JP2016538318A - 新規ｓｅｚ６モジュレーターおよび使用方法 - Google Patents

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Abstract

抗体およびその誘導体を含む新規のモジュレーター、ならびにこのようなモジュレーターを使用して、増殖性障害を処置する方法が提供される。本発明は、新規の発作関連６ホモログ（またはＳＥＺ６）モジュレーターであって、腫瘍細胞および／またはがん幹細胞を有効に標的化し、多種多様な悪性腫瘍を患う患者を処置するのに使用することができるモジュレーターを提供する。本明細書でより詳細に論じられる通り、少なくとも２つの自然発生のＳＥＺ６アイソフォームまたはバリアントが存在し、開示されているモジュレーターは、１つのアイソフォームもしくは他のアイソフォームまたはこれらの両方を含むか、あるいはこれらと選択的に会合し得る。

Description

相互参照出願
本出願は、２０１３年８月２８日に出願された米国仮出願第６１／８７１，２８９号に基づく優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによるＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に援用される。２０１４年８月２７日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、「Ｓ６９６９７ １１３０ＷＯ ＳＥＱＬ ０８２７１４ ｆｏｒ ｆｉｌｉｎｇ」という名称で、サイズは４６２，０７３バイトである。
発明の分野
本出願は一般に、新規の化合物、組成物、ならびに増殖性障害およびその任意の拡大、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、または転移の診断、防止、処置、または改善においてそれらを使用する方法に関する。広義の態様では、本発明は、新生物性障害の処置、診断、または予防のための抗ＳＥＺ６抗体および融合構築物を含む、発作関連６ホモログ（ＳＥＺ６）モジュレーターの使用に関する。本発明の選択された実施形態は、好ましくは、腫瘍開始細胞頻度の低下を含む、悪性腫瘍の免疫療法処置のための抗体薬物コンジュゲートを含む、このようなＳＥＺ６モジュレーターの使用を提供する。本発明の特に好ましい実施形態は、特異的エピトープと会合するモジュレーター、ならびに髄様甲状腺がん、小細胞肺がんを患う患者、および標準治療である白金ベースの薬剤に対して抵抗性である患者など、ある特定の患者集団を処置するための、開示されているモジュレーターの使用を含む。
発明の背景
幹細胞および前駆細胞の分化ならびに細胞増殖は、正常な進行中の過程であって、器官形成時の組織の増殖、ならびに全ての生物の生存期間における細胞の置き換えおよび大半の組織の修復を支持するように協調して作用する過程である。正常な事象の経過では、細胞の分化および増殖は、一般に、細胞運命の決定および組織のアーキテクチャーを維持するように均衡させた、多数の因子およびシグナルにより制御される。したがって、大部分において、細胞の分裂および組織の成熟を調節するのは、この制御された微小環境であり、ここでは、シグナルが、生物の必要に基づき適正に発せられる。これに関して、細胞の増殖および分化は、損傷した細胞もしくは死滅しつつある細胞の置き換え、または増殖に必要な場合に限り正常に生じる。残念ながら、例えば、様々なシグナリング化学物質の過少もしくは過剰、微小環境の変化の存在、遺伝子の突然変異、またはこれらの何らかの組合せを含む無数の因子から、細胞の増殖および／または分化の破壊が生じ得る。正常な細胞の増殖および／または分化が、撹乱または何らかの形で破壊されると、がんなどの増殖性障害を含む、様々な疾患または障害がもたらされる可能性がある。
がんのための従来の処置は、化学療法、放射線療法、手術、免疫療法（例えば、生物学的応答修飾因子、ワクチン、または標的化療法剤）、またはこれらの組合せを含む。残念ながら、ある特定のがんは、このような処置に対して非応答性であるか、または応答が最小限である。例えば、一部の患者では、腫瘍は、選択された治療の一般的有効性にもかかわらず、それらを非応答性とする遺伝子突然変異を呈示する。さらに、がんの種類およびがんがどのような形態をとるのかに応じて、手術など、一部の利用可能な処置は、実行可能は代替法とならない場合もある。現行の標準治療剤に固有の限界は、既往の処置を受け、その後、再発した患者を処置しようと試みる場合に、特に明らかである。このような場合、奏効しなかった治療レジメン、および結果としてもたらされる患者の増悪は、比較的侵襲性の疾患として顕症化することが多い不応性腫瘍であって、最終的に治癒不可能であることが分かる不応性腫瘍に寄与する場合がある。がんの診断および処置では、多年にわたり大きな改善がなされているが、多くの固形腫瘍についての全体的生存率は、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、腫瘍の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）および転移を防止する既存の治療の不奏効に起因して、大部分が不変のままである。したがって、増殖性障害のための、より標的化され、強力な治療を開発することは、依然として難題のままである。
本発明は、広義において、ＳＥＺ６関連障害（例えば、増殖性障害または新生物性障害）の処置において使用することができる、方法、化合物、組成物、および製品を対象とする、これらの目的物および他の目的物を提供する。この目的のために、本発明は、新規の発作関連６ホモログ（またはＳＥＺ６）モジュレーターであって、腫瘍細胞および／またはがん幹細胞を有効に標的化し、多種多様な悪性腫瘍を患う患者を処置するのに使用することができるモジュレーターを提供する。本明細書でより詳細に論じられる通り、少なくとも２つの自然発生のＳＥＺ６アイソフォームまたはバリアントが存在し、開示されているモジュレーターは、１つのアイソフォームもしくは他のアイソフォームまたはこれらの両方を含むか、あるいはこれらと選択的に会合し得る。さらに、ある特定の実施形態において、開示されているＳＥＺ６モジュレーターは、１または複数のＳＥＺファミリーメンバー（例えば、ＳＥＺ６ＬまたはＳＥＺ６Ｌ２）とさらに反応する場合もあり、他の実施形態において、もっぱら、ＳＥＺ６アイソフォーム（複数可）と会合または反応するように、作製し、選択することもできる。好ましい実施形態において、本発明は、より特定すると、抗体（すなわち、ＳＥＺ６の少なくとも１つのアイソフォームに免疫優先的に結合するか、これと反応するか、または会合する抗体）を含む単離ＳＥＺ６モジュレーターを対象とし、特に好ましい実施形態において、１または複数の細胞傷害剤または治療用部分、例えば、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピンに会合またはコンジュゲートさせる。さらに、下記で広範に論じられる通り、このようなモジュレーターを使用して、増殖性障害の予防、診断、または処置に有用な医薬組成物を提供することができる。
本発明の選択された実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、単離形態のＳＥＺ６ポリペプチドもしくはその断片、または他の部分と融合もしくは会合させたＳＥＺ６ポリペプチドもしくはその断片（例えば、Ｆｃ−ＳＥＺ６、ＰＥＧ−ＳＥＺ６、または標的化部分と会合させたＳＥＺ６）を含み得る。他の選択された実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、本出願の目的では、ＳＥＺ６を認識するか、これと競合するか、相互作用するか、結合するか、または会合し、腫瘍開始細胞を含む新生物性細胞の増殖を中和するか、消失させるか、退縮させるか、感作するか、再プログラムするか、阻害するか、または制御する、任意の構築物または化合物を意味するように理解されるものとするＳＥＺ６アンタゴニストを含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、新生物性細胞を伝播させるか、維持するか、拡大させるか、増殖させるか、またはそれらの生存、再帰、再生、および／または転移を他の形で容易とする、腫瘍開始細胞の能力を、サイレンシングするか、中和するか、低減するか、減衰させるか、枯渇させるか、緩和するか、減殺するか、再プログラムするか、消失させるか、または他の仕方で阻害することが予測外に見出された、抗ＳＥＺ６抗体、またはその断片もしくは誘導体を含む。特に好ましい実施形態において、抗体または免疫反応性断片は、１または複数の抗がん剤（例えば、細胞傷害剤）と会合またはコンジュゲートさせることができる。
このようなモジュレーターに関して述べると、適合性の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト、ヒト化およびヒト抗体、ならびに前出のそれぞれの免疫反応性断片および／またはバリアントを含む、いくつかの形態のうちのいずれか１つを呈し得ることが認められよう。好ましい実施形態は、ヒト化構築物または完全ヒト構築物など、比較的非免疫原性である抗体を含むであろう。当然ながら、本開示の観点で、当業者であれば、不要な実験を伴わずに、ＳＥＺ６抗体モジュレーターの重鎖および軽鎖可変領域と会合させた、１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を容易に同定し、これらのＣＤＲを使用して、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはＣＤＲグラフト化抗体を操作するかまたは製作し得るであろう。したがって、ある特定の好ましい実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、連続的なマウス軽鎖可変領域（図１０Ａ）またはマウス重鎖可変領域（図１０Ｂ）であって、これらの図に示された可変領域（配列番号２０〜１６９）から誘導された、１または複数のＣＤＲを組み込む抗体を含む。また、ヒトフレームワークおよびそれらのバリアントを有する、このようなＣＤＲグラフト可変領域も、配列番号１７０〜１９９を含む図１０に示される。好ましい実施形態において、このような抗体は、モノクローナル抗体を含み、なおより好ましい実施形態において、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、またはヒト化抗体を含むであろう。
図１０Ａおよび１０Ｂに示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする、例示的な核酸配列は、添付の配列表に示され、配列番号２２０〜３９９を含む。これに関して、本発明は、開示されている抗体可変領域アミノ酸配列であって、配列表に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子（および関連する構築物、ベクター、および宿主細胞）もさらに含むことが認められよう。
より特定すると、選択された実施形態において、適合性のＳＥＺ６モジュレーターは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する抗体であって、前記軽鎖可変領域が、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６および配列番号１６８に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７および配列番号１６９に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体を含み得る。他の好ましい実施形態において、選択されたモジュレーターは、上述のマウス配列に対して６５、７０、７５、または８０％の同一性を含む、重鎖および軽鎖可変領域を含むであろう。さらに他の実施形態において、モジュレーターは、開示されているマウス配列に対して８５、９０、なおまたは９５％の同一性を含む、重鎖および軽鎖可変領域を含むであろう。
当然ながら、本開示の観点で、当業者であれば、不要な実験を伴わずに、上述の重鎖および軽鎖可変領域と会合させたＣＤＲを容易に同定し、これらのＣＤＲを使用して、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはＣＤＲグラフト化抗体を操作するかまたは製作し得るであろう。これに関して、対象の重鎖または軽鎖可変領域の核酸配列またはアミノ酸配列を入力すると、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を自動的に表示する（一般に使用される番号付けシステムのうちのいずれかに準拠して）、複数のウェブサイトデータベースが利用可能である。そのようなものとして、選択された実施形態において、本発明は、図１０Ａまたは図１０Ｂに示される可変領域配列に由来する、１または複数のＣＤＲを含む抗ＳＥＺ６抗体を対象とする。好ましい実施形態において、このような抗体は、モノクローナル抗体を含み、なおより好ましい実施形態において、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、またはヒト化抗体を含むであろう。下記でより詳細に論じられる通り、さらに他の実施形態は、１または複数の細胞傷害剤とコンジュゲートまたは会合させた、このような抗体を含むであろう。
本発明の別の態様は、ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９、およびＳＣ１７．２００から得られるかまたは誘導されたモジュレーターを含む。
さらに他の適合性の実施形態において、本発明は、ＣＤＲグラフトＳＥＺ６モジュレーターまたはヒト化ＳＥＺ６モジュレーターである、ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５５、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１およびＳＣ１７．２００を含むであろう。さらに他の実施形態は、ヒト化抗体を含むＳＥＺ６モジュレーターであって、前記ヒト化抗体が、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、および配列番号１９０に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、および配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、および配列番号１９１に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＥＺ６モジュレーターを対象とする。加えて、本明細書の教示に従い、軽鎖可変領域（配列番号１９２）および重鎖可変領域（配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、および配列番号１９９）の、ある特定のヒト化バリアントも提供される。さらに、すぐ上で記載した、例示されるヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、添付の配列表で、配列番号３７０〜３９９として示される。
上述の態様のほか、本発明の他の好ましい実施形態は、１または複数の薬物または治療用部分（例えば、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピン）に会合またはコンジュゲートされたＳＥＺ６モジュレーターであって、増殖性障害の処置に特に、有効であり得る（単独で、または他の薬学的活性薬剤と組み合わせて）モジュレーターコンジュゲートをもたらすＳＥＺ６モジュレーターも含むであろう。より一般に、本発明のモジュレーターを製作し、選択したら、それらを、薬学的活性部分もしくは診断用部分または生体適合性修飾因子と連結するか、これらに融合させるか、コンジュゲートさせる（例えば、共有結合的に、または非共有結合的に）か、またはこれらと他の仕方で会合させることができる。本明細書において使用される場合、用語「コンジュゲート」または「モジュレーターコンジュゲート」または「抗体コンジュゲート」は、広義で使用され、会合法にかかわらず、開示されているモジュレーターと会合させた、任意の、生物学的に活性であるかまたは検出可能な分子または薬物を意味すると考えられよう。これに関して、このようなコンジュゲートは、開示されているモジュレーターに加えて、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性薬剤へと代謝されるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣薬剤、合成薬物、無機分子、有機分子、および放射性同位体も含み得ることが理解されるであろう。さらに、上記で指し示した通り、選択された薬物または治療用部分は、共有結合的に、または非共有結合的に、モジュレーターと会合させるか、またはこれに連結することができ、コンジュゲーションを実行するのに使用される方法に少なくとも部分的に応じて、様々なモル当量比を呈示する。
本発明の特に好ましい態様は、増殖性障害の診断および／または処置に使用することができる、抗体モジュレーターコンジュゲートまたは抗体−薬物コンジュゲートを含むであろう。このようなコンジュゲートは、式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ［式中、Ｍは、開示されているモジュレーターまたは標的結合性部分を表し、Ｌは、任意選択のリンカーまたはリンカー単位であり、Ｄは、適合性の薬物またはプロドラッグであり、ｎは、約１〜約２０の整数である］で表すことができる。文脈がそれ以外を示さなければ、「抗体−薬物コンジュゲート」もしくは「ＡＤＣ」という用語または式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎは、治療用部分および診断用部分の両方を含むコンジュゲートを包含すると考えるものとすることが認められよう。このような実施形態において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、モジュレーター単位（Ｍ）としての抗ＳＥＺ６と、治療用部分または診断用部分（Ｄ）と、任意選択で、薬物と抗原結合剤とを接合するリンカー（Ｌ）とを含むことが典型的であろう。モジュレーターは、治療用部分または診断用部分に直接的にコンジュゲートさせることもでき、間接的にコンジュゲートさせることもできる。リンカーを伴って治療用部分または診断用部分に接合されたモジュレーターを、「間接的にコンジュゲートされた」モジュレーターと称するのに対し、リンカーの非存在下で治療用部分または診断用部分に接合された抗体を、「直接的にコンジュゲートされた」抗体と称する。好ましい実施形態において、抗体は、上記で記載した、重鎖および軽鎖可変領域に由来する少なくとも１つのＣＤＲを含むＳＥＺ６ ｍＡｂである。
既に指し示された通り、本発明の一態様は、ＳＥＺ６ポリペプチドの、がん幹細胞との予測外の会合を含み得る。したがって、ある特定の他の実施形態において、本発明は、対象に投与されると、腫瘍開始細胞の頻度を低下させる、ＳＥＺ６モジュレーターを含むであろう。好ましくは、頻度の低下は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を使用して決定されるであろう。特に好ましい実施形態において、このような解析は、ヒト腫瘍生細胞の、免疫不全マウスへの移植を含む、ｉｎ ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を使用して実行することができる。代替的に、限界希釈解析は、ヒト腫瘍生細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏのコロニー支持条件への限界希釈沈殿を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける限界希釈解析を使用して実行することもできる。いずれの場合においても、頻度の低下についての解析、計算、または定量化は、正確な統計処理をもたらすポアソン分布統計の使用を含むことが好ましいであろう。このような定量化法が好ましいが、また、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学検査など、他の、それほど作業集約的でない方法も、所望の値をもたらすのに使用することができ、したがって、本発明の範囲内にあるものとして、明示的に想定されることが認められよう。このような場合、頻度の低下は、腫瘍開始細胞について富化されることが公知である、腫瘍細胞表面マーカーについてのフローサイトメトリー解析または免疫組織化学検出を使用して決定することができる。
そのようなものとして、本発明の別の好ましい実施形態は、ＳＥＺ６関連障害を処置する方法であって、治療有効量のＳＥＺ６モジュレーターを、それを必要とする対象に投与するステップを含み、腫瘍開始細胞の頻度を低下させる方法を含む。好ましくは、ＳＥＺ６関連障害は、新生物性障害を含む。ここでもまた、腫瘍開始細胞頻度の低下は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を使用して決定することが好ましいであろう。
これに関して、本発明は、少なくとも部分的に、ＳＥＺ６免疫原が、様々な新生物の病因に関与する、腫瘍永続化細胞（すなわち、がん幹細胞）と関連するという発見に基づくことが認められよう。より詳細には、本出願は、予測外にも、様々な例示的ＳＥＺ６モジュレーターの投与により、腫瘍開始細胞による腫瘍形成性シグナリングを媒介するか、低減するか、枯渇させるか、阻害するか、または消失させ得る（すなわち、腫瘍開始細胞の頻度を低下させ得る）ことを実証する。腫瘍開始細胞の枯渇、中和、低減、消失、再プログラム化、またはサイレンシングによるのであれ、腫瘍細胞の形状の変形（例えば、分化の誘導、ニッチの破壊）によるのであれ、このシグナリングが低減されれば、腫瘍形成、腫瘍の維持、拡大、および／または転移、ならびに再発を阻害することを介する、ＳＥＺ６関連障害のより有効な処置が可能となる。
上述のがん幹細胞との関連のほか、ＳＥＺ６アイソフォームは、腫瘍の増殖、再発、または転移の潜在的可能性に関与しているという証拠であって、神経内分泌特徴を含む証拠も存在する。本発明の目的では、このような腫瘍は、神経内分泌腫瘍（例えば、小細胞肺がんおよび髄様甲状腺腫瘍）および偽性神経内分泌腫瘍を含むであろう。したがって、本明細書で記載される、新規のＳＥＺ６モジュレーターを使用する、このような腫瘍形成性細胞の増殖への介入は、障害を改善または処置するのに、相加効果または相乗効果をもたらす、１つを超える機構（すなわち、発がん性経路のシグナリングを介する腫瘍開始細胞の低減および破壊）を介することが可能である。さらに他の好ましい実施形態において、細胞表面ＳＥＺ６の細胞への内部移行を利用して、モジュレーターにより媒介される抗がん剤を送達することもできる。これに関して、本発明は、いかなる特定の作用機構にも限定されず、開示されているモジュレーターの広範な使用であって、ＳＥＺ６関連障害を処置する（様々な新生物を含む）使用を包含することが認められよう。
したがって、他の実施形態において、本発明は、開示されているモジュレーターの使用であって、それを必要とする対象における、神経内分泌特徴を含む腫瘍、例えば、小細胞肺がんおよび髄様甲状腺腫瘍を処置する使用も含むであろう。当然ながら、同じモジュレーターは、これらの同じ腫瘍の予防、予後診断、診断、治療診断、阻害、または維持治療にも使用することができる。
開示されているモジュレーターは、小細胞肺がんまたは髄様甲状腺がんを患う患者を処置するのに有効であることもさらに発見されている。さらに、下記でより詳細に論じられ、かつ、実施例で示される通り、本発明の抗ＳＥＺ６抗体および抗体薬物コンジュゲートは、小細胞肺がんの形態であって、標準治療である白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン）に対して抵抗性である形態を患う患者集団など、ある特定の患者集団を処置するのに特に、有効である。したがって、選択された実施形態において、本発明は、白金抵抗性小細胞肺がんを患う患者を処置する方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを投与するステップを含む方法を含む。
本発明の他の様相では、開示されているモジュレーターが、発がん性経路を潜在的に破壊する一方で、腫瘍開始細胞を同時にサイレンシングする能力を利用する。このような多重活性ＳＥＺ６モジュレーター（例えば、ＳＥＺ６アンタゴニスト）は、標準治療の抗がん剤または減量剤と組み合わせて使用すると、特に、有効であると分かる場合がある。したがって、本発明の好ましい実施形態は、開示されているモジュレーターを、初回処置後において、維持治療のための抗転移薬剤として使用することを含む。加えて、２つまたはこれを超えるＳＥＺ６アンタゴニスト（例えば、ＳＥＺ６上の２つの個別のエピトープに特異的に結合する抗体）は、本教示に従う組合せで使用することができる。さらに、下記である程度詳細に論じられる通り、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、コンジュゲート状態で使用することもでき、非コンジュゲート状態でも使用することもでき、任意選択で、様々な化学的抗がん剤または生物学的抗がん剤と組み合わせた感作剤として使用することもできる。
したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、抗がん剤による処置のために、対象における腫瘍を感作する方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを、前記対象に投与するステップを含む方法を含む。他の実施形態は、処置後における転移または腫瘍の再発を低減する方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を含む。本発明の特に好ましい態様では、ＳＥＺ６モジュレーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける限界希釈解析を使用して決定される、腫瘍開始細胞頻度の低下を具体的な結果としてもたらすであろう。
より一般に、本発明の好ましい実施形態は、それを必要とする対象における、ＳＥＺ６関連障害を処置する方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを、対象に投与するステップを含む方法を含む。特に好ましい実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターを、抗がん剤と会合させる（例えば、コンジュゲートさせる）であろう。さらに他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、細胞表面上または細胞表面近傍におけるＳＥＺ６との会合または結合の後、内部移行されるであろう。さらに、対象の腫瘍組織が、正常隣接組織と比較した、ＳＥＺ６レベルの上昇を呈示する場合であれ、ＳＥＺ６レベルの低減または抑制を呈示する場合であれ、シグナリング経路の任意の破壊および付随する利益を含む、本発明の有益な態様を達成することは可能である。特に好ましい実施形態は、腫瘍形成性細胞上の、正常組織または非腫瘍形成性細胞と比較したＳＥＺ６レベルの上昇を呈示する障害の処置を含むであろう。
さらに別の態様では、本発明は、新生物性障害を患う対象を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも１つの内部移行ＳＥＺ６モジュレーターを投与するステップを含む方法を含むであろう。好ましい実施形態は、内部移行抗体モジュレーターの投与を含み、他の選択された実施形態において、内部移行抗体モジュレーターを、細胞傷害剤とコンジュゲートまたは会合させる。
他の実施形態は、ＳＥＺ６関連障害を患う対象を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも１つの枯渇化ＳＥＺ６モジュレーターを投与するステップを含む方法を対象とする。
さらに別の実施形態において、本発明は、維持治療の方法であって、開示されているエフェクターまたはモジュレーターを、腫瘍塊の少なくとも一部を除去するようにデザインされた初期手順（例えば、化学療法手順、照射手順、または手術手順）の後で、ある期間にわたり投与する方法を提供する。このような治療レジメンは、数週間、数カ月間、なおまたは数年間にわたり投与することができ、この場合、ＳＥＺ６モジュレーターは、転移および／または腫瘍の再発を阻害するように予防的に作用し得る。さらに他の実施形態において、開示されているモジュレーターを、転移、腫瘍の維持、または再発を防止するか、または遅延させることが公知の腫瘍減量レジメンと共に投与することもできる。
本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、ＳＥＺ６の公知のアイソフォーム、またはこのタンパク質の単一のアイソフォームと反応するように作製し、選択することもでき、逆に、ＳＥＺ６に加えて、少なくとも１つのさらなるＳＥＺ６ファミリーメンバー（例えば、ＳＥＺ６ＬまたはＳＥＺ６Ｌ２およびこれらのアイソフォーム）と反応または会合するパンＳＥＺ６モジュレーターを含む場合もあることがさらに認められよう。より詳細には、本明細書で開示されている通り、抗体など、好ましいモジュレーターは、それらが、ＳＥＺ６だけにより呈示されるドメイン（またはその中のエピトープ）と反応するように、作製し、選択することもでき、２つまたはこれを超えるＳＥＺ６ファミリーメンバーにわたり、少なくとも何らかの形で保存的なドメインと反応するように、作製し、選択することもできる。
さらに他の好ましい実施形態において、モジュレーターは、ＳＥＺ６の特異的なエピトープ、部分、モチーフ、またはドメインと会合するか、またはこれに結合するであろう。下記である程度詳細に論じられる通り、いずれのＳＥＺ６アイソフォームも、少なくともＮ末端ドメインと、２つの交互に現れるＳｕｓｈｉドメインおよびＣＵＢドメインと、３つのさらなるタンデムＳｕｓｈｉドメインリピートとを含む、同一な細胞外領域を組み込む（図１Ｅを参照されたい）。加えて、ＳＥＺ６タンパク質は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。したがって、ある特定の実施形態において、モジュレーターは、ＳＥＺ６のＮ末端ドメイン（すなわち、成熟タンパク質内のアミノ酸１〜３３５）またはその中のエピトープに結合するかまたはこれと会合するであろう。本発明の他の態様は、ＳＥＺ６の特定のＳｕｓｈｉドメインに位置する特異的エピトープと会合するか、またはこれに結合するモジュレーターを含む。これに関して、特定のモジュレーターは、Ｓｕｓｈｉドメイン１（アミノ酸３３６〜３９５）、Ｓｕｓｈｉドメイン２（アミノ酸５１１〜５７２）、Ｓｕｓｈｉドメイン３（アミノ酸６９０〜７４８）、Ｓｕｓｈｉドメイン４（アミノ酸７５０〜８１３）、またはＳｕｓｈｉドメイン５（アミノ酸８１７〜８７８）に位置するエピトープと会合するか、またはこれに結合することが可能である。本発明の他の態様は、ＳＥＺ６の特定のＣＵＢ様ドメインに位置する特異的エピトープと会合するか、またはこれに結合するモジュレーターを含む。これに関して、特定のモジュレーターは、ＣＵＢドメイン１（アミノ酸３９７〜５０８）またはＣＵＢドメイン２（アミノ酸５７４〜６８５）に位置するエピトープと会合するか、またはこれに結合することが可能である。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、ＳＥＺ６上のある特定のエピトープに結合し得る。
一実施形態において、本発明は、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープであって、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する単離抗体を提供する。
別の実施形態において、本発明は、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合し、エピトープが、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
当然ながら、上述のドメインのそれぞれは、１つを超えるエピトープを含むことが可能であり、１つを超えるビンと会合し得ることが認められよう。モジュレーター「ビン」または抗体「ビン」に関して述べると、ＳＥＺ６抗原は、タンパク質に沿って位置する特異的ビンを規定するように、当技術分野で認知されている技法を使用して、競合抗体の結合を介して、解析またはマッピングし得ることが認められよう。本明細書でより詳細に論じられ、かつ、下記の実施例９および１０で示されるが、２つの抗体（これらのうちの１つを、「基準抗体」、「ビン画定抗体」、または「画定抗体」と称することができる）は、標的抗原への結合について互いと実質的に競合するならば、同じビン内にあると考えることができる。このような場合、対象の抗体エピトープは、いずれの抗体も、抗原に結合することを立体的もしくは静電的に阻害されるか、または抗原への結合から排除されるように、同一な場合もあり、実質的に同一な場合もあり、十分に近接している（それらが数アミノ酸隔たっている場合の、直線的な意味で近接しているか、またはコンフォメーション的に近接している）場合もある。このように規定されたビンは一般に、ある特定のＳＥＺ６ドメインと関連し得る（例えば、基準抗体は、特異的ドメイン内に含有されたエピトープと結合するであろう）が、相関は常に正確なわけではない（例えば、あるドメイン内に１つを超えるビンが存在する場合もあり、ビンがコンフォメーション的に規定され、１つを超えるドメインを含む場合もある）。当業者は、ＳＥＺ６ドメインと経験的に決定されたビンとの関係を容易に決定し得ることが認められよう。
本発明に関して述べると、当技術分野で認知された技法（例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法）を使用する競合結合解析により、少なくとも７つの顕著に異なるビンであって、それらのそれぞれが、多数の抗体モジュレーターを含有することが見出されるビンが規定された。本開示の目的では、７つのビンを、ビンＡ〜ＦおよびビンＵと称した。ビンＡ〜Ｆは、固有のビンであり、これらのビンのそれぞれの中に含有される抗体は、ＳＥＺ６タンパク質への結合について互いと競合する。ビンＵは、ビンＡ〜Ｆ内の抗体とは競合しないが、互いとの結合については競合し得る抗体を含有する。したがって、選択された実施形態において、本発明は、ビンＡ、ビンＢ、ビンＣ、ビンＤ、ビンＥ、ビンＦ、およびビンＵからなる群から選択されるビン内に存在するモジュレーターを含むであろう。他の実施形態において、本発明は、ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９、およびＳＣ１７．２００からなる群から選択される基準抗体により規定されるビン内に存在するモジュレーターを含む。さらに他の実施形態において、本発明は、ビンＡに由来するモジュレーター、ビンＢに由来するモジュレーター、ビンＣに由来するモジュレーター、ビンＤに由来するモジュレーター、ビンＥに由来するモジュレーター、ビンＦに由来するモジュレーター、またはビンＵに由来するモジュレーターを含むであろう。さらに他の好ましい実施形態は、基準抗体モジュレーターおよび基準抗体と競合する任意の抗体を含むであろう。
開示されているモジュレーターの文脈で使用される場合の「競合する」または「競合抗体」という用語は、抗体間の結合の競合であって、基準抗体または免疫機能的断片が、共通の抗原に対する被験抗体の特異的結合を、実質的に（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％を超えて）防止または阻害するアッセイにより決定される競合を意味する。このような競合を決定するのに適する方法は、例えば、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合的ＥＬＩＳＡなど、当技術分野で公知の技法を含む。
選択された実施形態において、本発明は、ＳＥＺ６と会合するパンＳＥＺ６モジュレーターと、少なくとも１つの他のＳＥＺ６ファミリーメンバー（例えば、ＳＥＺ６ＬまたはＳＥＺ６Ｌ２）とを含む。他の選択された実施形態において、本発明は、ＳＥＺ６の１または複数のアイソフォームとは免疫特異的に会合するが、他の任意のＳＥＺ６ファミリーメンバーとは免疫特異的に会合しないＳＥＺ６モジュレーターを含む。さらに他の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量のパンＳＥＺ６モジュレーターを投与するステップを含む方法を含む。さらに他の実施形態は、それを必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量のＳＥＺ６モジュレーターであって、ＳＥＺ６の１または複数のアイソフォームとは免疫特異的に会合するが、他の任意のＳＥＺ６ファミリーメンバーとは免疫特異的に会合しないＳＥＺ６モジュレーターを投与するステップを含む方法を含む。
一実施形態において、本発明は、がんを患う対象を処置する方法であって、治療有効量の、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを投与するステップを含み、抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合し、エピトープが、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む方法を対象とする。好ましい実施形態において、治療用部分は、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピンを含むであろう。場合によって、がんを患う対象は、白金ベースの薬剤で既に処置されている可能性がある。
別の実施形態において、本発明は、髄様甲状腺がんを患う対象を処置する方法であって、治療有効量の、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを投与するステップを含む方法を対象とする。一実施形態において、髄様甲状腺がんを患う対象を処置するのに使用される抗体薬物コンジュゲートは、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体を含むことが可能であり、この場合、エピトープは、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む。好ましい実施形態において、治療用部分は、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピンを含み得る。
さらなる実施形態において、本発明は、白金抵抗性小細胞肺がんを患う対象を処置する方法であって、治療有効量の、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを投与するステップを含み、抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合し、エピトープが、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む方法を対象とする。好ましい実施形態において、白金抵抗性小細胞肺がんを患う患者は、白金ベースの薬剤で既に処置されている。別の好ましい実施形態において、治療用部分は、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピンを含むであろう。
上記で論じられた治療的使用のほか、本発明のモジュレーターを使用して、ＳＥＺ６関連障害であり、特に、増殖性障害を検出、診断、または分類し得ることが認められよう。一部の実施形態において、モジュレーターを、対象に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏで検出またはモニタリングすることができる。当業者であれば、このようなモジュレーターは、下記で開示されているマーカーまたはレポーターで標識するか、またはこれらと会合させることができ、いくつかの標準的な技法（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャンなど）のうちのいずれか１つを使用して検出し得ることを認められよう。
したがって、一部の実施形態において、本発明は、ＳＥＺ６関連障害を、それを必要とする対象において、ｉｎ ｖｉｖｏで診断するか、検出するか、またはモニタリングする方法であって、ＳＥＺ６モジュレーターを投与するステップを含む方法を含むであろう。
他の場合には、モジュレーターは、当技術分野で認知された手順を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける診断状況において使用することができる。そのようなものとして、好ましい実施形態は、対象におけるがん（例えば、髄様甲状腺がんまたは白金抵抗性小細胞肺がん）を診断する方法であって、（ａ）対象に由来する腫瘍試料を用意するステップと；（ｂ）腫瘍試料を、レポーターで標識された抗ＳＥＺ６抗体に曝露するステップであって、前記抗ＳＥＺ６抗体が、腫瘍試料（例えば、髄様甲状腺腫瘍試料、小細胞肺がん腫瘍試料、または白金抵抗性小細胞肺がんの腫瘍試料）と会合するステップと；（ｃ）腫瘍試料と会合したレポーターを検出するステップとを含む方法を含む。一部の実施形態において、腫瘍試料を用意するステップは、腫瘍試料を抗ＳＥＺ６抗体に曝露するステップ、または腫瘍試料と会合したレポーターを検出するステップとは別個に実施することができる。場合によって、腫瘍試料と会合したレポーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、免疫組織化学を使用して検出されるであろう。場合によって、腫瘍試料は、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに結合する抗ＳＥＺ６抗体へと曝露され、ここで、エピトープは、アミノ酸残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２を含む。
このような方法は、本出願と共に容易に見定めることができ、自動式プレートリーダー、専用のレポーター系など、一般に利用可能な市販の技術を使用して容易に実施することができる。選択された実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、試料中に存在する腫瘍永続化細胞と会合するであろう。他の好ましい実施形態において、検出するステップまたは定量化するステップは、腫瘍開始細胞頻度の低下およびその検出を含むであろう。さらに、限界希釈解析は、上記で既に示唆した通りに実行することができ、頻度の低下について、正確な統計処理をもたらすポアソン分布統計を援用することが好ましい。
同様な文脈で、本発明はまた、がんなど、ＳＥＺ６関連障害の診断およびモニタリングに有用な、キットまたはデバイスおよび関連する方法も提供する。この目的で、本発明は、ＳＥＺ６関連障害を診断または処置するのに有用な製品であって、ＳＥＺ６モジュレーターを含むレセプタクルと、前記ＳＥＺ６モジュレーターを使用してＳＥＺ６関連障害を処置または診断するための指示書材料とを含む製品を提供することが好ましい。選択された実施形態において、デバイスおよび関連する方法は、少なくとも１つの循環腫瘍細胞を接触させるステップを含むであろう。
本発明の他の好ましい実施形態において、また、開示されているモジュレーターの特性を、腫瘍開始細胞の集団または亜集団を、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）またはレーザー媒介式区分を含むフローサイトメトリー解析などの方法により同定するか、特徴付けるか、単離するか、区分するか、または富化するのに有用な手段としても利用する。
そのようなものとして、本発明の別の好ましい実施形態は、腫瘍開始細胞の集団を同定するか、単離するか、区分するか、または富化する方法であって、前記腫瘍開始細胞を、ＳＥＺ６モジュレーターと接触させるステップを含む方法を対象とする。
前出は、概要であり、このため、必然的に、単純化、一般化、および詳細の省略を含有するが、結果として、当業者であれば、概要とは、例示的なものであるに過ぎず、いかなる形でも限定的であろうと意図するものではないことを認められよう。本明細書で記載される方法、組成物、および／もしくはデバイス、ならびに／または他の対象物の他の態様、特徴、および利点は、本明細書で示される教示において明らかとなろう。概要は、下記の「発明を実施するための形態」でさらに記載される概念の選択を、単純化された形態で導入するように提示されている。この概要は、特許請求される対象物の鍵となる特徴または本質的な特徴を同定することを意図するものでも、特許請求される対象物の範囲を決定するときの一助として使用されることを意図するものでもない。
図１Ａ〜１Ｅは、ＳＥＺ６についての様々な表示であって、本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関する核酸配列またはアミノ酸配列を含む表示である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１および２）は、ＳＥＺ６バリアント１および２のそれぞれをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する、全長ｍＲＮＡ配列（下線を付された）を描示する図である。図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３および４）は、図１Ａおよび１Ｂのそれぞれにおいて描示されたＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提示する図［図中、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通ドメインを指し示すアミノ酸残基に下線を付し、シグナルペプチドを指し示すアミノ酸残基（残基１〜１９）を太字として下線を付す］であり、図１Ｅは、各アイソフォームの細胞質末端における配列の差違を例示するように、２つのタンパク質アイソフォームのアラインメント（配列番号３および４）を描示する図［図中、下線を付された残基は、２つの配列の間の差違を指し示す］であり、図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域についての概略表示であって、様々なドメインの位置を例示する概略表示を提示する図である。 図１Ａ〜１Ｅは、ＳＥＺ６についての様々な表示であって、本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関する核酸配列またはアミノ酸配列を含む表示である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１および２）は、ＳＥＺ６バリアント１および２のそれぞれをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する、全長ｍＲＮＡ配列（下線を付された）を描示する図である。図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３および４）は、図１Ａおよび１Ｂのそれぞれにおいて描示されたＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提示する図［図中、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通ドメインを指し示すアミノ酸残基に下線を付し、シグナルペプチドを指し示すアミノ酸残基（残基１〜１９）を太字として下線を付す］であり、図１Ｅは、各アイソフォームの細胞質末端における配列の差違を例示するように、２つのタンパク質アイソフォームのアラインメント（配列番号３および４）を描示する図［図中、下線を付された残基は、２つの配列の間の差違を指し示す］であり、図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域についての概略表示であって、様々なドメインの位置を例示する概略表示を提示する図である。 図１Ａ〜１Ｅは、ＳＥＺ６についての様々な表示であって、本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関する核酸配列またはアミノ酸配列を含む表示である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１および２）は、ＳＥＺ６バリアント１および２のそれぞれをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する、全長ｍＲＮＡ配列（下線を付された）を描示する図である。図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３および４）は、図１Ａおよび１Ｂのそれぞれにおいて描示されたＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提示する図［図中、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通ドメインを指し示すアミノ酸残基に下線を付し、シグナルペプチドを指し示すアミノ酸残基（残基１〜１９）を太字として下線を付す］であり、図１Ｅは、各アイソフォームの細胞質末端における配列の差違を例示するように、２つのタンパク質アイソフォームのアラインメント（配列番号３および４）を描示する図［図中、下線を付された残基は、２つの配列の間の差違を指し示す］であり、図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域についての概略表示であって、様々なドメインの位置を例示する概略表示を提示する図である。 図１Ａ〜１Ｅは、ＳＥＺ６についての様々な表示であって、本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関する核酸配列またはアミノ酸配列を含む表示である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１および２）は、ＳＥＺ６バリアント１および２のそれぞれをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する、全長ｍＲＮＡ配列（下線を付された）を描示する図である。図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３および４）は、図１Ａおよび１Ｂのそれぞれにおいて描示されたＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提示する図［図中、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通ドメインを指し示すアミノ酸残基に下線を付し、シグナルペプチドを指し示すアミノ酸残基（残基１〜１９）を太字として下線を付す］であり、図１Ｅは、各アイソフォームの細胞質末端における配列の差違を例示するように、２つのタンパク質アイソフォームのアラインメント（配列番号３および４）を描示する図［図中、下線を付された残基は、２つの配列の間の差違を指し示す］であり、図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域についての概略表示であって、様々なドメインの位置を例示する概略表示を提示する図である。 図１Ａ〜１Ｅは、ＳＥＺ６についての様々な表示であって、本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関する核酸配列またはアミノ酸配列を含む表示である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１および２）は、ＳＥＺ６バリアント１および２のそれぞれをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する、全長ｍＲＮＡ配列（下線を付された）を描示する図である。図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３および４）は、図１Ａおよび１Ｂのそれぞれにおいて描示されたＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提示する図［図中、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通ドメインを指し示すアミノ酸残基に下線を付し、シグナルペプチドを指し示すアミノ酸残基（残基１〜１９）を太字として下線を付す］であり、図１Ｅは、各アイソフォームの細胞質末端における配列の差違を例示するように、２つのタンパク質アイソフォームのアラインメント（配列番号３および４）を描示する図［図中、下線を付された残基は、２つの配列の間の差違を指し示す］であり、図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域についての概略表示であって、様々なドメインの位置を例示する概略表示を提示する図である。 図１Ａ〜１Ｅは、ＳＥＺ６についての様々な表示であって、本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターに関する核酸配列またはアミノ酸配列を含む表示である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１および２）は、ＳＥＺ６バリアント１および２のそれぞれをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する、全長ｍＲＮＡ配列（下線を付された）を描示する図である。図１Ｃおよび１Ｄ（配列番号３および４）は、図１Ａおよび１Ｂのそれぞれにおいて描示されたＯＲＦの対応するアミノ酸配列を提示する図［図中、各タンパク質アイソフォームについて予測される膜貫通ドメインを指し示すアミノ酸残基に下線を付し、シグナルペプチドを指し示すアミノ酸残基（残基１〜１９）を太字として下線を付す］であり、図１Ｅは、各アイソフォームの細胞質末端における配列の差違を例示するように、２つのタンパク質アイソフォームのアラインメント（配列番号３および４）を描示する図［図中、下線を付された残基は、２つの配列の間の差違を指し示す］であり、図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域についての概略表示であって、様々なドメインの位置を例示する概略表示を提示する図である。
図２Ａ〜２Ｃは、ＳＥＺ６の最も近縁のヒトアイソフォームと、アカゲザルＳＥＺ６タンパク質、カニクイザルＳＥＺ６タンパク質、マウスＳＥＺ６タンパク質、またはラットＳＥＺ６タンパク質との、タンパク質レベルにおける同一性パーセントについての表解表示（図２Ａ）；ＳＥＺ６ファミリーの遺伝子の報告されたアイソフォームのそれぞれについての、様々なｃＤＮＡまたはタンパク質配列受託番号の表解式列挙（図２Ｂ）；ならびにヒトＳＥＺ６タンパク質、ＳＥＺ６Ｌタンパク質、およびＳＥＺ６Ｌ２タンパク質のうちで最も長いアイソフォームの間の、タンパク質レベルにおける同一性パーセント（図２Ｃ）を提示する図である。 図２Ａ〜２Ｃは、ＳＥＺ６の最も近縁のヒトアイソフォームと、アカゲザルＳＥＺ６タンパク質、カニクイザルＳＥＺ６タンパク質、マウスＳＥＺ６タンパク質、またはラットＳＥＺ６タンパク質との、タンパク質レベルにおける同一性パーセントについての表解表示（図２Ａ）；ＳＥＺ６ファミリーの遺伝子の報告されたアイソフォームのそれぞれについての、様々なｃＤＮＡまたはタンパク質配列受託番号の表解式列挙（図２Ｂ）；ならびにヒトＳＥＺ６タンパク質、ＳＥＺ６Ｌタンパク質、およびＳＥＺ６Ｌ２タンパク質のうちで最も長いアイソフォームの間の、タンパク質レベルにおける同一性パーセント（図２Ｃ）を提示する図である。 図２Ａ〜２Ｃは、ＳＥＺ６の最も近縁のヒトアイソフォームと、アカゲザルＳＥＺ６タンパク質、カニクイザルＳＥＺ６タンパク質、マウスＳＥＺ６タンパク質、またはラットＳＥＺ６タンパク質との、タンパク質レベルにおける同一性パーセントについての表解表示（図２Ａ）；ＳＥＺ６ファミリーの遺伝子の報告されたアイソフォームのそれぞれについての、様々なｃＤＮＡまたはタンパク質配列受託番号の表解式列挙（図２Ｂ）；ならびにヒトＳＥＺ６タンパク質、ＳＥＺ６Ｌタンパク質、およびＳＥＺ６Ｌ２タンパク質のうちで最も長いアイソフォームの間の、タンパク質レベルにおける同一性パーセント（図２Ｃ）を提示する図である。
図３Ａ〜３Ｃは、免疫原の産生に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図である。完全成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質（図３Ｂ；配列番号６）をコードするヒトＳＥＺ６特異的ｃＤＮＡクローン（図３Ａ；配列番号５）は、ＳＥＺ６タンパク質についてのデータベースによる基準配列である、ＮＰ＿８４９１９１（配列番号３）との公知の差違（図３Ｃ）を伴う、市販品のｃＤＮＡクローン（ＢＣ１４６２９２；配列番号７）から構築した。 図３Ａ〜３Ｃは、免疫原の産生に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図である。完全成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質（図３Ｂ；配列番号６）をコードするヒトＳＥＺ６特異的ｃＤＮＡクローン（図３Ａ；配列番号５）は、ＳＥＺ６タンパク質についてのデータベースによる基準配列である、ＮＰ＿８４９１９１（配列番号３）との公知の差違（図３Ｃ）を伴う、市販品のｃＤＮＡクローン（ＢＣ１４６２９２；配列番号７）から構築した。 図３Ａ〜３Ｃは、免疫原の産生に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図である。完全成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質（図３Ｂ；配列番号６）をコードするヒトＳＥＺ６特異的ｃＤＮＡクローン（図３Ａ；配列番号５）は、ＳＥＺ６タンパク質についてのデータベースによる基準配列である、ＮＰ＿８４９１９１（配列番号３）との公知の差違（図３Ｃ）を伴う、市販品のｃＤＮＡクローン（ＢＣ１４６２９２；配列番号７）から構築した。
図４Ａおよび４Ｂは、ＣＨＯ−Ｓ細胞内でＦｃ−ＳＥＺ６構築物を発現させ（図４Ａ；配列番号８）、タンパク質免疫原をもたらす（図４Ｂ；配列番号９）のに使用されるｃＤＮＡであって、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインに融合させたヒトＳＥＺ６のＥＣＤを含むｃＤＮＡを提示する図［図中、下線を付された配列は、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインに対応し、二重下線を付された配列は、ＩｇＫシグナルペプチドに対応し、太字フォントのアミノ酸は、ｈＳＥＺ６断片をクローニングするのに使用される制限部位が寄与する残基に対応する］である。 図４Ａおよび４Ｂは、ＣＨＯ−Ｓ細胞内でＦｃ−ＳＥＺ６構築物を発現させ（図４Ａ；配列番号８）、タンパク質免疫原をもたらす（図４Ｂ；配列番号９）のに使用されるｃＤＮＡであって、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインに融合させたヒトＳＥＺ６のＥＣＤを含むｃＤＮＡを提示する図［図中、下線を付された配列は、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインに対応し、二重下線を付された配列は、ＩｇＫシグナルペプチドに対応し、太字フォントのアミノ酸は、ｈＳＥＺ６断片をクローニングするのに使用される制限部位が寄与する残基に対応する］である。
図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。 図５Ａ〜５Ｊは、免疫原の作製に関する核酸配列もしくはアミノ酸配列、または本明細書で記載されるＳＥＺ６モジュレーターを作製するかもしくは特徴付ける使用される細胞系についての様々な表示を提示する図［図中、下線を付された配列は、例示される特異的ＳＥＺ６またはＳＥＺ６ファミリーメンバーのタンパク質のＥＣＤを描示する］であり、図は、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ａ、配列番号１０）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｃ、配列番号１２）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｅ、配列番号１４）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｇ、配列番号１６）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｉ、配列番号１８）をコードする構築物のためのｃＤＮＡ配列、またはこれらのｃＤＮＡ構築物によりコードされる、対応するタンパク質、すなわち、成熟マウスＳＥＺ６（図５Ｂ、配列番号１１）、成熟ラットＳＥＺ６（図５Ｄ、配列番号１３）、成熟カニクイザルＳＥＺ６（図５Ｆ、配列番号１５）、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｈ、配列番号１７）、もしくはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質の成熟ＥＣＤ（図５Ｊ、配列番号１９）を含む。
図６Ａおよび６Ｂは、腫瘍細胞亜集団または正常組織に由来するｍＲＮＡについての全トランスクリプトーム（ＳＯＬｉＤ）シークエンシングを使用して測定される、様々な遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルについての描示である。図６Ａは、神経内分泌特徴を有する腫瘍と関連する遺伝子についての表解表示であり、図６Ｂは、正常組織内および肺がんに由来する複数の非伝統的異種移植（ＮＴＸ）腫瘍内のＳＥＺ６ ｍＲＮＡ発現についてのグラフ表示である。 図６Ａおよび６Ｂは、腫瘍細胞亜集団または正常組織に由来するｍＲＮＡについての全トランスクリプトーム（ＳＯＬｉＤ）シークエンシングを使用して測定される、様々な遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルについての描示である。図６Ａは、神経内分泌特徴を有する腫瘍と関連する遺伝子についての表解表示であり、図６Ｂは、正常組織内および肺がんに由来する複数の非伝統的異種移植（ＮＴＸ）腫瘍内のＳＥＺ６ ｍＲＮＡ発現についてのグラフ表示である。
図７Ａ〜７Ｆは、マイクロアレイを使用して解析されたｍＲＮＡ発現レベルを描示する図である。図７Ａは、４６の腫瘍細胞系および２つの正常組織のマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングについてのグラフ表示であり、図７Ｂおよび７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）またはＮｏｔｃｈシグナリング経路（図７Ｃ）と関連する、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞および比較的小さな数は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞および比較的大きな数は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される、様々な腫瘍内および対照組織内のＨＥＳ６ ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ表示であり、図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、または神経運命への分化を示す、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系内のＳＥＺ６の相対発現に対応する、標準化された強度値についてのグラフ表示である。 図７Ａ〜７Ｆは、マイクロアレイを使用して解析されたｍＲＮＡ発現レベルを描示する図である。図７Ａは、４６の腫瘍細胞系および２つの正常組織のマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングについてのグラフ表示であり、図７Ｂおよび７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）またはＮｏｔｃｈシグナリング経路（図７Ｃ）と関連する、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞および比較的小さな数は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞および比較的大きな数は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される、様々な腫瘍内および対照組織内のＨＥＳ６ ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ表示であり、図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、または神経運命への分化を示す、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系内のＳＥＺ６の相対発現に対応する、標準化された強度値についてのグラフ表示である。 図７Ａ〜７Ｆは、マイクロアレイを使用して解析されたｍＲＮＡ発現レベルを描示する図である。図７Ａは、４６の腫瘍細胞系および２つの正常組織のマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングについてのグラフ表示であり、図７Ｂおよび７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）またはＮｏｔｃｈシグナリング経路（図７Ｃ）と関連する、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞および比較的小さな数は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞および比較的大きな数は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される、様々な腫瘍内および対照組織内のＨＥＳ６ ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ表示であり、図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、または神経運命への分化を示す、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系内のＳＥＺ６の相対発現に対応する、標準化された強度値についてのグラフ表示である。 図７Ａ〜７Ｆは、マイクロアレイを使用して解析されたｍＲＮＡ発現レベルを描示する図である。図７Ａは、４６の腫瘍細胞系および２つの正常組織のマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングについてのグラフ表示であり、図７Ｂおよび７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）またはＮｏｔｃｈシグナリング経路（図７Ｃ）と関連する、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞および比較的小さな数は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞および比較的大きな数は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される、様々な腫瘍内および対照組織内のＨＥＳ６ ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ表示であり、図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、または神経運命への分化を示す、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系内のＳＥＺ６の相対発現に対応する、標準化された強度値についてのグラフ表示である。 図７Ａ〜７Ｆは、マイクロアレイを使用して解析されたｍＲＮＡ発現レベルを描示する図である。図７Ａは、４６の腫瘍細胞系および２つの正常組織のマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングについてのグラフ表示であり、図７Ｂおよび７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）またはＮｏｔｃｈシグナリング経路（図７Ｃ）と関連する、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞および比較的小さな数は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞および比較的大きな数は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される、様々な腫瘍内および対照組織内のＨＥＳ６ ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ表示であり、図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、または神経運命への分化を示す、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系内のＳＥＺ６の相対発現に対応する、標準化された強度値についてのグラフ表示である。 図７Ａ〜７Ｆは、マイクロアレイを使用して解析されたｍＲＮＡ発現レベルを描示する図である。図７Ａは、４６の腫瘍細胞系および２つの正常組織のマイクロアレイプロファイルの教師なしクラスタリングについてのグラフ表示であり、図７Ｂおよび７Ｃは、神経内分泌表現型（図７Ｂ）またはＮｏｔｃｈシグナリング経路（図７Ｃ）と関連する、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞および比較的小さな数は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞および比較的大きな数は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定される、様々な腫瘍内および対照組織内のＨＥＳ６ ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフ表示であり、図７Ｅは、神経発生、神経コミットメント、または神経運命への分化を示す、選択された遺伝子の相対発現レベルに対応する、標準化された強度値についての表解表示［図中、影を付されない細胞は、発現がほとんど見られないかまたは見られないことを指し示し、暗色の細胞は、高発現レベルを指し示す］であり、図７Ｆは、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系内のＳＥＺ６の相対発現に対応する、標準化された強度値についてのグラフ表示である。
図８Ａおよび８Ｂは、正常組織またはバルクの神経内分泌ＮＴＸ腫瘍（図８Ａ）および他の様々なＮＴＸ腫瘍（図８Ｂ）から単離された、様々なＲＮＡ試料中のＲＴ−ＰＣＲにより測定される、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡ転写物の相対発現レベルを示すグラフ表示である。 図８Ａおよび８Ｂは、正常組織またはバルクの神経内分泌ＮＴＸ腫瘍（図８Ａ）および他の様々なＮＴＸ腫瘍（図８Ｂ）から単離された、様々なＲＮＡ試料中のＲＴ−ＰＣＲにより測定される、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡ転写物の相対発現レベルを示すグラフ表示である。
図９Ａおよび９Ｂは、１８の異なる固形腫瘍型のうちの１つを伴う患者に由来する、全腫瘍検体内（グレードット）またはマッチさせた正常隣接組織（ＮＡＴ；白ドット）についてのＲＴ−ＰＣＲで測定される、ヒトＳＥＺ６の絶対ｍＲＮＡ発現レベル（図９Ａ）または標準化ｍＲＮＡ発現レベル（図９Ｂ）を示すグラフ表示である。
図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。 図１０Ａ〜１０Ｂは、本明細書の実施例で記載される通りに、単離、クローニング、および操作された、いくつかの例示的なマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）の連続アミノ酸配列を提示する図である。対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。図１０Ｃは、ヒト化抗体であるＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．２００ ｖＬ１の軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列を示す図である。
図１１は、本発明の例示的なモジュレーターの様々な特徴を示す図である。図１１Ａは、表解フォーマットで表される、例示的なＳＥＺ６モジュレーターの生化学特性および免疫特性を示す図であり、図１１Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅アッセイにおける、抗体が結合するドメインと、抗体の有効性との相関を提示する図である。 図１１は、本発明の例示的なモジュレーターの様々な特徴を示す図である。図１１Ａは、表解フォーマットで表される、例示的なＳＥＺ６モジュレーターの生化学特性および免疫特性を示す図であり、図１１Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅アッセイにおける、抗体が結合するドメインと、抗体の有効性との相関を提示する図である。
