CN1343774A - 一种癫痫相关蛋白编码序列,其编码的多肽、制法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种新的癫痫相关蛋白SEZ－6。本发明提供了hSEZ－6的cDNA编码序列该序列编码的多肽、利用重组技术生产所述hSEZ－6的方法及其应用。

Description

一种癫痫相关蛋白编码序列，其编码的多肽、制法及用途

本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。更具体地说，本发明涉及癫痫相关基因(seizure-related gene，SEZ)家族的一个新成员。

癫痫是一种常见的发作性神志异常疾病，平均每200人中就有一人是该病患者(BrainRes(2000)857(1-2)：286-290)，因病人在发作时有类似羊的叫吼声，故俗称″羊癫疯″。该病发作时，病人突然倒地，不省人事，口吐涎沫，两目上翻，四肢抽搐，或口中啼叫有声，昏迷时间不等，醒后恢复正常；也有一过性的精神惚恍，两目钝呆，或肢体抽搐等症状，这种发作往往无定时。

由于癫痫发作的不定时性、长期性、多发性及其带来的学习记忆障碍，一旦确诊后病人就需要长期治疗和随访，因此诊断癫痫是一个很严肃的问题。目前该病主要是通过临床观察并记录脑电图进行诊断，但是该方法有其局限性，如：对一般病人而言，由于头皮电极所记录到的癫痫样电活动可能不来自电极下，而为远处病灶所致，所以脑电图很难及时精确显示癫痫样电活动。对该症的治疗通常采用化学药剂，尤以神经递质类药物较佳，然而神经递质药物的毒副作用很大；此外该病也可采用手术治疗，由于该病患者在脑部通常存在病灶，所以手术治疗有一定的的危险性。

病理分析表明，病变中央部位的神经细胞坏死、缺失，而邻近部位呈现神经元群结构紊乱、胶质增生并可有供血障碍。同时，病灶中谷氨酸脱羧酶减少，GABA合成增加，此外，发作时先有细胞外鈣离子的减少，继以细胞外钾离子的增加，前者破坏细胞膜的稳定性，后者阻挠细胞内鈣离子的外流，延长去极化的时程。

由于常规医疗手段的缺点及病理机制的进一步揭晓，越来越多的人致力于从遗传学角度，即通过研究与神经细胞电位相关的基因来诊断和治疗癫痫，SEZ基因家族就是近年来发现的与癫痫发生有密切关系的一类基因。1995年，Shimizu Nishicawa K等人从小鼠的大脑皮层细胞制成的cDNA文库中克隆并表达了小鼠的SEZ-6基因(Bioche Biophys Res Commun(1995)28(2)：201-210)；1995年，Kzjiwara K等人发现小鼠SEZ-17(PTZ-17)的RNA注射到Xenopus oocyte中会引起细胞内的鈣离子凝集(Brain Res(1995)671：170-174)；1996年，KzjiwaraK等人在对小鼠大脑皮进行差异杂交时分离得到了SEZ-12基因(Bioche BiophysRes Commun(1996)222：144-148)；Nishioca M在2000年分离克隆到人的SEZ-6L基因(Oncogene(2000)19(54)：6551-6560)。虽然已知的SEZ家族成员已有很多，但是到目前为止，尚没有人报导过本发明的人SEZ-6编码序列或其多肽。

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码SEZ基因家族的一个新成员，被命名为hSEZ-6(human seizure-related gene 6)。

本发明的另一个目的是提供一种新的SEZ基因家族成员基因产物，该蛋白被命名为hSEZ-6。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人SEZ蛋白的方法。

本发明还涉及这种人SEZ蛋白的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人SEZ-6蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列有至少80％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列杂交。

在本发明中，“分离”或“纯化”的DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的SEZ-6蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列或其活性片段、其活性衍生物。

在本发明中，术语“SEZ-6蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有SEZ-6蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO：1的简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO：1序列的编码框180-3167位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人SEZ-6相同功能的蛋白的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与hSEZ-6DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗hSEZ-6多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有SEZ-6蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有SEZ-6蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成SEZ-6蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成SEZ-6蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达SEZ-6蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有SEZ-6蛋白活性的多肽。

本发明还提供hSEZ-6蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然hSEZ-6多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括hSEZ-6多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内hSEZ-6的表达。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有hSEZ-6多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码hSEZ-6的核酸分子。

本发明还包括检测hSEZ-6核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hSEZ-6多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对hSEZ-6 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于hSEZ-6基因产物或片段。较佳地，指那些能与hSEZ-6基因产物或片段结合但不识别或结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制hSEZ-6蛋白的分子，也包括那些并不影响hSEZ-6蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的hSEZ-6基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的hSEZ-6基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达hSEZ-6或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断hSEZ-6功能的抗体以及不影响hSEZ-6功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用hSEZ-6基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与hSEZ-6基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人SEZ-6核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

