は、限定するものではないが、約10,000グラム／モルより小さい分子量を有するペプチド、ペプチド擬似体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機もしくは無機化合物（ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約5,000グラム／モルより小さい分子量を有する有機もしくは無機化合物、約1,000グラム／モルより小さい分子量を有する有機もしくは無機化合物、約500グラム／モルより小さい分子量を有する有機もしくは無機化合物、ならびに該化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態が含まれる。
本明細書では「被験者」および「患者」なる用語は相互交換可能に用いられる。本明細書中で用いる「被験者」とは、動物、好ましくは霊長類以外の哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウス）および霊長類（例えば、カニクイザルのようなサル、チンパンジー、およびヒト）、より好ましくはヒトをさす。一実施形態において、被験者は、炎症性疾患を有する哺乳動物、好ましくはヒトである。一実施形態において、被験者は、家畜（例えばウマ、ウシ、ブタ等）またはペット（例えばイヌまたはネコ）である。別の実施形態において、被験者は、癌またはその１以上の症状のためのインテグリンαvβ3以外の現在の治療に対して抵抗性または非応答性である。別の実施形態において、被験者は、免疫不全の、または免疫抑制された哺乳動物、好ましくはヒト（例えばHIV患者）、ではない。別の実施形態において、被験者は、およそ400細胞/mm3未満、好ましくはおよそ500細胞/mm3未満のリンパ球数を有する哺乳動物、好ましくはヒト、ではない。好ましい実施形態において、被験者はヒトである。
本明細書中で用いる「相乗作用」とは、単一の薬剤2種以上の相加作用よりも効果的である治療の組合せ（例えば予防または治療薬）をさす。例えば、治療（例えば予防または治療薬）の組合せの相乗作用により、1種以上の薬剤の投与量を少なくすることができ、および／または癌を有する被験者への該治療の投与頻度を減らすことが可能である。治療（例えば予防または治療薬）の癌の予防または治療における該治療の効力を低下させることなく、該治療の被験者への投与に伴う毒性を減らすことにつながる。その上、相乗作用により、癌の予防または治療における治療の効力改善が望める。最後に、治療の組合せの相乗作用により、単剤療法の使用に伴う有害なまたは望ましくない副作用を回避し改善することができる。
本明細書中で用いる「治療薬」とは、癌またはこれらの１以上の症状の治療、管理または改善に使用することができる薬剤を意味する。特定の実施形態において、「治療薬」という用語はインテグリンαvβ3アンタゴニスト（例えば、VITAXIN（登録商標）等の抗インテグリンαvβ3抗体）をさす。特定の他の実施形態では、「治療薬」という用語はインテグリンαvβ3アンタゴニストを意味しない。別の一実施形態では、「治療薬」という用語はインテグリンαvβ3アンタゴニスト、およびインテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の癌治療を意味する。好ましくは、治療薬は癌もしくはその１以上の症状を治療、管理、または改善するために、有用であることが知られているか、使用されていたか、あるいは現在使用されている薬剤である。治療薬は、in vitroおよび／またはin vivoで該薬剤が有する１以上の効果に基づいて、別の薬剤として特性付けされることがある。例えば、抗炎症剤は、免疫調節剤として特性付けることもできる。
本明細書中で用いる「治療的有効量」とは、原発性、局所性、または転移性癌組織の破壊、改変、制御もしくは除去、癌もしくはその１以上の症状の改善、または癌の進展の抑制、癌の退行の誘発、または別の治療（例えば治療薬）の治療効果の増大もしくは改善のために十分な治療（例えば治療薬）の量をいう。治療的有効量は、癌の広がりを遅延または最小化するのに十分な治療（例えば治療薬）の量をいう場合がある。治療的有効量はまた、癌の治療または管理において治療効果を与える治療（例えば治療薬）の量をいう場合もある。更に、本発明の治療薬に関して治療的有効量は、癌の治療または管理において治療効果を与える治療薬単独、または他の治療との併用における量を意味する。インテグリンαvβ3のアンタゴニストの量に関連して使用する場合、この用語は、総体的治療を改善するか、望まれない効果を低減もしくは回避するか、または別の治療（例えば治療薬）の治療的効力を増大させるかもしくはこれと相乗作用する量を包含し得る。特定の実施形態において、治療的有効量の治療（例えば治療薬）は、細胞の増殖、形成、または数の増加を低減し得る。この実施形態に従い、好ましくは、治療的有効量の治療（例えば治療薬）は、細胞の増殖、形成、または数の増加を、PBS等の対照と比較して少なくとも５％、好ましくは少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％、低減する。治療薬の治療的有効量の好適な投与量の例を下記セクション5.8.2に記載する。
本明細書中で用いる「治療プロトコル」とは、１種以上の治療（例えば１種以上の治療薬）を投与して治療効果を達成する際の用量およびタイミングの計画をさす。
本明細書中で用いる「治療（therapiesまたはtherapy）」または「療法」とは、癌またはその１以上の症状の予防、治療、管理または改善において使用できる任意のプロトコル、方法および／または薬剤をいうことができる。ある実施形態において、「治療」および「療法」とは、癌の化学療法、放射線療法、ホルモン療法、生物学的治療、および／または当分野において熟練した癌専門医に公知の癌の予防、管理、もしくは治療のために有用な他の治療をいう。
本明細書中で用いる「治療する」および「治療」とは、１種以上の治療（例えば予防または治療薬）の投与（適用）により生じる、原発性、局所性、または転移性癌組織の根絶、除去、改変、または制御、または癌もしくはその１以上の症状の進行、重篤度、および／もしくは持続期間の低減または改善、またはその１以上の症状の改善をさす。特定の実施形態において、上記用語は、増殖、形成、および／または細胞数の増加の低減を意味する。他の実施形態において、かかる用語は、こうした疾患を有する被験者に１以上の予防または治療薬を投与して得られる、癌の広がりの最小化または遅延をいう。
4. 図面の説明
（末尾の「図面の簡単な説明」欄参照）
5. 発明の詳細な説明
本発明は、癌の現在の単一薬剤療法または併用療法よりも優れた予防または治療プロフィールを提供する治療プロトコールを包含する。特に本発明は、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善のためのインテグリンαvβ3のアンタゴニストの使用を包含する。本発明はまた、インテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体）の予防または治療効果を増強する治療プロトコールを包含する。本発明はまた、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための、成分（例えば治療物質または治療薬）に結合または融合したインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体）の使用を包含する。
本発明は、臓器または組織（例えば骨）に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体）を１回以上投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態において本発明は、骨に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを１回以上投与することを含む方法を提供する。好適な実施形態において本発明は、骨に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に予防的または治療的有効量の１つ以上の、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片、好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片を１回以上投与することを含む方法を提供する。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に、成分（例えば治療物質または治療薬）に融合または結合した予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくはインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体、さらに好ましくはVITAXIN（登録商標）もしくはその抗体結合断片）を１回以上投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態において本発明は、臓器または組織（例えば骨）に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に、成分（例えば治療物質または治療薬）に融合または結合した予防的または治療的有効量のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを１回以上投与することを含む方法を提供する。より具体的な実施形態において本発明は、骨に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に、成分（例えば治療物質または治療薬）に融合または結合したインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する、予防的または治療的有効量の１つ以上の抗体またはその断片を１回以上投与することを含む方法を提供する。好適な実施形態において本発明は、骨に転移する可能性があるかまたは転移している癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善するための方法であって、必要な被験体に、成分に融合または結合したVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片を１回以上投与することを含む方法を提供する。インテグリンαvβ3のアンタゴニストが融合または結合することができる他の成分の例には、特に限定されないが、後述のセクション5.5.1に開示の物質がある。
本発明は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストがインテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の治療物と併用して使用される、癌の治療プロトコールを包含する。本発明は一部は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストが、他の癌治療（現在の標準的かつ実験的化学療法を含む）が引き起こす副作用と、相乗作用するか、その有効性を増強するか、その抵抗性を改善するか、および／またはそれを低下させるという認識に基づく。本発明の併用療法は、付加的効力、付加的治療効果、または相乗作用を有する。本発明の併用療法は、被験体のクオリティオブライフを改善しおよび／または予防または治療効果を達成するために、癌の予防、管理、治療、または改善のためにインテグリンαvβ3のアンタゴニストと併用して使用される治療物（例えば、予防薬または治療薬）の用量を低下させることを可能にし、および／または癌を有する該被験体へのそのような予防薬または治療薬の投与頻度を減少させることができる。さらに本発明の併用療法は、被験体のクオリティオブライフを改善しおよび／または予防または治療効果を達成するために、癌を有する被験体への、１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストの用量を低下させることを可能にし、および／または１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストの投与頻度を減少させることができる。さらに本発明の併用療法は、癌のための現在の単一薬剤治療法および／または既存の併用療法の投与に関連する好ましくないかまたは有害な副作用を低下または回避し、これは治療プロトコールへの患者のコンプライアンスを改善する。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストを、癌治療に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の治療物を併用して投与することを含む方法を提供する。そのような方法で使用されるインテグリンαvβ3アンタゴニストは、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしていなくてもよい。１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニストと併用して使用できる癌治療の例には、特に限定されないが後述のセクション5.6に開示されるものがある。ある実施形態においてインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3のアンタゴニストと同じ機序で作用する別の癌治療と併用して投与される。別の実施形態においてインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3のアンタゴニストと異なる機序で作用する別の癌治療と併用して、必要な被験体に投与される。例えば特に限定されないが、癌治療は、アポトーシス誘導性、細胞障害性、抗細胞分裂性、チュブリン安定化、微小管形成阻害性、トポイソメラーゼ活性、抗代謝性、またはDNA相互作用性物質がある。他の実施態様において、インテグリンαvβ3のアンタゴニストとともに投与される癌治療は、遺伝子治療に基づく。他の実施形態において治療は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストではない別の抗体である。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、１つ以上のインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体）を、癌治療ではない１つ以上の治療（非癌治療としても知られている）と併用して投与することを含む方法を提供する。そのような方法で使用されるインテグリンαvβ3アンタゴニストは、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしていなくてもよい。非癌治療の例には、特に限定されないが、抗催吐剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤および抗生物質がある。
ある実施形態において本発明の方法で使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片である。好適な実施形態において本発明の方法で使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、LM609抗体、またはそこから得られるインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体（例えば、キメラおよびヒト化LM609、例えば抗体Vitaxin（登録商標））である。そのような抗体は、国際特許公報WO89/05155、WO98/33919およびWO00/78815ならびにUS Patent No. 5,753,230に記載されている（これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。具体的な実施形態において本発明の方法で使用されるインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3への結合において、LM609またはVitaxin（登録商標）、またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその断片である。この実施形態においてインテグリンαvβ3への結合において、LM609またはVitaxin（登録商標）、またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその断片は、モノクローナル抗体D12や、国際特許公報WO98/40488に開示されているその抗原結合断片を含まない。
別の実施形態において本発明は、Ecr（内皮細胞と黒色腫細胞の両方の表面上に見いだされるRGD指令接着受容体）と免疫反応する抗体を提供する。接着受容体を含有する細胞が、ビトロネクチン、フィブロネクチンまたはフォンウィルブラント因子からなる内皮下マトリックスに接着する能力を阻害するのに有用な抗体が、本発明に包含される。また、インテグリンαvβ3の機能活性を阻害するか、またはインテグリンαvβ3介在病理を阻害する抗体も、本発明に包含される。従って本発明は、血管形成の阻害、またはインテグリンαvβ3に仲介されるかまたは影響される他の機能（特に限定されないが、細胞増殖、細胞付着、細胞遊走、顆粒化組織成長、ある炎症）の阻害に有用な抗体を提供する。そのような抗体は、国際特許公報WO89/05155、WO98/33919およびWO00/78815、ならびにUS Patent No. 5,753,230に記載されている（これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
本発明は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストを単独で、または他の癌もしくは非癌治療物と併用して投与するプロトコールを提供する。本発明の併用療法の治療物（例えば、予防薬または治療薬）は、同時または逐次的に被験体に投与することができる。本発明の併用療法の治療物（例えば予防薬または治療薬）はまた、循環して投与することもできる。循環療法は、治療（例えば、予防薬または治療薬）の１つに対する耐性の出現を低下させるために、治療（例えば、予防薬または治療薬）の１つの副作用を回避するかまたは低下させるために、および／または治療の効力を改善するために、ある期間の第１の治療（例えば、第１の予防薬または治療薬）の投与と、次にある期間の第２の治療（例えば、第２の予防薬または治療薬）とを含み、この逐次的投与（すなわちサイクル）を繰り返す。本発明の併用療法の治療（例えば、予防薬または治療薬）はまた、同時に被験体に投与することができる。
併用療法の予防薬または治療薬は、同じ医薬組成物中で被験体に投与することができる。あるいは併用療法の予防薬または治療薬は、同時に別の医薬組成物中で被験体に投与することができる。予防薬または治療薬は、被験体に同じかまたは異なる投与経路で投与される。本発明の医薬組成物は、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善のために、本発明の方法に従って使用される。好ましくは本発明の医薬組成物は無菌であり、癌を有する被験体への特定の投与法に適した形である。
本発明の方法と組成物は、特に限定されないが後述のセクション5.1.1.1に開示した癌を含む癌の予防、管理、治療、または改善に有用である。本発明で予防、管理、治療、または改善することができる癌の具体例には、特に限定されないが、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸または他の消化管、胃、脾臓、平滑筋、皮下組織、前立腺、乳房、卵巣、精巣または他の生殖臓器、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または中枢神経系の癌がある。具体的な実施形態において本発明の方法と組成物は、インテグリンαvβ3を発現する原発性または続発性癌の予防、管理、治療、または改善に使用される。別の実施形態において本発明の方法と組成物は、インテグリンαvβ3を発現しない原発性または続発性癌の予防、管理、治療、または改善に使用される。好適な実施形態において方法と組成物は、他の組織または臓器（例えば骨）に転移する可能性を有するかまたは転移している癌の予防、管理、治療、または改善に使用される。好適な実施形態において本発明の方法と組成物は、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、骨癌または乳癌の予防、管理、治療、または改善に使用される。
本発明の方法と組成物は、未治療の癌患者のみでなく、現在の標準的および実験的癌治療法（特に限定されないが、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、放射線療法、および手術を含む）に部分的または完全に抵抗性の癌患者の管理または治療にも有用である。具体的な実施形態において本発明の方法と組成物は、インテグリンαvβ3アンタゴニストの投与を含む治療以外の治療に抵抗性または非応答性であることが証明されている癌の、予防、管理、治療、または改善に有用である。好適な実施形態において本発明の方法と組成物は、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片、好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片の投与を含む治療に抵抗性または非応答性であることが証明されている癌の、予防、管理、治療、または改善に有用である。本発明の方法と組成物は、望ましくない、または有害な副作用のためにインテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくはインテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片、好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）以外の治療を許容しない患者の、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善に有用である。
本発明はまた、インテグリンαvβ3のアンタゴニストのスクリーニング法を提供する。ある実施形態において、例えばインテグリンαvβ3のリガンド特異性を変化させおよび／またはサブユニット鎖のヘテロダイマー化を破壊するために、インテグリンαvβ3のサブユニットにアミノ酸置換が行われる。具体的な実施形態においてそのようなアミノ酸置換は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストとインテグリンαvβ3エピトープとの特異的相互作用を破壊する。好適な実施形態においてアミノ酸置換は、リガンド結合特異性、好ましくはLM609および／またはVitaxin（登録商標）のリガンド結合特異性を与えるインテグリンサブユニットの領域内に行われる。具体的な実施形態において、Vitaxin（登録商標）への結合を破壊するために、ヒトβ3サブユニットのアミノ酸171、173および174は、好ましくはそれぞれGln、IleおよびLysで置換される。別の好適な実施形態において、β3 サブユニットのアミノ酸171、173、174、179、および182にそれぞれGln、Ile、Lys、ThrおよびSerを用いて、アミノ酸置換が行われる。従って、アミノ酸置換されたインテグリンαvβ3のサブユニットは、野生型インテグリンαvβ3には結合するが変異型には結合しないモノクローナル抗体を同定することにより、特定のエピトープに対する特異的親和性を有する抗体をスクリーニングするのに使用することができる。別の実施形態において本発明の方法は、ヘテロダイマーのヒトβ3 鎖のアミノ酸164〜202の領域に結合するアンタゴニストのスクリーニングを含む。さらに本発明は、ヘテロダイマー化αvβ3に結合するが、ヘテロダイマー中に含まれない時αvまたはβ3鎖に結合しないモノクローナル抗体を同定するための方法を与える。そのようなスクリーニング法を使用して同定される抗体は、単独または他の治療と併用して、インテグリンαvβ3介在疾患またおよび障害またはその１つ以上の症状（特に限定されないが、癌、炎症性疾患、および自己免疫疾患を含む）の予防、治療、管理または改善に使用することができる。好ましくはこれらの抗体は、LM609、Vitaxin（登録商標）、D12、または１つ以下、２つ以下、５個以下、８個以下、10個以下のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する、LM609、Vitaxin（登録商標）、またはD12のCDRを有する抗体もしくは抗原結合断片ではない。
本発明は、検出可能な物質に結合または融合した１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を使用して、癌の進行を検出、診断および／または追跡する方法を提供する。特に動物モデルおよび臨床試験の生検中のインテグリンαvβ3の分析におけるインテグリンαvβ3アンタゴニストの使用を促進する方法も提供される。
本発明は、癌の予防、治療、管理、改善、検出、追跡または診断で使用される、１つ以上の容器中の、検出可能な物質、治療物質または治療薬に結合または融合した１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を含むキットを提供する。本発明はまた、癌の予防、治療、管理、改善、検出、追跡または診断で使用される、第１のバイアル中に１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を含み、第２のバイアル中にインテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の１つ以上の予防薬または治療薬とを含むキットを提供する。本発明はまた、本発明はまた、癌の予防、治療、管理、改善、検出、追跡または診断で使用される、第１のバイアル中に、治療物質または治療薬に結合または融合した１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を含み、第２のバイアル中にインテグリンαvβ3のアンタゴニスト以外の１つ以上の予防薬または治療薬とを含むキットを提供する。キットはさらに、包装材料および／または説明書を含有してもよい。
5.1 予防／治療法
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、または改善する方法であって、必要な被験体に、１つ以上のインテグリンαvβ3を単独で、または癌またはその１つ以上の症状の予防、治療、管理、または改善に有用な１つ以上の他の治療（例えば、１つ以上の他の予防薬または治療薬）と併用して投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストは、成分（例えば治療物質または治療薬）に融合している。
ある実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、被験体に、インテグリンαvβ3活性を継続して阻止する好ましいレベル（例えば、約0.1〜約100μg/ml）にアンタゴニストの血漿濃度を維持する投与所用を使用して投与される。具体的な実施形態においてアンタゴニストの血漿濃度は、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、または50μg/mlで維持される。被験体で好ましい血漿濃度は、特に限定されないが、癌の性質、癌の重症度、被験体の状態を含むいくつかの要因に依存して変化する。別の実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、間欠的に被験体に投与される。この実施形態においてアンタゴニストは、成分（例えば、治療物質または毒素）に結合してもしなくてもよい。
具体的な実施形態において、インテグリンαvβ3のアンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体、さらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、骨吸収の少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％を阻止するレベルに、アンタゴニストの血漿濃度を維持する投与処方を使用して、骨癌または骨に転移した癌を有する被験体に投与される。具体的な実施形態において、アンタゴニストの血漿濃度は、骨癌または骨に転移した癌を有する被験体で約0.1μg/ml〜約100μg/mlで維持される。
ある実施形態において、インテグリンαvβ3のアンタゴニストは、被験体（好ましくはヒト）に、癌の治療に有用な１つ以上の他の治療物（例えば、予防薬または治療薬）と同時に投与される。用語「同時に」は、正確に同時の治療物（例えば、予防薬または治療薬）の投与に限定されず、むしろ、インテグリンαvβ3のアンタゴニストと別の治療物が被験体に、連続してかつある時間範囲内（インテグリンαvβ3が他の治療物と一緒に作用して、これらを同時でなく投与した場合より利点が増強するように）で投与されることを意味する。例えば各治療物（例えば、Vitaxin（登録商標）、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、または生物学的療法）は被験体に、同時にまたは逐次的に、異なる時点で任意の順序で投与される；しかし、同時ではなくでも、所望の治療効果または予防効果を提供するように、充分に近い時間に投与すべきである。各治療物は被験体に別々に、任意の適切な型でかつ任意の適当な経路で投与することができる。他の実施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストは、手術の前、同時または後に被験体に投与される。好ましくは手術は、局所的腫瘍を除去し、大きな腫瘍を小さくする。手術はまた、疼痛を緩和するために予防的に行われる。好適な実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片である。
種々の実施形態において治療物（例えば、予防薬または治療薬）は被験体に、１時間未満離れて、約１時間離れて、約１時間〜約２時間離れて、約２時間〜約３時間離れて、約３時間〜約４時間離れて、約４時間〜約５時間離れて、約５時間〜約６時間離れて、約６時間〜約７時間離れて、約７時間〜約８時間離れて、約８時間〜約９時間離れて、約９時間〜約10時間離れて、約10時間〜約11時間離れて、約11時間〜約12時間離れて、24時間離れて、48時間離れて、投与される。好適な実施形態において、患者の１回の通院で２または３つの治療物（例えば、３つ以上の予防薬または治療薬）が投与される。
他の実施形態において、治療物（例えば、予防薬または治療薬）は被験体に、約２〜４日間離れて、約４〜６日間離れて、約１週間離れて、約１〜２週間離れて、または２週間以上離れて、投与される。好適な実施形態において、治療物（例えば、予防薬または治療薬）は被験体に、両方の治療が活性である時間枠で投与される。当業者は、例えば投与された治療物の半減期を測定することにより、そのような時間枠を決定できるであろう。
ある実施形態において本発明の併用療法の治療物（例えば予防薬または治療薬）はまた、循環して投与することもできる。循環療法は、ある期間の第１の治療（例えば、第１の物質）の投与と、次にある期間の第２の治療（例えば、第２の物質）および／または第３の療法（例えば、第２の物質）を含み、この逐次的投与を繰り返す。循環療法は、１つ以上の治療物に対する耐性の出現を低下させ、治療の１つの副作用を回避するかまたは低下させ、および／または治療の効力を改善する。
ある実施形態において、治療物（例えば予防薬または治療薬）は、被験体に、約３週間未満のサイクル、２週間毎に約１回、10日毎に約１回、または毎週約１回投与される。１つのサイクルは、１サイクル当たり約90分かけて、１サイクル当たり約１時間かけて、１サイクル当たり約45分かけて、注入により治療薬または予防薬を投与することを含む。各サイクルは、少なくとも１週間の休み、少なくとも２週間の休み、少なくとも３週間の休みを含む。投与されるサイクルの数は、約１〜約12サイクルであり、より典型的には約２〜約10サイクルであり、より典型的には約２〜約８サイクルである。
好適な実施形態において、Vitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片は、被験体に１週間に１回または２週間に１回投与され、化学療法は被験体に、数日間毎日投与される。別の好適な実施形態においてVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片は、被験体に１週間に１回または２週間に１回投与され、化学療法は被験体に、数日間毎日投与される。さらに別の好適な実施形態においてVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片は、被験体に１週間に１回または２週間に１回投与され、化学療法は被験体に、数時間〜数日間のセッションで投与される。これらの実施形態において、該被験体に化学療法が投与されない数週間の休止期間があってもよい。
好適な実施形態において、Vitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片は被験体に、１週間に１回または２週間に１回投与され、放射線療法は該被験体に、数日間毎日投与される。別の好適な実施形態においてVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片は、１週間に１回または２週間に１回投与され、放射線療法は該被験体に、１ヶ月に３回８週目まで投与される。別の好適な実施形態においてVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片は、１週間に１回または２週間に１回投与され、放射線療法は該被験体に、１週間に１日８週目まで投与される。これらの実施形態において、放射線が投与されない数週間の休止期間があってもよい。別の好適な実施形態においてVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片は、１週間に１回または２週間に１回投与され、ホルモン療法は該被験体に、毎日投与され、生物学的療法／免疫療法は被験体に、１週間に１回または２週間に１回投与される。
さらに別の実施形態において、本発明の治療薬および予防薬は被験体に、連続的注入または頻繁な投与により、休止期間の延長無しで、機械のように規則正確な投与処方で投与される。そのような機械のように規則正確な投与は、一定の間隔で休止期間無しで投与される。典型的には予防薬または治療薬、特に細胞障害性は、低用量で使用される。そのような投与処方は、比較的低用量を毎日長期間の投与を包含する。好適な実施形態において低用量の使用は毒性副作用を小さくし、休止期間を排除する。ある実施形態において治療薬および予防薬は、約24時間〜約２日間まで、約１週間まで、約２週間まで、約３週間まで、約１ヶ月〜約２ヶ月まで、約３ヶ月まで、約４ヶ月まで、約５ヶ月まで、約６ヶ月までの範囲で、慢性の低用量もしくは連続的注入により投与される。好適な実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストはベクター板またはその抗原結合断片である。そのような投与処方のスケジュール作成は、熟練した腫瘍遺伝子学者により最適化される。
他の実施形態において、治療物（例えば予防薬または治療薬）は、被験体に同時に投与され、すなわち個々の用量の予防薬または治療薬は、別々であるが、インテグリンαvβ3アンタゴニストが他の物質と一緒に作用できる時間間隔で投与される。例えばおよび／または予防薬または治療薬は被験体に１週間に１回、２週間毎に１回または３週間毎に１回被験体に投与される別の予防薬または治療薬と組合せて、投与される。すなわち予防薬または治療薬が同時にまたは同じ通院で投与されなくても、予防薬または治療薬の投与処方は同時に行われる。好適な実施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片である。
他の治療物（例えば予防薬および／または）と組合せて使用される時、インテグリンαvβ3アンタゴニストおよび予防薬および／または治療薬は、付加的または、さらに好ましくは相乗的に作用することができる。ある実施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストは被験体に、同じ医薬組成物中の１つ以上の予防薬または治療薬と同時に投与される。別の実施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストは被験体に、別の医薬組成物中の１つ以上の予防薬または治療薬と同時に投与される。さらに別の実施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストは被験体に、別の予防薬または治療薬の投与の前または後に投与される。本発明は、インテグリンαvβ3のアンタゴニストを糖に、他の予防薬または治療薬と併用して、同じかまたは異なる投与経路（例えば経口および非経口）により投与することを包含する。ある実施形態において、インテグリンαvβ3のアンタゴニストが被験体に、有害の副作用（特に限定されないが、毒性を含む）を示す可能性がある他の予防薬または治療薬と同時に投与される時、予防薬または治療薬は、有害な副作用が誘発される閾値よりしたの用量で有利に投与できる。好適な実施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片である。
本明細書に記載の投与量と頻度は、治療的有効および予防的有効という用語に包含される。用量と頻度はさらに、投与される具体的な治療薬または予防薬、癌の重症度と種類、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および病歴に依存して、各患者に特異的な要因により変動するであろう。適当な処方は、そのような要因を考慮し、かつ以下の、例えば文献に報告され、Physician's Desk Reference (第57版、2003）で推奨されている用量により、当業者が選択することができる。予防的または治療的有効量の物質の適当な用量の例を、後述のセクション5.8.2に記載する。
5.1.1 患者集団
本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、改善する方法であって、被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）、またはインテグリンαvβ3アンタゴニストを含む医薬組成物（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態において本発明で使用されるインテグリンαvβ3アンタゴニストは、別の成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合される。
本発明はまた、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、改善する方法であって、被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）、と癌治療物を投与することを含む方法を提供する。特に本発明は、癌またはその１つ以上の症状を予防、管理、治療、改善する方法であって、被験体に、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）、および癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、改善に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の治療物（特に限定されないが、後述のセクション5.6に列記される予防薬または治療薬を含む）を投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態において、本発明の方法で使用されるインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、別の成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合している。
本発明は、癌またはその１つ以上の症状の予防、管理、治療、または改善に有用な、他の治療を受けている患者を治療または管理する方法を包含する。本発明は、癌に罹っているかまたは罹ると予測される被験体／患者を治療または管理する方法を包含する。本発明はまた、有害な作用または不耐が起きる前に癌治療を受けている被験体の癌を治療または管理する方法を包含する。
本明細書に記載のインテグリンαvβ3アンタゴニストまたは併用療法は、治療の最初の、２番目の、３番目の、４番目のまたは５番目の手段として使用される。本発明は、癌の従来の治療に対して抵抗性の癌患者を治療または管理する方法を包含する。癌細胞の少なくとも１部の有意な部分が、治療により死滅せず、その細胞分裂が停止しないなら、癌は治療に抵抗性であると決定される。そのような決定は、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当該分野で公知の任意の方法によりin vivoまたはin vitroで、「抵抗性」の当該分野で受け入れられている意味を使用して決定される。具体的な実施形態において、癌細胞の数が大きく低下しないかまたは増加するなら、癌は抵抗性である。本発明はまた、そのような癌の既存の単一薬剤治療に抵抗性の癌患者を治療または管理方法を包含する。
本発明は、以前他の癌治療を受けたために免疫抑制されている癌患者を治療または管理する方法を包含する。本発明はまた、他の治療に対して抵抗性であることが証明されているが、もうこれらの治療を受けていない患者を治療または管理する方法も包含する。本発明はまた、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法が毒性が強すぎるかまたはその可能性があり、すなわち、治療または管理される被験体にとって許容できないかまたは耐えられない副作用を引き起こす、患者を治療または管理するための代替法を提供する。本発明はまた、癌に対する素因を有する患者を治療する方法を包含する。本発明はまた、平均絶対リンパ球数が少なくとも500細胞/mm3、好ましくは少なくとも600細胞/mm3、さらに好ましくは少なくとも750細胞/mm3である患者を治療または管理する方法を包含する。本発明はまた、癌患者の１つ以上の症状の発生または進展を予防方法を包含する。本発明はまた、不治の癌を有する患者、特にホスピスの患者の１つ以上の症状を改善する方法を包含する。さらに本発明は、癌について治療されているが疾患の活性は無い患者の癌を予防する方法を提供する。