図１２Ａおよび１２Ｂは、電気化学発光アッセイを使用して測定される、ＳＥＺ６タンパク質の発現の検出を示す図である。図１２Ａは、抗ＳＥＺ６抗体であるＳＣ１７．３３を使用して、ヒトＳＥＺ６タンパク質を過剰発現させるように操作されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ｈ２９３Ｔ−ＨｕＳＥＺ６）内の、ＳＥＺ６発現を示す図であり、図１２Ｂは、様々なＮＴＸ腫瘍溶解物中および正常組織溶解物中のヒトＳＥＺ６の相対タンパク質発現を示す図である。 図１２Ａおよび１２Ｂは、電気化学発光アッセイを使用して測定される、ＳＥＺ６タンパク質の発現の検出を示す図である。図１２Ａは、抗ＳＥＺ６抗体であるＳＣ１７．３３を使用して、ヒトＳＥＺ６タンパク質を過剰発現させるように操作されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ｈ２９３Ｔ−ＨｕＳＥＺ６）内の、ＳＥＺ６発現を示す図であり、図１２Ｂは、様々なＮＴＸ腫瘍溶解物中および正常組織溶解物中のヒトＳＥＺ６の相対タンパク質発現を示す図である。
図１３Ａが、様々な抗ＳＥＺ６抗体を使用して、ＮＴＸ腫瘍細胞上のＳＥＺ６タンパク質発現についての、フローサイトメトリーによる検出を示す図であるのに対し、図１３Ｂは、様々な抗ＳＥＺ６抗体を使用して、ＣＳＣ内のＳＥＺ６タンパク質発現の増強を、ＮＴＧ亜集団と比較して示す図である。 図１３Ａが、様々な抗ＳＥＺ６抗体を使用して、ＮＴＸ腫瘍細胞上のＳＥＺ６タンパク質発現についての、フローサイトメトリーによる検出を示す図であるのに対し、図１３Ｂは、様々な抗ＳＥＺ６抗体を使用して、ＣＳＣ内のＳＥＺ６タンパク質発現の増強を、ＮＴＧ亜集団と比較して示す図である。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＳＥＺ６を発現させるＣＳＣが、ＳＥＺ６を発現させないＣＳＣと比較して、腫瘍形成性の増強を呈示することを示す図である。図１４Ａは、ＣＤ３２４（ＣＳＣのマーカー）およびＳＥＺ６の発現に基づいて、肺腫瘍内の細胞（ＬＵ３７）についての、ＦＡＣＳによる細胞分取を示すコンタープロットであり、図１４Ｂは、ＣＤ３２４＋ＳＥＺ６＋（黒丸）またはＣＤ３２４＋ＳＥＺ６−（白丸）である腫瘍細胞であって、免疫不全マウスへの植込みの後における腫瘍細胞の増殖についてのグラフ表示である。ＣＤ３２４およびＳＥＺ６の両方を発現させる腫瘍細胞は、腫瘍形成性の増強を呈示する。
図１５Ａおよび１５Ｂは、それぞれ、開示されているモジュレーターが、細胞傷害性ペイロードを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた、ＳＥＺ６を発現させるように操作された細胞（図１５Ａ）およびＮＴＸ肺腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ３７、およびＬＵ１００）（図１５Ｂ）へと方向付ける標的化部分として有効に使用され得ることを例示する表解表示およびグラフ表示を提示する図［図中、標準化された相対発光単位（ＲＬＵ）の減少は、サポリン毒素の内部移行による細胞の殺滅を示す］である。 図１５Ａおよび１５Ｂは、それぞれ、開示されているモジュレーターが、細胞傷害性ペイロードを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた、ＳＥＺ６を発現させるように操作された細胞（図１５Ａ）およびＮＴＸ肺腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ３７、およびＬＵ１００）（図１５Ｂ）へと方向付ける標的化部分として有効に使用され得ることを例示する表解表示およびグラフ表示を提示する図［図中、標準化された相対発光単位（ＲＬＵ）の減少は、サポリン毒素の内部移行による細胞の殺滅を示す］である。 図１５Ａおよび１５Ｂは、それぞれ、開示されているモジュレーターが、細胞傷害性ペイロードを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた、ＳＥＺ６を発現させるように操作された細胞（図１５Ａ）およびＮＴＸ肺腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ３７、およびＬＵ１００）（図１５Ｂ）へと方向付ける標的化部分として有効に使用され得ることを例示する表解表示およびグラフ表示を提示する図［図中、標準化された相対発光単位（ＲＬＵ）の減少は、サポリン毒素の内部移行による細胞の殺滅を示す］である。
図１６は、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を使用して決定される、様々なＳＣＬＣ内および髄様甲状腺腫瘍内のＳＥＺ６発現についての定量化を示す図であり、図１６Ａは、ＮＴＸ ＳＣＬＣ腫瘍内のＳＥＺ６発現を示す図であり、図１６Ｂは、ＳＣＬＣ腫瘍マイクロアレイ内のＳＥＺ６発現を示す図であり、図１６Ｃは、原発性髄様甲状腺腫瘍内のＳＥＺ６発現を示す図である。 図１６は、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を使用して決定される、様々なＳＣＬＣ内および髄様甲状腺腫瘍内のＳＥＺ６発現についての定量化を示す図であり、図１６Ａは、ＮＴＸ ＳＣＬＣ腫瘍内のＳＥＺ６発現を示す図であり、図１６Ｂは、ＳＣＬＣ腫瘍マイクロアレイ内のＳＥＺ６発現を示す図であり、図１６Ｃは、原発性髄様甲状腺腫瘍内のＳＥＺ６発現を示す図である。 図１６は、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を使用して決定される、様々なＳＣＬＣ内および髄様甲状腺腫瘍内のＳＥＺ６発現についての定量化を示す図であり、図１６Ａは、ＮＴＸ ＳＣＬＣ腫瘍内のＳＥＺ６発現を示す図であり、図１６Ｂは、ＳＣＬＣ腫瘍マイクロアレイ内のＳＥＺ６発現を示す図であり、図１６Ｃは、原発性髄様甲状腺腫瘍内のＳＥＺ６発現を示す図である。
図１７Ａ〜１７Ｂは、コンジュゲート抗ＳＥＺ６マウス抗体が、ＮＴＸ腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を遅延させる能力について描示する図である。図１７Ａが、ＳＣＬＣ（ＬＵ６４）ＮＴＸ腫瘍細胞系上およびＯＶ（ＯＶ２６）ＮＴＸ腫瘍細胞系上で抗ＳＥＺ６ ＡＤＣを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅アッセイの結果を示す図であるのに対し、図１７Ｂは、抗ＳＥＺ６ ＡＤＣの、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳＣＬＣ（ＬＵ８６）腫瘍およびＬＣＮＥＣ（ＬＵ５０）腫瘍の増殖に対する効果を示す図である。 図１７Ａ〜１７Ｂは、コンジュゲート抗ＳＥＺ６マウス抗体が、ＮＴＸ腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を遅延させる能力について描示する図である。図１７Ａが、ＳＣＬＣ（ＬＵ６４）ＮＴＸ腫瘍細胞系上およびＯＶ（ＯＶ２６）ＮＴＸ腫瘍細胞系上で抗ＳＥＺ６ ＡＤＣを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅アッセイの結果を示す図であるのに対し、図１７Ｂは、抗ＳＥＺ６ ＡＤＣの、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳＣＬＣ（ＬＵ８６）腫瘍およびＬＣＮＥＣ（ＬＵ５０）腫瘍の増殖に対する効果を示す図である。
図１８Ａ〜１８Ｄは、コンジュゲートヒト化抗ＳＥＺ６抗体が、甲状腺細胞系のｉｎ ｖｉｔｒｏ（図１８Ａ）およびｉｎ ｖｉｖｏ（図１８Ｂ）における増殖を遅延させ、４つのＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ６４、ＬＵ１１１およびＬＵ１１７）の増殖をｉｎ ｖｉｖｏにおいて遅延させ、免疫不全マウスにおける永続的な寛解を達成する（図１８Ｃおよび１８Ｄ）能力について描示する図である。 図１８Ａ〜１８Ｄは、コンジュゲートヒト化抗ＳＥＺ６抗体が、甲状腺細胞系のｉｎ ｖｉｔｒｏ（図１８Ａ）およびｉｎ ｖｉｖｏ（図１８Ｂ）における増殖を遅延させ、４つのＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ６４、ＬＵ１１１およびＬＵ１１７）の増殖をｉｎ ｖｉｖｏにおいて遅延させ、免疫不全マウスにおける永続的な寛解を達成する（図１８Ｃおよび１８Ｄ）能力について描示する図である。 図１８Ａ〜１８Ｄは、コンジュゲートヒト化抗ＳＥＺ６抗体が、甲状腺細胞系のｉｎ ｖｉｔｒｏ（図１８Ａ）およびｉｎ ｖｉｖｏ（図１８Ｂ）における増殖を遅延させ、４つのＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ６４、ＬＵ１１１およびＬＵ１１７）の増殖をｉｎ ｖｉｖｏにおいて遅延させ、免疫不全マウスにおける永続的な寛解を達成する（図１８Ｃおよび１８Ｄ）能力について描示する図である。 図１８Ａ〜１８Ｄは、コンジュゲートヒト化抗ＳＥＺ６抗体が、甲状腺細胞系のｉｎ ｖｉｔｒｏ（図１８Ａ）およびｉｎ ｖｉｖｏ（図１８Ｂ）における増殖を遅延させ、４つのＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ８０、ＬＵ６４、ＬＵ１１１およびＬＵ１１７）の増殖をｉｎ ｖｉｖｏにおいて遅延させ、免疫不全マウスにおける永続的な寛解を達成する（図１８Ｃおよび１８Ｄ）能力について描示する図である。
図１９は、親小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）患者由来異種移植（ＰＤＸ）細胞系であるＬＵ１２４ｐ２内のオキサリプラチン（oxalaplatin）についての用量反応曲線を、オキサリプラチン抵抗性細胞系であるＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ２およびＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３と比較して示す図である。
図２０は、親ＳＣＬＣ ＰＤＸ細胞系であるＬＵ１２４ｐ１内およびＬＵ１２４ｐ３内、ならびにオキサリプラチン抵抗性細胞系であるＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３内の、ＳＥＺ６のｍＲＮＡ発現を示す図である。
図２１は、親ＳＣＬＣ ＰＤＸ細胞系であるＬＵ１２４ｐ３内、およびオキサリプラチン抵抗性細胞系であるＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３内の、ＳＥＺ６のタンパク質発現を示す図である。
発明の詳細な説明
Ｉ．序説
本発明は、多くの異なる形態で実施することができるが、本明細書では、本発明の原理について例示する、その具体的な例示的実施形態が開示されている。本発明は、例示される具体的な実施形態に限定されるわけではないことが強調されるべきである。さらに、本明細書において使用される場合、任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される対象を限定するとはみなさないものとする。最後に、本開示の目的では、全ての配列識別受託番号は、そうでないことが注意されない限り、ＮＣＢＩ基準配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース内および／またはＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベース内で見出すことができる。
既に示唆した通り、驚くべきことに、ＳＥＺ６の発現は、特に、神経内分泌特徴を伴う腫瘍の場合、新生物性増殖および増殖性障害と関連し、ＳＥＺ６およびそのバリアントまたはアイソフォームにより、関連疾患の処置において利用することができる、有用な腫瘍マーカーがもたらされることが見出された。さらに、本出願において示される通り、細胞表面ＳＥＺ６タンパク質などのＳＥＺ６マーカーまたはＳＥＺ６決定基は、がん幹細胞（腫瘍永続化細胞としてもまた公知の）と関連し、これらを消失させるかまたはサイレンシングするのに有効に利用し得ることも予測外に見出された。がん幹細胞を選択的に低下させるかまたは消失させる能力（例えば、コンジュゲートされたＳＥＺ６モジュレーターの使用により）は、このような細胞は一般に、多くの従来型処置に対して抵抗性であることが公知である点で、特に、驚くべきである。すなわち、従来の標的化された処置方法、ならびにより近年の標的化された処置方法の有効性は、これらの多様な処置方法を前にしてもなお、がんの増殖を永続化させることが可能な、抵抗性がん幹細胞の存在および／または出現により制限されることが多い。さらに、がん幹細胞と関連する決定基は、発現が低度であるかまたは一貫しないこと、腫瘍形成性細胞との関連を維持できないこと、または細胞表面に存在できないことに起因して、治療標的として良好ではないことが多い。先行技術の教示とは明らかに対照的に、本明細書に開示されている化合物および方法は、この固有の抵抗性を効果的に克服して、このようながん幹細胞を特異的に消失させるか、枯渇させるか、サイレンシングするか、またはそれらの分化を促進し、これにより、根底的な腫瘍の増殖を維持または再誘導するそれらの能力を失効化する。
より詳細には、本明細書に開示されているＳＥＺ６モジュレーターなどのＳＥＺ６モジュレーターは、それを必要とする対象における増殖性障害（例えば、新生物性障害）の予後診断、診断、治療診断、処置、または防止において使用すると有利であり得ることが発見された。したがって、本発明の好ましい実施形態については、特に、特定のドメイン、領域、もしくはエピトープに関して、またはがん幹細胞もしくは神経内分泌特徴を含む腫瘍、およびそれらの、開示されているモジュレーターとの相互作用の文脈で、下記で広範にわたり論じるが、当業者であれば、本発明の範囲は、このような例示的な実施形態により限定されないことを認められよう。むしろ、本発明の最も広範な実施形態および添付の特許請求の範囲は、任意の特定の作用機構、または特異的に標的化される腫瘍、細胞構成要素、もしくは分子構成要素にかかわらず、ＳＥＺ６モジュレーター（コンジュゲートされたモジュレーターを含む）、ならびに新生物性障害または増殖性障害を含む、様々なＳＥＺ６関連障害またはＳＥＺ６介在性障害の予後診断、診断、治療診断、処置、または防止におけるそれらの使用を広くかつ明示的に対象とする。
この目的のため、かつ、本出願で実証される通り、開示されているＳＥＺ６モジュレーターは、増殖性細胞または腫瘍形成性細胞を標的化し、これらを消失させるかまたは他の形で失効化させ、ＳＥＺ６関連障害（例えば、新生物）を処置するのに効果的に使用することができることが予測外に見出された。本明細書において使用される場合、「ＳＥＺ６関連障害」とは、任意の障害または疾患（増殖性障害を含む）であって、疾患または障害の経過の間または病因における、ＳＥＺ６遺伝子の構成要素または発現の表現型異常または遺伝子型異常により、マーキング、診断、検出、または同定される障害または疾患を意味するように理解するものとする。これに関して、ＳＥＺ６表現型の異常または決定基は、例えば、ＳＥＺ６タンパク質発現のレベルの上昇または抑制、ある特定の規定可能な細胞集団上のＳＥＺ６タンパク質発現の異常、または細胞周期の不適切な相もしくは段階におけるＳＥＺ６タンパク質発現の異常を含み得る。当然ながら、また、ＳＥＺ６の遺伝子型決定基の類似する発現パターン（例えば、ｍＲＮＡ転写レベル）も、ＳＥＺ６関連障害を分類または検出するのに使用し得ることが認められよう。
本明細書において使用される場合、用語「決定基」または「ＳＥＺ６決定基」は、特定の細胞、細胞集団、または組織と同定可能な形で関連するか、あるいは特定の細胞内もしくは細胞上、特定の細胞集団内もしくは細胞集団上、または特定の組織内もしくは組織上で特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカー、または因子であって、ＳＥＺ６関連疾患またはＳＥＺ６関連障害の影響を受ける組織内もしくは組織上、細胞内もしくは細胞上、または細胞集団内もしくは細胞集団上で同定される形質、特性、マーカー、または因子を含む、形質、特性、マーカー、または因子を意味するものとする。選択された好ましい実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、ＳＥＺ６決定基（例えば、細胞表面ＳＥＺ６タンパク質またはＳＥＺ６ ｍＲＮＡ）と直接会合、結合、または反応し、これにより、障害を改善することが可能である。より一般に、決定基は、形態的、機能的または生化学的な性質となることができ、遺伝子型または表現型的であり得る。他の好ましい実施形態において、決定基は、特異的細胞型（例えば、がん幹細胞）またはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特異的なポイントまたは特定のニッチにおける細胞）によって差次的または優先的に発現される（または発現されない）細胞表面抗原または遺伝子構成要素である。さらに他の好ましい実施形態において、決定基は、特異的細胞内もしくは個々の細胞集団内で異なる形で調節（上方調節または下方調節）される遺伝子もしくは遺伝子実体、その物理的構造および化学的組成に関して差次的に修飾される遺伝子、または差次的化学修飾を示す遺伝子と物理的に会合するタンパク質もしくはタンパク質のコレクションを含み得る。本明細書において企図される決定基は具体的に、正または負であると考えられ、その存在（正）または非存在（負）により、細胞、細胞亜集団、または組織（例えば、腫瘍）を描示することが可能である。
同様の文脈では、本発明の「ＳＥＺ６モジュレーター」は広く、ＳＥＺ６バリアントもしくはアイソフォーム（またはその特異的ドメイン、特異的領域、または特異的エピトープ）またはその遺伝子構成要素を認識するか、これと反応するか、競合するか、これをアンタゴナイズするか、これと相互作用するか、これに結合するか、これをアゴナイズするか、またはこれと会合する任意の化合物を含む。これらの相互作用により、ＳＥＺ６モジュレーターは、腫瘍形成性細胞（例えば、腫瘍永続化細胞またはがん幹細胞）の頻度、活性、再発、転移、または移動度を、有利に消失させるか、低下させるか、または緩和し得る。本明細書に開示されている例示的なモジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態において、選択されたモジュレーターは、ＳＥＺ６タンパク質アイソフォームまたはその免疫反応性断片もしくは誘導体に対する抗体を含むであろう。このような抗体は、アンタゴニスト的性質の場合もあり、アゴニスト的性質の場合もあり、任意選択で、治療剤または診断剤とコンジュゲートまたは会合させることができる。さらに、このような抗体または抗体断片は、枯渇抗体、中和抗体、または内部移行抗体も含み得る。他の実施形態において、本発明におけるモジュレーターは、ＳＥＺ６アイソフォームまたはその反応性の断片を含む、ＳＥＺ６構築物を構成するであろう。このような構築物は、融合タンパク質を含むことが可能であり、免疫グロブリンまたは生物学的応答修飾因子など、他のポリペプチドに由来する反応性ドメインを含み得ることが認められよう。さらに他の態様では、ＳＥＺ６モジュレーターは、ゲノムレベルで所望の効果を及ぼす核酸部分（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス構築物など）を含むであろう。本教示に適合性の、さらに他のモジュレーターは、については、下記で詳細に論じられるであろう。
より一般に、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、細胞表面ＳＥＺ６タンパク質を含むＳＥＺ６決定基（遺伝子型または表現型）を認識するか、これと反応するか、競合するか、これをアンタゴナイズするか、これと相互作用するか、これに結合するか、これをアゴナイズするか、またはこれと会合する任意の化合物を広く含む。どの形態のモジュレーターを最終的に選択するにせよ、対象に導入する前に、単離および精製された状態であることが好ましいであろう。これに関して「単離ＳＥＺ６モジュレーター」または「単離ＳＥＺ６抗体」という用語は、広義で、標準的な薬学的慣行に従い、望ましくない夾雑物（生物学的な夾雑物または他の形の夾雑物）を実質的に含まない状態でモジュレーターを含む、任意の調製物または組成物を意味すると解釈されるものとする。さらに、これらの調製物は、当技術分野で認知された様々な技法を使用して、所望の通りに精製および製剤化することもできる。当然ながら、このような「単離」調製物は、最終生成物の販売的側面、製造的側面、または治療的側面を改善し、医薬組成物を提供するように、意図する通りに製剤化することもでき、所望の通りに不活性成分または有効成分と組み合わせることもできることが認められよう。広義では、同じ一般的な検討を、「単離」ＳＥＺ６アイソフォームもしくは「単離」ＳＥＺ６バリアントまたはこれらをコードする「単離」核酸へも適用することができる。
さらに、驚くべきことに、特定のＳＥＺ６ドメイン、モチーフ、またはエピトープと相互作用するか、会合するか、またはこれに結合するモジュレーターは、腫瘍形成性細胞を消失させ、かつ／または、がん幹細胞の、腫瘍の増殖または伝播に対する効果をサイレンシングするかもしくは弱めるのにとりわけ有効であることが見出された。すなわち、細胞表面に近位のドメイン（例えば、ＳｕｓｈｉドメインまたはＣＵＢ様ドメインのうちの１つ）と反応または会合するモジュレーターが、腫瘍形成性細胞を枯渇させるかまたは中和するのに有効である一方、また、細胞表面に比較的より遠位のドメイン、モチーフ、または領域へと会合するか、またはこれに結合するモジュレーターは、腫瘍形成性細胞を消失させるか、中和するか、枯渇化させるか、またはサイレンシングするのに有効であることも予測外に発見された。これは、例えば、細胞傷害剤を含む抗ＳＥＺ６抗体薬物コンジュゲートなど、コンジュゲートされたモジュレーターについてとりわけ当てはまる。
本発明は、任意のＳＥＺ６モジュレーターの、任意の種類の新生物を含む、任意のＳＥＺ６障害の処置における使用を明示的に企図するが、特に好ましい実施形態において、開示されているモジュレーターを使用して、神経内分泌腫瘍を含む、神経内分泌特徴を含む腫瘍（遺伝子型または表現型）を防止、処置、または診断することができる。真性の神経内分泌腫瘍または「カノニカルの神経内分泌腫瘍」（ＮＥＴ）は、分散した内分泌系から生じ、高度に侵襲性なことが典型的である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、および子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（髄様甲状腺がん）、および肺（小細胞肺癌および大細胞性神経内分泌癌）において生じる。さらに、開示されているモジュレーターは、遺伝子型または表現型において、カノニカルの神経内分泌腫瘍と共通の形質を模倣するか、これらを含むか、これらに酷似するか、またはこれらを呈示する、偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）を処置、防止、または診断するのに有利に使用することができる。「偽性神経内分泌腫瘍」とは、散在する神経内分泌系細胞、または発がん性過程において、神経内分泌系の分化カスケードが異常に再活性化した細胞から生じる腫瘍である。このようなｐＮＥＴは一般に、ある特定の遺伝子型、表現型、または生化学的特徴を、従来から規定されている神経内分泌腫瘍であって、生物学的に活性のアミン、神経伝達物質、およびペプチドホルモンのサブセットを産生する能力を含む神経内分泌腫瘍と共有する。したがって、本発明の目的では、「神経内分泌特徴を含む腫瘍」または「神経内分泌特徴を呈示する腫瘍」という語句は、文脈がそれ以外を示さなければ、神経内分泌腫瘍および偽性神経内分泌腫瘍の両方を含むと考えられるものとする。
好ましい実施形態において、開示されているモジュレーターは、小細胞肺がんを処置するのに使用され、特に好ましい実施形態において、それを必要とする対象において、白金抵抗性小細胞肺がんを処置するのに使用されるであろう。本明細書において使用され、当技術分野で公知の通り、「白金抵抗性小細胞肺がん」という用語は、対象における腫瘍または腫瘍形成性小細胞肺がん細胞であって、カルボプラチン、シスプラチン、および／またはオキサリプラチンなど、標準治療である白金ベースの薬剤による処置に対して抵抗性または不応性である、腫瘍または腫瘍形成性小細胞肺がん細胞の存在を意味する。このような状態は、標準的な臨床手順を使用して容易に診断され、それらの認識は、当技術分野の通常の技能を有する臨床家の範囲内にある。
上記で一般に論じられた腫瘍との関連のほか、また、選択された腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）と、ＳＥＺ６決定基との、表現型または遺伝子型における関連の兆候も認められる。これに関して、選択されたＴＩＣ（例えば、がん幹細胞）は、正常組織および非腫瘍形成性細胞（ＮＴＧ）と比較すると、高レベルのＳＥＺ６タンパク質を発現させる可能性があり、併せて、固形腫瘍の大半を構成することが典型的である。したがって、ＳＥＺ６決定基は、腫瘍関連マーカー（または抗原または免疫原）を含むことが可能であり、開示されているモジュレーターは、細胞表面上または腫瘍微小環境内のタンパク質レベルの変化による、ＴＩＣおよび関連する新生物の検出および抑制に有効な薬剤をもたらし得る。したがって、タンパク質へと会合するか、これに結合するか、またはこれと反応する、免疫反応性アンタゴニストおよび抗体を含むＳＥＺ６モジュレーターは、腫瘍開始細胞の頻度を効果的に低下させることが可能であり、これらの腫瘍開始細胞が、休眠したままでいるか、かつ／または患者における腫瘍の増殖、転移、または再発を促進し続ける能力を消失させるか、枯渇させるか、失効化するか、低下させるか、これらの分化を促進するか、またはこれらを他の形で排除するかもしくは限定するのに有用であり得るであろう。これに関して、当業者ならば、本発明により、ＳＥＺ６モジュレーターおよび腫瘍開始細胞の頻度の低下におけるそれらの使用がさらに提供されることを認められよう。
ＩＩ．ＳＥＺ６生理学
ＳＥＺ６（発作関連６ホモログとしてもまた公知である）とは、元は、痙攣誘発剤であるペンチレンテトラゾールで処理されたマウス大脳皮質由来細胞からクローニングされた、Ｉ型膜貫通タンパク質である（Shimizu-Nishikawa、１９９５年；ＰＭＩＤ：７７２３６１９）。代表的なＳＥＺ６タンパク質オルソログは、ヒト（ＮＰ＿８４９１９１；ＮＰ＿００１０９２１０５）、チンパンジー（ＸＰ＿５１１３６８、ＮＰ＿００１１３９９１３）、マウス（ＮＰ＿０６７２６１）、およびラット（ＮＰ＿００１０９９２２４）などが挙げられるがこれらに限定されない。ヒトでは、ＳＥＺ６遺伝子は、染色体１７ｑ１１．２上に位置する、５１．１ｋＢｐにわたる１７のエクソンからなる。最後のエクソンから１６塩基対離れているに過ぎない、代替的なスプライスアクセプター部位は、２つのプロセシングされた転写物であって、１つは約４２１０塩基（ＮＭ＿１７８８６０；図１Ａ）であり、１つは約４１９４塩基（ＮＭ＿００１０９８６３５、図１Ｂ）である転写物をもたらす。前者の転写物が、９９４アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿８４９１９１；図１Ｃ）をコードするのに対し、後者の転写物は、９９３アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿００１０９２１０５；図１Ｄ）をコードする。ＳＥＺ６のこれらの２つのタンパク質アイソフォームは、それらの細胞外ドメインおよびそれらの膜貫通ドメインにわたる全体で１００％の同一性を共有し、最後の１０アミノ酸残基だけが異なる（図１Ｅ）。第３のスプライスバリアントは、ＳＥＺ６の分泌形態を作製することが報告されている（Shimizu-Nishikawa、１９９５年；ＰＭＩＤ：７７２３６１９）が、ＮＣＢＩデータベースのＧｅｎｅページのエントリー中の、関連するＲｅｆＳｅｑ中には含まれていない。本発明のモジュレーターは、スプライスバリアントのうちのいずれかに結合し得る。
アイソフォームの生物学的関与性は不明であるが、１つの研究は、マウスＳＥＺ６ノックアウトマウスに由来するニューロン内でそれらの発現を回復させた場合の膜タンパク質について、可溶性タンパク質と対比した対抗作用を示唆している（Gunnersenら、２００７年、ＰＭＩＤ：１８０３１６８１）。ＳＥＺ６タンパク質についての種間タンパク質配列同一性について、図２Ａで一覧する。ヒトゲノムでは、２つの近縁の遺伝子である、発作関連６ホモログ様（ＳＥＺ６Ｌ）および発作関連６ホモログ様２（ＳＥＺ６Ｌ２）が認められ、それらのそれぞれが、多数のアイソフォームをコードする複数のスプライスバリアントを有する（図２Ｂ）。ヒトにおける、ＳＥＺ６様タンパク質のこのファミリーのメンバーのそれぞれの最長のタンパク質についての同一性パーセントを、図２Ｃに示す。本出願の目的では、それらの様々なアイソフォームを含む、ＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ、およびＳＥＺ６Ｌ２をまとめて、ＳＥＺ６ファミリーと称する。本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、ＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ、またはＳＥＺ６Ｌ２のそれぞれに特異的なモジュレーターを含む。代替的に、本発明のモジュレーターは、ＳＥＺ６ならびにＳＥＺ６Ｌおよび／またはＳＥＺ６Ｌ２の一方または両方と交差反応し得る。
成熟ＳＥＺ６タンパク質は、一連の構造ドメイン：細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および固有のＮ末端ドメインを含む細胞外ドメインに続いて、２つの交互に現れるＳｕｓｈｉドメインおよびＣＵＢ様ドメイン、ならびに３つのさらなるタンデムＳｕｓｈｉドメインリピートから構成される。ＳＥＺ６抗原の２つのアイソフォームが存在するが、カルボキシ最末端、細胞質ドメインだけが異なる。
図１Ｆは、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域についての概略図であって、ＳｕｓｈｉドメインおよびＣＵＢドメインと、Ｎ末端ドメインとの一般的並置を例示する概略図を提示する。一般に、ドメインは、アミノ酸残基３３６〜３９５（Ｓｕｓｈｉドメイン１）、３９７〜５０８（ＣＵＢドメイン１）、５１１〜５７２（Ｓｕｓｈｉドメイン２）、５７４〜６８５（ＣＵＢドメイン２）、６９０〜７４８（Ｓｕｓｈｉドメイン３）、７５０〜８１３（Ｓｕｓｈｉドメイン４）、８１７〜８７８（Ｓｕｓｈｉドメイン５）の近傍で生じると認識されており、アミノ酸残基１〜３３５の近傍におけるＮ末端ドメイン、およびアミノ酸残基７１〜１６９の近傍における、プロリンに富む残基による構成上のバイアスを伴う。
Ｓｕｓｈｉリピートは、他のヒト補体調節タンパク質（すなわち、補体Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ結合部位）内で見出される、短いコンセンサスリピートと類似する。ＣＵＢ様ドメインは、他の哺乳動物の補体結合性タンパク質内で見出されるＣＵＢドメインであって、補体の活性化以外の、多数の生物学的過程であり、パターン形成、アクソンの誘導、炎症、および腫瘍の抑制などが挙げられるがこれらに限定されない（BorkおよびBeckman、１９９３年、ＰＭＩＤ：８５１０１６５）生物学的過程に関与する、広範にわたるタンパク質と会合するＣＵＢドメインと類似する。ＳｕｓｈｉドメインおよびＣＵＢドメインのいずれも、ＳＥＺ６の機能について、細胞外における他のタンパク質の結合の関与を含意する。ＣＵＢドメインを含有するタンパク質はまた、細胞シグナリング経路へ関連付けられてきており、ＳＥＺ６のＣ末端細胞質ドメインが、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリーメンバーによるリン酸化のための潜在的標的である、Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒモチーフ（配列番号２００）を含有することは、この機能と符合する。そうであるなら、これにより、ＳＥＺ６は、Ｒａｓの活性化をもたらす細胞内シグナリング経路と関連付けられてきたことから、ＳＥＺ６は、神経栄養因子受容体であり得ることが示唆される。
本明細書において使用される場合、用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」は、細胞表面における発現の前に切断することができる、１９アミノ酸のシグナルペプチドを伴わずに産生される、ＳＥＺ６タンパク質の形態（複数可）を指すことに留意されたい。そうでないことが指し示されない限りにおいて、ＳＥＺ６アミノ酸の番号付け（ドメイン、領域、エピトープなどについての）は、成熟タンパク質の文脈では、リーダーを伴わずになされるであろう。
ＳＥＺ６は、齧歯動物の腎臓内、肝臓内、心臓内、肺内、および胸腺内では、ＲＴ−ＰＣＲにより、低レベルで検出されるが、強度のタンパク質発現が見られるのは脳内だけであり、有意なレベルの発現は精巣内で見られた（HerbstおよびNicklin、１９９７年、ＰＭＩＤ：９０７３１７３）。ＳＥＺ６に対するポリクローナル血清を使用して、発生１３日目のマウス前脳内のタンパク質発現を検出した。強い染色は、発生しつつある皮質板および皮質サブプレートの、有糸分裂後における成熟ニューロン内で検出された。この染色は、成体脳では減殺され、ここでは、ＳＥＺ６の発現は、海馬、小脳、および嗅球など、進行中の形態可塑性と関連する他の脳領域内、ならびに網膜および脊髄のニューロン内で検出することができる（Gunnersenら、２００７年、ＰＭＩＤ：１８０３１６８１）。最も稠密なシグナルは、神経細胞体の濃度が最大となる領域内で見出される。広範にわたる網膜内のＳＥＺ６発現にもかかわらず、ＳＥＺ６の非存在下でも、網膜機能は、影響を受けなかった（Gunnersenら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６６２０９６）。ＳＥＺ６による染色パターンは、新皮質層および海馬の出現と緊密に結びついており、発生時における、この遺伝子の前脳特異的な役割を含意する。ヒトおよびマウスでは、ＳＥＺ６は、新皮質の高度に特異的な領域内で差次的に発現することが見出された（Gunnersenら、２００７年、前掲）。
ヒトＳＥＺ６遺伝子における突然変異は、熱性発作（ＦＳ）、体温の上昇を伴う痙攣および小児期における最も一般的な種類の発作に関連付けられてきた（Yuら、２００７年、ＰＭＩＤ：１７０８６５４３）。ＦＳは、持続期間、再発、および身体が発作の影響を受ける程度に応じて、単純型ＦＳまたは複合型ＦＳとして分類される。中国人のコホート内の、１５例の健常対照では、ＳＥＺ６内の突然変異が見出されなかったが、ＦＳを伴う患者６０例中２１例では、突然変異が見出され、最も一般的な種類の突然変異は、ｃＤＮＡの１４３５位における、ヘテロ接合性のシトシン挿入（フレームシフト突然変異）であった。突然変異の発生率は、複合型ＦＳを伴う患者および陽性の家族歴を伴う患者において有意に高かった。複合型ＦＳを伴う小児が、後年において発作を有する可能性は８０％であるので、著者らは、ＳＥＺ６内の突然変異についてのスクリーニングが、ＦＳの再発またはてんかんの発生の予測において有用であり得ることを示唆している（Yuら、２００７年、前掲）。後の研究は、この研究が、因果性を含意するのに適正な力を持つ範囲、関与性、および能力について疑問視しているが、ＳＥＺ６が、発作障害において役割を果たす多くの遺伝子のうちの１つの遺伝子であり得ることは支持している（Mulleyら、２０１１年、ＰＭＩＤ：２１７８５７２５）。
ＳＥＺ６の具体的な分子的機能は、依然として不明なままである。上記で論じた通り、このタンパク質の構造モジュールについての解析により、相同性が同定されており、配列についての解析は、シグナリング、細胞間連絡、および神経発生における可能な役割を示唆している。脳の回路を構成する、シグナリングネットワークを形成する、ニューロンの樹状分枝化および結合性は、神経細胞内の内因性の分子プログラム、ならびに外因性シグナルの両方を介して発生し、指定されている。哺乳動物前脳内の主要なニューロンである錐体ニューロンにおける樹状増殖の過程により、形状が顕著に異なるニューロン（錐体細胞体および２つの顕著に異なる複雑な樹状ツリー：一方は、細胞体の尖端部から発生する構造であり、他方は、細胞体の基底部から発生する構造である）がもたらされる。Gunnersenら（２００７年、前掲）は、ＳＥＺ６ヌルマウスが、これらのニューロンの樹状ツリーにおいて、過剰量の短い樹状突起を呈示するが、所与のニューロンが接続されるニューロンの範囲である、全体的な樹枝野の増大をもたらさないことを示している。ノックアウトニューロン内で、膜結合型ＳＥＺ６アイソフォームの発現を回復させると、抗分枝化効果が結果としてもたらされる。行動学的試験では、ＳＥＺ６ヌルマウスは、探索、運動、および認知に関わる特異的な欠損を提示する。これらのデータは、ＳＥＺ６が、発生時において、複雑な樹状分枝が精緻化するときに、樹状突起の伸長と分枝化との間で必要なバランスを達成するのに重要であることを示唆する。
まとめると、上記の研究は、ＳＥＺ６タンパク質が、神経発生の文脈で重要であり、細胞間連絡およびシグナリングにおいて、何らかの役割を果たす可能性が高いことを強く示唆する。腫瘍内では、発生シグナリング経路の不十分な再活性化または正常なシグナリング経路の調節異常が共通して観察されている（Harrisら、２０１２年）。発生プログラムの部分的な再活性化を示す特徴を共有する、腫瘍の１つのコレクションは、神経内分泌表現型を伴う腫瘍であって、様々なホルモンおよび内分泌マーカーを発現および／または分泌させ、神経発生、神経コミットメント、または神経運命への分化を示す様々な神経マーカーを発現させる腫瘍である（Yao、２００８年；ＰＭＩＤ：１８５６５８９４）。神経内分泌特徴を伴う腫瘍は、低頻度だが、広範にわたる原発部位において発生し、それらの網羅的な分類は、依然として問題を含んだままである（Yao、ＰＭＩＤ：１８５６５８９４；Klimstra、２０１０年；ＰＭＩＤ：２０６６４４７０；Kloeppel、２０１１年；ＰＭＩＤ：２２００５１１２）が、４つの主要な種類：低悪性度良性カルチノイド、悪性挙動を伴う低悪性度高分化度神経内分泌腫瘍、神経内分泌特徴と上皮特徴との混合型腫瘍、および高悪性度低分化度神経内分泌癌へと分類することができる。これらの分類のうちで、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）のサブセットを含む、低分化度神経内分泌癌とは、予後の悪いがん型である。ＳＣＬＣは、気管支に由来し、肺性神経内分泌細胞から部分的に発生することが仮定されている（GalluzzoおよびBocchetta、２０１１年；ＰＭＩＤ：２１５０４３２０）。これらの腫瘍の細胞供給源がどこに由来するのであれ、それらは、低分化度の内分泌表現型を示し、しばしば、高度に増殖性および侵襲性であり、神経タンパク質を高頻度で過剰発現させることが明らかである。同様に、甲状腺のカルシトニン分泌性傍濾胞Ｃ細胞から発生する、特殊な神経内分泌腫瘍型である、髄様甲状腺がん（ＭＴＣ）も、それらの成熟した内分泌機能およびそれらの神経堤組織からの由来のいずれとも符合する、神経内分泌表現型を示す（Cookら、２０１０年；ＰＭＩＤ：２０１８２５８８）。甲状腺がんのうちの約３〜５％占めるに過ぎないが、ＭＴＣは、全ての甲状腺がんによる死亡のうちの最大１４％を結果としてもたらし、標準的な化学療法または照射処置に対する応答が思わしくなく、カボザンチニブおよびバンデタニブなど、新規の分子標的化チロシンキナーゼ阻害剤に対しては応答性がなお悪く、単剤療法への応答も悪い（Haddad、２０１３年；ＰＭＩＤ：２４００２５１６）。したがって、予後の悪い腫瘍についてのこれらの例を踏まえると、結果として生じる、これらの腫瘍内の神経発現マーカーの上昇であって、これらの腫瘍以外では神経系へと主に限局される可能性もあり、発生時における限定的な発現を示す可能性もあり、ＳＥＺ６がその例であり得る、神経発現マーカーの上昇は、神経内分泌表現型を伴う腫瘍のための固有の治療標的をもたらし得る。
ＩＩＩ.がん幹細胞
上記で示唆された通り、驚くべきことに、ＳＥＺ６の発現（遺伝子型および／または表現型）異常は、様々な腫瘍形成性細胞亜集団と関連することが発見された。これに関して、本発明は、このような細胞を標的化するのに特に有用であり、とりわけ、腫瘍永続化細胞を標的化するのに特に有用であり、これにより、新生物性障害の処置、管理、または防止を容易とし得るＳＥＺ６モジュレーターを提供する。したがって、好ましい実施形態において、ＳＥＺ６決定基（表現型または遺伝子型）のモジュレーターは、本教示に従い、腫瘍開始細胞頻度を低下し、これにより、増殖性障害の処置または管理を容易とするのに有利に使用することができる。
本出願の目的では、「腫瘍開始細胞」（ＴＩＣ）という用語は、「腫瘍永続化細胞」（ＴＰＣ；すなわち、がん幹細胞またはＣＳＣ）および高度に増殖性の「腫瘍前駆細胞」（ＴＰｒｏｇと称する）の両方であって、併せて、一般に、バルク腫瘍または腫瘍塊の固有の亜集団（すなわち、０．１〜４０％）を構成する、ＴＰＣおよびＴＰｒｏｇの両方を包含する。本開示の目的では、「腫瘍永続化細胞」および「がん幹細胞」または「新生物性幹細胞」という用語は、同義であり、本明細書では互換的に使用することができる。ＴＰＣが、腫瘍内に存在する腫瘍細胞の組成を完全に再現することが可能であり、少数の単離細胞の継代移植（マウスによる２代またはこれを超える継代）により実証される通り、無際限の自己再生能を有し得るのに対し、ＴＰｒｏｇは、無際限の自己再生能を提示しないという点で、ＴＰＣは、ＴＰｒｏｇと異なる。
当業者ならば、適切な細胞表面マーカーを使用する、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が、単一の細胞と細胞塊（すなわち、ダブレットなど）とを識別するその能力に少なくとも部分的に起因して、高度に富化されたがん幹細胞亜集団（例えば、＞９９．５％の純度）を単離するのに信頼できる方法であることを認められよう。このような技法を使用して、小細胞数の高度に精製されたＴＰｒｏｇ細胞を、免疫不全マウスへと移植すると、初代移植片内では、腫瘍の増殖を促進し得ることが示されている。しかし、精製されたＴＰＣ亜集団と異なり、ＴＰｒｏｇから発生した腫瘍は、表現型上の細胞異質性において、親腫瘍を完全には反映せず、後代の移植片内の継代腫瘍形成の再誘発においては、顕著に非効率的である。これに対し、ＴＰＣ亜集団は、継代で単離および移植される場合も、親腫瘍の細胞異質性を完全に再構成し、腫瘍を効率的に誘発することが可能である。したがって、当業者ならば、初代移植片内では、いずれも腫瘍形成性であるが、ＴＰＣとＴＰｒｏｇとの決定的な差違は、小細胞数での継代移植時にも、異質性の腫瘍の増殖を永続的に促進するＴＰＣの固有の能力であることを認識するであろう。ＴＰＣを特徴付ける他の一般的手法は、形状、ならびに細胞表面マーカー、転写プロファイル、および薬物応答の検討を伴うが、マーカーの発現は、培養条件およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞系の継代と共に変化し得る。
したがって、本発明の目的では、腫瘍永続化細胞も、正常組織内の細胞階層を支持する正常幹細胞と同様に、多重系列分化能を維持しながら無際限に自己再生する、それらの能力により定義することが好ましい。したがって、腫瘍永続化細胞は、腫瘍形成性の後代（すなわち、腫瘍開始細胞：ＴＰＣおよびＴＰｒｏｇ）および非腫瘍形成性（ＮＴＧ）の後代の両方を発生させることが可能である。本明細書において使用される場合、「非腫瘍形成性細胞」（ＮＴＧ）とは、腫瘍開始細胞から発生するが、それ自体では、自己再生能または腫瘍を含む腫瘍細胞の異質性の系列を発生させる能力を有さない腫瘍細胞を指す。実験では、ＮＴＧ細胞は、過剰細胞数で移植される場合でもなお、マウスにおいて、腫瘍を再現的に形成することが不可能である。
指し示される通り、ＴＰｒｏｇはまた、マウスにおいて腫瘍を発生させるそれらの能力が限定されていることに起因して、腫瘍開始細胞（またはＴＩＣ）としても類別される。ＴＰｒｏｇは、ＴＰＣの後代であり、一定回数の、自己再生的でない細胞分裂が可能なことが典型的である。加えて、ＴＰｒｏｇ細胞はさらに、それらのそれぞれが、表現型（例えば、細胞表面マーカー）および腫瘍細胞アーキテクチャーを再現する能力の差違により識別することができる、早期腫瘍前駆細胞（ＥＴＰ）と、後期腫瘍前駆細胞（ＬＴＰ）とに分けることもできる。このような技術的差違にもかかわらず、ＥＴＰおよびＬＴＰのいずれも、小細胞数で移植されると、腫瘍を継代で再構成することが一般にそれほど可能でなく、親腫瘍の異質性を反映しないことが典型的であるという点で、ＴＰＣとは機能的に異なる。前出の顕著な差異にもかかわらず、様々なＴＰｒｏｇ集団はまた、まれな機会には、通常は幹細胞に帰せられる自己再生能を獲得し、それら自体がＴＰＣ（またはＣＳＣ）となる場合があることも示されている。いずれにせよ、いずれの種類の腫瘍開始細胞も、単一の患者の典型的な腫瘍塊内に現れ、本明細書に開示されているモジュレーターによる処置にかけられる可能性が高い。すなわち、開示されている組成物は一般に、特定の実施形態または腫瘍内に現れるミックスにかかわらず、このようなＳＥＺ６陽性腫瘍開始細胞の頻度を低下させるか、またはこれらの化学的感受性を変化させるのに有効である。
本発明の文脈では、ＴＰＣは、腫瘍のバルクを構成する、ＴＰｒｏｇ（ＥＴＰおよびＬＴＰの両方）、ＮＴＧ細胞、および腫瘍浸潤性非ＴＰＣ由来細胞（例えば、線維芽細胞／間質細胞、内皮細胞、および造血細胞）より、腫瘍形成性であり、比較的休眠性であり、しばしば化学療法抵抗性である。従来の治療およびレジメンが、大部分、腫瘍を減量し、かつ、急速に増殖しつつある細胞に攻撃するようにデザインされていることを踏まえると、ＴＰＣは、従来の治療およびレジメンに対して、速く増殖しつつあるＴＰｒｏｇおよび他のバルク腫瘍細胞集団より抵抗性が大きい可能性が高い。さらに、ＴＰＣは、それらを、従来の治療に対して比較的化学療法抵抗性とする他の特徴であって、多剤抵抗性輸送体の発現の増大、ＤＮＡ修復機構の増強、および抗アポトーシス性タンパク質などの特徴を発現させることが多い。それらのそれぞれがＴＰＣによる薬物耐性に寄与する、これらの特性は、進行期の新生物を伴う患者の大半には長期にわたる利益を確保する、標準的な腫瘍処置レジメンの不奏効の鍵となる原因、すなわち、持続的な腫瘍の増殖および再発を促進する細胞（すなわち、ＴＰＣまたはＣＳＣ）を適正に標的化し、根絶できないことの原因を構成する。
多くの先行技術による処置と異なり、本発明の新規の組成物は、選択されたモジュレーターの形態または特異的標的（例えば、遺伝子素材、ＳＥＺ６抗体、またはリガンド融合構築物）にかかわらず、対象に投与されると、腫瘍開始細胞の頻度を低下させることが好ましい。上記で言及した通り、腫瘍開始細胞頻度の低下は、ａ）腫瘍開始細胞の消失、枯渇、感作、サイレンシング、もしくは阻害；ｂ）腫瘍開始細胞の増殖、拡大、もしくは再発の制御；ｃ）腫瘍開始細胞の誘発、伝播、維持、もしくは増殖の遮断；またはｄ）腫瘍形成性細胞の生存、再生、および／もしくは転移に対する他の形の妨害の結果として生じ得る。一部の実施形態において、腫瘍開始細胞の頻度の低下は、１または複数の生理学的経路の変化の結果として生じる。経路の変化は、腫瘍開始細胞の低下または消失によるのであれ、それらの潜在的能力の改変（例えば、分化の誘導、ニッチの破壊）によるのであれ、腫瘍環境または他の細胞に影響を及ぼすそれらの能力に他の形で干渉することによるのであれ、腫瘍形成、腫瘍の維持、ならびに／または転移および再発を阻害することにより、ＳＥＺ６関連障害のより有効な処置を可能とする。
当技術分野で認知された方法であって、腫瘍開始細胞の頻度のこのような低下を評価するのに使用することができる方法の中には、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける限界希釈解析の後で、好ましくは、ポアソン分布統計を使用する計数を行うか、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍を発生させる能力の有無など、所定の決定的事象の頻度を評価する方法がある。このような限界希釈解析は、腫瘍開始細胞頻度の低下を計算する好ましい方法を含むが、また、他のそれほど要求が大きくない方法も、若干正確さが劣り、本明細書の教示と完全に適合性なわけではないが、所望の値を有効に決定するのに使用することができる。したがって、当業者であれば認められる通り、また、周知のフローサイトメトリー手段または免疫組織化学手段により、頻度値の低下を決定することも可能である。上述の方法の全てについては、例えば、それらのそれぞれが参照によりそれらの全体において、かつ、特に、開示されている方法について本明細書に組み込まれる、Dyllaら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８５６０５９４およびHoeyら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１を参照されたい。
限界希釈解析について述べると、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腫瘍開始細胞頻度の計数は、分画されたヒト腫瘍細胞または分画されていないヒト腫瘍細胞（例えば、それぞれ、処置された腫瘍および処置されていない腫瘍に由来する）を、コロニー形成を促進する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖条件に置くことにより達成することができる。このようにすれば、コロニー形成細胞を、コロニーの単純なカウンティングおよび特徴付けにより計数することもでき、例えば、プレーティングの少なくとも１０日後において、ヒト腫瘍細胞を、系列希釈下のプレートに入れ、各ウェルを、コロニー形成について陽性または陰性と評定することからなる解析により計数することもできる。一般に、腫瘍開始細胞頻度を決定するそれらの能力がより正確な、ｉｎ ｖｉｖｏにおける限界希釈実験または限界希釈解析は、系列希釈下における、ヒト腫瘍細胞の、非処置対照または処置された集団からの、例えば、免疫不全マウスへの移植と、その後、各マウスを、移植の少なくとも６０日後において、腫瘍形成について陽性または陰性と評定することとを包含する。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける限界希釈解析による細胞頻度値の誘導は、ポアソン分布統計を、陽性事象および陰性事象についての公知の頻度へと適用し、これにより、この場合、コロニー形成または腫瘍形成のそれぞれである、陽性事象の定義を十分に満たす事象についての頻度を提示することによりなされることが好ましい。
本発明と適合性の他の方法であって、腫瘍開始細胞頻度を計算するのに使用することができる方法について述べると、最も一般的な方法は、定量的フローサイトメトリー技法および免疫組織化学による染色手順を含む。すぐ上で記載した限界希釈解析技法ほど正確ではないが、これらの手順は、それほど作業集約的でなく、比較的短い時間枠内で妥当な値をもたらす。したがって、当業者ならば、フローサイトメトリーによる細胞表面マーカープロファイル決定であって、当技術分野で認知された細胞表面タンパク質であり、腫瘍開始細胞について富化されることが公知のタンパク質（例えば、その全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第２０１２／０３１２８０号において示されている、潜在的に適合性のマーカー）に結合する、１または複数の抗体または試薬を援用する細胞表面マーカープロファイル決定を使用し、これにより、様々な試料に由来するＴＩＣレベルを測定し得ることが認められよう。さらに別の適合性の方法では、当業者であれば、これらの細胞を区別すると考えられる細胞表面タンパク質に結合することが可能な、１または複数の抗体または試薬を使用する免疫組織化学により、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて（例えば、組織切片内で）、ＴＩＣ頻度を計数し得るであろう。
当業者ならば、多数のマーカー（またはそれらの非存在）が、がん幹細胞の様々な集団と関連しており、腫瘍細胞亜集団を単離するかまたは特徴付けるのに使用されていることを認識するであろう。これに関して、例示的ながん幹細胞マーカーは、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＮＢ８４、ＴｒｋＡ、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２９、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ４６、トランスフェリン受容体、ＪＡＭ３、カルボキシペプチダーゼＭ、ＡＤＡＭ９、オンコスタチンＭ、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ネスチン、Ｓｏｘ１、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄ、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ｍｆ２、ｙｙ１、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃｋＡ５、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｍｌｌｔ３、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＡＸＩＮ１、ＢＣＬ９、ＭＹＣ、（ＴＣＦ４）ＳＬＣ７Ａ８、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＥＭ８、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＵＣ１６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１１、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＰＴＰＮ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＭＰＺＬ１、ＦＬＪ１００５２、Ｃ４．４Ａ、ＥＤＧ３、ＲＡＲＲＥＳ１、ＴＭＥＰＡＩ、ＰＴＳ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＮＩＤ２、ＳＴＥＡＰ、ＡＢＣＡ３、ＣＲＩＭ１、ＩＬ１Ｒ１、ＯＰＮ３、ＤＡＦ、ＭＵＣ１、ＭＣＰ、ＣＰＤ、ＮＭＡ、ＡＤＡＭ９、ＧＪＡ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＡＢＣＡ１、ＰＣＤＨ７、ＡＤＣＹ９、ＳＬＣ３９Ａ１、ＮＰＣ１、ＥＮＰＰ１、Ｎ３３、ＧＰＮＭＢ、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＬＳＲ１、ＬＲＰ３、Ｃ２０ｏｒｆ５２、ＴＭＥＰＡＩ、ＦＬＶＣＲ、ＰＣＤＨＡ１０、ＧＰＲ５４、ＴＧＦＢＲ３、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＰＣＤＨＢ２、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１６６、ＡＦＰ、ＢＭＰ−４、β−カテニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、デコリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ１０５、ＣＤ６４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＣＤ４９ｂ、およびＣＤ４９ｆを含む。例えば、それらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Schulenburgら、２０１０年、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８、ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、同２００８／０１７５８７０、同２０１０／０２７５２８０、同２０１０／０１６２４１６、および同２０１１／００２０２２１を参照されたい。上述のマーカーのそれぞれはまた、本発明の二重特異的抗体または多重特異的抗体の文脈では、二次標的抗原として使用することができることもさらに認められよう。
同様に、ある特定の腫瘍型のがん幹細胞と関連する細胞表面表現型の非限定的な例は、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋のほか、当技術分野で公知の、他のがん幹細胞表面表現型を含む。例えば、それらのそれぞれが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Schulenburgら、２０１０年、前掲、Visvaderら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３を参照されたい。当業者であれば、すぐ上で例示されたマーカー表現型などのマーカー表現型を、標準的なフローサイトメトリー解析および細胞分取法と共に使用して、ＴＩＣ細胞もしくはＴＩＣ細胞集団および／またはＴＰＣ細胞もしくはＴＰＣ細胞集団を、さらなる解析のために、特徴付けるか、単離するか、精製するか、または富化し得ることを認められよう。解析される腫瘍検体が、初代患者腫瘍検体であるのか、患者由来のＮＴＸ腫瘍であるのかにかかわらず、ＣＤ４６と、ＣＤ３２４と、任意選択で、ＣＤ６６ｃとが、多くのヒト結腸直腸（「ＣＲ」）腫瘍細胞、乳房（「ＢＲ」）腫瘍細胞、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）腫瘍細胞、小細胞肺（ＳＣＬＣ）腫瘍細胞、膵臓（「ＰＡ」）腫瘍細胞、黒色腫（「Ｍｅｌ」）腫瘍細胞、卵巣（「ＯＶ」）腫瘍細胞、および頭頸部がん（「ＨＮ」）腫瘍細胞の表面上で、高度に、または異質性に発現することは、本発明に関する目的に適う。
次いで、上記で言及された方法、および当技術分野で公知の、選択されたマーカーのうちのいずれかを使用すると、本明細書の教示に従い、開示されているＳＥＺ６モジュレーター（細胞傷害剤にコンジュゲートさせたＳＥＺ６モジュレーターを含む）により提供される、ＴＩＣ（またはその中のＴＰＣ）の頻度の低下を定量化することが可能である。場合によって、本発明の化合物は、ＴＩＣまたはＴＰＣの頻度を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、なおまたは３５％低下し得る（上記で言及された様々な機構であって、消失、分化の誘導、ニッチの破壊、サイレンシングなどを含む機構により）。他の実施形態において、ＴＩＣまたはＴＰＣの頻度の低下は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％のオーダーであり得る。ある特定の実施形態において、開示されている化合物は、ＴＩＣまたはＴＰＣの頻度を、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、なおまたは９５％低下し得る。当然ながら、ＴＩＣまたはＴＰＣの頻度の任意の低下は、新生物の腫瘍形成性、遷延性、再発、および侵襲性の対応する低下を結果としてもたらす可能性が高いことが認められよう。
ＩＶ．ＳＥＺ６モジュレーター
いずれにせよ、本発明は、ＳＥＺ６アンタゴニストを含むＳＥＺ６モジュレーターの、いくつかのＳＥＺ６関連悪性腫瘍のうちのいずれか１つを含む様々な障害の診断、治療診断、処置、および／または予防のための使用を対象とする。開示されているモジュレーターは、単独で使用することもでき、化学療法剤または免疫療法剤（例えば、治療抗体）または生物学的応答修飾因子など、多種多様な抗がん化合物と共に使用することもできる。他の選択された実施形態において、２つまたはこれを超える個別のＳＥＺ６モジュレーターは、抗新生物効果の増強するように、組み合わせて使用することもでき、多重特異的構築物を製作するのに使用することもできる。
ある特定の実施形態において、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドを含むであろう。より特定すると、本発明の例示的なモジュレーターは、抗体およびそれらの抗原結合性断片もしくは誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、生体有機分子、ペプチド模倣薬剤、薬理作用物質およびそれらの代謝物、転写制御配列および翻訳制御配列などを含み得る。ある特定の実施形態において、モジュレーターは、例えば、ＳＥＺ６融合構築物（例えば、ＳＥＺ６−Ｆｃ、ＳＥＺ６−標的化部分など）またはＳＥＺ６−コンジュゲート（例えば、ＳＥＺ６−ＰＥＧ、ＳＥＺ６−細胞傷害剤、ＳＥＺ６−ｂｒｍなど）を含む、可溶性ＳＥＺ６（ｓＳＥＺ６）、またはその形態、バリアント、誘導体、もしくは断片を含むであろう。また、他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、抗体またはその免疫反応性断片もしくは誘導体を含むことも認められよう。特に好ましい実施形態において、本発明のモジュレーターは、中和抗体またはその誘導体または断片を含むであろう。他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、内部移行抗体またはその断片を含み得る。さらに他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、枯渇化抗体またはその断片を含み得る。さらに、上述の融合構築物と同様に、これらの抗体モジュレーターは、選択された細胞傷害剤、ポリマー、生物学的応答修飾因子（ＢＲＭ）などとコンジュゲートさせるか、連結するか、または他の形で会合させて、様々な（および、任意選択で、複数の）作用機構を伴う、方向付けられた免疫療法をもたらすこともできる。上記で示唆された通り、このような抗体は、パンＳＥＺ６抗体であり、２つまたはこれを超えるＳＥＺ６ファミリーメンバー（例えば、図１１Ａに示される、ＳＥＺ６およびＳＥＺ６Ｌ）と会合する場合もあり、ＳＥＺ６のアイソフォームの一方または両方と選択的に反応する免疫特異的抗体の場合もある。さらに他の実施形態において、モジュレーターは、遺伝子レベルで作用し、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどとしての化合物であって、ＳＥＺ６決定基の遺伝子型構成要素と相互作用または会合する化合物も含み得る。
開示されているＳＥＺ６モジュレーターは、ＴＰＣおよび／または関連する新生物を含む腫瘍細胞の増殖、伝播、または生存を、様々な機構であって、選択された経路をアゴナイズもしくはアンタゴナイズすること、または、例えば、ＳＥＺ６モジュレーター、任意の会合させたペイロードの形態、もしくは投与および送達法に応じて、特異的細胞を消失させることを含む機構により、枯渇させるか、サイレンシングするか、中和するか、消失させるか、または阻害し得ることもさらに認められよう。したがって、本明細書に開示されている好ましい実施形態は、腫瘍永続化細胞などの特異的腫瘍細胞亜集団の枯渇、阻害、もしくはサイレンシング、または特異的エピトープまたはドメインと相互作用するモジュレーターを対象とするが、このような実施形態は、例示的なものであるに過ぎず、いかなる意味でも限定的なものではないことも強調しなければならない。むしろ、添付の特許請求の範囲で示される通り、本発明は、任意の特定の機構、結合領域、または標的腫瘍細胞集団にかかわらず、ＳＥＺ６モジュレーターおよびそれらの、様々なＳＥＺ６関連障害の処置、管理、または予防における使用を広く対象とする。
選択されたモジュレーターの形態にかかわらず、選択された化合物は、アンタゴニスト的性質であり得ることが認められよう。本明細書において使用される場合、「アンタゴニスト」とは、特定の標的または指定された標的（例えば、ＳＥＺ６）の活性であって、受容体のリガンドへの結合、または酵素の基質との相互作用を含む活性を中和するか、遮断するか、阻害するか、失効化するか、低下させるか、またはこれらに干渉することが可能な分子を指す。これに関して、本発明のＳＥＺ６アンタゴニストは、ＳＥＺ６タンパク質またはその断片を認識するか、これと反応するか、結合するか、連結するか、競合するか、会合するか、または他の形で相互作用し、バルク腫瘍またはＮＴＧ細胞を含む腫瘍開始細胞または他の新生物性細胞の増殖を消失させるか、サイレンシングするか、低下させるか、阻害するか、妨害するか、制限するか、または制御する、任意のリガンド、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体またはその免疫活性断片もしくは免疫活性誘導体を含み得ることが認められよう。適合性のアンタゴニストは、ＳＥＺ６遺伝子型または表現型決定基を認識するかまたはこれと会合し、これにより、発現パターンを変化させるか、または基質、受容体、またはリガンドとのその結合もしくは相互作用を封鎖する、小分子阻害剤、アプタマー、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど、受容体分子またはリガンド分子およびこれらの誘導体をさらに含む。
本明細書において使用される通り、アンタゴニストとは、特定のタンパク質または指定されたタンパク質の活性であって、受容体のリガンドへの結合、または酵素の基質との相互作用を含む活性を中和するか、遮断するか、阻害するか、失効化するか、低下させるか、またはこれらに干渉することが可能な分子を指す。より一般に、本発明のアンタゴニストは、抗体およびそれらの抗原結合性断片もしくは誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、生体有機分子、ペプチド模倣薬剤、薬理作用物質およびそれらの代謝物、転写制御配列および翻訳制御配列などを含み得る。アンタゴニストはまた、タンパク質に特異的に結合し、これにより、その基質標的へのその結合を封鎖する、小分子阻害剤、融合タンパク質、受容体分子、および誘導体、タンパク質のアンタゴニストバリアント、タンパク質へと方向づけられたアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、およびタンパク質に対するリボザイムも含み得る。
本明細書で使用され、２つまたはこれを超える分子または化合物へと適用される「〜を認識する」または「会合する」という用語は、１つの分子が、他の分子に対して効果を及ぼす、分子の、共有結合的または非共有結合的な、反応、結合、特異的結合、連結、相互作用、接続、連結、統合、癒合、融合、または接合を意味するように理解するものとする。
さらに、本明細書の実施例で実証される（例えば、図１１を参照されたい）通り、ヒトＳＥＺ６の一部のモジュレーターは、ある特定の場合、ヒト以外の種（例えば、ラットまたはカニクイザル）に由来するＳＥＺ６と交差反応する。他の場合、例示的なモジュレーターは、ヒトＳＥＺ６の１または複数のアイソフォームに特異的であることが可能であり、他の種に由来するＳＥＺ６オルソログとの交差反応性を呈示しないであろう。当然ながら、本明細書の教示と共に、このような実施形態は、単一の種に由来する、２つまたはこれを超えるＳＥＺ６ファミリーメンバーと会合するパンＳＥＺ６抗体、またはＳＥＺ６ともっぱら会合する抗体を含み得る。
いずれにせよ、かつ、下記でより詳細に論じられる通り、当業者ならば、開示されているモジュレーターを、コンジュゲート形態または非コンジュゲート形態において使用し得ることを認められよう。すなわち、モジュレーターは、薬学的活性化合物、生物学的応答修飾因子、抗がん剤、細胞傷害性もしくは細胞分裂阻害剤、診断部分、または生体適合性修飾因子へと会合またはコンジュゲートさせる（例えば、共有結合的に、または非共有結合的に）ことができる。この点において、このようなコンジュゲートが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣薬剤、合成薬物、無機分子、有機分子、および放射性同位体を含むことができることが理解されよう。さらに、本明細書で指し示される通り、選択されたコンジュゲートは、ＳＥＺ６モジュレーターへと、コンジュゲーションを実行するのに使用される方法に少なくとも部分的に応じて、様々なモル比で、共有結合的に連結することもでき、非共有結合的に連結することもできる。
Ｖ．モジュレーターの製作および供給
Ａ．抗体によるモジュレーター
１.概観
既に示唆した通り、本発明の特に好ましい実施形態は、ＳＥＺ６の１または複数のアイソフォームと優先的に会合する（および、任意選択で、他のＳＥＺ６ファミリーメンバーと交差反応し得る）、抗体の形態のＳＥＺ６モジュレーターを含む。当業者ならば、例えば、それらのそれぞれが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Abbasら、「Cellular and Molecular Immunology」６版、W.B. Saunders Company（２０１０年）またはMurpheyら、「Janeway’s Immunobiology」、８版、Garland Science（２０１１年）において示される基盤など、抗体について十分に展開された知見の基盤を認められよう。
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および霊長動物抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、イントラボディー、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ムテインおよびそれらのバリアントを含む合成抗体；Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖ＦｖＦｃ、単鎖Ｆｖ；ならびにＦｃ融合体および他の修飾を含むこれらの誘導体などの抗体断片、ならびに、それらが、所望の生物学的活性（すなわち、抗原との会合または結合）を呈示する限りにおいて、他の任意の免疫活性分子を含む。さらに、用語は、抗体の全てのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）および全てのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のほか、文脈がそれ以外を示さなければ、これらの変異形もさらに含む。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ、およびμにより表記される。任意の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの顕著に異なることが明らかな種類のうちの１つへと割り当てることができる。
全てのこのような抗体が本発明の範囲内にあるが、例示だけを目的として、免疫グロブリンのＩｇＧクラスを含む好ましい実施形態について、ある程度詳細に論じられるであろう。しかし、このような開示は、例示的な組成物および本発明を実施する方法を実証するだけのものであり、いかなる形であれ、本発明の範囲またはこれに添付する特許請求の範囲を限定するものではないことが理解されるであろう。
周知の通り、軽鎖（ＶＬ）部分および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインは、抗原の認識および特異性を決定し、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動度、循環半減期、補体結合など、重要な生物学的特性を付与し、これら調節する。
「可変」領域は、軽鎖可変ドメイン内および重鎖可変ドメイン内のいずれにおいても、相補性決定領域（ＣＤＲ）と一般に称する３つのセグメントにおいて顕在化する超可変部位を含む。可変ドメインのうちの、より高度に保存的な部分であって、ＣＤＲを挟む部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する。例えば、自然発生の単量体の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体では、「Ｙ」字型の各アーム上に存在する６つのＣＤＲは、抗体が水性環境においてその三次元的立体配置をとるときに抗原結合部位を形成するように特異的に配置された、短く非連続のアミノ酸配列である。したがって、自然発生の各ＩｇＧ抗体は、２つの同一な結合部位であって、Ｙ字型の各アームのアミノ末端に近位の結合部位を含む。
当業者ならば、標準的な技法を使用して、ＣＤＲの位置を容易に同定し得ることが認められよう。当業者はまた、Kabatら（１９９１年、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号、National Technical Information Service、Springfield、Va.）において記載されている、番号付けシステムにも精通している。これに関して、Kabatらは、可変ドメイン配列のための番号付けシステムであって、任意の抗体へと適用可能な番号付けシステムを規定した。当業者ならば、配列それ自体以外のいかなる実験データにも依存せずに、この「Ｋａｂａｔによる番号付け」システムを、任意の可変ドメイン配列へと、明確に割り当てることができる。そうでないことが指定されない限りにおいて、抗体内の特異的なアミノ酸残基位置についての番号付けに対する言及は、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムに従う。
したがって、Ｋａｂａｔによれば、ＶＨでは、残基３１〜３５は、ＣＤＲ１を含み、残基５０〜６５は、ＣＤＲ２を構成し、残基９５〜１０２は、ＣＤＲ３を含むが、ＶＬでは、残基２４〜３４は、ＣＤＲ１であり、残基５０〜５６は、ＣＤＲ２を含み、残基８９〜９７は、ＣＤＲ３を構成する。この文脈のＶＨでは、ＦＲ１は、アミノ酸１〜３０を包含する可変領域のドメインに対応し；ＦＲ２は、アミノ酸３６〜４９を包含する可変領域のドメインに対応し；ＦＲ３は、アミノ酸６６〜９４を包含する可変領域のドメインに対応し；ＦＲ４は、アミノ酸１０３〜可変領域の末端にわたる可変領域のドメインに対応する。軽鎖のＦＲも同様に、軽鎖可変領域ＣＤＲのそれぞれにより隔てられている。
