CN1431307A - 人类肝癌衍生生长因子4、其编码序列、制法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人肝癌细胞衍生生长因子(HDGF4)的cDNA序列。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的应用以及所述多核苷酸和所述多肽的制备方法。

Description

人类肝癌衍生生长因子4、其编码序列、制法及用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及一种人肝癌细胞衍生生长因子(HDGF4)的cDNA序列。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的应用以及所述多核苷酸和所述多肽的制备方法。

背景技术

生长因子是调节细胞增殖和分化的一类物质，其分子量从几百到几万不等，习惯上称多肽生长因子，通过与特异的膜表面受体作用后引发的一系列级联反应而实现对细胞生长的调节。与经典的多肽和蛋白质激素相比，多肽生长因子没有特定的内分泌腺和内分泌细胞，而是通过一些细胞的旁分泌和自分泌释放并扩散到靶细胞，从而协调机体自身的统一和对外界的反应。

肝癌衍生生长因子( hepatoma  derived  growth  factor，HDGF)是一种较为重要的生长因子，这个名称首次出现Klagsbrun，M.等人1986年的论文(P.N.A.S.USAVol.33，pp2448-2452，1986)中。在该文中，Klagsbrun，M.等人从人的肝癌细胞株SK-HEP-1分离纯化了一个约18.5-19KD蛋白因子，这种因子的一个显著特点就是与肝素有很强的亲和力。

在1989年，日本大阪大学医学院的Nakamura实验小组成员从人的肝癌细胞株HuH-7分离纯化到一个约64KD的蛋白因子，也命名为HDGF(Clinic ChimicaActa.，183：273-284，1989)。在该文中，Nakamura，H.等人对该因子的生化性质和功能作了初步的研究，并认为HDGF不同于当时已发现的PDGF、FGF、HGF(肝癌生长因子)等细胞因子。1997年该实验组在小鼠中找到了HDGF的同系物并发现了该基因家族的另两个成员HRP-1、HRP-2，它们都具有一个相当保守的98个氨基酸长的HATH( homologous to the  amino  terminus of  HDGF)序列( Biochem. Biophys.Res.Commun.238：26-32，1997)，1999年该实验组又在人和小鼠中克隆到了HDGF基因家族的另一个成员HRP-3( Biochem.Biophys.Res.Commun.266(1)：81-87，1999)。

然而，在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的人HDGF4。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的人肝癌细胞衍生生长因子多核苷酸序列，该多核苷酸序列被命名为人HDGF4。

本发明的另一个目的是提供一种新的人肝癌细胞衍生生长因子的蛋白，该蛋白被命名为人HDGF4。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人HDGF4蛋白的方法。

本发明还提供了这种人HDGF4基因序列和蛋白的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人HDGF4蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸4-852位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸4-852位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO：2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO：1中从核苷酸4-852位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的HDGF4蛋白多肽，它包括：具有SEQID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有HDGF4蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有HDGF4蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HDGF4蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：l中从核苷酸4-852位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HDGF4蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达HDGF4蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有HDGF4蛋白活性的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种抗体，它与HDGF4蛋白多肽特异性结合。

在本发明的另一方面，提供了一种探针分子，它含有如SEQ ID NO：1所示的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

附图说明

图1显示了人HDGF4与HDGF家族其他成员氨基酸N端序列同源比较。其中，“*”代表各序列在该位置具有相同的氨基酸，“：”表示各序列在该位置的氨基酸分布具有较高的同源性，“.”表示各序列在该位置的氨基酸分布具有较高的同源性。附图中各序列的Genbank登录号如下：

小鼠HRP1    JC5661

大鼠HRP     AAL29938

小鼠HDGF    JC5660

大鼠HDGF    AAL47132

人HDGF      D16431

人HRP1      AAH18991

人HRP3      BAA90477

小鼠HRP3    AB029493

小鼠HRP2    JC5662

大鼠HDGF3   AAK50635

由图1可知，本发明的人HDGF4其氨基末端(HATH区域通常包括N端98个氨基酸)与HDGF家族其他成员都有较高同源性。

具体实施方式

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“HDGF4蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有HDGF4蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中4-852位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO：1序列的编码框4-852位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1中4-852位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地，在高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸4-852位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO：1中从核苷酸4-852位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与人HDGF4相同功能的蛋白的SEQ ID NO：1中开放读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。本发明的编码序列可以是DNA或RNA，可以是单链或双链。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的20％，较佳地50％，更佳地80％，最佳地90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“HDGF4蛋白多肽”指具有HDGF4蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与人HDGF4相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时(最好按表1所示进行)，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括HDGF4蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与HDGF4 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗HDGF4多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含HDGF4多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了HDGF4多肽的可溶性片段。通常，该片段具有HDGF4多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供HDGF4蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然HDGF4多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还提供了“人HDGF4保守性变异多肽”。在本发明中，“人HDGF4保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                                  表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser

Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括HDGF4多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内HDGF4的表达。

本发明还包括可用作探针和引物的核酸分子，该分子通常具有HDGF4多肽编码序列的约8-100个，较佳地约15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码HDGF4的核酸分子。

本发明还包括检测HDGF4核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于HDGF4多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

本发明还包括对HDGF4 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于HDGF4基因产物或片段。较佳地，指那些能与HDGF4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制HDGF4蛋白的分子，也包括那些并不影响HDGF4蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的HDGF4基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab＇或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的HDGF4基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达HDGF4或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断HDGF4功能的抗体以及不影响HDGF4功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用HDGF4基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与HDGF4基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人HDGF4核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes：A Manualof Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列被定位于染色体上的某个精确位置，将可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。

接着，有必要确定患病个体和健康个体之间的cDNA或基因组序列方面的差异。如果某一突变存在于部分或全部患病个体但不存在于正常个体，那么该突变可能就是该疾病的致病因素。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与HDGF4发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的人HDGF4蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人HDGF4蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的人HDGF4蛋白多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

在本发明的一个具体实施方案中，人HDGF4的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用寡核苷酸A1：5＇-gctatgtcttgcttcagccgctc-3＇(SEQ ID NO：3)为正向引物，寡核苷酸A2：5＇-ccgtgactacaggccttctatttc-3＇(SEQ ID NO：4)为反向引物，进行PCR，PCR条件均为93℃4分钟，随之以93℃ 1分钟，68℃ 1分钟和72℃ 1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段，为所需的目的片段。其全长为861个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO：1，其中开放读框位于4-852位核苷酸。

肝癌细胞衍生生长因子(HDGF)是从人的肝癌细胞株HuH-7中分离到的肝素结合蛋白，它具有刺激细胞生长的活性，能够促进成纤维细胞和一些肝癌细胞的生长，HDGF的有丝分裂原活性使其在急性恶性肝炎和肝损伤的治疗上存在着极大的应用价值。

研究表明，HDGF虽然源自肝癌细胞株，但它在正常细胞和癌细胞系中均有广泛的表达，因而HDGF不仅仅局限于作用癌细胞，可能对正常的组织和细胞的生理和发育过程也有重要的生理作用。如：可促进SMC、猴Cos-7、Swiss-3T3、HuH-7、7.1.1细胞分裂；可以促进与调节血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的生长，可作为分泌性的生长因子或核因子发挥功能。HDGF家族的已知各成员的表达模式是不同的，但是它们在睾丸中都有很高程度的富集，而且它们的5’非翻译区均有高于70％的GC比，因而在雄性生殖细胞发育过程中有重要功能，并和DNA甲基化，染色质构象以及翻译调控相关。

因此，本发明的HDGF4在肝组织部分切除后有助于促进肝细胞的增殖，加速创面愈合；通过HDGF4寻找其小分子拮抗物或抑制剂并制成药物，可对肝癌细胞起到抑制生长及诱导凋亡的作用，从而减缓并控制肝癌病情的发展。由于HDGF4在不同的细胞中表达的情况不同，故将HDGF4蛋白、其编码核酸或其活性部分制成试剂盒，可用于良、恶性肿瘤的早期诊断，还可对肝癌的术后疗效和预后监测起到辅助作用。

本发明的HDGF4对各种细胞都有不同程度的有丝分裂作用，因此还可用于调节血管内皮细胞和血管平滑肌生长，在促进创伤愈合、治疗器官的急性炎症性损伤、治疗肝癌以外的恶性肿瘤方面也有一定的应用价值。

本发明人HDGF4核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人HDGF4的表达水平或者抑制人HDGF4的过度表达。本发明的人HDGF4蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人HDGF4缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

此外，由于本发明的人HDGF4具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

HDGF4的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人睾丸λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用寡核苷酸A1：5＇-gctatgtcttgcttcagccgctc-3＇(SEQ ID NO：3)为正向引物，寡核苷酸A2：5＇-ccgtgactacaggccttctatttc-3＇(SEQ ID NO：4)为反向引物，进行PCR，PCR条件均为93℃4分钟，随之以93℃ 1分钟，68℃ 1分钟和72℃ 1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段。