得到了全长的cDNA分子后就可以与特定载体连接，制成探针或作为微矩阵的底物以获得一系列相关核苷酸序列；得到了蛋白后，可制成抗体、受体、拮抗剂、药物或试剂盒诊断、治疗相关疾病。

在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为4227个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO：1，其中开放读框位于180-3167位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用四对寡核苷酸：A1：5′-AAC CAG CAC CATGCG CCC GGT AG-3′，A2：5′-TGA GAT GCC TGG CGC CCT TCA GC-3′；B1：5′-CAT TACCAA GCC TAT CTC CTG AG-3′，B2：5′-CTC AAA GAAGTG GAT GAC GAA GC-3′；C1：5′-CCA TGG CTG ATG TCA CCA TTC AG-3′，C2：5′-AGC AAG GAG CCT TGC TGC TGGAG-3′；D1：5′-AGT CTA GGG AAG TCA ACT CAG AC-3′，D2：5′-CAT GCC AAA TTC CTGGGT CCT TG-3′；作为引物进行PCR，其中A1、B1、C1、D1均为正向引物，A2、B2、C2、D2均为反向引物。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、74℃1分钟和适当的延伸温度1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。四次反应的适当延伸温度分别为76℃、68℃、70℃、68℃。把四次反应得到的片段进行拼接，最终得到长度为4227bp的目的片段(见SEQ IDNO 1)。

用hSEZ-6的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白结构及功能域同源检索，结果发现它与SEZ家族成员具有较高的同源性，如它与小鼠SEZ-6(gi|10946586，见SEQ ID NO 3)基因在蛋白水平上显示了89％的同一性(见附表)，与人SEZ-6L(gi|6941614)基因在蛋白水平上显示了46％的同一性。此外，同绝大多数SEZ家族成员一样，本发明的SEZ-6具有在脑中特异表达，存在两处跨膜结构的特征等等；因而认为本发明的hSEZ-6蛋白是该家族的新成员，具有同该家族成员相似的功能，也可用来诊断和治疗癫痫及某些由神经元膜电位异常引起的疾病，如震颤麻痹、舞蹈症、扭转痉挛等等。本发明的人SEZ-6蛋白可以与合适的药学上可接受的载体联用，这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂；本发明的人SEZ-6蛋白还可以被制成针剂、片剂形式或与其他治疗剂一起使用制成试剂盒。最后，本发明的人SEZ-6可作为靶蛋白，筛选对诊断和治疗上述疾病有重要价值的小分子药物。

此外，由于本发明的人SEZ-6具有源自人的天然氨基酸序列，因此，预计在施用于人时必然比来源于其他物种的同族蛋白具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

附表为本发明的hSEZ-6与小鼠SEZ-6的氨基酸序列同源比较。其中相同的氨基酸用“|”标出。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1

hSEZ-6的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用四对寡核苷酸：A1：5′-AAC CAGCAC CAT GCG CCC GGT AG-3′，A2：5′-TGA GAT GCC TGG CGC CCT TCA GC-3′；B1：5′-CAT TAC CAA GCC TAT CTC CTG AG-3′，B2：5′-CTC AAA GAA GTG GAT GAC GAAGC-3′；C1：5′-CCA TGG CTG ATG TCA CCA TTC AG-3′，C2：5′-AGC AAG GAG CCT TGCTGC TGG AG-3′；D1：5′-AGT CTA GGG AAG TCA ACT CAG AC-3′，D2：5′-CAT GCC AAATTC CTG GGT CCT TG-3′；作为引物进行PCR，其中A1、B1、C1、D1均为正向引物，A2、B2、C2、D2均为反向引物。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、74℃1分钟和适当的延伸温度1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。四次反应的适当延伸温度分别为76℃、68℃、70℃、68℃。把四次反应得到的片段进行拼接，得到长度为3885bp的目的片段。

2.PCR产物的测序

将如上四次反应获得的PCR扩增产物分别与pGEM-T^载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(PHarmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCEL^TM DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共4227bp，详细序列见SEQ ID NO：1，其中开放读框位于180-3167位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出hSEZ-6的氨基酸序列，共996个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO：2。

实施例2

同源比较

用hSEZ-6的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它与SEZ家族成员都具有一定的同源性。如它与小鼠SEZ-6(gi|10946586，见SEQ ID NO3)基因在蛋白水平上显示了89％的同一性(见表)，与人SEZ-6L(gi|6941614)基因在蛋白水平上显示了46％的同一性。

SEZ家族成员被认为与癫痫发作有关，绝大多数SEZ家族成员都在脑中特异表达或表达量很高，且大多在戊撑四唑诱导后表达量明显增加，许多SEZ基因家族成员还具有跨膜结构。而通过PCGENE软件分析，本发明的人SEZ-6蛋白亦存在跨膜结构，预测有两处：从第2到第23和第922到第953位，并且N端前20个氨基酸具有分泌肽的特征；Northern杂交显示本发明的SEZ-6在脑中特异表达，这进一步证明本发明的hSEZ-6蛋白是该家族的新成员，具有同该家族成员相似的功能，若将其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等制成药物，可用来诊断和治疗癫痫及某类由神经元电位异常引起的疾病，如老年性痴呆、记忆力衰退、震颤麻痹、舞蹈症、扭转痉挛等等。