ＣＤＲは、抗体ごとに大幅に変化する（かつ、定義上、Ｋａｂａｔによるコンセンサス配列との相同性を呈示しない）ことに留意されたい。加えて、種間の相違または対立遺伝子間の相違のために、所与の任意のＫａｂａｔ部位番号におけるある特定の個々の残基の識別も、抗体鎖ごとに変化し得る。代替的な番号付けは、Chothiaら、J. Mol. Biol.、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）およびMacCallumら、J. Mol. Biol.、２６２巻：７３２〜７４５頁（１９９６年）において示されているが、Ｋａｂａｔの場合と同様、ＦＲの境界は、上記に記載した、それぞれのＣＤＲ末端により隔てられている。また、定義が、互いに照らして比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む、Chothiaら、Nature、３４２巻、８７７〜８８３頁（１９８９年）およびS. Dubel編、「Handbook of Therapeutic Antibodies」、３版、WILEY-VCH Verlag GmbH and Co.（２００７年）も参照されたい。上述の参考文献のそれぞれは、参照によりそれら全体において本明細書に組み込まれ、上記で引用された参考文献のそれぞれにより規定される結合領域またはＣＤＲを含むアミノ酸残基を、比較のために、下記の表１に示す。
より特定すると、抗体配列内の可変領域およびＣＤＲは、（ｉ）上記で論じられた一般的規則など、当技術分野で開発された一般的規則に従い同定することもでき、（ｉｉ）配列を、公知の可変領域のデータベースに照らしてアラインさせることにより同定することもできる。これらの領域を同定するための方法については、KontermannおよびDubel編、「Antibody Engineering」、Springer、New York、NY、２００１年およびDinarelloら、「Current Protocols in Immunology」、John Wiley and Sons Inc.、Hoboken、NJ、２０００年において記載されている。抗体配列の例示的なデータベースについては、Retterら、Nucl. Acids Res.、３３巻（データベース特集号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４頁（２００５年）において記載されている通り、www.bioinf.org.uk/abs（Department of Biochemistry ＆ Molecular Biology University College London、London、EnglandのA.C. Martinにより維持されている）における「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト、およびwww.vbase2.orgにおけるＶＢＡＳＥ２ウェブサイトにおいて記載されており、これらを介してアクセスすることができる。これに関して、Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトでは、対象の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の核酸配列またはアミノ酸配列を入力すると、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を自動的に表示し（一般に使用される番号付けシステムのうちのいずれかに準拠して）、これらの注釈を施すであろう。さらに、Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトはまた、ＣＤＲを容易に同定するために開発された一般的規則であって、本明細書の教示に従い使用することができる一般的規則も含む。本発明の文脈では、開示されている軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲであって、図１０Ａまたは図１０Ｂにおいて示されるマウス可変領域アミノ酸配列から誘導した軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲのうちのいずれかを組み合わせるか、または再配列して、本教示に従い最適化された、抗ＳＥＺ６（例えば、ヒト化抗ｈＳＥＺ６、ＣＤＲグラフト抗ｈＳＥＺ６、またはキメラ抗ｈＳＥＺ６）抗体をもたらし得ることが認められよう。すなわち、図１０Ａに示される軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２０〜１６８、偶数）または図１０Ｂに示される重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２１〜１６９、奇数）から誘導したＣＤＲのうちの１または複数を、ＳＥＺ６モジュレーター内に組み込むことができ、特に好ましい実施形態において、１または複数のＳＥＺ６アイソフォームと免疫特異的に会合するＣＤＲグラフト化抗体内またはヒト化抗体内に組み込むことができる。このようなヒト化モジュレーターの軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号１７０〜１９２、偶数）および重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号１７１〜１９３、奇数；および１９４〜１９９）の例はまた、図１０Ａおよび１０Ｂにも示される。
ｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１（配列番号１９２）は、ヒト化軽鎖構築物であるｈＳＣ１７．２００（配列番号１９０）のバリアントであり、ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ１〜ｖＨ６（配列番号１９３〜１９８）は、ＳＣ１７．９０（配列番号１２７）から誘導した、重鎖構築物であるｈＳＣ．１５５（配列番号１８４）のバリアントであり、ｈＳＣ１６１ ｖＨ１（配列番号１９９）は、重鎖構築物であるｈＳＣ１７．１６１（配列番号１８９）のバリアントであることに留意されたい。下記でより詳細に論じられる通り、これらのバリアントは、親抗体の１または複数の生化学的特性を最適化するように、構築され、調べられた。例示的なヒト化抗体である、ｈＳＣ１７．２００およびｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１の全長アミノ酸配列を、図１０Ｃに、配列番号４００〜４０２として示す。ヒト化抗体バリアントであるｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１は、ヒト化抗体ｈＳＣ１７．２００から誘導しており、一般的なＨＣを、ｈＳＣ１７．２００抗体と共有する。したがって、ｈＳＣ１７．２００の全長ＬＣおよび全長ＨＣは、それぞれ、配列番号４００および４０１に対応し、ｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１の全長ＬＣおよび全長ＨＣは、それぞれ、配列番号４０３および４０１に対応する。
まとめると、これらの新規のアミノ酸配列は、本発明に従う、例示的な、７５のマウスモジュレーターおよび１１のヒト化モジュレーターを表示する（報告されたバリアントと共に）。さらに、図１０Ａおよび１０Ｂに示される、７５の例示的なマウスモジュレーターおよび１１のヒト化モジュレーターならびにバリアントのそれぞれの、対応する核酸配列も、本出願の配列表に組み入れる（配列番号２２０〜３９９）。
図１０Ａおよび１０Ｂで注釈を施されたＣＤＲは、Ｋａｂａｔによる番号付けを使用して規定する。しかし、本明細書で論じられ、下記の実施例８で実証される通り、当業者であれば、Chothiaら、MacCallumら、またはＡｂｙｓｉｓもしくはＶＢａｓｅ２など、ウェブサイトデータベースのうちの１つにより規定されるＣＤＲを、図１０Ａまたは図１０Ｂに示されるそれぞれの重鎖配列および軽鎖配列のそれぞれについて、容易に規定し、同定し、誘導させ、かつ／または列挙し得るであろう。したがって、全てのこのような命名法により規定されるＣＤＲを含む、対象のＣＤＲおよび抗体のそれぞれは、本発明の範囲内に明示的に含まれる。「可変領域ＣＤＲのアミノ酸残基」またはより単純に「ＣＤＲ」という用語は、上記で示した、任意の配列ベース方法のまたは構造ベースの方法を使用して同定される、ＣＤＲ内のアミノ酸を含む。
本出願で論じられる、任意の重鎖定常領域のアミノ酸位置について、番号付けは、シークエンシングされた最初のヒトＩｇＧ１であることが報告されている、骨髄腫タンパク質であるＥｕのアミノ酸配列について記載する、Edelmanら、１９６９年、Proc、Natl. Acad. Sci. USA、６３巻（１号）：７８〜８５頁において最初に記載されたＥｕインデックスに従う。ＥｄｅｌｍａｎによるＥｕインデックスはまた、Kabatら、１９９１年（前掲）においても示されている。したがって、重鎖の文脈における「Ｋａｂａｔにより示されるＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔによるＥＵインデックス」という用語は、Kabatら、１９９１年（前掲）で示される、ＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１によるＥｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域のアミノ酸配列に使用される番号付けシステムも、Kabat、１９９１年において同様に示されている。本発明に適合性の、例示的なカッパＣＬおよびＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列を、添付の配列表内の配列番号４０３および４０４として示す。当業者ならば、開示されている定常領域配列を、本発明のＳＥＺ６抗体内およびＡＤＣ内に組み込まれ得る、全長抗体をもたらすように、標準的な分子生物学法を使用して、開示されている重鎖および軽鎖可変領域と接合し得ることを認められよう。
下記の実施例で示す通り、本発明の選択された実施形態は、ＳＥＺ６に免疫特異的に結合するマウス抗体であって、「供給源」抗体または「基準」抗体と考えられ得る抗体を含む。他の実施形態において、本発明により企図される抗体は、供給源抗体の定常領域またはエピトープ結合性アミノ酸配列の任意選択の修飾により、このような「供給源」抗体または「基準」抗体から誘導させることができる。一実施形態において、供給源抗体内の選択されたアミノ酸を、欠失、突然変異、置換、組込み、または組合せにより変化させる場合、抗体は、供給源抗体から「誘導」される。別の実施形態において、「誘導」抗体は、供給源抗体の断片（例えば、１または複数のＣＤＲまたは全可変領域）を、誘導体抗体（例えば、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、またはヒト化抗体）をもたらすように、アクセプター抗体配列と組み合わせるか、またはアクセプター抗体配列へと組み込んだ抗体である。これらの「誘導」（例えば、ヒト化またはＣＤＲグラフト）抗体は、標準的な分子生物学法を使用して、例えば、決定基に対するアフィニティーを改善するか；細胞培養物中の産生および収率を改善するか； ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫原性を低下させるか；毒性を低下させるか；活性部分のコンジュゲーションを容易とするか；または多重特異的抗体を創出するなど、様々な理由で作製することができる。このような抗体はまた、化学的手段または翻訳後修飾を介する成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはＰＥＧ化）により、供給源抗体から誘導させることもできる。本発明の「供給源」マウス抗体の例は、ＳＣ１７．１５５、ＳＣ１７．１６１、およびＳＣ１７．２００であり、このような供給源抗体から誘導した抗体の例は、ｈＳＣ１７．１５５、ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ１〜ｖＨ５（ＳＣ１７．１５５から誘導した）；ｈＳＣ１７．１６１ ｖＬ１（ＳＣ１７．１６１から誘導した）；およびｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１（ｈＳＣ１７．２００から誘導した）である。
２．抗体によるモジュレーターの作製
ａ．ポリクローナル抗体
当技術分野では、ウサギ、マウス、ラットなどを含む、多様な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生が周知である。一部の実施形態では、ポリクローナル抗ＳＥＺ６抗体含有血清は、動物から採血するか、またはこれを屠殺することにより得る。血清は、研究を目的として、動物から得られた形態で使用することもでき、代替的に、免疫グロブリン画分または均一な抗体調製物をもたらすように、抗ＳＥＺ６抗体を、部分的または完全に精製することもできる。
略述すると、選択された動物は、例えば、選択されたアイソフォーム、ドメイン、および／もしくはペプチド、またはＳＥＺ６もしくはその免疫反応性断片を発現する生細胞もしくは細胞調製物を含みうる、ＳＥＺ６免疫原（例えば、可溶性ＳＥＺ６またはｓＳＥＺ６）で免疫する。接種される種に応じて、免疫応答を増加させるのに使用されうる、当技術分野で公知のアジュバントは、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなど、潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定されない。このようなアジュバントは、局所的沈着物中に封鎖することにより、抗原を急速な散失から保護する場合もあり、マクロファージおよび免疫系の他の成分に対して走化性の因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有する場合もある。免疫スケジュールは、２回またはこれを超える、選択された免疫原の投与を所定の期間にわたり繰り広げることを伴うことが好ましい。
図１Ｃまたは図１Ｄに示される、ＳＥＺ６タンパク質のアミノ酸配列を解析して、抗体を作製するための、ＳＥＺ６タンパク質の特異的領域を選択することができる。例えば、ＳＥＺ６アミノ酸配列の疎水性および親水性解析を使用して、ＳＥＺ６構造内の親水性領域を同定する。免疫原性構造を示すＳＥＺ６タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ解析、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ解析、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ解析、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ解析、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ解析、またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析など、当技術分野で公知の、他の多様な方法を使用してたやすく同定することができる。平均可撓性プロファイルは、Bhaskaran R.、Ponnuswamy P. K.、１９８８年、Int. J. Pept. Protein Res.、３２巻：２４２〜２５５頁による方法を使用して作成することができる。ベータターンプロファイルは、Deleage, G.、Roux B.、１９８７年、Protein Engineering、１巻：２８９〜２９４頁による方法を使用して作成することができる。したがって、これらのプログラムまたは方法のうちのいずれかにより同定される、ＳＥＺ６領域、ＳＥＺ６ドメイン、またはＳＥＺ６モチーフの各々は、本発明の範囲内にあり、所望される特性を含むモジュレーターを生じさせる免疫原をもたらすように、単離または操作することができる。ＳＥＺ６抗体を作製するのに好ましい方法は、本明細書に提示される実施例により、さらに例示する。当技術分野では、免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法が周知である。当技術分野ではまた、タンパク質との、ＢＳＡ、ＫＬＨ、または他の担体タンパク質などの担体との免疫原性コンジュゲートを調製するための方法も周知である。ある状況では、例えば、カルボジイミド試薬を使用する、直接的なコンジュゲーションを使用するが、他の場合には、連結試薬が有効である。ＳＥＺ６免疫原の投与は、当技術分野で理解されている通り、適切な期間にわたり、適切なアジュバントの使用を伴う、注射により実行されることが多い。免疫スケジュール中には、抗体の力価を、下記の実施例で記載されている通りに測定して、抗体の形成が適正であることを決定することができる。
ｂ．モノクローナル抗体
加えて、本発明は、モノクローナル抗体の使用を意図する。当技術分野で公知の「モノクローナル抗体」（またはｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、少量で存在しうる可能な変異（例えば、天然に存在する変異）を除き、集団を構成する個々の抗体は、同一である。ある特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は、抗原に結合するか、またはこれと会合するポリペプチド配列を含む抗体であって、抗原結合性ポリペプチド配列が、単一の標的結合性ポリペプチド配列の、複数のポリペプチド配列からの選択を含むプロセスにより得られた抗体を含む。
より一般に、かつ本明細書の実施例６で例示される通り、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え技法、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））またはこれらのいくらかの組合せを含む、当技術分野で公知の多種多様な技法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、ならびに当技術分野で認知された生化学技法および遺伝子操作技法であって、それらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、An, Zhigiang（編）、Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic、John Wiley and Sons、１版、２００９年；Shireら（編）、Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing、Springer Science + Business Media LLC、１版、２０１０年；Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２版、１９８８年；Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas、５６３〜６８１頁（Elsevier、N.Y.、１９８１年）においてより詳細に記載されているような技法を使用して生成することができる。選択された結合性配列をさらに、変化させて、例えば、標的に対する親和性を改善し、標的結合性配列をヒト化し、細胞培養においてその産生を改善し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるその免疫原性を低減させ、多重特異性抗体を創製するなどをすることができること、および、変化させた標的結合性配列を含む抗体もまた、本発明の抗体であることを理解されたい。
ｃ．キメラ抗体
別の実施形態において、本発明の抗体は、共有結合的に接合されたタンパク質セグメントであって、少なくとも２つの異なる分子種または抗体の種類に由来するタンパク質セグメントから誘導されたキメラ抗体を含み得る。当技術分野で公知の通り、「キメラ」抗体という用語は、それらが、所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の分子種から誘導されるか、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は、別の分子種から誘導されるか、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体内、ならびにこのような抗体の断片内の対応する配列と同一であるかまたは相同である構築物を対象とする（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））。
一実施形態において、本明細書の教示に従うキメラ抗体は、マウスＶＨアミノ酸配列およびマウスＶＬアミノ酸配列ならびにヒト供給源から誘導された定常領域を含み得る。他の適合性の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、下記で記載されるヒト化抗体を含み得る。別の実施形態において、いわゆる「ＣＤＲグラフト」抗体である抗体は、特定の分子種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属するが、抗体鎖（複数可）の残りの部分は、別の分子種から誘導されるか、または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一であるかまたは相同である、１または複数のＣＤＲを含む。ヒトにおける使用のために、選択された齧歯動物ＣＤＲを、ヒト抗体へとグラフトし、ヒト抗体の自然発生の可変領域またはＣＤＲのうちの１または複数を置き換えることができる。これらの構築物は一般に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低下しながら、完全強度のモジュレーター機能（例えば、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用）など）をもたらす利点を有する。
ｄ．ヒト化抗体
「ヒト化」抗体は、ＣＤＲグラフト化抗体と類似している。本明細書において使用される、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態とは、１または複数の非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体とは、レシピエントのＣＤＲに由来する残基を、所望の特異性、アフィニティー、および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物など、非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する残基で置き換えた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体またはアクセプター抗体）である。ある特定の好ましい実施形態において、ヒト免疫グロブリンの可変ドメイン内の１または複数のＦＲ内の残基を、ドナー抗体に由来する対応する非ヒト残基で置き換えて、グラフトされたＣＤＲ（複数可）の適切な三次元的立体配置を維持し、これにより、アフィニティーを改善する一助とする。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の効能をさらに精緻化するように、レシピエント抗体内またはドナー抗体内で見出されない残基も含み得る。
ＣＤＲグラフティングおよびヒト化抗体については、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０および同５，６９３，７６２において記載されている。ヒト化抗体は、任意選択でまた、免疫グロブリンＦｃ、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細については、例えば、Jonesら、Nature、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および同７，０８７，４０９を参照されたい。さらに別の方法を、「ヒューマニアリング」と称し、これは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００５／０００８６２５において記載されている。加えて、非ヒト抗体はまた、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失またはＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において開示されている方法を介する「脱免疫化」により修飾することもできる。上述の参考文献のそれぞれは、その全体において本明細書に組み込まれる。
ヒト化抗体はまた、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも１つに由来する免疫グロブリン可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を、単離し、操作し、発現させることなど、一般的な分子生物学技法を使用して、バイオエンジニアリングすることもできる。上記で言及されたこのような核酸の供給源に加えて、例えば、Tomlinson, I. A.ら（１９９２年）、J. Mol. Biol.、２２７巻：７７６〜７９８頁；Cook, G. P.ら（１９９５年）、Immunol. Today、１６巻：２３７〜２４２頁；Chothia, D.ら（１９９２年）、J. Mol. Biol.、２２７巻：７９９〜８１７頁；Tomlinsonら（１９９５年）、EMBO J、１４巻：４６２８〜４６３８頁において開示されている通り、ヒト生殖細胞系列配列も利用可能である。Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリー（ＶＢＡＳＥ２：Retterら、Nucleic Acid Res.、３３巻；６７１〜６７４頁、２００５年）（Tomlinson,I.A.ら、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編纂されている）は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリーを提供している。また、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４において記載されている通り、ヒトコンセンサスＦＲも使用することができる。
選択された実施形態において、かつ、下記の実施例８で詳述される通り、ヒト化抗体の重鎖または軽鎖可変領域のアミノ酸残基のうちの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％は、レシピエントのＦＲ配列およびＣＤＲ配列のアミノ酸残基に対応するであろう。他の実施形態において、ヒト化抗体可変領域残基のうちの少なくとも８５％または９０％は、レシピエントのＦＲ配列およびＣＤＲ配列の残基に対応するであろう。さらに好ましい実施形態において、ヒト化抗体可変領域残基のうちの９５％超は、レシピエントのＦＲ配列およびＣＤＲ配列の残基に対応するであろう。
ｅ．ヒト抗体
別の実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体を含みる。「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより産生される抗体、および／またはヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を指す。
ヒト抗体は、当技術分野で公知の多様な技法を使用して生成することができる。１つの技法は、（好ましくはヒト）抗体のライブラリーを、ファージ上で合成し、そのライブラリーを、目的の抗原またはその抗体結合性部分でスクリーニングし、抗原に結合するファージを単離し、ここから免疫反応性断片を得ることができるファージディスプレイである。当技術分野では、このようなライブラリーを調製し、スクリーニングするための方法が周知であり、ファージディスプレイライブラリーを作製するためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、型番：２７−９４００−０１；および、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、型番：２４０６１２）。また、抗体ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングする際に使用されうる、他の方法および試薬も存在する（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９１／１７２７１号、同第ＷＯ９２／２０７９１号、同第ＷＯ９２／１５６７９号、同第ＷＯ９３／０１２８８号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／０９６９０号；および、Barbasら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照されたい）。
一実施形態では、組換えヒト抗体は、上記の通りに調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。一実施形態では、ライブラリーは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ ｃＤＮＡおよびヒトＶＨ ｃＤＮＡを使用して作製された、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。
ナイーブライブラリー（天然または合成のいずれか）により生成された抗体の親和性は、中程度（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫａ）でありうるが、また、当技術分野で記載されている通り、二次ライブラリーから構築および再選択することにより、親和性成熟も、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することができる。例えば、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、変異を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ランダムに導入することができる（Leungら、Technique、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）において報告されている）。加えて、親和性成熟は、例えば、目的のＣＤＲにわたりランダムな配列を保有するプライマーを伴うＰＣＲを使用して、選択された個々のＦｖクローンにおいて、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに変異させ、高親和性のクローンをスクリーニングすることにより実施することもできる。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ内で変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを創製するための方法について記載した。別の有効な手法は、Marksら、Biotechnol.、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、ファージディスプレイにより選択されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを、免疫されていないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーで組み換え、複数ラウンドにわたるチェインリシャッフリングにより、より高い親和性についてスクリーニングする手法である。この技法は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約１０−９Ｍまたはこれ未満の抗体および抗体断片の生成を可能とする。
他の実施形態では、それらの表面に結合対（binding pairs）を発現する真核細胞（例えば、酵母）を含むライブラリーを使用する、類似の手順を用いることができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／４０４，０５９を参照されたい。一実施形態では、ヒト抗体を、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択する（Vaughanら、Nature Biotechnology、１４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）：Sheetsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））。他の実施形態では、ヒト結合対は、酵母など、真核細胞内で作製されたコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離することができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２を参照されたい。このような技法は、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを可能とし、候補配列の比較的容易な操作（例えば、親和性成熟または組換えシャッフリングによる）をもたらすのに有利である。
ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化させ、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したマウスに導入することによっても作製することができる。感作すると、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む全ての点で、ヒトにおいて認められるヒト抗体に酷似するヒト抗体の産生が観察された。この手法は、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；同５，５４５，８０６；同５，５６９，８２５；同５，６２５，１２６；同５，６３３，４２５；同５，６６１，０１６、ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１および同６，１５０，５８４；ならびにLonbergおよびHuszar、Intern. Rev. Immunol.、１３巻：６５〜９３頁（１９９５年）において記載されている。代替的に、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化（このようなＢリンパ球は、新生物性障害を患う個体から回収することもでき、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて免疫することもできる）を介して調製することができる。例えば、Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、７７頁（１９８５年）；Boernerら、J. Immunol、１４７巻（１号）：８６〜９５頁（１９９１年）；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照されたい。
３．さらなるプロセシング
どのようにして得られるにせよ、モジュレーター産生細胞（例えば、ハイブリドーマコロニー、酵母コロニーなど）を、例えば、頑健な増殖、高度な抗体産生、および、下記でより詳細に論じられる通り、所望の抗体特徴を含む所望の特徴について選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、同系動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることもでき、免疫系を欠く動物、例えば、ヌードマウスにおいて増殖させることもでき、細胞培養物中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることもできる。当業者には、それらのそれぞれが個別の抗体分子種を産生するハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択し、クローニングし、増殖させる方法が周知である。
Ｂ．組換えモジュレーターの産生
１．概観
供給源が用意できたら、所望のＳＥＺ６モジュレーターをコードするＤＮＡを、従来の手順（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することを介する）を使用して、容易に単離し、シークエンシングすることができる。モジュレーターが抗体である場合は、単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞（またはファージ由来のコロニーもしくは酵母由来のコロニー）を、このようなＤＮＡの好ましい供給源として用いることができる。所望の場合は、核酸を本明細書に記載されている通りにさらに操作して、融合タンパク質、またはキメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト抗体を含む薬剤を創出することもできる。より特定すると、単離されたＤＮＡ（これは修飾することができる）を使用して、抗体を製造するための定常領域配列および可変領域配列をクローニングすることができる。
したがって、例示的な実施形態において、抗体は、従来の手順（Al-Rubeai；An、およびShireら、全て前掲、ならびにSambrook J.およびRussell D.、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（２０００年）；Ausubelら、「Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology」、Wiley, John & Sons, Inc.（２００２年）において示されている手順など）であって、単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞（またはファージ由来のコロニーもしくは酵母由来のコロニー）を、核酸分子の好ましい供給源として用いる手順を使用して、組換えにより産生することができる。
本明細書において使用される場合、用語「核酸分子」は、一本鎖であれ、二本鎖であれ、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子ならびにこれらの人工的バリアント（例えば、ペプチド核酸）を含むことを意図する。核酸は、本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体の一方または両方をコードし得る。本発明の核酸分子はまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、解析するか、突然変異させるか、または増幅するための、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、またはシークエンシングプライマーとしての使用に十分なポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸；および相補性配列も含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００ヌクレオチドもしくはこれを超える長さの場合もあり、かつ／または１もしくは複数のさらなる配列、例えば、調節配列を含む場合もあり、かつ／または大型の核酸、例えば、ベクターの一部の場合もある。このような核酸配列は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体を含むモジュレーターを創出するように、さらに操作し得ることが認められよう。より特定すると、単離された核酸分子（これは修飾することができる）を使用して、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１において記載されている抗体を製造するための定常領域配列および可変領域配列をクローニングすることができる。
「単離核酸」という用語は、この核酸が（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されたか、（ｉｉ）クローニングを介する組換えにより産生されたか、（ｉｉｉ）例えば、切断およびゲル電気泳動による分画を介して精製されたか、または（ｉｖ）例えば、化学合成により合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技法を介する操作に利用可能な核酸である。
抗体の所望の免疫反応性部分をコードする核酸の供給源が、ファージディスプレイ技術、酵母ライブラリー、ハイブリドーマベースの技術、または合成のいずれから得られるか、またはこれらのいずれに由来するのであれ、本発明は、抗体またはそれらの抗原結合性断片もしくは抗原結合性誘導体をコードする核酸分子および核酸配列を包含することを理解されたい。さらに、本発明は、このような核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞も対象とする。
ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技法によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子へと転換することができる。これらの操作では、ＶＬをコードするＤＮＡ断片またはＶＨをコードするＤＮＡ断片を、抗体定常領域または可撓性のリンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片へと作動的に連結する。この文脈で使用される「作動的に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片を、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列が、インフレームにとどまるように接合させることを意味する。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長重鎖遺伝子へと転換することができる。当技術分野では、ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Kabat, E. A.ら（１９９１年）、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、５版、U.S. Department of Health and Human Services、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。下記でより詳細に論じられる通り、本明細書の教示に適合性の、例示的なＩｇＧ１定常領域を、添付の配列表内の配列番号４０３として示す。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することができる。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）へと転換することができる。当技術分野では、ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Kabat, E. A.ら（１９９１年）、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、５版、U.S. Department of Health and Human Services、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。これに関して、例示的な適合性のカッパ軽鎖定常領域を、添付の配列表内の配列番号４０４として示す。
２．ハイブリダイゼーションおよび配列同一性
指し示される通り、本発明は、ある特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸とハイブリダイズする核酸もさらに提供する。より詳細には、本発明は、中程度の厳密性または高度な厳密性のハイブリダイゼーション条件（例えば、下記で規定される）下で、本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を包含する。当技術分野では、核酸をハイブリダイズさせるための方法が周知である。周知の通り、中程度に厳密なハイブリダイゼーション条件は、５倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄液、約５０％のホルムアミド、６倍濃度のＳＳＣ、および５５℃のハイブリダイゼーション温度によるハイブリダイゼーション緩衝液（またはハイブリダイゼーション温度を４２℃とする、約５０％のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション溶液など、他の類似のハイブリダイゼーション溶液）、ならびに０．５倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で６０℃の洗浄条件を含む。比較を目的として述べると、高度に厳密なハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼーションは、４５℃、６倍濃度のＳＳＣによる洗浄の後、６８℃、０．１倍濃度のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中で１または複数回にわたる洗浄を含む。さらに、当業者ならば、互いと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には、互いとのハイブリダイズを維持するように、ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を操作して、ハイブリダイゼーションの厳密性を増大または減少させることもできる。
本発明はまた、記載される核酸分子と「実質的に同一な」核酸分子も含む。一実施形態において、核酸配列に関して「実質的に同一な」という用語は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を呈示する核酸分子の配列とみなすことができる。他の実施形態において、核酸分子は、基準核酸配列との９５％または９８％の配列同一性を呈示する。
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータおよび適切な条件を案出するための指針は、例えば、Sambrook、Fritsch、およびManiatis（１９８９年、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、９および１１章；ならびに「Current Protocols in Molecular Biology」、１９９５年、Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.、２．１０および６．３〜６．４節）により示されており、当業者は、例えば、核酸の長さおよび／または塩基組成に基づき、容易に決定することができる。
配列同一性ともまた称する、ポリペプチドの配列類似性は、配列解析ソフトウェアを使用して測定することが典型的である。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、および他の修飾へと割り当てられる、類似性の尺度を使用して、類似する配列をマッチさせる。例えば、配列解析ツールであるＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）は、異なる種の生物に由来する相同なポリペプチドなど、近縁のポリペプチドの間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定するのに、デフォルトパラメータで使用することができる、「ＧＡＰ」および「ＢＥＳＴ−ＦＩＴ」などのプログラムを含有する（例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１またはDurbinら、「Biological Sequence Analysis: Probabilistic models of proteins and nucleic acids」、Cambridge Press（１９９８年）を参照されたい）。
ポリペプチド配列はまた、デフォルトパラメータまたは推奨されるパラメータを使用する、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１内のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の重複が最大となる領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提示する（Pearson（２０００年）、前掲）。本発明の配列を、異なる生物に由来する多数の配列を含有するデータベースと比較する場合、別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、とりわけ、デフォルトパラメータを使用する、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、それらのそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれる、Altschulら（１９９０年）J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁；およびAltschulら（１９９７年）Nucleic Acids Res.、２５巻：３３８９〜４０２頁を参照されたい。
これに関して、本発明はまた、抗体可変領域のポリペプチド配列（例えば、ドナー軽鎖可変領域もしくはドナー重鎖可変領域、アクセプター軽鎖可変領域もしくはアクセプター重鎖可変領域、または結果として得られるヒト化構築物）に関して「実質的に同一な」ポリペプチドをコードする核酸分子も含む。このようなポリペプチドへと適用される場合の「実質的な同一性」または「実質的に同一な」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用する、ＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴ−ＦＩＴプログラムなどにより最適にアラインされる場合、少なくとも６０％、または６５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９３％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖（Ｒ基）を有する、別のアミノ酸残基で置換する置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２つまたはこれを超えるアミノ酸配列が、保存的置換で互いと異なる場合には、配列同一性パーセントまたは類似度を、置換の保存的性質について補正するように、上方に調整することができる。
３．発現
ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質／ペプチドの組換え発現、すなわち、産生の様々な過程は、例えば、BergerおよびKimmel、「Guide to Molecular Cloning Techniques」、「Methods in Enzymology」、１５２巻、Academic Press, Inc.、San Diego、Calif.；Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（３版）１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.（２０００年）；ならびに「Current Protocols in Molecular Biology」、F. M. Ausubelら編、「Current Protocols」、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.との合弁事業体（２００６年までの増補）において示されている通り、周知である。
目的のいくつかの用語は、「発現制御配列」を含み、これは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。周知の通り、「プロモーター」または「プロモーター領域」は、一般に、発現させる核酸配列に対して上流（５’側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位および結合部位をもたらすことによりこの配列の発現を制御する核酸配列に関する。
本発明に従い適合性の、例示的なプロモーターは、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、およびＴ７ポリメラーゼのプロモーター、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ならびにこれらの人工のハイブリッドプロモーター（例えば、ＣＭＶによる）を含み、この場合、これらの１または複数の部分を、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）など、他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターの１または複数の部分へと融合させるが、さらなるイントロン（複数可）は、組み入れる場合もあり、組み入れない場合もある。
ある特定の実施形態において、核酸分子は、ベクター内に、適切な場合はこの核酸の発現を制御するプロモーターと共に存在し得る。周知の「ベクター」という用語は、前記核酸を、例えば、原核生物細胞および／または真核生物細胞へと導入し、適切な場合はゲノムへと組み込むことを可能とする、核酸のための任意の中間的なビヒクルを含む。当技術分野では、哺乳動物細胞を形質転換する方法が周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、同４，９１２，０４０、同４，７４０，４６１、および同４，９５９，４５５を参照されたい。ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体（例えば、全抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体のＶＨもしくはＶＬ、またはその部分、または重鎖ＣＤＲもしくは軽鎖ＣＤＲ、単鎖Ｆｖ、またはその断片もしくはバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含み得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８６／０５８０７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０１０３６号；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４を参照されたい）。
様々な宿主−発現ベクター系が市販されており、多くは、本明細書の教示に適合性であり、本発明のモジュレーターを発現させるのに使用することができる。このような系は、モジュレーターコード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）などの微生物；モジュレーターコード配列を含有する、組換え酵母発現ベクターをトランスフェクトされた酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属）；モジュレーターコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；モジュレーターコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス；タバコモザイクウイルス）を感染させるか、もしくはモジュレーターコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）をトランスフェクトされた植物細胞系（例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、バレイショなど）；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、牛痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞など）などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明のポリペプチドおよび抗原結合性分子を作製するように操作することができる任意の種類の細胞系を対象とする。一実施形態において、宿主細胞を、修飾糖形態を伴う抗原結合性分子の産生を可能とするように操作する。好ましい実施形態において、抗原結合性分子またはバリアントの抗原結合性分子は、抗体、抗体断片、または融合タンパク質である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）活性を有する、１または複数のポリペプチドを高レベルで発現させるようにさらに操作されている。適合性の宿主細胞は、培養細胞、例えば、少数だけを挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞などの哺乳動物培養細胞を含むが、また、トランスジェニック動物組織内、トランスジェニック植物組織内もしくは栽培植物組織内、または動物組織内に含まれる細胞も含む。
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには、安定的な発現が好ましい。これに応じて、選択されたモジュレーターを安定的に発現させる細胞系は、当技術分野で認知された標準的な技法を使用して操作することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択マーカーで形質転換することができる。当技術分野で周知の選択系のうちのいずれかであって、ある特定の条件下で発現を増強するのに効率的な手法をもたらす、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含む選択系を使用することができる。ＧＳ系は、それらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、ＥＰ特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号、同第０３２３９９７号、および同第０３３８８４１号；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９および同５，８７９，９３６との関連で全体的にまたは部分的に論じられる。別の好ましい発現系である、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ Ｋｉｔも、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより市販されており（型番Ａ１３６９６−０１）、これもまた、モジュレーター産生に使用し得る安定的な細胞系の開発を可能とする。
このような宿主発現系は、それを介して目的のコード配列を産生させ、その後、これを精製し得るビヒクルを表すが、また、適切なヌクレオチドのコード配列で形質転換するかまたはこれをトランスフェクトすると、ｉｎ ｓｉｔｕで本発明の分子を発現させ得る細胞も表す。宿主細胞には、本発明の２つの発現ベクター、例えば、重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第２のベクターを共トランスフェクトすることができる。
したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、抗体またはそれらの部分の発現を可能とする、組換え宿主細胞を提供する。本明細書では、このような組換え宿主細胞内の発現により産生される抗体を、組換え抗体と称する。本発明はまた、このような宿主細胞の後代細胞、およびこのような宿主細胞により産生される抗体ももたらす。
Ｃ．化学合成
加えて、モジュレーターは、当技術分野で公知の技法（例えば、Creighton、１９８３年、Proteins: Structures and Molecular Principles、W.H. Freeman & Co.、N.Y.；およびHunkapiller, M.ら、１９８４年、Nature、３１０巻：１０５〜１１１頁を参照されたい）を使用して、化学合成することもできる。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的なアミノ酸類似体（一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸）を、ポリペプチド配列への置換または付加として導入することもできる。
Ｄ．トランスジェニック系
他の実施形態において、モジュレーターを、免疫グロブリン重鎖配列および免疫グロブリン軽鎖配列などの組換え分子についてトランスジェニックであり、所望の化合物を回収可能な形態で産生する、哺乳動物または植物の作製を介して、トランスジェニック産生することもできる。これは、例えば、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物のミルク中のタンパク質モジュレーター（例えば、抗体）の産生、およびこのミルクからの回収を含む。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，８２７，６９０、同５，７５６，６８７、同５，７５０，１７２、および同５，７４１，９５７を参照されたい。一部の実施形態において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を、抗体を産生するように免疫化する。
他のトランスジェニック技法は、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual、２版、Cold Spring Harbor Press（１９９９年）; Jacksonら、Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach、Oxford University Press（２０００年）；およびPinkert、Transgenic Animal Technology： A Laboratory Handbook、Academic Press（１９９９年）；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，４１７，４２９において示されている。一実施形態において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマであり、所望の生成物は、血液、ミルク、尿、唾液、涙液、粘液、および他の体液中に産生され、これらから、当技術分野で認知された精製技法を使用して、容易に得ることができる。
他の適合性の産生系は、植物において抗体を作製するための方法であって、例えば、このような技法に関して本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０４６，０３７および同５，９５９，１７７において記載されている方法などの方法を含む。
Ｅ．単離／精製
本発明のモジュレーターを、組換え発現または開示されている他の技法のうちの他のいずれかにより作製したら、これを、免疫グロブリンまたはタンパク質を精製するための、当技術分野で公知の任意の方法により精製することができる。これに関して、モジュレーターは、「単離」することができるが、これは、モジュレーターが、同定され、その天然環境の構成要素から分離および／または回収されたことを意味する。その天然環境の夾雑構成要素とは、ポリペプチドの診断的使用または治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含み得る。単離されたモジュレーターは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないため、ｉｎ ｓｉｔｕの組換え細胞内のモジュレーターを含む。
所望の分子を、最初のステップとして細胞内で産生させる場合は、粒子状破砕物である、宿主細胞または溶解させた断片を、例えば、遠心分離または限外濾過により除去することができる。モジュレーターを培地中に分泌させる場合は、一般にまず、このような発現系に由来する上清を、市販されるタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットまたはＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）を使用して濃縮する。不溶性夾雑物を除去したら、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーなど、標準的な技法を使用して、モジュレーター調製物をさらに精製し得るが、アフィニティークロマトグラフィーが特に目的の技法である。これに関して、プロテインＡを、ヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖、またはヒトＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製するのに使用することができる（Lindmarkら、J Immunol Meth、６２巻：１頁（１９８３年））のに対し、プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に推奨される（Gussら、EMBO J、５巻：１５６７頁（１９８６年））。また、イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のセファロースクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。特に好ましい実施形態において、本発明のモジュレーターは、少なくとも部分的に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されるであろう。
ＶＩ．ＳＥＺ６モジュレーター断片およびＳＥＺ６モジュレーター誘導体
どのような作製および産生方法を選択するにせよ、本発明のモジュレーターは、標的決定基（例えば、抗原）と反応するか、これに結合するか、連結するか、これと複合体化するか、これに接続されるか、結合するか、接合するか、これと相互作用するか、または他の形で会合し、これにより、所望の結果をもたらすであろう。モジュレーターが、抗体またはその断片、構築物、もしくは誘導体を含む場合、このような会合は、抗体上に発現する、１または複数の「結合部位」または「結合性構成要素」を介する可能性があり、この場合、結合部位は、標的分子または目的の抗原への選択的結合の一因となる、ポリペプチドの領域を含む。結合性ドメインは、少なくとも１つの結合部位を含む（例えば、インタクトなＩｇＧ抗体は、２つの結合性ドメインおよび２つの結合部位を有するであろう）。例示的な結合性ドメインは、抗体可変ドメイン、リガンドの受容体結合性ドメイン、受容体のリガンド結合性ドメイン、または酵素ドメインを含む。
Ａ．抗体
上記で言及した通り、「抗体」という用語は、少なくとも、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体および霊長動物抗体、ヒト抗体、組換え作製抗体、イントラボディー、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびに合成抗体を対象とすることを意図する。
Ｂ．断片
本発明を実施するのにどのような形態のモジュレーター（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択するのかに関わらず、部位特異的抗体の免疫反応性断片を、本明細書の教示に従い使用しうることが認識される。「抗体断片」は、無傷抗体の少なくとも一部を含む。本明細書で使用される抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合性断片を含み、「抗原結合性断片」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片であって、選択された抗原もしくはその免疫原性決定基に免疫特異的に結合するか、もしくはこれと反応するか、または断片が由来する無傷抗体と、特異的抗原結合について競合するポリペプチド断片を指す。
例示的な断片は、ＶＬ断片、ＶＨ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディー、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。加えて、活性な断片は、抗原／基質または受容体と相互作用し、それらを、無傷抗体の場合と同様の様式で修飾する（おそらく、いくぶん効率は低いが）その能力を保持する、抗体の一部も含む。
他の実施形態では、抗体断片とは、Ｆｃ領域を含み、無傷抗体に存在する場合のＦｃ領域と通常関連する生物学的機能の少なくとも１つ、例えば、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能、および補体への結合を保持する断片である。一実施形態では、抗体断片とは、無傷抗体と実質的に同様のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性を断片に付与することが可能なＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含みうる。
当業者によりよく認識される通り、断片は、無傷抗体もしくは無傷抗体鎖または完全抗体もしくは完全抗体鎖の化学的処理または酵素的処理（パパインまたはペプシンなど）を介して得ることもでき、組換え手段により得ることもできる。抗体断片のより詳細な記載については、例えば、Fundamental Immunology、W. E. Paul編、Raven Press、N.Y.（１９９９年）を参照されたい。
Ｃ．誘導体
本発明は、１または複数の修飾を含む、免疫反応性のモジュレーター誘導体および抗原結合性分子もさらに含む。
１．多価抗体
一実施形態では、本発明のモジュレーターは、一価の場合もあり、多価（例えば、二価、三価など）の場合もある。本明細書で使用される「価数」という用語は、抗体に付随する潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、１つの標的分子または標的分子上の特異的位置もしくは特異的遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価である場合、分子の各結合部位は、単一の抗原上の位置またはエピトープに特異的に結合する。抗体が、１つを超える標的結合部位を含む（多価）場合、各標的結合部位は、同じ分子に特異的に結合する場合もあり、異なる分子に特異的に結合する場合もある（例えば、異なるリガンドに結合する場合もあり、異なる抗原に結合する場合もあり、あるいは同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合する場合もある）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照されたい。各場合に、結合部位のうちの少なくとも１つは、ＳＥＺ６アイソフォームと関連するエピトープ、モチーフ、またはドメインを含む。
一実施形態では、モジュレーターは、Millsteinら、１９８３年、Nature、３０５巻：５３７〜５３９頁において記載されている通り、２つの鎖が異なる特異性を有する、二重特異性抗体である。他の実施形態は、三重特異性抗体など、さらなる特異性を有する抗体を含む。他のより精巧な、適合性の多重特異性構築物およびそれらの製作方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５、ならびにＷＯ９４／０４６９０；Sureshら、１９８６年、Methods in Enzymology、１２１巻：２１０頁；ＷＯ９６／２７０１１において示されている。
上記で言及された通り、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合する場合もあり、標的分子および固体支持材料上の（or）異種ポリペプチドなどの異種エピトープの両方に免疫特異的に結合する場合もある。抗ＳＥＺ６抗体の好ましい実施形態は、２つの抗原だけに結合する（すなわち、二重特異性抗体である）が、本発明にはまた、三重特異性抗体など、さらなる特異性を有する抗体も包含される。二重特異性抗体はまた、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体も含む。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体のうちの一方をアビジンにカップリングさせ、他方をビオチンにカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を、望ましくない細胞に向けて標的化することが提案されており（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）、ＨＩＶ感染症の処置のためにも提案されている（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製することができる。当技術分野では、適切な架橋剤が周知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０において、多数の架橋技法と共に開示されている。
さらに他の実施形態では、当業者に周知の方法を使用して、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインなど、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。
２．Ｆｃ領域の修飾
上記で示した、開示される、モジュレーター（例えば、Ｆｃ−ＳＥＺ６または抗ＳＥＺ６抗体）の可変領域または結合性領域に対する多様な修飾、置換、付加、または欠失に加えて、当業者は、本発明の選択された実施形態はまた、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換または修飾も含みうることを認識する。より特定すると、本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、とりわけ、薬物動態の変化、血清中半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の低減、産生の増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）または「ＣＤＣ」（補体依存性細胞傷害作用）活性の増強または低減、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化、ならびに結合特異性の修飾を含むがこれらに限定されない、好ましい特徴を有する化合物を結果としてもたらす、１種または複数のさらなるアミノ酸残基の置換、変異、および／または修飾を含有しうることが意図される。これに関して、これらのＦｃ変異体は、開示されるモジュレーターの、有効な抗新生物特性を増強するように使用すると有利でありうることが認識される。