2.PCR产物的测序

将如上获得的目的cDNA序列与pGEM-T^TM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCEL^TM DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，获得全长cDNA序列，共861bp，详细序列见SEQ IDNO：1。

gctatgtctt gcttcagccg ctctaagtac aagaccgggg acctggtgtt tgccaagtta 60

aagggctatg cccactggcc agcgaggatc gaacatgtcg ctgaagccaa ccgctaccag 120

gtgttcttct tcgggaccca tgagaccgcc ctgctgggtc ccaggcacct gttcccttat 180

gaggagtcca aagagaagtt cggcaagccc aacaagaggc gcggcttcag cgaggggctg 240

tgggagatcg agcacgaccc tatggttgag gcctcctcta gcctgtgctc agaagaggat 300

cagagctaca cagaggatcc tgggctagca gaggagccgg aactaggaca ggagctggtg 360

caggagctgg agcccgaatt catgcctgag ctggaggcag aacctgagat gcctgagacc 420

gagtgtgaac aggagcccga gccccagcct gcctatgacc tgctggacgc cgtggaggag 480

ccgggcctca ccaaggccga gccaggagat cagcaagccg agcatgtgca agagaagcac 540

cctgaggtgg aggcagaggc tgaggctgag gctgaggccg aggcagaggc ggaggcggag 600

gccaaggctg aggtggagga gccggggagt ctgaagagga gcgcggagga tgaagagcct 660

cattgtcctc tcaaacggcc cagggaggcg gctcctggtg cgttggagat ggagcctgct 720

gaagagcgcg aggctgaggc ctgccccttc gtggaggagc ctgaccaagc ccaggagcag 780

ctgcctccgt tggaggaaga ggccacagaa aaggcggtcc agggcctgat tgttggagaa 840

atagaaggcc tgtagtcacg g 861

(SEQ ID NO：1)

根据得到的全长cDNA序列推导出HDGF4的氨基酸序列，共283个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO：2。

MSCFSRSKYK TGDLVFAKLK GYAHWPARIE HVAEANRYQV FFFGTHETAL 50

LGPRHLFPYE ESKEKFGKPN KRRGFSEGLW EIEHDPMVEA SSSLCSEEDQ 100

SYTEDPGLAE EPELGQELVQ ELEPEFMPEL EAEPEMPETE CEQEPEPQPA 150

YDLLDAVEEP GLTKAEPGDQ QAEHVQEKHP EVEAEAEAEA EAEAEAEAEA 200

KAEVEEPGSL KRSAEDEEPH CPLKRPREAA PGALEMEPAE EREAEACPFV 250

EEPDQAQEQL PPLEEEATEK AVQGLIVGEI EGL 283

(SEQ ID NO：2)

实施例2

同源比较

用人HDGF4的编码蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行蛋白同源检索。HDGF家族成员氨基末端(HATH region，homologous to the amino terminus of the HDGF)具有高度保守性，被认为是该家族成员的特征性序列，而本发明的人HDGF4其氨基末端与HDGF家族其他成员都有较高同源性，参见图1中人HDGF4与HDGF家族其他成员氨基酸N端序列同源比较。鉴于本发明的上述特征认为其属于肝癌细胞衍生生长因子(HDGF)家族，具有与该家族成员相似的功能。

肝癌细胞衍生生长因子(HDGF)是从人的肝癌细胞株HuH-7中分离到的肝素结合蛋白，它具有刺激细胞生长的活性，能够促进成纤维细胞和一些肝癌细胞的生长，HDGF的有丝分裂原活性使其在急性恶性肝炎和肝损伤的治疗上存在着极大的应用价值。

研究表明，HDGF虽然源自肝癌细胞株，但它在正常细胞和癌细胞系中均有广泛的表达，因而HDGF不仅仅局限于作用癌细胞，可能对正常的组织细胞也有重要的生理作用。如：可促进SMC、猴Cos-7、Swiss-3T3、HuH-7、7.1.1细胞分裂；可以促进血管生成；可作为分泌性的生长因子或核因子发挥功能。

本发明的人HDGF4还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明HDGF4还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，如将本发明HDGF4的N端与人的其它HDGF及鼠HDGF的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

针对本发明HDGF4的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

实施例3

HDGF4在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，将编码HDGF4的cDNA序列用对应于该DNA序列的5＇和3＇-端的PCR寡核苷酸引物进行扩增。