实施例3

hSEZ-6在大肠杆菌中的表达

编码hSEZ-6的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。

5′寡核苷酸引物序列为

5’-AAGCTTCACCATGCGCCCGGTAGCCCTGC-3’

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的SEZ-6编码序列的19个核苷酸；

3’寡核苷酸引物序列为

5’-GGAGTGCGACTATTCTCTCGTCTCCTGCA-3’

该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点和SEZ-6的编码序列。

限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用SalI和HindIII消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达1acI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明hSEZ-6的cDNA插入片段已正确装入载体。

过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使1acI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的SEZ-6。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱SEZ-6。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白性质。此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：2的序列一致。

实施例4

hSEZ-6在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，将编码hSEZ-6的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5’-AAGCGAATTCA TGCGCCCGGT AGCCCTGC-3’

该引物含有EcoRV限制性限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的SEZ-6编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-GGAGAAGCTTATTCTC TCG TCTCCTGCA-3’

该引物含有HindIII限制性限制性内切酶的酶切位点和SEZ-6的编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用HindIII、EcoRV消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证结果表明SEZ-6的cDNA插入片段已正确装入载体。

质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1MNaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白性质。此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：2的序列一致。

实施例5：

表达谱分析

多种组织Northern(MTNTM)印迹膜(16种组织)购自Clontech公司，以引物A1和A2从人脑cDNA文库(Clontech)中扩增得到的片段为探针，用α-³²P-dATP(DuPont公司)对其进行随机引物标记，条件为37℃1小时，具体操作见MegaprimeDNA标记系统说明书(Amersham)。Northern杂交按用户手册操作。主要步骤如下：(1)配制MTN杂交液(终浓度如下：5XSSPE，10Xdenhardt′s，100μg/mlCTDNA，50％甲酰胺，2％SDS)，68℃预热杂交液，彻底溶解沉淀物。(2)烫膜，倒入少许烧开的0.05％SDS溶液于膜上，震荡、冷却后测信号(3)将尼龙膜放在杂交管中，加入预杂交液，42℃预杂交12小时(4)变性后探针加入杂交管中，42℃杂交24小时(5)洗膜，42℃，用2XSSC，0.05％SDS溶液洗两次，每次20分钟(6)用X光片进行放射自显影。

结果显示hSEZ-6基因在脑中表大量很高，在其它组织中几乎不表达。

实例6：

作为微矩阵的底物

微矩阵(Microarrays)，又称DNA芯片。芯片可通过使用喷墨技术及一系列化学方法如射线、化学、热力学、机械方法等把样品固定在底物上得到，形成的元件有点状、条形等等。一块典型的芯片通常含有一定数量的元件，可通过手工或用适当的仪器设备制备。杂交反应后，洗去未结合的探针，然后用扫描仪来检测发生杂交反应的元件及反应的程度。探针与每一个芯片元件的互补性和结合量都可通过对扫描出的图像的分析来判断。

全长cDNA、EST、或基因片段都可以作为固定于底物上的样品。适合于杂交的片段可通过用一些著名的生物软件(如LASERGENE SOFTWARE(DNASTAR))，来选择。这些全长cDNA、EST、与本发明的核酸序列相关的片断、或与这项发明有关的cDNA库中随机选出的片段被有序的排列于玻璃等载体上。cDNA固着于玻片的方法是：紫外线交联、热学、化学处理、干燥(Schena，M.et al.(1995)Science 270：467-470；and Shalon，D.et al.(1996)GenomeRes.6：639-645.)等。将探针用荧光标记后，再与固着地反应元件杂交。杂交结果可用于推断基因功能，理解疾病产生的基因基础，诊断疾病，并可改进及监测药剂的活性。

本发明的hSEZ-6核苷酸序列或其全长片段可作微矩阵的对象，检测出基因变异、突变及多态现象，从而对相关疾病的诊断治疗起辅助作用。

实施例7：

试剂盒的制备

试剂盒1：

它含有(1)特异性扩增人SEZ-6的引物对和使用说明。该试剂盒还可含有或不含有将mRNA逆转录成cDNA的所需试剂。其中，该特异性引物的序列衍生自SEQ ID NO：1的序列。对逆转录成的cDNA进行特异性扩增，以检测样品中是否含有hSEZ6的核酸序列。该试剂盒还可含有进行PCR反应所需的其他试剂，例如缓冲液等。