この目的で、本発明のある特定の実施形態は、Ｆｃ領域の置換または修飾、例えば、Ｆｃエフェクター機能が増強されているか、または好ましいＦｃエフェクター機能を有する化合物を生成するための、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、置換、変異、および／または修飾も含みうる。例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、ならびにＦｃＲｎ）との間の相互作用に関与するアミノ酸残基の変化は、細胞傷害作用の増加および／または血清中半減期の延長など、薬物動態の変化をもたらしうる（例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol、９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Capelら、Immunomethods、４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；ならびにde Haasら、J. Lab. Clin. Med.、１２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）を参照されたい）。
選択された実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期が延長した抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基を修飾すること（例えば、置換すること、欠失させること、または付加すること）により作製すことができる（例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号；同第ＷＯ０４／０２９２０７号；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照されたい）。このような実施形態に関して述べると、Ｆｃ変異体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける半減期であって、５日間を超える、１０日間を超える、１５日間を超える、好ましくは、２０日間を超える、２５日間を超える、３０日間を超える、３５日間を超える、４０日間を超える、４５日間を超える、２カ月間を超える、３カ月間を超える、４カ月間を超える、または５カ月間を超える半減期をもたらしうる。半減期の延長は、より高い血清中力価を結果としてもたらし、これにより、抗体の投与頻度を低減し、かつ／または投与される抗体の濃度を低減する。ヒトＦｃＲｎへのｉｎ ｖｉｖｏにおける結合、およびヒトＦｃＲｎへの高親和性の結合性ポリペプチドの血清中半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現する、トランスジェニックマウスまたはトランスフェクトされたヒト細胞系においてアッセイすることもでき、または変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長動物においてアッセイすることもできる。ＷＯ２０００／４２０７２では、ＦｃＲｎへの結合が改善されたかまたは減少した抗体変異体について記載されている。例えば、また、Shieldsら、J. Biol. Chem.、９巻（２号）：６５９１〜６６０４頁（２００１年）も参照されたい。
他の実施形態では、Ｆｃの変化は、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性の増強または低減をもたらしうる。当技術分野で公知の通り、ＣＤＣとは、補体の存在下における標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣとは、分泌されたＩｇが、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃＲに結合することにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原保有標的細胞に特異的に結合し、続いて、細胞毒素により標的細胞の死滅化を可能とする、細胞傷害作用の一形態を指す。本発明の文脈では、ＦｃＲへの結合親和性を「変化させた」抗体変異体であって、親抗体もしくは非修飾抗体と比較して、または天然配列のＦｃＲを含む抗体と比較して、結合性が増強または減少したかのいずれかの抗体変異体が提供される。結合性の低下を提示するこのような変異体は、感知できる結合性をほとんどまたは全く保有し得ず、例えば、当技術分野で周知の技法により決定されるとおり、ＦｃＲへの結合性は、例えば、天然配列と比較して０〜２０％である。他の実施形態では、変異体は、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して、結合性の増強を呈示する。Ｆｃ変異体のこれらの種類は、開示される抗体の有効な抗新生物特性を増強するように使用すると有利でありうることが認識される。さらに他の実施形態では、このような変化は、結合親和性の増加、免疫原性の低減、産生の増加、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位について）、結合特異性の修飾、食作用の増加；および／または細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体：ＢＣＲ）の下方調節などをもたらす。
３．グリコシル化の変化
さらに他の実施形態は、１つまたは複数の操作された糖形態、すなわち、グリコシル化パターンの変化またはタンパク質（例えば、Ｆｃドメインにおいて）に共有結合で結合させた炭水化物組成の変化を含むＳＥＺ６モジュレーターを含む。例えば、Shields, R. L.ら（２００２年）、J. Biol. Chem.、２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁を参照されたい。操作された糖形態は、エフェクター機能を増強もしくは低減すること、標的に対するモジュレーターの親和性を増加させること、またはモジュレーターの生成を容易とすることを含むがこれらに限定されない、様々な目的に有用でありうる。エフェクター機能の低減が所望される、ある特定の実施形態では、その分子を、非グリコシル化形態を発現するように操作することができる。１つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の消失を結果としてもたらして、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させうる置換が周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０および同６，３５０，８６１を参照されたい）。逆に、１つまたは複数のさらなるグリコシル化部位において操作することにより、エフェクター機能の増強または結合性の改善を、Ｆｃ含有分子に付与することもできる。
他の実施形態は、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体、または二分枝型ＧｌｃＮＡｃ構造を増加させた抗体など、グリコシル化組成を変化させたＦｃ変異体を含む。このようなグリコシル化パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが実証されている。操作された糖形態は、当業者に公知の任意の方法により作製することができ、例えば、操作された発現株または変異体の発現株を使用することにより作製することもでき、１種または複数の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））との共発現により作製することもでき、多様な生物または多様な生物に由来する細胞系においてＦｃ領域を含む分子を発現させることにより作製することもでき、Ｆｃ領域を含む分子を発現させた後で、炭水化物（複数可）を修飾することにより作製することもできる（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２を参照されたい）。
４．さらなるプロセシング
モジュレーターは、生成の間に、または生成後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結などにより差次的に修飾することができる。多数の化学修飾のうちのいずれかを、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下における代謝的合成などを含むがこれらに限定されない公知の技法により実行することができる。
本発明に包含される多様な翻訳後修飾は、例えば、Ｎ結合型炭水化物鎖またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、化学部分のアミノ酸主鎖への結合、Ｎ結合型炭水化物鎖またはＯ結合型炭水化物鎖の化学修飾、および原核宿主細胞の発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失を含む。さらに、モジュレーターはまた、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素による標識、または親和性標識などの検出標識であって、モジュレーターの検出および単離を可能とする検出標識で修飾することもできる。
ＶＩＩ．モジュレーターの特徴
モジュレーターが、どのようにして得られたのであれ、上述の形態のうちのいずれの形態を取るのであれ、開示されているモジュレーターの様々な実施形態は、ある特定の特徴を呈示し得る。選択された実施形態において、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマコロニーまたは酵母コロニー）を、例えば、頑健な増殖、高度なモジュレーター生成、および下記でより詳細に論じられる通り、所望のモジュレーター特徴を含む、好適な特性について選択し、クローニングし、さらにスクリーニングすることができる。他の場合には、モジュレーターの特徴は、特定の抗原（例えば、特異的ＳＥＺ６アイソフォームまたはその断片）または標的抗原の免疫反応性断片を、動物への接種のために選択することにより付与するかまたはこれに影響を及ぼすことができる。さらに他の実施形態において、選択されたモジュレーターは、上記に記載した通り、アフィニティーまたは薬物動態など、免疫化学的特徴を増強または精緻化するように操作することができる。
Ａ．中和モジュレーター
ある特定の実施形態において、モジュレーターは、「中和」抗体またはその誘導体もしくは断片を含むであろう。すなわち、本発明は、特異的ドメイン、特異的モチーフ、または特異的エピトープに結合し、ＳＥＺ６の生物学的活性を遮断、低減、または阻害することが可能な抗体分子を含み得る。より一般に、「中和抗体」という用語は、標的分子またはリガンドに結合するかまたはこれらと相互作用し、標的分子の、受容体または基質などの結合性パートナーへの結合または会合を防止し、これにより、そうでなければ分子の相互作用から生じる生物学的応答を妨げる抗体を指す。
当技術分野で公知の競合的結合アッセイを使用して、抗体またはその免疫機能的断片もしくは誘導体の結合および特異的を評価し得ることが認められよう。本発明に関して述べると、例えば、神経栄養因子リガンド活性の低下により、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける競合的結合アッセイにおいて測定される通り、過剰な抗体により、ＳＥＺ６へと結合した結合パートナーの量が、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはこれを超えて低減される場合、抗体または断片は、ＳＥＺ６の、結合性パートナーまたは基質（例えば、神経栄養因子リガンド）への結合を阻害または低減すると考えられるであろう。例えば、ＳＥＺ６に対する抗体の場合、中和抗体またはアンタゴニストは、リガンド活性を、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはこれを超えて変化させることが好ましいであろう。この修飾活性は、当技術分野で認知された技法を使用して直接測定することもでき、変化した活性が下流に及ぼす影響（例えば、腫瘍形成、細胞の生存、または経路の活性化）により測定することもできることが認められよう。
Ｂ．内部移行モジュレーター
証拠では、ＳＥＺ６またはその選択されたアイソフォームは、可溶性形態で存在し得ることが指し示されているが、少なくとも一部のＳＥＺ６は、細胞表面との会合を維持する可能性が高く、これにより、開示されているモジュレーターの内部移行を可能とする。したがって、本発明の抗ＳＥＺ６抗体は、ＳＥＺ６を発現させる細胞により、少なくともある程度は内部移行され得る。例えば、腫瘍開始細胞の表面上でＳＥＺ６に結合する抗ＳＥＺ６抗体は、腫瘍開始細胞により内部移行され得る。特に好ましい実施形態において、このような抗ＳＥＺ６抗体を、内部移行すると細胞を死滅させる細胞傷害性部分などの抗がん剤へと、会合またはコンジュゲートさせることができる。特に好ましい実施形態において、モジュレーターは、内部移行抗体薬物コンジュゲートを含むであろう。
本明細書で使用される「内部移行する」モジュレーターとは、関連する抗原または受容体に結合すると、細胞により取り込まれる（任意のペイロードと共に）モジュレーターである。認識される通り、好ましい実施形態では、モジュレーターは、抗体断片およびその抗体誘導体含む抗体、ならびに抗体コンジュゲートを含みうる。内部移行は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生じる場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏで生じる場合もある。治療的適用では、内部移行は、それを必要とする被験体において、ｉｎ ｖｉｖｏで生じることが好ましい。内部移行される抗体分子の数は、抗原発現細胞、とりわけ抗原を発現するがん幹細胞を死滅させるのに十分であるかまたは適正でありうる。場合によって、抗体または抗体コンジュゲートの効力に応じて、単一抗体分子の細胞への取込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある特定の毒素は、抗体にコンジュゲートさせた少数の毒素分子の内部移行が、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である程度に、高度に強力である。抗体が、哺乳動物細胞に結合すると、内部移行するのかどうかは、多様なアッセイであって、下記の実施例（例えば、実施例１５、１７および１８）で記載されるアッセイを含むアッセイにより決定することができる。抗体が細胞に内部移行するかどうかを検出する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８において記載されている。
Ｃ．枯渇化モジュレーター
他の実施形態では、抗体は、枯渇化抗体またはその誘導体もしくは断片を含む。「枯渇化」抗体という用語は、好ましくは、細胞表面上または細胞表面近傍において、抗原に結合するかまたはこれと会合し、細胞の死滅または消失を誘導するか、促進するか、または引き起こす（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは細胞傷害剤の導入によって）抗体を指す。一部の実施形態では、選択された枯渇化抗体を、細胞傷害剤と会合させるかまたはこれにコンジュゲートさせる。
枯渇化抗体は、定義された細胞集団内のＳＥＺ６腫瘍形成性細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％を除去するか、失わせるか、消失させるか、または死滅させうることが好ましい。一部の実施形態では、細胞集団は、富化された、区分された（sectioned）、精製された、または単離された腫瘍永続細胞を含みうる。他の実施形態では、細胞集団は、腫瘍永続化細胞を含む、全腫瘍試料を含む場合もあり、不均一な腫瘍抽出物を含む場合もある。当業者は、下記実施例（例えば、実施例１４および１５）に記載されるような本明細書の教示に従い、標準的な生化学的技法を使用して、腫瘍形成性細胞または腫瘍永続細胞の枯渇をモニタリングおよび定量しうることを認識する。
Ｄ．ビニングおよびエピトープマッピング
開示される抗ＳＥＺ６抗体モジュレーターは、選択された標的またはその断片により提示される、個別のエピトープまたは免疫原性決定基と会合するかまたはこれに結合することがさらに認識される。ある特定の実施形態では、エピトープまたは免疫原性決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基など、化学的に活性の表面基（grouping）を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴、および／または特異的な電荷特徴を有しうる。したがって、本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体への特異的結合、または他の形での分子との相互作用が可能な任意のタンパク質決定基を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それがタンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合する（または免疫特異的に結合するかまたは反応する）という。好ましい実施形態では、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が、１０−６Ｍ未満であるかもしくはこれと等しいか、または１０−７Ｍ未満であるかもしくはこれと等しい場合に、より好ましくは、平衡解離定数が、１０−８Ｍ未満であるかもしくはこれと等しく、なおより好ましくは、該解離定数が、１０−９Ｍ未満であるかもしくはこれと等しい場合に、抗原に特異的に結合するという。
より直接的に、「エピトープ」という用語は、その一般的な生化学的意味で使用され、特定の抗体モジュレーターにより認識され、これが特異的に結合することが可能な標的抗原の部分を指す。抗原が、ＳＥＺ６などのポリペプチドである場合、エピトープは一般に、連続アミノ酸およびタンパク質が三次元に折り畳まれて近接した非連続アミノ酸（「コンフォメーションエピトープ」）の両方から形成されうる。このようなコンフォメーションエピトープでは、相互作用点は、線状としては互いから隔てられたタンパク質上のアミノ酸残基にわたり生じる。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（場合によって、「線状」エピトープまたは「連続」エピトープと称する）は、タンパク質が変性しても保持されることが典型的であるのに対し、三次元に折り畳まれて形成されるエピトープは、タンパク質が変性すると失われることが典型的である。いずれにせよ、抗体エピトープは、固有の空間的コンフォメーションにおいて、少なくとも３つ、より通例では、少なくとも５つまたは８〜１０個のアミノ酸を含むことが典型的である。
これに関して、ある特定の実施形態では、エピトープは、ＳＥＺ６タンパク質の１つまたは複数の領域、ドメイン、またはモチーフ（例えば、成熟アイソフォーム１のアミノ酸１〜９０６）と関連するか、またはこれらの中に存在し得ることが認識される。本明細書でより詳細に論じられる通り、ＳＥＺ６タンパク質の細胞外領域は、一連の、一般に認識されたドメインであって、５つのＳｕｓｈｉドメインおよびＮ末端ドメインを伴う２つのＣＵＢドメインを含むドメインを含む。本開示の目的では、「ドメイン」という用語は、その一般に受け入れられた意味に従い使用され、タンパク質内の、同定可能または定義可能である、保存的な構造実体であって、特色のある二次構造内容を呈示する構造実体を指すと考えられる。多くの場合、共通の機能を有する相同的ドメインは通例、配列類似性を示し、多数の異なるタンパク質内で見出される（例えば、Ｓｕｓｈｉドメインは、多数の異なるタンパク質内で見出されることが報告されている）。同様に、当技術分野で認識されている「モチーフ」という用語は、その一般的な意味に従い使用され、一般に、短く保存的なタンパク質の領域であって、典型的に、１０〜２０の連続アミノ酸残基である領域を指すものとする。本明細書を通して論じられる通り、選択された実施形態は、ＳＥＺ６の特異的領域内、特異的ドメイン内、または特異的モチーフ内のエピトープと会合するかまたはこれに結合するモジュレーターを含む。
いずれにせよ、抗原上の所望されるエピトープを決定したら、例えば、本発明で記載される技法を使用して、エピトープを含むペプチドで免疫することにより、そのエピトープに対する抗体を作製することが可能である。代替的に、発見プロセスの間、抗体を作製および特徴づけすることにより、特異的ドメイン内または特異的モチーフ内に配置された所望のエピトープについての情報を解明することもできる。次いで、この情報から、抗体を、同じエピトープへの結合について、競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成する手法は、互いと競合的に結合する抗体、すなわち、抗原への結合について競合する抗体を見出す競合研究を実施することである。それらの交差競合に基づき、抗体をビニングするためのハイスループットプロセスについては、ＷＯ０３／４８７３１において記載されている。他のビニング法またはドメインレベルの方法またはエピトープマッピング法であって、酵母上でのモジュレーターの競合または抗原断片の発現を含む方法が、実施例９および１０に示される。
本明細書で用いられる、「ビニング」という用語は、それらの抗原結合の特徴および競合に基づき、抗体を群分けまたは分類するのに使用される方法を指す。ビニング法は、本発明のモジュレーターを定義および類別するのに有用であるが、ビンは、エピトープと常に直接相関するわけではなく、エピトープ結合についてのこのような初期決定は、本明細書で記載される、当技術分野で認識された他の方法により、さらに精緻化および確認することができる。しかし、下記の実施例で示され、論じられる通り、抗体モジュレーターの、個々のビンへの経験的な割当てにより、開示されるモジュレーターの治療的な潜在的可能性を示しうる情報がもたらされる。
より具体的に述べると、当技術分野で公知であり、本明細書の実施例で示される方法を使用することにより、選択された基準抗体（またはその断片）が、第２の被験抗体（すなわち、同じビン内にある）が結合するのと同じエピトープに結合するか、またはこれとの結合について第２の被験抗体と交差競合するのかどうかを決定することができる。一実施形態では、基準抗体モジュレーターは、ＳＥＺ６抗原と、飽和条件下で会合し、次いで、ＳＥＺ６に結合する第２の抗体モジュレーターまたは被験抗体モジュレーターの能力を、標準的な免疫化学技法を使用して決定する。被験抗体が、ＳＥＺ６に、基準抗ＳＥＺ６抗体と同時に、実質的に結合することが可能であれば、第２の抗体または被験抗体は、一次抗体または基準抗体とは異なるエピトープに結合する。しかし、被験抗体が、ＳＥＺ６に、同時に、実質的に結合することが可能でないなら、被験抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ、または一次抗体が結合するエピトープと近接する（少なくとも立体的に）エピトープに結合する。すなわち、被験抗体は、抗原結合について競合し、基準抗体と同じビン内にある。
開示されるモジュレーターの文脈で使用される場合の「競合する」または「競合抗体」という用語は、抗体間の競合であって、被験下にある被験抗体または免疫学的機能的断片が、共通の抗原に対する基準抗体の特異的結合を防止または阻害するアッセイにより決定される競合を意味する。このようなアッセイは、固体表面に結合させた精製抗原（例えば、ＳＥＺ６またはそのドメインもしくは断片）またはこれらのいずれかを保有する細胞、標識されていない被験免疫グロブリンおよび標識された基準免疫グロブリンの使用を伴うことが典型的である。競合的阻害は、被験免疫グロブリンの存在下において、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通常は、被験免疫グロブリンを過剰に存在させ、かつ／または最初に結合することを可能にする。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体、および基準抗体が結合するエピトープに対して、立体障害が生じるのに十分な程度に近位の隣接エピトープに結合する抗体を含む。本明細書の実施例では、競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細が提示される。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、基準抗体の共通抗原への特異的結合は、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害される。場合によって、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％、またはこれを超えて阻害される。
逆に、基準抗体を結合させる場合、基準抗体は、続いて添加される被験抗体（すなわち、ＳＥＺ６モジュレーター）の結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害することが好ましい。場合によって、被験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％、またはこれを超えて阻害される。
本発明に関して述べると、かつ、下記の実施例９および１０で示される通り、ＳＥＺ６の細胞外ドメインは、競合的結合により、本明細書で「ビンＡ」〜「ビンＦ」およびビンＵと称する、少なくとも７つのビンを規定することが決定されている（表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉を介して）。
これに関して、かつ当技術分野で公知で、下記実施例で詳述される通り、所望のビニングデータまたは競合結合データは、直接的または間接的な固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、直接的または間接的な固相酵素免疫アッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００システム（すなわち、表面プラズモン共鳴：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（すなわち、バイオレイヤー干渉法：ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）、またはフローサイトメトリー法を使用して得ることができる。本明細書で使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの特異的相互作用の解析を可能とする光学現象を指す。「バイオレイヤー干渉法」という用語は、２つの表面：バイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層、および内部基準層から反射された白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技法を指す。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化により、リアルタイムで測定されうる、干渉パターンのシフトが引き起こされる。特に好ましい実施形態では、解析（表面プラズモン共鳴であれ、バイオレイヤー干渉法であれ、フローサイトメトリーであれ）は、下記実施例で示される、Ｂｉａｃｏｒｅ測定器またはＦｏｒｔｅＢｉｏ測定器またはフローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ）を使用して実施する。
開示されるＳＥＺ６抗体モジュレーターが会合または結合するエピトープをさらに特徴付けるために、Cochranら（参照により本明細書に組み込まれる、J Immunol Methods.、２８７巻（１〜２号）：１４７〜１５８頁（２００４年））により記載されているプロトコールの変法を使用して、ドメインレベルのエピトープマッピングを実施した。略述すると、特異的アミノ酸配列を含むＳＥＺ６の個々のドメインを、酵母の表面上で発現させ、各ＳＥＺ６抗体による結合を、フローサイトメトリーにより決定した。結果は、以下、実施例１０で述べられ、図１４Ａおよび図１４Ｂに示される。
他の適合性のエピトープマッピング技法は、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Reineke（２００４年）Methods Mol Biol ２４８巻：４４３〜６３頁）（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）、またはペプチド切断解析を含む。加えて、エピトープの切出し、エピトープの抽出、および抗原の化学修飾などの方法（Tomer（２０００年）Protein Science ９巻：４８７〜４９６頁）（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）も用いることができる。他の実施形態では、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Antigen Structure-based Antibody Profiling）（ＡＳＡＰ）としてもまた公知の、修飾支援プロファイリング（Modification-Assisted Profiling）（ＭＡＰ）により、各抗体の、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する結合プロファイルの類似性に従い、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を類別する方法（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）がもたらされる。各類型は、別の類型により表されるエピトープと明確に異なるか、または部分的に重複する、固有のエピトープを反映しうる。この技術は、特徴づけにより、遺伝子的に識別可能な抗体に焦点を当てうるように、遺伝子的に同一な抗体の迅速なフィルタリングを可能とする。ＭＡＰを使用して、本発明のｈＳＥＺ６抗体モジュレーターを、異なるエピトープに結合する抗体の群へと分取しうることが認識される。
固定化された抗原の構造を変化させるのに有用な作用物質（agent）は、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼであるＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼであるＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）などの酵素を含む。固定化された抗原の構造を変化させるのに有用な作用物質はまた、化学薬品、たとえば、スクシンイミジルエステルおよびそれらの誘導体、一級アミン含有化合物、ヒドラジンおよびカルボヒドラジン、遊離アミノ酸などでもありうる。
抗原タンパク質は、バイオセンサーチップ表面上またはポリスチレンビーズ上に固定化することができる。後者は、例えば、マルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）などのアッセイで処理することができる。最大１００種類の異なるビーズによるマルチプレックス解析を扱うＬＵＭＩＮＥＸの能力のために、ＬＵＭＩＮＥＸは、多様な修飾を伴う、ほとんど無制限の抗原表面を提示する結果として、抗体エピトーププロファイリングにおける、バイオセンサーアッセイを凌駕する解像度の改善をもたらす。
Ｅ．モジュレーター結合特性
エピトープ特異性のほか、開示される抗体は、例えば、結合親和性などの物理的特徴を使用しても特徴づけることができる。これに関して、本発明は、１つまたは複数のＳＥＺ６アイソフォーム、または、パン抗体の場合は、ＳＥＺ６ファミリーの１つを超えるメンバーに対して高結合親和性を有する抗体の使用もさらに包含する。
本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。本発明の抗体は、その解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が、≦１０−７Ｍである場合に、その標的抗原に免疫特異的に結合するといわれる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合に、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合に、非常に高親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態では、抗体のＫＤは、≦１０−９Ｍであり、オフ速度は、約１×１０−４／秒である。本発明の一実施形態では、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態では、抗体は、ＳＥＺ６に、約１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍの間のＫＤで結合し、さらに別の実施形態では、≦２×１０−１０ＭのＫＤで結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、解離定数またはＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が、１０−２Ｍ未満、５×１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満、または５×１０−１５Ｍ未満である抗体を含む。
具体的な実施形態では、ＳＥＺ６に免疫特異的に結合する本発明の抗体の会合速度定数またはｋｏｎ（またはｋａ）速度（ＳＥＺ６（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｎ←Ａｂ−Ａｇ）は、少なくとも１０５Ｍ−１秒−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１秒−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１秒−１、少なくとも１０６Ｍ−１秒−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１秒−１、少なくとも１０７Ｍ−１秒−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１秒−１、または少なくとも１０８Ｍ−１秒−１である。
別の実施形態では、ＳＥＺ６に免疫特異的に結合する本発明の抗体の解離速度定数またはｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（ＳＥＺ６（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｆｆ←Ａｂ−Ａｇ）は、１０−１秒−１未満、５×１０−１秒−１未満、１０−２秒−１未満、５×１０−２秒−１未満、１０−３秒−１未満、５×１０−３秒−１未満、１０−４秒−１未満、５×１０−４秒−１未満、１０−５秒−１未満、５×１０−５秒−１未満、１０−６秒−１未満、５×１０−６秒−１未満、１０−７秒−１未満、５×１０−７秒−１未満、１０−８秒−１未満、５×１０−８秒−１未満、１０−９秒−１未満、５×１０−９秒−１未満、または１０−１０秒−１未満である。
本発明の他の選択された実施形態では、抗ＳＥＺ６抗体の親和性定数またはＫａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×１０１５Ｍ−１である。
上述のモジュレーター特徴のほか、本発明の抗体は、例えば、熱安定性（すなわち、融解温度；Ｔｍ）および等電点を含む、さらなる物理的特徴を使用して、さらに特徴づけることもできる（例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Bjellqvistら、１９９３年、Electrophoresis、１４巻：１０２３頁；Vermeerら、２０００年、Biophys. J.、７８巻：３９４〜４０４頁；Vermeerら、２０００年、Biophys. J.、７９巻：２１５０〜２１５４頁を参照されたい）。
ＶＩＩＩ．コンジュゲートモジュレーター
Ａ．概観
本発明のモジュレーターは、本明細書の教示に従って作製および／または製作され、選択されると、薬学的に活性もしくは診断用部分または生体適合性修飾因子と連結、融合、コンジュゲート（例えば、共有結合的に、または非共有結合的に）または他の仕方で会合させることができる。本発明のモジュレーター（例えば、抗体）は、治療用部分と、直接的にコンジュゲートさせることもでき、間接的にコンジュゲートさせることもできる。抗体は治療用部分または他の部分に接続するリンカー（リンカーについては、下記でより詳細に記載される）を使用せずに、このような抗体を、このような部分と会合させるか、連結するか、または融合させる場合、抗体は、治療用部分または他の部分、例えば、レポーターに「直接的にコンジュゲート」している。抗体をこのような部分へと接続するリンカーを使用して、抗体を、このような部分と会合させるか、連結するか、または融合させる場合、抗体は、治療用部分または他の部分、例えば、レポーターに「間接的にコンジュゲート」している。本明細書において使用される場合、用語「コンジュゲート」または「モジュレーターコンジュゲート」または「抗体コンジュゲート」は、広義で使用され、会合方法に関わらず、開示されているモジュレーターと会合させた、任意の、生物学的に活性であるかまたは検出可能な分子または薬物を意味すると考えられよう。この点において、このようなコンジュゲートが、開示されているモジュレーターに加えて、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ｉｎ ｖｉｖｏで活性薬剤に代謝されるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣薬剤、合成薬物、無機分子、有機分子、および放射性同位体を含むことできることが理解されよう。さらに、上記で指し示した通り、選択されたコンジュゲートは、共有結合的に、または非共有結合的に、モジュレーターと会合させるか、またはこれに連結することができ、コンジュゲーションを実行するのに使用される方法に少なくとも部分的に応じて、様々なモル当量比を呈示する。
本発明の特に好ましい態様は、増殖性障害の診断および／または処置に使用することができる、抗体モジュレーターコンジュゲートまたは抗体−薬物コンジュゲートを含むであろう。文脈がそれ以外を示さなければ、「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」という用語または式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎは、治療用部分および診断用部分の両方を含むコンジュゲートを包含すると考えるものとすることが認められよう。このような実施形態において、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、モジュレーターまたは細胞結合性単位（本明細書では、ＣＢＡ、Ｍ、またはＡｂと略記される）としてのＳＥＺ６モジュレーター（典型的には、抗ＳＥＺ６抗体）、治療用部分（例えば、抗がん剤）、または診断用部分（Ｄ）を含み、任意選択で、薬物と抗原結合剤とを接合するリンカー（Ｌ）を含むであろう。本開示の目的では、「ｎ」とは、１〜２０の整数を意味するように理解するものとする。好ましい実施形態において、モジュレーターは、上記で記載した、重鎖および軽鎖可変領域に由来する少なくとも１つのＣＤＲを含むＳＥＺ６ ｍＡｂである。
当業者であれば、いくつかの異なる反応が、治療用部分もしくは診断用部分および／またはリンカーの、結合剤への接合または会合に利用可能であることを認められよう。選択された実施形態において、これは、結合剤、例えば、抗体分子のアミノ酸残基であって、リシンのアミン基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボキシル基、システインのスルフヒドリル基、ならびに芳香族アミノ酸の様々な部分を含むアミノ酸残基の反応により達成することができる。共有結合的接合の中で最も一般的に使用される非特異的方法のうちの１つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を、抗体のアミノ（またはカルボキシ）基に連結する、カルボジイミド反応である。加えて、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二官能性薬剤も、化合物のアミノ基を、抗体分子のアミノ基に連結するのに使用されている。また、シッフ塩基反応も、薬物の結合剤への接合に利用可能である。この方法は、グリコール基またはヒドロキシ基を含有する薬物の過ヨウ素酸による酸化を伴い、これにより、アルデヒドを形成し、次いで、これを、結合剤と反応させる。接合は、結合剤のアミノ基を伴うシッフ塩基の形成を介して生じる。また、イソチオシアン酸およびアズラクトンも、薬物を結合剤に共有結合的に接合させるためのカップリング剤として使用されている。
他の実施形態において、開示されている本発明のモジュレーターを、選択された特徴を付与するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（例えば、生体毒素、バイオマーカー、精製用タグなど）とコンジュゲートまたは会合させることができる。ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）モジュレーターまたはその断片の使用であって、タンパク質またはペプチドが、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸を含む使用を包含する。構築物は、必ずしも直接連結する必要はなく、アミノ酸リンカー配列を介して構築することができる。例えば、本発明のモジュレーターを、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体へと融合またはコンジュゲートさせて、二重特異的構築物をもたらすことにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、異種ポリペプチドを、ＳＥＺ６を発現させる特定の細胞型へと標的化するのに、抗体を使用することができる。さらに、異種ポリペプチドに融合またはコンジュゲートさせたモジュレーターはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるイムノアッセイでも使用することができ、当技術分野で公知の精製方法論（例えばｈｉｓタグ）と特に適合性であり得る。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９３／２１２３２号；欧州特許第ＥＰ４３９，０９５号；Naramuraら、１９９４年、Immunol. Lett.、３９巻：９１〜９９頁；米国特許第５，４７４，９８１号；Gilliesら、１９９２年、PNAS、８９巻：１４２８〜１４３２頁；およびFellら、１９９１年、J. Immunol.、１４６巻：２４４６〜２４５２頁を参照されたい。
Ｂ．リンカー
上述のペプチドリンカーまたはスペーサーのほか、他の複数の種類またはタイプのリンカーも、開示されているモジュレーターを、薬学的活性部分もしくは診断用部分または生体適合性修飾因子と会合させるのに使用することができることが認められよう。一部の実施形態において、リンカーは、細胞内環境において、リンカーの切断により、薬物単位が抗体から放出されるように、細胞内条件下で切断可能である。さらに他の実施形態において、リンカー単位は、切断可能でなく、薬物は、例えば、抗体の分解により放出される。
ＡＤＣのリンカーは、細胞外において安定であり、ＡＤＣ分子の凝集を防止し、ＡＤＣを、水性媒体中で、遊離した可溶性および単量体状態に保つことが好ましい。細胞への輸送または送達の前に、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、安定であり、インタクトを維持する、すなわち、抗体の薬物部分への連結を維持することが好ましい。リンカーは、標的細胞の外部では、安定であるが、細胞の内部では、ある効率的な速度で切断され得る。有効なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し；（ｉｉ）コンジュゲートまたは薬物部分の細胞内送達を可能とし；（ｉｉｉ）安定およびインタクトを維持する、すなわち、コンジュゲートが、その標的化部位へと送達または輸送されるまで、切断されず；（ｉｖ）ＰＢＤ薬物部分の細胞傷害効果、細胞殺滅効果、または細胞増殖抑制効果を維持するであろう。ＡＤＣの安定性は、質量分析、ＨＰＬＣ、およびＬＣ／ＭＳによる分離／解析技法など、標準的な解析技法により測定することができる。抗体と薬物部分との共有結合的接合は、リンカーが２つの反応性官能基、すなわち、反応的な意味における二価性を有することを要求する。ペプチド、核酸、薬物、毒素、抗体、ハプテン、およびレポーター基など、２つまたはこれを超える機能的部分または生物学的活性部分を接合させるのに有用な、二価のリンカー試薬は公知であり、それらの結果として得られるコンジュゲートの方法も記載されている（Hermanson, G.T.（１９９６年）Bioconjugate Techniques、Academic Press：New York、２３４〜２４２頁）。
この目的で、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム内環境またはエンドソーム内環境またはカベオラ内環境）内に存在する切断作用物質により切断されるリンカーの使用を含む。リンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない、細胞内ペプチダーゼ酵素または細胞内プロテアーゼ酵素により切断される、ペプチジルリンカーであり得る。一部の実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断作用物質は、それらのそれぞれが、ジペプチドの薬物誘導体を加水分解する結果として、標的細胞の内部で活性薬物の放出をもたらすことが公知である、カテプシンＢおよびカテプシンＤならびにプラスミンを含み得る。カテプシンＢは、がん性組織内で高度に発現することが見出されているので、チオール依存性プロテアーゼであるカテプシンＢにより切断される例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例については、例えば、それらのそれぞれが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１２／００７８０２８において記載されている。具体的な好ましい実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断されるペプチジルリンカーは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５において記載されているペプチジルリンカーなど、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ａｌａ−Ｖａｌリンカー、またはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。細胞内のタンパク質分解による治療剤の放出を使用する１つの利点は、コンジュゲートさせると、薬剤は、典型的に弱められ、コンジュゲートの血清中安定性は典型的に高いことである。
他の実施形態において、切断型リンカーは、ｐＨ感受性である、すなわち、ある特定のｐＨ値において、加水分解に対して感受性である。ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能であることが典型的である。例えば、リソソーム内で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；同５，８２４，８０５；同５，６２２，９２９を参照されたい）。このようなリンカーは、血液中の中性ｐＨ条件下などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームの近似的ｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回ると不安定である。
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断される（例えば、ジスルフィドリンカー）。当技術分野では、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）、およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成され得る、ジスルフィドリンカーを含む、様々なジスルフィドリンカーが公知である。さらに他の具体的実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Johnsonら、１９９５年、Anticancer Res.、１５巻：１３８７〜９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lauら、１９９５年、Bioorg-Med-Chem.、３巻（１０号）：１２９９〜１３０４頁）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Lauら、１９９５年、Bioorg-Med-Chem.、３巻（１０号）：１３０５〜１２頁）である。さらに他の実施形態において、リンカー単位は、切断可能でなく、薬物は、例えば、抗体の分解により放出される（参照によりそれらの全体において、かつ、全ての目的で本明細書に組み込まれる、米国公開第２００５／０２３８６４９号を参照されたい）。
より特定すると、好ましい実施形態（参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７において示される）では、適合性のリンカーは、
［式中、アステリスクは、細胞傷害剤への接合点を指し示し、ＣＢＡは、細胞結合剤／モジュレーターであり、Ｌ１は、リンカーであり、Ａは、Ｌ１を、細胞結合剤に接続する接続基であり、Ｌ２は、共有結合であるか、または、−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって、自壊型リンカーを形成し、Ｌ１またはＬ２は、切断型リンカーである］
を含むであろう。
Ｌ１は、好ましくは、切断型リンカーであり、リンカーを切断へと活性化させるための誘因と称することができる。
Ｌ１およびＬ２の性質は、存在する場合、広く変化し得る。これらの基は、それらの切断特徴であって、コンジュゲートを送達する部位における条件により指定され得る特徴に基づいて選択される。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、また、ｐＨの変化（例えば、酸不安定性または塩基不安定性）、温度の変化、または照射時の変化（例えば、光不安定性）により切断されるリンカーも使用することができる。本発明ではまた、還元条件下または酸化条件下で切断されるリンカーも使用することができる。
Ｌ１は、連続アミノ酸配列を含み得る。アミノ酸配列は、酵素による切断のための標的基質であることが可能であり、これにより、Ｒ１０のＮ１０位からの放出を可能とする。
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断される。一実施形態において、酵素は、エステラーゼまたはペプチダーゼである。
一実施形態において、Ｌ２が存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって、自壊型リンカーを形成する。一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性のための基質であり、これにより、Ｒ１０のＮ１０位からの放出を可能とする。
一実施形態において、Ｌ１が、酵素の作用により切断され、Ｌ２が存在する場合、酵素により、Ｌ１とＬ２との間の結合が切断される。
Ｌ１とＬ２とは、存在する場合、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
から選択される結合により接続することができる。
Ｌ２に接続されるＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端の場合もあり、アミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来する場合もある。
Ｌ２に接続されるＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端の場合もあり、アミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来する場合もある。
Ｌ２に接続されるＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来し得る。
「アミノ酸側鎖」という用語は、（ｉ）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンなど、自然発生のアミノ酸；（ｉｉ）オルニチンおよびシトルリンなど、希少なアミノ酸；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、自然発生のアミノ酸の合成類似体および合成誘導体；ならびに（ｉｖ）全ての光学異性体、ジアステレオマー、異性体濃縮形態、同位体標識形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護形態、およびこれらのラセミ混合物内で見出される基を含む。
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２は一緒になって、基：
［式中、アステリスクは、薬物位置または細胞傷害剤位置への接合点を指し示し、波線は、リンカーＬ１への接合点を指し示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは、０〜３である］を形成する。フェニレン環は、任意選択で、本明細書に記載されている、１つ、２つ、または３つの置換基により置換される。一実施形態において、フェニレン基は、任意選択で、ハロ、ＮＯ２、Ｒ、またはＯＲにより置換される。
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
一実施形態において、ｎは、０または１である。好ましくは、ｎは、０である。
Ｙが、ＮＨであり、ｎが、０である場合、自壊型リンカーを、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ：ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ ｃａｒｂｏｎｙｌ）と称することができる。
自壊型リンカーは、下記（ｎ＝０の場合）：
［式中、Ｌ＊は、リンカーの残りの部分の活性化形態である］に示される線に沿って進行する、遠隔部位の活性化がなされると、保護された化合物の放出を可能とするであろう。これらの基は、活性化部位を、保護された化合物から分離する利点を有する。上記で記載した通り、フェニレン基は、任意選択で、置換することができる。
本明細書に記載されている一実施形態において、Ｌ＊基は、本明細書に記載されているリンカーＬ１であり、ジペプチド基を含み得る。
別の実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２は一緒になって、
［式中、アステリスク、波線、Ｙ、およびｎは、上記で規定した通りである］から選択される基を形成する。各フェニレン環は、任意選択で、本明細書に記載されている、１つ、２つ、または３つの置換基により置換される。一実施形態において、Ｙ置換基を有するフェニレン基は、任意選択で置換され、Ｙ置換基を有さないフェニレン環は、非置換である。一実施形態において、Ｙ置換基を有するフェニレン環は、非置換であり、Ｙ置換基を有さないフェニレン環は、任意選択で置換される。
別の実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２は一緒になって、
［式中、アステリスク、波線、Ｙ、およびｎは、上記で規定した通りである。Ｅは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであり、Ｄは、Ｎ、ＣＨ、またはＣＲであり、Ｆは、Ｎ、ＣＨ、またはＣＲである］から選択される基を形成する。
一実施形態において、Ｄは、Ｎである。
一実施形態において、Ｄは、ＣＨである。
一実施形態において、Ｅは、ＯまたはＳである。
一実施形態において、Ｆは、ＣＨである。
好ましい実施形態において、リンカーは、カテプシン不安定性リンカーである。
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−［式中、−ＮＨ−および−ＣＯ−は、それぞれ、アミノ酸Ｘ１基およびＸ２のＮ末端およびＣ末端を表す］として表すことができる。ジペプチド内のアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーが、カテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシンにより媒介される切断のための作用部位であり得る。
加えて、カルボキシル側鎖官能基またはアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、ＧｌｕおよびＬｙｓのそれぞれでは、ＣＯおよびＮＨは、この側鎖官能基を表し得る。
一実施形態において、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、および−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−［式中、Ｃｉｔは、シトルリンである］
から選択される。
ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、および−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−
から選択されることが好ましい。
最も好ましくは、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−内の−Ｘ１−Ｘ２−基は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｖａｌ−Ａｌａ−である。
参照により本明細書に組み込まれる、Dubowchikら、Bioconjugate Chemistry、２００２年、１３巻、８５５〜８６９頁により記載されているものを含む他のジペプチドの組合せも使用することができる。
一実施形態において、適切な場合、アミノ酸側鎖を誘導体化する。例えば、アミノ酸側鎖のアミノ基またはカルボキシ基を誘導体化することができる。
一実施形態において、リシンなど、側鎖アミノ酸のアミノＮＨ２基は、ＮＨＲおよびＮＲＲ’からなる群から選択される誘導体化形態である。
一実施形態において、アスパラギン酸など、側鎖アミノ酸のカルボキシＣＯＯＨ基は、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、およびＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される誘導体化形態である。
一実施形態において、適切な場合、アミノ酸側鎖を、化学的に保護する。側鎖保護基は、ＲＬ基との関連で下記において論じられる基であり得る。保護されたアミノ酸配列は、酵素により切断される。例えば、Ｂｏｃ法により側鎖保護されたＬｙｓ残基を含むジペプチド配列は、カテプシンにより切断されることが確立されている。
当技術分野では、アミノ酸側鎖のための保護基が周知であり、Novabiochem Catalogにおいて記載されている。さらなる保護基戦略は、GreeneおよびWuts、Protective Groups in Organic Synthesisにおいて示されている。
反応性の側鎖官能基を有するアミノ酸について、可能な側鎖保護基を下記：
Ａｒｇ：Ｚ、Ｍｔｒ、Ｔｏｓ；
Ａｓｎ：Ｔｒｔ、Ｘａｎ；
Ａｓｐ：Ｂｚｌ、ｔ−Ｂｕ；
Ｃｙｓ：Ａｃｍ、Ｂｚｌ、Ｂｚｌ−ＯＭｅ、Ｂｚｌ−Ｍｅ、Ｔｒｔ；
Ｇｌｕ：Ｂｚｌ、ｔ−Ｂｕ；
Ｇｌｎ：Ｔｒｔ、Ｘａｎ；
Ｈｉｓ：Ｂｏｃ、Ｄｎｐ、Ｔｏｓ、Ｔｒｔ；
Ｌｙｓ：Ｂｏｃ、Ｚ−Ｃｌ、Ｆｍｏｃ、Ｚ、Ａｌｌｏｃ；
Ｓｅｒ：Ｂｚｌ、ＴＢＤＭＳ、ＴＢＤＰＳ；
Ｔｈｒ：Ｂｚ；
Ｔｒｐ：Ｂｏｃ；
Ｔｙｒ：Ｂｚｌ、Ｚ、Ｚ−Ｂｒ
に示す。
一実施形態において、存在する場合、側鎖保護は、キャッピング基として施される基、またはキャッピング基の一部として施される基に対して直交となるように選択される。したがって、側鎖保護基を除去しても、キャッピング基またはキャッピング基の一部である任意の保護基の官能基は除去されない。
本発明の他の実施形態において、選択されるアミノ酸は、反応性の側鎖官能基を有さないアミノ酸である。例えば、アミノ酸は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、およびＶａｌから選択することができる。
一実施形態において、ジペプチドを、自壊型リンカーと組み合わせて使用する。自壊型リンカーは、−Ｘ２−に接続することができる。
自壊型リンカーが存在する場合、−Ｘ２−は、自壊型リンカーに直接接続される。好ましくは、−Ｘ２−ＣＯ−基は、Ｙ［式中、Ｙは、ＮＨであり、これにより、−Ｘ２−ＣＯ−ＮＨ−基を形成する］に接続される。
−ＮＨ−Ｘ１−は、Ａに直接接続される。Ａは、−ＣＯ−官能基を含み、これにより、−Ｘ１−とのアミド連結を形成することが可能である。
一実施形態において、Ｌ１およびＬ２は、−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって、ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−ＰＡＢＣ−基を含む。ＰＡＢＣ基は、細胞傷害剤に直接接続される。好ましくは、自壊型リンカーとジペプチドは一緒になって、下記：
［式中、アステリスクは、選択された細胞傷害性部分への接合点を指し示し、波線は、リンカーＬ１の残りの部分への接合点またはＡへの接合点を指し示す］に例示される、−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を形成する。好ましくは、波線は、Ａへの接合点を指し示す。Ｌｙｓアミノ酸の側鎖は、例えば、上記に記載したＢｏｃ、Ｆｍｏｃ、またはＡｌｌｏｃで保護することができる。
代替的に、自壊型リンカーとジペプチドは一緒になって、下記：
［式中、アステリスクおよび波線は、上記で規定した通りである］に例示される、−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を形成する。
代替的に、自壊型リンカーとジペプチドは一緒になって、下記：
［式中、アステリスクおよび波線は、上記で規定した通りである］に例示される、−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を形成する。
本発明の一部の実施形態において、薬物部分が、非保護のイミン結合を含有する、例えば、部分Ｂが存在するなら、リンカーは、遊離アミノ（Ｈ２Ｎ−）基を含有しないことが好ましい場合がある。したがって、リンカーが、−Ａ−Ｌ１−Ｌ２−構造を有するなら、リンカーは、遊離アミノ基を含有しないことが好ましいであろう。この優先事項は、リンカーが、例えば、Ｌ１としてのジペプチドを含有する場合に、特に、関与性であり、この実施形態において、２つのアミノ酸のうちの１つは、リシンから選択されないことが好ましいであろう。
理論に束縛されることを望まずに述べると、薬物部分内の非保護のイミン結合と、リンカー内の遊離アミノ基との組合せは、薬物−リンカー部分の二量体化であって、このような薬物−リンカー部分の、抗体へのコンジュゲーションに干渉し得る二量体化を引き起こし得る。これらの基の交差反応は、強い酸（例えば、ＴＦＡ）が、遊離アミノ基を脱保護するのに使用される場合など、アンモニウムイオン（Ｈ３Ｎ＋−）としての遊離アミノ基が存在する場合に加速化される。
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と細胞結合剤とは、直接接続され得る。例えば、Ｌ１が、連続アミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、細胞結合剤に直接接続され得る。
したがって、Ａが共有結合である場合、細胞結合剤とＬ１との接続は、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、および＝Ｎ−ＮＨ−
から選択することができる。
ＳＥＺ６モジュレーターに接続されるＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端の場合もあり、アミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来する場合もある。
モジュレーターに接続されるＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端の場合もあり、アミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来する場合もある。
細胞結合剤に接続されるＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来し得る。
モジュレーター剤に接続されるＬ１のチオール基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のチオール基に由来し得る。
Ｌ１のアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、およびチオール基に関する上記の注釈はまた、細胞結合剤にも適用される。
一実施形態において、Ｌ２は、−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって、
［式中、アステリスクは、Ｎ１０位への接合点を指し示し、波線は、Ｌ１への接合点を指し示し、ｎは、０〜３であり、Ｙは、共有結合または官能基であり、Ｅは、例えば、酵素作用または光により活性化可能であり、これにより、自壊性単位を作製する基である］を表す。フェニレン環は、任意選択で、本明細書に記載されている、１つ、２つ、または３つの置換基により置換される。一実施形態において、フェニレン基は、任意選択で、ハロ、ＮＯ２、Ｒ、またはＯＲにより置換される。ｎは、０または１であることが好ましい。ｎは、０であることが最も好ましい。
Ｅは、基が、例えば、光または酵素の作用による活性化に対して感受性となるように選択される。Ｅは、−ＮＯ２またはグルクロン酸（glucoronic acid）であり得る。前者は、ニトロレダクターゼの作用に対して感受性であることが可能であり、後者は、β−グルクロニダーゼ（β-glucoronidase）の作用に対して感受性であり得る。
この実施形態において、自壊型リンカーは、下記（ｎ＝０の場合）：
［式中、アステリスクは、Ｎ１０位への接合点を指し示し、Ｅ＊は、Ｅの活性化形態であり、Ｙは、上記に記載した通りである］線に沿って進行する、Ｅの活性化がなされると、保護された化合物の放出を可能とするであろう。これらの基は、活性化部位を、保護された化合物から分離する利点を有する。上記で記載した通り、フェニレン基は、任意選択で、さらに置換することができる。
Ｙ基は、Ｌ１に共有結合させることができる。
Ｙ基は、
−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、および−Ｓ−
から選択される官能基であり得る。
Ｌ１がジペプチドである場合、Ｙは、−ＮＨ−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり、これにより、Ｌ１とＹとのアミド結合を形成することが好ましい。この実施形態において、ジペプチド配列は、酵素的活性に対する基質でなくてよい。
別の実施形態において、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と細胞結合剤とは、間接的に接続される。
Ｌ１とＡとは、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
から選択される結合により接続することができる。
リンカーは、モジュレーター上の求核官能基との反応のために、求電子官能基を含有することが好ましい。抗体上の求核基は、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合は、糖ヒドロキシル基または糖アミノ基などが挙げられるがこれらに限定されない。アミン基、チオール基、およびヒドロキシル基は、求核基であり、リンカー部分上およびリンカー試薬上の求電子基であって、（ｉ）マレイミド基（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステルなどの活性エステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物；（ｉｖ）ハロアセトアミドなどの、アルキルハロゲン化物およびベンジルハロゲン化物；ならびに（ｖ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルを含み、これらのうちの一部は、以下：
の通りに例示される。
いくつかの抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤で処置することにより、リンカー試薬とのコンジュゲーションについて反応性とすることができる。各システイン架橋は、これにより、理論的には、２つの反応性チオール求核試薬を形成するであろう。リシンの、２−イミノチオラン（トラウト試薬）との反応により、さらなる求核基を、抗体へと導入する結果として、アミンのチオールへの転換をもたらすことができる。１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超えるシステイン残基を導入すること（例えば、１または複数の天然システイン以外のアミノ酸残基を含む突然変異体の抗体を調製すること）により、反応性チオール基を、抗体（またはその断片）へと導入することができる。ＵＳ７５２１５４１は、反応性のシステインアミノ酸の導入による抗体の操作を教示する。
一部の実施形態において、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応性である、反応性の求核基を有する。抗体上の有用な求電子基は、アルデヒドおよびケトンのカルボニル基などが挙げられるがこれらに限定されない。リンカーの求核基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応し、抗体単位との共有結合を形成し得る。リンカー上の有用な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドなどが挙げられるがこれらに限定されない。抗体上の求電子基は、リンカーへの接合に好都合な部位をもたらす。
一実施形態において、Ａ基は、
［式中、アステリスクは、Ｌ１への接合点を指し示し、波線は、細胞結合剤への接合点を指し示し、ｎは、０〜６である］である。一実施形態において、ｎは、５である。
一実施形態において、Ａ基は、
［式中、アステリスクは、Ｌ１への接合点を指し示し、波線は、細胞結合剤への接合点を指し示し、ｎは、０〜６である］である。一実施形態において、ｎは、５である。
一実施形態において、Ａ基は、
［式中、アステリスクは、Ｌ１への接合点を指し示し、波線は、細胞結合剤への接合点を指し示し、ｎは、０または１であり、ｍは、０〜３０である］である。好ましい実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、０〜１０、１〜８、好ましくは、４〜８であり、最も好ましくは、４または８である。別の実施形態において、ｍは、１０〜３０であり、好ましくは、２０〜３０である。代替的に、ｍは、０〜５０である。この実施形態において、ｍは、１０〜４０であることが好ましく、ｎは、１である。
一実施形態において、Ａ基は、
［式中、アステリスクは、Ｌ１への接合点を指し示し、波線は、細胞結合剤への接合点を指し示し、ｎは、０または１であり、ｍは、０〜３０である］である。好ましい実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、０〜１０、１〜８、好ましくは、４〜８であり、最も好ましくは、４または８である。別の実施形態において、ｍは、１０〜３０であり、好ましくは、２０〜３０である。代替的に、ｍは、０〜５０である。この実施形態において、ｍは、１０〜４０であることが好ましく、ｎは、１である。
一実施形態において、細胞結合剤とＡとの接続は、細胞結合剤のチオール残基と、Ａのマレイミド基との接続を介する。
一実施形態において、細胞結合剤とＡとの接続は、
［式中、アステリスクは、Ａの残りの部分への接合点を指し示し、波線は、細胞結合剤の残りの部分への接合点を指し示す］である。この実施形態において、Ｓ原子は、モジュレーターから誘導されることが典型的である。
上記の実施形態のそれぞれでは、下記に示される代替的な官能基：
［式中、波線は、前出と同様に、細胞結合剤への接合点を指し示し、アステリスクは、Ａ基の残りの部分への結合を指し示す］を、マレイミド由来基の代わりに使用することができる。
一実施形態において、マレイミド由来基を、基：
［式中、波線は、細胞結合剤への接合点を指し示し、アステリスクは、Ａ基の残りの部分への結合を指し示す］で置き換える。
一実施形態において、マレイミド由来基を、任意選択で、細胞結合剤と併せて、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−、＝Ｎ−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｎ＝
から選択される基で置き換える。