好適な実施形態において本発明は、化学療法を受けたかまたは受けている癌患者を管理または治療する方法を包含する。この実施形態においてそのような患者には、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法、および手術を受けたかまたは受けている患者を含む。癌を治療しない使用される化学療法剤の例には、特に限定されないが、メソトレキセート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロスポリンＡ、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、ミトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、エトポシド、カンパテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルなどがある。
具体的な実施形態において本発明は、放射線療法を受けたかまたは受けている癌患者を治療または管理する方法を包含する。この実施形態においてそのような患者には、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法、および手術を受けたかまたは受けている患者を含む。別の具体的な実施形態において本発明は、ホルモン療法および／または生物学的療法／免疫療法を受けたかまたは受けている癌患者を治療または管理する方法を包含する。この実施形態においてそのような患者には、化学療法、放射線療法、および手術を受けたかまたは受けている患者を含む。
本発明の方法により予防、治療、管理、または改善できる癌には、特に限定されないが、新生物、腫瘍、転移、または制御できない細胞増殖と特徴とする任意の疾患または障害がある。癌は、原発性癌または転移癌である。癌はインテグリンαvβ3を発現するかまたは発現しない。好適な実施形態において、本発明の方法により管理、治療、または改善される癌は、別の臓器または組織まで転移したインテグリンαvβ3を発現する癌である。好適な実施形態において本発明の方法により管理、治療、または改善される癌は、骨まで転移したインテグリンαvβ3を発現する癌である。本発明の方法により治療できる癌の具体例には、特に限定されないが、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌がある。さらなる癌には、特に限定されないが後述のセクション5.1.1.1に開示した癌がある。
5.1.1.1 癌
本発明の方法により予防、管理、治療、または改善できる癌の具体例には、特に限定されないが、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌がある。さらなる癌には、特に限定されないが以下がある：白血病、例えば特に限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄芽球性、骨髄性単球性、単球性、赤白血病白血病、骨髄異形成症候群）、慢性白血病（例えば特に限定されないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病）；真性赤血球増加症；リンパ腫、例えばホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば特に限定されないが、スモルダリング多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫；ワルデンストレームマクログロブリン血症；意義が不明のモノクローナル免疫グロブリン血症；良性モノクローナル免疫グロブリン血症；重鎖疾患；骨癌、および結合組織肉腫、例えば特に限定されないが、骨肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、コレステリン腫誘導性骨肉腫、骨のページェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨大細胞腫瘍、骨の繊維肉腫、脊索腫、骨膜性肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（血管内皮腫）、繊維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、リポ肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫；脳腫瘍、例えば特に限定されないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、乏突起神経膠芽細胞腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫；乳癌、特に限定されないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、分泌管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、ページェット病（若年性ページェット病を含む）、および炎症性乳癌；副腎癌、例えば特に限定されないが、クロム親和性細胞腫、副腎皮質癌；甲状腺癌、例えば特に限定されないが、乳頭状または瀘胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌；膵臓癌、例えば特に限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは島細胞腫瘍；下垂体癌、例えば特に限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症；眼の癌、例えば特に限定されないが、虹彩黒色腫、脈絡黒色腫、および毛様体黒色腫、および網膜芽細胞腫；膣癌、例えば扁平上皮細胞癌、腺癌、および黒色腫；外陰癌、例えば扁平上皮細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびページェット病；子宮頚癌、例えば特に限定されないが、扁平上皮細胞癌、および腺癌；子宮癌、例えば特に限定されないが、子宮内膜癌および子宮肉腫；卵巣癌、例えば特に限定されないが、卵巣上皮癌、境界腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質性腫瘍；食道癌、例えば特に限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、例えば特に限定されないが、腺癌、肉芽腫性（ポリープ状）、潰瘍性、表層進展性、びまん拡散性、悪性リンパ腫、リポ肉腫、繊維肉腫、および癌肉腫；結腸癌；直腸癌；肝臓癌、例えば特に限定されないが、肝細胞癌、および肝芽細胞腫、胆嚢癌、例えば腺癌；胆管癌、例えば特に限定されないが、乳頭状、結節性、およびびまん性；肺癌、例えば非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌、および小細胞肺癌；精巣癌、例えば特に限定されないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞、非精上皮腫、精上皮腫、奇形癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺癌、例えば特に限定されないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫；陰茎癌；口腔癌、例えば特に限定されないが、扁平上皮細胞癌；基底癌；唾液腺癌、例えば特に限定されないが、腺癌、粘液性類表皮癌、および腺様嚢胞癌；咽頭癌、例えば特に限定されないが扁平上皮細胞癌、およびいぼ状癌；皮膚癌、例えば特に限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌および黒色腫、表層進展性、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端性ほくろ性黒色腫；腎臓癌、例えば特に限定されないが、腎細胞癌、腺癌、腎細胞腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盂および／または子宮）；ウィルムス腫瘍；膀胱癌、例えば特に限定されないが、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫。さらに癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原生癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌および乳頭状腺癌がある（このような疾患の総説については、Fishmanら、1985, Medicine、第２版、J.B. lippincott Co., フィラデルフィア、とMurphyら、1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, バイキングペンギン（Viling Penguin）、ペンギンブックス米国社（Penguin Books U.S.A., Inc.）、アメリカ合衆国）。またアポトーシスの異常により引き起こされる癌も、本発明の方法と組成物により治療することができる。そのような癌には、特に限定されないが、濾胞性リンパ腫、p53変異を有する癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、および家族性腺腫様ポリープおよび骨髄異形成症候群のような前癌病変がある。
ある実施形態において、本発明の方法により予防、管理、治療、または改善される癌はインテグリンαvβ3を発現する。他の実施形態において、本発明の方法により予防、管理、治療、または改善される癌は、コード領域が得られた癌と同じ種類の非癌細胞と比較してインテグリンαvβ3を過剰発現する。別の実施形態において本発明の方法により予防、管理、治療、または改善される癌は、インテグリンαvβ3を発現しない。好適な実施形態において本発明の方法により予防、管理、治療、または改善される癌は、異常な血管形成に関連している。本明細書において用語「異常な血管形成」は、血管形成の正常なプロセスからはずれた血管形成を意味し、例えば特に限定されないが、体の血管形成活性の上昇、および体の異常な部位での血管形成がある。
好適な実施形態において、本発明の方法により予防、管理、治療、または改善される癌は、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、または黒色腫である。別の実施形態において本発明の方法により予防、管理、治療、または改善される癌は、転移性腫瘍であり、特に限定されないが骨まで転移したかまたは転移する可能性のある腫瘍（非限定例は、骨まで転移したかまたは転移ある可能性のある前立腺癌、乳癌および肺癌である）、肺まで転移したかまたは転移ある可能性のある腫瘍、脳まで転移したかまたは転移ある可能性のある腫瘍、および被験体の他の臓器または組織まで転移したかまたは転移ある可能性のある腫瘍がある。
5.1.1.2 乳癌の治療
具体的な実施形態において、乳癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、乳癌治療または管理に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の治療物（特に限定されないが、ドキソルビシン、エピルビシン、ドキソルビシンとシクロスポリンの併用（AC）、シクロスポリン、ドキソルビシンおよび5-フルオロウラシルの併用（CAF）、シクロスポリン、エピルビシンおよび5-フルオロウラシルの併用（CDF）、Herceptin（登録商標）、タモキシフェン、タモキシフェンと細胞障害性化学療法の併用を含む）を併用して投与される。ある実施形態において転移乳癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、予防的または治療的有効量のタキサン類（例えば、ドセタキセルとパクリタキセル）の投与と併用して、投与される。別の実施形態において、結節陽性の局在性乳癌の患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニストを、予防的または治療的有効量のタキサン類＋標準的ドキソルビシンとシクロホスファミドを、結節陽性の局在性乳癌の患者の補助治療のために投与される。これらの実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしていなくてもよい。
5.1.1.3 結腸癌の治療
具体的な実施形態において、結腸癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、結腸癌治療または管理に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の治療物（特に限定されないが、5-FUとロイコボリンの併用、5-FUとレバミゾール、イリノテカンの併用（CPT-11）、またはイリノテカン、5-FUおよびロイコボリンの併用（IFL）を併用して投与される。これらの実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしていなくてもよい。
5.1.1.4 前立腺癌の治療
具体的な実施形態において、前立腺癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、前立腺癌治療または管理に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の治療物（特に限定されないが、外部放射線療法、ラジオアイソトープ（すなわち、I125、パラジウム、イリジウム）の組織間挿入、ロイプロリドもしくは他のLHRHアゴニスト、非ステロイド抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド）、ステロイド抗アンドロゲン（シプロテロンアセテート）、ロイプロリドとルフタミドの併用、エストロゲン、例えばDES、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、結合エストロゲンU.S.P.、DES-ジホスフェート、ラジオアイソトープ（例えばストロンチウム-89）、外部放射線療法とストロンチウム-89の併用、第２の手段としてのホルモン療法、例えばアミノグルテチミド、ヒドロコーチゾン、フルタミド停止、プロゲステロン、およびケトコナゾール、低用量プレドニソン、または症状の主観的改善とPSAレベルの低下を引き起こすと報告されている他の化学療法処方（ドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン／ドセタキセル、エストラムスチン／エトポシド、エストラムスチン／ビンブラスチン、およびエストラムスチン／パクリタキセルがある）を併用して投与される。これらの実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしていなくてもよい。
5.1.1.5 黒色腫の治療
具体的な実施形態において、黒色腫患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、黒色腫治療または管理に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の治療物（特に限定されないが、ジカルバジン（DTIC）、ニトロソ尿素、例えばカルムスチン（BCNU）とロムスチン（OCNU）、軽い単一薬剤活性を有する物質、例えばビンカアルカロイド、白金化合物、およびタキサン、Dartmough処方（シスプラチン、BCNU、およびDTIC）、インターフェロンアルファ（IFN-A）、およびインターロイキン-2（IL-2））を併用して投与される。別の実施形態において、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、メルファラン（L-PAM）有りで腫瘍壊死因子−アルファ（TNT-アルファ）有りまたは無しの単離された高温四肢潅流（ILP）と併用して、多重脳転移、骨転移、および脊髄圧迫の黒色腫患者に投与することができる。これらの実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしていなくてもよい。
5.1.1.6 卵巣癌の治療
具体的な実施形態において、卵巣癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、卵巣癌治療または管理に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の物質（特に限定されないが、腹腔内放射線療法、例えばP32療法、全腹部および骨盤放射線療法、シスプラチン、パクリタキセル（Taxol）またはタキセル（Taxotere）とシスプラチンまたはカーボプラチンの併用、シクロホスファミドとシスプラチンの併用、シクロホスファミドとカーボプラチンの併用、5-フルオロウラシル（5-FU）とロイコボリン、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲムシタビンまたはトポテカンの併用）と併用して投与される。具体的な実施形態において白金抵抗性の卵巣癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、予防的または治療的有効量のタキソールの投与と併用して投与される。本発明は、白金抵抗性の疾患患者にイホスファミド、シスプラチンベースの併用処方が失敗した後のサルベージ化学療法としてヘキサメチルメラミン（HMM）、およびその腫瘍上に検出可能なレベルの細胞質エストロゲン受容体を有する患者のタモキシフェン、の投与を含む抵抗性卵巣癌患者の治療が包含される。
5.1.1.7 肺癌の治療
具体的な実施形態において、肺癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、肺癌治療または管理に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の治療物（特に限定されないが、胸部放射線療法、シスプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびエトポシド単独、または併用、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン／エトポシド、およびシスプラチンの併用（CAV/EP）、気管支内レーザー療法、気管支内ステント、および／または近接照射療法による局所的緩解）を併用して投与される。
別の具体的な実施形態において、非小細胞肺癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、肺癌治療に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の治療物（特に限定されないが、姑息的放射線療法、シスプラチン、ビンブラスチンおよびミトマイシンの併用、シスプラチンとビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、またはゲミシタビンの併用、カーボプラチンとパクリタキセルの併用、気管支内病変のための間質放射線療法、または定位放射線療法）を併用して投与される。
5.1.1.8 骨癌と骨転移の治療
具体的な実施形態において、骨癌と骨転移の患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を投与される。別の実施形態において、骨癌と骨転移の患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）を、骨癌と骨転移の治療または管理に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の他の治療物（特に限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣物、合成薬剤、無機分子、および有機分子を含む）を併用して投与される。これらの実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）は、成分（例えば、治療物質または治療薬）に結合または融合してもしていなくてもよい。骨癌と骨転移を治療するのに有用であることがわかっている、使用されてきた、または現在使用されている任意の物質または治療を、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）、または本発明の成分に結合または融合したインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体または断片、およびさらに好ましくはVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片）と併用して使用することができる。そのような治療の例には、特に限定されないが、リン酸塩、水酸化アルミニウム、炭酸アルミニウムゲル、マグネシウム、ビタミンD、カルシトリオール、ビタミンD2（エルゴカルシフェロール）、ビタミンD3（コレカルシフェロール）、カルシウム、リチウム、糖質コルチコイド、ビスフォスフォネートまたはその薬学的に許容される塩もしくはエステル（非限定例はアレンドロネート、クロドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、リセドロネート、チルドロネート、およびゾレンドロネートである）、カルシトニン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、硝酸ガリウム、エストロゲン類、プロゲスチン類、エストロゲンアンタゴニスト（例えば、タモキシフェン）、エストロゲン受容体調節物質、アンドロゲン受容体調節物質、細胞障害性もしくは抗増殖性物質、マトリックス金属プロテアーゼインヒビター、表皮由来、繊維芽細胞由来もしくは血小板由来増殖因子のインヒビター、VEGFのインヒビター、増殖因子に対するまたは増殖因子受容体に対する抗体、Flk-1/KDRのインヒビター、Flt-1、Tck/Tie-2もしくはTie-1のインヒビター、カテプシンKインヒビター、破骨細胞プロトンATPaseのインヒビター、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（u-PA）のインヒビター、腫瘍特異的抗体−インターロイキン-2融合タンパク質、HMG-CoA還元酵素のインヒビター、プレニル化インヒビター（非限定例は、フェルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼインヒビターまたは２重ファルネシル／ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼインヒビターである）、副甲状腺ホルモンもしくは副甲状腺ホルモン断片（非限定例は外因性PTH類似体、1-34PTHである）、成長ホルモン、US Patent No. 6,472,402と6,482,411に開示された分子、癌治療に使用される任意の物質（後述のセクション5.6参照）、腎透析、手術、またはこれらの組合せがある。
具体的な実施形態において、骨肉腫の患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは、ドキソルビシン、イホスファミド、シスプラチン、高用量メソトレキセート、シクロホスファミド、エトポシド、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、および手術を含む）と併用して投与される。別の具体的な実施形態において、骨転移した癌患者は、予防的または治療的有効量の１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニストを、骨転移腫瘍の治療に有用な予防的または治療的有効量の１つ以上の物質（非限定例は、骨に転移した前立腺癌または乳癌のホルモンインヒビター、および手術である）、および放射線療法（非限定例は、ストロンチウム89とサマリウム153であり、これらは、抗腫瘍作用を示し症状を緩和する向骨性の放射性核種である）、およびビスフォスフォネート）と併用して投与される。
5.2 インテグリンα v β 3 のアンタゴニスト
本発明は、当該分野で公知の任意の有効量のインテグリンαvβ3アンタゴニストを単独で、または癌の治療または予防に有用な有効量の１つ以上の他の物質と併用して投与することを含む。例えば特に限定されないが本発明は、１つ以上のインテグリンαvβ3アンタゴニスト、例えば、マウスモノクローナルLM609（Scripps、国際特許公報WO89/015155とUS Patent No. 5,753,230、これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）；ヒト化モノクローナル抗体MEDI-522（Vitaxin（登録商標）としても知られている、メドイミューン社（MedImmune, Inc.）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州；Wuら、1998, PNAS USA 95811):6037-6042；国際特許公報WO90/33919とWO00/78815、それぞれ、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）；D12（国際特許公報WO98/40488）；抗インテグリンαvβ3抗体PDE117-706（ATCC 受託番号HB-12224）、P112-4C1（ATCC 受託番号HB-12225）、P113-12A6（ATCC 受託番号HB-12226）、P112-11D2（ATCC 受託番号HB-12227）、P112-10D4（ATCC 受託番号HB-12228）、P113-1F3（ATCC 受託番号HB-12229）（G.D., Searle & Co.；国際特許公報WO98/46264）；17661-37Eおよび17661-37E1-5（USBiological）；MON2032および2033（Cal'Tag）、ab7166（BV3）およびab7167（BV4）（Abcam）；およびWOW-1（Kiossesら、Nature Cell Biology 3:316-320）；RGD含有ペプチド、例えばTriflavin；小分子ペプチド模倣物インテグリンαvβ3アンタゴニスト、例えばS836（Searle）およびS448（Searle）；ディスインテグリンとその誘導体、例えばアクチン（Accutin）と遺伝子または遺伝子断片、例えばdel-1（Progenitor）およびPEX；非触媒性メタロプロテイナーゼ断片（Scripps）およびシレンギチド（Cilengitide）（Merck KGA）の投与を包含する。本発明はまた、以下の米国特許とUSP出願公報に開示された有効量のインテグリンαvβ3アンタゴニストの投与を包含する：US Patent No. 6,472,403；6,426,353；6,416,964；6,410,526；6,358,970；6,344,484；6,316,412；6,297,249；6,294,549；6,274,620；6,268,378；6,232,308；6,211,184；6,204,282；6,193,968；6,171,588；6,160,099；6,153,628；6,130,231；6,127,355；6,100,423；6,096,707；6,090,944；6,066,648；6,048,861；6,037,176；6,017,926；6,017,925；5,985,278；5,981,546；5,981,478；5,955,572；5,952,341；5,925,655；5,919,792；5,877,281；5,852,210；5,849,865；5,849,692；5,830,678；5,843,906；5,843,774；5,817,457；5,807,819；5,792,745；5,780,426；5,773,646；5,773,644；5,773,412；5,770,565；5,767,071；5,766,591；5,760,029；5,760,028；5,759,996；5,753,230；5,710,159；5,705,481；5,693,612；5,681,820；5,652,110；5,652,109；5,578,704；5,589,570；5,523,209；5,498,694；5,478,725；5,306,620；5,262,520；5,204,445；5,196,511；5,290,873；および5,149,780；および米国特許出願公報No. 20020019402；20020019387；20020010176；20020001840；20010053853；20010044535；20010023242；20010016645；20010011125；および20010001309（これらは参照するこ
とによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ある実施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストは、以下の米国特許とUSP出願公報に開示された有効量のインテグリンαvβ3アンタゴニストの投与を含まない：US Patent No. 6,472,403；6,426,353；6,416,964；6,410,526；6,358,970；6,344,484；6,316,412；6,297,249；6,294,549；6,274,620；6,268,378；6,232,308；6,211,184；6,204,282；6,193,968；6,171,588；6,160,099；6,153,628；6,130,231；6,127,355；6,100,423；6,096,707；6,090,944；6,066,648；6,048,861；6,037,176；6,017,926；6,017,925；5,985,278；5,981,546；5,981,478；5,955,572；5,952,341；5,925,655；5,919,792；5,877,281；5,852,210；5,849,865；5,849,692；5,830,678；5,843,906；5,843,774；5,817,457；5,807,819；5,792,745；5,780,426；5,773,646；5,773,644；5,773,412；5,770,565；5,767,071；5,766,591；5,760,029；5,760,028；5,759,996；5,753,230；5,710,159；5,705,481；5,693,612；5,681,820；5,652,110；5,652,109；5,578,704；5,589,570；5,523,209；5,498,694；5,478,725；5,306,620；5,262,520；5,204,445；5,196,511；5,290,873；および5,149,780；および米国特許出願公報No. 20020019402；20020019387；20020010176；20020001840；20010053853；20010044535；20010023242；20010016645；20010011125；および20010001309（これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実
施形態においてインテグリンαvβ3アンタゴニストは、17661-37Eおよび17661-37E1-5（USBiological）；MON2032および2033（Cal'Tag）、D12（国際特許公報WO98/40488）；抗インテグリンαvβ3抗体PDE117-706（ATCC 受託番号HB-12224）、P112-4C1（ATCC 受託番号HB-12225）、P113-12A6（ATCC 受託番号HB-12226）、P112-11D2（ATCC 受託番号HB-12227）、P112-10D4（ATCC 受託番号HB-12228）、P113-1F3（ATCC 受託番号HB-12229）（G.D., Searle & Co.；国際特許公報WO98/46264）；ab7166（BV3）およびab7167（BV4）（Abcam）；およびWOW-1（Kiossesら、Nature Cell Biology 3:316-320）；RGD含有ペプチド、例えばTriflavin；小分子ペプチド模倣物インテグリンαvβ3アンタゴニスト、例えばS836（Searle）およびS448（Searle）；ディスインテグリンとその誘導体、例えばアクチン（Accutin）と遺伝子または遺伝子断片、例えばdel-1（Progenitor）およびPEX；非触媒性メタロプロテイナーゼ断片（Scripps）およびシレンギチド（Cilengitide）（Merck KGA）を含まない。
好適な実施形態において、インテグリンαvβ3のアンタゴニストは抗体である。さらに好適な実施形態においてインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、Vitaxin（登録商標）、その誘導体、類似体、およびエピトープ結合断片である（例えば、国際特許公報WO89/05155、WO98/33919、およびWO0078815に開示されているもの）。
好適な実施形態においてインテグリンαvβ3のアンタゴニストは、インテグリンαvβ3への結合においてVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその断片である。
5.3 インテグリンα v β 3 アンタゴニストのスクリーニング方法
本発明は、インテグリンαvβ3のアンタゴニスト、特にVitaxin（登録商標）および／またはLM609と同じエピトープに特異的に結合する抗体の同定方法を提供する。一つには、本発明者等は、ヒトβ3鎖の残基171、173および／または174の変異が、インテグリンαvβ3ヘテロダイマーへのVitaxin（登録商標）および／またはLM609抗体の結合を妨害することを見出した。本発明者等はまた、Vitaxin（登録商標）とLM609はマウスインテグリンαvβ3に結合しないが、Vitaxin（登録商標）とLM609は、ヒトβ鎖のアミノ酸164〜202に対応するマウスβ鎖の領域が、ヒトβ鎖のアミノ酸164〜202で置換された修飾マウスインテグリンαvβ3に結合することを見出した。ある実施形態において、例えば、インテグリンαvβ3のリガンド特異性を変化させるために、および／またはサブユニット鎖のヘテロダイマー化を破壊するために、アミノ酸置換はインテグリンαvβ3のサブユニット中に行われる。好ましくはインテグリンαvβ3はヒトである。具体的な実施形態においてそのようなアミノ酸置換は、インテグリンαvβ3のあるアンタゴニストと特定のインテグリンαvβ3エピトープとの特異的相互作用を破壊する。好適な実施形態においてアミノ酸置換は、リガンド結合特異性、好ましくはLM609および／またはVITAXIN（登録商標）のリガンド結合特異性を付与するインテグリンサブユニットの領域内、特にヒトβ3の164〜202残基内に行われる。あるいはヒトβ3鎖の164〜202残基に対応するマウスβ鎖残基は、ヒトβ3鎖の164〜202残基で置換される。そのようなマウス−ヒトキメラは、ヒトβ3鎖の164〜202領域に結合するがマウスインテグリンαvβ3に結合しないアンタゴニストをスクリーニングするのに使用することができる。
好適な実施形態においてアミノ酸置換は、β3サブユニット中で行われる。ある実施形態においてヒトβ3残基は、表１に記載のようにラット残基で置換される。ある実施形態において171位のラットGln残基のヒトGlu残基による置換は、LM609のインテグリンαvβ3結合を妨害する。この同じ変化は、VITAXIN（登録商標）への結合を妨害する。別の実施形態において、173位と174位のラットIle残基とLys残基のそれぞれヒトLeu残基とGlu残基による置換（「変異B」）は、VITAXIN（登録商標）への結合を妨害し、抗ラットβ3抗体への結合を上昇させる。さらに別の実施形態において、179位と182位のラットThr残基とSer残基のそれぞれヒトAsp残基とThr残基による置換（「変異C」）は、抗ラットβ3抗体に対する結合特異性を付与する。変異AとCの組合せ（３つの置換残基）は、マウス抗ラットβ3抗体に対する結合特異性を付与し、VITAXIN（登録商標）への結合を妨害する。具体的な好適な実施形態において、アミノ酸171、173および174を置換してVITAXIN（登録商標）への結合を妨害することができる。別の好適な実施形態において、アミノ酸171、173、174、179および182を置換して、LM609、およびヒト化抗インテグリンαvβ3抗体（例えばVITAXIN（登録商標））へのインテグリンαvβ3の結合を妨害することができる。そのような置換は好適な例であるが、限定的ではない。そのような置換サブユニットは単に例示的なものであり、決して限定的ではない。抗体結合に関与することが特定されたインテグリンαvβ3領域は、置換、欠失および挿入残基で変化させて、種々の抗体の結合特異性を性状解析し、同じまたは類似の結合特異性を有する抗体をスクリーニングすることができる。
インテグリンαvβ3のアミノ酸置換されたサブユニットは、野生型インテグリンαvβ3に結合するが改変型に結合しないモノクローナル抗体、またはヒトαvβ3からの対応する領域で置換した領域を有するマウスαvβ3インテグリンに結合するが野生型マウスインテグリンαvβ3に結合しないモノクローナル抗体を同定することにより、特定のエピトープに対する特異的親和性を有する抗体をスクリーニングするのに使用することができる。さらに本発明は、ヘテロダイマー化αvβ3に結合するが、ヘテロダイマー中に含まれない時はαvにもβ3鎖にも結合しないモノクローナル抗体を同定するための方法を提供する。そのようなスクリーニングは、例えば変異体インテグリンαvβ3または個々のαvもしくはβ3鎖を組換え発現するために野生型インテグリンαvβ3を発現しない細胞株を使用して、当該分野で公知の抗体特異性をアッセイするための任意のルーチン法により行われる。そのようなスクリーニング法から同定される抗体は、特に限定されないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、骨代謝関連障害、血管形成関連障害、αvβ3の異常な発現および／または活性に関連する障害、および癌を含む、インテグリンαvβ3介在疾患および障害の、予防、管理、および治療に有用であり得る。そのような抗体は、本発明の方法と組成物で使用できる。好ましくはこれらの抗体は、LM609、VITAXIN（登録商標）、D12、または１つ以下、２つ以下、５つ以下、８つ以下、または10以下のアミノ酸置換、欠失または挿入を有するLM609、VITAXIN（登録商標）またはD12のCDR（または、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのCDR、または重鎖のCDR3）を有する抗体もしくは抗原結合断片ではない。
Figure 2005533001
5.4 インテグリンα V β 3 に免疫特異的に結合する抗体
前記で検討したように、本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を投与することを包含する。本発明は、これらに限られないが、LM609 (Scripps)、ネズミモノクローナルLM609 (国際公開第89/015155号および米国特許第5753230号、これらを本願明細書に参照によりそのまま組み入れる);ヒト化モノクローナル抗体MEDI-522(VITAXIN(登録商標)としても知られる、MedImmune, Inc., Gaithersburg, MD;Wu et al., 1998年PNAS USA 95(11):6037〜6042頁;国際公開第90/33919号および国際公開第00/78815号、これらをそれぞれ本願明細書に参照によりそのまま組み入れる);D12(国際公開第98/40488号);抗インテグリンαVβ3抗体PDE 117-706(ATCC受託番号HB-12224)、P112-4C1(ATCC受託番号HB-12225)、P113-12A6(ATCC受託番号HB-12226)、P112-11D2(ATCC受託番号HB-12227)、P112-10D4(ATCC受託番号HB-12228)およびP113-1F3(ATCC受託番号HB-12229)(G.D, Searle & Co.,国際公開第98/46264号);17661-37Eおよび17661-37E 1-5(USBiological)、MON 2032および2033(CalTag)、ab7166(BV3)およびab 7167(BV4)(Abcam)、WOW-1(Kiosses et al., Nature Cell Biology, 3:316〜320頁)およびこれらの同族体、誘導体または断片を含むαVβ3モノクローナルおよびポリクローナル抗体を投与することを包含する。好ましい一実施形態では、抗体は、インテグリンαVβ3またはその抗原結合断片と結合するヒト化阻止モノクローナル抗体であるVitaxin(登録商標)である。下記に、本発明の様々な態様に包含される抗体のより詳細な説明を記載する。