此外，较佳地，至少一个所用的引物跨越了两个外显子，因为此时对应于人SEZ-6的基因组序列将不产生扩增产物。

试剂盒2：

该试剂盒含有针对人SEZ-6的特异性的抗体(例如实施例5中制备的多克隆抗体，或者用标准的杂交瘤技术产生的抗人SEZ-6的单克隆抗体)，和使用说明。该试剂盒用于直接检测样品中是否存在或缺失人SEZ-6蛋白。先通过特异性免疫反应形成免疫复合物，然后用常规技术检测免疫复合物。

试剂盒3：

该试剂盒含有可特异性地与人SEZ-6的mRNA杂交的探针。它还可含有或不含有杂交缓冲液。该试剂盒通过核酸分子与人SEZ-6特异性探针之间的杂交反应来检测样品中是否存在人SEZ-6的核酸分子。

试剂盒也可用于检测出基因变异、突变及多态现象，并检测出一系列与本发明的hSEZ-6相关的基因，从而对相关疾病的诊断、治疗起辅助作用。

实例8：

基因定位

发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。

实施例9：

制备抗体

将按实例3、实例4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀hSEZ-6基因翻译产物的能力加以评估。针对本发明人SEZ-6的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

实例10：

制成药物

本发明的hSEZ-6蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等可作为药物，用于诊断和治疗癫痫及某类些由神经元电位异常引起的疾病，如老年性痴呆、记忆力衰退、震颤麻痹、舞蹈症、扭转痉挛等有重要价值的小分子药物。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

此外，本发明人SEZ-6核酸(编码序列或反义序列)可以直接引入细胞，以提高人SEZ-6的表达水平或者抑制人SEZ-6的过度表达。本发明的人SEZ-6蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人SEZ-6缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