一実施形態において、マレイミド由来基を、任意選択で、細胞結合剤と併せて、
［式中、波線は、細胞結合剤への接合点またはＡ基の残りの部分への結合のうちの一方を指し示し、アステリスクは、細胞結合剤への接合点またはＡ基の残りの部分への結合のうちの他方を指し示す］から選択される基で置き換える。
Ｌ１を、選択されたモジュレーターへと接続するのに適する他の基については、ＷＯ２００５／０８２０２３において記載されている。
別の好ましい実施形態において、本発明のモジュレーターを、薬物リンカー単位を含む生体適合性のポリマーと会合させることができる。これに関して、適合性のポリマーのうちの１つのこのような種類は、Ｆｌｅｘｉｍｅｒ（登録商標）ポリマー（Ｍｅｒｓａｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を含む。このようなポリマーは、生体分解性であり、忍容が良好であり、臨床的な妥当性が確認されていることが報告されている。さらに、このようなポリマーは、薬物動態の制御、薬物放出の局在化、および生体内分布の改善を可能とする、いくつかのカスタマイズ可能なリンカー技術および化学反応とも適合性である。
選択されたモジュレーターはまた、放射性同位体に直接コンジュゲートさせることもでき、放射性金属イオン（本明細書に記載されている）をコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレート化剤を含む場合もある。ある特定の実施形態において、大環状キレート化剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これは、リンカー分子を介して抗体に接合させることができる。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、Denardoら、１９９８年、Clin Cancer Res.、４巻：２４８３頁；Petersonら、１９９９年、Bioconjug. Chem.、１０巻：５５３頁；およびZimmermanら、１９９９年、Nucl. Med. Biol.、２６巻：９４３頁において記載されている。
より一般に、治療用部分または細胞傷害剤を、モジュレーターにコンジュゲートさせるための技法は周知である。上記で論じた通り、部分は、任意の当技術分野で認知された方法であって、アルデヒド／シッフ連結、スルフヒドリル連結、酸不安定性連結、ｃｉｓ−アコニチル連結、ヒドラゾン連結、酵素分解性連結などが挙げられるがこれらに限定されない方法により、モジュレーターにコンジュゲートさせることができる（一般に、Garnett、２００２年、Adv Drug Deliv Rev、５３巻：１７１頁を参照されたい）。また、例えば、Amonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、「Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy」、Reisfeldら（編）、２４３〜５６頁（Alan R. Liss, Inc.、１９８５年）；Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、「Controlled Drug Delivery」（２版）、Robinsonら（編）、６２３〜５３頁（Marcel Dekker, Inc.、１９８７年）；Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら（編）、４７５〜５０６頁（１９８５年）；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら（編）、３０３〜１６頁（Academic Press、１９８５年）、およびThorpeら、１９８２年、Immunol. Rev.、６２巻：１１９頁も参照されたい。好ましい実施形態において、治療用部分または細胞傷害剤にコンジュゲートさせるＳＥＺ６モジュレーターは、細胞表面と会合したＳＥＺ６分子に結合した細胞により内部移行され、これにより、治療ペイロードを送達することが可能である。
Ｃ．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明のモジュレーターを、モジュレーター特徴を、所望の通りに、調整するか、変化させるか、改善するか、または緩和するのに使用され得る、生体適合性修飾因子とコンジュゲートさせるか、または他の仕方で会合させることができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体または融合構築物は、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または類似する生体適合性のポリマーなど、比較的高分子量のポリマー分子に接合させることにより作製することができる。当業者ならば、ＰＥＧを、抗体に特異的特性（例えば、半減期を調整し得る）を付与するように選択し得る、多くの異なる分子量および分子立体配置で得ることを認められよう。ＰＥＧは、多官能性リンカーを伴うかまたは伴わずに、ＰＥＧの、前記抗体または抗体断片のＮ末端またはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションにより、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、モジュレーターまたは抗体断片または誘導体へと接合させることができる。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、結果としてもたらされる生物学的活性の喪失が最小限の誘導体化を使用することができる。コンジュゲーションの程度は、ＰＥＧ分子の、抗体分子への最適なコンジュゲーションを確保するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析で緊密にモニタリングすることができる。反応しなかったＰＥＧは、例えば、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。同様にして、開示されているモジュレーターは、抗体または抗体断片を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの半減期を長くするように、アルブミンにコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際公開第ＷＯ９３／１５１９９号、同第ＷＯ９３／１５２００号、およびＷＯ０１／７７１３７；ならびに欧州特許０４１３６２２号を参照されたい。当業者には、他の生体適合性のコンジュゲートも明らかであり、本明細書の教示に従い、容易に同定することができる。
Ｄ．診断剤または検出剤
他の好ましい実施形態において、本発明のモジュレーター、またはその断片もしくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチドまたはヌクレオチド）、小分子、フルオロフォア、または放射性同位体であり得る、診断剤または検出剤、マーカーまたはレポーターにコンジュゲートさせることができる。標識されたモジュレーターは、過剰増殖性障害の発症または進行をモニタリングするのに有用な場合もあり、開示されているモジュレーターを含む特定の治療の有効性を決定する（すなわち、治療診断）か、または将来の処置コースを決定する、臨床試験手順の一部として有用な場合もある。このようなマーカーまたはレポーターはまた、選択されたモジュレーターの精製、モジュレーターアナリティックス（例えば、エピトープへの結合または抗体のビニング）、ＴＩＣの分離もしくは単離、または臨床手順もしくは毒性研究において有用な場合もある。
このような診断解析および／または検出は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む様々な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどが挙げられるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンなどが挙げられるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどが挙げられるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクォリンなどが挙げられるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどが挙げられるがこれらに限定されない放射性材料；様々なポジトロン放出断層撮影を使用したポジトロン放出金属、非放射性常磁性金属イオン、ならびにまたは特異的な放射性同位体に放射性標識またはコンジュゲートされた分子などが挙げられるがこれらに限定されない、検出可能な物質にモジュレーターをカップリングすることにより達成することができる。このような実施形態において、適切な検出方法論は、当技術分野において周知であり、いくつかの市販の供給源から直ちに利用することができる。
上に示す通り、他の実施形態において、モジュレーターまたはその断片は、ペプチドまたはフルオロフォアなど、マーカー配列または化合物に融合またはコンジュゲートさせて、免疫組織化学検査、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣｓなど、精製または診断または分析手順を容易にすることができる。好ましい実施形態において、マーカーは、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）により提供されるものなど、ｈｉｓタグなどのｈｉｓタグを含み、とりわけ、その多くは市販されている。精製に有用な他のペプチドタグとして、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Wilsonら、１９８４年、Cell、３７巻：７６７頁）および「ｆｌａｇ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられるがこれらに限定されない。
Ｅ．治療用部分
既に示唆した通り、モジュレーターまたはそれらの断片もしくは誘導体はまた、細胞傷害剤、細胞分裂阻害剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤、ＢＲＭ、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、および抗転移薬剤、ならびに免疫療法剤が挙げられるがこれらに限定されない、抗増殖剤または抗がん剤などの「治療用部分」または「薬物」とコンジュゲートさせるか、連結するか、もしくは融合させるか、または他の仕方で会合させることもできる。
好ましい例示的な抗がん剤は、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、ＤＭ−１およびＤＭ−４（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）などのメイタンシノイド、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシン Ｄ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、ならびにシクロホスファミドおよびその類似体または相同体を含む。さらなる適合性の細胞毒素は、ドラスタチン、ならびにモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を含むアウリスタチン、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、またはイプシロン−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ）などのアマニチン、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ，Ｂ．Ｖ．）および修飾ピロロベンゾジアゼピン二量体（Ｓｐｉｒｏｇｅｎ，Ｌｔｄ）などのＤＮＡ副溝結合剤メアヤマイシン類似体またはメアヤマイシン誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７で示されるＦＲ９０１４６４）などのスプライシング阻害剤、エポチロン類似体およびパクリタキセルなどの微小管結合剤、ならびにカリケアミシンおよびエスペラミシンなどのＤＮＡ損傷剤を含む。さらに、ある特定の実施形態において、本発明のＳＥＺ６モジュレーターを、抗ＣＤ３結合性分子と会合させて、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、それらに腫瘍開始細胞を標的化させることができる（ＢｉＴＥ技術：例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Fuhrmann, S.ら、Annual Meeting of AACR、抄録５６２５号（２０１０年）を参照されたい）。
なおさらなる適合性の抗がん剤は、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン（dacarbazine））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（thiotepa）、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）であるシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生剤（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）などが挙げられるがこれらに限定されない。治療用部分についてのより広範なリストは、それらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０７５９５７号およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５において見い出すことができる。
上記で指し示した通り、本発明の選択された実施形態は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を細胞傷害剤として含む、抗ＳＥＺ６抗体薬物コンジュゲートなどのコンジュゲートＳＥＺ６モジュレーターを対象とする。ＰＢＤとは、ＤＮＡの副溝に共有結合的に結合し、核酸の合成を阻害することにより、抗腫瘍活性を及ぼすアルキル化剤であることが認められよう。これに関して、ＰＢＤは、最小限の骨髄抑制を呈示しながら、強力な抗腫瘍特性を有することが示されている。本発明に適合性のＰＢＤは、複数種類のリンカー（例えば、遊離スルフヒドリルを伴うマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）のうちのいずれか１つを使用して、ＳＥＺ６モジュレーターに連結することができ、ある特定の実施形態において、二量体の形態（すなわち、ＰＢＤ二量体）である。開示されているモジュレーターへとコンジュゲートさせ得る、適合性のＰＢＤ（および任意選択のリンカー）については、例えば、それらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、同７，０４９，３１１、同７，１８９，７１０、同７，４２９，６５８、同７，４０７，９５１、同７，７４１，３１９、同７，５５７，０９９、同８，０３４，８０８、同８，１６３，７３６、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７、およびＰＣＴ出願第ＷＯ２０１１／１３０６１３号、同第ＷＯ２０１１／１２８６５０号、および同第ＷＯ２０１１／１３０６１６号において記載されている。したがって、特に好ましい実施形態において、モジュレーターは、抗ＳＥＺ６抗体とコンジュゲートまたは会合させた、１または複数のＰＢＤ二量体（すなわち、ＳＥＺ６−ＰＢＤ ＡＤＣ）を含むであろう。
特に好ましい実施形態では、開示されるモジュレーターにコンジュゲートさせうる、適合性のＰＢＤについては、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７号において記載されている。本開示では、ＰＢＤ二量体、すなわち、２つのＰＢＤ部分を含むＰＢＤ二量体が好ましい場合がある。したがって、本発明の好ましいコンジュゲートは、式（ＡＢ）または（ＡＣ）：
［式中、
点線は、Ｃ１とＣ２との間またはＣ２とＣ３との間の、任意選択の二重結合の存在を示し；
Ｒ２は独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、およびＣＯＲから選択され、任意選択で、ハロまたはジハロからさらに選択され、ここで、ＲＤは独立して、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、およびハロから選択され；
Ｒ６およびＲ９は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、およびハロから選択され；
Ｒ７は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、およびハロから選択され；
Ｒ１０は、上記に記載した通り、モジュレーターまたはその断片もしくは誘導体に接続させたリンカーであり；
Ｑは独立して、Ｏ、Ｓ、およびＮＨから選択され；
Ｒ１１は、ＨまたはＲであるか、またはＱがＯである場合、ＳＯ３Ｍ［式中、Ｍは、金属カチオンである］であり；
ＲおよびＲ’は、各々独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基、およびＣ５〜２０アリール基から選択され、任意選択で、基ＮＲＲ’ との関連で、ＲおよびＲ’は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、任意選択で置換された、４員、５員、６員、または７員の複素環式環を形成し、
Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”、およびＲ１１”は、それぞれ、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、Ｑ、およびＲ１１に従い定義される通りであり、ＲＣは、キャッピング基である］
を有するコンジュゲートである。
二重結合
一実施形態では、Ｃ１とＣ２との間およびＣ２とＣ３との間に、二重結合が存在しない。
一実施形態では、点線は、下記：
で示す通り、Ｃ２とＣ３との間の、任意選択の二重結合の存在を示す。
一実施形態では、Ｒ２が、Ｃ５〜２０アリール、またはＣ１〜１２アルキルである場合、二重結合は、Ｃ２とＣ３との間に存在する。
一実施形態では、点線は、下記：
で示す通り、Ｃ１とＣ２との間の、任意選択の二重結合の存在を示す。
一実施形態では、Ｒ２が、Ｃ５〜２０アリール、またはＣ１〜１２アルキルである場合、二重結合は、Ｃ１とＣ２との間に存在する。
Ｒ２
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、およびＣＯＲから選択され、任意選択で、ハロまたはジハロからさらに選択される。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、およびＣＯＲから選択される。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｈ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤ、および＝Ｃ（ＲＤ）２から選択される。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｈである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝Ｏである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝ＣＨ２である。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝ＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物内で、基＝ＣＨ−ＲＤは、下記：
に示されるいずれかの立体配置を有しうる。
一実施形態では、立体配置は、立体配置（Ｉ）である。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝Ｃ（ＲＤ）２である。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、＝ＣＦ２である。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、Ｒである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ５〜２０アリールである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキルである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ５〜２０アリールである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ５〜７アリールである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、Ｃ８〜１０アリールである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、フェニルである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、ナフチルである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、ピリジルである。
一実施形態では、Ｒ２は独立して、任意選択で置換された、キノリニルまたはイソキノリニルである。
一実施形態では、Ｒ２は、１つ〜３つの置換基を保有するが、１つおよび２つの置換基がより好ましく、単一の置換基が最も好ましい。置換基は、任意の位置でありうる。
Ｒ２が、Ｃ５〜７アリール基である場合、単一の置換基は、化合物の残りの部分への結合に隣接しない環原子であることが好ましく、すなわち、それは、化合物の残りの部分への結合に対して、βまたはγであることが好ましい。したがって、Ｃ５〜７アリール基が、フェニルである場合、置換基は、メタ位またはパラ位にあることが好ましく、パラ位にあることがより好ましい。
一実施形態では、Ｒ２は、
［式中、アステリスクは、結合点を示す］
から選択される。
Ｒ２が、Ｃ８〜１０アリール基、例えば、キノリニルまたはイソキノリニルである場合、それは、キノリン環またはイソキノリン環の任意の位置において、任意の数の置換基を保有しうる。一部の実施形態では、Ｒ２は、１つ、２つ、または３つの置換基を保有し、これらの置換基は、近位環上および遠位環上のいずれかの場合もあり、これらの両方の場合もある（１つを超える置換基の場合）。
一実施形態では、Ｒ２が、任意選択で置換される場合、置換基は、下記の置換基節で与えられる置換基から選択される。
Ｒが、任意選択で置換される場合、置換基は、
ハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノ、およびチオエーテル
から選択されることが好ましい。
一実施形態では、ＲまたはＲ２が、任意選択で置換される場合、置換基は、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、およびＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される。
Ｒ２が、Ｃ１〜１２アルキルである場合、任意選択の置換基は加えて、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基およびＣ５〜２０アリール基も含みうる。
Ｒ２が、Ｃ３〜２０ヘテロシクリルである場合、任意選択の置換基は加えて、Ｃ１〜１２アルキル基およびＣ５〜２０アリール基も含みうる。
Ｒ２が、Ｃ５〜２０アリール基である場合、任意選択の置換基は加えて、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基およびＣ１〜１２アルキル基も含みうる。
「アルキル」という用語は、サブクラスであるアルケニルおよびアルキニルならびにシクロアルキルを包含することが理解される。したがって、Ｒ２が、任意選択で置換されたＣ１〜１２アルキルである場合、アルキル基は、任意選択で、コンジュゲート系の一部を形成しうる、１つまたは複数の炭素間二重結合または炭素間三重結合を含有することが理解される。一実施形態では、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキル基は、少なくとも１つの炭素間二重結合または炭素間三重結合を含有し、この結合を、Ｃ１とＣ２との間またはＣ２とＣ３との間に存在する二重結合とコンジュゲートさせる。一実施形態では、Ｃ１〜１２アルキル基は、飽和Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、Ｃ２〜１２アルキニル、およびＣ３〜１２シクロアルキルから選択される基である。
Ｒ２上の置換基が、ハロである場合、それは、好ましくは、ＦまたはＣｌであり、より好ましくは、Ｃｌである。
Ｒ２上の置換基が、エーテルである場合、それは、一部の実施形態では、アルコキシ基、例えば、Ｃ１〜７アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ）の場合もあり、一部の実施形態では、Ｃ５〜７アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）の場合もある。
Ｒ２上の置換基が、Ｃ１〜７アルキルである場合、それは、好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）でありうる。
Ｒ２上の置換基が、Ｃ３〜７ヘテロシクリルである場合、それは、一部の実施形態では、Ｃ６窒素を含有するヘテロシクリル基、例えば、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルでありうる。これらの基は、窒素原子を介して、ＰＢＤ部分の残りの部分に結合させることができる。これらの基は、例えば、Ｃ１〜４アルキル基により、さらに置換することができる。
Ｒ２上の置換基が、ビス−オキシ−Ｃ１〜３アルキレンである場合、これは、ビス−オキシ−メチレンまたはビス−オキシ−エチレンであることが好ましい。
Ｒ２の特に好ましい置換基は、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチル−ピペラジニル、モルホリノ、およびメチル−チエニルを含む。
特に好ましい置換Ｒ２基は、４−メトキシ−フェニル、３−メトキシフェニル、４−エトキシ−フェニル、３−エトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−クロロ−フェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イル、およびキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イル、およびイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル、およびナフチルを含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、Ｒ２は、ハロまたはジハロである。一実施形態では、Ｒ２は、−Ｆまたは−Ｆ２であり、これらの置換基を、下記に、それぞれ、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
として例示する。
ＲＤ
一実施形態では、ＲＤは独立して、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、およびハロから選択される。
一実施形態では、ＲＤは独立して、Ｒである。
一実施形態では、ＲＤは独立して、ハロである。
Ｒ６
一実施形態では、Ｒ６は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−、およびハロから選択される。
一実施形態では、Ｒ６は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、およびハロから選択される。
一実施形態では、Ｒ６は独立して、Ｈおよびハロから選択される。
一実施形態では、Ｒ６は独立して、Ｈである。
一実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、一緒になって、基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−［式中、ｐは、１または２である］を形成する。
Ｒ７
Ｒ７は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、およびハロから選択される。
一実施形態では、Ｒ７は独立して、ＯＲである。
一実施形態では、Ｒ７は独立して、ＯＲ７Ａ［式中、Ｒ７Ａは独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜６アルキルである］である。
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、任意選択で置換された、飽和Ｃ１〜６アルキルである。
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、任意選択で置換された、Ｃ２〜４アルケニルである。
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、Ｍｅである。
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、ＣＨ２Ｐｈである。
一実施形態では、Ｒ７Ａは独立して、アリルである。
一実施形態では、化合物は、二量体［ここで、各単量体のＲ７基は、一緒になって、単量体を連結する、式Ｘ−Ｒ”−Ｘを有する二量体架橋を形成する］である。
Ｒ８
一実施形態では、化合物は、二量体［ここで、各単量体のＲ８基は、一緒になって、単量体を連結する、式Ｘ−Ｒ”−Ｘを有する二量体架橋を形成する］である。
一実施形態では、Ｒ８は独立して、ＯＲ８Ａ［式中、Ｒ８Ａは独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜４アルキルである］である。
一実施形態では、Ｒ８Ａは独立して、任意選択で置換された、飽和Ｃ１〜６アルキルまたは任意選択で置換された、Ｃ２〜４アルケニルである。
一実施形態では、Ｒ８Ａは独立して、Ｍｅである。
一実施形態では、Ｒ８Ａは独立して、ＣＨ２Ｐｈである。
一実施形態では、Ｒ８Ａは独立して、アリルである。
一実施形態では、Ｒ８およびＲ７は、一緒になって、基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−［式中、ｐは、１または２である］を形成する。
一実施形態では、Ｒ８およびＲ９は、一緒になって、基−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−［式中、ｐは、１または２である］を形成する。
Ｒ９
一実施形態では、Ｒ９は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−、およびハロから選択される。
一実施形態では、Ｒ９は独立して、Ｈである。
一実施形態では、Ｒ９は独立して、ＲまたはＯＲである。
ＲおよびＲ’
一実施形態では、Ｒは独立して、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基、およびＣ５〜２０アリール基から選択される。これらの基の各々は、下記の置換基節で定義される。
一実施形態において、Ｒは独立に、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキルである。
一実施形態において、Ｒは独立に、任意選択で置換された、Ｃ３〜２０ヘテロシクリルである。
一実施形態において、Ｒは独立に、任意選択で置換された、Ｃ５〜２０アリールである。
一実施形態において、Ｒは独立に、任意選択で置換された、Ｃ１〜１２アルキルである。
上記では、Ｒ２との関連で、好ましいアルキル基およびアリール基、ならびに任意選択の置換基の識別および数に関する多様な実施形態について記載した。Ｒ２について示された優先事項（preference）は、Ｒにも適用されるので、適切な場合、他の全てのＲ基［ここで、例えば、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９は、Ｒである］にも適用可能である。
Ｒについての優先事項はまた、Ｒ’にも適用される。
本発明の一部の実施形態では、置換基−ＮＲＲ’を有する化合物が提供される。一実施形態では、ＲおよびＲ’は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、任意選択で置換された、４員、５員、６員、または７員の複素環式環を形成する。環は、さらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、またはＳを含有しうる。
一実施形態では、複素環式環は、それ自体、Ｒ基で置換されている。さらなるヘテロ原子Ｎが存在する場合には、置換基は、ヘテロ原子Ｎ上に存在しうる。
Ｒ”
Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であって、ここで、その鎖を、１つまたは複数のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、および／または芳香族環、例えば、環が任意選択で置換されたベンゼンまたはピリジンで中断させうる、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
一実施形態では、Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であって、ここで、その鎖を、１つまたは複数のヘテロ原子、および／または芳香族環、例えば、ベンゼンまたはピリジンで中断させうる、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
一実施形態では、アルキレン基は、Ｏ、Ｓ、およびＮＭｅから選択される１つまたは複数のヘテロ原子、ならびに／または、環が任意選択で置換された芳香族環で、任意選択で中断される。
一実施形態では、芳香族環は、Ｃ５〜２０アリーレン基であり、ここで、アリーレンは、２つの水素原子を、芳香族化合物の２つの芳香族環原子から除去することにより得られる二価部分であって、５〜２０個の環原子を有する部分に関する。
一実施形態では、Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であって、ここで、その鎖を、１つまたは複数のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、および／または芳香族環、例えば、環が任意選択でＮＨ２により置換されたベンゼンまたはピリジンで中断させうる、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基、Ｃ５アルキレン基、Ｃ７アルキレン基、Ｃ９アルキレン基、およびＣ１１アルキレン基から選択される。
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基、Ｃ５アルキレン基、およびＣ７アルキレン基から選択される。
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基およびＣ５アルキレン基から選択される。
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基である。
一実施形態では、Ｒ”は、Ｃ５アルキレン基である。
上記で列挙されたアルキレン基は、１つまたは複数のヘテロ原子、および／または芳香族環、例えば、環が任意選択で置換されたベンゼンまたはピリジンで、任意選択で中断させることができる。
上記で列挙されたアルキレン基は、１つまたは複数のヘテロ原子、および／または芳香族環、例えば、ベンゼンまたはピリジンで、任意選択で中断させることができる。
上記で列挙されたアルキレン基は、非置換の直鎖状脂肪族アルキレン基でありうる。
Ｘ
一実施形態では、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮ（Ｈ）から選択される。
Ｘは、Ｏであることが好ましい。
Ｒ１０
上記で記載した適合性のリンカーなど、適合性のリンカーは、ＳＥＺ６モジュレーター（ＣＢＡ／Ａｂ／Ｍ）を、Ｒ１０位（すなわち、Ｎ１０）における共有結合により、ＰＢＤ薬物部分Ｄに接合させることが好ましい。リンカーとは、１または複数の薬物部分（Ｄ）とモジュレーター（好ましくは、抗体）とを連結して、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するのに使用することができる、二官能性部分または多官能性部分である。リンカー（Ｌ）は、細胞の外部で安定的である、すなわち、細胞外リンカーの場合もあり、酵素活性、加水分解、または他の代謝条件により切断される場合もある。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物部分または抗体への結合について反応性の官能基を有するリンカーを使用して調製し得ると好都合である。抗体（Ａｂ）のシステインチオールまたはアミン、例えば、Ｎ末端アミンもしくはリシンなど、アミノ酸側鎖のアミンは、リンカー試薬またはスペーサー試薬、ＰＢＤ薬物部分（Ｄ）または薬物−リンカー（Ｄ−Ｌ）試薬の官能基との結合を形成し得る。
ＰＢＤ部分のＮ１０位に接合させたリンカー上の多くの官能基は、細胞結合剤との反応に有用であり得る。例えば、エステル連結、チオエステル連結、アミド連結、チオアミド連結、カルバメート連結、チオカルバメート連結、尿素連結、チオ尿素連結、エーテル連結、チオエーテル連結、またはジスルフィド連結は、リンカー−ＰＢＤ薬物中間体と細胞結合剤との反応から形成され得る。
別の実施形態において、リンカーは、凝集、可溶性、または反応性をモジュレートする基で置換することができる。例えば、スルホネート置換基は、ＡＤＣを調製するのに援用される合成経路に応じて、試薬の水溶性を増大させ、リンカー試薬の、抗体または薬物部分とのカップリング反応を容易とする場合もあり、Ａｂ−ＬのＤとのカップリング反応またはＤ−ＬのＡｂとのカップリング反応を容易とする場合もある。
好ましい一実施形態において、Ｒ１０は、基：
［式中、アステリスクは、Ｎ１０位への接合点を指し示し、ＣＢＡは、細胞結合剤／モジュレーターであり、Ｌ１は、リンカーであり、Ａは、Ｌ１を、細胞結合剤に接続する接続基であり、Ｌ２は、共有結合であるか、または−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって、自壊型リンカーを形成し、Ｌ１またはＬ２は、切断型リンカーである］である。
Ｌ１は、好ましくは、切断型リンカーであり、リンカーを切断へと活性化させるための誘因と称することができる。
上記のリンカー節で論じた通り、Ｌ１およびＬ２の性質は、存在する場合、広く変化し得る。これらの基は、それらの切断特徴であって、コンジュゲートを送達する部位における条件により指定され得る特徴に基づいて選択される。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、また、ｐＨの変化（例えば、酸不安定性または塩基不安定性）、温度の変化、または照射時の変化（例えば、光不安定性）により切断されるリンカーも使用することができる。本発明ではまた、還元条件下または酸化条件下で切断されるリンカーも使用することができる。
Ｌ１は、連続アミノ酸配列を含み得る。アミノ酸配列は、酵素による切断のための標的基質であることが可能であり、これにより、Ｒ１０のＮ１０位からの放出を可能とする。
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断される。一実施形態において、酵素は、エステラーゼまたはペプチダーゼである。
一実施形態において、Ｌ２が存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって、自壊型リンカーを形成する。一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性のための基質であり、これにより、Ｒ１０のＮ１０位からの放出を可能とする。
一実施形態において、Ｌ１が、酵素の作用により切断され、Ｌ２が存在する場合、酵素により、Ｌ１とＬ２との間の結合が切断される。
選択されたリンカーの、選択されたＰＢＤへの接合に関して述べると、ＲＣ基は、Ｎ１０〜Ｃ１１におけるイミン結合、カルビノールアミン、置換カルビノールアミンを残すように、ある特定のＰＢＤ部分のＮ１０位から除去可能であり、ここで、ＱＲ１１は、ＯＳＯ３Ｍ、亜硫酸水素付加物、チオカルビノールアミン、置換チオカルビノールアミン、または置換カルビノールアミン（carbinalamine）である。
一実施形態において、ＲＣは、除去可能な保護基であって、Ｎ１０〜Ｃ１１におけるイミン結合、カルビノールアミン、置換カルビノールアミンを残すような保護基の場合もあり、ＱＲ１１が、ＯＳＯ３Ｍ、亜硫酸水素付加物である保護基の場合もある。一実施形態において、ＲＣは、Ｎ１０〜Ｃ１１におけるイミン結合を残すように除去可能な保護基である。
ＲＣ基は、例えば、Ｎ１０〜Ｃ１１におけるイミン結合、カルビノールアミンなどをもたらすように、Ｒ１０基の除去に要求される条件と同じ条件下で除去可能であることを意図する。キャッピング基は、Ｎ１０位において意図される官能基のための保護基として作用する。キャッピング基は、細胞結合剤に対して反応性でないことが意図される。例えば、ＲＣは、ＲＬと同じではない。
キャッピング基を有する化合物は、イミン単量体を有する二量体の合成における中間体として使用することができる。代替的に、キャッピング基を有する化合物は、イミン、カルビノールアミン、置換カルビノールアミンなどをもたらすように、キャッピング基が、標的位置において除去されるコンジュゲートとして使用することができる。したがって、この実施形態において、キャッピング基を、ＷＯ００／１２５０７で規定されている通り、治療剤として除去可能な窒素保護基と称することができる。
一実施形態において、ＲＣ基は、Ｒ１０基のリンカーであるＲＬを切断する条件下で除去可能である。したがって、一実施形態において、キャッピング基は、酵素の作用により切断される。
代替的な実施形態において、キャッピング基は、リンカーＲＬの、モジュレーターへの接続の前に除去可能である。この実施形態において、キャッピング基は、リンカーＲＬを切断しない条件下で除去可能である。
化合物が、細胞結合剤への接続を形成するように、官能Ｇ１基を含む場合、キャッピング基は、Ｇ１の付加または脱マスキングの前に除去可能である。
キャッピング基を、保護基戦略の一部として使用して、二量体内の単量体ユニットのうちの１つだけが、細胞結合剤に接続されることを確保することができる。
キャッピング基を、Ｎ１０〜Ｃ１１におけるイミン結合のためのマスクとして使用することができる。キャッピング基は、イミン官能基が、化合物内で要求される時点で除去することができる。キャッピング基はまた、上記に記載した通り、カルビノールアミン、置換カルビノールアミン、および亜硫酸水素付加物のためのマスクでもある。
一実施形態において、ＲＣは、カルバメート保護基である。
一実施形態において、カルバメート保護基は、
Ａｌｌｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｐｓｅｃ、Ｃｂｚ、およびＰＮＺ
から選択される。
任意選択で、カルバメート保護基は、Ｍｏｃからさらに選択される。
一実施形態において、ＲＣは、細胞結合剤への接続のための官能基を欠くリンカーＲＬ基である。
本出願は特に、カルバメートであるＲＣ基に関する。
一実施形態において、ＲＣは、基：
［式中、アステリスクは、Ｎ１０位への接合点を指し示し、Ｇ２は、末端基であり、Ｌ３は、共有結合または切断型リンカーＬ１であり、Ｌ２は、共有結合であるか、またはＯＣ（＝Ｏ）と一緒になって、自壊型リンカーを形成する］である。
Ｌ３およびＬ２の両方が共有結合である場合、Ｇ２とＯＣ（＝Ｏ）とは併せて、上記で規定したカルバメート保護基を形成する。
Ｌ１は、Ｒ１０との関連において、上記で規定した通りである。
Ｌ２は、Ｒ１０との関連において、上記で規定した通りである。
周知の保護基に基づく末端基を含む、様々な末端基については、下記で記載する。
一実施形態において、Ｌ３は、切断型リンカーＬ１であり、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）と一緒になって、自壊型リンカーを形成する。この実施形態において、Ｇ２は、Ａｃ（アセチル）もしくはＭｏｃ、またはＡｌｌｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｐｓｅｃ、Ｃｂｚ、およびＰＮＺから選択されるカルバメート保護基である。任意選択で、カルバメート保護基は、Ｍｏｃからさらに選択される。
別の実施形態において、Ｇ２は、アシル基−Ｃ（＝Ｏ）Ｇ３［式中、Ｇ３は、アルキル（シクロアルキル、アルケニル、およびアルキニルを含む）、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、およびアリール（ヘテロアリールおよびカルボアリールを含む）から選択される］である。これらの基は、任意選択で、置換することができる。アシル基は、適切な場合、Ｌ３またはＬ２のアミノ基と一緒になって、アミド結合を形成し得る。アシル基は、適切な場合、Ｌ３またはＬ２のヒドロキシ基と一緒になって、エステル結合を形成し得る。
一実施形態において、Ｇ３は、ヘテロアルキルである。ヘテロアルキル基は、ポリエチレングリコールを含み得る。ヘテロアルキル基は、アシル基と隣接するＯまたはＮなどのヘテロ原子を有し、これにより、適切な場合、Ｌ３基またはＬ２基内に存在するヘテロ原子と共に、適切な場合、カルバメート基またはカルボネート基を形成することが可能である。
一実施形態において、Ｇ３は、ＮＨ２、ＮＨＲおよびＮＲＲ’から選択される。Ｇ３は、ＮＲＲ’であることが好ましい。
一実施形態において、Ｇ２は、基：
［式中、アステリスクは、Ｌ３への接合点を指し示し、ｎは、０〜６であり、Ｇ４は、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、およびハロから選択される。ＯＨ基、ＳＨ基、ＮＨ２基、およびＮＨＲ基は、保護されている］である。一実施形態において、ｎは、１〜６であり、好ましくは、ｎは、５である。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、およびＮＲＲ’である。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、およびＮＲＲ’である。好ましくは、Ｇ４は、ＯＲおよびＮＲＲ’から選択され、最も好ましくは、Ｇ４は、ＯＲである。最も好ましくは、Ｇ４は、ＯＭｅである。
一実施形態において、Ｇ２基は、
［式中、アステリスクは、Ｌ３への接合点を指し示し、ｎおよびＧ４は、上記で規定した通りである］である。
一実施形態において、Ｇ２基は、
［式中、アステリスクは、Ｌ３への接合点を指し示し、ｎは、０または１であり、ｍは、０〜５０であり、Ｇ４は、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、およびハロから選択される］である。好ましい実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、０〜１０、１〜２、好ましくは、４〜８であり、最も好ましくは、４または８である。別の実施形態において、ｎは、１であり、ｍは、１０〜５０、好ましくは、２０〜４０である。ＯＨ基、ＳＨ基、ＮＨ２基、およびＮＨＲ基は、保護されている。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、およびＮＲＲ’である。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、およびＮＲＲ’である。好ましくは、Ｇ４は、ＯＲおよびＮＲＲ’から選択され、最も好ましくは、Ｇ４は、ＯＲである。好ましくは、Ｇ４は、ＯＭｅである。
一実施形態において、Ｇ２基は、
［式中、アステリスクは、Ｌ３への接合点を指し示し、ｎ、ｍ、およびＧ４は、上記で規定した通りである］である。
一実施形態において、Ｇ２基は、
［式中、ｎは、１〜２０であり、ｍは、０〜６であり、Ｇ４は、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、およびハロから選択される］である。一実施形態において、ｎは、１〜１０である。別の実施形態において、ｎは、１０〜５０、好ましくは、２０〜４０である。一実施形態において、ｎは、１である。一実施形態において、ｍは、１である。ＯＨ基、ＳＨ基、ＮＨ２基、およびＮＨＲ基は、保護されている。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、およびＮＲＲ’である。一実施形態において、Ｇ４は、ＯＲ、ＳＲ、およびＮＲＲ’である。好ましくは、Ｇ４は、ＯＲおよびＮＲＲ’から選択され、最も好ましくは、Ｇ４は、ＯＲである。好ましくは、Ｇ４は、ＯＭｅである。
一実施形態において、Ｇ２基は、
［式中、アステリスクは、Ｌ３への接合点を指し示し、ｎ、ｍ、およびＧ４は、上記で規定した通りである］である。
上記の実施形態のそれぞれでは、Ｇ４は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、およびＮＨＲであり得る。これらの基は、保護されていることが好ましい。
一実施形態において、ＯＨは、Ｂｚｌ、ＴＢＤＭＳ、またはＴＢＤＰＳで保護されている。
一実施形態において、ＳＨは、Ａｃｍ、Ｂｚｌ、Ｂｚｌ−ＯＭｅ、Ｂｚｌ−Ｍｅ、またはＴｒｔで保護されている。
一実施形態において、ＮＨ２またはＮＨＲは、Ｂｏｃ、Ｍｏｃ、Ｚ−Ｃｌ、Ｆｍｏｃ、Ｚ、またはＡｌｌｏｃで保護されている。
一実施形態において、Ｇ２基は、ジペプチドであるＬ３基との組合せで存在する。
キャッピング基は、モジュレーターへの接続を意図されていない。したがって、二量体内に存在する他の単量体は、リンカーを介するモジュレーターへの接続点として用いられる。したがって、キャッピング基内に存在する官能基は、モジュレーターとの反応に利用可能でないことが好ましい。したがって、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨなど、反応性の官能基は、回避することが好ましい。しかし、このような官能基は、上記に記載した通りに保護されれば、キャッピング基内に存在し得る。
したがって、本明細書の教示に従い、本発明の一実施形態は、化合物：
［式中、ＣＢＡは、細胞結合剤／モジュレーターであり、ｎは、０または１である。Ｌ１は、既に規定した通りであり、ＲＥおよびＲＥ”はそれぞれ、ＨまたはＲＤから独立に選択される］を含むコンジュゲートを含む。
別の実施形態において、コンジュゲートは、化合物：
［式中、ＣＢＡは、細胞結合剤／モジュレーターであり、Ｌ１は、既に規定した通りであり、Ａｒ１およびＡｒ２はそれぞれ、独立に、任意選択で、Ｃ５〜２０アリールにより置換され、ｎは、０または１である］を含む。
当業者であれば、他の対称性および非対称性のＰＢＤ二量体およびリンカーも、本発明と適合性であり、本明細書の教示および先行技術に基づき、不要な実験を伴わずに選択され得ることを認められよう。
本発明の別の態様は、放射性同位体を含むＡＤＣを含む。このような実施形態と適合性であり得る例示的な放射性同位体は、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、および２１１Ａｔなどが挙げられるがこれらに限定されない。また、他の放射性核種、とりわけ、エネルギー範囲を６０〜４，０００ｋｅＶとする放射性核種も、診断剤および治療剤として利用可能である。処置される状態および所望の治療プロファイルに応じて、当業者は、開示されているモジュレーターを伴う使用に適する放射性同位体を容易に選択することができる。
本発明のＳＥＺ６モジュレーターはまた、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物（例えば、生物学的応答修飾因子またはＢＲＭ）にコンジュゲートさせることもできる。すなわち、本発明と適合性の治療剤または部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるとはみなさないものとする。例えば、特に好ましい実施形態において、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片であり得る。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（または別の細胞傷害性ＲＮａｓｅ）、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際特許出願公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照されたい）、ＡＩＭ ＩＩ（国際特許出願公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Takahashiら、１９９４年、J. Immunol.、６巻：１５６７頁）、およびＶＥＧＩ（国際特許出願公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照されたい）などのタンパク質、抗血栓剤もしくは抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン；または、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」））、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、および顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、もしくは増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」）などの生物学的応答修飾因子を含み得る。上記で示した通り、当技術分野では、モジュレーターをポリペプチド部分に融合またはコンジュゲートさせる方法が公知である。既に開示した対象の参考文献に加えて、例えば、それらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，３３６，６０３、同５，６２２，９２９、同５，３５９，０４６、同５，３４９，０５３、同５，４４７，８５１、および同５，１１２，９４６；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０４３８８号および同第ＷＯ９１／０６５７０号； Ashkenaziら、１９９１年、PNAS USA、８８巻：１０５３５頁； Zhengら、１９９５年、J Immunol、１５４巻：５５９０頁；およびVilら、１９９２年、PNAS USA、８９巻：１１３３７頁を参照されたい。さらに、上記で示した通り、モジュレーターの、このような部分との会合は、必ずしも直接的な会合である必要はなく、リンカー配列を介して施すことができる。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、それらのそれぞれが本明細書に組み込まれる、Denardoら、１９９８年、Clin Cancer Res、４巻：２４８３頁； Petersonら、１９９９年、Bioconjug Chem、１０巻：５５３頁； Zimmermanら、１９９９年、Nucl Med Biol、２６巻：９４３頁； Garnett、２００２年、Adv Drug Deliv Rev、５３巻：１７１頁において記載されている。
ＩＸ．診断およびスクリーニング
Ａ．診断
さらに他の実施形態において、本発明は、増殖性障害を検出、診断、またはモニタリングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法またはｉｎ ｖｉｖｏ方法、および患者に由来する細胞をスクリーニングして、ＣＳＣを含む腫瘍形成性細胞を同定する方法を提供する。このような方法は、がんの進行を処置またはモニタリングするために、がんを有する個体を同定するステップを含み、このステップは、患者または患者から得られる試料（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれか）を、本明細書で記載されているモジュレーターと接触させるステップと、試料における結合または遊離標的分子へのモジュレーターの会合の存在または非存在またはレベルを検出するステップを含む。特に好ましい実施形態において、モジュレーターは、本明細書に記載されている検出可能な標識またはレポーター分子を含むであろう。
一部の実施形態において、抗体など、モジュレーターの、試料中の特定の細胞との会合により、試料は、ＣＳＣを含有し得ることが表示されることから、がんを有する個体を、本明細書に記載されているモジュレーターで有効に処置し得ることが指し示される可能性が高い。方法は、結合レベルを対照と比較するステップをさらに含み得る。逆に、モジュレーターが、Ｆｃ構築物であり、所望の情報をもたらすように試料と接触させる場合は、結合特性を利用し、モニタリングする（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、直接的または間接的に）ことができる。
例示的な適合性のアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、競合的結合アッセイ、蛍光免疫アッセイ、免疫ブロットアッセイ、ウェスタンブロット解析、フローサイトメトリーアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。ｉｎ ｖｉｖｏにおける適合性の治療診断または診断は、当業者が公知の通り、磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、ポジトロン断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線造影、超音波など、当技術分野で認知されたイメージング技法またはモニタリング技法を含み得る。
別の実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがんの進行および／または発症機序を解析する方法を提供する。別の実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがんの進行および／または発症機序の解析は、腫瘍進行の程度を決定するステップを含む。別の実施形態において、解析は、腫瘍の同定を含む。別の実施形態において、腫瘍進行の解析を、原発性腫瘍に対して実施する。別の実施形態において、解析を、当業者に公知のがんの種類に応じて、ある時間にわたり実施する。別の実施形態において、原発性腫瘍の転移細胞に由来する続発性腫瘍についてのさらなる解析を、ｉｎ ｖｉｖｏで行う。別の実施形態において、続発性腫瘍のサイズおよび形状について解析する。一部の実施形態において、さらなるｅｘ ｖｉｖｏ解析も実施する。
別の実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがんの進行および／または発症機序を解析する方法であって、細胞の転移を決定するステップ、または循環腫瘍細胞のレベルを検出するもしくは定量化するステップを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において、細胞の転移についての解析は、原発性腫瘍から不連続の部位における、細胞の進行性増殖の決定を含む。別の実施形態において、細胞の転移解析の部位は、新生物性拡大の経路を含む。一部の実施形態において、細胞は、血管系、リンパ系、体内腔、またはこれらの組合せを介して分散し得る。別の実施形態において、細胞の転移解析は、細胞の遊走、播種、溢出、増殖、またはこれらの組合せに関して実施する。
したがって、特に好ましい実施形態において、本発明のモジュレーターを使用して、患者試料（例えば、血漿または血液）中のＳＥＺ６レベルを検出および定量化することができ、これを使用して、増殖性障害を含むＳＥＺ６関連障害を検出、診断、またはモニタリングすることができる。関連の実施形態において、本発明のモジュレーターを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、循環腫瘍細胞を検出、モニタリング、および／または定量化することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照されたい）。さらに他の好ましい実施形態において、循環腫瘍細胞は、がん幹細胞を含み得る。
ある特定の例では、ベースラインを確立するように、治療またはレジメンの前に、開示されているモジュレーターを使用して、対象における腫瘍形成性細胞、または対象に由来する試料中の腫瘍形成性細胞を評価するかまたは特徴付けることができる。他の例では、試料は、処置された対象に由来する。一部の例では、試料は、対象から、対象が、処置を開始または終了した、少なくとも約１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、６０、９０日後、６カ月後、９カ月後、１２カ月後、または＞１２カ月後に採取される。ある特定の例では、腫瘍形成性細胞は、ある特定の投与回数の後で（例えば、２、５、１０、２０、３０またはこれを超える投与回数の治療の後で）評価するかまたは特徴付ける。他の例では、腫瘍形成性細胞は、１回または複数回の治療を施した１週間、２週間、１カ月間、２カ月間、１年間、２年間、３年間、４年間またはこれを超える期間の後で、特徴付けるかまたは評価する。
別の態様では、かつ、以下でより詳細に論じられる通り、本発明は、過剰増殖性障害を検出、モニタリング、もしくは診断するか、可能な処置のために、このような障害を有する個体を同定するか、または患者における障害の進行（または退縮）をモニタリングするためのキットであって、本明細書に記載されているモジュレーター、およびモジュレーターの試料に対する効果を検出するための試薬を含むキットを提供する。
本発明のさらに別の態様は、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）のために標識されたＳＥＺ６の使用を含む。これに関して、ＳＥＺ６ ＩＨＣを、診断用ツールとして使用して、様々な増殖性障害の診断の一助とし、ＳＥＺ６モジュレーター療法を含む処置に対する潜在的応答をモニタリングすることができる。適合性の診断アッセイは、化学的に固定（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、二クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化第二水銀、四酸化クロム、およびピクリン酸などが挙げられるがこれらに限定されない）され、包埋（メタクリル酸グリコール、パラフィン、および樹脂などが挙げられるがこれらに限定されない）されているか、または凍結を介して保存された組織に対して実施することができる。下記でより詳細に論じられる通り、このようなアッセイは、処置に関する決定を誘導し、投与レジメンおよび投与時期を決定するのに使用し得るであろう。
好ましい実施形態において、本発明は、白金抵抗性小細胞肺がんを診断する方法であって、（ａ）小細胞肺がん腫瘍対象に由来する試料を用意するステップと；（ｂ）腫瘍試料を、レポーターで標識された抗ＳＥＺ６抗体へと曝露するステップであり、前記抗ＳＥＺ６抗体が、腫瘍試料と会合するステップと；（ｃ）腫瘍試料と会合したレポーターを検出するステップとを含む方法を対象とする。好ましい実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける診断方法（例えば、ＩＨＣ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、またはフローサイトメトリー）を使用して、このようなレポーターを検出することができる。一部の実施形態において、腫瘍試料を用意するステップは、腫瘍試料を抗ＳＥＺ６抗体へと曝露するステップ、または腫瘍試料と会合したレポーターを検出するステップとは別個に実施することができる。
別の実施形態において、本発明は、髄様甲状腺がんを診断する方法であって、（ａ）髄様甲状腺腫瘍対象に由来する試料を用意するステップと；（ｂ）腫瘍試料を、レポーターで標識された抗ＳＥＺ６抗体へと曝露するステップであり、前記抗ＳＥＺ６抗体が、腫瘍試料と会合するステップと；（ｃ）腫瘍試料と会合したレポーターを検出するステップとを含む方法を対象とする。好ましい実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける診断方法（例えば、ＩＨＣ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、またはフローサイトメトリー）を使用して、このようなレポーターを検出することができる。一部の実施形態において、腫瘍試料を用意するステップは、腫瘍試料を抗ＳＥＺ６抗体へと曝露するステップ、または腫瘍試料と会合したレポーターを検出するステップとは別個に実施することができる。
Ｂ．スクリーニング
ある特定の実施形態において、モジュレーターはまた、抗原（例えば、その遺伝子型構成要素または表現型構成要素）と相互作用することにより、腫瘍形成性細胞またはそれらの後代の機能または活性を変化させる化合物または薬剤（例えば、薬物）についてスクリーニングするかまたはこれらを同定するのにも使用することができる。このような化合物および薬剤は、例えば、増殖性障害の処置についてスクリーニングされる候補薬物であり得る。一実施形態において、系または方法は、ＳＥＺ６を含む腫瘍形成性細胞および化合物または薬剤（例えば、薬物）を含み、ここで、細胞および化合物または薬剤を互いと接触させる。このような実施形態において、対象細胞は、開示されているモジュレーターを使用して、同定され、モニタリングされ、かつ／または富化されている。
さらに別の実施形態において、方法は、腫瘍形成性細胞またはそれらの後代を、被験薬剤または被験化合物と、直接的または間接的に接触させるステップと、被験薬剤または被験化合物により、抗原を会合させた腫瘍形成性細胞の活性または機能がモジュレートされるかどうかを決定するステップとを含む。直接的な相互作用の１つの例は、物理的相互作用であるが、間接的相互作用は、組成物の、中間的分子に対する作用を含み、中間的分子が、言及される実体（例えば、細胞または細胞培養物）に対して作用する。モジュレートされ得る例示的な活性または機能は、細胞の形状もしくは生存率の変化、マーカーの発現、分化または脱分化、細胞呼吸、ミトコンドリア活性、膜の完全性、成熟、増殖、生存率、アポトーシス、または細胞死を含む。
薬剤および化合物をスクリーニングおよび同定する方法は、ハイスループットスクリーニングに適する方法であって、任意選択で、所定の位置またはアドレスに位置付けられまたは配置された細胞アレイ（例えば、マイクロアレイ）を含む方法を含む。例えば、細胞は、培養ディッシュ、試験管、フラスコ、ローラーボトル、またはプレート（例えば、８、１６、３２、６４、９６、３８４、および１５３６マルチウェルプレートまたはディッシュなど、単一のマルチウェルプレートまたはディッシュ）上に位置付けられまたは配置される（あらかじめ播種される）。ロボット式または手動式のハイスループット方法により、化学的相互作用をプローブし、短時間で多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナル（例えば、フルオロフォアを介する）および超高速で情報を処理する自動式解析を活用する技法が開発されている（例えば、Pinhasovら、Comb. Chem. High Throughput Screen.、７巻：１３３頁（２００４年）を参照されたい）。例えば、マイクロアレイ技術は、特異的な遺伝子についての情報をもたらす一方で、数千にわたる遺伝子の相互作用を一度にプローブするのに広範にわたり使用されている（例えば、MocellinおよびRossi、Adv. Exp. Med. Biol.、５９３巻：１９頁（２００７年）を参照されたい）。
スクリーニングされ得るライブラリーは、例えば、小分子ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、完全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリー（Ａｄｉｍａｂ，ＬＬＣ）、ｓｉＲＮＡライブラリー、およびアデノウイルストランスフェクションベクターを含む。
Ｘ．医薬調製物および治療的使用
Ａ．製剤および投与経路
任意選択のコンジュゲートを伴うモジュレーターの形態、意図される送達方式、処置またはモニタリングされる疾患、および他の多数の変数に応じ、当技術分野で認識された技法を使用して、本発明の組成物を、所望の通りに製剤化することができる。一部の実施形態では、本発明の治療用組成物は、さらなる成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分を伴って投与することもできるが、そのほかは、任意選択で、適切な、薬学的に許容される担体であって、当技術分野で周知の賦形剤および補助剤を含む担体を含有するように製剤化することもできる（例えば、Gennaro、Remington： The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons： Drugfacts Plus、２０版（２００３年）； Anselら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、７版、Lippencott Williams and Wilkins（２００４年）；Kibbeら、Handbook of Pharmaceutical Excipients、３版、Pharamaceutical Press （２０００年）を参照されたい）。ビヒクル、アジュバント、および希釈剤を含む、多様な、薬学的に許容される担体は、多数の市販の供給源からたやすく入手可能である。さらにまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、安定化剤、湿潤剤など、薬学的に許容される補助物質一式も入手可能である。ある特定の非限定的な例示的担体は、食塩液、緩衝食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せを含む。
より特定すると、一部の実施形態では、本発明の治療用組成物は、さらなる成分を伴わずに投与することもでき、最小限のさらなる成分を伴って投与することもできることが認識される。逆に、本発明の抗ＳＥＺ６モジュレーターは、任意選択で、適切な、薬学的に許容される担体であって、当技術分野で周知であり、モジュレーターの投与を容易にする比較的不活性な物質であるか、または活性化合物を、作用部位に送達するために薬学的に最適化された調製物へと加工する一助となる、賦形剤および補助剤を含む担体を含有するように製剤化することもできる。例えば、賦形剤は、形態または粘稠性をもたらす場合もあり、モジュレーターの薬物動態または安定性を改善するための希釈剤として作用する場合もある。適切な賦形剤または添加剤は、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、容量オスモル濃度を変化させる塩、封入剤、緩衝剤、および皮膚浸透増強剤を含むがこれらに限定されない。ある特定の好ましい実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥形態で提供され、投与前に、例えば、緩衝食塩液中で再構成される場合もある。
全身投与用に開示されるモジュレーターは、経腸投与用、非経口投与用、または局所投与用に製剤化することもできる。実際、３種類の製剤全てを同時に使用して、有効成分の全身投与を達成することができる。非経口および非経口でない薬物送達用の賦形剤ならびに製剤は、Remington, The Science and Practice of Pharmacy、２０版、Mack Publishing（２０００年）に示されている。非経口投与に適する製剤は、水溶性形態、例えば、水溶性の塩形態にある活性化合物の水溶液を含む。加えて、油性の注射用懸濁液に適するものとしての活性化合物の懸濁液も投与することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えば、ヘキシル置換されたポリ（ラクチド）、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質を含有することが可能であり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む。任意選択で、懸濁液はまた、安定化剤も含有しうる。リポソームはまた、細胞に送達するための薬剤を封入するのにも使用することができる。
経腸投与に適する製剤は、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤、丸薬、コーティングされた錠剤を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、または吸入剤、およびこれらの制御放出形態を含む。
一般に、ＳＥＺ６モジュレーターを含む、本発明の化合物および組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、それを必要とする被験体に、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、室内（intraventricular）、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、および髄腔内（intrathecal）を含むがこれらに限定されない多様な経路によるか、またはこれら以外では、植込みもしくは吸入により投与することができる。対象の組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、およびエアゾールを含むがこれらに限定されない、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物に製剤化することができる。適切な製剤および投与経路は、意図される適用および治療レジメンに従い選択することができる。