本発明の方法で使用される抗体には、これらに限られないが、モノクローナル抗体、合成抗体、多特異的(multispecific)抗体、ヒト抗体、ラクダ化(camelized)抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fvs(scFv)、単一領域(single domain)抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合Fvs (sdFv)および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)および前記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。特に、本発明の方法で使用される抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分、即ち、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、いずれかのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、群(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)または免疫グロブリン分子のサブクラスのいずれかであってよい。
本発明の方法で使用される抗体は、トリおよび哺乳動物を含む動物源(例えば、ヒト、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリ)に由来してよい。好ましくは、抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本願明細書で使用する場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、さらに、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、またはヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから単離される抗体が含まれる。
本発明の方法で使用される抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより大きな多重特異性であってよい。多重特異性抗体は、インテグリンαVβ3ポリペプチドの様々なエピトープに免疫特異的に結合するか、インテグリンαVβ3ポリペプチドと、異種ポリペプチドまたは固体支持物質などの異種エピトープとの両方に免疫特異的に結合しうる。例えば、国際公開第93/17715号、同第92/08802号、同第91/00360号および同第92/05793号;Tutt, et al., J. Immunol. 147:60〜69頁(1991年);米国特許第4474893号、同第4714681号、同第4925648号、同第5573920号および同第5601819号;およびKostelny et al., J. Immunol. 148:1547〜1553頁(1992年)。
特定の一実施形態では、本発明の方法で使用される抗体は、Vitaxin(登録商標)またはその抗原結合断片(例えば、Vitaxin(登録商標)の1個または複数の相補的決定領域(CDR))である。Vitaxin(登録商標)のアミノ酸配列は例えば、国際公開第98/33919号、同第00/78815号および同第02/070007号、米国特許出願公開第09/339922号に開示されており、これらはそれぞれ、そのまま参照して組み込まれる。H鎖可変領域およびL鎖可変領域でのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号3および配列番号4と規定される(図1Aおよび1B)。H鎖可変領域およびL鎖可変領域でのヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号1および配列番号2と規定される(図1Aおよび1B)。別の実施形態では、本発明の方法で使用される抗体は、Vitaxin(登録商標)と同じエピトープに結合するか、インテグリンαVβ3に結合するVitaxin(登録商標)と競合する。別の一実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体は、Vitaxin(登録商標)またはVitaxin(登録商標)の抗原結合断片ではない。
本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この抗体は、LM609またはVITAXIN(登録商標)でのVH領域のアミノ酸配列を有する可変性のH(「VH」)領域を含む。さらに本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この抗体は、LM609またはVITAXIN(登録商標)でのVL領域のアミノ酸配列を有する可変性のL(「VL」)領域を含む。さらに本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この抗体は、本願明細書に開示されているVL領域または他のVL領域と組み合わされている本願明細書に開示されているVH領域を含む。さらに本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を包含し、この抗体は、本願明細書に開示されているVH領域または他のVH領域と組み合わされている本願明細書に開示されているVL領域を含む。
本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この抗体は、下記の表2に挙げられているVH CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む。さらに本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この抗体は、下記の表2に挙げられているVL CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む。さらに本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この抗体は、下記の表2に挙げられている1つ又は複数のVH CDRおよび1つ又は複数のVL CDRを含む。特に、本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この抗体は、VH CDR1およびVL CDR1;VH CDR1およびVL CDR2;VH CDR1およびVL CDR3;VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR2 and VL CDR2;VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR3およびVH CDR1;VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR3およびVL CDR3;VH1 CDR1,VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR1,VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR1,VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR2,VH CDR3およびVL CDR1,VH CDR2,VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;または下記の表2に挙げたVH CDRとVL CDRとのいずれかの組合せを含む。
Figure 2005533001
本発明の方法で使用される抗体には、変性されている、即ち、抗体への何らかの分子の共有結合により変性されている誘導体が含まれる。例えば、これらに限られないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化(pegylation)、リン酸化、アミド化、知られている保護残基/ブロック残基による誘導体化、タンパク分解性分解、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合により変性されている抗体が含まれる。数多くの化学変性は全て、これらに限られないが、特異的な化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などにより実施することができる。加えて、誘導体は、1個または複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
さらに本発明は、Vitaxin(登録商標)またはLM609と競合する抗体またはその断片、またはインテグリンαVβ3に結合するその抗原結合断片を包含する。このような抗体を同定するために使用することができる競合アッセイは、当業者にはよく知られている。特別な一実施形態では、よく知られているORIGEN分析により測定されるように、抗体1μg/mlは、ORIGEN TAG標識されたLM609またはVitaxin(登録商標)の75%、80%、85%または90%がビオチン標識されたインテグリンαVβ3に結合することを阻止する。別の実施形態では、本発明は、Vitaxin(登録商標)、LM609またはインテグリンαVβ3に結合するその抗原結合断片と競合する国際公開第98/40488号に開示されているもの以外の抗体または断片を包含する。
さらに本発明は、当業者に知られている枠組み構造領域を含む本発明の抗体またはその断片を提供する。好ましくは、本発明の抗体またはその断片の断片領域は、ヒトまたはヒト化されている。特定の一実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、Vitaxin(登録商標)および/またはVitaxin(登録商標)からの1個または複数のCDRの枠組み構造領域を含む。
本発明は、枠組み構造領域または可変領域に突然変異(例えば、1個または複数のアミノ酸置換)を伴うVitaxin(登録商標)のアミノ酸配列を含む抗体または抗体断片を使用することを含む。好ましくは、これらの抗体中の突然変異は、抗体が免疫特異的に結合するインテグリンαVβ3に対する抗体の結合力および/または親和性を保持または増強する。当業者に知られている標準的な技術(イムノアッセイ)を使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
本発明は、通常は単離されている、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体をコードする核酸分子を使用することを包含する。特定の一実施形態では、単離されている核酸分子は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体をコードし、この際、この抗体は、LM609またはVitaxin(登録商標)のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、単離されている核酸分子は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体をコードし、この際、この抗体は、LM609またはVitaxin(登録商標)のVH領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含む。別の実施形態では、単離されている核酸分子は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体をコードし、この際、この抗体は、LM609またはVitaxin(登録商標)のVL領域のアミノ酸配列を有するVL領域を含む。
本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離されている核酸分子を使用することを包含し、この際、この抗体は、上記の表2に挙げられているVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む。特に、本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離されている核酸分子を使用することを包含し、この際、この抗体は、上記の表2に挙げられている各VH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1個、2個またはそれ以上のVH CDRを含む。
本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離されている核酸分子を使用することを包含し、この際、この抗体は、上記の表2に挙げられているVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む。特に、本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離されている核酸分子を使用することを包含し、この際、この抗体は、上記の表2に挙げられているVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1個、2個またはそれ以上のVL CDRを含む。
本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この際、この抗体は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する本願明細書に記載のVH領域、VH CDR、VL領域またはVL CDRの誘導体を含む。当業者に知られている標準的な技術を使用して、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列に、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびPCR仲介突然変異誘発を含む突然変異(例えば、付加、欠失および/または置換)を導入することができる。好ましくは、この誘導体は、本来の分子に対して25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸配列、15個のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換または2個未満のアミノ酸置換を含む。好ましい一実施形態では、誘導体は、1個または複数の予測されている非必須アミノ酸残基のところで行われている保存的アミノ酸置換を有する(即ち、抗体がインテグリンαVβ3に免疫特異的に結合することに関して重要ではないアミノ酸残基)。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基に置換されているものである。同様の電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で同定されている。これらのファミリーには、塩残基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を伴うアミノ酸が含まれる。もしくは、突然変異を、飽和突然変異誘発などにより、コード配列の全てまたは部分に沿ってランダムに導入し、生じた突然変異を、活性を保持する突然変異を同定する生物学的活性に関してスクリーニングすることができる。突然変異誘発の後に、コードされる抗体を発現させ、抗体の活性を決定することができる。
本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この際、この抗体は、可変L(VL)領域および/または可変H(VH)領域に1個または複数のアミノ酸残基置換を伴うLM609またはVitaxin(登録商標)のアミノ酸配列を有する。さらに本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体を使用することを包含し、この際、前記の抗体は、1個または複数のVL CDRおよび/または1個または複数のVH CDRに1個または複数のアミノ酸残基置換を伴うLM609またはVitaxin(登録商標)のアミノ酸配列を有する。LM609またはVitaxin(登録商標)のVH領域、VH CDR、VL領域および/またはVL CDRに置換残基を導入することにより生じた抗体をインビトロおよびインビボで、例えば、インテグリンαVβ3に結合するその活性に関して(例えば、これらに限られないがELISAおよびBIAcoreを含むイムノアッセイにより)、または癌またはその1種または複数の症状を予防、治療、制御または緩和するその能力に関して試験することができる。
さらに本発明は、インテグリンαVβ3またはその断片に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を使用することを包含し、この際、この抗体または抗体断片は、Vitaxin(登録商標)の可変H鎖および/またはL鎖のアミノ酸配列(即ち、配列番号3および/または配列番号4)に対して少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%同一である可変H鎖および/または可変L鎖のアミノ酸配列を有する。さらに本発明は、インテグリンαVβ3またはその断片に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を使用することを包含し、この際、この抗体または抗体断片は、Vitaxin(登録商標)の1個または複数のアミノ酸配列に対して少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%同一である1個または複数のCDRのアミノ酸配列を有する。2個のアミノ酸配列の同一性パーセントの決定は、BLASTタンパク質探索を含む当業者に知られている何らかの方法により決定することができる。
さらに本発明は、インテグリンαVβ3またはその断片に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を使用することを包含し、この際、この抗体または抗体断片は、ストリンジェントな条件下にVitaxin(登録商標)のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によりコードされる。好ましい一実施形態では、本発明は、インテグリンαVβ3またはその断片に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を使用することを包含し、この際、この抗体または抗体断片は、Vitaxin(登録商標)の可変Lおよび/または可変H鎖(即ち、配列番号1および/または配列番号2)のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によりコードされる可変Lおよび/または可変H鎖を有する。他の好ましい実施形態では、本発明は、インテグリンαVβ3またはその断片に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を使用することを包含し、この際、この抗体または抗体断片は、ストリンジェントな条件下に1個または複数のVitaxin(登録商標)のCDRのヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列によりコードされる1個または複数のCDRを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、これらに限られないが、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、それに続く0.2×SSC/0.1%SDS中、約50〜65℃での1回または複数回の洗浄;6×SSC中、約45℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、それに続く0.1×SSC/0.2%SDS中、約60℃での1回または複数回の洗浄などの高度にストリンジェントな条件;または当業者に知られている他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(例えば、Ausubel, F.M. et al., eds. 1989年 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY 6.3.1〜6.3.6頁および2.10.3頁参照)が含まれる。
さらに本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒト中で15日以上、好ましくは20日以上、25日以上、30日以上、35日以上、40日以上、45日以上、2カ月以上、3カ月以上、4カ月以上または5カ月以上の半減期を有する抗体またはその断片を使用することを包含する。哺乳動物、好ましくはヒト中での本発明の抗体またはその断片の増加した半減期によって、哺乳動物中での前記の抗体または抗体断片のより高い血清力価が生じ、それにより、前記の抗体または抗体断片の投与頻度が減るか、および/または投与される前記の抗体または抗体断片の濃度が低下する。インビボで増加した半減期を有する抗体またはその断片を、当業者に知られている技術により生成することができる。例えば、増加したインビボでの半減期を有する抗体または断片は、FcドメインとFcRn受容体との相互作用に関与すると同定されているアミノ酸残基を変性(例えば、置換、欠失および付加)することにより生成することができる(例えば、PCT国際公開第97/34631号および「長い半減期を有する分子、その組成物および使用」と題されている2000年12月12日に提出された同時仮出願第60/254884号参照;これらは、本願明細書に参照によりそのまま組み込まれる)。増加したインビボ半減期を有する抗体またはその断片は、前記の抗体またはその抗体断片に高分子量のポリエチレングリコール(PEG)などのポリマー分子を結合することにより生成することができる。PEGは、多機能性リンカーを用いて、または用いずに、PEGから前記-抗体または抗体断片のN-またはC-末端への部位特異的結合を介してか、またはリシン残基上に存在するε-アミノ基を介して、前記の抗体または抗体断片に結合させることができる。生物学的活性に最小限の損失をもたらす直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化が使用される。結合程度を、SDS-PAGEおよび質量分析により厳密に監視して、抗体へのPEG分子の正確な結合を保証する。未反応のPEGを、例えばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体-PEGコンジュゲートから分離することができる。
さらに、抗体を、アルブミンに結合させて、インビボでより安定か、またはより長いインビボでの半減期を有する抗体または抗体断片を製造することができる。技術は、当分野でよく知られている;例えば、国際公開第93/15199号、同第93/15200号および同第01/77137号および欧州特許第413622号参照、これらはいずれも、本願明細書に参照により組み込まれる。
5.4.1 抗体コンジュゲート
本発明は、これらに限られないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、低分子、模倣剤、合成薬物、無機分子および有機分子を含む1個または複数の成分と結合または融合している抗体またはその断片を使用することを包含する。
本発明は、異種タンパク質またはポリペプチド(またはその断片に、好ましくは少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個または少なくとも100個のアミノ酸)に組換え融合または化学結合(共有および非共有結合の両方を含む)されている抗体またはその断片を使用して、融合タンパク質を生成することを包含する。融合は、直接である必要はなく、リンカー配列を介して生じてもよい。例えば、抗体を使用して、抗体と特定の細胞表面受容体に特異的な抗体とを融合または結合させることにより、異種ポリペプチドを特定の細胞種にインビトロまたはインビボで向けることができる。異種ポリペプチドに融合または結合されている抗体を、当分野で知られている方法を使用するインビトロイムノアッセイおよび精製方法で使用することもできる。例えば、国際公開第93/21232号;欧州特許第439,095号;Naramura et al., 1994年,Immunol. Lett. 39:91〜99頁;米国特許第5474981号; Gillies et al., 1992年, PNAS 89:1428〜1432頁;およびFell et al.,1991年, J. Immunol. 146:2446〜2452頁参照(これらは、そのまま参照により組み込まれる)。
さらに本発明は、抗体断片に融合または結合している異種タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、異種ポリペプチドは、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、VH領域、VL領域、VH CDR、VL CDRまたはその断片に融合または縮合していてよい。ポリペプチドを抗体部分に融合または結合させる方法は、当分野でよく知られている。例えば、米国特許第5336603号、同第5622929号、同第5359046号、同第5349053号、同第5447851号および同第5112946号;欧州特許第307434号および同第367166号;国際公開第96/04388号および同第91/06570号; Ashkenazi et al., 1991年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535〜10539頁; Zheng et al., 1995年, J. Immunol. 154:5590〜5600頁;およびVil et al., 1992年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337〜11341頁参照(前記の参考文献はそのまま参照により組み込まれる)。
例えばVitaxin(登録商標)または他の抗インテグリンαVβ3抗体の付加的な融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング（shuffling）、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリングおよび/またはコドンシャッフリングを介して生成することができる(まとめて、「DNAシャッフリング」と称される)。DNAシャッフリングを使用して、本発明の抗体またはその断片(例えば、高い親和性および低い解離率を有する抗体またはその断片)の活性を変えることができる。通常、米国特許第5605793号;同第5811238号;同第5830721号;同第5834252号;同第5837458号およびPatten et al., 1997年, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724〜33頁;Harayama, 1998年, Trends Biotechnol. 16(2):76〜82頁; Hansson, et al., 1999年, J. Mol. Biol. 287:265〜76頁;およびLorenzo and Blasco, 1998年, Biotechniques 24(2):308〜313頁参照(これらの特許および刊行物はそれぞれ、本願明細書に参照によりそのまま組み込まれる)。抗体またはその断片、またはコードされた抗体またはその断片は、誤りがちPCRによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入または組換え前の他の方法に掛けることにより変えることができる。インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドの1個または複数の部分は、1個または複数の異種分子の1個または複数の成分、モチーフ、切片、部分、領域、断片などで組替えることができる。
さらに、抗体またはその断片を、精製を容易にするペプチドなどのマーカー配列に融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、pQEベクター中で用意されたタグ(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)などのヘキサ-ヒスチジンペプチドであり、特に、これらの多くは、市販されている。Gentz et al., 1989年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821〜824頁に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡単な精製をもたらす。精製で使用することができる他のペプチドタグには、これらに限られないが、赤血球凝集素「HA」タグが含まれ、これは、インフルエンザへマググルチニンタンパク質(Wilson et al., 1984年, Cell 37:767頁) および「flag]タグに由来するエピトープに対応する。
他の実施形態では、本発明の抗体またはその断片、類似体または誘導体は、診断薬または検出薬に結合している。このような抗体は、特定の治療の効力を決定するなどの、臨床試験手順の一部として、癌の発生または進行を監視または診断するために使用することができる。このような診断および検出は、これらに限られないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素;これらに限られないが、ストレプタビジンルビオチン(streptavidinlbiotin)およびアビジン/ビオチンなどの補欠分子族;これらに限られないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシネート(isothiocynate)、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンなどの蛍光物質;これらに限られないがルミノールなどの発光物質;これらに限られないがルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンなどの生物発光物質;これらに限られないがヨウ素(131I、125I、123I、121I、)、炭素(14C)、イオウ(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、111In、)およびテクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Snおよび117Tinなどの放射性物質;様々な陽電子放出トモグラフィで使用される陽電子放出金属、非放射性(noradioactive)常磁性金属イオンおよび放射線標識されているか、または特異的なラジオアイソトープに共役されている分子を含む検出可能な物質に抗体をカップリングすることにより達成することができる。
さらに本発明は、治療成分と結合している抗体またはその断片を使用することを包含する。抗体またはその断片は、細胞毒、例えば、細胞増殖抑制剤、細胞致死剤、治療薬または放射性金属イオン、例えば、α線放出剤などの治療成分に複合してよい。細胞毒または細胞毒薬には、細胞に有害な薬剤が含まれる。治療成分には、これらに限られないが、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン(decarbazine))、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル(thioepa chlorambucil)、メルファラン(melphalan)、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アンスラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(anthramycin)(AMC))、アウリスタチン(Auristatin)分子(例えば、アウリスタチンPHE、ブリオスタチン(bryostatin)1およびソラスタチン(solastatin)10;Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802〜8頁(2002年)、Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580〜4頁(2001年)、Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735〜40頁(2001年)、Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76〜80頁(1999年)、Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15:367〜72頁(1999年)参照、これらは全て、本願明細書に参照により組み込まれる)、ホルモン(例えば、グルココルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲンおよびエストロゲン)、DNA-修復酵素阻害剤(例えば、エトポシドまたはトポテカン(topotecan))、キナーゼ阻害剤(例えば、化合物ST1571、イマチニブメシレート(imatinib mesylate)(Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7):2167〜76頁(2002年))、細胞毒(例えば、パクリタクセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピュロマイシンおよびこれらの同族体または類似体)および米国特許第6245759号、同第6399633号、同第6383790号、同第6335156号、同第6271242号、同第6242196号、同第6218410号、同第6218372号、同第6057300号、同第6034053号、同第5985877号、同第5958769号、同第5925376号、同第5922844号、同第5911995号、同第5872223号、同第5863904号、同第5840745号、同第5728868号、同第5648239号、同第5587459号に開示されている化合物、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば、R115777、BMS214662および米国特許第6458935号、同第6451812号、同第6440974号、同第6436960号、同第6432959号、同第6420387号、同第6414145号、同第6410541号、同第6410539号、同第6403581号、同第6399615号、同第6387905号、同第6372747号、同第6369034号、同第6362188号、同第6342765号、同第6342487号、同第6300501号、同第6268363号、同第6265422号、同第6248756号、同第6239140号、同第6232338号、同第6228865号、同第6228856号、同第6225322号、同第6218406号、同第6211193号、同第6187786号、同第6169096号、同第6159984号、同第6143766号、同第6133303号、同第6127366号、同第6124465号、同第6124295号、同第6103723号、同第6093737号、同第6090948号、同第6080870号、同第6077853号、同第6071935号、同第6066738号、同第6063930号、同第6054466号、同第6051582号、同第6051574号および同第6040305号に記載されている化合物)、トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、カンプトテシン、イリノテカン;SN-38;topotecan;9-アミノカンプトテシン;GG-211(GI147211);DX-8951f;IST-622;ルビテカン;ピラゾロアクリジン;XR-5000;サイントピン(saintopin);UCE6;UCE1022;TAN-1518A;TAN-1518B;KT6006;KT6528;ED-110;NB-506;ED-110;NB-506;およびレベッカマイシン(rebeccamycin));ブルガレイン(bulgarein);Hoescht染料33342およびHoechst染料33258などのDNA副溝結合剤;ニチジン(nitidine);ファガロニン;エピベルベリン(epiberberine);コラリン(coralyne);β-ラパコン(lapachone);BC-4-1;ビスホスホネート(例えば、アレンドロネート(alendronate)、シマドロンテ(cimadronte)、クロドロネート(clodronate)、チルドロネート(tiludronate)、エチドロネート(etidronate)、イバンドロネート(ibandronate)、ネリドロネート(neridronate)、オルパンドロネート(olpandronate)、リセドロネート(risedronate)、ピリドロネート(piridronate)、パミドロネート(pamidronate)、ゾレンドロネート(zolendronate))HMG-CoAレダクターゼ阻害剤(例えば、ロバスタチン、シムバスタチン、アトルバスタチン(atorvastatin)、プラバスタチン(pravastatin)、フルバスタチン(fluvastatin)、スタチン、セリバスタチン(cerivastatin)、レスコール(lescol)、ルピトル(lupitor)、ロスバスタチン(rosuvastatin)およびアトルバスタチン(atorvastatin)およびこれらの薬剤として許容される塩、溶媒和物、包接化合物およびプロドラッグが含まれる。例えば、Rothenberg, M.L., Annals of Oncology 8:837〜855頁(1997年);およびMoreau, P., et al., J. Med. Chem. 41:1631〜1640頁(1998年)参照)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、米国特許第6277832号、同第5998596号、同第5885834号、同第5734033号および同第5618709号に開示されているもの)、免疫調節剤(例えば、抗体およびサイトカイン)、抗体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビンホスフェートおよび2-クロロデオキシアデノシン)。例には、パクリタクセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピュロマイシンおよびこれらの同族体または類似体が含まれる。治療薬には、これらに限られないが、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))、アウリスタチン分子(例えば、アウリスタチンPHE、ブリオスタチン1およびソラスタチン(solas
tatin)10;Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802〜8頁(2002年)、Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580〜4頁(2001年)、Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735〜40頁(2001年)、Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76〜80頁(1999年)、Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15:367〜72頁(1999年)参照、これらは全て、本願明細書に参照により組み込まれる)、細胞分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)、ホルモン(例えば、グルココルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲンおよびエストロゲン)、DNA-修復酵素阻害剤(例えば、エトポシドまたはトポテカン(topotecan))、キナーゼ阻害剤(例えば、化合物ST1571、イマチニブメシレート(Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7):2167〜76頁(2002年))および米国特許第6245759号、同第6399633号、同第6383790号、同第6335156号、同第6271242号、同第6242196号、同第6218410号、同第6218372号、同第6057300号、同第6034053号、同第5985877号、同第5958769号、同第5925376号、同第5922844号、同第5911995号、同第5872223号、同第5863904号、同第5840745号、同第5728868号、同第5648239号、同第5587459号に開示されている化合物、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば、R115777、BMS214662および米国特許第6458935号、同第6451812号、同第6440974号、同第6436960号、同第6432959号、同第6420387号、同第6414145号、同第6410541号、同第6410539号、同第6403581号、同第6399615号、同第6387905号、同第6372747号、同第6369034号、同第6362188号、同第6342765号、同第6342487号、同第6300501号、同第6268363号、同第6265422号、同第6248756号、同第6239140号、同第6232338号、同第6228865号、同第6228856号、同第6225322号、同第6218406号、同第6211193号、同第6187786号、同第6169096号、同第6159984号、同第6143766号、同第6133303号、同第6127366号、同第6124465号、同第6124295号、同第6103723号、同第6093737号、同第6090948号、同第6080870号、同第6077853号、同第6071935号、同第6066738号、同第6063930号、同第6054466号、同第6051582号、同第6051574号および同第6040305号に記載されている化合物)、トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、カンプトテシン、イリノテカン;SN-38;topotecan;9-アミノカンプトテシン;GG-211(GI147211);DX-8951f;IST-622;ルビテカン;ピラゾロアクリジン;XR-5000;サイントピン(saintopin);UCE6;UCE1022;TAN-1518A;TAN-1518B;KT6006;KT6528;ED-110;NB-506;ED-110;NB-506;およびレベッカマイシン);ブルガレイン;Hoescht染料33342およびHoechst染料33258などのDNA副溝結合剤;ニチジン;ファガロニン;エピベルベリン;コラリン;β-ラパコン(;BC-4-1;および薬剤として許容される塩、溶媒和物、包接化合物およびプロドラッグが含まれる。例えば、Rothenberg, M.L., Annals of Oncology 8:837〜855頁(1997年);およびMoreau, P., et al., J. Med. Chem. 41:1631〜1640頁(1998年)参照)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、米国特許第6277832号、同第5998596号、同第5885834号、同第5734033号および同第5618709号に開示されているもの)、免疫調節剤(例えば、抗体およびサイトカイン)、抗体(例えば、リツキシマブ(rituximab)(Rituxan(登録商標))、カリケアマイシン(calicheamycin)(Mylotarg(登録商標))、イブリツモマブ・チウキセタン(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin(登録商標))およびトシツモマブ(tositumomab)(Bexxar(登録商標))およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビンホスフェートおよび2-クロロデオキシアデノシン)。