当本发明的人SEZ-6蛋白多肽被用作药物时，治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明涉及的序列信息如下：(1)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：4227bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)序列描述：SEQ ID NO：11 CGCCAGGCGC TGGCCGTGGT GCTGATTCTG TCAGGCGCTG GCGGCGGCAG CGGCGGTGAC61 GGCTGCGGCC CCGCTCCCTC TACCCGGCCG GACCCGGCTC TGCCCCCGCG CCCAAGCCCC121 ACCAAGCCCC CCGCCCTCCC GCCGCGGTCC CAGCCCAGGG CGCGGCCGCA ACCAGCACCA181 TGCGCCCGGT AGCCCTGCTG CTCCTGCCCT CGCTGCTGGC GCTCCTGGCT CACGGACTCT241 CTTTAGAGGC CCCAACCGTG GGGAAAGGAC AAGCCCCAGG CATCGAGGAG ACAGATGGCG301 AGCTGACAGC AGCCCCCACA CCTGAGCAGC CAGAACGAGG CGTCCACTTT GTCACAACAG361 CCCCCACCTT GAAGCTGCTC AACCACCACC CGCTGCTTGA GGAATTCCTA CACGAGGGGC421 TGGAAAAGGG AGATGAGGAG CTGAGGCCAG CACTGTCCTT TCAGCCTGAC CCACCTGCAC481 CCTTCACCCC AAGTCCCCTT CCCCGCCTGG CCAACCAGGA CAGCCGCCCT GTCTTTACCA541 GCCCCACTCC AGCCATGGCT GCGGTACCCA CTCAGCCCCA GTCCAAGGAG GGACCCTGGA601 GTCCGGATCC GGAGTCAGAG TCCCCTATGC TTCGAATCAC AGCTCCCCTA CCTCCAGGGC661 CCAGCATGGC AGTGCCCACC CTAGGCCCAG GGGAGATAGC CAGCACTACA CCCCCCAGCA721 GAGCCTGGAC ACCAACCCAA GAGGGTCCTG GAGACATGGG AAGGCCGTGG GTTGCAGAGG781 TTGTGTCCCA GGGCGCAGGG ATCGGGATCC AGGGGACCAT CACCTCCTCC ACAGCTTCAG841 GAGATGATGA GGAGACCACC ACTACCACCA CCATCATCAC CACCACCATC ACCACAGTCC901 AGACACCAGG CCCTTGTAGC TGGAATTTCT CAGGCCCAGA GGGCTCTCTG GACTCCCCTA961 CAGACCTCAG CTCCCCCACT GATGTTGGCC TGGACTGCTT CTTCTACATC TCTGTCTACC1021 CTGGCTATGG CGTGGAAATC AAGGTCAAGA ATATCAGCCT CCGGGAAGGG GAGACAGTGA1081 CTGTGGAAGG CCTGGGGGGG CCTGACCCAC TGCCCCTGGC CAACCAGTCT TTCCTGCTGC1141 GGGGCCAAGT CATCCGCAGC CCCACCCACC AAGCGGCCCT GAGGTTCCAG AGCCTCCCGC1201 CACCGGCTGG CCCTGGCACC TTCCATTTCC ATTACCAAGC CTATCTCCTG AGCTGCCACT1261 TTCCCCGTCG TCCAGCTTAT GGAGATGTGA CTGTCACCAG CCTCCACCCA GGGGGTAGTG1321 CCCGCTTCCA TTGTGCCACT GGCTACCAGC TGAAGGGCGC CAGGCATCTC ACCTGTCTCA1381 ATGCCACCCA GCCCTTCTGG GATTCAAAGG AGCCCGTCTG CATCGGTGAG TGCCCAGGGG1441 TGATCCGCAA TGCCACCACC GGCCGCATCG TCTCTCCAGG CTTCCCGGGC AACTACAGCA1501 ACAACCTCAC CTGTCACTGG CTGCTTGAGG CTCCTGAGGG CCAGCGGCTA CACCTGCACT1561 TTGAGAAGGT TTCCCTGGCA GAGGATGATG ACAGGCTCAT CATTCGCAAT GGGGACAACG1621 TGGAGGCCCC ACCAGTGTAT GATTCCTATG AGGTGGAATA CCTGCCCATT GAGGGCCTGC1681 TCAGCTCTGG CAAACACTTC TTTGTTGAGC TCAGTACTGA CAGCAGCGGG GCAGCTGCAG1741 GCATGGCCCT GCGCTATGAG GCCTTCCAGC AGGGCCATTG CTATGAGCCC TTTGTCAAAT1801 ACGGTAACTT CAGCAGCAGC ACACCCACCT ACCCTGTGGG TACCACTGTG GAGTTCAGCT1861 GCGACCCTGG CTACACCCTG GAGCAGGGCT CCATCATCAT CGAGTGTGTT GACCCCCACG1921 ACCCCCAGTG GAATGAGACA GAGCCAGCCT GCCGAGCCGT GTGCAGCGGG GAGATCACAG1981 ACTCGGCTGG CGTGGTACTC TCTCCCAACT GGCCAGAGCC CTACGGTCGT GGGCAGGATT2041 GTATCTGGGG TGTGCATGTG GAAGAGGACA AGCGCATCAT GCTGGACATC CGAGTGCTGC2101 GCATAGGCCC TGGTGATGTG CTTACCTTCT ATGATGGGGA TGACCTGACG GCCCGGGTTC2161 TGGGCCAGTA CTCAGGGCCC CGTAGCCACT TCAAGCTCTT TACCTCCATG GCTGATGTCA2221 CCATTCAGTT CCAGTCGGAC CCCGGGACCT CAGTGCTGGG CTACCAGCAG GGCTTCGTCA2281 TCCACTTCTT TGAGGTGCCC CGCAATGACA CATGTCCGGA GCTGCCTGAG ATCCCCAATG2341 GCTGGAAGAG CCCATCGCAG CCTGAGCTAG TGCACGGCAC CGTGGTCACT TACCAGTGCT2401 ACCCTGGCTA CCAGGTAGTG GGATCCAGTG TCCTCATGTG CCAGTGGGAC CTAACTTGGA2461 GTGAGGACCT GCCCTCATGC CAGAGGGTGA CTTCCTGCCA CGATCCTGGA GATGTGGAGC2521 ACAGCCGACG CCTCATATCC AGCCCCAAGT TTCCCGTGGG GGCCACCGTG CAATATATCT2581 GTGACCAGGG TTTTGTGCTG ATGGGCAGCT CCATCCTCAC CTGCCATGAT CGCCAGGCTG2641 GCAGCCCCAA GTGGAGTGAC CGGGCCCCTA AATGTCTCCT GGAACAGCTC AAGCCATGCC2701 ATGGTCTCAG TGCCCCTGAG AATGGTGCCC GAAGTCCTGA GAAGCAGCTA CACCCAGCAG2761 GGGCCACCAT CCACTTCTCG TGTGCCCCTG GCTATGTGCT GAAGGGCCAG GCCAGCATCA2821 AGTGTGTGCC TGGGCACCCC TCGCATTGGA GTGACCCCCC ACCCATCTGT AGGGCTGCCT2881 CTCTGGATGG TTCTACAACA GTCGCAGCCT GGATGGTTGC CAAGGCACCT GCTGCCTCCA2941 GCACCCTGGA TGCTGCCCAC ATTGCAGCTG CCATCTTCTT GCCACTGGTG GCGATGGTGT3001 TGTTGGTAGG AGGTGTATAC TTCTACTTCT CCAGGCTCCA GGGAAAAAGC TCCCTGCAGC3061 TGCCCCGCCC CCGCCCCCGC CCCTACAACC GCATTACCAT AGAGTCAGCG