Ｂ．投与量
同様に、ある特定の投与レジメン、すなわち、用量、投与時期、および投与回数は、特定の個体およびその個体の病歴、ならびに薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）などの経験的な検討事項に依存する。投与頻度は、治療コースにわたり決定および調整することができ、増殖性細胞または腫瘍形成性細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持、新生物性細胞の増殖の低減、または転移の発生の遅延に基づく。他の実施形態では、投与される投与量を調整するかまたは減じて、潜在的な副作用および／または毒性を管理することができる。代替的に、対象の治療用組成物の連続的な徐放製剤も適切でありうる。
一般に、本発明のモジュレーターは、多様な範囲で投与することができる。これらは、投与１回当たり約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重；投与１回当たり約５０μｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重；投与１回当たり約１００μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。他の範囲は、投与１回当たり約１００μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、および投与１回当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重を含む。ある特定の実施形態では、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
選択された実施形態において、モジュレーターは、投与１回当たり体重１ｋｇ当たり約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μｇで投与されるであろう。他の実施形態は、投与１回当たり体重１ｋｇ当たり約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００μｇで、モジュレーターの投与を含むであろう。他の好ましい実施形態において、開示されているモジュレーターは、１ｋｇ当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇで投与されるであろう。さらに他の実施形態において、モジュレーターは、投与１回当たり体重１ｋｇ当たり１２、１４、１６、１８、または２０ｍｇで投与することができる。さらに他の実施形態において、モジュレーターは、投与１回当たり体重１ｋｇ当たり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、または１００ｍｇで投与することができる。本明細書の教示によれば、上述の投与量は、非コンジュゲートモジュレーターおよび細胞傷害剤にコンジュゲートさせたモジュレーターのいずれにも適用可能であることが認められよう。当業者は、前臨床動物研究、臨床観察、ならびに標準的な医療技法および生化学技法および測定に基づき、様々なコンジュゲートモジュレーターおよび非コンジュゲートモジュレーターに適する投与量を容易に決定し得るであろう。
コンジュゲートモジュレーターに関して、特に好ましい実施形態は、投与１回当たり体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの間の投与量を含むであろう。これに関して、コンジュゲートモジュレーターは、投与１回当たり体重１ｋｇ当たり５０、７５、もしくは１００μｇ、または体重１ｋｇ当たり０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、もしくは１ｍｇで投与することができる。他の好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートモジュレーターは、投与１回当たり体重１ｋｇ当たり１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、または５ｍｇで投与することができる。特に好ましい実施形態において、このようなコンジュゲートモジュレーターの投与量は、ある期間にわたり静脈内投与されるであろう。さらに、このような投与量は、規定された処置コースにおいて、複数回にわたり投与することもできる。
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７において開示されている通り、体表面積（ＢＳＡ）の計算に立脚し得る。周知の通り、ＢＳＡは、患者の身長および体重を使用して計算され、患者の身体の表面積により表される対象のサイズについての尺度をもたらす。ある特定の実施形態において、モジュレーターは、１０ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の投与量で投与することができ、１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、または４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与することができる。
また、当技術分野で認知された技法および経験的な技法を使用して、コンジュゲートモジュレーター（すなわち、ＡＤＣ）に適する投与量を決定し得ることも認められよう。
いずれにせよ、ＳＥＺ６モジュレーター（コンジュゲートモジュレーターおよび非コンジュゲートモジュレーターの両方）は、それを必要とする対象に必要に応じて投与することが好ましい。投与頻度の決定は、主治医などの当業者が、処置される状態、処置される対象の年齢、処置される状態の重症度、処置される対象の全般的な健康状態などについての検討に基づき下すことができる。一般に、有効用量のＳＥＺ６モジュレーターを、１回または複数回にわたり対象に投与する。より特定すると、有効用量のモジュレーターは、毎月１回、毎月１回を超えて、または毎月１回未満対象に投与する。ある特定の実施形態において、有効用量のＳＥＺ６モジュレーターを、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、または数年間を含む期間において、複数回にわたり投与することができる。さらに他の実施形態において、開示されているモジュレーターの投与の間に、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合もあり、数カ月間（１、２、３、４、５、６、７、または８カ月間）が経過する場合もあり、なおまたは１年間もしくは数年間が経過する場合もある。
ある特定の好ましい実施形態では、コンジュゲートモジュレーターを有する処置コースは、選択された医薬品（すなわちＡＤＣ）の、数週間または数カ月間における、複数回にわたる投与を含む。より具体的に述べると、本発明のコンジュゲートモジュレーターは、毎日１回、２日ごとに１回、４日ごとに１回、毎週１回、１０日ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、毎月１回、６週間ごとに１回、２カ月ごとに１回、１０週間ごとに１回、または３カ月ごとに１回投与することができる。これに関して、患者の応答および臨床的慣行に基づき、投与量を変化させることもでき、投与間隔を調整することもできることが認識される。
投与量およびレジメンはまた、開示される治療用組成物について、１回または複数回の投与を施された個体において、経験的に決定することもできる。例えば、個体には、本明細書で記載される通りに生成された治療用組成物を、投与量を漸増させて施すことができる。選択された実施形態では、投与量は、それぞれ、経験的に決定されるかまたは観察される副作用または毒性に基づき、段階的に増加させることもでき、低減するかまたは減じることもできる。選択された組成物の有効性を評価するには、既に記載されている通り、具体的な疾患、障害、または状態についてのマーカーを追跡することができる。個体がんを有する実施形態では、マーカーは、触診もしくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定、ｘ線もしくは他のイメージング技法による腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍の生検および腫瘍試料の顕微鏡観察により評価される改善；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんについてのＰＳＡ）もしくは本明細書で記載される方法に従い同定される、抗原の測定；疼痛もしくは麻痺の軽減；腫瘍と関連する発話、視覚、呼吸、もしくは他の身体機能障害の改善；食欲の増進；または受け入れられた検査により測定される生活の質の向上もしくは生存の延長を含む。当業者には、投与量が、個体、新生物性状態の種類、新生物性状態の病期、新生物性状態が個体における他の場所に転移し始めたかどうか、ならびに過去に使用された処置および現在用いられている処置に応じて変化することが明らかである。
Ｃ．組合せ療法
組合せ療法は、望ましくない新生物性の細胞増殖を減殺もしくは阻害するか、がんの発症を減少させるか、がんの再発を減少させるかもしくは防止するか、またはがんの拡大もしくは転移を減殺もしくは防止するのに特に有用であり得る。このような場合、本発明のモジュレーターは、除去しなければ腫瘍塊を下支えして永続化させるＣＳＣを除去することにより、感作剤または化学感作剤として機能することが可能であり、これにより、現行の標準治療である減量剤または抗がん剤のより有効な使用を可能とする。本明細書において使用される場合、「組合せ療法」は、少なくとも１つのＳＥＺ６モジュレーターおよび少なくとも１つの治療用部分（例えば、抗がん剤）を含む組合せであって、好ましくは、がん（例えば、髄様甲状腺がんまたはＳＣＬＣ）の処置において、（ｉ）単独で使用されるＳＥＺ６モジュレーター、もしくは（ｉｉ）単独で使用される治療用部分、もしくは（ｉｉｉ）ＳＥＺ６モジュレーターを添加せずに別の治療用部分と組み合わせた治療用部分の使用を凌駕する治療的相乗作用を及ぼすか、またはこれらを凌駕して測定可能な治療効果を改善する組合せの投与を意味する。本明細書において使用される場合、「治療的相乗作用」という用語は、ＳＥＺ６モジュレーターと１または複数の治療用部分との組合せであって、ＳＥＺ６モジュレーターと１または複数の治療用部分との組合せの相加効果を超える治療効果を有する組合せを意味する。
本発明における「組合せ療法」の文脈では、治療用部分は、１または複数の抗がん剤であって、細胞傷害剤、細胞分裂阻害剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤（モノクローナル抗体および小分子実体の両方を含む）、ＢＲＭ、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、および抗転移薬剤、ならびに免疫療法剤を含むことが可能であり、特異手法および非特異手法の両方を含む。
開示されている組合せによる所望の転帰は、対照またはベースラインの測定に照らした比較により定量化される。本明細書において使用される場合、「改善する」「増大させる」または「低減する」などの相対的な用語は、本明細書に記載されている処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載されているＳＥＺ６モジュレーターの非存在下であるが、標準治療による処置など、他の治療用部分の存在下の対照個体（または複数の対照個体）における測定値などの対照と比べた値を指し示す。代表的な対照個体は、処置される個体と同じ形態のがんに罹患する個体であって、処置される個体とほぼ同じ年齢の個体である（処置される個体における病期と、対照個体における病期とが同等であることを確保するように）。
治療への応答の変化または改善は一般に、統計学的に有意である。本明細書において使用される場合、「有意性」または「有意」という用語は、２つまたはこれを超える実体の間にランダムでない関連が存在する確率についての統計学的解析に関する。関係が「有意」であるのかないのか、または関係に「有意性」があるのかないのかを決定するために、「ｐ値」を計算することができる。使用者により規定されたカットオフ点を下回るｐ値は、有意であるとみなされる。０．１未満であるかもしくはこれと等しいｐ値、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．００１未満のｐ値は、有意であるとみなすことができる。
相乗作用的治療効果は、単一の治療用部分もしくはＳＥＺ６モジュレーターにより誘発される治療効果、または所与の組合せのＳＥＺ６モジュレーターもしくは単一の治療用部分により誘発される治療効果の総和の少なくとも約２倍の効果の場合もあり、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍の効果の場合もある。相乗作用的治療効果はまた、単一の治療用部分もしくはＳＥＺ６モジュレーターにより誘発される治療効果、または所与の組合せのＳＥＺ６モジュレーターもしくは単一の治療用部分により誘発される治療効果の総和と比較して、少なくとも１０％の治療効果の増大として観察される場合もあり、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、またはこれを超える治療効果の増大として観察される場合もある。相乗効果はまた、それらを組合せで使用する場合に、治療剤の投与の低減を可能とする効果でもある。
組合せ療法を実施するには、モジュレーターおよび抗がん剤を、被験体に、単一の組成物により同時に投与することもでき、２つまたはこれを超える別個の組成物として、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して、同時に投与することもできる。代替的に、モジュレーターは、抗がん剤による処置に、例えば、数分間〜数週間の範囲の間隔で先行する場合もあり、後続する場合もある。各送達の間の期間は、抗がん剤とモジュレーターとが、腫瘍に対して組合せ効果を及ぼしうるような期間である。少なくとも１つの実施形態では、抗がん剤およびモジュレーターの両方を、互いから約５分間〜約２週間以内に投与する。さらに他の実施形態では、モジュレーターの投与と、抗がん剤の投与の間に、数日間（２、３、４、５、６、または７日間）が経過する場合もあり、数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合もあり、数カ月間（１、２、３、４、５、６、７、または８カ月間）が経過する場合もある。
組合せ療法は、１回、２回、または少なくとも状態が処置されるか、緩和されるか、または治癒するまでの期間にわたり投与することができる。一部の実施形態では、組合せ療法は、複数回にわたり、例えば、毎日３回〜６カ月ごとに１回投与される。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、隔日１回、３日ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回、隔月１回、３カ月ごとに１回、６カ月ごとに１回などのスケジュールで行うこともでき、ミニポンプを介して持続的に投与することもできる。組合せ療法は、既に言及された任意の経路を介して投与することができる。組合せ療法は、腫瘍部位から遠隔の部位に投与することもできる。
一実施形態では、モジュレーターを、短い処置サイクルにわたり、１種または複数の抗がん剤と組み合わせて、それを必要とする被験体に投与する。本発明はまた、非持続的な投与、または毎日の用量の複数回の部分的な投与への分割も意図する。モジュレーターと抗がん剤とは、隔日または隔週で交互に投与することもでき、一連の抗体処置を施した後で、抗がん剤療法による１回または複数回にわたる処置を施すこともできる。いずれにせよ、当業者により理解される通り、化学療法剤の適切な用量は一般に、ほぼ臨床療法において既に用いられている用量であり、この場合、化学療法剤は、単独でまたは他の化学療法剤と組み合わせて投与される。
別の好ましい実施形態では、本発明のＳＥＺ６モジュレーターを、腫瘍の初期症状後における再発の可能性を低減するかまたは消失させる維持療法において使用することもできる。障害は処置され、初期腫瘍塊を消失させるか、軽減させるか、または他の形で改善され、それにより患者は無症状であるかまたは寛解していることが好ましい。このようなときは、標準的な診断手順を使用して、疾患の徴候がほとんどまたは全くなくてもなお、被験体に、薬学的有効量の、開示されるモジュレーターを、１回または複数回にわたり投与することができる。一部の実施形態では、モジュレーターは、毎週、隔週、毎月、６週間ごと、２カ月ごと、３カ月ごと、６カ月ごと、または毎年など、ある期間にわたり、定期的なスケジュールで投与される。本明細書の教示を踏まえるなら、当業者は、疾患再発の潜在的可能性を低減する好適な投与量および投与レジメンをたやすく決定しうる。さらに、このような処置は、患者の応答ならびに臨床パラメータおよび診断パラメータに応じて、数週間、数カ月間、数年間の期間にわたり、なおまたは無期限に継続しうる。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターを、減量手順後において、腫瘍転移の可能性を防止または低減するために、予防的に使用することもでき、アジュバント療法として使用することもできる。本開示で使用される「減量手順」とは、広義で定義され、腫瘍または腫瘍の増殖を、消失させるか、低減するか、処置するか、または改善する、任意の手順、技法、または方法を意味するものとする。例示的な減量手順は、手術、照射処置（すなわち、ビーム照射）、化学療法、免疫療法、または切除を含むがこれらに限定されない。腫瘍の転移を低減する臨床手順、診断手順、または治療診断手順により示唆される通り、本開示の観点に照らして当業者によりたやすく決定される適切な時点において、開示されるモジュレーターを投与することができる。モジュレーターは、標準的な技法を使用して決定される薬学的に有効な投与量で、１回または複数回にわたり投与することができる。投与レジメンは、その改変を可能とする、適切な診断技法またはモニタリング技法を伴うことが好ましい。
本発明のさらに他の実施形態は、開示されるモジュレーターを、無症状であるが、増殖性障害を発症する危険性がある被験体に投与することを含む。すなわち、本発明のモジュレーターは、真に防止的な意味で使用することができ、調査または検査され、１つまたは複数の言及された危険因子（例えば、ゲノムによる徴候、家族歴、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける検査結果など）を有するが、新生物を発症していない患者へも施すことができる。このような場合、当業者であれば、経験的な観察によるかまたは受け入れられた臨床的慣行により、有効な投与レジメンを決定することが可能である。
一部の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、および／またはオキサリプラチン）など、様々なファーストラインのＳＣＬＣ処置と組み合わせて使用することができる。一実施形態において、組合せ療法は、ＳＥＺ６モジュレーターと、白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、および／またはオキサリプラチン）と、任意選択で、１または複数の他の治療用部分との使用を含む。別の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、シクロホスファミドと、任意選択で、ドキソルビシンおよび／またはビンクリスチンと組み合わせて使用することもできる。さらに別の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、エトポシドと組み合わせて使用することができる。さらなる実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、トポテカンまたはパクリタキセルと組み合わせて使用することができる。
他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、カボザンチニブまたはバンデタニブなど、様々なファーストラインの髄様甲状腺腫瘍処置と組み合わせて使用することができる。一実施形態において、組合せ療法は、ＳＥＺ６モジュレーターと、カボザンチニブと、任意選択で、１または複数の他の治療用部分との使用を含む。別の実施形態において、組合せ療法は、ＳＥＺ６モジュレーターと、バンデタニブと、任意選択で、１または複数の他の治療用部分との使用を含む。
組合せ療法は、突然変異しているか、または発現の異常な遺伝子またはタンパク質（例えば、ＲＥＴ）を含む髄様甲状腺腫瘍に対して有効な、別の治療用部分と組み合わせたＳＥＺ６モジュレーターを含み得る。
本発明はまた、ＳＥＺ６モジュレーターの、放射線療法との組合せも提供する。他の実施形態において、ＳＥＺ６モジュレーターは、下記で記載される抗がん剤のうちの１または複数と組み合わせて使用することができる。
Ｄ．抗がん剤
「抗がん剤」または「抗増殖剤」という用語は、がんなどの細胞増殖性障害を処置するのに使用しうる任意の薬剤を意味し、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、抗脈管形成剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化された抗がん剤、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、照射療法、および抗転移剤、ならびに免疫療法剤を含むがこれらに限定されない。選択された実施形態において、上記で論じた通り、このような抗がん剤は、コンジュゲートを構成することが可能であり、投与の前にモジュレーターと会合させ得ることが認められよう。ある特定の実施形態において、開示されている抗がん剤は、ＳＥＺ６モジュレーターに連結されて、本明細書で示されるＡＤＣをもたらすであろう。
本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞に対して毒性であり、細胞の機能を減少させるかもしくは阻害し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。典型的には、その物質は、生物に由来する天然に存在する分子である。細胞傷害剤の例は、細菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、ジフテリア（Diptheria）毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属内毒素および外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、アブリン、リシン、モデクシン、ビスクミン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａによる阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓによる阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitegellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物の低分子毒素もしくは酵素的活性毒素（例えば、それらの断片および／または変異体を含む、細胞外膵臓ＲＮアーゼなどの細胞傷害性ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ）を含むがこれらに限定されない。
本発明の目的では、「化学療法剤」は、がん細胞の成長、増殖および／または生存を非特異的に減少させるまたは阻害する化学化合物（例えば、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤）を含む。このような化学薬品は、細胞成長または細胞分裂に必要な細胞内過程を対象とすることが多く、したがって、一般に成長および分裂が急速であるがん性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合化し、これにより、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法剤は、がん性細胞またはがん性となる可能性がある細胞もしくは腫瘍形成性の後代を発生させる可能性がある細胞（例えば、ＴＩＣ）を阻害するかまたは阻害するように設計された、任意の化学薬品を含みうる。このような薬剤は、組合せで、例えば、ＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンで投与されることが多く、最も有効であることが多い。ここでもまた、選択された実施形態において、このような化学療法剤を、開示されているモジュレーターにコンジュゲートさせることができる。
本発明のモジュレーターと組み合わせて（コンジュゲートされて）使用されうる抗がん剤の例は、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアミラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン（eleutherobin）、パンクラチスタチン、サルコジクチイン（sarcodictyin）、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ジネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質、エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（cactionomycin）、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシンであるＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖複合体であるＰＳＫ（登録商標）（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ゲムシタビンであるＧＥＭＺＡＲ（登録商標）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビンであるＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluorometlhylornithine）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤であって、細胞増殖を低減する阻害剤、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含むがこれらに限定されない。この定義にはまた、腫瘍におけるホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤であって、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体モジュレーター、副腎におけるエストロゲンの産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、ならびに抗アンドロゲン剤などの抗ホルモン剤のほか；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；ワクチン、ｒＩＬ−２であるＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）；トポイソメラーゼ１阻害剤であるＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）；ｒｍＲＨであるＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）；ビノレルビン、およびエスペラミシン、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
他の実施形態では、本発明のモジュレーターを、現在臨床試験であるか、または市販されている、多数の抗体（または免疫療法剤）のうちのいずれか１つと組み合わせて使用することができる。この目的で、開示されるモジュレーターは、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ（duligotumab）、デュシギツマブ（dusigitumab）、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イマガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ（nofetumomabn）、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、およびこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用することができる。
また他の特に好ましい実施形態は、がん治療について承認された抗体であって、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（gemtuzumab ozogamcin）、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ、およびブレンツキシマブベドチンを含むがこれらに限定されない抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合性のさらなる抗がん剤をたやすく同定することが可能である。
Ｅ．放射線療法
本発明はまた、モジュレーターの、放射線療法（すなわち、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡの損傷を誘導する任意の機構であって、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などの機構）との組合せももたらす。また、放射性同位元素の、腫瘍細胞への方向付けられた送達を使用する組合せ療法も意図され、この組合せ療法を、標的化された抗がん剤または他の標的化手段との関連で使用することができる。放射線療法は、約１〜約２週間の期間にわたり、パルスで投与されることが典型的である。頭頸部がんを有する被験体には、放射線療法を、約６〜７週間にわたり投与することができる。任意選択で、放射線療法は、単回投与として投与することもでき、複数回にわたる逐次投与として投与することもできる。
ＸＩ．適応
本発明のモジュレーターを使用して、任意のＳＥＺ６関連障害の発生または再発を診断、処置、または阻害しうることが認識される。したがって、単独で投与されるのであれ、抗がん剤または放射線療法と組み合わせて投与されるのであれ、本発明のモジュレーターは、患者または被験体における新生物性状態であって、良性腫瘍または悪性疾患（例えば、副腎癌、肝臓（ｌｉｖｅｒ）癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、甲状腺癌、肝臓（ｈｅｐａｔｉｃ）癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、および子宮癌；肉腫；神経膠芽腫；および多様な頭頸部腫瘍）；白血病およびリンパ系悪性疾患；ニューロンの障害、神経膠障害、星状細胞障害、視床下部障害、ならびに他の腺障害、マクロファージ障害、上皮障害、間質障害、および胞胚腔障害；ならびに炎症性障害、脈管形成性障害、免疫障害、および病原体により引き起こされる障害など、他の障害を含みうる新生物性状態を一般に処置するのに特に有用である。特に、処置の重要な標的は、充実性腫瘍を含む新生物性状態であるが、血液悪性疾患も、本発明の範囲内にある。処置される「対象」または「患者」は、ヒトであることが好ましいが、本明細書において使用される場合、用語は、明示的には、任意の哺乳動物種を含むと考えられる。
より具体的に述べると、本発明に従う処置にかけられる新生物性状態は、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞巣状軟部肉腫、星状細胞腫瘍、膀胱がん（扁平上皮癌および移行細胞癌）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳脊髄腫瘍、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈小体腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（fibrogenesis imperfecta ossium）、線維性骨異形成症、胆嚢胆管がん、妊娠性絨毛疾患、生殖細胞腫瘍、頭頸部がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺がん（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌など）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭癌、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫（posterious unveal melanoma）、まれな血液障害、腎転移がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫（rhabdomysarcoma）、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移がん、および子宮がん（子宮頸癌、子宮内膜癌、および平滑筋腫）を含むがこれらに限定されない群から選択することができる。
ある特定の好ましい実施形態では、増殖性障害は、副腎腫瘍、肝腫瘍、腎腫瘍、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸腫瘍、子宮腫瘍、食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍（小細胞腫瘍および非小細胞腫瘍の両方）、甲状腺腫瘍、癌、肉腫、神経膠芽細胞腫、および多様な頭頸部腫瘍を含むがこれらに限定されない、充実性腫瘍を含む。他の好ましい実施形態では、かつ、下記の実施例で示される通り、開示されるモジュレーターは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮性非小細胞肺がんまたは扁平上皮性小細胞肺がん）の処置においてとりわけ有効である。
一実施形態において、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんは、不応性であるか、再発性であるか、またはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、またはカバジタキセル）および／もしくは白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トポテカンなど）に対して抵抗性である。白金ベースの薬剤に関して述べると、ＳＣＬＣのための主要な標準治療の化学療法は、シスプラチンとエトポシドとの組合せである。処置コースの後、多くの患者が、白金ベースの薬剤に対して抵抗性となる（Stewart、２００４年；ＰＭＩＤ：２００４７８４３）。白金ベースの薬物に対する抵抗性の複数の機構であって、とりわけ、膜組成の変化、低酸素状態の増大、銅輸送体遺伝子の発現の低下、および多剤抵抗性遺伝子の発現の増大を含む機構が認められる。ＳＣＬＣを伴う大半の患者は、標準治療処置でまず処置されることを踏まえると、本発明の一部の実施形態において、本明細書で開示されている抗体を使用して、応答しなかったかまたは再発した患者を処置することができる。初期の白金応答性は高いが、がん患者の大半は、シスプラチン抵抗性疾患を伴って、最終的に再発するであろう。特に好ましい実施形態において、開示されているモジュレーターをコンジュゲート形態で使用して、小細胞肺がんを処置することができる。他の好ましい実施形態において、開示されているモジュレーターをコンジュゲート形態で使用して、それを必要とする対象において、白金抵抗性小細胞肺がんを処置することができる。小細胞肺がんに関して述べると、特に好ましい実施形態は、コンジュゲートモジュレーター（ＡＤＣ）の投与を含むであろう。選択された実施形態において、コンジュゲートモジュレーターは、限局期疾患を呈示する患者に投与されるであろう。他の実施形態において、開示されているモジュレーターは、拡張期疾患を呈示する患者に投与されるであろう。他の好ましい実施形態において、開示されているコンジュゲートモジュレーターは、不応性患者（すなわち、初期治療のコースの完了時において、または初期治療のコースを完了したすぐ後で再発する患者）に投与されるであろう。さらに他の実施形態は、開示されているモジュレーターの、感受性の患者（すなわち、再発が一次治療後２〜３カ月間を超える患者）への投与を含む。各場合に、選択された投与レジメンおよび臨床診断に応じて、適合性のモジュレーターは、コンジュゲート状態の場合もあり、非コンジュゲート状態の場合もあることが認められよう。
上記で論じた通り、開示されるモジュレーターはさらに、神経内分泌腫瘍を含む、神経内分泌特徴または表現型を有する腫瘍を防止、処置、または診断するのにも使用することができる。分散した内分泌系（dispersed endocrine system）から生じる真性またはカノニカルの神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、比較的まれであり、人口１００，０００人当たりの発生数は２〜５例であるが、高度に侵襲性である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、および子宮内膜）、消化管（結腸、胃）、甲状腺（髄様甲状腺がん）、および肺（小細胞肺癌および大細胞性神経内分泌癌）において生じる。これらの腫瘍は、セロトニンおよび／またはクロモグラニンＡを含む複数のホルモンであって、カルチノイド症候群として公知の、消耗性の症状を引き起こすことができるホルモンを分泌しうる。このような腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、ガンマエノラーゼとしてもまた公知であり、遺伝子記号＝ＥＮＯ２である）、ＣＤ５６（またはＮＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、およびシナプトフィシン（ＳＹＰ）など、陽性の免疫組織化学マーカーによって表される場合もあり、ＡＳＣＬ１など、発現の上昇を呈示することが公知の遺伝子によって表される場合もある。残念ながら、従来の化学療法は、ＮＥＴを処置するのにそれほど有効でなく、肝転移が一般的な転帰である。
本発明の一部の実施形態において、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートさせた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、抗体がＳＥＺ６に特異的に結合する抗体薬物コンジュゲートを使用して、がん（例えば、髄様甲状腺がん）を患う対象を処置することができる。好ましい実施形態において、がん（例えば、髄様甲状腺がん）を処置するのに使用される抗体薬物コンジュゲートは、図１０Ａで示される３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域および図１０Ｂで示される３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む抗ＳＥＺ６抗体を含むであろう。他の実施形態において、がん（例えば、髄様甲状腺がん）を患う対象を処置するのに使用される抗体薬物コンジュゲートは、図１０Ａおよび１０Ｂに示される軽鎖および重鎖可変領域を含む抗ＳＥＺ６抗体と競合し得る。さらに別の実施形態において、がん（例えば、髄様甲状腺がん）を患う対象を処置するのに使用される抗体薬物コンジュゲートは、ヒト化抗ＳＥＺ６抗体、例えば、図１０Ａおよび１０Ｂに示される、ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ｈＳＣ１７．１５１、ｈＳＣ１７．１５５、ｈＳＣ１７．１５６、ｈＳＣ１７．１６１およびｈＳＣ１７．２００、ならびにこのようなヒト化抗体と競合する任意の抗体を含み得る。本発明の他の実施形態において、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートさせた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、抗体がＳＥＺ６に特異的に結合する抗体薬物コンジュゲートを使用して、小細胞肺がん（例えば、白金抵抗性小細胞肺がん）を患う対象を処置することができる。好ましい実施形態において、小細胞肺がん（例えば、白金抵抗性小細胞肺がん）を患う対象を処置するのに使用される抗体薬物コンジュゲートは、ヒト化抗ＳＥＺ６抗体、例えば、図１０Ａおよび１０Ｂに示される、ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ｈＳＣ１７．１５１、ｈＳＣ１７．１５５、ｈＳＣ１７．１５６、ｈＳＣ１７．１６１およびｈＳＣ１７．２００、ならびにこのようなヒト化抗体と競合する任意の抗体を含み得る。好ましい実施形態において、小細胞肺がんを患う対象は、白金ベースの薬剤で既に処置されているであろう。
開示されるモジュレーターは、神経内分泌腫瘍を処置するのに使用すると有利でありうるが、それらはまた、遺伝子型または表現型において、カノニカルの神経内分泌腫瘍と共通の形質を模倣するか、これらに酷似するか、またはこれらを呈示する、偽性神経内分泌腫瘍（pseudo neuroendocrine tumor）（ｐＮＥＴ）を処置、防止、または診断するのにも使用することができる。偽性神経内分泌腫瘍または神経内分泌特徴を有する腫瘍とは、散在する神経内分泌系の細胞、または発がん性過程において、神経内分泌系の分化カスケードが異常に再活性化した細胞から生じる腫瘍である。このようなｐＮＥＴは一般に、生物学的に活性のアミン、神経伝達物質、およびペプチドホルモンのサブセットを産生する能力を含むある特定の表現型または生化学的特徴を、従来から定義されている神経内分泌腫瘍と共有する。歴史的に述べると、このような腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴ）は、稠密につなぎ合わされた小細胞であって、細胞病変が穏やかで最小限の細胞質および円形から楕円形の点状核を有する小細胞を示すことが多い、共通の外見を共有する。本発明の目的では、神経内分泌腫瘍および偽性神経内分泌腫瘍を定義するのに使用されうる、共通して発現する組織学的マーカーまたは遺伝子マーカーは、クロモグラニンＡ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、ＰＧＰ９．５、ＡＳＣＬ１、およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を含むがこれらに限定されない。
したがって、本発明のモジュレーターを使用して、偽性神経内分泌腫瘍およびカノニカルの神経内分泌腫瘍の両方を処置するのに有益である。これに関して、モジュレーターは、本明細書で記載される通り、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、および子宮内膜）、消化管（結腸、胃）、甲状腺（髄様甲状腺がん）、および肺（小細胞肺癌および大細胞性神経内分泌癌）において生じる、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴの両方）を処置するのに使用することができる。さらに、本発明のモジュレーターは、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、クロモグラニンＡ、ＡＳＣＬ１、およびＰＧＰ９．５（ＵＣＨＬ１）からなる群から選択される、１種または複数のマーカーを発現する腫瘍を処置するのにも使用することができる。すなわち、本発明は、ＮＳＥ＋であるか、またはＣＤ５６＋であるか、またはＰＧＰ９．５＋であるか、またはＡＳＣＬ１＋であるか、またはＳＹＰ＋であるか、またはＣＨＧＡ＋であるか、またはこれらのいくつかの組合せである腫瘍を患う被験体を処置するのに使用することができる。
血液悪性疾患に関して述べると、本発明の化合物および方法が、多様なＢ細胞リンパ腫であって、低悪性度ＮＨＬ、濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中等悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性（high grade small non-cleaved cell）ＮＨＬ、巨大腫瘤病変（bulky disease）ＮＨＬ、ワルデンストレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫（monocytic B cell lymphoma）、血管免疫芽球性リンパ腺症、小リンパ球性リンパ芽球腫、濾胞性リンパ芽球腫、びまん性大細胞リンパ芽球腫、びまん性小型切れ込み核細胞性リンパ芽球腫、大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、および非バーキットリンパ腫、大細胞を主とする濾胞性リンパ腫；小型切れ込み核細胞を主とする濾胞性リンパ腫；ならびに小型切れ込み核細胞および大細胞混合型濾胞性リンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫を処置するのに特に有効でありうることがさらに認識される。Gaidonoら、「Lymphomas」、CANCER： PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY中、２巻：２１３１〜２１４５頁（DeVitaら編、増補５版、１９９７年）を参照されたい。当業者には、これらのリンパ腫は、分類システムの変化のために異なる名称を有することが多く、異なる名称の下に分類されたリンパ腫を有する患者もまた、本発明の組合せ治療レジメンから利益を得ることが明らかなはずである。
本発明はまた、良性腫瘍または前がん性腫瘍を提示する被験体の防止的処置または予防的処置ももたらす。ＳＥＺ６関連障害以外の、任意の特定の種類の腫瘍または増殖性障害を、本発明を使用する処置から除外すべきだとは考えられない。しかし、腫瘍細胞の種類は、二次治療剤、特に、化学療法剤および標的化された抗がん剤と組み合わせた本発明の使用と関与性でありうる。
ＸＩＩ．研究用試薬
本発明の他の好ましい実施形態においてまた、開示されているモジュレーターの特性を、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）、またはレーザー媒介式区分などの方法により、腫瘍始原細胞の集団または亜集団を同定するか、モニタリングするか、単離するか、区分するか、または富化するのに有用な手段としても利用する。当業者であれば、モジュレーターは、がん幹細胞を含むＴＩＣの特徴付けおよび操作のための複数の適合性の技法（例えば、それらのそれぞれが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／６８６，３５９、同１２／６６９，１３６、および同１２／７５７，６４９を参照されたい）において使用し得ることを認められよう。
ＸＩＩＩ．製品
また、１つまたは複数の容器を含む医薬パックおよび医薬キットであって、１回または複数回の投与分のＳＥＺ６モジュレーターを含むパックおよびキットもまた提供される。ある特定の実施形態では、１種または複数のさらなる薬剤を有するかまたは伴わずに、例えば、抗ＳＥＺ６抗体を含む所定量の組成物を含有する、単位投与量が提供される。他の実施形態では、このような単位投与量は、単回使用用の注射用プレフィルドシリンジで供給される。また他の実施形態では、単位投与量中に含有される組成物は、食塩液、スクロースなど、ホスフェートなどの緩衝剤などを含む場合もあり、かつ／または安定で有効なｐＨ範囲内で製剤化される場合もある。代替的に、ある特定の実施形態では、組成物を、適切な液体、例えば、滅菌水を添加すると再構成されうる凍結乾燥粉末として提供することもできる。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は、タンパク質の凝集を阻害する１種または複数の物質であって、スクロースおよびアルギニンを含むがこれらに限定されない物質を含む。容器（複数可）上の任意の表示、または容器（複数可）と関連する任意の表示は、封入された組成物が、えり抜きの疾患状態を診断または処置するのに使用されることを示す。
本発明はまた、単回投与用投与単位または複数回投与用投与単位のＳＥＺ６モジュレーター、および、任意選択で、１種または複数の抗がん剤を作製するためのキットも提供する。キットは、容器および容器上にあるかまたは容器と関連する表示または添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができ、薬学的有効量の、開示されるモジュレーターを、コンジュゲート形態または非コンジュゲート形態で含有しうる。他の好ましい実施形態では、容器（複数可）は、滅菌アクセスポートを含む（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ（intravenous solution bag）の場合もあり、皮下注射用注射針で穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合もある）。このようなキットは一般に、適切な容器内に、ＳＥＺ６モジュレーターの、薬学的に許容される製剤と、任意選択で、同じまたは異なる容器内に、１種または複数の抗がん剤とを含有する。キットはまた、診断用または組合せ療法用の、他の薬学的に許容される製剤も含有しうる。例えば、本発明のＳＥＺ６モジュレーターに加えて、このようなキットは、化学療法薬または放射線療法薬などの、ある範囲の抗がん剤；抗脈管形成剤；抗転移剤；標的化された抗がん剤；細胞傷害剤；および／または他の抗がん剤のうちの任意の１種または複数を含有しうる。このようなキットはまた、ＳＥＺ６モジュレーターを、抗がん剤または診断剤とコンジュゲートさせるのに適する試薬（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９を参照されたい）も提供する。
より具体的に述べると、キットは、さらなる成分を伴うかまたは伴わずに、ＳＥＺ６モジュレーターを含有する単一の容器を有する場合もあり、各所望される薬剤のための、別個の容器を有する場合もある。コンジュゲーションのために組み合わされた治療剤を提供する場合、単一の溶液を、モル当量の組合せであらかじめ混合することもでき、１つの成分を他の成分に対して過剰としてあらかじめ混合することもできる。代替的に、キットのＳＥＺ６モジュレーターおよびいずれか任意選択の抗がん剤は、別個の容器内で個別に維持してから、患者に投与することもできる。キットはまた、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、リンゲル液、およびデキストロース溶液など、滅菌の薬学的に許容される緩衝液または他の希釈剤を含有する第２／第３の格納手段も含みうる。
キットの構成要素を１種または複数の液体溶液により提供する場合、液体溶液は水溶液であることが好ましく、滅菌水溶液であることが特に好ましい。しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末（複数可）として提供することもできる。試薬または構成要素を乾燥粉末として提供する場合は、適切な溶媒を添加することにより粉末を再構成することができる。溶媒はまた、別の容器で提供されうることも想定される。
上記で簡略に示された通り、キットはまた、抗体および任意選択の構成要素を動物または患者に投与するための手段、例えば、１つまたは複数の注射針もしくはシリンジ、なおまたは点眼器、ピペット、もしくは他のこのような器具であって、それにより製剤を動物に注入もしくは導入するか、または身体の疾患領域に適用し得る器具も含有しうる。本発明のキットはまた、バイアルなどおよび他の構成要素を、市販のために、例えば、射出成形または吹込み成形されたプラスチック容器であり、所望のバイアルおよび他の器具をそれらの中に入れて保持するプラスチック容器などを密封して閉じ込めて含有するための手段も含むことが典型的である。任意の表示または添付文書により、ＳＥＺ６モジュレーター組成物が、がん、例えば、小細胞肺がんを処置するのに使用されることが示される。
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレーターは、増殖性障害の診断または処置において有用な診断デバイスまたは治療デバイスと共に使用する場合もあり、これらを含む場合もある。例えば、好ましい実施形態では、本発明の化合物および組成物は、増殖性障害の病因または発現に関与する細胞またはマーカー化合物を、検出、モニタリング、定量、またはプロファイリングするのに使用されうる、ある特定の診断デバイスまたは測定器と組み合わせることができる。選択された実施形態では、マーカー化合物は、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィシン、クロモグラニンＡ、およびＰＧＰ９．５を含みうる。
特に好ましい実施形態では、デバイスを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて循環腫瘍細胞を検出、モニタリング、および／または定量する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照されたい）ことができる。また他の好ましい実施形態では、かつ、上記で論じた通り、循環腫瘍細胞は、がん幹細胞を含みうる。
ＸＩＶ．その他
本明細書でそうでないことが規定されない限り、本発明との関連で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によりそうでないことが要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。より具体的に述べると、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される通り、文脈によりそうでないことが明確に指定されない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質（a protein）」への言及は、複数のタンパク質を含み、「細胞（a cell）」への言及は、細胞の混合物を含むなどである。加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲で提示される範囲は、端点および端点の間の全ての点の両方を含む。したがって、２．０〜３．０の範囲は、２．０、３．０、および２．０と３．０との間の全ての点を含む。
一般的に、本明細書で記載される、細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される用語法ならびにこれらの技法は、周知の用語法および技法であり、当技術分野で一般に使用されている。そうでないことが示されない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野において周知であり、多様で一般的な参考文献および多様でより特殊な参考文献であって、本明細書を通して引用され、論じられている、参考文献において記載されている、従来の方法に従い実施される。例えば、Abbasら、Cellular and Molecular Immunology、６版、W.B. Saunders Company（２０１０年）；Sambrook J.およびRussell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual、３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.（２０００年）；Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology、Wiley, John & Sons, Inc.（２００２年）；HarlowおよびLane、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.（１９９８年）；およびColiganら、Short Protocols in Protein Science、Wiley、John & Sons, Inc.（２００３年）を参照されたい。酵素反応および精製技法は、当技術分野において一般に達成される通り、または本明細書で記載される通り、製造業者の仕様に従い実施する。本明細書で記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および製薬化学の実験手順および実験技法との関連で使用される用語法は、周知であり、当技術分野で一般に使用される用語法である。さらに、本明細書で使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するとは解釈されるべきではない。
ＸＶ．ＳＥＺ６に関する参考文献
本明細書内で開示または引用される全ての参考文献または文書は、限定せずに述べると、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書において使用される場合、任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するとはみなさないものとする。
ＸＶＩ．配列表の概要
本出願には、多数の核酸配列およびアミノ酸配列を含む配列表が添付されている。以下の表２は、含まれる配列についての概要を提示する。
ＸＶＩＩ．本発明の選択された実施形態
本明細書の開示に加えて、本発明は、すぐ下に具体的に示される、選択された実施形態も対象とする。
このように上記で一般に記載された本発明は、例示を目的として提示されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することにより、いっそう容易に理解されるであろう。実施例は、下記の実験が、実施される全ての実験または唯一の実験であることを表すように意図するものではない。そうでないことが指し示されない限りにおいて、部分は、重量による部分であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧または大気圧近傍の圧力である。
（実施例１）
神経内分泌特徴を有する腫瘍の同定、および全トランスクリプトームシークエンシングを使用するマーカー発現の解析
分散した内分泌系から生じる神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、まれであり、人口１００，０００人当たりの発生数は２〜５例であるが、高度に侵襲性である。神経内分泌腫瘍は、副腎、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸部、および子宮内膜）、膵臓、消化管（胃および結腸）、甲状腺（髄様甲状腺がん）、および肺（小細胞肺癌、大細胞性神経内分泌癌、およびカルチノイド）において生じる。これらの腫瘍は、セロトニンおよび／またはクロモグラニンＡを含む複数のホルモンであって、カルチノイド症候群として公知の、消耗性の症状を引き起こすホルモンを分泌し得る。これらの腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、ガンマエノラーゼとしてもまた公知であり、遺伝子記号＝ＥＮＯ２である）、ＣＤ５６／ＮＣＡＭ１、およびシナプトフィシンなど、陽性の免疫組織化学検査マーカーを表徴とし得る。従来の化学療法は、ＮＥＴを処置するのに奏効しておらず、転移性拡大に起因する死亡が一般的な転帰である。残念ながら、大半の場合に、手術が、早期の検出の後および腫瘍転移の前に施すことを条件として、唯一の可能な治癒のための処置である。この文脈では、研究は、神経内分泌特徴を含む腫瘍と関連する新規の治療標的を同定する目的で企図された。
このような腫瘍を、それらががん患者において存在する通りに同定し、特徴付けるために、当技術分野で認知された技法を使用して、大規模な非伝統的異種移植（ＮＴＸ）腫瘍バンクが開発および維持されている。実質的な数の個別の腫瘍細胞系を含むＮＴＸ腫瘍バンクは、元は、様々な悪性の固形腫瘍に罹患する多数のがん患者から得られた異質性の腫瘍細胞の、複数世代にわたる継代（本明細書の実施例および図の一部では、被験試料の継代数は、試料の記号表示に付されたｐ０〜ｐ＃［表示中、ｐ０は、患者の腫瘍から直接得られた非継代試料を示し、ｐ＃は、試験の前に腫瘍をマウスに継代移植した回数を示す］により指し示されることに注意されたい）により、免疫不全マウスにおいて繁殖させたものである。十分に規定された系列を有する、多数の個別の早期継代のＮＴＸ腫瘍細胞系の持続的な入手可能性により、細胞系から精製された細胞の同定および特徴付けが大幅に容易となっている。このような作業では、最小限に継代されたＮＴＸ細胞系の使用により、ｉｎ ｖｉｖｏ実験が簡略化され、検証可能な結果が容易にもたらされる。さらに、早期継代のＮＴＸ腫瘍は、イリノテカン（すなわち、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））およびシスプラチン／エトポシドレジメンなどの治療剤に応答し、これにより、腫瘍の増殖、現行の治療に対する抵抗性、および腫瘍の再発を駆動する根底的な機構に対する、臨床的に関与性の洞察がもたらされる。
ＮＴＸ腫瘍細胞系が確立されたので、それらの表現型を様々な様式で特徴付けて、全般的遺伝子発現を検討した。バンク内のどのＮＴＸ細胞系がＮＥＴであり得るのかを同定するために、遺伝子発現プロファイルを、全トランスクリプトームシークエンシングおよび／またはマイクロアレイ解析により作成した。具体的には、データを検討して、ＮＥＴ内で増大することが公知の特異的遺伝子を高レベルで発現させる腫瘍を同定するか、または神経内分泌性分化（例えば、ＡＳＣＬ１、ＮＣＡＭ１、ＣＨＧＡ）、ならびにＮＯＴＣＨシグナリングの抑制（例えば、ＮＯＴＣＨ受容体レベルの低減、およびリガンド分子およびエフェクター分子に対する変化）を示す、ＮＯＴＣＨ経路遺伝子の変化を伴う腫瘍の組織化学マーカーとして使用した。
より特定すると、重度免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍について一般的になされる通りに、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系を確立し、腫瘍は、８００〜２，０００ｍｍ３に到達した後で摘出し、細胞は、当技術分野で認知された酵素消化技法（例えば、本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照されたい）を使用して、懸濁液へと解離および分散させた。次いで、これらのＮＴＸ細胞系から解離された細胞調製物から、マウス細胞を枯渇させ、次いで、ヒト腫瘍細胞亜集団を、蛍光活性化細胞分取によりさらに単離し、ＲＬＴｐｌｕｓ ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中に溶解させた。次いで、これらの溶解物を、使用するまで、−８０℃で保存した。融解させたら、販売元の指示書に従い、ＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、ここでもまた、製造業者のプロトコールおよび推奨される測定器の設定を使用して、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で定量化した。結果として得られる全ＲＮＡ調製物は、遺伝子シークエンシングおよび遺伝子発現解析に適切であった。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）ＳＯＬｉＤ（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）４．５またはＳＯＬｉＤ ５５００ｘｌ次世代シークエンシングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全トランスクリプトームシークエンシングを、ＮＴＸ細胞系に由来するＲＮＡ試料に対して実施した。低入力のためにデザインされた、ＡＢＩ製の改変全トランスクリプトーム（ＷＴ：ｗｈｏｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）プロトコール、または全ＲＮＡまたはＯｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２（商標）（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、ｃＤＮＡを、全ＲＮＡ試料から作製した。改変低入力ＷＴプロトコールでは、１．０ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ｍＲＮＡを３’端で増幅することから、マッピングされる遺伝子発現に大きな３’バイアスが生じるのに対し、ＮｕＧｅｎ製のシステムは、転写物を通したより一貫した増幅を可能とし、ｍＲＮＡおよび非ポリアデニル化転写物であるｃＤＮＡの両方の増幅であって、ランダムなヘキサマーを使用する増幅を含む。ｃＤＮＡライブラリーを断片化し、バーコードアダプターを、添加して、断片ライブラリーの、異なる試料からのプーリングを可能とした。
ＡＢＩ製のＳＯＬｉＤ ４．５およびＳＯＬｉＤ ５５００ｘｌ次世代シークエンシングプラットフォームは、複数のＮＴＸ細胞系および分取された集団に由来するトランスクリプトームについての並列シークエンシングを可能とする。ｃＤＮＡライブラリーを、各ＲＮＡ試料から構築し、断片化およびバーコード処理する。各断片ライブラリー上のバーコードにより、複数の試料を等濃度でプールし、試料の特異性を確保しながら併せて処理することが可能となる。試料は、試料の一貫性を確保するＡＢＩ製のＳＯＬｉＤ（商標）ＥＺ Ｂｅａｄ（商標）ロボットシステムを使用して、エマルジョンＰＣＲを介して採取する。ペアドエンドシークエンシングにより、プール内に存在する単一のビーズ上のクローン増幅された各断片について、５’〜３’方向の５０塩基のリードおよび３’〜５’方向の２５塩基のリードを作製する。５５００ｘｌプラットフォームの場合、上記で言及された方法によりプールされた８例ずつのあらゆる試料セットについて、ビーズを、単一のチップ上の６つの単一のチャネルレーンへと、均等に配置する。これにより、８つの試料のそれぞれについて、平均で、５０塩基のリード５０００万超および２５塩基のリード５０００万超が作り出され、腫瘍細胞内のｍＲＮＡ転写物レベルについての極めて正確な表示が作製される。公開されているヒトゲノムについてのＮＣＢＩ ｖｅｒｓｉｏｎ ｈｇ１９．２を使用して、ＳＯＬｉＤプラットフォームにより作成されたデータであって、ＲｅｆＳｅｑ ｖｅｒｓｉｏｎ ４７により注釈を施された３４，６０９の遺伝子へとマッピングされたデータにより、大半の試料中のＲＮＡレベルについての検証可能な測定がもたらされた。
ＳＯＬｉＤプラットフォームは、リードカバレッジ（いまだ注釈を施されていないゲノム位置へと固有にマッピングされたリード）だけに基づき、発現だけでなく、ＳＮＰ、公知および未知の代替的スプライシングイベント、小分子非コードＲＮＡ、および潜在的に新規のエクソンの発見を捕捉することも可能である。したがって、この次世代シークエンシングプラットフォームの、特許権のあるデータ解析および視覚化ソフトウェアと対にした使用により、差次的な転写物の発現、ならびに発現したｍＲＮＡ転写物の特異的スプライスバリアントの差違および／または優先性の発見が可能となった。ＳＯＬｉＤプラットフォームによるシークエンシングデータは名目上、ＲＰＭ（１００万当たりのリード）計量およびＲＰＫＭ（１００万当たりのキロベース当たりのリード）計量を使用して、転写物発現値として表されており、標準的な慣例である、基本的な差次的発現解析を可能とする。
４つの小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）腫瘍（ＬＵ７３、ＬＵ６４、ＬＵ８６、およびＬＵ９５）、１つの卵巣腫瘍（ＯＶ２６）および大細胞性神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ；ＬＵ３７）についての全トランスクリプトームシークエンシングの結果として、ＮＥＴ内で一般的に見出される遺伝子発現パターンの決定がなされた（図６Ａ）。より詳細には、これらの腫瘍では、複数のＮＥＴマーカー（ＡＳＣＬ１、ＮＣＡＭ１、ＣＨＧＡ）が高度に発現し、Ｎｏｔｃｈ受容体レベルおよびエフェクター分子（例えば、ＨＥＳ１、ＨＥＹ１）レベルが低減され、Ｎｏｔｃｈ抑制マーカー（例えば、ＤＬＬ３およびＨＥＳ６）が増大していた。これに対し、４つの正常肺試料、３つの肺腺癌腫瘍（ＬＵ１３７、ＬＵ１４６、およびＬＵ１５３）、および３つの扁平上皮性肺がん（ＬＵ４９、ＬＵ７０、およびＬＵ７６）の全てでは、様々なＮｏｔｃｈ受容体およびエフェクター分子が発現し、ＨＥＳ６およびＤＬＬ３など、Ｎｏｔｃｈ抑制因子の発現の上昇は示されない。
さらに、図６Ｂで見られる通り、正常組織試料を、神経内分泌特徴を有する様々な肺ＮＴＸ集団と比較する、全トランスクリプトームデータの解析により、神経内分泌特徴を有する４つの肺がん集団（ＬＵ７３、ＬＵ６４、ＬＵ８６、およびＬＵ９５）内のＳＥＺ６は、転写物の発現が極めて低度であるかまたは発現が見られない被験正常組織内と比較して、ｍＲＮＡ転写物レベルで上方調節されることが示された。これらの結果は、ＳＥＺ６が、特定のがん（神経内分泌特徴を伴う肺がんを含む）による腫瘍の形成および維持において重要な役割を果たし得ることを示唆する。これに基づき、ＳＥＺ６を、さらなる解析のために、潜在的免疫療法標的として選択する。
（実施例２）
神経内分泌特徴を伴う、選択されたＮＴＸ腫瘍内の遺伝子発現についての、マイクロアレイ解析およびＲＴ−ＰＣＲ解析
上述のＮＴＸバンク内で、それらについてのＳＯＬｉＤ全トランスクリプトームデータが存在したＮＥＴ以外のさらなるＮＥＴを同定しようと試みる中で、マイクロアレイ解析を使用して、ＮＴＸ細胞系の大規模なセットについて検討した。具体的には、ヒトゲノム内の１９，３８０の遺伝子に対してデザインされた、２９，１８７のプローブを含有する、ＯｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）マイクロアレイプラットフォーム（Ｐｈａｌａｎｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ）を使用して、４６のＮＴＸ細胞系内の全腫瘍または２つの正常組織に由来する２〜６μｇの全ＲＮＡ試料について解析した。より詳細には、ＲＮＡ試料は、４６例の患者に由来する全ＮＴＸ腫瘍であって、結腸直腸（ＣＲ）がん、黒色腫（ＳＫ）がん、腎臓（ＫＤ）がん、肺（ＬＵ）がん、卵巣（ＯＶ）がん、子宮内膜（ＥＭ）がん、乳（ＢＲ）がん、肝臓（ＬＩＶ）がん、または膵臓（ＰＡ）がんを含む全ＮＴＸ腫瘍から得た（実施例１で記載した通りに）。正常結腸直腸（ＮｏｒｍＣＲ）組織および正常膵臓（ＮｏｒｍＰＡ）組織を、対照として使用した。さらにより詳細には、肺腫瘍を、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、扁平上皮がん（ＳＣＣ）、または大細胞性神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）としてさらに下位分類した。ＲＮＡ試料は、製造業者のプロトコールを使用して３連で処理し、結果として得られるデータは、各試料中の対象遺伝子について得られた強度測定値を標準化および変換するための、標準的な業務上の慣行を使用して解析した。ｈｃｌｕｓｔ．２と呼ばれる、Ｒ／ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒによるパッケージ一式中の、ピアソン−スピアマンによる不偏階層的クラスタリングアルゴリズムを使用して、これらの４８例の試料についての、標準的なマイクロアレイ系統樹を創出した。当技術分野で公知の通り、Ｒ／ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒとは、データ解析のために、学術、金融業界、および医薬業界で広く使用されている、オープンソースの統計プログラミング言語である。一般に、腫瘍は、遺伝子発現パターン、発現強度などに基づき、配列およびクラスタリングした。
図７Ａに示される通り、４８例の試料から誘導した全１９３８０遺伝子にわたる系統樹により、ＮＴＸ細胞系を、それらの由来する腫瘍型または組織に基づき、併せてクラスタリングした。複数の腫瘍は、（１）と表記される分枝上に併せてクラスタリングされる神経内分泌表現型と関連することが典型的であり、これらは、皮膚がん、多数の肺がん、および他のＮＥＴを含んだ。興味深いことに、（２）と表記される小枝により、２つの大細胞性神経内分泌特徴を伴う肺がん（ＬＵ５０．ＬＣＮＥＣ、およびＬＵ３７．ＬＣＮＥＣ）および小細胞肺がん（ＬＵ１０２．ＳＣＬＣ）は、卵巣（ＯＶ２６）腫瘍および腎臓（ＫＤ６６）腫瘍（クラスターＣ）と共にクラスタリングされることが示されたことから、これらの後者の腫瘍もまた、神経内分泌表現型を保有することが示唆された。さらに、図７Ａは、３つのさらなるＳＣＬＣ腫瘍からなるクラスターＤを示し、その右側には、さらなるＳＣＬＣ腫瘍（ＬＵ１００）および神経内分泌系の子宮内膜腫瘍（ＥＭ６）を含有する、小型のクラスター（クラスターＥ）が存在する。クラスターＤおよびＥの中の腫瘍の全ては一般に、臨床における研究文献および病態経験に基づき、一部の神経内分泌特徴を保有すると理解されている。ＳＣＣを含むクラスターＧが、図７Ａの系統樹の完全に異なる分枝上で見出され得るという事実は、クラスタリングが、もっぱら、腫瘍の臓器由来により駆動されるわけではないことを指し示す。
