CN1376796A - 一种新的人类蛋白编码序列、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人类细胞分化和发育相关蛋白(hWHSRP)的cDNA序列以及该序列编码的多肽,本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法,以及这些多核苷酸和所述多肽的用途。

Description

一种新的人类蛋白编码序列、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种人类细胞分化和发育蛋白序列。更具体地说，本发明涉及一种Wolf-Hirschhorn综合症相关人类蛋白(hWHSRP)的cDNA序列以及该序列编码的多肽。本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和所述多肽的用途。

背景技术

Wolf-Hirschhorn综合症(WHS)又被称为4号染色体短臂缺失综合症，顾名思义，它是由第四号染色体短臂的部分缺失引起的。该病患者通常表现出严重的生长延滞和智力缺陷。据浙江省20个医疗单位对1979年各医院产房的登记统计表明，即使足月生产，新生儿出生体重仅约两千克左右，活动性较少，肌张力较弱，神经运动及生长发育严重障碍：唇腭裂的几率为10％，小颌的几率50％为，先天性心脏病的几率为50％，癫痫的几率为50％。

研究表明，该病对于发育另一严重的影响是其关键部位，即WHS病人交叠的最小区域，定位于慢性舞蹈病G8(D4S10)标记远端。慢性舞蹈症(chronic progressivechorea)又名为遗传性舞蹈病(hereditary chorea)或Huntington舞蹈病，是基底节及大脑皮层变性导致的一种遗传病。其特征为慢性进行性舞蹈样动作和痴呆，个别患者伴有癫痫、肌阵挛、共济失调及头疼等症状。

在研究WHS的过程中，其关键部位被限定在一个165kb的序列已知区域。Stec I等人在该关键部位鉴定了一个长度为90kb的基因，并定名为WHSC1(Wolf-Hirschhornsyndrome candidate 1)。这个含有25个外显子的基因，在早期发育和复杂的剪切和分化过程中广泛表达。它在快速增长的胚胎组织中优先表达。它编码存在于四个发育蛋白中的功能域：一个PWWP，一个HMG，一个SET和一个PHD型的锌指。根据上述特征，WHSC1被认为是与WHS特征现象相关的候选基因(Hum Mol Genet 1998Jul；7(7)：1071-82)。此外，Stec I还鉴定了一个蛋白结构域并根据其保守的“脯氨酸—色氨酸—色氨酸—脯氨酸”序列将其并命名为PWWP。它在核源的蛋白中存在，并在细胞生长和分化中起重要作用，还涉及蛋白—蛋白相互作用(2000，FEBSLett；473(1)：1-5)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种细胞分化和发育相关多核苷酸，该多核苷酸编码的蛋白被命名为Wolf-Hirschhorn综合症相关人类蛋白(human Wolf-Hirschhorn syndromerelated protein，hWHSRP)。

本发明的另一个目的是提供一种WHS相关蛋白，该蛋白被命名为hWHSRP。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的hWHSRP的方法。

本发明还提供了hWHSRP基因序列和多肽的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人hWHSRP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中从1-921位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的hWHSRP蛋白多肽，它包括：具有SEQ IDNO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQID NO.2序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有hWHSRP蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有hWHSRP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hWHSRP蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hWHSRP蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达hWHSRP蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有hWHSRP蛋白活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为921个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于1-921位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“hWHSRP蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有hWHSRP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中1-921位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框1-921位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中1-921位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ IDNO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人hWHSRP相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少70％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“hWHSRP蛋白多肽”指具有hWHSRP蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人hWHSRP相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括hhWHSRP1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与hWHSRP DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗hWHSRP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含hWHSRP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括hWHSRP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有hWHSRP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供hWHSRP蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然hWHSRP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括hWHSRP多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内hWHSRP的表达。

本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有hWHSRP多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码hWHSRP的核酸分子。

本发明还包括检测hWHSRP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hWHSRP多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对hWHSRP DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于hWHSRP基因产物或片段。较佳地，指那些能与hWHSRP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制hWHSRP蛋白的分子，也包括那些并不影响hWHSRP蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的hWHSRP基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的hWHSRP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达hWHSRP或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，921；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，921；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas.Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断hWHSRP功能的抗体以及不影响hWHSRP功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用hWHSRP基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与hWHSRP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人hWHSRP核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。