TTTGACAATC3121 CAACTTACGA GACTGGATCT CTTTCCTTTG CAGGAGACGA GAGAATATGA AGTCTCCATC3181 TAGGTGGGGG CAGTCTAGGG AAGTCAACTC AGACTTGCAC CACAGTCCAG CAGCAAGGCT3241 CCTTGCTTCC TGCTGTCCCT CCACCTCCTG TATATACCAC CTAGGAGGAG ATGCCACCAA3301 GCCCTCAAGA AGTTGTGCCC TTCCCCGCCT GCGATGCCCA CCATGGCCTA TTTTCTTGGT3361 GTCATTGCCC ACTTGGGGCC CTTCATTGGG CCCATGTCAG GGGGCATCTA CCTGTGGGAA3421 GAACATAGCT GGAGCACAAG CATCAACAGC CAGCATCCTG AGCCTCCTCA TGCCCTGGAC3481 CAGCCTGGAA CACACTAGCA GAGCAGGAGT ACCTTTCTCC ACATGACCAC CATCCCGCCC3541 TGGCATGGCA ACCTGCAGCA GGATTAACTT GACCATGGTG GGAACTGCAC CAGGGTACTC3601 CTCACAGCGC CATCACCAAT GGCCAAAACT CCTCTCAACG GTGACCTCTG GGTAGTCCTG3661 GCATGCCAAC ATCAGCCTCT TGGGAGGTCT CTAGTTCTCT AAAGTTCTGG ACAGTTCTGC3721 CTCCTGCCCT GTCCCAGTGG AGGCAGTAAT TCTAGGAGAT CCTAAGGGGT TCAGGGGGAC3781 CCTACCCCCA CCTCAGGTTG GGCTTCCCTG GGCACTCATG CTCCACACCA AAGCAGGACA3841 CGCCATTTTC CACTGACCAC CCTATACCCT GAGGAAAGGG AGACTTTCCT CCGATGTTTA3901 TTTAGCTGTT GCAAACATCT TCACCCTAAT AGTCCCTCCT CCAATTCCAG CCACTTGTCA3961 GGCTCTCCTC TTGACCACTG TGTTATGGGA TAAGGGGAGG GGGTGGGCAT ATTCTGGAGA4021 GGAGCAGAGG TCCAAGGACC CAGGAATTTG GCATGGAACA GGTGGTAGGA GAGCCCCAGG4081 GAGACGCCCA GGAGCTGGCT GAAAGCCACT TTGTACATGT AATGTATTAT ATGGGGTCTG4141 GGCTCCAGCC AGAGAACAAT CTTTTATTTC TGTTGTTTCC TTATTAAAAT GGTGTTTTTG4201 GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：996个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(iii)序列描述：SEQ ID NO：21 MRPVALLLLP SLLALLAHGL SLEAPTVGKG QAPGIEETDG ELTAAPTPEQ PERGVHFVTT61 APTLKLLNHH PLLEEFLHEG LEKGDEELRP ALSFQPDPPA PFTPSPLPRL ANQDSRPVFT121 SPTPAMAAVP TQPQSKEGPW SPDPESESPM LRITAPLPPG PSMAVPTLGP GEIASTTPPS181 RAWTPTQEGP GDMGRPWVAE VVSQGAGIGI QGTITSSTAS GDDEETTTTT TIITTTITTV241 QTPGPCSWNF SGPEGSLDSP TDLSSPTDVG LDCFFYISVY PGYGVEIKVK NISLREGETV301 TVEGLGGPDP LPLANQSFLL RGQVIRSPTH QAALRFQSLP PPAGPGTFHF HYQAYLLSCH361 FPRRPAYGDV TVTSLHPGGS ARFHCATGYQ LKGARHLTCL NATQPFWDSK EPVCIGECPG421 VIRNATTGRI VSPGFPGNYS NNLTCHWLLE APEGQRLHLH FEKVSLAEDD DRLIIRNGDN481 VEAPPVYDSY EVEYLPIEGL LSSGKHFFVE LSTDSSGAAA GMALRYEAFQ QGHCYEPFVK541 YGNFSSSTPT YPVGTTVEFS CDPGYTLEQG SIIIECVDPH DPQWNETEPA CRAVCSGEIT601 DSAGVVLSPN WPEPYGRGQD CIWGVHVEED KRIMLDIRVL RIGPGDVLTF YDGDDLTARV661 LGQYSGPRSH FKLFTSMADV TIQFQSDPGT SVLGYQQGFV IHFFEVPRND TCPELPEIPN721 GWKSPSQPEL VHGTVVTYQC YPGYQVVGSS VLMCQWDLTW SEDLPSCQRV TSCHDPGDVE781 HSRRLISSPK FPVGATVQYI CDQGFVLMGS SILTCHDRQA GSPKWSDRAP KCLLEQLKPC841 HGLSAPENGA RSPEKQLHPA GATIHFSCAP GYVLKGQASI KCVPGHPSHW SDPPPICRAA901 SLDGSTTVAA WMVAKAPAAS STLDAAHIAA AIFLPLVAMV LLVGGVYFYF SRLQGKSSLQ961 LPRPRPRPYN RITIESAFDN PTYETGSLSF AGDERI(3)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：991个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(iii)序列描述：SEQ ID NO：31 MRPAALLLLP SLLALLAHGL SSEAPITGEG HATGIRETDG ELTAAPTPEQ SDRGVHFVTT61 APTLKLLNHH PLLEEFLQEG LEREEAPQPA LPFQPDSPTH FTPSPLPRLT NQDNRPVFTS121 PTPAVAAAPT QPHSREKPWN LESKPPELSI TSSLPPGPSM AYPTLLPEDR PSTTPPSQAW181 TPTQEGPGDM DRPWVPEVMS KTTGLGVEGT IATSTGSGDD EETTTTIITT TVTTVQPPGP241 CSWNFSGPEG SLDSPTAPSS PSDVGLDCFY YISVYPGYGV EIKVENISLQ EGETITVEGL301 GGPDPLPLAN QSFLLRGQVI RSPTHQAALR FQSLPLPAGP GTFHFRYQAY LLSCHFPRRP361 AYGDVTVTSL HPGGSAHFHC ATGYQLKGAR FLTCLNATQP FWDSQEPVCI AACGGVIRNA421 TTGR1VSPGF PGNYSNNLTC HWLLEPPESQ RLHLHFEKVS LAEDDDRLII RNGNNVEAPP481 VYDSYEVEYL PIEGLLSSGR HFFVEFSTDS SGAAAGMALR YEAFQQRHCY EPFVKYGNFS541 SSAPSYPVGT TVEFSCDPGY TLEQGSIIIE CVDLHDPQWN ETEPACRAVC SGEITDSAGV601 VLSPNWPEPY GRGQDCIWGV HVEEDKRIML DIRVLRIGSG DVLTFYDGDD LTARVLGQYS661 GPRGHFKLFT SMADVTIQFQ SDPGTSALGY QQGFVIHFFE VPRNNTCPEL PEIPNGWKNP721 SQPELVHGTV VTYQCYPGYQ VVGSSILMCQ WDLSWSEDLP SCQRVTSCHD PGDVEHSRRL781 ISSPKFPVGA TVQYVCDQGF VLTGSAILTC HDRQAGSPKW SDRAPKCLLE QFKPCHGLSA841 PENGARSPEK RLHPAGATIH FSCAPGYVLK GQASIKCVPG HPSHWSDPPP ICRAASLDGF901 YNGRSLDVAK APAASSALDA AHLAAAIFLP LVAMVLLVGG VYLYFSRFQG KSPLQLPRTH961 PRPYNRITVE SAFDNPTYET GSLSFAGDER I