ＮＥＴと関連する遺伝子マーカーのコレクションについての精査（図７Ｂ）により、それらが、クラスターＣおよびＤを含む腫瘍内では、強く発現する一方で、クラスターＧ内の腫瘍（肺の扁平細胞癌）内の発現は最小限であると示されることから、クラスターＣおよびＤは、ＮＥＴまたは神経内分泌表現型を伴う腫瘍を表すことが示唆される。より詳細には、クラスターＣのＮＥＴが、ＡＳＣＬ１、ＣＡＬＣＡ、ＣＨＧＡ、ＳＳＴ、およびＮＫＸ２−１を高度に発現させるのに対し、クラスターＤのＮＥＴは、ＣＨＧＡ、ＥＮＯ２、およびＮＣＡＭ１を高度に発現させ、これは、部分的にこれらの腫瘍のクラスタリングの一因となる、これらの神経内分泌表現型遺伝子の表れである。興味深い特徴は、神経内分泌腫瘍との関連が報告されることは、場合によるが、他の文脈では、腫瘍形成と明確に連関する遺伝子である、クラスターＤ内のＫＩＴの強い発現である。これは、これらの遺伝子のうちのいずれかの強い発現を欠くクラスターＧ内のＳＣＣ腫瘍と対照的である（図７Ｂ）。
クラスターＣ内の腫瘍は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの低減と符合する表現型：任意のＮｏｔｃｈ受容体の発現の欠如、ＪＡＧ１およびＨＥＳ１の発現の比較的な欠如、および高レベルのＡＳＣＬ１発現を示す（図７Ｃ）。興味深いことに、クラスターＤは、ヘテロ二量体の形成を介してＨＥＳ１活性をアンタゴナイズすることにより、ＡＳＣＬ１活性を促進する転写因子である、ＨＥＳ６の高度な発現を示す。
上述の結果に照らし、Ｔａｑｍａｎリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実施するのに、製造業者のプロトコールに従い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、様々なＮＴＸ細胞系および正常組織からの、ＨＥＳ６のｍＲＮＡ発現を検討した。ＲＮＡは、上記に記載した通りに単離し、品質が遺伝子発現解析に適することを確保するように点検した。正常組織に由来するＲＮＡは購入した（Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。２００ｎｇのＲＮＡは、ｃＤＮＡアーカイブキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する、ｃＤＮＡの合成に使用した。ｃＤＮＡは、ＨＥＳ６のｍＲＮＡレベルを測定するＨＥＳ６ Ｔａｑｍａｎアッセイを含有する、Ｔａｑｍａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙｓ（ＴＬＤＡ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上のｑＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。
ＨＥＳ６ ｍＲＮＡレベルを、内部対照に照らした標準化の後で、各ＮＴＸ細胞系または正常組織試料について示す（グラフ上の単一のドット）。標準化値は、重大な毒性の正常組織内における平均発現（ＮｏｒｍＴｏｘ）と比べてプロットする。この技法により、ＮＴＸ腫瘍バンクに由来する、神経内分泌特徴を有する様々な腫瘍の、ＨＥＳ６および他の関与性のマーカーの測定を介する迅速な同定および特徴付けが可能となる。図７Ｄは、サンプリングされた神経内分泌特徴を伴う腫瘍（例えば、ＬＵ−ＳＣＬＣ、ＬＵ−ＬＣＮＥＣ）内のＨＥＳ６の全般的過剰発現を、正常組織、乳房、結腸、肝臓および他の選択された腫瘍と比較して例示する。これらのマイクロアレイデータおよびｑＰＣＲデータにより、少なくとも一部の子宮内膜腫瘍、腎臓腫瘍、および卵巣腫瘍は、神経内分泌腫瘍特徴を呈示し得ることが示される（図７Ａおよび７Ｄ）ことは有意義である。
上記で記載した通りに作成されたマイクロアレイデータは、クラスターＣ、Ｄ、およびＥの中の腫瘍が、様々な神経内分泌マーカーを呈示することを示すだけでなく、また、これらのクラスター内の腫瘍が、神経発生、神経コミットメント、または神経運命への分化を示すマーカーを発現させることも示した（図７Ｅ）。クラスターＤ内の腫瘍が、これらのマーカーの多く（例えば、ＢＥＸ１受容体およびＢＥＸ４受容体、ＣＤ５６受容体、ＮＲＣＡＭ受容体、ＳＥＭＡ受容体、ＳＯＸ因子およびＺＩＣ因子）のより強力で一貫した上方調節を高頻度で示し、ホルモンの上方調節を、他のクラスターと対比して高頻度で低減したことから、より神経性の表現型が示唆されることは、特に興味深い。注目すべきことに、これらの同じクラスター内の腫瘍はまた、高レベルのＳＥＺ６転写物も示したことから、ＳＥＺ６は、神経内分泌特徴および神経特徴を有する腫瘍と関連することが示唆される（図７Ｆ）。
（実施例３）
神経内分泌特徴および神経特徴を有する腫瘍内のＳＥＺ６ ｍＲＮＡの発現
全トランスクリプトームシークエンシング（実施例１）ならびにマイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ（実施例２）を含む様々な技法を使用して、神経内分泌特徴を呈示する腫瘍を同定した。非神経内分泌腫瘍および正常組織と比較した場合に、神経内分泌腫瘍内で高度に発現する潜在的治療標的を見出すために、このようにして作成されたデータをさらに解析した。実施例１で論じた通り、正常脳内で主に発現する１回膜貫通タンパク質であるＳＥＺ６は、多くの神経内分泌腫瘍内でも高度に発現することが見出された（図６Ｂ）。
実施例２で作製されたマイクロアレイデータは、クラスターＣ、Ｄ、およびＥに位置する腫瘍が、神経内分泌マーカー（図７Ｂ）および神経マーカー（図７Ｅ）を発現させることを示した。これらの同じクラスター内の腫瘍はまた、高レベルのＳＥＺ６転写物も示したことから、ＳＥＺ６は、神経内分泌特徴および神経特徴を有する腫瘍と関連することが示唆される（図７Ｆ）。これは、ＳＥＺ６の、出生後前脳の発生および成体における海馬の特異的領域内の持続的な発現における公知の役割と符合する。ＳＥＺ６は、細胞間の認識およびシグナリングにおいて重要な役割を果たすと考えられる。腫瘍内では、発生に関わる経路が不適切に発現することが多い。
様々な試料ＮＴＸ腫瘍細胞系内のＳＥＺ６ ｍＲＮＡ発現レベルを決定するために、本質的に上記の実施例２で記載した通りに、ＳＥＺ６ Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。図８Ａは、正常組織内の平均発現と比べ、内部対照遺伝子であるＡＬＡＳ１の発現に照らして標準化された、ＳＥＺ６の発現を示す。神経内分泌ＮＴＸ集団内では、ＳＥＺ６遺伝子発現は、正常組織と対比して、１０，０００，０００倍を超えて上昇する。図８Ａに示されるＳＣＬＣ ＮＴＸ細胞系のうちの５つは、初代生検（ｐ０）から直接抽出されたｍＲＮＡ試料である。これらの非継代腫瘍内のＳＥＺ６の発現により、ＳＥＺ６の発現は、マウスにおいて増殖するヒト腫瘍から生じるアーチファクトではないことが実証される。図８Ａにはまた、ＮＳＣＬＣの３つの亜型も表され、ＬＵ２５は、紡錘細胞癌であり、ＬＵ５０は、大細胞性神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）であり、ＬＵ８５は、扁平細胞癌（ＳＣＣ）である。それぞれ、腎臓腫瘍および卵巣腫瘍である、ＫＤＹ６６およびＯＶ２６が、マイクロアレイ上で、ＳＣＬＣ腫瘍およびＬＣＮＥＣ腫瘍と共にクラスタリングした（図７Ａ）ことから、これらもまた、神経内分泌特徴を有することが示唆される。
ＳＥＺ６の発現についての解析を、より広範にわたる腫瘍検体へと拡張するために、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。略述すると、ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、実施例１で記載した通りに調製された１ｎｇのＲＮＡを、ｃＤＮＡへと転換した。ＳＥＺ６特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して、ｃＤＮＡをあらかじめ増幅し、次いで、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施するのに使用した。正常組織内の発現（ＮｏｒｍＴｏｘまたはＮｏｒｍ）を、以下のＮＴＸ細胞系内の発現：ＢＲ（１３）、ＣＲ（２４）、ＫＤＹ（１０）、ＯＶ（３５）、ＰＡ（２１）、肺腺癌（ＬＵ−Ａｄｅｎｏ）（２３）、ＬＵ−ＣＡＲ（１）、ＬＵ−ＬＣＣ（８）、ＳＣＣ（１２）、ＳＣＬＣ（３０）、および髄様甲状腺がん（ＴＨＹ）（１）（括弧内の数は、固有の被験ＮＴＸ細胞系の数を指し示す）と比較した（図８Ｂ）。ＳＣＬＣ ＮＴＸ、ＴＨＹ ＮＴＸ、ＬＵ−ＣＡＲ ＮＴＸ、およびＬＣ−ＬＣＣ ＮＴＸは、最高度のＳＥＺ６発現を示すが、正常組織試料と比較した、ある程度のＳＥＺ６発現はまた、ＯＶ ＮＴＸ細胞系内、ＰＡ ＮＴＸ細胞系内、ＢＲ ＮＴＸ細胞系内、ＣＲ ＮＴＸ細胞系内、およびＬＵ−Ａｄｅｎｏ ＮＴＸ細胞系内でも見られた。
「ＮｏｒｍＴｏｘ」とは、正常組織による以下の試料：１つの副腎試料、４つの結腸試料、４つの腎臓試料、４つの肝臓試料、３つの肺試料、３つの膵臓試料、３つの心臓試料、３つの食道試料、１つの骨格筋試料、１つの皮膚試料、２つの皮膚線維芽細胞試料、２つの角化細胞試料、３つの小腸試料、１つの脾臓試料、２つの胃試料、および２つの気管試料を表す。「Ｎｏｒｍ」と表記される正常組織の別のセットは、正常組織による以下の試料：脂肪、Ｂ細胞、膀胱、脳、乳房、子宮頸部、メラニン細胞、単球、ＮＫ細胞、卵巣、末梢血単核細胞、胎盤、前立腺、唾液腺、Ｔ細胞、精巣、胸腺、および甲状腺を表す。大半の正常組織では、ＳＥＺ６は発現しないが、膵臓内、結腸内、肝臓内、および肺内では低度な発現が見られ、脳内では高度な発現が見られる。上記と本質的に同じ方法を使用して、異なるＳＥＺ６特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを、様々なＮＴＸ腫瘍細胞系に対して実行した。各腫瘍型について調べた腫瘍細胞系の数を分母として表記する一方、ＳＥＺ６を発現させた腫瘍の数を分子として表記する：２／６（ＣＲ）、２／４（ＧＡ）、１／１（ＧＢ）（神経膠芽腫）、１／１（ＫＤＹ）、２／６（ＳＫ）、２／５（ＬＵ−Ａｄｅｎｏ）、４／４（ＬＣＮＥＣ）、２／７（ＬＵ−ＳＣＣ）、９／９（ＳＣＬＣ）、および１／２（ＯＶ）（データは示さない）。
まとめると、これらのデータにより、ＳＥＺ６は、神経内分泌特徴および神経特徴を呈示する腫瘍内で上方調節されることが示唆されることから、これらの腫瘍型の処置のための治療標的として用いられ得ることが示唆される。
（実施例４）
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用する、様々な腫瘍検体内および正常組織検体内のＳＥＺ６ ｍＲＮＡの発現
ＳＥＺ６の発現についての解析を、より広範にわたる腫瘍検体へと拡張するために、Ｔａｑｍａｎ ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）ｑＰＣＲ（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３８４ウェルアレイ上で、実質的に前出の実施例で記載した通りに実施した。このアレイは、１８の異なる固形腫瘍型にわたる、遺伝子発現の比較であって、各腫瘍型についての、複数の患者由来の試料、および正常隣接組織からの、複数の患者由来の試料を伴う比較を可能とする。
これに関して、図９Ａおよび９Ｂは、それぞれ、１８の異なる固形腫瘍型のうちの１つを伴う患者に由来する、全腫瘍検体（グレードット）内または正常隣接組織（ＮＡＴ；白ドット）内の、ＳＥＺ６についての絶対遺伝子発現レベルおよび相対遺伝子発現レベルを示す。より詳細には、図９Ａは、様々な全腫瘍検体内またはマッチさせた正常隣接組織内のＳＥＺ６の絶対ｍＲＮＡ発現レベルを示す。図９Ｂは、解析された各腫瘍型について、β−アクチンに照らして標準化され、正常隣接組織内の発現と比べてプロットされたＳＥＺ６の発現レベルを示す。ＳＥＺ６が検出されなかった検体には、実験プロトコールにおける増幅の最終サイクルを表す、５０のＣｔ値を割り当てた。各ドットは、単一の組織検体を表し、幾何平均値を黒線として表す。
このＯｒｉｇｅｎｅ Ａｒｒａｙを使用したところ、副腎がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、および膵臓がんのサブセットであって、これらの多くが低分化度神経内分泌表現型を伴う神経内分泌腫瘍または腫瘍を表し得るサブセット内では、過剰ＳＥＺ６の発現が見られた。これは、１／１の髄様甲状腺がんおよび１／３の濾胞型甲状腺乳頭癌、８／８の膵神経内分泌腫瘍、４／４の膵島細胞腫瘍、１／２の肺大細胞性神経内分泌がん、および３／３の肺カルチノイド腫瘍における高度な発現を含む。図９Ａ内の絶対遺伝子発現により示される通り、高ＳＥＺ６発現を伴う正常組織は、正常な精巣および膵臓に限られる。これにより、ＳＥＺ６は、神経内分泌特徴および神経特徴を伴う腫瘍などが挙げられるがこれらに限定されない多種多様な腫瘍内の腫瘍形成および／または腫瘍進行において、役割を果たし得ることが示唆される。
（実施例５）
組換えＳＥＺ６タンパク質のクローニングおよび発現
ヒトＳＥＺ６（ｈＳＥＺ６）
ＳＥＺ６アイソフォーム１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）およびＳＥＺ６アイソフォーム２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を、それぞれ、図１Ｃおよび１Ｄに示す。ＳＥＺ６アイソフォームのそれぞれの細胞外ドメインは、同一である。図１Ｃおよび１Ｄでは、１９アミノ酸を含むリーダー配列を太字とし、下線を付す。配列番号３および配列番号４のそれぞれのアミノ酸残基の残りの部分は、成熟ＳＥＺ６タンパク質を含む。ヒトＳＥＺ６に関して、本発明で要求される、全ての分子材料および細胞材料を作製し、開発するために、完全成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質（図３Ｂ；配列番号６）をコードするｃＤＮＡ（図３Ａ；配列番号５）を、以下の通りに創出した。市販品のヒトＳＥＺ６ ｃＤＮＡは、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入し、このｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＢＣ１４６２９２に対応する。配列アラインメントは、ＢＣ１４６２９２によりコードされるタンパク質が、内因性ヒトＳＥＺ６タンパク質をコードするＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿８４９１９１（残基４１４、４１５、および４１７；図３Ｃを参照されたい）と、複数の残基だけ異なることを示した。ＰＣＲを使用して、ＢＣ１４６２９２クローンに由来する、２つの個別のｃＤＮＡ断片を増幅したが、この場合、内因性ヒトＳＥＺ６タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である、ＮＭ＿１７８８６０によりコードされる配列と同一な配列により、成熟ＳＥＺ６タンパク質をコードするｃＤＮＡを創出するオーバーラップＰＣＲ工程では、使用されるプライマーにより、ｃＤＮＡへと、残基４１４〜４１７において、所望の変化を導入した。成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質またはその断片を発現させる構築物に対する全ての後続の操作では、ｈＳＥＺ６と称する修復ｃＤＮＡクローン（図３Ａ）を使用した。
ＳＥＺ６分子に対する免疫反応性モジュレーターまたは免疫特異性モジュレーターを作製するために、ヒトＳＥＺ６タンパク質のＥＣＤ部分を、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインへと融合させたキメラ融合遺伝子を作製した（図４Ａ；配列番号８）。これは、以下の通りになされた。ＳＥＺ６のＥＣＤをコードするｃＤＮＡを、ｈＳＥＺ６ ｃＤＮＡクローン（図３Ａ）からＰＣＲ増幅し、その後、標準的な分子法を使用して、このＰＣＲ産物を、ＣＭＶ駆動型発現ベクターへと、ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流に、かつ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ ｃＤＮＡの上流に、インフレームでサブクローニングした。ｈＳＥＺ６−Ｆｃ ＯＲＦと称する、ｈＳＥＺ６−Ｆｃ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、図４Ａに示し、ｈＳＥＺ６−Ｆｃ ＯＲＦによりコードされる、対応するタンパク質配列を、図４Ｂに示す（配列番号９）。配列の下線を付された領域は、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃに対応する。太字とさて、下線を付された領域は、ＩｇＫシグナルペプチドに対応し、太字フォントの配列は、ＳＥＺ６ ＥＣＤを挟むクローニング制限部位によりコードされる融合タンパク質の部分に対応する。
組換えｈＳＥＺ６ ＥＣＤタンパク質を作製するために、同様のＰＣＲベースの戦略を使用した。ＳＥＺ６のＥＣＤをコードするｃＤＮＡ断片を、ｈＳＥＺ６ ｃＤＮＡクローンから増幅し、ＣＭＶ駆動型発現ベクターへと、インフレームで、ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流に、かつ、インフレームで、９ヒスチジンエピトープタグ（配列番号２０１）をコードする配列の上流にサブクローニングした。
ＣＭＶ駆動型発現ベクターは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内および／またはＣＨＯ−Ｓ細胞内で、高レベルの一過性発現を可能とする。ポリエチレンイミンポリマーを、トランスフェクト試薬として使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の懸濁培養物もしくは付着培養物または懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、ｈＳＥＺ６ ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質またはｈＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質をコードする発現構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの３〜５日後、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムまたはＮｉｃｋｅｌ−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムのそれぞれを使用して、ｈＳＥＺ６ ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質またはｈＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、清明化させた細胞上清から精製した。
組換えヒトＳＥＺ６を過剰発現させる安定的な細胞系は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に形質導入するレンチウイルスベクターを使用して、以下の通りに構築した。ＰＣＲ増幅は、ヒトＳＥＺ６クローンを、成熟ヒトＳＥＺ６タンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を産生するための鋳型として使用して実施した。標準的な分子クローニング法を使用して、作製された断片を、インフレームで、ＩｇＫシグナルペプチドをコードする配列の下流にサブクローニングし、あらかじめ操作されたＤＤＫエピトープタグを、ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の複数のクローニング部位の上流にサブクローニングした。結果として得られるバイシストロニックのレンチウイルスベクターを使用して、ヒトＳＥＺ６−Ｔ２Ａペプチド−ＧＦＰポリペプチドを過剰発現させる細胞系を操作した。Ｔ２Ａ配列は、ペプチド結合の縮合部に対するリボソームスキッピングを促進する結果として、２つの独立のタンパク質であり、この場合、ＳＥＺ６およびＧＦＰをもたらす。
マウスＳＥＺ６（ｍＳＥＺ６）
組換えマウスＳＥＺ６を過剰発現させる安定的な細胞系は、本質的に、組換えヒトＳＥＺ６について上記に記載した通りに操作した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、マウスＳＥＺ６を発現させるレンチウイルスベクターを形質導入した。ベクターは、本質的に以下の通りに操作した。ＮＣＢＩデータベース内にＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０２１２８６として収載されている成熟マウスＳＥＺ６タンパク質（図５Ｂ；配列番号１１）をコードするｃＤＮＡ断片（図５Ａ；配列番号１０）は、市販品のマウスＳＥＺ６ ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ；型番ＭＣ２０３６３４）からのＰＣＲ増幅により得、標準的な分子クローニング技法を使用して、ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流にサブクローニングし、あらかじめ操作されたＤＤＫエピトープタグ配列を、ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−ＲＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の複数のクローニング部位の上流にサブクローニングした。これにより、バイシストロニックのレンチウイルスベクターをもたらし、マウスＳＥＺ６およびＲＦＰを過剰発現させるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系を産生するのに使用した。
ラットＳＥＺ６（ｒＳＥＺ６）
ラットＳＥＺ６に関して、本発明で要求される、全ての分子材料および細胞材料を作製し、開発するために、完全成熟ラットＳＥＺ６タンパク質（図５Ｄ、配列番号１３）をコードするｃＤＮＡ（図５Ｃ、配列番号１２）を、以下の通りに得た。全長成熟ラットタンパク質（すなわち、全長タンパク質から野生型シグナルペプチドを取り除いたもの）をコードするｃＤＮＡは、ラット脳ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；型番６３９４１２）から増幅した。配列アラインメントは、コードされたタンパク質のＥＣＤが、ＮＣＢＩデータベース内にＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１０９９２２４として収載されている内因性ラットＳＥＺ６タンパク質と相同であることを示した。ｒＳＥＺ６と称するこのｃＤＮＡクローン（図５Ｄ）を、その後における、ラットＳＥＺ６タンパク質断片を発現させる構築物の操作に使用した。
カニクイザルＳＥＺ６（ｃＳＥＺ６）
カニクイザルＳＥＺ６に関して、本発明で要求される、全ての分子材料および細胞材料を作製し、開発するために、カニクイザルＳＥＺ６タンパク質（図５Ｆ、配列番号１５）をコードするｃＤＮＡ（図５Ｅ、配列番号１４）を、以下の通りに得た。予測されるカニクイザルＳＥＺ６ ＯＲＦ配列を、バイオインフォーマティックス解析により、以下の様式でアセンブルした。ヒトＳＥＺ６遺伝子のＯＲＦは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿１７８８６０から得、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ＮＣＢＩデータベース内の、全ゲノムショットガンシークエンシングコンティグと比較した。次いで、ＢＬＡＳＴの結果を使用して、推定カニクイザルＳＥＺ６ ＯＲＦをアセンブルした。カニクイザルＳＥＺ６の予測される野生型シグナルペプチドをコードする配列は、このＢＬＡＳＴにより誘導される配列から除去し、ＩｇＫシグナルペプチドをコードする配列で置きかえた。哺乳動物細胞内の産生のためのコドン最適化の後で、この完全ハイブリッドＯＲＦ配列を、合成遺伝子（ＧｅｎｅＷｉｚ）として委託した。ｃＳＥＺ６と称する、この最適化されたｃＤＮＡクローン（図５Ｅ）を、その後における、カニクイザルＳＥＺ６タンパク質断片を発現させる構築物の操作に使用した。
ヒトＳＥＺ６ＬおよびＳＥＺ６Ｌ２
ヒトゲノムでは、ＳＥＺ６の２つの近縁の遺伝子である、発作関連６ホモログ様（ＳＥＺ６Ｌ）および発作関連６ホモログ様２（ＳＥＺ６Ｌ２）が認められる。３つのタンパク質の間の全体的な同一性パーセントは比較的小さい（約４２％）が、タンパク質の対または３つのタンパク質全ての間では、完全な同一性を有する小型の連なりが認められる。抗ＳＥＺ６モジュレーターの、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質およびＳＥＺ６Ｌ２タンパク質との任意の可能な交差反応性について探索するために、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質（ＮＰ＿００６６９３８）およびヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質（ＮＰ＿００１２３０２６１）のＥＣＤをコードするオープンリーディングフレームを、コドン最適化し、合成した（ＧｅｎｅＷｉｚ）。ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質またはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質のＥＣＤをコードする、これらの最適化されたｃＤＮＡ配列を、図５Ｇおよび５Ｉに示す。
交差反応性研究のための材料
材料は、本発明のＳＥＺ６モジュレーターが、ラットＳＥＺ６相同体および／またはカニクイザルＳＥＺ６相同体と交差反応するのか、近縁のヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質およびヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質と交差反応するのかについて研究するために作製した。ラットＳＥＺ６タンパク質またはカニクイザルＳＥＺ６タンパク質のＥＣＤ部分（それぞれ、図５Ｄおよび５Ｆにおいて下線を付された）を、９ヒスチジンエピトープタグ（配列番号２０１）へと融合させる、キメラ融合遺伝子をデザインした。ＰＣＲを使用して、ラットＳＥＺ６またはカニクイザルＳＥＺ６のＥＣＤをコードするｃＤＮＡ断片を、それぞれ、ｒＳＥＺ６またはｃＳＥＺ６から増幅し、ＣＭＶ駆動型発現ベクターへと、インフレームで、ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流に、かつ、インフレームで、９ヒスチジンエピトープタグ（配列番号２０１）をコードする配列の上流にサブクローニングした。同様に、ヒトＳＥＺ６Ｌタンパク質またはヒトＳＥＺ６Ｌ２タンパク質のＥＣＤ部分をコードするオープンリーディングフレームを、ＣＭＶ駆動型発現ベクターへと、インフレームで、ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流に、かつ、インフレームで、９ヒスチジンエピトープタグ（配列番号２０１）をコードする配列の上流にサブクローニングする、キメラ融合遺伝子もデザインした。これらの融合タンパク質について、結果として生じる、コードされたタンパク質配列を、それぞれ、図５Ｈおよび５Ｊに示すが、下線を付された配列は、検討される特定のタンパク質のＥＣＤを表す。
上記で作り出された、ラットＳＥＺ６ ＥＣＤ−ＨｉｓベクターおよびカニクイザルＳＥＺ６ ＥＣＤ−Ｈｉｓベクターを使用して、組換えｒＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質およびｃＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質のそれぞれを、以下の通りに産生および精製した。当技術分野で認知された技法を使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の懸濁培養物もしくは付着培養物または懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、ｒＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質またはｃＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトした。ポリエチレンイミンポリマーを、トランスフェクト試薬として使用した。トランスフェクションの３〜５日後、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒおよびＮｉｃｋｅｌ−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを使用して、ｒＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質またはｃＳＥＺ６−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、清明化させた細胞上清から精製した。同様に、ヒトＳＥＺ６ＬおよびＳＥＺ６Ｌ２ ＥＣＤ−Ｈｉｓベクターを使用して、ラット相同体およびカニクイザル相同体について記載した通りに、組換えヒトＳＥＺ６ＬおよびヒトＳＥＺ６Ｌ２ ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質も産生および精製した。
（実施例６）
抗ＳＥＺ６マウスモジュレーターの作製
本明細書の教示に従い、ヒトＳＥＺ６−Ｆｃを接種することにより、マウス抗体の形態のＳＥＺ６モジュレーターを産生した。これに関して、３つのマウス株を使用して、様々な増殖性障害を防止および／または処置するために、ＳＥＺ６と会合し、かつ／またはＳＥＺ６の作用を阻害するのに使用され得る、高アフィニティーのマウスモノクローナル抗体によるモジュレーターを作製した。具体的には、Ｂａｌｂ／ｃマウス株、ＣＤ−１マウス株、およびＦＶＢマウス株を、ヒト組換えＳＥＺ６−Ｆｃで免疫化し、ハイブリドーマを産生するのに使用した。
ＳＥＺ６−Ｆｃ抗原は、実施例５（図４Ａおよび４Ｂ）で示されるＳＥＺ６−Ｆｃ構築物を過剰発現させるＣＨＯ−Ｓ細胞に由来する上清から精製した。１０μｇのＳＥＺ６−Ｆｃ免疫原を、初回の免疫化に使用した後、５μｇおよび２．５μｇのＳＥＺ６−Ｆｃ免疫原を、その後の３回にわたる免疫化および５回にわたる免疫化のそれぞれに使用した。全ての免疫化は、等容量のＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはアラムアジュバントと共に乳化させた免疫原により実施した。マウス抗体は、全ての注射のために、足蹠経路を介して、６匹の雌マウス（２匹ずつ：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）を免疫化することにより作製した。
固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウス血清を、ヒトＳＥＺ６に特異的なマウスＩｇＧ抗体についてスクリーニングした。バックグラウンドを上回る陽性シグナルは、ＳＥＺ６に特異的な抗体を示した。略述すると、９６ウェルプレート（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；型番６１０７４４）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中に０．５μｇ／ｍｌの組換えＳＥＺ６−Ｈｉｓで、終夜コーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、ウェル１つ当たり２００μＬずつのＰＢＳ中に３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡにより、室温（ＲＴ：ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１時間にわたりブロッキングした。マウス血清を滴定し（１：１００、１：２００、１：４００、および１：８００）、ＳＥＺ６でコーティングされたプレートに、ウェル１つ当たり５０μＬずつで添加し、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、３％のＢＳＡ−ＰＢＳまたはＰＢＳ中に２％のＦＣＳ中で１：１０，０００に希釈された、ウェル１つ当たり５０μＬずつの、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。再度プレートを洗浄し、ウェル１つ当たり４０μＬずつのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；３４０２８）を、ＲＴで１５分間にわたり添加した。発色させた後、等容量の２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させ、プレートを、分光光度計により、ＯＤ４５０で解析した。
血清陽性免疫化マウスを屠殺し、流入領域リンパ節（肥大した場合、膝窩および鼠径および内側腸骨）を切り出し、抗体産生細胞のための供給源として使用した。Ｂ細胞（細胞２２８．９×１０６個）の単一細胞懸濁液を、非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ−１５８０）と、エレクトロセルフュージョンにより、１：１の比で融合させた。エレクトロフュージョンは、製造業者の指示書に準拠して、ＢＴＸ Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して実施した。融合手順の後で、細胞を、Ａｚａｓｅｒｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ；型番Ａ９６６６）、１５％のウシクローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン、および５０μＭの２−メルカプトエタノールを含有する、ピルビン酸ナトリウムを伴う高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ；型番１５−０１７−ＣＭ）を補充したハイブリドーマ選択培地中に再懸濁させ、次いで、３つのＴ２２５フラスコ内の、フラスコ１つ当たり９０ｍＬずつの選択培地中に播種した。次いで、フラスコを、５％のＣＯ２および９５％の空気を含有する、加湿された３７℃のインキュベーター内に、６〜７日間にわたり入れた。
６〜７日間にわたる増殖の後で、Ａｒｉａ Ｉ細胞分取器を使用して、Ｔ２２５内、バルクで増殖させた細胞からなるライブラリーを、Ｆａｌｃｏｎ ９６ウェルＵ字底プレート内に、ウェル１つ当たりの細胞１個で播種した。次いで、選択されたハイブリドーマを、１５％のウシクローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、および１００μＭのヒポキサンチンを含有する、２００μＬの培養培地中で増殖させた。任意の使用されなかった残りのハイブリドーマライブラリー細胞は、将来のライブラリー試験のために凍結させた。増殖の１０〜１１日後、各ウェルからの、播種された細胞の上清を、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＦＡＣＳアッセイにより、ＳＥＺ６に対して反応性の抗体についてアッセイした。
ＥＬＩＳＡによるスクリーニングのために、９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍＬのＳＥＺ６−Ｆｃにより、４℃で終夜コーティングした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中３％のＢＳＡにより、３７℃で１時間にわたりブロッキングし、速やかに使用するか、または４℃で保存した。未希釈のハイブリドーマ上清を、プレート上、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈されたＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより、ＲＴで１時間にわたりプロービングした。次いで、プレートを、上記に記載した基質溶液と共にインキュベートし、ＯＤ４５０で読み取った。バックグラウンドを上回るシグナルにより決定される、ヒトＳＥＺ６に優先的に結合する免疫グロブリンを含有するウェルは、移し、増殖させた。
マウス免疫グロブリンを分泌する、選択された増殖陽性ハイブリドーマウェルはまた、前出の実施例で製作された、選択された抗原または構築物を過剰発現させるように操作された２９３細胞を伴うフローサイトメトリーベースのアッセイを使用して、ヒトＳＥＺ６に対する特異性、ならびにカニクイザルＳＥＺ６、ラットＳＥＺ６、およびマウスＳＥＺ６との交差反応性についてもスクリーニングした。
フローサイトメトリーアッセイのために、ヒトＳＥＺ６、カニクイザルＳＥＺ６、ラットＳＥＺ６、またはマウスＳＥＺ６のそれぞれを形質導入されたｈ２９３細胞５０×１０４個を、２５〜１００μＬのハイブリドーマ上清と共に、３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ、２％のＦＣＳで２回にわたり洗浄し、次いで、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で１：２００に希釈された、５０μＬの、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。インキュベーションの１５分後、細胞を、ＰＢＳ、２％ＦＣＳで２回にわたり洗浄し、ＤＡＰＩを伴う同じ緩衝液中に再懸濁させ、製造業者の指示書に従い、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩを使用する、フローサイトメトリーにより解析した。ＳＥＺ６＋ＧＦＰ＋細胞に優先的に結合する免疫グロブリンを含有するウェルは、移し、増殖させた。結果として得られるｈＳＥＺ６特異的クローンハイブリドーマは、ＣＳ−１０凍結培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で凍結保存し、液体窒素中で保存した。ヒトＳＥＺ６細胞、カニクイザルＳＥＺ６細胞、ラットＳＥＺ６細胞、またはマウスＳＥＺ６細胞と結合する抗体は、交差反応性抗体として注記した（図１１Ａを参照されたい）。
ＥＬＩＳＡ解析およびフローサイトメトリー解析により、これらのハイブリドーマの大半または全てに由来する精製抗体は、ＳＥＺ６に、濃度依存的に結合することが確認された。ＳＥＺ６ ＧＦＰ細胞に結合する免疫グロブリンを含有するウェルは、移し、増殖させた。結果として得られるクローンハイブリドーマは、ＣＳ−１０凍結培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で凍結保存し、液体窒素中で保存した。
１回の融合を実施したら、４８枚のプレート（約４０％のクローニング効率で４６０８個のウェル）に播種した。初期スクリーニングにより、ヒトＳＥＺ６と会合する６３のマウス抗体がもたらされた。続いて、二次スクリーニングを実施し、ヒトＳＥＺ６と会合する１３４の抗体をもたらした。
（実施例７）
ＳＥＺ６マウスモジュレーターのシークエンシング
前出に基づき、いくつかの、例示的な、顕著に異なるモノクローナル抗体であって、固定化されたヒトＳＥＺ６細胞またはｈ２９３−ｈＳＥＺ６細胞に見かけ上の高アフィニティーで結合するモノクローナル抗体を、シークエンシングおよびさらなる解析のために選択した。図１０Ａおよび１０Ｂにおいて表解式で示される通り、選択された、実施例６で作製されたモノクローナル抗体に由来する軽鎖可変領域（図１０Ａ）および重鎖可変領域（図１０Ｂ）についての配列解析により、多くの抗体が、新規の相補性決定領域を有し、しばしば、新規のＶＤＪ配置を提示することが確認された。図１０Ａおよび１０Ｂに示される相補性決定領域は、Kabatら、前掲に準拠して規定されることに注意されたい。
例示的なモジュレーターのシークエンシングにおける第１のステップとして、選択されたハイブリドーマ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で溶解させて、ＲＮＡを調製した。これに関して、１０４〜１０５個の間の細胞を、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中に再懸濁させ、２００μＬのクロロホルムを添加した後で強く振盪した。次いで、試料を、４℃で１０分間にわたり遠心分離し、水性相を、未使用の微量遠心管へと移し、等容量のイソプロパノールを添加した。試験管を、再度強く振盪し、ＲＴで１０分間にわたりインキュベートしてから、４℃で１０分間にわたり遠心分離した。結果として得られるＲＮＡペレットを、７０％のエタノール１ｍＬで１回洗浄し、ＲＴで簡易乾燥させてから、４０μＬのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁させたＲＮＡ調製物の品質を、１％のアガロースゲル中で３μＬを分画することにより決定してから、使用するまで、−８０℃で保存した。
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な、３’マウスＣγプライマーと組み合わせて、完全なマウスＶＨレパートリーをターゲティングするようにデザインされた、３２のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む、５’プライマーミックスを使用して増幅した。ＶＨの４００ｂｐのＰＣＲ断片を、同じＰＣＲプライマーを使用して、両端からシークエンシングした。同様に、カッパ軽鎖を増幅およびシークエンシングするために、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するようにデザインされた、３２の５’Ｖκリーダー配列を含有するプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に対して特異的な単一のリバースプライマーと組み合わせて使用した。ＶＨ転写物およびＶＬ転写物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して増幅した。
各ハイブリドーマについて、４回はＶκ軽鎖についてであり、４回はＶガンマ重鎖（γ１）についてである、のべ８回にわたるＲＴ−ＰＣＲ反応を施した。Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を、増幅に使用した。このキットは、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅおよびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰミックス、緩衝液、ならびに「困難な」（例えば、ＧＣに富む）鋳型の効率的な増幅を可能とする新規の添加剤である、Ｑ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎのブレンドを提供する。３μＬのＲＮＡ、１００μＭの重鎖プライマーまたはカッパ軽鎖プライマー０．５μＬ（ＩＤＴにより特注で合成された）、５倍濃度のＲＴ−ＰＣＲ緩衝液５μＬ、１μＬのｄＮＴＰ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する酵素ミックス１μＬ、ならびにリボヌクレアーゼ阻害剤であるＲＮａｓｉｎ０．４μＬ（１単位）を含む反応混合物を調製した。反応混合物は、逆転写およびＰＣＲの両方に要求される試薬の全てを含有する。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間のＲＴステップに続く、（９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で１分間）による３０サイクルのＰＣＲに設定した。次いで、７２℃で１０分間にわたる最終インキュベーションが施された。
直接的なＤＮＡシークエンシングのためのＰＣＲ産物を調製するために、製造業者のプロトコールに従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤＮＡは、５０μＬの滅菌水を使用して、スピンカラムから溶出させ、次いで、両方の鎖から直接シークエンシングした。抽出されたＰＣＲ産物は、特異的Ｖ領域プライマーを使用してシークエンシングした。ヌクレオチド配列は、最高度の配列相同性を伴う、生殖細胞系列のＶ遺伝子、Ｄ遺伝子、およびＪ遺伝子のメンバーを同定するのに、ＩＭＧＴを使用して解析した。誘導した配列を、Ｖ−ＢＡＳＥ２（Retterら、前掲）を使用して、かつ、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の、マウス生殖細胞系列データベースに照らしたアラインメントにより、公知の生殖細胞系列のＩｇ Ｖ領域およびＩｇ Ｊ領域のＤＮＡ配列とさらに比較して、下記に示されるヒト化構築物の製作の一助とした。
より詳細には、図１０Ａは、抗ＳＥＺ６抗体に由来する７４の固有の新規のマウス軽鎖可変領域（配列番号２０〜１６８、偶数）、および代表的なマウス軽鎖から誘導された１１のヒト化軽鎖可変領域（配列番号１７０〜１９２、偶数）の連続的なアミノ酸配列を描示する。同様に、図１０Ｂは、同じ抗ＳＥＺ６抗体に由来する７４の固有の新規のマウス重鎖可変領域（配列番号２１〜１６９、奇数）、およびヒト化軽鎖をもたらす同じマウス抗体に由来する１１のヒト化重鎖可変領域（（配列番号１７１〜１９３、奇数）の連続的なアミノ酸配列を描示する。したがって、併せると、図１０Ａおよび１０Ｂは、７４の固有の作動可能なマウス抗ＳＥＺ６抗体（ＳＣ１７．１、ＳＣ１７．２、ＳＣ１７．３、ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．８、ＳＣ１７．９、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．１１、ＳＣ１７．１４、ＳＣ１７．１５、ＳＣ１７．１６（ＳＣ１７．６の２連）、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１８、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２２、ＳＣ１７．２４（ＳＣ１７．２の２連配列）、ＳＣ１７．２７、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．２９、ＳＣ１７．３０、ＳＣ１７．３２、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３５、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．３８、ＳＣ１７．３９、ＳＣ１７．４０、ＳＣ１７．４１、ＳＣ１７．４２、ＳＣ１７．４５、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．４７、ＳＣ１７．４９、ＳＣ１７．５０、ＳＣ１７．５３、ＳＣ１７．５４、ＳＣ１７．５６、ＳＣ１７．５７、ＳＣ１７．５９、ＳＣ１７．６１、ＳＣ１７．６３、ＳＣ１７．７１、ＳＣ１７．７２、ＳＣ１７．７４、ＳＣ１７．７６、ＳＣ１７．７７、ＳＣ１７．７９、ＳＣ１７．８１、ＳＣ１７．８２、ＳＣ１７．８４、ＳＣ１７．８５、ＳＣ１７．８７、ＳＣ１７．８９、ＳＣ１７．９０、ＳＣ１７．９１、ＳＣ１７．９３、ＳＣ１７．９５、ＳＣ１７．９７、ＳＣ１７．９９、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１１４、ＳＣ１７．１１５、ＳＣ１７．１２０、ＳＣ１７１２１、ＳＣ１７．１２２、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１８７、ＳＣ１７．１９１、ＳＣ１７．１９３、ＳＣ１７．１９９、およびＳＣ１７．２００と称する）、および１１のヒト化抗体（ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ｈＳＣ１７．１５１、ｈＳＣ１７．１５５、ｈＳＣ１７．１５６、ｈＳＣ１７．１６１、およびｈＳＣ１７．２００と称する）の、注釈を施された配列を提示する。これらの同じ記号表示が、対象の抗体をもたらすクローンを指す場合もあり、任意の特定の記号表示の使用はそれ自体、包括的な開示の文脈で解釈すべきであることに注意されたい。
加えて、ｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１（配列番号１９２）は、ヒト化軽鎖構築物であるｈＳＣ１７．２００（配列番号１９０）のバリアントであり、ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ１〜ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ６（配列番号１９３〜１９８）は、ＳＣ１７．９０（配列番号１２７）から誘導された、重鎖構築物であるｈＳＣ．１５５（配列番号１８４）のバリアントであり、ｈＳＣ１６１ ｖＨ１（配列番号１９９）は、重鎖構築物であるｈＳＣ１７．１６１（配列番号１８９）のバリアントである。下記でより詳細に論じられる通り、これらのバリアントは、親抗体の１または複数の生化学的特性を最適化するように、構築され、調べられた。
さらに、図１０Ａおよび１０Ｂに示される、７４の例示的なマウスモジュレーターおよび１１のヒト化モジュレーターならびにバリアントのそれぞれの対応する核酸配列も、本出願の配列表に組み入れられる（配列番号２２０〜３９９）。
本出願の目的では、各特定の抗体の配列番号は、連続番号である。したがって、ｍＡｂ ＳＣ１７．１は、軽鎖および重鎖可変領域のそれぞれに対する、配列番号２０および２１を含む。これに関して、ＳＣ１７．２は、配列番号２２および２３を含み、ＳＣ１７．９は、配列番号２４および２５を含むなどである。さらに、図１０Ａおよび１０Ｂ内の各抗体アミノ酸配列の対応する核酸配列も、配列表に示されている。配列表では、組み入れられた核酸配列は、対応するアミノ酸配列（軽鎖または重鎖）より２００大きい配列番号を含む。したがって、ｍＡｂ ＳＣ１７．１の軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列（すなわち、配列番号２０および２１）をコードする核酸配列は、配列番号２２０および２２１を含む。これに関して、開示されている軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列の全てをコードする核酸配列であって、ヒト化構築物およびそれらのバリアントをコードする核酸配列を含む核酸配列も、同様に番号付けされ、配列番号２２０〜３９９を含む。
（実施例８）
キメラＳＥＺ６モジュレーターおよびヒト化ＳＥＺ６モジュレーターの作製
上記で示唆された通り、実施例７による１１のマウス抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティングを使用してヒト化した。重鎖および軽鎖のためのヒトフレームワークは、機能的なヒト生殖細胞系列遺伝子に照らした配列類似性および構造類似性に基づき選択した。これに関して、構造類似性は、Chothiaら（前掲）において記載されている通り、カノニカルのマウスＣＤＲ構造を、同じカノニカル構造を伴うヒト候補遺伝子と比較することにより査定した。
より特定すると、１１のマウス抗体であるＳＣ１７．１６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．１５１、ＳＣ１７．１５５（ＳＣ１７．９０の２連）、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６１、およびＳＣ１７．２００は、ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４、ｈＳＣ１７．４６、ｈＳＣ１７．１５１、ｈＳＣ１７．１５５、ｈＳＣ１７．１５６、ｈＳＣ１７．１６１、およびｈＳＣ１７．２００モジュレーターをもたらすように、コンピュータ支援型ＣＤＲグラフティング方法（Ａｂｙｓｉｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐｌｃ．）および標準的な分子操作技法を使用してヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域は、対象のマウスフレームワーク配列およびそのカノニカル構造とのそれらの最高の配列相同性に基づき選択した。ヒト化解析の目的では、アミノ酸の、ＣＤＲドメインのそれぞれへの割当ては、Ｋａｂａｔらによる番号付け（前掲）に従う。
分子操作手順は、当技術分野で認知された技法を使用して実行した。この目的のために、全ｍＲＮＡを、ハイブリドーマから抽出し、すぐ上の実施例７で示した通りに増幅した。
対象のマウス抗体の重鎖および軽鎖のＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントに関するデータは、ヌクレオチド配列情報から得た。配列データに基づき、組換えモノクローナル抗体をクローニングするために、抗体のＩｇＶＨおよびＩｇＶＫ軽鎖のリーダー配列に対して特異的な、新規のプライマーセットをデザインした。その後、Ｖ−（Ｄ）−Ｊ配列を、マウスＩｇ生殖細胞系列配列に照らしてアラインさせた。１１のヒト化構築物のそれぞれについて、結果として得られる遺伝子の配置を、すぐ下の表３に示す。
表３に列挙されるヒト化抗体は、図１０Ａおよび１０Ｂに示される、注釈を施された軽鎖および重鎖配列（配列番号１７０〜１９１）に対応する。軽鎖および重鎖可変領域の対応する核酸配列は、添付の配列表に示す。表３により、結合モジュレーターの好適な特性を維持するには、極めて少数のフレームワークの変化が必要であることがさらに実証される。これに関して、フレームワークの変化または復帰突然変異は、重鎖可変領域のうちの３つだけで施され、軽鎖可変領域内の２つのフレームワーク修飾だけが企図された。
一部のヒト化軽鎖およびヒト化重鎖可変領域では、抗原への結合を維持しながら、安定性を改善するように、ＦＲ内またはＣＤＲ内にアミノ酸突然変異を導入したことに注意されたい。ＳＣ１７．１５５の場合、ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ１〜ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ６と称する６つのバリアントを産生した。これらのバリアントのそれぞれでは、変化は、ｈＳＣ１７．１５５の重鎖可変領域のＦＲまたはＣＤＲに対して作製し、軽鎖可変領域は、不変のまま放置した。ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ１およびｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ２の場合、点突然変異を、ｈＳＣ１７．１５５の重鎖可変領域のＦＲ１（配列番号４７１および４７２）に導入した。ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ３の場合、点突然変異を、ｈＳＣ１７．１５５重鎖可変領域のＣＤＲＨ１（配列番号４７３）に導入した。ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ４〜ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ６の場合、点突然変異を、ｈＳＣ１７．１５５重鎖可変領域のＣＤＲＨ２（それぞれ、配列番号４７４、４７５、および４７６）に導入した。ｈＳＣ１７．１６１の場合、重鎖可変領域のＦＲ１（配列番号４７７）；ＦＲ２（配列番号４７８）およびＦＲ３（配列番号４７９）内のある特定のアミノ酸を変化させるのに対し、軽鎖可変領域は、修飾しなかった。最後に、ｈＳＣ２００ ｖＬ１の場合、点突然変異を、ｈＳＣ１７．２００の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１（配列番号４８０）に導入したが、重鎖可変領域は、修飾しなかった。各場合に、ＣＤＲまたはＦＲが修飾された抗体の結合アフィニティーは、対応するキメラ抗体またはマウス抗体と同等であることが見出された。９つの例示的なヒト化バリアント鎖（軽鎖および重鎖）の配列を、図１０Ａおよび１０Ｂの末尾に列挙する（配列番号１９２〜１９９）が、ここで、これらは、ヒト化親鎖の記号表示を保持し、表記により、これらを変化させたことが指し示されている（例えば、ｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１、ｈＳＣ１７．１５５ ｖＨ１〜６、およびｈＳＣ１７．１６１ ｖＨ１）。例示的なヒト化抗体である、ｈＳＣ１７．２００およびｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１の全長アミノ酸配列を、図１０Ｃに、配列番号４００〜４０２として示す。ヒト化抗体バリアントであるｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１は、ヒト化抗体ｈＳＣ１７．２００から誘導されており、一般的なＨＣを、ｈＳＣ１７．２００抗体と共有する。したがって、ｈＳＣ１７．２００の全長ＬＣおよび全長ＨＣは、それぞれ、配列番号４００および４０１に対応し、ｈＳＣ１７．２００ ｖＬ１の全長ＬＣおよび全長ＨＣは、それぞれ、配列番号４０３および４０１に対応する。全ての選択された抗体の、ＣＤＲグラフティングによるヒト化の後、結果として得られる、軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列について解析して、マウスドナーおよびヒトアクセプターの軽鎖および重鎖可変領域に照らしたそれらの相同性を決定した。下記の表４に示される結果により、ヒト化構築物は、一貫して、マウスドナー配列に照らした相同性より高度な相同性を、ヒトアクセプター配列に照らして呈示したことが示される。より詳細には、マウス重鎖およびマウス軽鎖可変領域は一般に、ヒト化可変領域配列とドナーハイブリドーマのタンパク質配列との相同性（７４％〜８９％）と比較して、ヒト生殖細胞系列遺伝子による最も緊密なマッチ（８４％〜９５％）に対して高い百分率の相同性を示す。
試験により、かつ、実施例９で論じられる通り、ヒト化構築物のそれぞれは、マウス親抗体により示される結合特徴とほぼ同等な、好適な結合特徴を呈示した（データは示さない）。
ヒト化抗体であれ、マウス抗体であれ、可変領域の核酸配列を決定したら、当技術分野で認知された技法を使用して、本発明の抗体を発現させ、単離することができる。この目的のために、選択された重鎖（ヒト化またはマウス）可変領域の合成ＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ１発現ベクターへとクローニングした。同様に、可変領域軽鎖ＤＮＡ断片（ここでもまた、ヒト化またはマウス）を、ヒト軽鎖発現ベクターへとクローニングした。次いで、選択された抗体を、誘導した重鎖および軽鎖核酸構築物の、ＣＨＯ細胞への共トランスフェクションにより発現させた。
より特定すると、１つの適合性の抗体産生方法は、マウス可変領域遺伝子またはヒト化可変領域遺伝子（ＰＣＲを使用して増幅された）の、選択されたヒト免疫グロブリン発現ベクターへの指向性クローニングを含んだ。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲにおいて使用される全てのプライマーは、ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域を含有する発現ベクターへの指向性クローニングを可能とする制限部位を含んだ。略述すると、ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した後、ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ（重鎖用）およびＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ（軽鎖用）のそれぞれで消化した。消化されたＰＣＲ産物を精製してから、発現ベクターへとライゲーションした。ライゲーション反応は、２００ＵのＴ４−ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物、ならびに２５ｎｇの直鎖化ベクターＤＮＡを伴う１０μＬの総容量で実施した。コンピテントのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ菌株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃の熱ショックを介して、３μＬのライゲーション産物で形質転換し、アンピシリンプレートへと播種した（１００μｇ／ｍＬ）。次いで、ＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクターの同じ部位へと挿入する一方、合成のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ ＶＫインサートを、それぞれのｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位へとクローニングした。
選択された抗体を産生する細胞は、２９３ｆｅｃｔｉｎを使用する、ＨＥＫ２９３細胞への、適切なプラスミドのトランスフェクションにより作製した。これに関して、プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ：ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）２９３Ｔ（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ−１１２６８）細胞を、１５０ｍｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内、１０％の熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）中の標準的条件下で培養した。
一過性トランスフェクションのため、細胞を、８０％のコンフルエンシーまで増殖させた。等量のＩｇＨ鎖ベクターＤＮＡおよび対応するＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（１２．５μｇずつ）を、５０μＬのＨＥＫ２９３トランスフェクション試薬と混合した、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに添加した。ミックスを、室温で３０分間にわたりインキュベートし、培養プレートに均等に分配した。上清を、トランスフェクションの３日後に採取し、１０％のＦＢＳを補充した、２０ｍＬの未使用のＤＭＥＭで置き換え、トランスフェクションの６日後に再度採取した。８００×ｇで１０分間にわたる遠心分離により、培養物上清を、細胞破砕物から分離し、４℃で保存した。組換えキメラおよびヒト化抗体を、プロテインＧビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、適切な条件下で保存した。
（実施例９）
ＳＥＺ６モジュレーターの特徴
様々な方法を使用して、上記で示した通りに作製された、選択されたＳＥＺ６モジュレーターの結合特徴免疫化学的特徴を解析した。詳細には、いくつかの抗体モジュレーターを、当技術分野で認知された方法であって、フローサイトメトリーを含む方法により、ＳＥＺ６Ｌタンパク質およびＳＥＺ６Ｌ２タンパク質と共に、ヒトＳＥＺ６抗原、カニクイザルＳＥＺ６抗原、ラットＳＥＺ６抗原、およびマウスＳＥＺ６抗原に照らした、アフィニティー、ビニング、および交差反応性について特徴付けた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）上のバイオレイヤー干渉解析またはＢｉａｃｏｒｅ ２０００を使用する表面プラズモン共鳴を、それぞれ、製造業者の指示書に従い使用して、選択されたモジュレーターのアフィニティーならびに反応速度定数であるｋｏｎおよびｋｏｆｆを測定した。
特徴付けの結果は、図１１Ａに表解形式で示すが、ここでは、選択されたモジュレーターは一般に、ナノモル範囲の比較的大きなアフィニティーを呈示し、多くの場合、１または複数のＳＥＺ６オルソログと交差反応性であることを見ることができる。図１１Ａは、経験的に決定されたビンであって、対象のモジュレーターにより占有されたビンもさらに列挙する。まとめると、これらのデータは、動物モデルにおけるそれらの反応性に基づき、開示されているモジュレーターの様々な結合特性、ならびに医薬開発へのそれらの潜在的適性を実証する。
これに関して、選択されたＳＣ１７抗体モジュレーターが、ヒトＳＥＺ６と免疫特異的に会合し得ることを確認し、同じモジュレーターが、ＳＥＺ６ＬおよびＳＥＺ６Ｌ２に加えて、カニクイザルＳＥＺ６、ラットＳＥＺ６、および／またはマウスＳＥＺ６とも交差反応するのかどうかを決定するために、製造業者の指示書に従い、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩを使用して、フローサイトメトリーを実施した。より特定すると、モジュレーターを、マウスＳＥＺ６およびラットＳＥＺ６への交差反応性について、それぞれ、マウスＳＥＺ６およびラットＳＥＺ６を発現させる、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞系（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＣＬ１３１）およびＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞系（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ−１１６０５）に対するフローサイトメトリーにより調べた。カニクイザルＳＥＺ６への交差反応性について検討するため、カニクイザルＳＥＺ６の細胞外ドメインを提示する酵母（Boderら、１９９７年）を、フローサイトメトリー解析に使用した。
略述すると、ウェル１つ当たりの、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、ＲＩＮ−５ｍＦ細胞、またはカニクイザルＳＥＺ６を提示する酵母細胞１×１０５個ずつを、５μｇ／ｍＬの抗体を伴う５０μＬのＰＢＳ（２％ＦＣＳ）緩衝液と共に、３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、同じ緩衝液で２回にわたり洗浄し、次いで、ＰＢＳ緩衝液中で１：２００に希釈された、試料１例当たり５０μＬずつの、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。１５分間にわたりインキュベートした後で、細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２回にわたり洗浄し、Ｎｅｕｒｏ２ａおよびＲｉｎ−ｍ５Ｆについてのフローサイトメトリー解析のために、ＤＡＰＩを伴う同じ緩衝液中に再懸濁させるか、またはｃＳＥＺ６を伴う酵母細胞についてのフローサイトメトリー解析のために、ＤＡＰＩを伴わない緩衝液中に再懸濁させた。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞系もしくはＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞系またはカニクイザルＳＥＺ６を提示する酵母に結合した抗体は、それぞれ、マウスＳＥＺ６、ラットＳＥＺ６、またはカニクイザルＳＥＺ６に対して交差反応性であると考えられた。図１１Ａは、交差反応性の結果を示す。６つの抗体が、ヒトＳＥＺ６およびマウスＳＥＺ６（ＳＣ１７．６（ＳＣ１７．１６の２連）、ＳＣ１７．７、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２６、およびＳＣ１７．４２）に対して交差反応性であり；６つの抗体が、ヒトおよびラットＳＥＺ６（ＳＣ１７．６、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２６、ＳＣ１７．２８、ＳＣ１７．３４、およびＳＣ１７．４２）に対して交差反応性であり；６つの抗体が、ヒトおよびカニクイザルＳＥＺ６（ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．２６、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３６、およびＳＣ１７．４５）に対して交差反応性であった。ＳＣ１７．６は、ＳＣ１７．１６の２連配列であり、同じ結合特徴を呈示することに留意されたい。
上記の交差反応性データを、ラットＳＥＺ６について検証し、選択されたエフェクターのアフィニティーならびに反応速度定数であるｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定するために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）上のバイオレイヤー干渉解析またはＢｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の表面プラズモン共鳴を実行した。アフィニティーは、実施例５で作製された、ヒト組換えＳＥＺ６−Ｈｉｓおよびラット組換えＳＥＺ６−Ｈｉｓの両方について決定した。図１１Ａで見られる通り、いくつかの抗体について調べ、ラットＳＥＺ６と交差反応させた。選択されたモジュレーターは、ラットＳＥＺ６およびヒトＳＥＺ６の両方に対して、ナノモル範囲の比較的大きなアフィニティーを呈示した。
ファミリーメンバーのタンパク質である、ＳＥＺ６ＬおよびＳＥＺ６Ｌ２への交差反応性を決定するため、ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用した。プレートを、０．２μｇ／ｍＬのＰＢＳ中のＳＥＺ６、ＳＥＺ６Ｌ、またはＳＥＺ６Ｌ２タンパク質で終夜コーティングした。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで洗浄した後で、ウェルを、ウェル１つ当たり１００μＬずつの、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ＰＢＳＡ：ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ）で、室温で１時間にわたりブロッキングした。次いで、抗体を、１００μＬのＰＢＳＡ中１μｇ／ｍＬで、室温で１時間にわたり添加した。ＰＢＳＴによる洗浄後、ウェル１つ当たり１００μＬずつの、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、室温で１時間にわたり、ＰＢＳＡ中で１：２，０００に希釈した。プレートを洗浄し、室温で１５分間にわたり、ウェル１つ当たり１００μＬずつのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；３４０２８）を添加した。発色後、等容量の２ＭのＨ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させ、分光光度計により、ＯＤ４５０で解析した。図１１Ａは、１つの抗体が、ＳＥＺ６Ｌ（ＳＣ１７．７）と交差反応性であり、５つの抗体が、ＳＥＺ６Ｌ２（ＳＣ１７．６、ＳＣ１７．７、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．２６およびＳＣ１７．２８）と交差反応性であることを示す。上記で論じた通り、このようなパンＳＥＺ６抗体は、本明細書の教示と適合性であり、開示されている方法と共に使用することができる。
ＣＤＲグラフティング工程により、それらの結合特徴が、感知可能な程度に変化したかどうかを決定するために、実施例８による以下のヒト化構築物：ｈＳＣ１７．１６、ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．２８、ｈＳＣ１７．３４、およびｈＳＣ１７．４６の結合特徴について解析した。ヒト化構築物（ＣＤＲグラフト）を、マウス親（またはドナー）重鎖および軽鎖可変ドメインと、ヒト定常領域とを含む「従来型」キメラ抗体であって、ヒト化構築物で使用されたキメラ抗体と実質的に同等な「従来型」キメラ抗体と比較した。これらの構築物に対して、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、表面プラズモン共鳴を実行して、ヒト化過程によりもたらされる、任意の微妙な速度定数の変化を同定した。全ての場合において、ヒト化抗体の結合アフィニティーは、対応するマウス抗体と同等であるかまたはこれより良好であった（データは示さない）。
図１１Ａに示される、様々なＳＥＺ６モジュレーターについて、抗体のビニングを決定した。製造業者の指示書に従い、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＲＥＤを使用して、同じビンまたは異なるビンに結合する競合抗体を同定した。略述すると、基準抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップへと捕捉し、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロッキングし、ベースラインを収集した。次いで、単量体の組換えヒトＳＥＺ６（実施例５で記載した）を、特異的抗体（Ａｂ１）で捕捉し、チップを、対照としての同じ抗体（Ａｂ１）を伴うウェル内、または異なる被験抗体（Ａｂ２）を伴うウェル内に浸漬した。新規の抗体とのさらなる結合が観察されたた、Ａｂ１とＡｂ２とは、異なるビン内にあると決定した。対照のＡｂ１との結合レベルの比較により決定される、さらなる結合が生じなければ、Ａｂ２を、同じビン内にあると決定した。当技術分野で公知の通り、この工程は、９６ウェルプレート内の固有のビンを表す一連の抗体全てを使用して、固有の抗体の大規模なライブラリーをスクリーニングするように拡張することもできる。この場合、このビニング工程は、スクリーニングされた抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上の少なくとも７つの異なるビンに結合することを示した。ビンＡ〜Ｆは、固有のビンであり、これらのビンのそれぞれの中に含有される抗体は、ＳＥＺ６タンパク質への結合について、互いと競合する（規定された他のビンに由来する抗体とは競合しない）。ビンＵは、ビンＡ〜Ｆ内の抗体とは競合しないが、互いとの結合については競合し得る抗体を含有する。図１１Ｂは、ある特定のエピトープに結合する抗体間の相関と、これらの抗体群が、ＳＥＺ６を過剰発現させるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を死滅させる能力とを示す（すぐ下の実施例１０でより詳細に記載される）。