さらに、抗体またはその断片は、所定の生体応答を変更する治療成分または薬物成分に複合していてよい。治療成分または薬物成分は、従来の化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物成分は、所望の生体活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。例えば、このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I(国際公開第97/33899号参照)、AIM II(例えば、国際公開第97/34911号参照)、Fasリガンド(タカハシet al., 1994年, J. Immunol., 6:1567〜1574頁)およびVEGI (国際公開第99/23105号)などのタンパク質、血栓薬または抗血管形成薬、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチンまたは凝血経路の成分(例えば、組織因子);または例えば、リンホカイン(例えば、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)および顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」)、成長因子(例えば、成長ホルモン(「GH」))または凝固因子(例えば、カルシウム、ビタミンK、これらに限られないがハーゲマン因子(XII因子)などの組織因子、高分子量キニノゲン(HMWK)、プレカリクレイン(PK)、凝固タンパク質因子II(プロトロンビン)、V、XIIa、VIII、XIIIa、XI、XIa、IX、IXa、X因子、リン脂質、フィブリノゲンのαおよびβ鎖からのフィブリノペプチドAおよびB、フィブリンモノマーなどの生体応答調節剤が含まれる。
さらに、抗体は、213Biなどのアルファ-放出体などの放射性金属イオン、またはこれらに限られないが、131In、131LU、131Y、131Ho、131Smを含む放射性金属イオンをポリペプチドに結合させるために使用することができる大環状キレート化剤などの治療成分に複合させることができる。一定の実施形態では、大環状キレート化剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸(DOTA)であり、これは、リンカー分子を介して抗体に結合しうる。このようなリンカー分子は、当分野で通常知られており、Denardo et al., 1998年, Clin Cancer Res. 4(10):2483〜90頁; Peterson et al., 1999年, Bioconjug. Chem. 10(4):553〜7頁;およびZimmerman et al., 1999年, Nucl. Med. Biol. 26(8):943〜50頁に記載されており、これらはそれぞれ、そのまま参照により組み込まれる。
治療成分を抗体に結合させる技術は、よく知られている;例えば、Arnon et al.著「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeld et al. (eds.))243〜56頁(Alan R. Liss, Inc. 1985年);Hellstrom et al.著「Antibodies For Drug Delivery」(Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.))623〜53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987年);Thorpe著「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」(Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.))475〜506頁(1985年);「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.))303〜16頁(Academic Press 1985年)およびThorpe et al.著、1982年、Immunol. Rev. 62:119〜58頁参照。
もしくは、抗体を、第2の抗体に結合させて、本願明細書に参照によりそのまま組み込まれるSegalによる米国特許第4676980号に記載されているような抗体へテロコンジュゲートを生成することもできる。
インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片に結合している治療成分または薬物は、患者の特定の疾患に望ましい予防または治療効果をもたらすように達成すべきである。臨床医または他の医療従事者は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片に結合させる治療成分または薬物を決定する際には、次のこと:疾患の性質、疾患の重度および患者の状態を考慮すべきである。
さらに抗体を、固体支持体に結合させることができ、これは、ターゲット抗原のイムノアッセイまたは精製に特に使用することができる。このような固体支持体には、これらに限られないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが含まれる。
5.4.2 抗体を生成する方法
抗体を合成するための技術分野で知られている方法により、特に、化学合成により、または好ましくは組換え発現技術により、抗体またはその断片を生成することができる。
インテグリンαVβ3に対するポリクローナル抗体は、当分野でよく知られている様々な手順により生成することができる。例えば、インテグリンαVβ3またはその免疫原性断片を、これらに限られないがウサギ、マウス、ラットなどを含む様々なホスト動物に投与して、インテグリンαVβ3に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発することができる。様々なアジュバントを使用して、免疫応答を増大させることができ、ホスト種に応じて、これらに限られないが、フロイントのアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイル乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびBCGなどの使用可能なヒトアジュバント(カルメット-ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム-パルヴムが含まれる。このようなアジュバントは、当分野でよく知られている。
ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術またはこれらの組合せを含む当分野で知られている幅広い技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当分野で知られており、例えば、Harlow et al.著、Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988年); Hammerling, et al.著、: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563〜681頁(Elsevier, N.Y., 1981年)に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる(前記の参考文献は、そのまま参照により組み込まれる)。本願明細書で使用される場合の「モノクローナル抗体」との用語は、ハイブリドーマ技術を介して生じる抗体に限られない。「モノクローナル抗体」との用語は、真核クローン、原核クローンまたはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体のことであって、これらがそれによって生じる方法ではない。
ハイブリドーマ技術を使用して特異性抗体を製造およびスクリーニングする方法は、一般的で、当分野でよく知られている。簡単には、マウスを、インテグリンαVβ3で免疫化し、免疫応答が検出されたら、例えば、インテグリンαVβ3に特異的な抗体がマウス血清中で検出されたら、マウスの脾臓を取り出し、脾細胞を単離する。次いで、よく知られている技術により、脾細胞を適切な骨髄腫細胞、例えば、ATCCから入手可能な細胞系SP20に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限られた希釈でクローニングする。ついで、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドと結合しうる抗体を分泌する細胞に関して、当分野で知られている方法によりアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫化することにより、通常は高レベルの抗体を含有する腹水を生成することができる。
したがって、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することにより、モノクローナル抗体を生成することができ、その際、好ましくは、インテグリンαVβ3で免疫化されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次いで、インテグリンαVβ3に結合しうる抗体を分泌するハイブリドーマクローンの融合をもたらすハイブリドーマをスクリーニングすることにより、ハイブリドーマを生成する。
当業者に知られている技術により、特異的インテグリンαVβ3エピトープを認識する抗体断片を生成することができる。例えば、パパイン(Fab断片を生成するため)またはペプシン(F(ab')2断片を生成するため)などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク分解により、本発明のFabおよびF(ab')2断片を生成することができる。F(ab')2断片は、様々な領域を含有し、L鎖定常領域およびH鎖のCH1領域を有する。さらに、本発明の抗体は、当分野で知られている様々なファージディスプレイ法を使用して生成することができる。
ファージディスプレイ法では、機能性抗体領域が、これらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に表示される。特に、VHおよびVL領域をコードするDNA配列は、動物cDNAライブラリーから増幅される(例えば、リンパ球組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー)。VHおよびVL領域をコードするDNAを、PCRによりscFvリンカーと共に組換え、ファージミド(phagemid)ベクター(例えば、pCANTAB6またはpComb3HSS)中でクローニングする。ベクターを、E.coli中で電気穿孔し、E.coliをヘルパーファージに感染させる。これらの方法で使用されるファージは通常、fdおよびM13を含む繊維状ファージであり、VHおよびVL領域は通常、組換えにより、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIに融合される。該当するインテグリンαVβ3エピトープに結合する抗原結合領域を発現するファージを選択するか、例えば、標識された抗原または固体表面またはビーズに結合または捕捉されている抗原を使用して、抗原で同定することができる。本発明の抗体を調製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Brinkman et al., 1995年, J. Immunol. Methods 182:41〜50頁;Ames et al., 1995年, J. Immunol. Methods 184:177〜186頁;Kettleborough et al., 1994年, Eur. J. Immunol. 24:952〜958頁; Persic et al., 1997年, Gene 187:9〜18頁; Burton et al., 1994年, Advances in Immunology 57:191〜280頁;国際出願第GB91/01134号;国際公開第90/02809号、国際公開第91/10737号、国際公開第92/01047号、国際公開第92/18619号、国際公開第93/11236号、国際公開第95/15982号、国際公開第95/20401号および国際公開第97/13844号;および米国特許第5698426号、米国特許第5223409号、米国特許第5403484号、米国特許第5580717号、米国特許第5427908号、米国特許第5750753号、米国特許第5821047号、米国特許第5571698号、米国特許第5427908号、米国特許第5516637号、米国特許第5780225号、米国特許第5658727号、米国特許第5733743号および米国特許第5969108号に開示されているものが含まれる;これらはそれぞれ、本願明細書に参照によりそのまま組み込まれる。
前記の参考文献に記載されているように、ファージ選択の後に、ファージから、領域をコードする抗体を単離し、ヒト抗体を含む抗体全体または他の所望の抗原結合断片を生成するために使用し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む所望のホスト中で、下記に記載されているように発現させる。Fab、Fab'およびF(ab')2断片を組換えにより生成する技術をさらに、国際公開第92/22324号;Mullinax et al., 1992年, BioTechniques 12(6):864〜869頁;Sawai et al., 1995年, AJRI 34:26〜34頁;およびBetter et al., 1988年, Science 240:1041〜1043頁(前記の参考文献は、そのまま参照により組み込まれる)に開示されている方法などの当分野で知られている方法を使用して用いることもできる。
抗体全体を生成するためには、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを使用して、scFvクローン中のVHまたはVL配列を増幅することができる。当業者に知られているクローニング技術を使用して、PCR増幅されたVH領域を、VH定常領域、例えば、ヒトγ4定常領域を発現するベクター中でクローニングし、PCR増幅されたVL領域を、VL定常領域、例えば、ヒトκまたはλ定常領域を発現するベクター中でクローニングすることができる。好ましくは、VHまたはVL領域を発現するためのベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変領域、定常領域のためのクローニング部位およびネオマイシンなどの選択マーカーを含有する。VHおよびVL領域を、必要な定常領域を発現する1種のベクター中でクローニングすることもできる。次いで、当業者に知られている技術を使用して、H鎖変換ベクターおよびL鎖変換ベクターを細胞系に同時させて、全長抗体、例えば、IgGを発現する永続的または一過性細胞系を生成する。
ヒト内での抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの使用では、ヒトまたはキメラ抗体を使用することが好ましい。完全なヒト抗体が、ヒト患者を治療処置するためには特に好ましい。ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する前記のファージディスプレイ法を含む当分野で知られている様々な方法により、ヒト抗体を調製することができる。さらに、米国特許第4444887号および米国特許第4716111号;国際公開第98/46645号、国際公開第98/50433号、国際公開第98/24893号、国際公開第98/16654号、国際公開第96/34096号、国際公開第96/33735号および国際公開第91/10741号参照;これらはそれぞれ、参照により本願明細書にそのまま組み込まれる。
機能性内在性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子は発現することができるトランスジェニックマウスを使用して、ヒト抗体を調製することもできる。例えば、ヒトHおよびL鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または、相同的組換えにより、マウス胚性幹細胞系に導入することができる。もしくは、ヒト可変領域、定常領域および分散領域を、ヒトHおよびL鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞系に導入することができる。マウスHおよびL鎖免疫グロブリン遺伝子は、別々に、または同時に相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入に刺激されて、非機能性になりうる。特に、JH領域のホモ接合性欠失により、内在抗体産生が阻止される。改変した胚性幹細胞を増殖し、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを生成する。次いで、このキメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生成する。トランスジェニックマウスを通常の方法により、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全てまたは一部で免疫化する。慣用のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化されたトランスジェニックマウスから、その抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウス中のヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の間に再編成し、次いで、クラス転換および体細胞突然変異を受ける。こうして、このような技術を使用して、治療的に使用することができるIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を生成することができる。ヒト抗体を生成するためのこの技術の外観に関しては、Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65〜93頁)参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体およびこのような抗体を調製するためのプロトコルに関するこの技術の詳細な検討に関しては、例えば、国際公開第98/24893号、国際公開第96/34096号および国際公開第96/33735号;および米国特許第5413923号、米国特許第5625126号、米国特許第5633425号、米国特許第5569825号、米国特許第5661016号、米国特許第5545806号、米国特許第5814318号および米国特許第5939598号参照;これらは、本願明細書に参照によりそのまま組み込まれる。加えて、Abgenix, Inc. (Freemont, CA)、Genpharm (San Jose, CA)および Medarex (Princeton, NJ)などの会社を、前記と同様の技術を使用して選択された抗原に対するヒト抗体を得るために用いることができる。
キメラ抗体は、抗体の様々な部分が、様々な免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を調製する方法は、当分野で知られている。例えば、Morrison, 1985年, Science 229:1202頁; Oi et al., 1986年, BioTechniques 4:214頁; Gillies et al., 1989年, J. Immunol. Methods 125:191〜202頁;および米国特許第5807715号、米国特許第4816567号、米国特許第4816397号および米国特許第6311415号参照;これらは、本願明細書に参照によりそのまま組み込まれる。
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する枠組み構造領域と、非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRとを有する抗体またはその変異体または断片である。ヒト化抗体は、少なくとも1個、通常は2個の可変領域(Fab、Fab'、F(ab').sub.2、Fabc,Fv)の実質的に全てを有し、ここで、CDR領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリン(即ち、ドナー抗体)のCDR領域に対応し、枠組み構造領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の枠組み構造領域である。好ましくは、ヒト化抗体はさらに、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、通常は、ヒト免疫グロブリンの一部を有する。普通は、抗体は、L鎖、さらに少なくともH鎖の可変領域を含む。抗体はさらに、H鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3およびCH4領域を含みうる。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含む免疫グロブリンならびにIgG1、IgG2、IgG3およびlgG4を含むアイソタイプからなる群から選択することができる。ヒト化抗体が、細胞毒性を示すことを望む場合、通常、定常領域は、補体結合性定常領域であり、そのクラスは、通常IgG.sub.1であることが望ましい。このような細胞毒性が望ましくない場合には、定常領域は、IgG.sub.2クラスであってもよい。ヒト化抗体は、1個よりも多い群またはアイソタイプからの配列を含んでよく、所望のエフェクター機能を最適化する特定の定常領域を選択することは、当分野の通常の技術の範囲内である。ヒト化抗体の枠組み構造およびCDR領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、ドナーCDRまたはコンセンサス枠組み構造を、少なくとも1個の残基の置換、挿入または欠失により突然変異させて、その部位でのCDRまたは枠組み構造残基が、コンセンサス抗体または移入抗体に対応しないようにすることもできる。しかしながら、このような突然変異は、広範ではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75%が、より多くは90%が、最も好ましくは95%よりも多くが、親枠組み構造領域(FR)およびCDR配列の残基に対応している。これらに限られないが、CDR移植(欧州特許第239400号;国際公開第91/09967号;および米国特許第5225539号、米国特許第5530101号および米国特許第5585089号)、化粧張り(veneering)または表面変更(resurfacing)(欧州特許第592106号および欧州特許第519596号;Padlan, 1991年, Molecular Immunology 28(4/5):489〜498頁; Studnicka et al., 1994年, Protein Engineering 7(6):805〜814頁;およびRoguska et al., 1994, PNAS 91:969〜73頁)、鎖シャッフリング(米国特許第5565332号)および例えば、米国特許第6407213号、米国特許第5766886号、国際公開第9317105号、Tan et al., J. Immunol. 169:1119〜25頁(2002年)、Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353〜60頁(2000年)、Morea et al., Methods 20(3):267〜79頁(2000年)、Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678〜84頁(1997年)、Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895〜904頁(1996年)、Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s 〜5977s頁(1995年)、Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717〜22頁(1995年)、Sandhu JS, Gene 150(2):409〜10頁(1994年)およびPedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959〜73頁 (1994年)に開示されている技術を含む当分野で知られている様々な技術を使用して、ヒト化抗体を調製することができる。往々にして、枠組み構造領域中の枠組み構造残基を、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換して、抗原結合性を変える、好ましくは改善する。これらの枠組み構造置換は、当分野でよく知られている方法により、例えば、抗原結合に重要な枠組み構造残基を同定するためにCDRと枠組み構造残基との相互作用をモデリングし、特定の位置での異常な枠組み構造残基を同定するために配列を比較することにより同定する。(例えば、Queen et al.の米国特許第5585089号;およびRiechmann et al., 1988年, Nature 332:323頁参照;これらは、本願明細書に参照によりそのまま組み込まれる)。
さらに、本発明の抗体は、当業者によく知られている技術を使用して、インテグリンαVβ3を「模倣」する抗イディオタイプ抗体を生成するために使用することができる(例えば、Greenspan & Bona, 1989年, FASEB J. 7(5):437〜444頁;およびNissinoff, 1991年, J. Immunol. 147(8):2429〜2438頁参照)。例えば、インテグリンαVβ3に結合し、インテグリンαVβ3とそのリガンドとの結合(当分野でよく知られているアッセイにより決定され、前記で開示されたように)を競合により阻害する本発明の抗体は、インテグリンαVβ3結合領域を模倣し、結果として、インテグリンαVβ3および/またはそのリガンドと結合および中和する抗イディオタイプを生成するために使用することができる。抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのFab断片をこのように中和することは、インテグリンαVβ3を中和するための治療計画で使用することができる。本発明は、本発明の抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの使用を用いる方法を提供する。
5.4.3 抗体をコードするポリヌクレオチド
さらに本発明は、例えば前記で定義したような高ストリンジェントな、中ストリンジェントなまたは低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを包含する。
このポリヌクレオチドおよび決定されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、当分野で知られている方法により得ることができる。抗体のアミノ酸配列は知られているので、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列は、当分野でよく知られている方法を使用して決定することができる。即ち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸を生じるように組立てる。抗体をコードするこのようなポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド(例えば、Kutmeier et al., 1994年, BioTechniques 17:242頁に記載されているような)から組立てることができ、これは簡単には、抗体をコードする配列部分を含有する複数のオリゴヌクレオチドを重ね、融合させ、これらのオリゴヌクレオチドを連結させ、次いで、連結されたオリゴヌクレオチドをPCRにより増幅する合成を含む。
もしくは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な源からの核酸から生成することができる。抗体分子の配列は知られているが、特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できない場合には、配列の3'および5'末端にハイブリダイゼーション可能な合成プライマーを使用するPCR増幅により、または抗体をコードするcDNAライブラリーからの例えばcDNAクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成するか、適切な源(例えば、本発明の抗体を発現すると選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体発現組織または細胞から生じた抗体cDNAライブラリーまたはcDNAライブラリー、またはそれらから単離された核酸、好ましくはポリA+RNA)から得ることができる。次いで、当分野でよく知られている方法を使用して、PCRにより生じた増幅された核酸を、複製可能なクローニングベクター中でクローニングすることができる。
抗体のヌクレオチド配列を決定したら、ヌクレオチド配列を操作するために当分野でよく知られている方法、例えば、組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCRなどを使用して(例えば、Sambrook et al., 1990年, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubel et al., eds., 1998年, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技術参照;これらは、本願明細書に参照によりそのまま組み込まれる)、抗体のヌクレオチド配列を操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成する、例えば、アミノ酸置換、欠失および/または挿入を生成する。
特定の一実施形態では、通常の組換えDNA技術を使用して、1個または複数のCDRを、枠組み構造領域に挿入する。枠組み構造領域は、天然に生じるか、コンセンサス枠組み構造領域、好ましくはヒト枠組み構造領域であってよい(例えば、ヒト枠組み構造領域の列記に関しては、Chothia et al., 1998年, J. Mol. Biol. 278: 457〜479頁参照)。好ましくは、枠組み構造領域とCDRとの組合せにより生じたポリヌクレオチドは、インテグリンαVβ3に特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、前記で検討したように、1回または複数のアミノ酸置換を、枠組み構造領域内で行うことができ、好ましくは、アミノ酸置換は、抗体とその抗原との結合を改善する。加えて、このような方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与する1個または複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行い、鎖内ジスルフィド結合を1個または複数欠いた抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明および当分野の技術範囲内である。
5.4.4 抗体の組換え発現
本発明の抗体、その誘導体、類似体または断片(例えば、本発明の抗体またはその一部のH鎖またはL鎖または本発明の一本鎖抗体)の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子または抗体またはその一部のHまたはL鎖をコードするポリヌクレオチド(好ましくは、必要ではないが、HまたはL鎖可変領域を含む)が得られたら、抗体分子を産生するためのベクターを、当分野でよく知られている技術を使用する組換えDNA技術により製造することができる。こうして、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製する方法は、本願明細書に記載している。当業者によく知られている方法を使用して、抗体をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構成することができる。これらの方法には例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって本発明は、本発明の抗体分子、抗体のHまたはL鎖、抗体のL鎖可変領域またはその一部または、プロモーターに機能的に結合されるHまたはL鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでよく(例えば、国際公開第86/05807号;国際公開第89/01036号;および米国特許第5122464号参照)、抗体の可変領域を、H鎖全体、L鎖全体、HおよびL鎖全体の両方を発現させるためのベクターなどにクローニングすることができる。
慣用の技術により、発現ベクターを宿主細胞に転移し、次いで、形質導入された細胞を慣用の技術により培養して、本発明の抗体を生成する。したがって、本発明は、本発明の抗体またはその断片、またはそのHまたはL鎖、またはその一部、または機能的に異種プロモーターに結合する本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体を発現するための好ましい実施形態では、HおよびL鎖の両方をコードするベクターを、下記のように免疫グロブリン分子全体を発現するための宿主細胞中で同時発現させることができる。
様々な宿主-発現ベクター系を、本発明の抗体分子を発現するために使用することができる(例えば、米国特許第5807715号参照)。このような宿主-発現系は、対象とするコード配列を生成し、次いで、精製することができる媒体であるが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質導入されると、その場で本発明の抗体分子を発現しうる細胞でもある。これらには、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたは抗体コード配列を含むコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、E. coliおよびB. subtilis)などの微生物に限らず;抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換されている酵母(例えば、Saccharomyces Pichia);抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染している昆虫細胞系;抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)を感染しているか、組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換されている植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム(例えば、メタロチオネインプロモーター)に、または哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター)に由来するプロモーターを含有する組換え発現構成物を含む哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0および3T3細胞)が含まれる。好ましくは、Escherichia coliなどの細菌細胞、さらに好ましくは、組換え抗体分子全体を特に発現するための真核細胞を、組換え抗体分子を発現するために使用する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルスからの主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと共に、抗体のための有効な発現系である(Foecking et al., 1986年, Gene 45:101頁;およびCockett et al., 1990年, Bio/Technology 8:2頁)。特定の一実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列の発現を、構成プロモーター、
誘導プロモーターまたは組織特異的プロモーターにより調節する。
細菌系では、発現される抗体分子の意図する用途に応じて、数多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を生成するために、大量にこのようなタンパク質を製造すべき場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高濃度の発現を目的とするベクターが望ましい。このようなベクターには、これらに限られないが、抗体コード配列が、ベクター内の枠組み中で、lacZコード領域と個々に連結して、融合タンパク質を生じうるE. coli発現ベクターpUR278 (Ruther et al., 1983年, EMBO 12:1791頁);pINベクター(Inouye & Inouye, 1985年, Nucleic Acids Res. 13:3101〜3109頁; Van Heeke & Schuster, 1989年, J. Biol. Chem. 24:5503〜5509頁)等が含まれる。さらにpGEXベクターを使用して、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現させることができる。通常、このような融合タンパク質は可溶性で、グルタチオンアガロースのマトリックスビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオンの存在下での溶離により、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターを、トロンビンまたはXaプロテアーゼ分裂部位因子(factor Xa protease cleavage sites)を含むように設計して、クローニングされたターゲット遺伝子産物を、GST成分から除去することができる。
昆虫系では、Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)を、異種遺伝子を発現させるためのベクターとして使用する。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞中で成長する。抗体コード配列を、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン(polyhedrin)遺伝子)中で個々にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。
哺乳動物宿主細胞では、数多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合には、該当する抗体コード領域を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび3連(tripartite)リーダー配列に連結することができる。次いで、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1またはE3領域)への挿入により、感染宿主中で生存可能で、抗体分子を発現しうる組換えウイルスが生じる(例えば、Logan & Shenk, 1984年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355〜359頁)。特異的な開始シグナルも、挿入された融合タンパク質コード配列の効果的な翻訳に必要である。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠と一致するべきである。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な由来、天然および合成の両方を有してよい。発現の効率を、適切な転写エンハンサー、転写終結因子などの包含により増強することができる(例えば、Bittner et al., 1987年, Methods in Enzymol. 153:516〜544頁参照)。