  附表人SEZ-6与小鼠SEZ-6氨基酸序列的同源比较HUMAN    -MRPVALLLLPSLLALLAHGLSLEAPTVGKGQAPGIEETDGELTAAPTPEQ -50

      ||| ||||||||||||||||| |||  | | | || ||||||||||||||MOUSE    -MRPAALLLLPSLLALLAHGLSSEAPITGEGHATGIRETDGELTAAPTPEQ -50HUMAN    -PERGVHFVTTAPTLKLLNHHPLLEEFLHEGLEKGDEELRPALSFQPDPPA -100

        ||||||||||||||||||||||||| ||||   |   ||| |||  |MOUSE    -SDRGVHFVTTAPTLKLLNHHPLLEEFLQEGLER-EEAPQPALPFQPDSPT -99HUMAN    -PFTPSPLPRLANQDSRPVFTSPTPAMAAVPTQPQSKEGPWSPDPESESPM -150

       ||||||| | ||| |||||||||| || |||| | | ||    ||  |MOUSE    -HFTPSPLPRLTNQDNRPVFTSPTPAVAAAPTQPHSREKPWN--LESKPPE -147HUMAN    -LRITAPLPPGPSMAVPTLGPGEIASTTPPSRAWTPTQEGPGDMGRPWVAE -200

      | |||||||||||||||| |    |||||| |||||||||||| |||| |MOUSE    -LSITSSLPPGPSMAVPTLLPEDRPSTTPPSQAWTPTQEGPGDMDRPWVPE -197HUMAN    -VVSQGAGIGIQGTITSSTASGDDEETTTTTTIITTTITTVQTPGPCSWNF -250

      | |   | |||     || ||||||||||  |||| ||||  ||||||||MOUSE    -VMSKTTGLGVEGTIATSTGSGDDEETTTT--IITTTVTTVQPPGPCSWNF -245HUMAN    -SGPEGSLDSPTDLSSPTDVGLDCFFYISVYPGYGVEIKVKNISLREGETV -300

      |||||||||||  ||| ||||||| |||||||||||||| |||| ||||MOUSE    -SGPEGSLDSPTAPSSPSDVGLDCFYYISVYPGYGVEIKVENISLQEGETI -295HUMAN    -TVEGLGGPDPLPLANQSFLLRGQVIRSPTHQAALRFQSLPPPAGPGTFHF -350