（実施例１０）
ＳＥＺ６モジュレーターについてのエピトープマッピング
開示されているＳＥＺ６抗体モジュレーターが会合または結合するエピトープを特徴付けるために、Cochranら（参照により本明細書に組み込まれる、J Immunol Methods.、２８７巻（１〜２号）：１４７〜１５８頁（２００４年））により記載されているプロトコールの変法を使用して、ドメインレベルのエピトープマッピングを実施した。ＳＥＺ６の個別のドメインを、酵母の表面上で発現させ、各ＳＥＺ６抗体による結合を、フローサイトメトリーにより決定した。
以下の構築物：ＳＥＺ６細胞外ドメイン（アミノ酸１〜９０４）；Ｓｕｓｈｉドメイン１（アミノ酸３３６〜３９５）、ＣＵＢドメイン１（アミノ酸２９７〜５０８）、Ｓｕｓｈｉドメイン２（アミノ酸５１１〜５７２）、ＣＵＢドメイン２（アミノ酸５７４〜６８５）、Ｓｕｓｈｉドメイン３（アミノ酸６９０〜７４８）、Ｓｕｓｈｉドメイン４（アミノ酸７５０〜８１３）、Ｓｕｓｈｉドメイン５（アミノ酸８１７〜８７８）、およびＳｕｓｈｉドメイン５＋Ｃ末端（アミノ酸８１７〜９０４）を発現させるために、酵母ディスプレイプラスミド構築物を創出した。加えて、Ｎ末端ドメイン（アミノ酸１〜３３５）を、Ｎ１（アミノ酸１〜７０）、Ｎ２（アミノ酸７１〜１６９）、およびＮ３（アミノ酸１６９〜３３５）と称する３つの断片へと分け、それらのそれぞれを、酵母ディスプレイプラスミドにクローニングした。アミノ酸の番号付けは、１９アミノ酸のリーダーペプチドを含まない。ドメイン情報については、一般に、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースエントリーであるＱ５３ＥＬ９を参照されたい。これらのプラスミドを、酵母に形質転換し、次いで、これらを、Cochranらにおいて記載されている通りに、増殖させ、誘導した。全てのアミノ酸の番号付けは、１９アミノ酸のリーダー配列を伴わない、成熟ＳＥＺ６タンパク質に基づくことに留意されたい。
特定の構築物への結合について調べるため、所望の構築物を発現させる誘導酵母細胞２００，０００個を、ＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中で２回にわたり洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのニワトリ抗ｃ−ｍｙｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、７日間にわたり培養されたハイブリドーマに由来する、５０ｎＭの精製抗体または非精製上清の１：２希釈液とを伴う５０μＬのＰＢＳＡ中でインキュベートした。細胞を、氷上で９０分間にわたりインキュベートし、次いで、ＰＢＳＡ中で２回にわたり洗浄した。次いで、細胞を、適切な二次抗体を伴う５０μＬのＰＢＳＡ中でインキュベートした：マウス抗体のためには、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ニワトリ、およびＡｌｅｘａ６４７コンジュゲートヤギ抗マウス（いずれも、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１μｇ／ｍＬずつで添加し、ヒト化抗体またはキメラ抗体のためには、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗ニワトリ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＲ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１μｇ／ｍＬずつで添加した。氷上で２０分間にわたるインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳＡで２回にわたり洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上で解析した。
全てのモジュレーターは、酵母細胞上で発現させた単一のドメインに固有に結合した。場合によって、抗体クローンは、Ｓｕｓｈｉドメイン５＋Ｃ末端を発現させる酵母には特異的に結合したが、Ｓｕｓｈｉドメイン５を発現させる酵母には特異的に結合しなかった。これらの抗体クローンは、Ｃ末端領域（アミノ酸８７９〜９０４）だけに結合すると結論付けられた。
エピトープは、コンフォメーショナル（すなわち、不連続）エピトープまたは直鎖状エピトープと分類された。抗原を変性させるために、ＳＥＺ６ ＥＣＤ構築物を提示する酵母を、８０℃で３０分間にわたり加熱処理し、氷冷ＰＢＳＡ中で２回にわたり洗浄し、次いで、上記に記載したのと同じ染色プロトコールおよびフローサイトメトリー解析にかけた。変性酵母および天然酵母の両方に結合した抗体を、直鎖状エピトープに結合する抗体として分類する一方、天然酵母には結合するが、変性酵母には結合しない抗体は、コンフォメーション的に特異的な抗体として分類した。
被験抗体のドメインレベルのエピトープマッピングデータについての概要を、下記の表５に提示する。直鎖状エピトープに結合する抗体に下線を付し、ＳＥＺ６ファミリーメンバーであるＳＥＺ６ＬおよびＳＥＺ６Ｌ２に結合する抗体は、それぞれ、アステリスクおよび／またはダガーを付して表記する。
本実施例１０で記載されている、ドメインマッピングされたＳＥＺ６抗体モジュレーターを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞殺滅アッセイを実施したところ、興味深く、かつ、驚くべき傾向が観察された。本質的に下記の実施例１４で記載される通りに実施される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅アッセイにより、特定の抗体が内部移行しＨＥＫ−２９３細胞を死滅させる能力を決定した。図１１Ｂは、被験抗体の有効性を、それらが結合するドメインと対比するプロットである。Ｎ１、Ｎ３、Ｓｕｓｈｉドメイン１、およびＳｕｓｈｉドメイン４を含むある特定のドメインに結合する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける殺滅の増強を呈示した。Ｓｕｓｈｉドメイン４と会合する抗体は、細胞への内部移行および殺滅において極めて有効であり、ＩＧＨＶ１−３４マウス生殖細胞系列フレームワーク領域およびＩＫＶ４−５９マウス生殖細胞系列フレームワーク領域との強い相関を呈示する。
選択された抗体に対する微細エピトープマッピングをさらに実施して、それらが結合する特異的アミノ酸を決定した。直鎖状エピトープに結合する抗体は、Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｅ８１１０Ｓ）を使用してマッピングした。エピトープマッピングのために選択された抗体は、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液、ｐＨ８ ３ｍＬ中に５０μｇ／ｍＬで、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ試験管（Ｎｕｎｃ）にコーティングし、終夜インキュベートした。試験管は、重炭酸溶液中に３％のＢＳＡ溶液でブロッキングした。次いで、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中のインプットファージ１０１１個を結合させた後、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で連続１０回にわたり洗浄して、結合しないファージを洗い落とした。残りのファージは、０．２Ｍのグリシン１ｍＬにより、静かに撹拌しながら、室温で１０分間にわたり溶出させた後、１Ｍのトリス−ＨＣｌ ｐＨ９ １５０μＬで中和した。溶出させたファージは、ここでもまた、インプットファージ１０１１個で、洗浄ステップでは、選択の厳密性を増大させるように、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を使用して、増幅およびパニングした。Ｑｉａｐｒｅｐ Ｍ１３ Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、第２ラウンドに由来する、溶出させたファージの２４のプラークから、ＤＮＡを単離し、シークエンシングした。クローンファージの結合は、マッピングされた抗体または対照抗体を、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ブロッキングし、各クローンファージに曝露する、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して確認した。ファージの結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、および１−Ｓｔｅｐ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した。特異的に結合するファージに由来するファージペプチド配列は、結合エピトープを決定するのに、抗原のＥＣＤペプチド配列に対するＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、アラインさせた。
不連続エピトープに結合する、選択された抗体は、Chaoら（２００７年）により記載されている技法を使用してマッピングした。ＳＥＺ６ ＥＣＤ突然変異体のライブラリーは、ヌクレオチド類似体である、８−オキソ−２’デオキシグアノシン−５’−三リン酸、および２’−デオキシ−ｐ−ヌクレオシド−５’三リン酸（いずれも、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ製）を、クローン１つ当たりのアミノ酸突然変異を１つとする標的の突然変異誘発率のために使用する、エラープローンＰＣＲにより作製した。これらは、酵母ディスプレイフォーマットに形質転換した。ドメインレベルのマッピングのための上記で記載した技法を使用して、ライブラリーを、５０ｎＭで、ｃ−ｍｙｃと抗体との結合について染色した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を使用して、野生型のＳＥＺ６ ＥＣＤと比較して結合の喪失を呈示するクローンを分取した。これらのクローンを再増殖させ、標的抗体への結合の喪失についてのさらなるＦＡＣＳ分取ラウンドにかけた。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、個々のＥＣＤクローンを単離し、シークエンシングした。必要な場合は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位指向突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、突然変異を、単一突然変異体ＥＣＤクローンとして再フォーマットした。
次に、個々のＥＣＤクローンをスクリーニングして、結合の喪失が、エピトープ内の突然変異に起因するのか、ミスフォールディングを引き起こす突然変異に起因するのかを決定した。システイン、プロリン、および終止コドンに関与する突然変異は、ミスフォールディング突然変異の可能性が高いために自動的に棄却した。次いで、残りのＥＣＤクローンを、競合しない、コンフォメーション的に特異的な抗体への結合についてスクリーニングした。野生型のＳＥＺ６ ＥＣＤと同等な結合を保持するＥＣＤクローンが、適正にフォールディングすると結論付けられるのに対し、競合しない、コンフォメーション的に特異的な抗体への結合を喪失したＥＣＤクローンは、ミスフォールディング突然変異を含有すると結論付けられた。後者の群内のＥＣＤクローン内の突然変異は、エピトープ内の突然変異であると結論付けられた。また、ＭＯＤＥＬＬＥＲを使用して、単離ドメインについての相同性モデルも構築して、エピトープ内の残基であると同定された残基が、１）フォールディング相同性モデルにおいて、互いと近傍して局在化し、２）包埋された残基であれば、ミスフォールディングを引き起こす可能性が高く、結合エピトープの一部である可能性が低いので、側鎖が、溶媒へと曝露されており、包埋されていないことを確認した。それらのエピトープを伴う抗体の概要については、表６で一覧する。エピトープの構造に最も著明に寄与することが見出された残基に下線を付す。
ＮＲは、エピトープが不連続であるので、配列番号が割り当てられなかったことを指し示す。
ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．２００およびＳＣ１７．４６についての微細エピトープマッピングの目的で、点突然変異を、ドメインレベルのエピトープマッピングにより、結合ドメインであることが決定された単離ドメインである、Ｓｕｓｈｉドメイン１上に構築した。場合によって、スクリーニングのための候補突然変異は、酵母により提示されるライブラリーとは独立に決定した。例えば、ＳＣ１７．４６の場合、スクリーニングのための候補突然変異は、ライブラリーベースのスクリーニングでは同定されず、むしろ、それらは、ドメインマッピング、カニクイザルＳＥＺ６ ＥＣＤおよびラットＳＥＺ６ ＥＣＤへの交差反応性の欠如、ならびに異なる種についての配列アラインメントであって、種の主要な配列の差違を同定する配列アラインメントに基づいて同定された。ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１２１、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１９１、および１７．２００の場合、候補残基は、アラニン走査解析とドメイン結合解析との組合せを使用して同定した。全ての場合において、候補突然変異は、その候補突然変異がライブラリーベースの手法により同定される他の抗体と同じ解析にかけた。
本発明は、ＳＥＺ６タンパク質（例えば、配列番号３または４のＳＥＺ６タンパク質を含む）上のエピトープに結合する、抗ＳＥＺ６抗体および抗体薬物コンジュゲートであって、エピトープが、（ｉ）残基Ｑ１２、Ｐ１４、Ｉ１６、Ｅ１７、Ｅ１８；（ｉｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、Ｑ７８２；（ｉｉｉ）残基Ｌ７３、Ｐ７４、Ｆ７５、Ｑ７６、Ｐ７７、Ｄ７８、Ｐ７９；（ｉｖ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、Ｈ３７５；（ｖ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、Ｈ３７５、Ｓ３５９；（ｖｉ）残基Ｒ３４２、Ｋ３８９；（ｖｉｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、Ｑ７８２；または（ｖｉｉｉ）残基Ｒ８０７、Ｋ８１０からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む、抗ＳＥＺ６抗体および抗体薬物コンジュゲートを対象とする。一実施形態において、本発明は、ＳＥＺ６タンパク質（例えば、配列番号３または４のＳＥＺ６タンパク質を含む）上のエピトープに結合する、抗ＳＥＺ６抗体および抗体薬物コンジュゲートであって、エピトープが、（ｉ）残基Ｑ１２、Ｐ１４、Ｉ１６、Ｅ１７、Ｅ１８；（ｉｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、Ｑ７８２；（ｉｉｉ）残基Ｌ７３、Ｐ７４、Ｆ７５、Ｑ７６、Ｐ７７、Ｄ７８、Ｐ７９；（ｉｖ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、Ｈ３７５；（ｖ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、Ｈ３７５、Ｓ３５９；（ｖｉ）残基Ｒ３４２、Ｋ３８９；（ｖｉｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、Ｑ７８２；または（ｖｉｉｉ）残基Ｒ８０７、Ｋ８１０からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む、抗ＳＥＺ６抗体および抗体薬物コンジュゲートを対象とする。別の実施形態において、本発明は、以下の抗体：ＳＣ１７．４、ＳＣ１７．１７、ＳＣ１７．２４、ＳＣ１７．３４、ＳＣ１７．３６、ＳＣ１７．４６、ＳＣ１７．１０２、ＳＣ１７．１２１、ＳＣ１７．１４０、ＳＣ１７．１５６、ＳＣ１７．１６６、ＳＣ１７．１９１およびＳＣ１７．２００のうちのいずれか１つと同じＳＥＺ６タンパク質（例えば、配列番号３または４のＳＥＺ６タンパク質を含む）上のエピトープに結合する、抗ＳＥＺ６抗体または抗体薬物コンジュゲートを対象とする。
（実施例１１）
フローサイトメトリーによるＳＥＺ６の表面発現の検出
フローサイトメトリーを使用して、実施例５で記載した通りに構築された、操作ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系の表面上のヒトＳＥＺ６タンパク質の存在を検出するために作製された抗ＳＥＺ６抗体の特異性を評価した。アイソタイプ染色対照および蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照を援用して、染色特異性を確認した。略述すると、ヒトＳＥＺ６およびＧＦＰを形質導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ（実施例５を参照されたい）または採取されたＮＴＸ腫瘍試料は、当技術分野で認知された酵素消化技法（例えば、本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照されたい）を使用して、懸濁液へと解離および分散させ、抗ＳＥＺ６抗体と共に３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ（２％ＦＣＳ）中で２回にわたり洗浄し、次いで、ＰＢＳ緩衝液中で１：２００に希釈された、試料１例当たり５０μｌずつの、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。インキュベーションの１５分後に、細胞を、ＰＢＳで２回にわたり洗浄し、ＤＡＰＩを伴うＰＢＳ中に再懸濁させ、既に論じられた通り、フローサイトメトリーで解析した。
ＳＣ１７．３３について、図１２Ａに示される代表的なデータにより実証される通り、ＳＥＺ６モジュレーターは、ＨＥＫ−２９３Ｔ−ＨｕＳＥＺ６細胞を強く認識した。これらのデータは、細胞表面で発現させたヒトＳＥＺ６を特異的に認識するモジュレーターが産生されたことを実証する。
選択されたＮＴＸ腫瘍の表面上のヒトＳＥＺ６タンパク質の発現は、複数の例示的なＳＣ１７抗体を使用するフローサイトメトリーにより評価した。ＬＵ３７内、ＬＵ８６内、およびＫＤＹ６６内のＳＥＺ６の発現を、ＳＣ１７．６（ＳＣ１７．１６の２連）抗体を使用して調べる一方、ＬＵ５０内、ＬＵ１００内、およびＬＵ７３内のＳＥＺ６の発現は、それぞれ、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．４２抗体およびＳＣ１７．２８抗体を使用して調べた。結果は、図１３Ａに示す。ＮＴＸ腫瘍を採取し、解離し、市販の抗マウスＣＤ４５抗体、抗マウスＨ−２Ｋｄ抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体、および上記で記載した、マウス抗ヒトＳＥＺ６抗体で共染色した。図１３Ａに示されるデータは、上記で言及された抗マウス抗体については陽性染色しないが、抗ヒトＥｐＣＡＭについては陽性染色する細胞を使用して作成した。上記で記載したＨＥＫ−２９３Ｔ染色実験と同様、アイソタイプ染色対照および蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照を援用して、染色特異性を確認した。図１３Ａに見られる通り、抗ＳＥＺ６染色は、肺ＮＴＸ腫瘍であるＬＵ３７、ＬＵ５０、およびＬＵ８６、ならびに腎臓ＮＴＸ腫瘍であるＫＤＹ６６について、蛍光プロファイルの右方へのシフト、および平均蛍光強度（ＭＦＩ）値の変化により指し示される通り、ヒトＮＴＸ腫瘍細胞の全てにおいて、ＦＭＯより高度であった。これらのデータは、ＳＥＺ６タンパク質が、様々なＮＴＸ腫瘍の表面上で発現し、したがって、抗ＳＥＺ６抗体を使用するモジュレーションに適することを示唆する。
（実施例１２）
様々な腫瘍内のＳＥＺ６タンパク質の発現
様々な腫瘍と関連する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡ転写物レベルの上昇を踏まえ、ＮＴＸ腫瘍内のＳＥＺ６タンパク質の発現の対応する増大を実証する作業を企図した。ＳＥＺ６タンパク質発現は、（ｉ）ＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ＬＬＣ）を使用する電気化学発光ＳＥＺ６サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ；および（ｉｉ）免疫組織化学染色により検出した。
ＮＴＸ腫瘍をマウスから摘出し、ドライアイス／エタノール上で瞬時凍結させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を、融解させた腫瘍片へと添加し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、腫瘍を細かく砕いた。遠心分離（２０，０００ｇ、２０分間、４℃）により溶解物を分離し、各溶解物中の総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸を使用して定量化した。タンパク質溶解物は、アッセイするまで、−８０℃で保存した。正常組織溶解物は、市販品供給元から購入した。
溶解物試料に由来するＳＥＺ６タンパク質濃度は、精製組換えＳＥＺ６タンパク質（実施例５）を使用して作成されたタンパク質濃度検量線から、値を内挿することにより決定した。ＳＥＺ６タンパク質検量線およびタンパク質定量化アッセイは、以下の通りに実行した。
ＭＳＤスタンダードプレートを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのＳＣ１７．１７抗体３０μＬにより、４℃で終夜コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴ中で洗浄し、１５０μＬのＭＳＤ ３％ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ溶液中で１時間にわたりブロッキングした。プレートを、ＰＢＳＴ中で再度洗浄した。また、ＭＳＤ １％ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ中で１０倍希釈された溶解物２５μＬ、または１０％のＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを含有するＭＳＤ １％ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ中で系列希釈された組換えＳＥＺ６標準物質２５μＬも、ウェルへと添加し、２時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴ中で洗浄した。次いで、ＳＣ１７．３６抗体を、ＭＳＤ ｓｕｌｆｏタグにコンジュゲートさせ、２５μＬのタグ付けされたＳＣ１７．３６を、洗浄されたプレートへと、ＭＳＤ １％ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ中に０．５μｇ／ｍＬで添加した。界面活性剤を伴うＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを、水中で１倍に希釈し、１５０μＬを、各ウェルへと添加した。プレートを、組み込まれたソフトウェア解析プログラムを使用して、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００上で読み取って、検量線からの内挿を介して、ＮＴＸ試料中のＳＥＺ６濃度を導いた。次いで、値を、総タンパク質濃度で除して、総溶解物タンパク質１ミリグラム当たりのＳＥＺ６ナノグラムをもたらした。結果として得られる濃度を、各スポットが、単一のＮＴＸ腫瘍細胞系に由来するＳＥＺ６タンパク質濃度を表す、図１２Ｂに示す。各スポットは、単一のＮＴＸ細胞系に由来するが、大半の場合、データ点をもたらすには、同じＮＴＸ細胞系に由来する複数の生物学的試料について調べ、値を平均した。
図１２Ｂは、正常組織溶解物と比較して、選択された腎臓腫瘍試料、卵巣腫瘍試料、およびＬＣＮＥＣ腫瘍試料が、中程度のＳＥＺ６タンパク質発現を呈示したのに対し、ＳＣＬＣ腫瘍では、最高度のＳＥＺ６タンパク質発現が見られたことを示す。全ての正常組織溶解物は、正常ヒト脳溶解物および正常ヒト眼溶解物を例外として、ＳＥＺ６タンパク質発現について陰性であった。
ＳＥＺ６は、ある特定のＰＤＸ腫瘍の表面上で発現することを確認し、腫瘍アーキテクチャー内のＳＥＺ６タンパク質の位置を決定するために、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を、ＰＤＸ腫瘍に対して実施した。ＩＨＣは、ＳＥＺ６に対するマウスモノクローナル一次抗体（ＳＣ１７．１４０）、マウス特異的ビオチンコンジュゲート二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼとカップリングさせたアビジン／ビオチン複合体、およびＤＡＢ検出（Nakene PK、１９６８年、１６巻：５５７〜６０頁）を含む間接的検出法を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片上で実施した。実施例５で記載した通りに調製された、ナイーブＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットと比較してＳＥＺ６を過剰発現させるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットのＦＦＰＥ切片上の特異的染色を示すことにより、ＳＣ１７．１４０は、ＩＨＣに適切であることを検証および確認した。特異性は、さらに、ヒトＳＥＺ６を過剰発現させるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞上、およびＩＨＣによりＳＥＺ６を発現させることが示された（データは示さない）ＮＴＸ腫瘍上の、５モル過剰量の精製組換えＳＥＺ６との競合シグナルにより確認した。
ＳＥＺ６の発現は、ＳＣＬＣ ＮＴＸ腫瘍内のＩＨＣにより測定したが、ここで、被験ＳＣＬＣ ＮＴＸ腫瘍１４例中１３例が、ＳＥＺ６を発現させた（図１６Ａ）。さらなるＩＨＣ解析は、ＳＣＬＣ患者（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．）から摘出された１７４例のヒト腫瘍のコア抜き切片を使用して作製された５つの組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上で実施した。図１６Ｂは、これらの５つのＴＭＡ内に含まれる、１７４例の原発性患者ＳＣＬＣ腫瘍内のＩＨＣにより測定されたＳＥＺ６の発現を示す。１７４例中１２２例のＳＣＬＣ試料、３例中２例のＳＣＬＣ／腺癌試料、および１例中１例のＳＣＬＣ／紡錘細胞試料は、ＳＥＺ６を発現させることが示された。これに対し、正常な被験肺組織試料は、ＳＥＺ６を発現させなかった（図１６Ｂ）。図１６Ａおよび１６Ｂに示されるＩＨＣの結果は、細胞表面染色の強度を定量化し、各強度レベル（染色なしを０とし、強い染色を３とする）で染色された腫瘍細胞の百分率を反映する、最終的な「Ｈスコア」を提示する、自動式画像解析ソフトウェアパッケージ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。Ｈスコアは、以下：（０における％）×０＋（１＋における％）×１＋（２＋における％）×２＋（３＋における％）×３の通りに計算した。したがって、Ｈスコアは、０〜３００の範囲にわたる連続変数をもたらす。
ＩＨＣはまた、髄様甲状腺がんを伴う患者に由来するＦＦＰＥ切片に対しても実施した。被験患者試料の全ては、ＳＥＺ６を発現させることが示された（図１６Ｃ）。甲状腺がん試料を、（−）は発現なしとし、（＋、＋＋、または＋＋＋）は染色強度の増大を表示するように、手作業で評定した。図１６Ｃにはまた、ＳＥＺ６を発現させると推定される、ＦＦＰＥ切片内の腫瘍細胞の百分率も示す。
ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、すぐ上で記載した、ＩＨＣにより決定されるＳＥＺ６発現の結果を検証するのに使用した。ＩＳＨは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．０ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Wangら、２０１２年、ＰＭＩＤ：２２１６６５４４）を使用して、手作業で実施した。使用されるＲＮＡｓｃｏｐｅプローブは、ＳＥＺ６のＥＣＤに対して特異的であった。各試料は、全ての細胞の小胞体内で位置特定される、シクロスポリン結合性タンパク質である、ペプチジルプロピルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）に対して特異的なＲＮＡｓｃｏｐｅプローブにより、ＲＮＡの完全性について品質管理した。バックグラウンドの染色は、ジアミノピメリン酸（ｄａｐＢ）ＲＮＡに対して特異的なプローブを使用して決定した。略述すると、図１６Ｂで使用されたＳＣＬＣ腫瘍マイクロアレイのうちの３つに由来する５μｍのＦＦＰＥ組織切片を、熱およびプロテアーゼで前処理してから、ＳＥＺ６ ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションにかけた。次いで、前増幅用オリゴヌクレオチド、増幅用オリゴヌクレオチド、ＨＲＰ標識オリゴヌクレオチドを、逐次ハイブリダイズさせた後、発色性沈殿物を、３，３’−ジアミノベンジジンにより発色させた。特異的なＲＮＡ染色シグナルは、褐色の点状ドットとして同定された。試料は、ギルによるヘマトキシリンで対比染色した。ＦＦＰＥ切片は、光学顕微鏡下で解析し、染色については、０〜４のスケールにより、手作業で評定し、ここで０＝染色なし、または細胞１０個当たり１ドット未満；１＝細胞１個当たり１〜３ドット；２＝細胞１個当たり４〜１０ドット；３＝細胞１個当たり１０ドットを超え、かつ、クラスター内で見出されるドットの１０％未満であった。加えて、例えば、試料中の細胞のうちの５〜３０％のスコアが１であり、細胞のうちの７０％超のスコアが０であれば、０．５のスコアを与えた。被験腫瘍試料３２例中５例（１６％）は、ＳＥＺ６を発現させず、３２例中１７例（５３％）のスコアは１であり、３２例中８例（２５％）のスコアは２であり、３２例中２例（６％）のスコアは３であった。組織マイクロアレイ内の原発性患者ＳＣＬＣ試料全体のうちの８４％が、ある程度のレベルでＳＥＺ６ ＲＮＡを発現させた。これは、ＩＨＣから得られた結果と大方で符合する。
実施例４で示した、ＳＥＺ６の発現についてのｍＲＮＡ転写データ、および実施例１１で示した、細胞表面タンパク質ＳＥＺ６の発現と組み合わされたデータにより、ＳＥＺ６決定基は、治療的介入のための魅力的な標的をもたらすという提案が強く後押しされる。
（実施例１３）
腫瘍開始細胞集団の富化
腫瘍細胞は、２つの種類の細胞亜集団：非腫瘍形成性細胞（ＮＴＧ）および腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）へと大きく分けることができる。ＴＩＣは、免疫不全マウスへと植え込まれると、腫瘍を形成する能力を有する。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、ＴＩＣのサブセットであり、多重系列分化能を維持しながら、無際限に自己複製することが可能である。ＳＥＺ６の発現が、腫瘍形成性の増強と相関し得るのかどうかを決定するために、それらの全てについて下記で記載される、全トランスクリプトームシークエンシング、フローサイトメトリー、および腫瘍形成性アッセイを実施した。
様々な腫瘍試料内のＳＥＺ６の発現についての全トランスクリプトーム解析は、実施例１で記載した通りに実施した。ＣＳＣは、様々な腫瘍内の幹細胞のマーカーであることが示されている、ＣＤ３２４の発現（ＰＣＴ出願第２０１２／０３１２８０号を参照されたい）に基づいて同定した。図６Ｂにおける結果は、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡ発現が、ＣＳＣ内で、２つのＳＣＬＣ ＮＴＸ腫瘍細胞系（ＬＵ８６、およびＬＵ９５）から単離されたＮＴＧ細胞と比較して上昇したことを示す。
フローサイトメトリーは、本質的に実施例１１で記載した通りに、ＮＴＸ肺腫瘍に由来する細胞に対して実施した。ＬＵ８６細胞、ＬＵ１１７細胞、およびＬＵ６４細胞は、ＣＳＣのマーカー集団であるＣＤ３２４（ＰＣＴ出願第２０１２／０３１２８０号を参照されたい）と、抗ＳＥＺ６抗体、ＳＣ１７．１０、ＳＣ１７．２８、またはＳＣ１７．４２のそれぞれとで共染色して、ＳＥＺ６が、これらの集団上で差次的に発現するのかどうかを決定した。図１３Ｂに指し示される通り、ＣＤ３２４およびＳＥＺ６の両方について陽性のＬＵ８６細胞、ＬＵ１１７細胞、およびＬＵ６４細胞の染色（黒実線）は、ＳＥＺ６単独について陽性の細胞染色（黒点線）と比較して、さらに右方へとシフトすることから、ＳＥＺ６は、ＮＴＧ細胞集団と比較して、ＣＳＣ上でより高度に発現することが指し示される。バルク集団のアイソタイプ対照は、グレーで塗りつぶされたヒストグラムとして示す（ＭＯＰＣ＝ＩｇＧ１）。
細胞表面ＳＥＺ６の発現が、腫瘍を発生させる能力の増強と相関し得るのかどうかを決定するために、腫瘍形成性研究を実行した。ＮＴＸ腫瘍試料は、当技術分野で認知された酵素消化技法（例えば、本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照されたい）を使用して、懸濁液へと解離および分散させた。これらのＮＴＸ細胞系から解離された細胞調製物を、マウスＣＤ４５、Ｈ２ｋＤ、ヒトＣＤ３２４、およびヒトＳＥＺ６、クローンＳＣ１７．４２を特異的に認識する、蛍光コンジュゲート抗体で染色した。いずれもマウスＣＤ４５またはＨ２ｋＤによる染色の非存在（マウス細胞の細胞調製物を枯渇させる）に基づき同定された、ヒト細胞の２つのサブセットは、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して単離した。一方のサブセットは、ＣＤ３２４およびＳＥＺ６の共発現に基づいて単離する一方、他方のサブセットは、ＣＤ３２４＋ＳＥＺ６−表現型に基づいて単離した。その後、顕著に異なるマーカーで富化された亜集団を、皮下注射により、マウス１匹当たりの細胞約５０個の用量で、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの乳房脂肪体へと移植した。
図１４Ａおよび１４Ｂは、患者から得られたＮＳＣＬＣ腫瘍から誘導された、代表的なＮＴＸ細胞系を使用して実行された、このような実験の結果を例示する。図１４Ａは、親腫瘍および分取された推定腫瘍形成性細胞のｍＣＤ４５−Ｈ２ｋＤ−サブセットの分布を示す散布図（ＣＤ３２４およびＳＥＺ６を使用してゲーティングされた）である。図１４Ｂは、分取された細胞亜集団の、免疫不全マウスへの植込みから生じる腫瘍体積の測定値をグラフにより示す。括弧内の値は、植え込まれたマウス１匹当たりの、発生した腫瘍の数を指し示す。
図１４によるデータは、腫瘍形成性が、高レベルのＣＤ３２４と組み合わせてＳＥＺ６を発現させる細胞の亜集団と一貫して関連したことを示して有意義である。逆に、これらの同じデータは、ＳＥＺ６を発現させないか、ＳＥＺ６の発現が低レベルの腫瘍細胞は、ＳＥＺ６の発現が高レベルであるかまたは陽性である対応物より腫瘍形成性がはるかに小さいことを実証する。作成されたデータに基づくと、驚くべきことに、ＣＤ３２４＋ＳＥＺ６＋表現型を発現させる腫瘍細胞の亜集団は一般に、腫瘍形成性能の大半を含有することが見出されたことから、ＳＥＺ６は、腫瘍形成性細胞のモジュレーションのための有効な治療標的をもたらし得ることが示唆される。
（実施例１４）
ＳＥＺ６モジュレーターは、細胞傷害剤の、ＳＥＺ６発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への送達を容易とする
本発明のＳＥＺ６モジュレーターは、細胞傷害剤の、生細胞への送達を媒介し得ることを実証するため、サポリン毒素に結合させた、選択されたＳＥＺ６抗体モジュレーターを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞殺滅アッセイを実施した。サポリンは、細胞質内のリボソームを活性化させることにより、細胞を死滅させる。したがって、以下のアッセイを使用すると、細胞死は、ＳＥＺ６抗体が、細胞傷害剤を内部移行し、細胞傷害剤を、標的細胞の細胞質へと送達することの指標である。
抗マウスＩｇＧ Ｆａｂ断片へと共有結合的に連結されたサポリン（「Ｆａｂ−サポリン」）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ；型番ＩＴ−４８）を、非標識のＳＥＺ６抗体と組み合わせ、ヒトＳＥＺ６を発現させるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（実施例５を参照されたい）と共にインキュベートした。結果として得られるサポリン複合体の内部移行し細胞を死滅させる能力を、７２時間後に、細胞生存率を測定することにより測定した。
詳細には、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中に、ウェル１つ当たりの細胞５００個を、抗体および毒素を添加する１日前に、９６ウェル組織培養処理プレートへと播種した。ヒトＳＥＺ６を発現させるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、２ｎＭのＦａｂ−サポリンと併せた、１００、５０、または１０ｐＭの濃度の、対照（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、またはＩｇＧ２ｂ）または精製マウスＳＥＺ６モジュレーターで処置した。細胞は、３日間にわたり培養し、その後、製造業者の指示書に従い、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞数を計数した。生発光単位（ＲＬＵ）を使用して、サポリンＦａｂ断片を伴う細胞を含有する培養物を、１００％基準値として設定し、他の全てのカウントは、これに照らして計算した（標準化されたＲＬＵまたは「生細胞％」と称する）。図１５Ａは、被験ＳＥＺ６モジュレーターの多くが、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の殺滅を、濃度依存的に媒介したことを示す。図１５Ａの最初の３行における結果により示される通り、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ１）は、細胞カウントに影響を及ぼさなかった（ＮＤ＝決定なし）。
このアッセイにより、内部移行は、さらなる架橋または二量体化の必要なしに、ＳＥＺ６特異的抗体が細胞表面に結合すると生じ得ることが実証される。
（実施例１５）
ＳＥＺ６モジュレーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける肺腫瘍細胞内の細胞傷害作用を媒介する
実施例１４の結果を裏付け、ＳＥＺ６モジュレーターが、ヒト腫瘍細胞による毒素の内部移行およびこれらに対する細胞殺滅を媒介し得るのかどうかを決定する（操作された細胞と対比して）ため、マウス系統を枯渇させたＮＴＸ細胞を播種し、その後、抗ＳＥＺ６抗体およびＦａｂ−サポリンへと曝露した。
ＮＴＸ腫瘍を、単一の細胞懸濁液へと解離し、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上、当技術分野で公知の、増殖因子を補充された無血清培地中に播種した。細胞を、３７℃／５％ＣＯ２／５％Ｏ２で１日間にわたり培養した後で、それらを、実施例１４で記載した通りに、対照（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、またはＩｇＧ２ｂ）またはマウスＳＥＺ６モジュレーターおよびＦａｂ−サポリンで処置した。７日後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して、モジュレーターにより媒介されるサポリンの細胞傷害作用を、残存生細胞数を定量化することにより評価した。
図１５Ｂに見られる通り、ＮＳＣＬＣ腫瘍であるＬＵ３７およびＳＣＬＣ腫瘍であるＬＵ８０を、ＳＣ１７．６（ＳＣ１７．１６の２連配列）ＳＥＺ６モジュレーターおよびＳＣ１７．３３ ＳＥＺ６モジュレーターへと曝露したところ、腫瘍細胞数の低減は、明らかであった。同様に、ＬＵ１００、ＳＣＬＣ腫瘍を、５０および５００ｐＭの、４つのＳＥＺ６モジュレーターである、ＳＣ１７．６、ＳＣ１７．１９、ＳＣ１７．３３、およびＳＣ１７．３４へと曝露したところ、腫瘍細胞の低減がなされた。これに対し、アイソタイプ対照抗体は、処置後において、生細胞の数に影響を及ぼさなかった。
このデータは、本明細書で記載される例示的な抗体が、細胞表面上のＳＥＺ６抗原に結合することが可能であり、細胞傷害性ペイロードの送達を容易とする結果として、細胞死をもたらし得ることを実証するだけでなく、上記でデータはまた、複数の抗ＳＥＺ６抗体が、様々なＮＴＸ腫瘍細胞の殺滅を媒介することも実証した。
（実施例１６）
ＳＥＺ６抗体−薬物コンジュゲートの調製
実施例１４および１５における、サポリンを伴うｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅アッセイに基づき、かつ、本発明の多用途性をさらに実証するために、上記に記載した、Ｍ−［Ｌ−Ｄ］構造を有する抗ＳＥＺ６抗体薬物コンジュゲートを調製した。すなわち、共有結合的に連結された細胞傷害剤を使用して、抗ＳＥＺ６抗体薬物コンジュゲート（ＳＥＺ６−ＡＤＣ）を調製した。より詳細には、本明細書またはすぐ下の参考文献で記載されるリンカーを含むＳＥＺ６−ＡＤＣを調製し、開示されているモジュレーターへと共有結合的に接合させたピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体を選択した（例えば、それらのそれぞれが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７および２０１２／００７８０２８およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ ６，２１４，３４５を参照されたい）。
ＰＢＤ薬物−リンカーの組合せは、引用された参考文献の観点で、当技術分野で認知された技法を使用して、合成および精製した。様々なＰＢＤ二量体およびリンカーを援用して、選択された薬物−リンカーの組合せを製作し、各リンカー単位は、遊離スルフヒドリルを伴う末端マレイミド部分を含んだ。これらのリンカーを使用して、ｍＡｂの、トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）による部分的な還元の後、還元されたＣｙｓ残基の、マレイミド−リンカーペイロードとの反応を介して、コンジュゲーションを調製した。
より特定すると、選択されたＳＥＺ６抗体モジュレーターを、２５ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ７．５および５ｍＭのＥＤＴＡによる緩衝液中、ｍＡｂ １モル当たり１．３モルのＴＣＥＰにより、３７℃で２時間にわたり還元した。反応を、１５℃へと冷却し、ＤＭＳＯ中のリンカーペイロードを、ｍＡｂ １モル当たり２．７モルの比で添加した後、追加量のＤＭＳＯを、６％（ｖ／ｖ）最終濃度まで添加した。反応は、１時間にわたり進行させた。反応しなかった薬物−リンカーは、過剰量のＮ−アセチルシステインを添加することによりキャッピングした。次いで、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣシステム（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＳＥＺ６−ＡＤＣ（またはＳＣ１７−ＡＤＣ）を、イオン交換カラムで精製して、凝集した高分子量抗体、共溶媒、および小分子を除去した。次いで、溶出させたＡＤＣを、接線流濾過（ＴＦＦ）により、製剤化緩衝液へと緩衝液交換した後、濃度調整および洗浄剤の付加を施した。最終ＡＤＣを、タンパク質濃度（ＵＶの測定を介する）、凝集（ＳＥＣ）、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを介する薬物対抗体比（ＤＡＲ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ＨＰＬＣを介する非コンジュゲート抗体の存在、ＲＰ ＨＰＬＣを介する非タンパク質性材料、およびＳＥＺ６発現細胞系を使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害作用について解析した。
上述の手順または実質的に類似する方法論を使用して、様々なＳＥＺ６モジュレーターおよびＰＢＤ二量体を含む、いくつかのＡＤＣ（すなわち、Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ）を作製し、様々なｉｎ ｖｉｖｏモデルおよびｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて調べた。これらの実施例および本開示の目的では、このようなＡＤＣを一般に、ＳＥＺ６−ＡＤＣまたはＳＣ１７−ＡＤＣと称する。個別のＡＤＣは、抗体（例えば、ＳＣ１７．１７）および特異的リンカー−細胞傷害剤の記号表示であるＡＤＣ１、ＡＤＣ２などに従い名指されるであろう。したがって、本発明と適合性の例示的なモジュレーターは、ＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１またはＳＣ１７．２４−ＡＤＣ２を含むことが可能であり、この場合、ＡＤＣ１およびＡＤＣ２は、個々のＰＢＤ二量体の細胞傷害剤（および任意選択で、リンカー）を表す。
初期のベンチマークとして、ｈＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害作用は、ＳＥＺ６を過剰発現させるＨＥＫ２９３細胞へと曝露された場合のＩＣ５０である１１ｎＭで測定された（データは示さない）。
（実施例１７）
コンジュゲートＳＥＺ６モジュレーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける肺腫瘍細胞内および卵巣腫瘍細胞内の細胞傷害作用を媒介する
上記の実施例１６で作製されたＡＤＣについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの原発性ヒト腫瘍細胞による毒素の内部移行およびこれらに対する細胞殺滅を媒介することが可能であるのかどうかを決定するように調べた。
Ｆａｂ−サポリンを添加しないことを除き、実施例１５で記載したのと同じ方法を使用して、マウス系統枯渇ＮＴＸ腫瘍細胞を、抗ＳＥＺ６ ＡＤＣまたはマウスアイソタイプ対照（ｍｓＩｇＧ１）へと曝露した。ＳＣＬＣ腫瘍であるＬＵ６４および卵巣ＮＥＴ腫瘍であるＯＶ２６を、抗ＳＥＺ６ ＡＤＣ（ＳＣ１７．２４−ＡＤＣ２、ＳＣ１７．２８−ＡＤＣ２、およびＳＣ１７．３４−ＡＤＣ２）で処置したところ、対照のｍｓＩｇＧ１と比較した、生存細胞パーセントの低減の増大が観察された（図１７Ａ）。ｍｓＩｇＧ１は、高濃度では、細胞に対して細胞傷害性であり得るが、３つの被験抗ＳＥＺ６ ＡＤＣの全ては、より強力であったことから、ＰＢＤ細胞毒素への全般的応答ではなく、ＳＥＺ６への免疫特異的応答が指し示される。
（実施例１８）
コンジュゲートＳＥＺ６モジュレーターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の増殖を抑制する
上記の実施例１６で作製されたＡＤＣについて、免疫不全マウスにおけるヒトＮＴＸ腫瘍を退縮させ、その増殖を抑制するそれらの能力を実証するように調べた。
当技術分野で認知された技法を使用して、患者由来ＮＴＸ腫瘍を、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスの脇腹で皮下増殖させた。腫瘍体積およびマウスの体重は、毎週２回モニタリングした。腫瘍体積が、１５０〜２５０ｍｍ３に到達したら、マウスを、処置群へと無作為に割り当て、ＳＣ１７−ＡＤＣ１または対照のＭｓＩｇＧ１−ＡＤＣ１を腹腔内注射した。マウスには、７日間で１ｍｇ／ｋｇずつ３回の注射（図１７Ｂにおける垂直方向の直線による指し示される）を施した。処置の後、腫瘍が８００ｍｍ３を超えるか、またはマウスが発病するまで、腫瘍体積およびマウスの体重をモニタリングした。
図１７Ｂは、マウス抗ＳＥＺ６ ＡＤＣが、マウスにおける、ＳＣＬＣ腫瘍（例えば、ＬＵ８６）およびＬＣＮＥＣ腫瘍（例えば、ＬＵ５０）のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を阻害し得ることを示す。ＬＵ８６の場合、５つの被験ＡＤＣ（ＳＣ１７．３−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．２４−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．２６−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．２８−ＡＤＣ１、およびＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１）により、長期間持続する永続的な寛解がもたらされ、場合によって、処置後１２０日間を超えた。特に、ＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１による処置が、この用量での研究の持続期間にわたり腫瘍の増殖を阻害する一方、ＳＣ１７．２４−ＡＤＣ１は、有意な腫瘍増殖の阻害をもたらし、進行までの期間は、５０日間を超えた。同様に、５つの例示的なＡＤＣ（ＳＣ１７．３−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．２４−ＡＤＣ１、ＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１、およびＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１）によるＬＵ５０の処置は、３５日間まで持続する、ＳＣ１７．４６による腫瘍増殖の抑制を結果としてもたらした。さらに、ＳＣ１７−ＡＤＣ１で処置されたマウスは、免疫不全の腫瘍保有ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで典型的に見られる作用以外の、健康に有害な作用を呈示しなかった。これらの結果は、開示されているＡＤＣを使用して、腫瘍の増殖を有効に抑制することができ、ＳＣ１７モジュレーターの結合の固有性は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性に影響を及ぼし得ることを示唆する。
より直接的には、様々なコンジュゲートモジュレーターが、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の増殖を、長期間にわたり、劇的に遅延させるかまたは抑制する能力により、ＳＥＺ６の、増殖性障害の処置のための治療標的としての使用の妥当性がさらに確認される。
（実施例１９）
ヒト化コンジュゲートＳＥＺ６モジュレーターは、腫瘍の増殖を抑制する
マウス抗ＳＥＺ６ ＡＤＣモジュレーターにより得られた印象的な結果を踏まえ、例示的なヒト化抗ＳＥＺ６ ＡＤＣモジュレーターの、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける甲状腺がん細胞系の処置、ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳＣＬＣ腫瘍の処置における有効性を実証するように、さらなる実験を実施した。
甲状腺がん細胞系を購入し（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１８０３）、９６ウェルプレートの、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＦ−１２Ｋ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ；型番３０−２００４）中に、３７℃、ウェル１つ当たりの細胞５００個で播種した。実施例１６で示した通りに産生された、５ｎＭのｈＳＣ１７．２００−ＡＤＣ１、または対照ＩｇＧ１−ＡＤＣ１を、細胞へと添加した。８日後に、製造業者の指示書に従い、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞数を計数した。生発光単位（ＲＬＵ）を使用して、有効性を測定したが、この場合、処置されていない細胞のＲＬＵを、１００％基準値として設定し、他の全てのＲＬＵ値は、基準値と比べて（標準化されたＲＬＵと称する）計算した。図１８Ａの結果は、抗ＳＥＺ６抗体薬物コンジュゲートであるｈＳＣ１７．２００−ＡＤＣ１により、甲状腺がん細胞の増殖が、ヒトＩｇＧ１−ＡＤＣ１対照を超えて著明に抑制されることを示す。
また、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト化抗ＳＥＺ６ ＡＤＣが、髄様甲状腺腫瘍体積を低減する能力についても調べた。甲状腺細胞系（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１８０３）を、９６ウェルプレートの、１０％のＦＢＳを補充したＦ−１２Ｋ Ｍｅｄｉｕｍ中に、３７℃、ウェル１つ当たりの細胞５００個で培養した。細胞は、採取し、５匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に植え込んだ。マウスにおける腫瘍が、平均２００ｍｍ３に到達したら、腹腔内注射を介して、２ｍｇ／ｋｇ ｈＳＣ１７．２００−ＡＤＣ１の単回投与を施した。有効性は、毎週１回の腫瘍体積測定によりモニタリングし、平均腫瘍体積および標準誤差の平均（ＳＥＭ）は、時間（日間）と対比してプロットした。ｈＳＣ１７．２００−ＡＤＣ１を投与した後、腫瘍体積の有意な低減を観察した（図１８Ｂ）。
また、ヒト化抗ＳＥＺ６ ＡＤＣが、ＳＣＬＣ腫瘍体積を低減する能力についても調べた。抗ＳＥＺ６ ＡＤＣ（ｈＳＣ１７．１７、ｈＳＣ１７．２４、ｈＳＣ１７．３４、およびｈＳＣ１７．４６）およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照ＡＤＣ（ｈｕＩｇＧ１）を、様々な患者由来ＮＴＸ腫瘍を保有する免疫不全マウスに投与した。マウスには、７日間で１ｍｇ／ｋｇずつ３回の注射（図１８Ｃおよび図１８Ｄにおける垂直方向の直線により指し示される）を施した。処置の後、腫瘍が８００ｍｍ３を超えるか、またはマウスが発病するまで、腫瘍体積およびマウスの体重をモニタリングした。これらの実験の結果を、図１８Ｃおよび１８Ｄに提示する。腫瘍塊の完全で永続性の消失は、４つのＳＣＬＣ腫瘍におけるヒト化抗ＳＥＺ６ ＡＤＣの投与により達成した。図１８Ｃは、ｈＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１、およびｈＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１による、ＬＵ８０腫瘍の縮減；ならびにｈＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１、ｈＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１、およびｈＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１による、ＬＵ６４腫瘍の消失を示す。図１８Ｄは、ｈＳＣ１７．１７−ＡＤＣ１およびｈＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１による、ＬＵ１１７腫瘍の縮減；ならびにｈＳＣ１７．３４−ＡＤＣ１およびｈＳＣ１７．４６−ＡＤＣ１による、ＬＵ１１１腫瘍の縮減を示す。
これらの結果は、様々なヒト化ＳＥＺ６モジュレーターが、異なる腫瘍の増殖を有効に遅延させる、驚くべき適用可能性を実証する。
（実施例２０）
化学療法抵抗性のＰＤＸ細胞系の作製
化学療法抵抗性のＳＣＬＣ細胞系を作製して、ファーストラインの化学療法による処置を既に経た腫瘍内のＳＥＺ６の発現について調べた。化学療法抵抗性の細胞系は、当技術分野で認知された技法を使用して作製され、維持された、ＰＤＸ腫瘍バンクから得られた、ＳＣＬＣ患者由来異種移植（ＰＤＸ）腫瘍細胞系から開発した。ＰＤＸ腫瘍バンクは、元は、様々な悪性の固形腫瘍に罹患する多数のがん患者から得られた異質性の腫瘍細胞の、複数世代にわたる継代により、免疫不全マウスにおいて繁殖させた、実質的な数の個別の腫瘍細胞系を含む。被験試料の継代数は、ｐ０〜ｐ＃［表示中、ｐ０は、患者の腫瘍から直接得られた非継代試料を示し、ｐ＃は、試験の前に腫瘍をマウスに継代移植した回数を示す］で指し示す。早期継代のＰＤＸ腫瘍は、イリノテカン（すなわち、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））およびシスプラチン／エトポシドレジメンなどの治療剤に応答することから、腫瘍の増殖、現行の治療に対する抵抗性、および腫瘍の再発を駆動する根底的な機構に対する、臨床的に関与性の洞察がもたらされる。
シスプラチンおよびオキサリプラチンを含むその誘導体は、ＳＣＬＣのための標準的化学療法である。シスプラチンは、組織培養培地中では安定でないという懸念（Schuldesら、１９９７年、ＰＭＩＤ：９１２８９８８）のために、オキサリプラチン抵抗性ＳＣＬＣ ＰＤＸ細胞系を開発した。オキサリプラチン抵抗性ＳＣＬＣ細胞系は、ヒト細胞を、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにより、皮下で２回にわたり継代されたＳＣＬＣ ＰＤＸ細胞系である、ＬＵ１２４ｐ２から単離することにより作製した。ＬＵ１２４ｐ２腫瘍は、８００〜２，０００ｍｍ３に到達した後で、マウスから摘出し、当技術分野で認知された酵素消化技法（例えば、ＵＳ２００７／０２９２４１４を参照されたい）を使用して、単一細胞懸濁液へと解離し、マウス細胞を枯渇させた。次いで、細胞を洗浄し、５％の酸素および血清非含有培地中で培養し、１μＭのオキサリプラチンで速やかに処置した。オキサリプラチンへの曝露の７日後に、細胞を洗浄し、毎週２回ずつの未使用の培地への更新を伴う、標準的な血清非含有培地中で、２週間にわたる回収を可能とした。回収期間の後、細胞を洗浄し、１μＭのオキサリプラチンを伴う新規のフラスコへと、さらに７日間にわたり再播種した後、最終的な洗浄および２週間にわたる回収期間を施した。結果として得られる細胞系を、ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ２と称した。Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、単一細胞懸濁液を作製した。細胞のうちの一部を、マウスへと注射して、ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ２細胞系を繁殖させる一方、他の細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、オキサリプラチンに対する感受性について調べた。
ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ２のオキサリプラチン感受性は、以下の通りに調べた。ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ２細胞を、９６ウェルプレートへと播種し、当技術分野で標準的な血清非含有培地中で滴定されたオキサリプラチンで処置した。培養の７日後に、製造業者の指示書に従い、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞を採取し、用量反応曲線を得た。ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ２は、親細胞系（ＬＵ１２４ｐ２）（ＩＣ５０＝０．０３６μＭ）と比較して、高用量のオキサリプラチンに対して抵抗性（ＩＣ５０＝２〜２．５μＭ）であった（図１９）。抵抗性が安定であるのかどうかを決定するため、ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ２細胞を、ここでもまた、免疫不全マウスにより継代して、ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３と呼ばれる細胞系をもたらした。ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３では、抵抗性が維持されたことから、選択圧の非存在下でもなお、すなわち、オキサリプラチンが非存在の場合でもなお、細胞系の抵抗性は維持されたことが示される。
（実施例２１）
マイクロアレイを使用する、化学療法抵抗性の腫瘍細胞内のＳＥＺ６の発現
マイクロアレイによる発現プロファイリングを使用して、ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３上で、化学療法感受性親細胞系と比較して上方調節される、潜在的な細胞表面標的を同定した。アッセイのための調製では、実施例１で記載した通りに、ＬＵ１２４ｐ３ ＰＤＸ細胞系およびＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３ ＰＤＸ細胞系に由来する腫瘍を摘出し、単一細胞懸濁液へと解離し、マウス細胞を枯渇させた。細胞を、製造業者の指示書に従い、ＲＬＴｐｌｕｓ ＲＮＡ溶解緩衝液中で溶解させ、−８０℃で保存し、ｍＲＮＡの抽出のために融解させた。融解させたら、ＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ｍＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコールおよび推奨される測定器の設定を使用する、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および／またはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、定量化した。結果として得られる全ｍＲＮＡ調製物を、遺伝子シークエンシングおよび遺伝子発現解析についての適性について評価した。
ヒトゲノム内の２７，９５８の遺伝子および７，４１９のｌｎｃＲＮＡに対してデザインされた、５０，５９９の生物学的プローブを含有する、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ ＧＥヒト８ｘ６０ ｖ２マイクロアレイプラットフォームを使用して、１〜２μｇの全腫瘍全ｍＲＮＡ試料について解析した。業務上の標準的慣行を使用して、強度値を標準化および変換して、各試料についての遺伝子発現を定量化した。ＳＥＺ６ ｍＲＮＡ（ＡｇｉｌｅｎｔプローブＩＤ：Ａ＿２３＿Ｐ４９８４９）は、ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３内で、マッチさせた親細胞系であるＬＵ１２４ｐ３と比較して上方調節され、また、早期のマウス継代に由来する親細胞系であるＬＵ１２４ｐ１と比較しても上方調節されると同定された（図２０）。
（実施例２２）
化学療法抵抗性の腫瘍細胞系内のＳＥＺ６タンパク質発現
実施例１で記載した通りに作製されたオキサリプラチン抵抗性細胞系と関連する、ＳＥＺ６ ｍＲＮＡ転写物レベルの上昇を踏まえ、ＳＥＺ６タンパク質発現はまた、この細胞系内でも上昇するのかどうかについて調べる作業を企図した。ＳＥＺ６タンパク質の発現を検出および定量化するため、ＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ）を使用して、電気化学発光ＳＥＺ６サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを開発した。
ＬＵ１２４ｐ３細胞およびＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３細胞を、ドライアイス／エタノール上で瞬時凍結させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、融解させた細胞へと添加し、遠心分離（２０，０００ｇ、２０分間、４℃）により溶解物を分離し、各溶解物中の総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸を使用して定量化した。タンパク質溶解物は、アッセイするまで−８０℃で保存した。溶解物試料に由来するＳＥＺ６タンパク質濃度は、精製組換えＳＥＺ６タンパク質を使用して作成されたタンパク質濃度検量線から値を内挿することにより決定した。ＳＥＺ６タンパク質検量線およびタンパク質定量化アッセイは、以下の通りに実行した。
ＭＳＤスタンダードプレートを、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に１μｇ／ｍＬの抗ＳＥＺ６抗体であるＳＣ１７．１７ ３０μＬと共に、４℃で終夜コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴ中で洗浄し、１５０μＬのＭＳＤ ３％ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ溶液中で、振盪しながら、１時間にわたりブロッキングした。プレートを、ＰＢＳＴ中で再度洗浄した。また、１０％のＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを含有するＭＳＤ １％ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ中で１０倍希釈された溶解物（または系列希釈された組換えＳＥＺ６標準物質）２５μＬも、ウェルへと添加し、振盪しながら、２時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴ中で再度洗浄した。抗ＳＥＺ６抗体であるＳＣ１７．３６抗体をｓｕｌｆｏタグ付けし、２５μＬのタグ付けされたＳＣ１７．３６抗体を、洗浄されたプレートへと、ＭＳＤ １％ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ中に０．５μｇ／ｍＬで、振盪しながら、室温で１時間にわたり添加した。プレートを、ＰＢＳＴ中で洗浄した。界面活性剤を伴うＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを、水中で１倍に希釈し、１５０μＬを、各ウェルへと添加した。プレートは、組み込まれたソフトウェア解析プログラムを使用して、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００上で読み取って、検量線からの内挿を介して、ＰＤＸ試料中のＳＥＺ６濃度を導いた。次いで、値を、総タンパク質濃度で除して、総溶解物タンパク質１ミリグラム当たりのＳＥＺ６ナノグラムをもたらした。結果として得られる濃度を、図２１に示すが、ここで、棒グラフは、ＬＵ１２４ｐ３細胞系およびＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３細胞系に由来するＳＥＺ６タンパク質濃度を表す。ＬＵ１２４細胞溶解物中のＳＥＺ６の発現が、総タンパク質１ｍｇ当たり５．８ｎｇであるのに対し、ＬＵ１２４オキサリプラチン抵抗性細胞系内のＳＥＺ６の発現は、総タンパク質１ｍｇ当たり１４．６ｎｇであった。
図２１は、オキサリプラチン抵抗性ＬＵ１２４ＯＸＡＨＩｐ３細胞系が、親ＬＵ１２４ｐ３細胞と比較して、高度なＳＥＺ６タンパク質発現を呈示したことを示す。上記の実施例で示したＳＥＺ６の発現についてのｍＲＮＡ転写データと組み合わされた、これらのデータにより、ＳＥＺ６タンパク質発現は、化学療法抵抗性を呈示する腫瘍内で上方調節されるという提案が強く後押しされる。
当業者であれば、本発明は、その精神または中心的属性から逸脱せずに、他の具体的な形態においても具体化し得ることをさらに認められよう。本発明の前出の記載は、その例示的な実施形態だけを開示するものであり、他の変更も、本発明の範囲内にあると想定されることを理解されたい。したがって、本発明は、本明細書で詳細に記載された特定の実施形態に限定されるものではない。そうではなく、本発明の範囲および内容を示すものとしては、添付の特許請求の範囲への言及がなされるべきである。

Claims (19)

  1. ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合する単離抗体であって、該エピトープが、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む、単離抗体。
  2. 治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、該抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む、抗体薬物コンジュゲート。
  3. 前記治療用部分が、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される、請求項２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  4. がんを患う対象を処置する方法であって、治療有効量の、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを投与するステップを含み、該抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む、方法。
  5. 前記治療用部分が、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記対象が、白金ベースの薬剤で既に処置されている、請求項４に記載の方法。
  7. 白金抵抗性小細胞肺がんを患う対象を処置する方法であって、治療有効量の、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを投与するステップを含み、該抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む、方法。
  8. 前記治療用部分が、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 髄様甲状腺がんを患う患者を処置する方法であって、治療有効量の、治療用部分に直接的または間接的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを投与するステップを含み、該抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに特異的に結合する、方法。
  10. 前記エピトープが、（ｉ）残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２；（ｉｉ）残基Ｒ３４２およびＫ３８９；ならびに（ｉｉｉ）残基Ｔ３５２、Ｓ３５３、およびＨ３７５からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記治療用部分が、アウリスタチン、アマニチン、およびピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
  12. 白金抵抗性小細胞肺がんを診断する方法であって、
    ａ．対象に由来する白金抵抗性小細胞肺がんの腫瘍試料を用意するステップと；
    ｂ．該腫瘍試料を、レポーターで標識された抗ＳＥＺ６抗体に曝露するステップであって、該抗ＳＥＺ６抗体が、該腫瘍試料と会合する、ステップと；
    ｃ．該腫瘍試料と会合した該レポーターを検出するステップと
    を含む方法。
  13. 前記レポーターが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検出される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記レポーターが、免疫組織化学検査を使用して検出される、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記抗ＳＥＺ６抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに結合し、前記エピトープが、アミノ酸残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 髄様甲状腺がんを診断する方法であって、
    ａ．対象に由来する髄様甲状腺腫瘍試料を用意するステップと；
    ｂ．該腫瘍試料を、レポーターで標識された抗ＳＥＺ６抗体に曝露するステップであって、該抗ＳＥＺ６抗体が、該腫瘍試料と会合する、ステップと；
    ｃ．該腫瘍試料と会合した該レポーターを検出するステップと
    を含む方法。
  17. 前記レポーターが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検出される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記レポーターが、免疫組織化学検査を使用して検出される、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記抗ＳＥＺ６抗体が、ＳＥＺ６タンパク質上のエピトープに結合し、前記エピトープが、アミノ酸残基Ｒ７６２、Ｌ７６４、Ｑ７７７、Ｉ７７９、Ｄ７８１、およびＱ７８２を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
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