加えて、所望のように特異的に挿入配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を変更し、プロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。このような変更(例えば、グリコシル化)およびタンパク質産物のプロセッシング(例えば、分解)は、タンパク質の機能に関して重要である。様々な宿主細胞が、翻訳後プロセッシングおよびタンパク質および遺伝子産物の変更に関して特徴的で特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の正確な変更およびプロセッシングを保証することができる。このために、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化およびリン酸化の正確なプロセッシングのための細胞組織を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞には、これらに限られないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0(免疫グロブリン鎖を内部で産生することのないマウス骨髄腫細胞系)、CRL7O3OおよびHsS78Bst細胞が含まれる。
長期にわたる組換えタンパク質を高収率で産生するためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞系を工学的に調製することができる。複製のウイルス由来を含む発現ベクターを使用することよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など)および選択可能なマーカーにより制御されているDNAで形質転換することができる。外来DNAの導入の後に、調製された細胞を、強化培地中で1〜2日間成長させ、次いで、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に耐性を与え、細胞が、プラスミドをその染色体へと安定に組み込み、クローニングされ、細胞系へと増殖しうる増殖巣を形成するまで増殖することを可能にする。この方法は、有利に使用して、抗体分子を発現する細胞系を調製することができる。このように調製された細胞系は、抗体分子と直接的に、または間接的に相互作用する組成物をスクリーニングおよび評価する際に特に使用することができる。
数多くの選択系を使用することができ、これらに限られないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., 1977年, Cell 11:223頁)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1992年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202頁)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., 1980年, Cell 22:8〜17頁)が含まれ、遺伝子は、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞で使用することができる。さらに、代謝拮抗物質耐性を、次の遺伝子を選択するためのベースとして使用することができる:メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr(Wigler et al., 1980年, Natl. Acad. Sci. USA 77:357頁; O'Hare et al., 1981年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527頁);ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(Mulligan & Berg, 1981年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072頁);アミノグリコシドG-418に対する耐性を与えるneo(Wu and Wu, 1991年, Biotherapy 3:87〜95頁; Tolstoshev, 1993年, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573〜596頁; Mulligan, 1993年, Science 260:926〜932頁;およびMorgan and Anderson, 1993年, Ann. Rev. Biochem. 62: 191〜217頁;May, 1993年, TIB TECH 11(5):l55〜2 15頁);およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerre et al., 1984年, Gene 30:147頁)。組換えDNA技術の技術分野で一般に知られている方法を慣用的に適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、このような方法は、例えば、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993年);Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990年);およびChapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994年);Colberre-Garapin et al., 1981年, J. Mol. Biol. 150:1頁に記載されており、これらは、本願明細書に参照によりそのまま組み入れることができる。
ベクター増幅により、抗体分子の発現レベルを高めることができる(概観のために、Bebbington and Hentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987年)参照)。抗体を発現するベクター系でのマーカーが増幅可能な場合には、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を高める。増幅される領域は、抗体遺伝子と関連しているので、抗体の産生も高まる(Crouse et al., 1983年, Mol. Cell. Biol. 3:257頁)。
宿主細胞を、本発明の2種の発現ベクターで同時形質導入することができ、第1のベクターは、ポリペプチドに由来するH鎖をコードし、第2のベクターは、ポリペプチドに由来するL鎖をコードする。2種のベクターは、ポリペプチドのHおよびL鎖を同等に発現しうる同一の選択可能なマーカーを含有してよい。もしくは、HおよびL鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現しうる単一のベクターを使用することもできる。このような場合、過剰な毒性の遊離H鎖を回避するために、L鎖をH鎖の前に置くべきである(Proudfoot, 1986年, Nature 322:52;およびKohler, 1980年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2 197頁)。HおよびL鎖のためのコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含有してよい。
本発明の抗体分子が、組換え発現により製造されたら、これを、免疫グロブリン分子を精製するための技術分野で知られている方法により、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特に、プロテインAの後の特異的抗原に対する親和性による親和性クロマトグラフィーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差により、またはタンパク質を精製するための他の標準的な技術により、精製することができる。さらに、本発明の抗体またはその断片を、本願明細書に記載されているか、もしくは精製を容易にするために当分野で知られている異種ポリペプチド配列に融合することができる。
5.5 インテグリンα V β 3 に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質
本発明は、癌またはその1種または複数の症状を予防、治療、制御または緩和する際にインテグリンαVβ3アンタゴニストとして使用するためのインテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質を包含する。特に、本発明は、癌細胞により発現されるインテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質を包含する。
特定の一実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、本願明細書に記載されているか、当業者によく知られているインビボまたはインビトロアッセイで、インテグリンαVβ3とそのリガンドとの相互作用を約25%、30%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98% 阻害または低減する。インテグリンαVβ3リガンドの例には、これらに限られないが、ビトロネクチン、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、エキスタチン(echistatin)、RGD-含有ペプチドおよびRGD模倣物質が含まれる(例えば、Dresner-Pollak et al., J. Cell Biochem. 56(3):323〜30頁; Duong et al., Front. Biosci. 1(3):d757〜68頁参照)。別の実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、本願明細書に記載されているか、当業者によく知られているインビボまたはインビトロアッセイで、インテグリンαVβ3とそのリガンドとの相互作用を著しくは阻害しない。
一実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子またはその断片のFc領域に融合した生体活性分子を含む。他の実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子のFc領域のCH2および/またはCH3領域に融合している生体活性分子を含む。さらに別の実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子のFc領域のCH2、CH3およびヒンジ領域に融合している生体活性分子を含む。これらの実施形態では、生体活性分子は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する。インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する生体活性分子には、これらに限られないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、低分子、模倣剤、合成薬物、無機分子および有機分子が含まれる。好ましくは、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する生体活性分子は、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個または少なくとも100個の隣接するアミノ酸残基を有するポリペプチドであり、免疫グロブリン分子またはその断片のFc領域のアミノ酸配列に対して異種である。
特別な一実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子またはその断片のFc領域に融合しているインテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するインテグリンαVβ3リガンドまたはその断片を含む。インテグリンαVβ3リガンドの例には、これらに限られないが、ビトロネクチン、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、エキスタチン(echistatin)、RGD-含有ペプチドおよびRGD模倣物質が含まれる(例えば、Dresner-Pollak et al., J. Cell Biochem. 56(3):323〜30頁; Duong et al., Front. Biosci. 1(3):d757〜68頁参照)。他の実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子のFc領域のCH2および/またはCH3領域に融合しているインテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するインテグリンαVβ3リガンドまたはその断片を含む。他の実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子のFc領域のCH2、CH3およびヒンジ領域に融合しているインテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するインテグリンαVβ3リガンドまたはその断片を含む。
他の実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子またはその断片のFc領域に融合しているインテグリンαVβ3リガンドまたはその断片のアミノ酸配列と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子のFc領域のCH2および/またはCH3領域に融合しているインテグリンαVβ3リガンドまたはその断片のアミノ酸配列と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫グロブリン分子のFc領域のCH2、CH3およびヒンジ領域に融合しているインテグリンαVβ3リガンドまたはその断片のアミノ酸配列と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
本発明は、インテグリンαVβ3リガンドまたはその断片をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子によりコードされるポリペプチドに融合している免疫グロブリン分子またはその断片のFcドメインを含む、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質を提供する。
特別な一実施形態では、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、ストリンジェントな条件下に、例えば、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、それに続く、0.2×SSC/0.1%SDS中、約50〜65℃での1回または複数回の洗浄、高度にストリンジェントな条件下に、例えば、6×SSC中、約45℃でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーション、それに続く、0.1×SSC/0.2%SDS中、約68℃での1回または複数回の洗浄、または当業者に知られている他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に(例えば、Ausubel, F.M. et al., eds., 1989年, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York 6.3.1〜6.3.6頁および2.10.3頁参照)、インテグリンαVβ3リガンドまたはその断片をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子によりコードされるポリペプチドに融合している免疫グロブリン分子またはその断片のFc領域を含む。
5.5.1 ペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質コンジュゲート
さらに本発明は、精製を容易にするための、これに限られないがペプチドなどのマーカー配列に融合している、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質を包含する。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、市販されている多くのものの中でも特に、pQEベクター中で提供されるタグ(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)などのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentz et al., 1989年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821〜824頁に記載されているように、例えば、ヘキサ-ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に使用することができる他のペプチドタグには、これらに限られないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープ(Wilson et al., 1984, Cell 37:767頁)に対応する赤血球凝集素「HA」タグおよび「flag」タグが含まれる。
さらに本発明は、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合し、治療成分に複合しているペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質を包含する。インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、細胞毒、例えば、細胞増殖抑制剤、細胞致死剤、治療効果を有する薬剤または放射性金属イオン、例えば、α線放出剤などの治療成分に複合していてよい。細胞毒または細胞毒薬には、細胞に有害な薬剤が含まれる。細胞毒または細胞毒薬には、これらに限られないが、パクリタキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピュロマイシンおよびこれらの類似体または同族体が含まれる。治療効果を有する他の薬剤には、これらに限られないが、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン(decarbazine))、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))および細胞分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が含まれる。
さらに、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドおよび融合タンパク質は、所定の生体応答を変更する治療成分または薬物成分に複合していてよい。治療に有益な薬剤または薬物成分は、従来の化学療法剤に限られると理解すべきではない。例えば、薬物成分は、所望の生体活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、IFN-α、IFN-β、NGF、PDGF、TPA、アポトーシス剤、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I(国際公開第97/33899号参照)、AIM II(例えば、国際公開第97/34911号参照)、Fasリガンド(タカハシet al., 1994年, J. Immunol., 6:1567〜1574頁)およびVEGF (国際公開第99/23105号)などのタンパク質、血栓薬または抗血管形成薬、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン;または例えば、リンホカイン(例えば、IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、GM-CSFおよびG-CSF)または成長因子(例えば、GH)が含まれる。
5.5.2 ポリペプチドおよび融合タンパク質を調製する方法
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術により、またはタンパク質合成技術により、例えば、ペプチド合成機を用いることにより製造することができる。例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸分子を、自動DNA合成機を含む慣用の技術により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、2個の連続する遺伝子断片間の相補的なオーバーハングを起こすアンカープライマーを使用して実施し、その後、該断片をアニーリングおよび再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992年参照)。さらに、生体活性分子をコードする核酸を、Fc領域またはその断片を含む発現ベクター中でクローニングして、生体活性分子が、枠内でFc領域またはFc領域断片に連結され得るようにすることができる。
ポリペプチドを抗体の定常領域に融合または結合する方法は、当分野で知られている。例えば、米国特許第5336603号、同第5622929号、同第5359046号、同第5349053号、同第5447851号、同第5723125号、同第5783181号、同第5908626号、同第58844095号、および同第5112946号;欧州特許第307434号、同第367166号および同第394827号;国際公開第91/06570号、同第96/04388号、同第96/22024号、同第97/34631号および同第99/04813号、; Ashkenazi et al., 1991年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535〜10539頁;Traunecker et al., 1988年, Nature, 331:84〜86頁; Zheng et al., 1995年, J. Immunol. 154:5590〜5600頁;およびVil et al., 1992年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337〜11341頁参照(前記の参考文献はそのまま参照により組み込まれる)。
生体活性分子またはそのFc領域またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、当業者に入手可能な情報から得ることができる(即ち、Genbank、文献または、慣用のクローニング)。インテグリンリガンドをコードするヌクレオチド配列は、入手可能な情報、例えば、Genbank、文献または、慣用のクローニングから得ることができる。例えば、Xiong et al., Science, 12;294(5541):339〜45頁(2001年)参照。ポリペプチド、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質コード配列を転写および翻訳するために必要な要素を含有するベクターに挿入することができる。タンパク質コード配列を発現するために、本発明では、様々な宿主-ベクター系を利用することができる。これらには、これらに限られないが、ウイルス(例えば、ワクチニアウイルス、アデノウイルスなど)に感染している哺乳動物細胞系;ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染している昆虫細胞系;酵母ベクターを含有する酵母などの微生物;またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAで形質転換されている細菌が含まれる。ベクターの発現要素は、その濃度および特異度において変動する。利用される宿主-ベクター系に応じて、数多くの適切な転写および翻訳要素のいずれかを使用することができる。
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質の発現は、当分野で知られているプロモーターまたはエンハンサー要素により制御することができる。融合タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するために使用することができるプロモーターには、これらに限られないが、SV40初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, 1981年, Nature 290:304〜310頁)、ラウス肉腫ウイルスの3'長い末端配列に含まれるプロモーター(Yamamoto, et al., 1980年, Cell 22:787〜797頁)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981年, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441〜1445頁)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., 1982年, Nature 296:39〜42頁)、テトラサイクリン(Tet)プロモーター(Gossen et al., 1995年, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547〜5551頁);β-ラクタマーゼプロモーターなどの原核発現ベクター(Villa-Kamaroff et al., 1978年, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727〜3731頁)またはそのプロモーター(DeBoer et al., 1983年, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21〜25頁;さらに「Useful proteins from recombinant bacteria」in Scientific American, 1980年, 242:74〜94頁参照);ノパリン合成酵素プロモーター領域を含む植物発現ベクター(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209〜213頁)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardner et al., 1981年, Nucl. Acids Res. 9:2871頁)および光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ(Herrera-Estrella et al., 1984年, Nature 310:115〜120頁);酵母またはGal 4プロモーターなどの他のカビからのプロモーター要素、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターおよび、組織特異的を示し、トランスジェニック動物で利用されている次の動物転写制御領域:膵臓腺房細胞中で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al., 1984年, Cell 38:639〜646頁; Ornitz et al., 1986年, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399〜409頁; MacDonald, 1987年, Hepatology 7:425〜515頁);膵臓β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985年, Nature 315:115〜122頁)、リンパ球様細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., 1984年, Cell 38:647〜658頁; Adames et al., 1985年, Nature 318:533〜538頁; Alexander et al., 1987年, Mol. Cell. Biol. 7:1436〜1444頁)、精巣、乳、リンパ球様およびマスト細胞中で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域(Leder et al., 1986年, Cell 45:485〜495頁)、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., 1987年, Genes and Devel. 1:268〜276頁)、肝臓中で活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., 1985年, Mol. Cell. Biol. 5:1639〜1648頁; Hammer et al., 1987年, Science 235:53〜58頁;肝臓中で活性なα1-抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., 1987年, Genes and Devel. 1:161〜171頁)、骨髄性細胞中で活性なβ-グロブリン遺伝子制御領域(Mogram et al., 1985年, Nature 315:338〜340頁; Kollias et al., 1986年, Cell 46:89〜94頁;脳中の乏突起神経膠細胞中で活性なミエリン塩残基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., 1987, Cell 48:703〜712);骨格筋中で活性なミオシンL鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985年, Nature 314:283〜286頁);神経細胞中で活性な神経特異性エノラーゼ(NSE)(Morelli et al., 1999年, Gen. Virol. 80:57〜83頁);神経細胞中で活性な脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子制御領域(Tabuchi et al., 1998年, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818〜823頁);星状膠細胞中で活性なグリア繊維酸性タンパク質(GFAP)プロモーター(Gomes et al., 1999年, Braz J Med Biol Res 32(5):619〜631頁; Morelli et al., 1999年, Gen. Virol. 80:57〜83頁)および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., 1986年, Science 234:1372〜1378頁)が含まれる。
特定の一実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質の発現を、構成プロモーターにより制御することができる。他の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質の発現を、誘導プロモーターにより制御することができる。他の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質の発現を、組織特異的プロモーターにより制御することができる。
特定の一実施形態では、ペプチド-、ポリペプチド-、タンパク質-または融合タンパク質-コード核酸に機能的に連結しているプロモーター、1種または複数の複製源由来ならびに場合によって、1種または複数の選択可能なマーカー(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子)を含有するベクターを使用する。
哺乳動物宿主細胞では、数多くのウイルスベースの発現系を使用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合には、該当する抗体コード領域を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび3連リーダー配列に連結することができる。次いで、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1またはE3領域)への挿入により、感染宿主中で生存可能で、抗体分子を発現しうる組換えウイルスが生じる(例えば、Logan & Shenk, 1984年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355〜359頁)。特異的な開始シグナルも、挿入された抗体コード配列の効果的な翻訳に必要でもある。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠と一致するべきである。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な由来、天然および合成の両方を有してよい。発現の効率を、適切な転写エンハンサー、転写終結因子などの包含により増強することができる(例えば、Bittner et al., 1987年, Methods in Enzymol. 153:516〜544頁参照)。
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子の挿入を含む発現ベクターは、3つの通常の手法により同定することができる:(a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、および(c)挿入配列の発現。第1の手法では、発現ベクター中での、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子の存在は、それぞれペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする挿入された遺伝子と同一の配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第2の手法では、組換えベクター/宿主系を、ベクター中へのポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入によりもたらされる一定の「マーカー」遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、形質転換表現型、バキュロウイルスでの閉塞体形成など)の存在または不在を基にして同定および選択することができる。例えば、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えを、マーカー遺伝子機能の不在により同定することができる。第3の手法では、組換え発現ベクターは、組換えにより発現される遺伝子産物(例えば、融合タンパク質)をアッセイすることにより同定することができる。このようなアッセイは、例えば、インビトロアッセイ系での融合タンパク質の物理的または機能的特性、例えば、抗生物質分子抗体との結合に基づくことができる。
加えて、望ましい特異的な方法で、挿入配列の発現を修飾するか、遺伝子産物を変更し、プロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。一定のプロモーターからの発現は、一定の誘導因子の存在により高めることができる;したがって、遺伝子操作で得た融合タンパク質の発現を制御することができる。さらに、様々な宿主細胞が、翻訳および翻訳後プロセッシングおよび変更(例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化)に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の所望の変更およびプロセッシングを保障するために、適切な細胞系または宿主系を調整することができる。例えば、細菌系での発現は、グリコシル化されていない産物をもたらし、酵母中での発現は、グリコシル化生成物をもたらす。転写一次産物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびホスホリル化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞には、これらに限られないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38、NS0および特に、例えば、SK-N-AS、SK-N-FI、SK-N-DZヒト神経芽腫(Sugimoto et al., 1984年, J. Natl. Cancer Inst. 73: 51〜57頁), SK-N-SHヒト神経芽腫(Biochim. Biophys. Acta, 1982年, 704: 450〜460頁)、Daoyヒト小脳髄芽腫(He et al., 1992年, Cancer Res. 52: 1144〜1148頁) DBTRG-05MG神経グリア芽細胞腫細胞(Kruse et al., 1992年, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609〜614頁)、IMR-32ヒト神経芽腫(Cancer Res., 1970年, 30: 2110〜2118頁)、1321N1ヒト神経膠星状細胞腫(Proc. Natl Acad. Sci. USA ,1977年, 74: 4816頁)、MOG-G-CCMヒト神経膠星状細胞腫(Br. J. Cancer, 1984, 49: 269頁)、U87MGヒト神経グリア芽細胞腫-星状膠細胞腫(Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968年, 74: 465〜486頁)、A172ヒト神経グリア芽細胞腫(Olopade et al., 1992, Cancer Res. 52: 2523〜2529頁)、C6ラット神経膠腫(Benda et al., 1968年, Science 161: 370〜371頁), Neuro-2aマウス神経芽腫(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970年, 65: 129〜136頁), NB41A3マウス神経芽腫(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1962年, 48: 1184〜1190頁), SCPヒツジ脈絡叢(Bolin et al., 1994年, J. Virol. Methods 48: 211〜221頁), G355-5, PG-4ネコ正常星状膠細胞(Haapala et al., 1985年, J. Virol. 53: 827〜833頁), Mpfフェレット脳(Trowbridge et al., 1982年, In Vitro 18: 952〜960頁)などの神経細胞系および例えば、CTX TNA2ラット正常皮質脳(Radany et al., 1992年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6467〜6471頁)、例えば、CRL7030 and Hs578Bstなどの正常細胞系が含まれる。さらに、様々なベクター/宿主-発現系により、様々な規模で反応をプロセッシングすることができる。
長期にわたる組換えタンパク質の高収率の産生には、安定な発現が好ましい。例えば、ポリペプチドまたは融合タンパク質を安定して発現する細胞系を工学的に調製することができる。ウイルス性複製源を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など)および選択可能なマーカーにより制御されているDNAで、宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入の後に、調製された細胞を、強化培地中で1〜2日間成長させ、次いで、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に耐性を与え、細胞が、プラスミドをその染色体へと安定に組み込み、クローニングされ、細胞系へと増殖しうる増殖巣を形成するまで増殖することを可能にする。この方法を、有利に使用して、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質を発現する細胞系を調製することができる。このように調製された細胞系は、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質の活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングおよび評価する際に特に使用することができる。
数多くの選択系を使用することができ、これらに限られないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., 1977年, Cell 11:223頁)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1992年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026頁)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., 1980年, Cell 22:8〜17頁)が含まれ、遺伝子は、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞で使用することができる。さらに、代謝拮抗物質耐性を、次の遺伝子を選択するためのベースとして使用することができる:メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr(Wigler et al., 1980年, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567頁; O'Hare et al., 1981年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527頁);ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(Mulligan & Berg, 1981年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072頁);アミノグリコシドG-418に対する耐性を与えるneo(Colberre-Garapin et al., 1981年, J. Mol. Biol. 150:1頁);およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerre et al., 1984年, Gene 30:147頁)遺伝子。