PCR反应中使用的5＇寡核苷酸引物序列为：

E1：5’-gcactgcagcatgtcttgcttcagccgc-3＇(SEQ ID NO：5)

该引物含有PstI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的HDGF4编码序列的部分核苷酸序列；

3＇端引物序列为：

E2：5’-gactaagcttcaggccttctatttctc-3＇(SEQ ID NO：6)

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和HDGF4的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶PstI、HindIII的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用PstI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段混合物，随后进行连接。再用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，用BamHI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证HDGF4的cDNA片段已正确插入了载体。

在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的HDGF4。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱HDGF4。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白，纯化后的蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质对含PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为31682。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：2的序列一致。

实施例4

HDGF4在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，将编码HDGF4的eDNA序列用对应于该DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得HDGF4 cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5＇寡核苷酸引物序列为：

C1：5’-gcaaagcttatgtcttgcttcagccgc-3＇(SEQ ID NO：7)

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的HDGF4编码序列的18个核苷酸部分核苷酸序列；

3＇端引物序列为：

C2：5’-gactctgcagccaggccttctatttctc-3’(SEQ ID NO：8)

该引物含有PstI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和HDGF4的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用HindIII和PstI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用BamHI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证HDGF4的cDNA片段已正确插入了载体。

质粒转染CHO细胞是用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris-HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris-HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为31682。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：2的序列一致。

实施例5

制备抗体

将实施例3和4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀HDGF4基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                              序列表<110>复旦大学<120>人类肝癌衍生生长因子4、其编码序列、制法及用途<130>017215<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>861<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(4)..(852)<400>1gct atg tct tgc ttc agc cgc tct aag tac aag acc ggg gac ctg gtg       48

Met Ser Cys Phe Ser Arg Ser Lys Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val

1               5                   10                  15ttt gcc aag tta aag ggc tat gcc cac tgg cca gcg agg atc gaa cat       96Phe Ala Lys Leu Lys Gly Tyr Ala His Trp Pro Ala Arg Ile Glu His

            20                  25                  30gtc gct gaa gcc aac cgc tac cag gtg ttc ttc ttc ggg acc cat gag       144Val Ala Glu Ala Ash Arg Tyr Gln Val Phe Phe Phe Gly Thr His Glu

        35                  40                  45acc gcc ctg ctg ggt ccc agg cac ctg ttc cct tat gag gag tcc aaa       192Thr Ala Leu Leu Gly Pro Arg His Leu Phe Pro Tyr Glu Glu Ser Lys

    50                  55                  60gag aag ttc ggc aag ccc aac aag agg cgc ggc ttc agc gag ggg ctg       240Glu Lys Phe Gly Lys Pro Ash Lys Arg Arg Gly Phe Ser Glu Gly Leu

65                  70                  75tgg gag atc gag cac gac cct atg gtt gag gcc tcc tct agc ctg tgc       288Trp Glu Ile Glu His Asp Pro Met Val Glu Ala Ser Ser Ser Leu Cys80                  85                  90                  95tca gaa gag gat cag agc tac aca gag gat cct ggg cta gca gag gag       336Ser Glu Glu Asp Gln Ser Tyr Thr Glu Asp Pro Gly Leu Ala Glu Glu

            100                 105                 110ccg gaa cta gga cag gag ctg gtg cag gag ctg gag ccc gaa ttc atg       384Pro Glu Leu Gly Gln Glu Leu Val Gln Glu Leu Glu Pro Glu Phe Met

        115                 120                 125cct gag ctg gag gca gaa cct gag atg cct gag acc gag tgt gaa cag      432Pro Glu Leu Glu Ala Glu Pro Glu Met Pro Glu Thr Glu Cys Glu Gln

    130                 135                 140gag ccc gag ccc cag cct gcc tat gac ctg ctg gac gcc gtg gag gag      480Glu Pro Glu Pro Gln Pro Ala Tyr Asp Leu Leu Asp Ala Val Glu Glu

145                 150                 155ccg ggc ctc acc aag gcc gag cca gga gat cag caa gcc gag cat gtg      528Pro Gly Leu Thr Lys Ala Glu Pro Gly Asp Gln Gln Ala Glu His Val160                 165                 170                 175caa gag aag cac cct gag gtg gag gca gag gct gag gct gag gct gag      576Gln Glu Lys His Pro Glu Val Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu

            180                 185                 190gcc gag gca gag gcg gag gcg gag gcc aag gct gag gtg gag gag ccg      624Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Glu Val Glu Glu Pro