在本发明中，hWHSRP的cDNA核苷酸序列是如此获得的：以人睾丸λgt10cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-ATTCATGTCTTGCT TCAGCCG-3′为正向引物，寡核苷酸A2：5′- GAAATCGAAGGCCTGTA GCTG-3’为反向引物，进行PCR。A1/A2的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，得到长度约为九百个核苷酸的片段。

通过同源检索发现，本发明的hWHSRP具有PWWP(脯氨酸—色氨酸—色氨酸—脯氨酸)结构域。该结构域存在于核源的蛋白中，可能涉及蛋白—蛋白相互作用并在细胞生长和分化中起重要作用。该结构域是在研究WHSC1(Wolf-Hirschhorn syndromecandidate 1)时确定的。WHSC1被认为是WHS的候选基因之一，与慢性舞蹈症等疾病也有一定关联。本发明的hWHSRP具有上述结构域，因此，它可能在细胞分化和发育中起重要作用，与WHS的产生相关。

将本发明人hWHSRP核酸(编码序列或反义序列)引入细胞，可以提高人hWHSRP的表达水平或者抑制人hWHSRP的过度表达。本发明的人hWHSRP蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因hWHSRP缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，将本发明hWHSRP的核苷酸编码序列(详见SEQ ID NO 1)或氨基酸序列(详见SEQ ID NO 3)与适当的物质连接，制成药物或试剂盒，可对细胞生长和分化异常引起的疾病，如WHS、慢性舞蹈症等的预防、诊断和治疗起到一定作用。

具体实施方式

实施例1

hWHSRP的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人睾丸λgt10cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-ATTC ATGTCTTGCT TCAGCCG-3′为正向引物，寡核苷酸A2：5′-GAAATCG AAGGCCTGTA GCTG-3’为反向引物，进行PCR。A1/A2的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，得到长度约为九百个核苷酸的片段。

2.PCR产物的测序

将用上述扩增产物与pGEM-T^载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprepPlasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiThermEXCEL^TMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后获得全长cDNA序列，共921bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于1-921位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出hWHSRP的氨基酸序列，共306个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。

实施例2

结构分析

用hWHSRP的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现hWHSRP的蛋白质序列中具有PWWP(脯氨酸—色氨酸—色氨酸—脯氨酸)结构域的典型序列。

PWWP结构域因其含有保守的“脯氨酸—色氨酸—色氨酸—脯氨酸”序列而命名。该结构域存在于核源的蛋白中，可能涉及蛋白—蛋白相互作用并在细胞生长和分化中起重要作用。该结构域是在研究WHSC1(Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1)时确定的。WHSC1被认为是WHS的候选基因之一，与慢性舞蹈症等疾病也有一定关联。

在本发明的蛋白中符合PWWP结构域的序列片段是：KTGDLVFAKLKGYAHWPARIEHVTEPNRYQVFFFGTHETALLGPKHLFPYE(SEQ IDNO.2中6-90位)。因此，这进一步证实了本发明的hWHSRP可能涉及蛋白—蛋白相互作用并在细胞生长和分化中起重要作用。

本发明的hWHSRP可检测并治疗由于该基因表达不正常而引起的疾病。此外，将本发明hWHSRP的核苷酸编码序列(详见SEQ ID NO 1)或氨基酸序列(详见SEQ IDNO 3)与适当的物质连接，制成药物或试剂盒，可对细胞生长和分化异常引起的疾病，如WHS、慢性舞蹈症等的预防、诊断和治疗起到一定作用。

由上可知，本发明所涉及的蛋白可能是人类生长发育过程中的起重要作用蛋白之一。这样本发明实际上提供了一种从基因水平上来改善患者乃至正常婴幼儿的发育状况的方法。通过对本发明的深入研究，一定能发现它与许多临床病例的关系，并最终为解决这些问题开拓新的思维与方法。

本发明的人hWHSRP还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，可将本发明人hWHSRP与相关蛋白进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。