本発明のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質が、組換え発現により製造されたら、これを、タンパク質を精製するための技術分野で知られている方法により、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特に、プロテインAの後の特異的抗原に対する親和性による親和性クロマトグラフィーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差により、またはタンパク質を精製するための他の標準的な技術により、精製することができる。
5.6 他の予防/治療薬
本発明により、インテグリンαVβ3のアンタゴニストの投与を、これらに限られないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法および/または生物学的療法/免疫療法などの1種または複数の治療の投与（適用）と組み合わせることにより、癌またはその1種または複数の症状を予防、治療、制御または緩和することができる。
特定の一実施形態では、本発明の方法は、これらに限られないが、Angiostatin(プラスミノーゲン断片);抗血管形成アンチトロンビンIII;Angiozyme;ABT-627;Bay 12-9566;Benefin; Bevacizumab; BMS-275291;軟骨由来阻害剤(CDI); CAI; CD59相補性断片; CEP-7055; Col 3; Combretastatin A-4; Endostatin (コラーゲンXVIII断片); フィブロネクチン断片; Gro-β;Halofuginone;へパリナーゼ;ヘパリン六糖断片; HMV833; ヒトコリオニックゴナドトロピン(hCG); IM-862;インターフェロンα/β/γ;インターフェロン誘発タンパク質(IP-10);インターロイキン-12; Kringle 5 (プラスミノーゲン断片); Marimastat;メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMPs); 2-メトキシエストラジオール; MMI 270 (CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; Neovastat; NM-3; Panzem; PI-88;胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;血小板第4因子(PF4); Prinomastat; プロラクチン16kD断片; Proliferin関連タンパク質(PRP); PTK 787/ZK 222594;レチノイド; Solimastat; Squalamine; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248;テトラヒドロコルチゾール-S;テトラチオモリブデート;サリドマイド;Thrombospondin-1 (TSP-1);TNP-470; 形質転換成長因子-β(TGF-b);Vasculostatin;Vasostatin (カルレチキュリン断片); ZD6126; ZD 6474;ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI);およびビスホスホネート(これらに限られないが、アレンドロネート(alendronate)、クロドロネート(clodronate)、エチドロネート、イバンドロネート(ibandronate)、パミドロネート(pamidronate)、リセドロネート(risedronate)、チルドロネート(tiludronate)およびゾレドロネート(and zoledronate)など)などの1種または複数の血管形成アンタゴニストを投与することを包含する。
特定の一実施形態では、本発明の方法は、これらに限られないが、化学療法剤および非化学療法免疫調節剤などの1種または複数の免疫調節剤を投与することを包含する。化学療法剤の非限定的な例には、メトトレキセート、シクロスポリンA、レフルノミド(leflunomide)、シスプラチン、イフォスファミド、タキソールおよびパクリタキソールなどのタキサン(taxanes)、トポイソメラーゼI阻害剤(例えば、CPT-11、トポテカン(topotecan)、9-ACおよびGG-211)、ゲムシタビン(gemcitabine)、ビノレルビン(vinorelbine)、オキサリプラチン(oxaliplatin)、5-フルオロウラシル(5-FU)、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール(temodal)、サイトカラシンB、グラミシジンD、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロールおよびピュロマイシン同族体およびサイトキサン(cytoxan)が含まれる。非化学療法免疫調節剤の例には、これらに限られないが、抗T細胞受容体抗体(例えば、抗-CD4抗体(例えば、cM-T412(Boeringer)、IDEC-CE9.1(登録商標)(IDECおよびSKB)、mAB 4162W94、OrthocloneおよびOKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗CD3抗体(例えば、Nuvion (Product Design Labs)、OKT3(Johnson & Johnson)またはRituxan (IDEC))、抗CD5抗体(例えば、抗-CD5リシン結合免疫コンジュゲート)、抗CD7抗体(例えば、CHH-380 (Novartis))、抗-CD8抗体、抗CD40リガンドモノクローナル抗体(例えば、IDEC-131 (IDEC))、抗CD52抗体(例えば、CAMPATH 1H (Ilex))、抗CD2抗体(例えば、MEDI-507 (MedImmune、Inc.,国際公開第02/098370号および国際公開第02/069904号)、抗CD11a抗体(例えば、Xanelim (Genentech))、および抗B7抗体(例えば、IDEC-114) (IDEC)); 抗サイトカイン受容体抗体(例えば、抗IFN受容体抗体、抗IL-2受容体抗体(例えば、Zenapax (Protein Design Labs))、抗IL-4受容体抗体、抗IL-6受容体抗体、抗IL-10受容体抗体および抗IL-12受容体抗体)、抗サイトカイン抗体(例えば、抗IFN抗体、抗TNF-α抗体、抗IL-1β抗体、抗IL-6抗体、抗IL-8抗体(例えば、ABX-IL-8 (Abgenix))、抗IL-12抗体および抗IL-23抗体)); CTLA4-免疫グロブリン; LFA-3TIP (Biogen,国際公開第93/08656号および米国特許第6162432号);可溶性サイトカイン受容体(例えば、TNF-α受容体またはその断片の細胞外領域、IL-1β受容体またはその断片の細胞外領域およびIL-6受容体またはその断片の細胞外領域);サイトカインまたはその断片(例えば、インターロイキン(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-23、TNF-α、TNF-β、インターフェロン(IFN)-α、IFN-β、IFN-γおよびGM-CSF);および抗サイトカイン抗体(例えば、抗IL-2抗体、抗IL-4抗体、抗IL-6抗体、抗IL-10抗体、抗IL-12抗体、抗IL-15抗体、抗TNF-α抗体および抗IFN-γ抗体)および腫瘍関連抗原に免疫特異的に結合する抗体(例えば、Herceptin(登録商標))。特定の実施形態では、免疫調節剤は、化学療法薬以外の免疫調節剤である。他の実施形態では、免疫調節剤は、IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、TNF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、M-CSF、G-CSF、IL-3またはエリスロポイエチンなどのサイトカインまたは造血因子以外の免疫調節剤である。さらに他の実施形態では、免疫調節剤は、化学療法薬およびサイトカインまたは造血因子以外の薬剤である。
特定の一実施形態では、本発明の方法は、これらに限られないが、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、ステロイド系抗炎症薬、β-アゴニスト、抗コリン作動薬およびメチルキサンチンなどの1種または複数の抗炎症薬を投与することを含む。NSAIDの例には、これらに限られないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ(celecoxib)(CELEBREX(商標))、ジクロフェナク(VOLTAREN(商標))、エトドラク(etodolac)(LODINE(商標))、フェノプロフェン(NALFON(商標))、インドメタシン(INDOCIN(商標))、ケトララク(ketoralac)(TORADOL(商標))、オキサプロジン(DAYPRO(商標))、ナブメントン(RELAFEN(商標))、スリンダク(CLINORIL(商標))、トルメンチン(tolmentin)(TOLECTIN(商標))、ロフェコキシブ(rofecoxib)(VIOXX(商標))、ナプロキセン(ALEVE(商標)、NAPROSYN(商標))、ケトプロフェン(ACTRON(商標))およびナブメトン(nabumetone)(RELAFEN(商標))が含まれる。このようなNSAIDは、シクロオキシゲナーゼ酵素(例えば、COX-1および/またはCOX-2)を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬の例には、これらに限られないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン(DECADRON(商標))、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン(DELTASONE(商標))、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アズルフィジン(azulfidine)、およびプロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエンなどのエイコサノイド(eicosanoids)が含まれる。
他の特定の実施形態では、本発明の方法は、1種または複数の抗ウイルス薬(例えば、アマンタジン、リバビリン、リマンタジン(rimantadine)、アシクロビル、ファムシクロビル(famciclovir)、フォスカルネット(foscarnet)、ガンシクロビル、トリフルリジン(trifluridine)、ビダラビン、ジダノシン(didanosine)、スタブジン(stavudine)、ザルシタビン(zalcitabine)、ジドブジン(zidovudine)、インターフェロン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))、制吐薬(例えば、アルプラゾラム、デキサメタゾン、ドンペリドン、ドロナビノール(dronabinol)、ドロペリドール(droperidol)、グラニセトロン(granisetron)、ハロペリドール、ハロペリドール、イオラゼパム(iorazepam)、メチルプレドニゾロン、メトクロプラミド、ナビロン、オンダンセトロン(ondansetron)、プロクロルペラジン)、抗真菌薬(例えば、アンホテリシン、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール(itraconazole)、ケトコナゾール(ketoconazole)、ミコナゾールおよびニスタチン)、抗寄生虫薬(例えば、デヒドロエメチン、ジロキサニドフロエート、エメチン、メフロキン、メラルソプロール、メトロニダゾール、ニフルチモックス(nifurtimox)、パロモマイシン、ペンタビジン(pentabidine)、ペンタミジンイセチオネート、プリマキン、キナクリン、キニジン)またはこれらの組合せを投与することを含む。
本発明の医薬組成物および投与形態およびキットを含む本発明の様々な実施形態で使用することができる抗癌剤の特定の例には、これらには限られないが、アシビシン(acivicin);アクラルビシン;塩酸アコダゾール(acodazole);アクロニン;アドゼレシン(adozelesin);アルデスロイキン(aldesleukin);アルトレタミン(altretamine);アンボマイシン(ambomycin);酢酸アメタントロン(ametantrone);アミノグルテチミド;アムサクリン(amsacrine);アナストロゾール(anastrozole);アントラマイシン;アスパラギナーゼ;アスペリン(asperlin);アザシチジン(azacitidine);アゼテパ(azetepa);アゾトマイシン(azotomycin);バチマスタット(batimastat);ベンゾデパ(benzodepa);ビカルタマイド(bicalutamide);塩酸ビスアントレン(bisantrene);ビスナフィドジメシレート(bisnafide dimesylate);ビゼレシン(bizelesin);硫酸ブレオマイシン;ブレキナルナトリウム(brequinar sodium);ブロピリミン(bropirimine);ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド(caracemide);カルベチマー(carbetimer);カルボプラチン;カルムスチン;塩酸カルビシン(carubicin);カルゼレシン(carzelesin);セデフィンゴル(cedefingol);クロラムブシル;シロルマイシン(cirolemycin);シスプラチン(cisplatin);クラドリビン(cladribine);クリスナトールメシレート(crisnatol mesylate);シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;塩酸ダウノルビシン;デシタビン(decitabine);デキソルマプラチン(dexormaplatin);デザグアニン(dezaguanine);デザグアニンメシレート;ジアジクオン(diaziquone);ドセタキセル(docetaxel);ドキソルビシン;塩酸ドキソルビシン;ドロロキシフェン(droloxifene);クエン酸ドロロキシフェン;プロピオン酸ドロモスタノロン;ドゥアゾマイシン(duazomycin);エダトレキセート(edatrexate);塩酸エフロルニチン(eflornithine);エルサミトルチン(elsamitrucin);エンロプラチン(enloplatin);エンプロメート(enpromate);エピプロピジン(epipropidine);塩酸エピルビシン;エルブロゾール(erbulozole);塩酸エソルビシン(esorubicin);エストラムスチン;エストラムスチンリン酸ナトリウム;エタニダゾール(etanidazole);エトポシド(etoposide);リン酸エトポシド;エトプリン;塩酸ファドロゾール(fadrozole);ファザラビン(fazarabine);フェンレチニド(fenretinide);フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル;フルロシタビン(flurocitabine);ホスキドン(fosquidone);フォストリエシンナトリウム(fostriecin sodium);ゲムシタビン(gemcitabine);塩酸ゲムシタビン;ヒドロキシウレア;塩酸イダルビシン(idarubicin);イフォスファミド;イルモフォシン(ilmofosine);インターロイキンII(組換えインターロイキンIIまたはIL2を含む)、インターフェロンα-2a;インターフェロンα-2b;インターフェロンα-n1 ;インターフェロンα-n3;インターフェロンβ-I a;インターフェロンγ-I b;イプロプラチン;塩酸イリノテカン;酢酸ランレオチド(lanreotide);レトロゾール(letrozole);酢酸ロイプロリド(leuprolide);塩酸リアロゾール;ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプロコール(masoprocol);マイタンシン(maytansine);塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロール(melengestrol);メルファラン;メノガリル(menogaril);メルカプトプリン;メトトレキセート;メトトレキセートナトリウム;メトプリン;メツレデパ;マイトインドミド(mitindomide);マイトカルシン(mitocarcin);マイトクロミン(mitocromin);マイトギリン(mitogillin);マイトマルシン(mitomalcin);マイトマイシン;マイトスパ(mitosper);ミトテン;塩酸ミトキサントロン;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン(ormaplatin);オキシスラン(oxisuran);パクリタクセル;ペグアスパルゲーゼ(pegaspargase);ペリオマイシン(peliomycin);ペンタムスチン(pentamustine);硫酸ペプロマイシン;ペルフォスファミド(perfosfamide);ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン(piroxantrone);プリカマイシン;プロメスタン(plomestane);ポルフィマー(porfimer)ナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン(prednimustine);塩酸プロカルバジン;ピュロマイシン;塩酸ピュロマイシン;ピラゾフリン(pyrazofurin);リボプリン(riboprine);ログレチミド(rogletimide);サフィンゴール(safingol);塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン(simtrazene);スパルフォセート(sparfosate)ナトリウム;スパルソマイシン(sparsomycin);塩酸スピロゲルマニウム(spirogermanium);スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;スロフェヌール(sulofenur);タリソマイシン(talisomycin);テコガラン(tecogalan)ナトリウム;テガフル;塩酸テロキサントロン(teloxantrone);テモポルフィン(temoporfin);テニポシド(teniposide);テルオキシロン(teroxirone);テストラクトン(testolactone);チアミプリン(thiamiprine);チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン(tirapazamine);クエン酸トレミフェン(toremifene citrate);酢酸トレストロン(trestolone);リン酸トリシリビン(triciribine);トリメトトレキセート;グルクロン酸トリメトトレキセート;トリプトレリン(triptorelin);塩酸ツブロゾール(tubulozole);ウラシルマスタード;ウレデパ(uredepa);バプレオチド(vapreotide);べルテポルフィン(verteporfin);硫酸ビンブラスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;硫酸ビンデシン;硫酸ビネピジン;硫酸ビングリシネート(vinglycinate);硫酸ビンロイロシン;酒石酸ビノレルビン(vinorelbine);硫酸ビンロシジン;硫酸ヴィンゾリジン(vinzolidine);ボロゾール(vorozole);ゼニプラチン(zeniplatin);ジノスタチン;塩酸ゾルビシンが含まれる。
他の抗癌薬には、これらに限られないが、20-epi-1,25ジヒドロキシビタミンD3;5-エチニルウラシル;アビラテロン(abiraterone);アクラルビシン;アシルフルべン(acylfulvene);アデシペノール(adecypenol);アドゼレシン(adozelesin);アルデスロイキン(aldesleukin);ALL-TKアンタゴニスト;アルトレタミン(altretamine);アムバムスチン(ambamustine);アミドックス(amidox);アミフォスチン(amifostine);アミノレブリン酸;アムルビシン(amrubicin);アムサクリン(amsacrine);アナグレリド(anagrelide);アナストロゾール(anastrozole);アンドログラフォリド(andrographolide);血管形成阻害剤;アンタゴニストD;アンタゴニストG;アンタレリックス(antarelix);抗背方化形態発生タンパク質-1;抗アンドロゲン物質、前立腺癌;抗エストロゲン物質;抗新生物薬;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィディコリングリシネート;アポトーシス遺伝子調節剤;アポトーシス調節剤;アプリン酸;ara-CDP-DL-PTBA;アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン(asulacrine);アタメスタン(atamestane);アトリムスチン(atrimustine);アキシナスタチン(axinastatin)1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン(azasetron);アザトキシン(azatoxin);アザチロシン(azatyrosine);バッカチン(baccatin)III誘導体;バラノール(balanol);バチマスタット(batimastat);BCR/ABLアンタゴニスト;ベンゾクロリン;ベンゾイルスタウロスポリン(benzoylstaurosporine);βラクタム誘導体;βアレチン(alethine);βクラマイシンB;ベツリン酸;bFGF阻害剤;ビカルタマイド(bicalutamide);ビスアントレン(bisantrene);ビスアジリジニルスペルミン(bisaziridinylspermine);ビスナフィド(bisnafide);ビストラテン(bistratene)A;ビゼレシン(bizelesin);ブレフレート(breflate);ブロピリミン(bropirimine);ブドチタン(budotitane);ブチオニンスルフォキシミン(buthionine sulfoximine);カルシポトリオール(calcipotriol);カルフォスチンC;カンプトテシン誘導体;カナリポックス(canarypox)IL-2;カペシタビン(capecitabine);カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール;CaRest M3;CARN 700;軟骨由来阻害剤;カルゼレシン(carzelesin);カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS);カスタノスペルミン(castanospermine);セクロピン(cecropin)B;セトロレリックス(cetrorelix);クロルルン(chlorlns);クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;シス-ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマイシン(collismycin)A;コリスマイシンB;コンブレタスタチン(combretastatin)A4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン(conagenin);クラムベシジン(crambescidin)816;クリスナトール(crisnatol);クリプトフィシン(cryptophycin)8;クリプトフィシンA誘導体;クラシン(curacin)A;シクロペントアントラキノン;シクロプラタム(cycloplatam);サイペマイシン(cypemycin);シタラビンオクフォスフェート(cytarabine ocfosfate);細胞溶解因子;サイトスタチン;ダクリキシマブ(dacliximab);デシタビン(decitabine);デヒドロジデムニン(dehydrodidemnin)B;デスロレリン(deslorelin);デキサメタゾン;デキシホスタミド(dexifosfamide);デキスラゾキサン(dexrazoxane);デキスべラパミル(dexverapamil);ジアジコン(diaziquone);ジデムニンB;ジドックス;ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシチジン;ジヒドロタキソール、9-;ジオキサマイシン(dioxamycin);ジフェニルスピロムスチン(diphenyl spiromustine);ドセタキセル;ドコサノール(docosanol);ドラステロン(dolasetron);ドキシフルリジン;ドロロキシフェン(droloxifene);ドロナビノール(dronabinol);デュオカルマイシン(duocarmycin)SA;エブセレン(ebselen);エコムスチン(ecomustine);エデルフォシン(edelfosine);エドゥレコロマブ(edrecolomab);エフロルニチン(eflornithine);エレメン(elemene);エミテフル(emitefur);エピルビシン;エプリステリド(epristeride);エストラムスチン類似体;エストロゲンアゴニスト;エストロゲンアンタゴニスト;エタニダゾール(etanidazole);リン酸エトポシド;エキセメスタン(exemestane);ファドロゾール(fadrozole);ファザラビン(fazarabine);フェンレチニド(fenretinide);フィルグラスチム(filgrastim);フィナステリド(finasteride);フラボピリドール(flavopiridol);フレゼラスチン(flezelastine);フルアステロン(fluasterone);フルダラビン;塩酸フルオロダウノルニシン(fluorodaunorunicin);フォルフェニメックス(forfenimex);フォルメスタン(formestane);フォストリエシン(fostriecin);フォテムスチン(fotemustine);ガドリニウムテキサフィリン(texaphyrin);硝酸ガリウム;ガロシタビン(galocitabine);ガニレリックス(ganirelix);ゼラチナーゼ阻害剤;ゲムシタビン(gemcitabine);グルタチオン阻害剤;ヘプスルファム(hepsulfam);ヘレグリン(heregulin);ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸(ibandronic acid);イダルビシン(idarubicin);イドキシフェン(idoxifene);イドラマントン(idramantone);イルモフォシン(ilmofosine);イロマスタット(ilomastat);イミダゾアクリドン(imidazoacridones);イミキモド(imiquimod);免疫刺激ペプチド;インスリン様成長因子1受容体阻害剤;インターフェロンアゴニスト;インターフェロン;インターロイキン;ヨベングアン(iobenguane);ヨードドキソルビシン(iododoxorubicin);イポメアノール(4);イロプラクト(iroplact);イルソグラジン(irsogladine);イソベンガゾール(isobengazole);イソホモハリコンドリン(isohomohalicondrin)B;イタセトロン(itasetron);ジャスプラキノリド(jasplakinolide);カハラリド(kahalalide)F; ラメラリン三酢酸(lamellarin)N;ランレオチド(lanreotide);ライナマイシン(leinamycin);レノグラスチム(lenograstim);硫酸レンチナン;レプトルスタチン(leptolstatin);レトロゾール(letrozole);白血病阻害因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリド(leuprolide)+エストロゲン+プロゲステロン;ロイプロレイン;レバミゾール;リアロゾール(liarozole);直鎖ポリアミン類似体;親油性二糖ペプチド;親油性白金化合物;リソクリナミド(lissoclinamide)7;ロバプラチン(lobaplatin);ロンブリシン;ロメトレキソール(lometrexol);ロニダミン(lonidamine);ロソキサントロン(losoxantrone);HMG-CoAレダクターゼ阻害剤(これらに限られないが、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、シムバスタチンおよびアトルバスタチンなど);ロキソリビン(loxoribine);ルルトテカン(lurtotecan);ルテニウムテキサフィリン;リソフィリン(lysofylline);溶菌ペプチド;マイタンシン(maitansine);マノスタチン(mannostatin)A;マリマスタット(marimastat);マソプロコール(masoprocol);マスピン(maspin);マトリリシン(matrilysin)阻害剤;マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤;メノガリル(menogaril);メルバロン(merbarone);メテレリン(meterelin);メチオニナーゼ;メトクロプラミド;MIF阻害剤;ミフェプリストン(mifepristone);ミルテフォシン(miltefosine);ミリモスチム(mirimostim);不整合二本鎖RNA;ミトグアゾン(mitoguazone);ミトラクトール(mitolactol);マイトマイシン類似体;ミトナフィド(mitonafide);マイトトキシン(mitotoxin)繊維芽細胞成長因子サポリン(saporin);ミトキサントロン;モファロテン(mofarotene);モルグラモスチム(molgramostim);モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン;モノホスホリル脂質A+マイオバクテリウム(myobacterium)細胞壁sk;モピダモール(mopidamol);多剤耐性遺伝子阻害剤;MTS1ベースの治療;マスタード抗癌剤;マイカペロシキド(mycaperoxide)B;マイコバクテリウム細胞壁抽出物;マイリアポロン(myriaporone);N-アセチルジナリン(acetyldinaline);N-置換ベンザミド;ナファレリン(nafarelin);ナグレスチプ(nagrestip);ナロキソン+ペンタゾシン;ナパビン(napavin);ナフテルピン(naphterpin);ナルトグラスチム(nartograstim);ネダプラチン;ネモルビシン(nemorubicin);ネリドロン酸(neridronic acid);中性エンドペプチダーゼ;ニルタミド(nilutamide);ニサマイシン(nisamycin);酸化窒素調節剤;ニトロキシド抗酸化薬;ニトルリン(nitrullyn);O6ベンジルグアニン;オクトレオチド(octreotide);オキセノン(okicenone);オリゴヌクレオチド;オナプリストン(onapristone);オンダンセトロン(ondansetron);オンダンセトロン;オラシン(oracin);オーラルサイトカイン誘発剤;オルマプラチン(ormaplatin);オサテロン(osaterone);オキサリプラチン(oxaliplatin);オキサウノマイシン(oxaunomycin);パクリタクセル;パクリタクセル類似体;パクリタクセル誘導体;パラウアミン(palauamine);パルミトイルリゾキシン(palmitoylrhizoxin);パミドロン酸(pamidronic acid);パナキシトリオール(panaxytriol);パノミフェン(panomifene);パラバクチン(parabactin);パゼリプチン(pazelliptine);ペガスパルゲーゼ(pegaspargase);ペルデシン(peldesine);ポリ硫酸ペントサンナトリウム;ペントスタチン(pentostatin);ペントロゾール(pentrozole);ペルフルブロン(perflubron);ペルフォスファミド(perfosfamide);ペリリル(perillyl)アルコール;フェナジノマイシン(phenazinomycin);酢酸フェニル;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;塩酸ピロカルピン;ピラルビシン;ピリトレキシム(piritrexim);プラセチン(placetin)A;プラセチンB;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;白金錯体;白金化合物;白金-トリアミン錯体;ポルフィマー(porfimer)ナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビスビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害剤;プロテインAベースの免疫調節剤;タンパク質キナーゼC阻害剤;プロテインキナーゼC阻害剤、ミクロアルガル(microalgal);タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビン-ポリオキシエチレン複合体;rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド(raltitrexed);ラモセトロン(ramosetron);rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras-GAP阻害剤;脱メチル化レテリプチン(retelliptine);レニウムRe 186エチドロネート;リゾキシン(rhizoxin);リボザイム;RIIレチナミド(retinamide);ログレチミド(rogletimide);ロヒツキン(rohitukine);ロムルチド(romurtide);ロキニメクス(roquinimex);ルビギノン(rubiginone)B1;ルボキシル(ruboxyl);サフィンゴール(safingol);サイントピン(saintopin);SarCNU;サルコフィトール(sarcophytol)A;サルグラモスチム(sargramostim);Sdi 1模倣物質;セムスチン;老化由来阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達調節剤;一本鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン;ソブゾキサン;ホウカプテン酸(borocaptate)ナトリウム;フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール(solverol);ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン(sonermin);スパルフォス酸(sparfosic acid);スピカマイシン(spicamycin)D;スピロムスチン(spiromustine);スプレノペンチン(splenopentin);スポンギスタチン(spongistatin)1;スクアラミン(squalamine);幹細胞阻害剤;幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド(stipiamide);ストロメリシン(stromelysin)阻害剤;スルフィノシン(sulfinosine); 血管作用性小腸ペプチド過活性アンタゴニスト;スラジスタ(suradista);スラミン;スウェインソニン(swainsonine);合成グリコサミノグリカン;タリムスチン(tallimustine);タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガラン(tecogalan)ナトリウム;テガフル(tegafur);テルラピリリウム(tellurapyrylium);テロメラーゼ(telomerase)阻害剤;テモポルフィン(temoporfin);テモゾロミド(temozolomide);テニポシド(teniposide);テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン(tetrazomine);タリブラスチン(thaliblastine);チオコラリン(thiocoraline);トロンボポイエチン;トロンボポイエチン模倣物質;チムアルファシン(thymalfasin);チモポイエチン受容体アゴニスト;チモトリナン(thymotrinan);甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン(etiopurpurin);チラパザミン(tirapazamine);二塩化チタノセン(titanocene);トプセンチン(topsentin);トレミフェン(toremifene);全能幹細胞因子;
翻訳阻害因子;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン(triciribine);トリメトトレキセート;トリプトレリン(triptorelin);トロピセトロン(tropisetron);ツロステリド(turosteride);チロシンキナーゼ阻害剤;チルホスチン(tyrphostins);UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長阻害因子;ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド(vapreotide);バリオリン(variolin)B;ベクター系、赤血球遺伝子治療薬;ベラレソール(velaresol);ベラミン(veramine);ベルジン;ベルテポルフィン(verteporfin);ビノレルビン(vinorelbine);ビンキサルチン(vinxaltine);Vitaxin(登録商標);ボロゾール(vorozole);ザノテロン(zanoterone);ゼニプラチン(zeniplatin);ジラスコルブ(zilascorb);およびジノスタチンスチマラマー(stimalamer)が含まれる。好ましいその他の抗癌剤は、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。サリドマイドおよびトポイソメラーゼ阻害剤を使用する方法で使用する場合には、これら2種の薬剤が特に有用である。特定の実施形態では、抗癌剤は、化学療法薬ではない。
さらに特定の実施形態では、本発明は、これらに限られないが、表3に開示されているような抗癌剤、好ましくは、前記の乳癌、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、大腸癌および肺癌などの1種または複数の療法の投与と組み合わせてのインテグリンαVβ3のアンタゴニストの投与も含む。併用療法で使用する場合、表3に挙げられている投与用量および/または頻度を下回ってもよい。
Figure 2005533001
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さらに本発明は、癌細胞を破壊するためにX線、γ線および他の放射線源を使用することを含む放射線療法と組み合わせてのインテグリンαVβ3アンタゴニストの投与を包含する。好ましい実施形態では、放射線療法は、放射線が遠隔源から向けられる外部ビーム放射または遠隔放射線療法として投与（適用）する。他の好ましい実施形態では、放射線療法は、放射線源が、癌細胞または腫瘍本体近くの体内に置かれている内部治療または密封小線源療法として投与（適用）する。
癌治療薬およびその容量、投与経路および推奨される取扱いは、当分野で知られており、Physician's Desk Reference (56th ed., 2002年)などの文献に記載されている。
5.7 生物学的アッセイ
本発明の予防および/または治療プロトコルの毒性および効力は、例えば、LD50(集団の50%までが致死する用量)およびED50(集団の50%で治療的に有効な用量)を決定するための細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性効果および治療効果の用量比は、治療指数であり、これは、比LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を示す予防および/または治療薬が望ましい。毒性副作用を示す予防および/または治療薬を使用することはできるが、このような薬剤を侵されている組織の部位に向けて、侵されていない細胞に起こりうるダメージを最小限にして、副作用を減らすように送達系を設計するように配慮すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための予防および/または治療薬の用量幅を規定する際に使用することができる。このような薬剤の用量は好ましくは、僅かな毒性を伴うか、毒性を伴わないED50を含む循環濃度の範囲内にある。使用される剤形および利用される投与経路に応じて、用量は、この範囲内で変動しうる。本発明の方法で使用される薬剤では、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。用量を、細胞培養で決定されたIC50(即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物濃度)を含む循環血漿濃度範囲が達成されるように動物モデルで決定することができる。このような情報を使用して、ヒトで使用可能な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