      |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||MOUSE    -TVEGLGGPDPLPLANQSFLLRGQVIRSPTHQAALRFQSLPLPAGPGTFHF -345HUMAN    -HYQAYLLSCHFPRRPAYGDVTVTSLHPGGSARFHCATGYQLKGARHLTCL -400

       |||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| ||||MOUSE    -RYQAYLLSCHFPRRPAYGDVTVTSLHPGGSAHFHCATGYQLKGARFLTCL -395HUMAN    -NATQPFWDSKEPVCIGECPGVIRNATTGRIVSPGFPGNYSNNLTCHWLLE -450

      ||||||||| |||||  | |||||||||||||||||||||||||||||||MOUSE    -NATQPFWDSQEPVCIAACGGVIRNATTGRIVSPGFPGNYSNNLTCHWLLE -445HUMAN    -APEGQRLHLHFEKVSLAEDDDRLIIRNGDNVEAPPVYDSYEVEYLPIEGL -500

       || |||| ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||MOUSE    -PPESQRLHLHFEKVSLAEDDDRLIIRNGNNVEAPPVYDSYEVEYLPIEGL -495HUMAN    -LSSGKHFFVELSTDSSGAAAGMALRYEAFQQGHCYEPFVKYGNFSSSTPT -550

      |||| ||||| |||||||||||||||||||| |||||||||||||||| |MOUSE    -LSSGRHFFVEFSTDSSGAAAGMALRYEAFQQRHCYEPFVKYGNFSSSAPS -545HUMAN    -YPVGTTVEFSCDPGYTLEQGSIIIECVDPHDPQWNETEPACRAVCSGEIT -600

       ||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||MOUSE    -YPVGTTVEFSCDPGYTLEQGSIIIECVDLHDPQWNETEPACRAVCSGEIT -595HUMAN    -DSAGVVLSPNWPEPYGRGQDCIWGVHVEEDKRIMLDIRVLRIGPGDVLTF -650

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||MOUSE    -DSAGVVLSPNWPEPYGRGQDCIWGVHVEEDKRIMLDIRVLRIGSGDVLTF -645HUMAN    -YDGDDLTARVLGQYSGPRSHFKLFTSMADVTIQFQSDPGTSVLGYQQGFV -700

      |||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| ||||||||MOUSE    -YDGDDLTARVLGQYSGPRGHFKLFTSMADVTIQFQSDPGTSALGYQQGFV -695HUMAN    -IHFFEVPRNDTCPELPEIPNGWKSPSQPELVHGTVVTYQCYPGYQVVGSS -750

      ||||||||| ||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||MOUSE    -IHFFEVPRNNTCPELPEIPNGWKNPSQPELVHGTVVTYQCYPGYQVVGSS -745HUMAN    -VLMCQWDLTWSEDLPSCQRVTSCHDPGDVEHSRRLISSPKFPVGATVQYI -800

      |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||MOUSE    -ILMCQWDLSWSEDLPSCQRVTSCHDPGDVEHSRRLISSPKFPVGATVQYV -795HUMAN    -CDQGFVLMGSSILTCHDRQAGSPKWSDRAPKCLLEQLKPCHGLSAPENGA -850

      ||||||| || ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||MOUSE    -CDQGFVLTGSAILTCHDRQAGSPKWSDRAPKCLLEQFKPCHGLSAPENGA -845HUMAN    -RSPEKQLHPAGATIHFSCAPGYVLKGQASIKCVPGHPSHWSDPPPICRAA -900

      ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||MOUSE    -RSPEKRLHPAGATIHFSCAPGYVLKGQASIKCVPGHPSHWSDPPPICRAA -895HUMAN    -SLDGSTTVAAWMVAKAPAASSTLDAAHIAAAIFLPLVAMVLLVGGVYFYF -950

      ||||        ||||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||MOUSE    -SLDGFYNGRSLDVAKAPAASSALDAAHLAAAIFLPLVAMVLLVGGVYLYF -945HUMAN    -SRLQGKSSLQLPRPRPRPYNRITIESAFDNPTYETGSLSFAGDERI -996

      || |||| |||||  |||||||| ||||||||||||||||||||||MOUSE    -SRFQGKSPLQLPRTHPRPYNRITVESAFDNPTYETGSLSFAGDERI -991同一性：89.2％

Claims (13)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人SEZ-6蛋白活性的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO：2所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列。

4.一种分离的hSEZ-6蛋白多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2序列的多肽。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

6.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

9.一种产生具有hSEZ-6蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有hSEZ-6蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hSEZ-6蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸180-3167位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hSEZ-6蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达hSEZ-6蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有hSEZ-6蛋白活性的多肽。

10.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该方法可产生如序列为SEQID NO：1中从180-3167位的核苷酸。

11.一种能与权利要求4所述的hSEZ-6蛋白多肽特异性结合的抗体。

12.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

13.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。