例如，本发明人hWHSRP核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人hWHSRP的表达水平或者抑制人hWHSRP的过度表达。本发明的人hWHSRP蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人hWHSRP缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

实施例3

hWHSRP在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，用对应于编码hWHSRP的cDNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得hWHSRP的cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-ATCTGGATCCATGTCTTGCT TCAGCCGCC-3′

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是hWHSRP编码序列近氨基端的部分核苷酸序列；

3′端引物序列为：

5’-GATCAAGCTT CAGGCCTT CGATTTCTCC A-3

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和hWHSRP的部分核苷酸序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用BamHI和HindIII消化pQE-9载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，并测序验证hWHSRP的cDNA片段已正确插入了载体。

在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)达0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的hWHSRP。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱hWHSRP。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。

实施例4

hWHSRP在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，用对应于编码hWHSRP的cDNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得hWHSRP cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5′-ATCTAAGCTTATGTCTTGCT TCAGCCGCC-3′

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是hWHSRP编码序列近氨基端的部分核苷酸序列；

3’端引物序列为：

5’-GATCGGATCC CAGGCCTT CGATTTCTCC A-3’

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和hWHSRP的部分核苷酸序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用BamHI和HindIII消化pcDNA3载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，并测序验证hWHSRP的cDNA片段已正确插入了载体。

质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。

实施例5

制备抗体

将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强兔疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人hWHSRP基因翻译产物的能力加以评估。

                        序列表<110>复旦大学<120>一种新的人类蛋白编码序列、其制备方法及用途<130>14<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>921<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)..(921)<223><400>1atg tct tgc ttc agc cgc cca aaa tac aag acc ggg gac ctg gtg ttt       48Met Ser Cys Phe Ser Arg Pro Lys Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val Phe1               5                   10                  15gcc aaa tta aag ggc tat gcc cat tgg cca gcg agg att gaa cat gtc       96Ala Lys Leu Lys Gly Tyr Ala His Trp Pro Ala Arg Ile Glu His Val

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50                  55                  60agg ttc ggc aag cct aac aag agg cgc ggc ttc agt gag ggg ctg tgg      240Arg Phe Gly Lys Pro Asn Lys Arg Arg Gly Phe Ser Glu Gly Leu Trp65                  70                  75                  80gag atc gag cac gac cct atg gtt gag gcc tcc cct tgc ctg tgc cca      288Glu Ile Glu His Asp Pro Met Val Glu Ala Ser Pro Cys Leu Cys Pro

            85                  90                  95gat gag gag cag ctt tgt gcc gag gag cca ggg cca gga gag gag cca      336Asp Glu Glu Gln Leu Cys Ala Glu Glu Pro Gly Pro Gly Glu Glu Pro

        100                 105                 110gag ccg ggg cag gag ctg gag ccg gaa tcc agg cct gag ctg gaa tcc      384Glu Pro Gly Gln Glu Leu Glu Pro Glu Ser Arg Pro Glu Leu Glu Ser

    115                 120                 125atg cct gag ctg gag gca gaa ccg agg cct gag aaa gag tgt gag cag      432Met Pro Glu Leu Glu Ala Glu Pro Arg Pro Glu Lys Glu Cys Glu Gln

130                 135                 140gag ccg gag cag gag ccg gag cag gag ccg gag cag gag ctg gag cag      480Glu Pro Glu Gln Glu Pro Glu Gln Glu Pro Glu Gln Glu Leu Glu Gln145                 150                 155                 160gag ccg gag ctg gag ccg gag ccg gag ccg gag ccg gag ccg gag ccg      528Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

            165                 170                 175gag ccc gag ccc gag ccg gag ccg gag ccc cag cct gcc tat gac cta      576Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Gln Pro Ala Tyr Asp Leu

        180                 185                 190ctg gat gcc aag gag gag cct ggc ctc att gag gcc gag cca gga gat      624Leu Asp Ala Lys Glu Glu Pro Gly Leu Ile Glu Ala Glu Pro Gly Asp

    195                 200                 205cag caa gcc gag caa gtg cga gag cag cac gct gaa gct gag gtc atg      672Gln Gln Ala Glu Gln Val Arg Glu Gln His Ala Glu Ala Glu Val Met