末梢血リンパ球数に対するインテグリンαVβ3の1種または複数のアンタゴニストの1回または複数回の用量の効果を、当業者に知られている標準的な技術を使用してモニター/評価することができる。患者での末梢血リンパ球数は、例えば、前記の患者から末梢血の試料を得、例えばFicoll-Hypaque(Pharmacia)勾配遠心分離を使用して血漿などの末梢血の他の成分からリンパ球を分離し、トリパンブルーを使用してリンパ球をカウントすることにより、決定することができる。患者での末梢血T細胞数は、例えばFicoll-Hypaque(Pharmacia)勾配遠心分離を使用して血漿などの末梢血の他の成分からリンパ球を分離し、FITCまたはフィコエリトリンに結合するCD3、CD4およびCD8などのT細胞抗原に対する抗体でT細胞を標識し、FACSによりT細胞の数を測定することにより、決定することができる。
インテグリンαVβ3活性の遮断および/またはインテグリンαVβ3の血漿濃度に対するインテグリンαVβ3の1種または複数のアンタゴニストの効果は、これらに限られないが、ウェスタンブロット法、ノーザンブロット法、RNアーゼ保護アッセイ、酵素活性アッセイ、原位置ハイブリッド形成法、免疫組織化学試験および免疫細胞化学試験を含むインテグリンαVβ3の活性および/または発現を測定する当分野で知られている技術により評価することができる。これらのアッセイでは、使用される試料は、αVβ3またはその発現が判明しているリガンドに特異的である。
本発明のインテグリンαVβ3のアンタゴニストの結合特異性、親和性および機能活性は、これらに限られないが、国際公開第00/78815号および国際公開第02/070007号、米国特許第6248326号、米国特許第6472403号、Pecheur et al., 2002年, FASEB J. 16(10):1266〜1268頁; Almed et al., The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 50:1371〜1379頁(2002年)(これらは全て参照により本願明細書に組み込まれる)に開示されているアッセイを含む、当分野で知られている様々なインビトロの結合および細胞接着アッセイで特徴付けることができる。
本発明のインテグリンαVβ3のアンタゴニストの結合特異性は、インテグリンαVβ3への結合および他のαV-またはβ3-含有インテグリンに対するその交差反応性を測定することにより評価することができる。特に、結合特異性を、α11bβ3、血小板上で発現される主要なインテグリンへの、およびインテグリンαVβ5、内皮細胞および結合組織細胞型上で広汎に見られるインテグリンへの結合を測定することにより評価することができる。手短かに言うと、交差反応を決定するためには、インテグリンをELISAプレート上にコーティングし、一連の抗体希釈を、インテグリンαVβ3および他のインテグリンに対する抗体結合活性に関して測定する。インテグリンαVβ3およびαVβ5は、当分野で知られている技術により、例えば、Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6471〜6475頁(1987年)およびCheresh and Spiro, J. Biol. Chem. 262:17703〜17711頁(1987年)に記載されている親和性クロマトグラフィーにより単離することができる。特定の一実施形態では、抗インテグリンαVβ3抗体親和性カラムを使用して、オクチルグルコシドヒト胎盤溶解産物からインテグリンαVβ3を単離し、他方で、抗αV親和性カラムを使用して、インテグリンαVβ3減損カラム流動からインテグリンαVβ5を単離する。抗体結合活性を、ヒツジ抗ヒトIgG-アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用するELISAにより評価する。精製されたヒトIgG1抗体を対照として使用することができる。
他の実施形態では、結合親和性および特異性を、インテグリンαVβ3に対する親抗インテグリンαVβ3抗体との競合結合アッセイで評価する。競合結合は、ELISAアッセイで測定する。抗体の結合は、高濃度の抗体競合物質の存在で決定する。もしくは、対照競合抗体は、ヒトIgG1に対する。
他の実施形態では、結合親和性および特異性を、フィブリノーゲンへのインテグリンαVβ3結合に対するインテグリンαVβ3のアンタゴニストの阻害活性を測定することにより評価する。手短かに言うと、αVβ3を、ELISAプレート上に置く。インテグリンαVβ3のアンタゴニストの阻害活性を、高濃度のアンタゴニストまたは対照抗体の存在下での結合ビオチン化フィブリノーゲンの量を測定することにより決定する。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼを使用して、結合フィブリノーゲンを検出する。
他の実施形態では、アンタゴニスト結合の特異性は、細胞接着アッセイでのインテグリンαVβ3結合の阻害により評価する。内皮細胞接着事象は、血管形成プロセスでの重要な要素であり、インテグリンαVβ3の阻害は、腫瘍の新生血管形成を低減して、腫瘍の成長速度を遅くすることが知られている。これらのアッセイでのインテグリンαVβ3アンタゴニストによるαVβ3-仲介細胞接着の阻害は、このアンタゴニストが原位置またはインビボで使用された場合に予測される阻害活性を示している。手短かに言うと、10%のFBSを含有するRPMI中で成長させたインテグリンαVβ3-陽性M21黒色腫細胞を、これらの細胞結合アッセイで使用する。トリプシン処理により、培養皿から細胞を除去し、濃度4×105細胞/mlで接着緩衝液中に再懸濁させる。抗体および対照抗体を、接着緩衝液250μl(Hepes緩衝されている生理食塩水中10mMのHepes、2mMのMgCl2、2mMのCaCl2、0.2mMのMnCl2および1%のBSA、pH 7.4)中で所望の濃度に希釈し、フィブリノーゲンを予めコーティングされている48ウェルプレートのウェルに加える。各ウェルを、濃度10μg/mlのフィブリノーゲン200μlで37℃で1時間コーティングする。このアッセイのために、抗体またはアイソタイプ適正対照抗体を含有する等容量の細胞(250μl)を各ウェルに加え、穏やかに振盪させることにより混合させ、37℃で20分間インキュベーションする。BSAのみでコーティングされている対照ウェルに細胞が残らなくなるまで、接着緩衝液で洗浄することにより、結合しなかった細胞を除去する。結合した細胞を、クリスタルバイオレットで染色することにより可視化し、続いて、これを、酢酸100μl(10%)で抽出し、560nmでの可溶化染料の吸収を決定することにより、定量する。
他の実施形態では、インテグリンαVβ3のアンタゴニストの阻害活性を、内皮細胞遊走アッセイで試験することもできる。これに関連して、Transwell細胞遊走アッセイを使用して、抗インテグリンαVβ3抗体が内皮細胞遊走を阻害する能力を評価することができる (Choi et al., J. Vascular Surg., 19:125〜134頁(1994年)およびLeavesly et al., J. Cell Biol., 121:163〜170頁(1993年))。手短かに言うと、対数期にあり、低い継代数のヒト臍帯静脈内皮細胞を、弱いトリプシン処理により取得し、洗浄し、2×106細胞/mlの濃度で、1%のBSAを含有する37℃のHBS (20mMのHepes、150mMのNaCl、1.8 mMのMgCl2、1.8mMのCaCl2、5mMのKClおよび5mMのグルコース、pH 7.4)中に再懸濁する。抗体を、ストック溶液から10μ/mlまで希釈する。抗インテグリンαVβ3抗体を、1:1希釈で細胞に加え(抗体の最終濃度=5μg/ml;細胞の最終濃度=1×106細胞/ml)、10〜30分間氷上でインキュベーションする。次いで、細胞/アンタゴニスト懸濁液(各区画に200μl)を、Transwell細胞培養チャンバーの上部区画に加えるが、その低部区画は、10μg/mlのビトロネクチン0.5ml(HBS中)でコーティングされている。ビトロネクチンは、内皮細胞のための化学誘引物質として役立つ。チャンバーを、37℃に4時間置いて、細胞遊走を生成する。細胞遊走の可視化を、綿棒で上部区画中に残っている細胞を最初に除去することにより行う。挿入物の下方に泳動した細胞を、クリスタルバイオレットで30分間染色し、続いて、酢酸中で可溶化し、染料の吸収を、550nmの波長で測定する。吸収量は、上部チャンバーから低部チャンバーへと泳動した細胞の数に比例する。
インビトロアッセイの他の例、例えば、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー分析、骨皮質および細胞外マトリックスタンパク質への細胞接着アッセイ、細胞遊走アッセイ、細胞浸潤アッセイ、細胞増殖アッセイは、Pecheur et al., 2002年, FASEB J. 16(10):1266〜1268頁に見ることができ、そのテキスト全体が、参照により本願明細書に組み込まれる。
本発明により使用される治療薬の抗癌活性は、当分野で知られており、参照によりそのまま本願明細書に組み込まれるRelevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999年, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999年, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991年, eds. Boven and Winograd);およびAnticancer Drug Development Guide (1997年 ed. Teicher)に記載されている、マウスインテグリンαVβ3が、ヒトインテグリンαVβ3に代えられているscidマウスモデルまたはトランスジェニックマウス、ヒト異種移植片を有するヌードマウス、インテグリンαVβ3のアンタゴニストがVitaxin(商標)と同じターゲットを認識するハムスター、ウサギなどの動物モデルなどの癌を研究するための様々な実験動物モデルを使用して決定することができる。下記に、いくつかのアッセイを例として示すが、これは、限定的なものではない。
特定の癌に関与すると当分野で知られている様々な動物モデルを使用することができ、これらには、これらに限られないが、全て、参照により本願明細書に組み込まれる国際公開第00/78815号、米国特許第6248326号、米国特許第6472403号、Pecheur et al., 2002年, FASEB J. 16(10):1266〜1268頁; Almed et al., The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 50:1371〜1379頁(2002年)に開示されているものが含まれる。
一実施形態では、インテグリンαVβ3のアンタゴニストによる腫瘍成長の阻害を、2種の動物モデルで試験する。第1のモデルでは、ニワトリ絨毛尿膜(CAM)での血管形成を測定する。このアッセイは、インビボでの血管形成に関してよく認められているモデルである。それというのも、組織全体に新生血管形成が生じるためである。特に、このアッセイでは、成長因子含浸フィルターディスクへと、またはCAM上で成長する組織へと成長するニワトリCAM血管の成長因子誘発血管形成を測定する。新生血管形成の阻害は、新しい血管成長の量および規模、またはCAM上での組織の成長阻害に基づいている。このアッセイは、他にも詳細に記載されており、新生血管形成、さらに、腫瘍組織の新生血管形成を測定するために使用されている(Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597〜618頁(1975年);Ossonski et al., Cancer Res., 40:2300〜2309頁(1980年); Brooks et al., Science, 264:569〜571頁(1994a)およびBrooks et al., Cell, 79:1157〜1164 (1994b))。手短かに言うと、成長因子誘発血管形成のために、フィルターディスクに皮膚生検用パンチを使用して♯1Whatman Qualitative Circlesから穴をあける。ディスクを初めに、UV光に当てて滅菌し、ついで、滅菌条件下に様々な濃度のTNF-αまたは陰性対照としてのHBSSに浸す(少なくとも1時間)。含浸させたフィルターディスクをCAM上に置くことにより、血管形成を誘発させる。胎芽を、様々な量のインテグリンαVβ3のアンタゴニストおよび対照(抗体または精製ヒトIgG1)で処理することにより、血管形成の阻害を行う。ディスク設置の約24時間後の静脈内注入により、処理を行う。48時間後にCAMを切開し、血管形成を1〜4段階で採点する。HBSS含浸フィルターディスクを、CAMを調製する際の組織損傷に応答して生じうる血管形成を表す陰性対照として使用し、これらのCAMでの値を、背景として引く。精製ヒトIgG1は、注入のための陰性対象として使用することができる。
成長因子誘発新生血管形成を使用する前記のCAMアッセイに加えて、腫瘍誘発新生血管形成を利用する他のアッセイを行うこともできる。これらのアッセイでは、血管形性を、インテグリンαVβ3-陰性腫瘍断片をCAMに移植することにより誘発させる。インテグリンαVβ3-陰性腫瘍断片の使用により、腫瘍成長の阻害は、CAM由来内皮細胞によるαVβ3-仲介新生血管形成の阻害によるものであって、腫瘍細胞上に存在するインテグリンαVβ3により仲介される接着事象によるものではないことが保証される。腫瘍成長の阻害は、FG(8×106細胞、すい臓癌)およびHep-3細胞(5×105細胞、喉頭癌)の単一細胞懸濁液を30μlでCAM上に置くことにより評価する。1週間後に、腫瘍を除去し、約50mgの断片に切り分け、その後、これらを新たなCAM上に置く。この第2の設置の24時間後に、胚を、抗インテグリンαVβ3抗体または陰性対照としてのヒトIgG1と共に静脈内注入する。腫瘍を、約7日間成長させ、この後、除去し、秤量する。
第2の動物モデルで、ウサギでのV×2癌細胞の阻害を、インテグリンαVβ3のアンタゴニストの腫瘍に対する阻害効果の測定として使用する。V×2癌は、ショープウイルス誘発パピローマに由来する移植可能な癌である。このことは、1940年に初めて記載され、以降、腫瘍浸潤、腫瘍-宿主相互作用および血管形成に関する研究で広汎に使用されている。V×2癌は、繊維性で非常に進行性の未分化型癌の形態を示す。V×2腫瘍の増殖は、ドナーウサギでの連続移植により達成される。皮下移植に続いて、当初炎症反応の後に、宿主修復メカニズムが2から4日目の間に生じることが報告されている。この修復メカニズムは、新しい結合組織の形成および新しい毛細血管の産生により特徴付けられる。新生した毛細血管は、4日目では修復帯域に限られたが、8日目までには、腫瘍の外側領域まで延長した。ウサギでのインテグリンαVβ3のアンタゴニストのこれらの特徴および薬物動態を使用して、これらの実験での当初用量および治療スケジュールを決定することができる。
前記の動物モデルでのV×2腫瘍の成長を使用して、V×2癌を皮下移植されているウサギでの原発腫瘍成長に対する、初期投与の後のインテグリンαVβ3のアンタゴニストの効果を研究する。手短かに言うと、V×2腫瘍(50mg)を、皮膚と筋肉との間の切開を介してウサギの内モモに移植する。原発腫瘍の測定を、25日間の実験を通して行う。
他の実施形態では、BALB/c nu/nuマウスを、異常な骨代謝および/または異常な血管形成に関与する癌を研究するための動物モデルとして使用する。様々な形態でαVβ3を発現する様々な細胞系(例えば、CHO、乳癌細胞などの癌細胞の型)を、ヌードマウスに静脈内で注入することができる。前記のPecheur参照。例えば、CHO細胞を、αVβ3の様々なcDNA構造(例えば、野生型、αVβ3突然変異型)で形質導入し、ヌードマウスに静脈内注射する。骨転移に対するαVβ3(突然変異により様々なレベルの活性を有する)およびインテグリンαVβ3のアンタゴニストの効果を、例えば、X線像、骨組織の組織学的試験または統計的分析により評価することができる。
他の実施形態では、宇宙環境(例えば、スペースシャトル)内の動物(健常な、または予め作製した動物モデル)を使用して、本発明のインテグリンαVβ3のアンタゴニストを評価することができる。長期宇宙飛行している宇宙飛行士は、骨粗しょう症患者と同様の、ただし地球の重力の利点を受けているヒトに比べて10倍の速さで(BioWorld Today, 14:13,2003年1月21日参照)骨密度低下を示すので、宇宙環境内の動物は、異常な骨代謝および/または異常な血管形成に関与する癌に対する、本発明のインテグリンαVβ3のアンタゴニストの効果を決定するための理想的な骨粗しょう症モデルである。
他の実施形態では、皮下移植されたヒト骨断片を有するSCIDマウス(SCID-ヒト-骨モデル)を、異常な骨代謝および/または異常な血管形成を伴う疾患に対する本発明のインテグリンαVβ3のアンタゴニストの効果を評価するための動物モデルとして使用する。例えば、癌細胞(例えば、ヒト前立腺癌細胞)を、動物モデル内のヒト骨断片に直接注入する。同時に、抗体治療を開始する。骨転移または血管形成に対する本発明のインテグリンαVβ3のアンタゴニストの効果を、対照群と比較することにより評価することができる。Nemeth et al., Clinical & Experimental Metastasis, 19 (Supp. 1):47(2002年)参照。
治療有用性の証明
本発明のプロトコルおよび組成物を好ましくは、ヒトで使用する前に、インビトロで、ついでインビボで、所望の治療または予防活性に関して試験する。例えば、特定の治療処方量の投与が適応しているか否かの決定に使用できるインビトロアッセイには、患者組織試料を培養中で成長させ、処方量にかけるか、もしくは投与し、組織試料に対するこのような処方量の効果を、観察するインビトロ細胞培養アッセイまたは血管形成アッセイが含まれる。接触細胞の低いレベルでの増殖または生存は、治療薬が、患者の状態を治療するために有効であることを示している。もしくは、患者からの培養細胞の代わりに、腫瘍の細胞または悪性細胞系、破骨細胞、内皮細胞または内皮細胞系を使用して、治療薬および方法をスクリーニングすることもできる。当分野で標準的な多くのアッセイを使用して、このような生存および/または成長を評価することができる;例えば、細胞増殖は、3H-チミジン導入を測定することにより、直接的な細胞数により、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)または細胞周期マーカーなどの知られている遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる;細胞生存度は、トリパンブルー染色により評価することができ;分化は、形態などの変化を元に視覚的に評価することができる。
予防薬または治療薬を、ヒトで試験する前に、これらに限られないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどの適切な動物モデル系で試験することができる。
技術分野で知られており、広く使用されている主な動物モデルは、知られており、前記のような当分野で記載されている。
さらに、当業者に知られているアッセイを使用して、癌を治療または予防するための本願明細書に開示されている併用療法の予防的および/または治療的有用性を評価することができる。
5.8 医薬組成物
本発明の組成物には、医薬組成物を製造する際に使用することができるバルク薬物組成物(例えば、不純か、非滅菌組成物)および単位剤形を調製する際に使用することができる医薬組成物(即ち、被験者または患者への投与に適している組成物)が含まれる。このような組成物は、予防的または治療的有効量の本願明細書に開示されている予防薬および/または治療薬またはこれら薬剤の組合せならびに薬剤として許容される担体を含有する。好ましくは、本発明の組成物は、予防的または治療的有効量のインテグリンαVβ3アンタゴニスト(好ましくは、インテグリンαVβ3に免疫特異的に結合する抗体またはその断片、さらに特に、Vitaxin(登録商標)またはその抗原結合断片)および/または抗癌剤および薬剤として許容される担体を含有する。
特定の一実施形態では、「薬剤として許容される」との用語は、連邦政府または州政府の規制当局により認められているか、米国薬局方または動物、特にはヒトで使用するために通常認められている薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」との用語は、それと共に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントアジュバント(完全または不完全))、賦形剤または溶剤に関する。このような薬学的担体は、水ならびに落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成由来を含むオイルなどの滅菌液であってよい。医薬組成物を静脈内で投与する場合には、水が好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に、注入可能な溶液のための液体担体として使用することもできる。適切な薬剤賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。望ましい場合には、組成物はさらに少量の湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、徐放性処方剤などの形をとってよい。
通常、本発明の組成物の成分は、別々に、または単位剤形中で一緒に混合して、例えば、活性薬剤の量を指示するアンプル又はサッシェなどの気密容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物を注入により投与すべき場合には、滅菌した薬剤用の水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて投与することもできる。組成物を注射により投与する場合には、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを用意して、成分が投与前に混合されるようにすることもできる。
本発明の組成物は、中性の形または塩の形で処方することができる。薬剤として許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンで形成される塩と、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、第二鉄の各水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンで形成される塩が含まれる。
様々な送達系が知られており、これらを使用して、インテグリンαVβ3アンタゴニスト、あるいはインテグリンαVβ3アンタゴニストと癌の予防または治療に有用な予防剤または治療剤との組合せを投与することができる。そのような送達系には、例えば、リポソームへの封入、超微粒子、マイクロカプセル、抗体または抗体断片を発現しうる組換え細胞、受容体仲介エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429〜4432頁(1987年)参照)、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構成などがある。本発明の予防薬または治療薬を投与する方法には、これらに限られないが、非経口投与(例えば、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下)、硬膜外、腫瘍内、滑液包内および粘膜(例えば、鼻腔内および経口経路)が含まれる。特定の一実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、滑液包内または皮下に投与する。予防薬または治療薬は、任意の簡便な経路、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など)を介しての吸収により投与することができ、他の生物活性薬剤と一緒に投与することもできる。投与は、全身的または局所的であってよい。
特定の一実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、治療を必要とする部位に局所的に投与することが望ましいことがある;これは、例えば、これらに限られないが、局所注入により、注射により、またはインプラントの手段により達成することができ、該インプラントは、シアラスティック(sialastic)膜などの膜、ポリマー、Tissuel(登録商標)または繊維などを含む多孔性、非多孔性またはゼラチン様の材料でできている。
さらに他の実施形態では、予防薬または治療薬は、制御放出または持続放出系で送達することもできる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御放出または持続放出を達成することができる(例えば、Langer, supra; Sefton, 1987年, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980年, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989年, N. Engl. J. Med. 321:574参照)。他の実施形態では、ポリマー物質を使用して、本発明の抗体またはその断片の制御放出または持続放出を達成することができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974年); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984年); Ranger and Peppas, 1983年, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61参照;さらにLevy et al., 1985年, Science 228:190; During et al., 1989年, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989年, J. Neurosurg. 7 1:105);米国特許第5679377号;米国特許第5916597号;米国特許第5912015号;米国特許第5989463号;米国特許第5128326号;国際公開第99/15154号;および国際公開第99/20253号参照)。持続放出処方剤で使用されるポリマーの例には、これらには限られないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアセテート)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリアクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)およびポリオルトエステルが含まれる。好ましい一実施形態では、持続放出処方剤で使用されるポリマーは、不活性で、浸出性不純物を含まず、貯蔵時に安定で、無菌で、生分解性である。さらに他の実施形態では、制御放出または持続放出系を、予防または治療ターゲットの近くに配置して、全身用量の一部だけで済ますことができる(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115〜138 (1984年)参照)。
制御放出系は、Langerによる概観で検討されている(1990年, Science 249:1527〜1533頁)。当業者に知られている技術を使用して、本発明の1種または複数の治療薬を含有する徐放性製剤を製造することができる。例えば、それぞれ、そのまま参照により本願明細書に組み込まれる米国特許第4526938号、国際公開第91/05548号、国際公開第96/20698号、Ning et al., 1996年, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179〜189頁、Song et al., 1995年, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372〜397頁、Cleek et al., 1997年, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853〜854頁およびLam et al., 1997年, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759〜760頁参照。
5.8.1 処方
本発明により使用するための医薬組成物は、慣用の方法で1種または複数の生理的に許容される担体または賦形剤を使用して処方することができる。
したがって、インテグリンαVβ3のアンタゴニストまたは他の抗癌剤およびその生理的に許容される塩および溶媒和物を、吸入または通気(口または鼻を介して)による投与、あるいは経口、非経口または粘膜(頬、膣、直腸、舌下)投与のために処方することができる。好ましい実施形態では、局所または全身非経口投与を使用する。
経口投与では、医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、馬鈴薯デンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム;または湿潤剤(例えば、硫酸ラウリルナトリウム)などの薬剤として許容される賦形剤を用いる慣用の手段により調製された錠剤またはカプセルの形をとってよい。錠剤を、当分野でよく知られている方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形をとるか、あるいは、使用前に水または他の適切な溶剤で構成するための乾燥製品として提供することもできる。このような液体製剤は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂);乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアゴム);非水性溶剤(例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油);および防腐剤(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、ソルビン酸)などの薬剤として許容される添加剤を用いる慣用の手段により調製することができる。製剤はさらに、適切であれば、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含有してもよい。
経口投与用の製剤を適切に処方して、活性化合物を制御放出することができる。
バッカル投与のためには、組成物は、慣用に処方された錠剤またはロゼンジの形をとってよい。
吸入による投与では、本発明により使用する予防薬または治療薬は、簡便には、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを用いる加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー状に送達される。加圧エアロゾルの場合には、用量単位を、計測された量を送達するためのバルブを備えることにより決定することができる。吸入器または注入器中で使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有して処方することができる。
予防薬または治療薬を、注入により、例えば、ボーラス注射または継続注入による非経口投与のために処方することができる。注射用の処方剤は、例えば、防腐剤を加えたアンプル中、または多回用量容器中の単位剤形で提供することができる。組成物は、油性または水性溶剤中の懸濁液、溶液または乳剤としての形をとってよく、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの処方剤を含有してもよい。あるいは、活性成分は、使用前に例えば発熱物質不含の滅菌水などの適切な溶剤で構成するための粉末形であってもよい。
予防薬または治療薬は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの慣用の座薬基剤を含有する座薬または保持浣腸剤などの直腸組成物で処方することもできる。
前記の処方剤に加えて、予防薬または治療薬は、デポー製剤として処方することもできる。このような長期作用処方剤は、移植(例えば、皮下または筋肉内)により、または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、予防薬または治療薬は、適切なポリマー物質または疎水性物質(例えば、許容されるオイル中の乳剤として)またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩として処方することもできる。
予防薬または治療薬が、量を示すアンプル又はサッシェなどの気密容器中にパッケージングされていることを、本発明はさらに提供する。一実施形態では、予防薬または治療薬を、気密容器中の無水滅菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給し、これは、患者に投与するために水または生理食塩水で適切な濃度に再構成することができる。
本発明の好ましい一実施形態では、様々な化学療法剤、生物学的/免疫療法剤およびホルモン療法剤の処方および投与は、当分野で知られており、Physician's Desk Reference, 56th ed.(2002年)に頻繁に記載されている。例えば、本発明の特定の実施形態では、本発明の治療剤は、表1に記載されているように処方および供給することができる。
本発明の他の実施形態では、放射性同位体などの放射線療法剤を、カプセル中の液体として、または飲料として経口投与することができる。放射性同位体は、静脈内注射のために処方することもできる。熟練した腫瘍専門医であれば、好ましい処方および投与経路を決定することができる。
本発明の特定の実施形態では、Vitaxin(登録商標)を、静脈内注射のためには1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200ml/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mLおよび300mg/mLで、静脈内注射または繰り返し皮下投与のためには5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200ml/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mLおよび300mg/mLで処方する。
望ましい場合には、組成物を、活性成分を含有する1個または複数の単位剤形を含有するパックまたはディスペンサーデバイス中で提供することができる。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックフォイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサーデバイスに、投与のための指示書を付けてもよい。
一定の好ましい実施形態では、パックまたはディスペンサーは、5mg/mL以下のVitaxin(登録商標)および特定の癌治療のためにPhysician's Desk Reference (56th ed. 2002年、参照によりそのまま本願明細書に組み込まれる)で決められている推奨用量以下の処方剤を含有する1個又は複数の単位剤形を含有する。
5.8.2 投与量
癌またはその１以上の症状の治療、予防、管理または改善に有効な本発明の組成物の量は、標準的な研究技術で決定することができる。例えば、癌またはその１以上の症状の治療、予防、管理または改善に有効な組成物の投与量は、本明細書中に開示された、あるいは当業者に公知の動物モデル等の動物モデルに組成物を投与することによって決定することができる。更に、場合によってin vitroアッセイを用いて最適な投与量範囲を同定するのを補助することができる。
好ましい有効量の選択は、当業者に公知のいくつかの因子を考慮して、当業者が（例えば臨床試験を通じて）決定することができる。このような因子としては、治療または予防すべき疾患、関連する症状、患者の体重、患者の免疫状態、および投与された医薬組成物の正確さに反映することが当業者に知られている他の因子が挙げられる。
製剤で用いるべき正確な投与量はまた、投与経路、および癌の重篤度に依存し、実施者の判断および各患者の状態に応じて決定されるべきである。有効量は、in vitroまたは動物モデル試験の系から得られる用量−応答曲線から外挿することができる。
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、および抗体について、患者に投与される用量は典型的には、患者の体重当たり0.01mg/kg〜100mg/kgである。好ましくは患者に投与される用量は、患者の体重当たり0.1mg/kg〜20mg/kg、より好ましくは患者の体重当たり1mg/kg〜10mg/kgである。一般に外来ポリペプチドに対する免疫応答のために、ヒト抗体およびヒト化抗体は、他の種からの抗体よりヒト体内でより長い半減期を有する。すなわち、より低用量のヒト抗体と低頻度の投与がしばしば可能である。
好適な実施形態において、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、VITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片）の用量は、0.1〜10mg/kg/週、好ましくは１〜９mg/kg/週、さらに好ましくは２〜８mg/kg/週、さらにより好ましくは３〜７mg/kg/週、最も好ましくは４〜６mg/kg/週である。別の実施形態において、被験体、好ましくはヒトは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する予防的または治療的有効量の抗体または抗体断片（例えば、VITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片）を１回以上投与され、ここで、該被験体に投与される、本発明の液体製剤中の予防的または治療的有効量の抗体または抗体断片の用量は、治療が進行するに連れて、例えば0.01μg/kg、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.08μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、0.75μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、または125μg/kgだけ増加する。別の実施形態において、被験体、好ましくはヒトは、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する予防的または治療的有効量の抗体または抗体断片（例えば、VITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片）を１回以上投与され、ここで、該被験体に投与される本発明の液体製剤中の予防的または治療的有効量の抗体または抗体断片の用量を、治療が進行するにつれて、例えば0.01μg/kg、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.08μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、0.75μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、または125μg/kgだけ増加する。
具体的な実施形態において、インテグリンαvβ3に免疫特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、VITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片）の用量は、抗体の血漿濃度を、インテグリンαvβ3活性を連続的に阻止する、好ましいレベル（例えば、約0.1〜約100mg/kg）に維持する投与処方で投与される。具体的な実施形態において、患者に投与される用量は、患者の体重当たり0.1mg/kg〜20mg/kg、より好ましくは患者の体重当たり1mg/kg〜10mg/kgである。
別の実施形態において、被験者、好ましくはヒトに、インテグリンαvβ3と免疫特異的に結合する予防的もしくは治療的有効量の抗体または抗体断片（例えばVITAXIN（登録商標）またはその断片）の１以上の用量を投与し、ここで、被験者に投与する本発明の液体製剤中の予防的もしくは治療的有効量の抗体または抗体断片の用量を、治療が進行するにつれて、例えば0.01μg/kg、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.08μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、0.75μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、または125μg/kgだけ増加させる。別の実施形態において、被験者、好ましくはヒトに、インテグリンαvβ3と免疫特異的に結合する予防的もしくは治療的有効量の抗体または抗体断片（例えばVITAXIN（登録商標）またはその断片）の１以上の用量を投与し、ここで、被験者に投与する本発明の液体製剤中の予防的もしくは治療的有効量の抗体または抗体断片の用量を、治療が進行するにつれて、例えば0.01μg/kg、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.08μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、0.75μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、または125μg/kgだけ減少させる。