        195                 200                 205ggg agt ctg aag agg agc gcg gag gat gaa gag cct cat tgt cct ctc      672Gly Ser Leu Lys Arg Ser Ala Glu Asp Glu Glu Pro His Cys Pro Leu

    210                 215                 220aaa cgg ccc agg gag gcg gct cct ggt gcg ttg gag atg gag cct gct      720Lys Arg Pro Arg Glu Ala Ala Pro Gly Ala Leu Glu Met Glu Pro Ala

225                 230                 235gaa gag cgc gag gct gag gcc tgc ccc ttc gtg gag gag cct gac caa      768Glu Glu Arg Glu Ala Glu Ala Cys Pro Phe Val Glu Glu Pro Asp Gln240                 245                 250                 255gcc cag gag cag ctg cct ccg ttg gag gaa gag gcc aca gaa aag gcg      816Ala Gln Glu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Glu Glu Ala Thr Glu Lys Ala

            260                 265                 270gtc cag ggc ctg att gtt gga gaa ata gaa ggc ctg tagtcacgg            861Val Gln Gly Leu Ile Val Gly Glu Ile Glu Gly Leu

        275                 280<210>2<211>283<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ser Cys Phe Ser Arg Ser Lys Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val Phe1               5                   10                  15Ala Lys Leu Lys Gly Tyr Ala His Trp Pro Ala Arg Ile Glu His Val

        20                  25                  30Ala Glu Ala Asn Arg Tyr Gln Val Phe Phe Phe Gly Thr His Glu Thr

    35                  40                  45Ala Leu Leu Gly Pro Arg His Leu Phe Pro Tyr Glu Glu Ser Lys Glu

50                  55                  60Lys Phe Gly Lys Pro Asn Lys Arg Arg Gly Phe Ser Glu Gly Leu Trp65                  70                  75                  80Glu Ile Glu His Asp Pro Met Val Glu Ala Ser Ser Ser Leu Cys Ser

            85                  90                  95Glu Glu Asp Gln Ser Tyr Thr Glu Asp Pro Gly Leu Ala Glu Glu Pro

        100                 105                 110Glu Leu Gly Gln Glu Leu Val Gln Glu Leu Glu Pro Glu Phe Met Pro

    115                 120                 125Glu Leu Glu Ala Glu Pro Glu Met Pro Glu Thr Glu Cys Glu Gln Glu

130                 135                 140Pro Glu Pro Gln Pro Ala Tyr Asp Leu Leu Asp Ala Val Glu Glu Pro145                 150                 155                 160Gly Leu Thr Lys Ala Glu Pro Gly Asp Gln Gln Ala Glu His Val Gln

            165                 170                 175Glu Lys His Pro Glu Val Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala

        180                 185                 190Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Glu Val Glu Glu Pro Gly

    195                 200                 205Ser Leu Lys Arg Ser Ala Glu Asp Glu Glu Pro His Cys Pro Leu Lys

210                 215                 220Arg Pro Arg Glu Ala Ala Pro Gly Ala Leu Glu Met Glu Pro Ala Glu225                 230                 235                 240Glu Arg Glu Ala Glu Ala Cys Pro Phe Val Glu Glu Pro Asp Gln Ala

            245                 250                 255Gln Glu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Glu Glu Ala Thr Glu Lys Ala Val

       260                  265                 270Gln Gly Leu Ile Val Gly Glu Ile Glu Gly Leu

    275                 280<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>引物<400>3gctatgtctt gcttcagccg ctc                                 23<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>引物<400>4ccgtgactac aggccttcta tttc                                24<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>引物<400>5gcactgcagc atgtcttgct tcagccgc                            28<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>引物<400>6gactaagctt caggccttct atttctc                             27<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>引物<400>7gcaaagctta tgtcttgctt cagccgc                             27<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>引物<400>8gactctgcag ccaggccttc tatttctc                            28

Claims (10)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人HDGF4蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸4-852位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸4-852位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO：2所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO：1中核苷酸4-852位的序列。

4.一种分离的HDGF4蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求6所述载体转化。

8.一种产生具有HDGF4蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有HDGF4蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成HDGF4蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸4-852位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成HDGF4蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达HDGF4蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有HDGF4蛋白活性的多肽。

9.一种抗体，其特征在于，它与HDGF4蛋白多肽特异性结合。

10.一种探针分子，其特征在于，它含有具有如SEQ ID NO：1所示的分子中8-100个连续核苷酸。