210                 215                 220gct gta gtg gag gag ccg gag agt ctg aag agg agc gcg gag gat gaa      720Ala Val Val Glu Glu Pro Glu Ser Leu Lys Arg Ser Ala Glu Asp Glu225                 230                 235                 240cag cct cac agt cct ccc aaa cgg ccc agg gag gcg gcg cct ggc gcg      768Gln Pro His Ser Pro Pro Lys Arg Pro Arg Glu Ala Ala Pro Gly Ala

            245                 250                 255ctg gag atg gag ccg gct gga gag cgc gag gca gag gcc tgc ccc ttc      816Leu Glu Met Glu Pro Ala Gly Glu Arg Glu Ala Glu Ala Cys Pro Phe

        260                 265                 270gtg gag gag cct gac caa gcc cag gaa cag cag act ccg ttg gaa gaa      864Val Glu Glu Pro Asp Gln Ala Gln Glu Gln Gln Thr Pro Leu Glu Glu

    275                 280                 285gag gcc aca gag gag gca gtc cag ggc ctg atg gtt gga gaa atc gaa      912Glu Ala Thr Glu Glu Ala Val Gln Gly Leu Met Val Gly Glu Ile Glu

290                 295                 300ggc ctg tag                                                          921Gly Leu305<210>2<211>306<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ser Cys Phe Ser Arg Pro Lys Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val Phe1               5                   10                  15Ala Lys Leu Lys Gly Tyr Ala His Trp Pro Ala Arg Ile Glu His Val

        20                  25                  30Thr Glu Pro Asn Arg Tyr Gln Val Phe Phe Phe Gly Thr His Glu Thr

    35                  40                  45Ala Leu Leu Gly Pro Lys His Leu Phe Pro Tyr Glu Glu Ser Lys Glu

50                  55                  60Arg Phe Gly Lys Pro Asn Lys Arg Arg Gly Phe Ser Glu Gly Leu Trp65                  70                  75                  80Glu Ile Glu His Asp Pro Met Val Glu Ala Ser Pro Cys Leu Cys Pro

            85                  90                  95Asp Glu Glu Gln Leu Cys Ala Glu Glu Pro Gly Pro Gly Glu Glu Pro

        100                 105                 110Glu Pro Gly Gln Glu Leu Glu Pro Glu Ser Arg Pro Glu Leu Glu Ser

    115                 120                 125Met Pro Glu Leu Glu Ala Glu Pro Arg Pro Glu Lys Glu Cys Glu Gln

130                 135                 140Glu Pro Glu Gln Glu Pro Glu Gln Glu Pro Glu Gln Glu Leu Glu Gln145                 150                 155                 160Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

            165                 170                 175Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Gln Pro Ala Tyr Asp Leu

        180                 185                 190Leu Asp Ala Lys Glu Glu Pro Gly Leu Ile Glu Ala Glu Pro Gly Asp

    195                 200                 205Gln Gln Ala Glu Gln Val Arg Glu Gln His Ala Glu Ala Glu Val Met

210                 215                 220Ala Val Val Glu Glu Pro Glu Ser Leu Lys Arg Ser Ala Glu Asp Glu225                 230                 235                 240Gln Pro His Ser Pro Pro Lys Arg Pro Arg Glu Ala Ala Pro Gly Ala

            245                 250                 255Leu Glu Met Glu Pro Ala Gly Glu Arg Glu Ala Glu Ala Cys Pro Phe

        260                 265                 270Val Glu Glu Pro Asp Gln Ala Gln Glu Gln Gln Thr Pro Leu Glu Glu

    275                 280                 285Glu Ala Thr Glu Glu Ala Val Gln Gly Leu Met Val Gly Glu Ile Glu

290                 295                 300Gly Leu305

Claims (14)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人hWHSRP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.1中核苷酸1-921位的序列。

4.一种分离的hWHSRP蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

10.一种产生具有hWHSRP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有hWHSRP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hWHSRP蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hWHSRP蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达hWHSRP蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有hWHSRP蛋白活性的多肽。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸1-921位。

12.一种能与权利要求4所述的hWHSRP蛋白多肽特异性结合的抗体。

13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。