小分子の投与量の例として、被験者の体重またはサンプル重量の１キログラム当たり小分子がミリグラムまたはマイクログラムの量が挙げられる（例えば、１kg当たり約１μg〜1kg当たり約500mg、1kg当たり約100μg〜1kg当たり約5mg、または1kg当たり約1μg〜1kg当たり約50μg）。
患者に投与される他の癌治療薬については、当分野で公知の種々の癌治療剤の典型的な投与量を表３に記載する。本発明は、癌またはその１以上の症状の予防、治療、管理または改善のために以前に有効であると考えられていたよりもより低い投与量の公知の予防または治療薬を投与する任意の方法を提供する。好ましくは、より低い投与量の公知の抗癌治療剤を、より低い投与量のインテグリンαvβ3アンタゴニストと組み合わせて投与する。
予防薬または治療薬の用量は、Physician's Desk Reference (第56版、2002）に記載されている。
5.9 キット
本発明は、インテグリンαvβ3アンタゴニストを充填した１つ以上の容器を含む、医薬パックまたはキットを提供する。医薬パックまたはキットは、癌の治療に有用な１つ以上の予防薬または治療薬を含む。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。そのような容器には場合により、生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関が処方した形の通知があり、そのような通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の機関による認可を反映する。
本発明は、上記方法で使用できるキットを提供する。ある実施形態において、キットはインテグリンαvβ3アンタゴニストを１つ以上の容器中に含む。キットはさらに、癌の治療に有用な１つ以上の予防薬または治療薬を、１つ以上の容器中に含む。好ましくは、インテグリンαvβ3アンタゴニストはVITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片である。好ましいある実施形態においては、別の予防薬または治療薬は化学療法剤である。好ましいある実施形態においては、予防薬または治療薬は生物学的またはホルモン療法剤である。より好ましくは、インテグリンαvβ3アンタゴニストはVITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片であり、別の予防薬または治療薬は乳癌の治療のためのタキソールまたはタモキシフェン、あるいは結腸癌の治療のための、場合によってイリノテカン（Irnotecan）と共に用いる、5-FU（5-フルオロウラシル）およびロイコボリン（Leucovorin）である。別の実施形態において、キットはインテグリンαvβ3アンタゴニストおよび癌の治療に有用な１つ以上の別の予防薬または治療薬を、１つの容器中に含む。好ましくはインテグリンαvβ3アンタゴニストはVITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片である。好ましいある実施形態においては、別の予防薬または治療薬は化学療法剤である。好ましいある実施形態においては、別の予防薬または治療薬は生物学的またはホルモン療法剤である。
本発明はまた、別の部分（特に限定されないが、異種ポリペプチド、ペプチドもしくはタンパク質、大分子、小分子、マーカー配列、診断もしくは検出物質、治療薬、放射性金属イオン、２次抗体、および固体支持体を含む）に結合したインテグリンαvβ3アンタゴニストを充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。医薬パックまたはキットはさらに、癌の治療に有用な１つ以上の他の予防薬または治療薬を１つ以上の容器に含む。
5.10 製品
本発明はまた、最終的にパッケージしたおよび標識した医薬製品を包含する。この製品は、密封されたガラスバイアルまたは他の容器のような適切な容器中に、適切な単位投与型を含む。非経口投与に適した剤形の場合、活性成分は無菌であり、粒子を含まない溶液として投与するのに適している。すなわち本発明は、非経口溶液と凍結乾燥粉末の両方（それぞれ無菌であり、後者は注射前に復元するのに適している）を含む。あるいは単位投与型は、経口、経皮、局所または粘膜投与に適した固体でもよい。
好ましい実施形態において、単位投与型は、静脈内、筋肉内、または皮下投与に適している。すなわち本発明は、各投与経路に適した、好ましくは無菌の溶液を含む。
すべての医薬製品と同様に、包装材料と容器は、保存と輸送中の製品の安定性を保護するように設計される。さらに本発明の製品は、問題の疾患または障害をいかに適切に予防または治療するかについて、医師、技術者または患者にアドバイスをする使用説明書または他の情報材料を含む。すなわち製品は、特に限定されないが、実際の用量、追跡法(例えば、リンパ球の平均絶対数、腫瘍細胞数、および腫瘍サイズを追跡する方法など）、および他の追跡情報を含む投与処方を示すかまたは示唆する指示手段を含む。
さらに詳しくは本発明は、包装材料、例えば箱、ビン、試験管、バイアル、噴霧器、吹き入れ器、静脈内（i.v.）バッグ、封筒など；および該包装材料に含まれる少なくとも１つの単位投与型の薬剤と含む製品を提供する。本発明はまた、包装材料、例えば箱、ビン、試験管、バイアル、噴霧器、吹き入れ器、静脈内（i.v.）バッグ、封筒など；および該包装材料に含まれる少なくとも１つの単位投与型の各薬剤と含む製品を提供する。本発明は更に、包装材料、例えば箱、ビン、試験管、バイアル、噴霧器、吹き入れ器、静脈内（i.v.）バッグ、封筒など；および該包装材料に含まれる少なくとも１つの単位投与型の各薬剤と含む製品を提供する。
具体的な実施形態において製品は、包装材料、および該包装材料に含まれる薬剤と説明書を含み、該薬剤は、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは抗体もしくはその抗原結合断片、およびより好ましくはVITAXIN(登録商標)もしくはその抗原結合断片）と薬学的に許容される担体であり、該説明書は、癌を有する被験体を予防、治療、または管理するための投与処方を示す。別の実施形態において製品は、包装材料、および該包装材料に含まれる薬剤と説明書を含み、該薬剤は、インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは抗体もしくはその抗原結合断片、およびより好ましくはVITAXIN(登録商標)もしくはその抗原結合断片）、インテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の予防薬または治療薬、および薬学的に許容される担体を含み、該説明諸は、癌を有する被験体を予防、治療、または管理するための投与処方を示す。別の実施形態において製品は、包装材料、および該包装材料に含まれる２つの薬剤（該第１の薬剤はインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくは抗体もしくはその抗原結合断片、およびより好ましくはVITAXIN(登録商標)もしくはその抗原結合断片）および薬学的に許容される担体であり、該第２の薬剤はインテグリンαvβ3アンタゴニスト以外の予防または治療薬である）と説明書を含み、該説明書は、癌を有する被験体を予防、治療、または管理するための投与処方を示す。
本発明は、本発明の方法により低下させられるかまたは避けられる副作用は、癌に関連する１つ以上の症状を予防、治療または改善するのに使用される製品に同梱される情報材料に示されることを示す。本発明の方法により低下させられるかまたは避けられる副作用には、特に限定されないが、生存徴候異常（発熱、頻脈、徐脈、高血圧、低血圧）、血液学的事象（貧血、リンパ球減少、白血球減少、血小板減少）、頭痛、悪寒、めまい、吐き気、無気力、腰痛、胸痛（胸部圧力）、下痢、筋肉痛、疼痛、かゆみ、乾癬、鼻炎、発汗、注射部位反応、および血管拡張がある。一部の治療は免疫抑制性であるため、長引いた免疫抑制は、感染（日和見感染を含む）のリスクを上昇させる。長引いた持続している免疫抑制はまた、ある種類の癌を発症するリスクを上昇させる。
さらに、癌、またはその１つ以上の症状または症候を、予防、治療または改善するために使用される製品に同梱される情報材料は、外来タンパク質がアレルギー反応（アナフィラキシーを含む）またはサイトシン放出症候群を引き起こすことがあることを示す。情報材料は、アレルギー反応が、ほんの軽いそう痒性発疹を引き起こすか、または紅皮症、スティーヴンズ-ジョンソン症候群、血管炎、またはアナフィラキシーのように重症かも知れないことを示す。情報材料はまた、過敏性反応（アナフィラキシー）が重症であり、随時致死的過敏症反応に至ることを示す。アナフィラキシーを含むアレルギー反応は、外来タンパク質が体内に注入された時に起きることがある。これは、蓴麻疹または発疹のような軽い症状から致死的全身性反応まである。アナフィラキシー反応は、暴露後まもなく、通常10分以内に起きる。患者は、感覚異常、喉頭浮腫、精神状態の変化、顔面もしくは咽頭の血管性浮腫、気道閉塞、気管支痙攣、蓴麻疹およびかゆみ、血清病、関節炎、アレルギー性腎症、糸球体腎炎、巨細胞性動脈炎、または好酸球増加症を経験することがある。
情報材料はまた、サイトカイン放出症候群が、ある抗体の投与に一時的に関連した急性の臨床症状であることも示すことができる。サイトカイン放出症候群は、活性化リンパ球または単球によるサイトカインの放出が原因であるとされている。サイトカイン放出症候群の臨床症状は、しばしば報告されている軽い自己限定性の「インフルエンザ様」疾患から、あまり報告されていない重症の生命に関わるショック様反応（これは、重症の心血管、肺および中枢神経系症状を含む）まである。この症候群は典型的には、投与の約30〜60分後（さらに遅いこともある）に始まり、数時間続くことがある。この複合症状の頻度と重症度は、通常最初の投与の時が最大である。以後は投与毎に、症状の頻度と重症度は低下する傾向にある。用量の増加または中断後の治療再開は、症状の再出現を引き起こすことがある。上記したように本発明は、本明細書に記載の１つ以上の副作用を回避または低減させる治療および予防法を包含する。
5.11 インテグリンα v β 3 発現の解析におけるインテグリンα v β 3 アンタゴニストの使用
インテグリンαvβ3アンタゴニストを用いて、細胞または細胞系、および組織切片および生検におけるインテグリンαvβ3の発現を可視化することができる。ある実施形態において、組織切片および生検におけるインテグリンαvβ3の可視化を、実施例３に記載の種々の条件下で行うことができる。ある実施形態において、組織サンプルおよび生検の分析には、凍結組織の使用が必要である。好ましい実施形態において、組織の処理およびパラフィン包埋のための標準的な方法を用いて組織サンプルおよび生検を調製し、得られるパラフィン包埋組織におけるインテグリンαvβ3の免疫組織化学染色を可能にする。好ましくは、用いる条件および試薬はインテグリンαvβ3上のLM609エピトープを維持し、さらに標準的なパラフィン包埋手順に適合するものである。特定の好ましい実施形態において、LM609によって認識されるインテグリンαvβ3上のエピトープの可視化は、およそ70％のエタノール中で、処理およびパラフィン包埋前に好ましくは24時間、しかし12〜36時間でも良い時間固定した組織を使用することで達成される。本発明によって、このような方法で臨床試験、動物モデル、および生検由来の組織サンプル中のインテグリンαvβ3発現解析が容易になり得る。
本発明の方法に従って解析される組織は、いくつかの実施形態において、外科手術で得られた癌患者由来の組織である。Almedら, The Journal of Histochemistry ＆ Cytochemistry 50:1371-1379 (2002)を参照のこと。例えば、手術で得られた卵巣癌患者由来の組織を分け、ドライアイス中で冷却したイソペンタン中に浸漬することで凍結切片包埋培地（OCT）のシリンダー中で凍結させる。組織の凍結切片を５μｍの厚さに切り、すぐに使用しない場合は−20℃で保存する。染色には、切片を冷アセトン中で15分間固定し、Tris緩衝液（100mM、pH7.6）中に保持する。メタノール中３％H2O2を用いて内在性パーオキシダーゼ活性を除去し、希釈卵白（蒸留水中５％）および脱脂粉乳（蒸留水中５％）を続けて用いて内在性ビオチン活性を遮断する（全てを10分間で行う）。切片をTris緩衝液（100mM、pH7.6）中でαvβ3Mabと共に１時間インキュベートする。ビオチンおよびストレプトアビジンHRPをそれぞれ15分間用いて抗体結合を増幅し、ジアミノベンジジン（DAB）を用いて複合体を可視化する。核はMayerのヘマトキシリンで軽く染色され、切片をのせ（nounted）、カバーをする（cover-slipped）。適当に希釈されたイソ型IgG1を陰性対照としての抗体に置き換える。切片を、熟練した病理学者によってDAB染色陽性について顕微鏡によって評価し、αvβ3発現の染色度を盲検的に（in a blind fashion）数値化した。
インテグリンαvβ3アンタゴニストを用いて、細胞または細胞系、および組織切片および生検中のインテグリンαvβ3の発現および／または活性レベルを測定することによって、癌（例えば肺癌、乳癌、前立腺癌、または卵巣癌）の転移能を評価することができる。
標識したインテグリンαvβ3アンタゴニスト（特に標識した抗インテグリンαvβ3抗体）は、癌の検出、診断、またはモニタリングの診断目的で用いることができる。こうした診断技術は当分野で公知であり、限定するものではないが、国際公開WO 01/58483、米国特許第6,248,326号、Pecheurら, 2002, FASEB J. 16(10):1266-1268、Almedら, The Journal of Histochemistry ＆ Cytochemistry 50:1371-1379 (2002)（これらの全てを参照により本明細書に組み入れる）に開示されたものが挙げられる。好ましい実施形態において、IgGもしくはIgM抗体に共有結合したインテグリンαvβ3と、または細胞（例えば癌細胞）に共有結合したインテグリンαvβ3と免疫特異的に結合する抗体は、疾患または障害を検出、診断、またはモニタリングする診断目的のために用いられる。癌の検出または診断は、当業者に周知の技術を用いたin vitroおよび／またはin vivoアッセイにおいて有効量（すなわちインテグリンαvβ3の発現を検出できるために有効な量）のインテグリンαvβ3アンタゴニストを用いることで実施できる。好ましい実施形態において、当業者に公知の標準的な画像化技法において有効量の本発明の抗体を用いて被験者、好ましくは哺乳動物の被験者、最も好ましくはヒトの被験者において癌を検出する。
特定の実施形態において、本発明は、疾患または障害の検出または診断方法であって、ａ）有効量の標識インテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくはインテグリンαvβ3と免疫特異的に結合する抗体または抗体断片、より好ましくはVITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片）を被験者に投与し、ｂ）標識インテグリンαvβ3アンタゴニストが動物の任意の所望部位、例えば癌の部位に優先的に濃縮するのを可能にする（、そして未結合の標識インテグリンαvβ3アンタゴニストがバックグラウンドレベルまで除去される）ために、投与後ある時間間隔の間待ち、ｃ）バックグラウンドレベルを測定し、そしてｄ）被験者における標識インテグリンαvβ3アンタゴニストを検出する、ことを含み、バックグラウンドレベルを超える標識インテグリンαvβ3アンタゴニストの検出が疾患の存在を示す、上記方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、疾患または障害の検出または診断方法であって、ａ）有効量のインテグリンαvβ3アンタゴニスト（好ましくはインテグリンαvβ3と免疫特異的に結合する抗体または抗体断片、より好ましくはVITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片）を被験者に投与し、ｂ）インテグリンαvβ3アンタゴニストを認識する第２の標識剤（例えば抗体または抗体断片）を投与し、ｃ）標識剤が動物の任意の所望部位、例えば癌の部位に優先的に濃縮するのを可能にする（、そして未結合の標識剤がバックグラウンドレベルまで除去される）ために、投与後ある時間間隔の間待ち、ｄ）バックグラウンドレベルを測定し、そしてｅ）被験者における標識剤を検出する、ことを含み、バックグラウンドレベルを超える標識剤の検出が疾患の存在を示す、上記方法を提供する。
更に別の実施形態において、本発明は、被験者における癌の診断または検出方法であって、有効量の標識インテグリンαvβ3アンタゴニスト（特に、インテグリンαvβ3、好ましくはVITAXIN（登録商標）またはその抗原結合断片と免疫特異的に結合する抗体または抗体断片）を被験者に投与した後、ある時間間隔で該被験者を画像化処理することを含み、その時間間隔は、標識インテグリンαvβ3アンタゴニストが被験者の特定の部位、例えば癌の部位に優先的に濃縮することを可能にするのに十分なものであり、被験者の部位に局在化した標識インテグリンαvβ3アンタゴニストの検出が癌の存在を示すものである、上記方法を提供する。好ましい実施形態において、in vivoで検出される癌は固形腫瘍癌である。
いくつかの実施形態において、癌のモニタリングは、例えば最初の診断後１ヶ月、最初の診断後６ヶ月、および最初の診断後１年で癌の診断方法を繰り返すことによって実施する。本発明の特定の実施形態において、腫瘍の密度によって、本発明の方法に従って抗αvβ3抗体を用いた腫瘍の検出が容易になる。
標識インテグリンαvβ3アンタゴニストの存在は、in vivoスキャニングのための当分野で公知の方法を用いて患者において検出することができる。これらの方法は、用いる標識の型に依存する。当業者であれば、特定の標識を検出する適切な方法を決定することができるであろう。本発明の診断方法で用いられ得る方法および装置としては、限定するものではないが、コンピューター断層撮影法（CT）、ポジション放射断層撮影法（PET）等の全身スキャン、核磁気共鳴映像法（MRI）、および超音波検査法が挙げられる。特定の実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストを放射性同位体で標識し、放射線応答性外科用器具（Thurstonら, 米国特許第5,441,050号）を用いて患者において検出する。別の実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストを蛍光化合物で標識し、蛍光応答性スキャニング器具を用いて患者において検出する。別の実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストを陽電子放射金属で標識し、陽電子放射断層撮影法を用いて患者において検出する。更に別の実施形態において、インテグリンαvβ3アンタゴニストを常磁性標識で標識し、核磁気共鳴映像法（MRI）を用いて患者において検出する。
転移性乳癌患者の治療
本発明のいくつかの実施形態、並びに本発明の新規かつ予想外の利点について、以下の非限定的実施例によって説明する。
転移性乳癌患者におけるVitaxin（登録商標）の薬物動力学および安全性を評価するための研究を設計した。癌患者には現在TaxolまたはTaxotereが投与されている。現在治療中の患者にはこれらの薬物治療を継続する。
患者に単回IV投与量のVitaxin（登録商標）を投与し、次いで４週間後から同じ投与量で各週IV投与量の反復投与を12週間行った後に分析した。Vitaxin（登録商標）の安全性およびIV投与の26週間の疾患状態の変化も評価する。別のグループの患者も同様に処置して評価するが、投与量を1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、または8mg/kgとする。
IV注射のために、Vitaxin（登録商標）を5mg/mLおよび10mg/mLで製剤化する。反復皮下投与のためには80mg/mLの製剤を必要とする。Vitaxin（登録商標）はまた、研究目的での投与のために100mg/mLでも製剤化する。
腫瘍増殖の進行による変化を測定または決定する。
Vitaxin（登録商標）は、参照によりその全体を本明細書中に組み入れるPCT公開WO 00/78815の開示に従って調製および製剤化することができる。
インテグリンα v β 3 に対する結合親和性の測定およびインテグリンα v β 3 のエピトープマッピング
動物におけるVitaxin（登録商標）の効果をモデル化しようとする以前の試みは、Vitaxin（登録商標）がラットおよびマウス細胞上のαvβ3に結合できないために制限があった。以下に示すのは、ハムスター、ウサギ、モルモットおよびサルを含む、一般的な実験動物へのVitaxin（登録商標）の結合を示す分析結果である。
Figure 2005533001
αvβ3に富む胎盤組織は、出産後すぐ、または犠牲にしたばかりの妊娠後期の動物から回収した。およそ１cm3の組織断片をOCT中で凍結し、薄い切片をSierra Biomedical（Sparks, NV）のモノクローナル抗体（10μg/ml）で染色した。αvβ3を認識するVitaxin（登録商標）はヒト、サル、モルモット、ハムスターおよびウサギの胎盤で発現していたが、ヒトおよびサルのαvβ3とのみ反応した。LM609もウサギに結合でき、ヒト化抗ヒトインテグリンにヒト化するとこの性状は失われた。ＮＤ：実施せず。
Figure 2005533001
細胞（5×105個）を0.5μgの抗体と共にインキュベートし、結合した抗体をフィコエリトリン標識二次抗体で検出した。平均チャネル蛍光（mean channel fluorescence）の結果を、イソ型をマッチさせた対照抗体に対する増加倍率で表す。マウス抗ラットβ3抗体F11を、ラット細胞系RG2のための陽性対照として含めた。HMVEC：ヒト微小血管内皮細胞；ＮＤ：実施せず。図２−４参照。
Ｉ125-標識Vitaxin（登録商標）を用いて、ヒト、ウサギおよびハムスター細胞系についての結合親和性および結合部位の数を決定した。Vitaxin（登録商標）のハムスターαvβ3に対する親和性はヒトαvβ3よりも約２−３倍低く、ウサギαvβ3に対する親和性はヒトαvβ3よりも約４−１０倍低かった。図２−４参照。
種々の種のβ3インテグリンの残基164-202の配列を比較し、変異を設計した。Vitaxin（登録商標）の結合エピトープの性状を更に解析するために、ハムスターcDNA由来のβ3をコードする遺伝子をクローニングし、配列を決定した。以前からLM609結合エピトープを含むとされていた領域のアミノ酸を上に示す（点線(dashed lines)は保存されている残基を示す）。ヒトの配列中のどの残基が抗体結合に必須であるかを決定するために、着色して示すアミノ酸を対応するラットの残基に変異させた。得られた遺伝子を、内在性ヒトαvを発現するHEK293細胞にトランスフェクトした。得られた細胞系を、フローサイトメトリーによって抗体結合について解析した。
Figure 2005533001
他のヒト化抗αvβ3では異なるが、Vitaxin（登録商標）およびLM609は、ヒトαvβ3に加えてハムスターおよびウサギαvβ3を認識し、そのためこれらの動物種における抗体を用いた腫瘍血管形成のモデル化が可能である。Vitaxin（登録商標）のハムスターαvβ3に対する親和性はヒトαvβ3に対するよりも約２−３倍低く、ウサギαvβ3に対する親和性はヒトαvβ3に対するよりも約４−１０倍低かった。Vitaxin（登録商標）はマウスαvと複合化したヒトβ3に結合した。
上記の研究に加えて、インテグリンαvβ3サブユニットを以下のように置換し、Vitaxin（登録商標）および／またはLM609のインテグリンαvβ3に対する結合をFACS解析によって解析した。
FACS解析のプロトコル：
HEK-293トランスフェクト体（transfectant）のFACS解析
目的：
このプロトコルを用いて、種々のインテグリンサブユニットでトランスフェクトしたHEK-293細胞におけるインテグリンの表面発現を評価した。インテグリンに結合した一次抗体を、蛍光色素-結合二次抗体によって検出し、フローサイトメトリーで分析した。
試薬：
１．FACS緩衝液：PBS/２％熱不活化FCS/0.2％NaN3
２．Vitaxin（登録商標）、ヒト化抗ヒトαvβ3インテグリンmAb
３．F11、マウス抗ラットb3 mAb
４．P3G8、マウス抗ヒトαv mAb（Chemicon, ＃MAB1953）
７ ７、マウス抗ヒトαv mAb（Santa Cruz, #sc-9969）
５．P2W7、マウス抗ヒトβ3 mAb（Chemicon, ＃MAB1381）
６．23/C6、マウス抗ヒトαvβ3インテグリンmAb（Santa Cruz, #sc-7312）
７．LM609、マウス抗ヒトαvβ3インテグリンmAb
６．ヤギ抗ヒトIgG、(Fab=)2断片／Alex488コンジュゲート（Molecular probes ＃A-11013）
７．ヤギ抗マウスIgG、(Fab=)2断片／Alex488コンジュゲート（Molecular probes ＃A-11017）
８．ヒトIgG（Jackson, #009-000-003）
９．マウスIgG（Jackson, #015-000-003）
手法：
１．付着性細胞を５ｍｌのPBSで２回洗浄する。
２．1.5mlのトリプシン溶液または細胞溶解液を添加し、37℃で２分間インキュベートする。
３．プレートに３ｍｌの培養培地またはFACs緩衝液を添加して、ピペッティングによってプレートから細胞をはがす。細胞を計数する。細胞をFACs緩衝液中に5×106個／mlで再懸濁する。
４．10μgのマウスIgGまたはヒトIgGを含む微量遠心管（microfuge tubes）中にアリコートの5×105個の細胞（100μl）を移す。細胞を室温で20分間インキュベートしてIgG受容体部位をブロックする。注記：ヒト一次mAbを用いる場合にはブロッキングにマウスIgGを用いること。マウス一次mAbを用いる場合にはブロッキングにヒトIgGを用いること。
５．0.5mgのVitaxin（登録商標）または他の一次mAbを添加し、室温で20分間インキュベートする。
６．500μlのFACS緩衝液で２回洗浄し、細胞を1500rpmで５分間遠心分離する。
７．0.5mgのヤギ抗ヒトIgG Alexa 488、または他の二次抗体を添加し、室温で20分間インキュベートする。
８．500μlのFACS緩衝液で２回洗浄し、細胞を1500rpmで５分間遠心分離する。
９．500μlの緩衝液中に再懸濁してFACS分析を行う。
１０．染色しない細胞をバックグラウンドに用いる。陰性対照として、二次抗体単独を使用する。
作製した特定の置換されたインテグリンαvβ3変異型を表１および図５および７にまとめる。Vitaxin（登録商標）等のヒト化抗-インテグリンαvβ3抗体、並びにLM609抗体および種々の置換されたインテグリンαvβ3変異型に対する抗-マウス抗体の結合親和性をFACSによって解析し、結果を図５、６、および７に示すようにまとめることができる。
パラフィン包埋組織切片中のインテグリンα v β 3 の染色のための免疫組織化学的手法
LM609抗体を用いてインテグリンαvβ3の免疫組織化学的検出を行った。パラフィン包埋組織中のインテグリンαvβ3の免疫組織化学染色を用いてインテグリンαvβ3の可視化を可能にする最適な方法のために、多くのパラメーターを試験し、以下に記載する。
手法
用いた固定剤および組織処理試薬は以下の通りであった：10％の中性に緩衝化したホルマリン、OmniFix 2000、STF、パラホルムアルデヒド 37％（４％で使用）、パラフィン、プロパー（Propar）、エタノール 200 proof（固定化のため）、およびエタノール 組織学グレード（処理のため）。
組織処理手法（別の固定剤中で最初にインキュベーションした後の段階）は以下の通りであった：
Figure 2005533001
組織染色試薬は以下の通りとした：
一次抗体 LM609（Chemical）マウス抗ヒトαvβ3
対照抗体 EBM11（Dako）マウス抗ヒトCD68
二次抗体／検出 新規フスシンとのアルカリホスファターゼ抗マウスコンジュゲート（Signal Pathology System）キット
ブロッキング Super block（Pierce）
結果：
固定方法の選択：ヒト新生児包皮組織（Cooperative Human Tissue Network）のLM609による染色（40μg/ml、室温で２時間）
Figure 2005533001
70％EtOH固定方法を以下のように更に最適化した。
ヒト新生児の包皮サンプル、およびSCIDマウス上のヒト包皮移植片中に皮内増殖したM21腫瘍異種移植片を10μg/mlのLM609で室温で１時間染色した。サンプルを70％EtOH中で24時間、72時間、および１週間固定した。最良の染色は24時間の固定後で見られた。組織を72時間固定した場合には染色が低下し始め、１週間染色した場合もより弱かった。
等価物
当業者は、本明細書に記載の本発明の具体例に対して多くの同等物が認識するかまたは、ルーチンの実験のみを行って確認できるであろう。そのような同等物は、特許請求の範囲に包含されると考えられる。
本明細書で言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、各特許および特許出願が参照することにより、具体的にかつ個々の本明細書に組み込まれるのと同程度に、本明細書中に取り込まれる。
抗体Vitaxin（登録商標）の可変領域のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。図1Aは、Vitaxin（登録商標）重鎖可変領域のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列（それぞれ、配列番号１と配列番号３）である。 抗体Vitaxin（登録商標）の可変領域のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。図1Bは、Vitaxin（登録商標）軽鎖可変領域のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列（それぞれ、配列番号２と配列番号４）である。 腫瘍細胞株への抗体結合のフローサイトメトリー分析。マウスmAb LM609とヒト化および最適化mAb Vitaxin（登録商標）は、ヒトとハムスターαvβ3の両方に結合することができたが、ヒト化mAbはヒトαvβ3への結合を示したがハムスターαvβ3には結合しなかった。ウサギαvβ3はVitaxin（登録商標）により認識されたが、ヒト化抗αvβ3には認識されず、LM609にはほんのわずかに認識された。ラットαvβ3は３つの抗体のいずれでも認識されなかったが、抗ラットαvβ3対照抗体により検出された。 ヒトβ3トランスフェクトB16F10細胞へのVitaxin（登録商標）の結合のフローサイトメトリー分析。αvβ3に対するVitaxin（登録商標）の結合特異性を調べるために、マウスミエローマ株B16F10を、ヒトβ3遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフェクトした。内因性マウスαvで発現されたβ3の発現について、FACSにより細胞を分析した。Vitaxin（登録商標）はトランスフェクト細胞を認識し、おそらく内因性マウスαvと複合体を形成したヒトβ3の提示が、抗体結合に充分であることを示した。この証拠は、Vitaxin（登録商標）により認識されるエピトープがβ3タンパク質内に含有されることを示唆する。 ラット残基を含有するヒトβ3へのαvβ3特異抗体の結合。ヒトβ3 cDNAによるヒトHEK293細胞のトランスフェクションによりαvβ3が表面発現され、これは、LM609、ヒト化抗インテグリンαvβ3、およびVitaxin（登録商標）を用いるフローサイトメトリーにより検出されたが、抗ラットβ3抗体では検出されなかった。β3のA領域とB領域の変異は、抗ヒトαvβ3抗体の結合を大きく低下させたが、抗ラットβ3抗体の結合を上昇させなかった。C領域の変異は、抗ヒト抗体結合に影響を与えなかったが、抗ラットβ3抗体の結合を上昇させた。興味深いことに、A領域とC領域の両方のアミノ酸をラット残基に変化させると、Vitaxin（登録商標）およびヒト化抗インテグリンαvβ3の結合が無くなったが、LM609の結合にはほんのわずかに影響を与えた。しかしA領域とC領域の変化は、抗ラットβ3抗体の結合を劇的に上昇させた。最後にすべての３つの領域（A、BおよびC）を対応するラット残基に変化させることにより、我々はLM609、ヒト化抗インテグリンαvβ3、およびVitaxin（登録商標）の結合を完全に排除することができた。 インテグリンαvβ3変異型と、アミノ酸置換インテグリンαvβ3変異型への抗体の結合親和性を示す。 インテグリンαvβ3変異型と、アミノ酸置換インテグリンαvβ3変異型への抗体の結合親和性を示す。 インテグリンαvβ3変異型と、アミノ酸置換インテグリンαvβ3変異型への抗体の結合親和性を示す。
【配列表】
Figure 2005533001
Figure 2005533001
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Figure 2005533001
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Claims (44)

  1. 患者における癌を予防、治療又は管理する方法であって、その必要のある患者に有効量のVITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片、および有効量の１種以上の他の癌治療を投与することを含む、上記方法。
  2. 患者における癌を予防、治療又は管理する方法であって、その必要のある患者に有効量のVITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片を治療部分にコンジュゲートさせて投与することを含む、上記方法。
  3. インテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体または抗体断片がD12またはその断片ではない、請求項１または２記載の方法。
  4. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片を、1種以上の他の癌治療の投与と並行して患者に投与する、請求項１記載の方法。
  5. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片を、１種以上の他の癌治療の投与と連続して患者に投与する、請求項１記載の方法。
  6. 他の癌治療がインテグリンαVβ3アンタゴニストを含まない、請求項１記載の方法。
  7. 有効量の１種以上の他の癌治療を患者に投与することを更に含む、請求項２記載の方法。
  8. 上記癌治療が化学療法、生物学的治療／免疫療法、放射線療法、ホルモン療法または外科手術である、請求項１または７記載の方法。
  9. 癌治療薬ではない他の治療薬の投与を更に含む、請求項１、２または７記載の方法。
  10. 上記治療薬が制吐薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬、抗炎症剤、抗ウイルス剤または抗生物質である、請求項９記載の方法。
  11. 他の癌治療がインテグリンαVβ3アンタゴニストを含まない、請求項７記載の方法。
  12. 上記癌が、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、精巣、甲状腺、血液、腎臓、肝臓、膵臓もしくは脳または中枢神経系の癌である、請求項１、２または７記載の方法。
  13. 有効量のVitaxin（登録商標）を患者に投与する、請求項１、２または７記載の方法。
  14. 患者が、以前１種以上の癌治療の投与によって治療されたことがあるが、インテグリンαVβ3アンタゴニストの投与による治療はされていない、請求項１、２または７記載の方法。
  15. 患者が化学療法単独で、または放射線療法、生物学的治療／免疫療法、ホルモン療法または外科手術の１以上との組み合わせで治療されたことがある、請求項１、２または７記載の方法。
  16. 患者が放射線療法単独で、または化学療法、生物学的治療／免疫療法、ホルモン療法または外科手術の１以上との組み合わせで治療されたことがある、請求項１、２または７記載の方法。
  17. 患者が生物学的治療／免疫療法単独で、または化学療法、放射線療法、ホルモン療法または外科手術の１以上との組み合わせで治療されたことがある、請求項１、２または７記載の方法。
  18. 患者がホルモン療法単独で、または化学療法、放射線療法、生物学的治療／免疫療法または外科手術の１以上との組み合わせで治療されたことがある、請求項１、２または７記載の方法。
  19. 患者が外科手術単独で、または化学療法、放射線療法、生物学的治療／免疫療法またはホルモン療法の１以上との組み合わせで治療されたことがある、請求項１、２または７記載の方法。
  20. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片、および癌治療を同じ投与方式で投与する、請求項１、２または７記載の方法。
  21. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片、および癌治療を異なる投与方式で投与する、請求項１、２または７記載の方法。
  22. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片、および癌治療を同じ投与形態で投与する、請求項１、２または７記載の方法。
  23. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片、および癌治療を異なる投与形態で投与する、請求項１、２または７記載の方法。
  24. 癌治療がVITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片とは異なるメカニズムで作用する、請求項１、２または７記載の方法。
  25. 癌治療がVITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片と同じメカニズムで作用する、請求項１、２または７記載の方法。
  26. 患者がヒトの患者である、請求項１、２または７記載の方法。
  27. 癌が骨転移性癌である、請求項１、２または７記載の方法。
  28. 癌がインテグリンαVβ3を発現する、請求項１、２または７記載の方法。
  29. 癌がインテグリンαVβ3を発現しない、請求項１、２または７記載の方法。
  30. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片を、毎週約0.1mg/kg〜10mg/kgの投与量で静脈内に投与する、請求項１記載の方法。
  31. 癌が化学療法または放射線療法に抵抗性である、請求項１、２または７記載の方法。
  32. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片を、被験体に非経口的、経口的、または腫瘍内に投与する、請求項１記載の方法。
  33. 癌治療が化学療法剤でない、請求項１または７記載の方法。
  34. 患者におけるリンパ球平均絶対総数を１以上の後のVitaxin（登録商標）またはその抗原結合断片の投与に先立って評価する、請求項１記載の方法。
  35. 患者におけるVITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片の血漿濃度を約0.1〜約100μg/mlに維持するために、VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片を続いて１回以上患者に投与する、請求項１記載の方法。
  36. 治療的有効量のVITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片、および治療的有効量の１種以上の抗癌剤、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
  37. VITAXIN（登録商標）もしくはその抗原結合断片、またはインテグリンαVβ3との結合においてVITAXIN（登録商標）と競合する抗体もしくはその断片が治療成分にコンジュゲートされている、請求項３６記載の組成物。
  38. 少なくとも１種の抗癌剤が化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、または生物学的治療／免疫療法剤である、請求項３６または３７記載の組成物。
  39. 組成物が治療的有効量のVitaxin（登録商標）を含有する、請求項３６または３７記載の組成物。
  40. 組成物が治療的有効量のVitaxin（登録商標）の断片を含有する、請求項３６または３７記載の組成物。
  41. 抗癌剤以外の治療薬を更に含有する、請求項３６または３７記載の組成物。
  42. 上記治療薬が制吐薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬、抗炎症剤、抗ウイルス剤または抗生物質である、請求項４１記載の組成物。
  43. Vitaxin（登録商標）によって特異的に認識されるエピトープに対する特異的結合親和性を有する抗体のスクリーニング方法であって、野生型ヒトインテグリンαvβ3に結合するが、ヒトβ3鎖中の残基171、173および174がそれぞれアミノ酸Gln、IleおよびLysで置換されたヒトインテグリンαvβ3には結合しないモノクローナル抗体の同定を含む、上記方法。
  44. 組織中のインテグリンαVβ3の検出方法であって、凍結していない組織をパラフィン包埋の24時間前に70％EtOH中に固定し、インテグリンαVβ3の免疫組織検出（immunohistodetection）のために抗体LM609で染色することを含む、上記方法。
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