CN1328134A - 一种蛋白激酶编码序列,其编码的多肽、制法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种新的蛋白激酶基因家族的成员人KID－1。本发明提供了该新蛋白激酶的cDNA编码序列、该序列编码的多肽,以及利用重组技术生产所述的新的人蛋白激酶的方法。本发明还提供了这种新人蛋白激酶的应用。

Description

一种蛋白激酶编码序列，其编码的多肽、制法及用途

本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。更具体地说，本发明的多肽涉及蛋白激酶家族的一个新成员。

人的学习和记忆功能主要由中枢神经系统控制，神经系统的基本结构是神经细胞，中枢系统神经细胞发生病变将导致癫痫(Int Rev Neurobiol，2001，237-252)、痴呆(Trends Neurosci，2000，23(11)：542-549；)、记忆力衰退、脊髓截瘫、脑梗塞乃至脑瘤等疾病。神经细胞是靠突触相互联系的，因而神经细胞突触被认为是信息存储位点(1991，Principles of Neural Science，pp.1009-1031.)。神经系统发育成熟后，虽然神经细胞胞体是一个相对固定的成分，但是每一个神经细胞都保留着形成新的突触和新的突触连接的能力，即突触可塑性，因此突触回路一直处于被修饰状态。这样，成年人就能学习掌握新信息、新技术并运用它们(Gordon.M.Sheperd，Neurobiology)。然而，突触可塑性同生物体内其它各项活动一样，通常是由细胞信号传导途径控制的，而蛋白磷酸化被认为是神经信号传导系统中的重要部分(1989，FASEB J.3，1583-1592)，因此人们都在寻找在脑中表达的磷酸激酶。

PIM—1就是具有上述性质的基因，这是一个在海马中诱导表达的蛋白激酶(1999，EMBO，VOL.18，pp.3359-3369)。PIM(Moloney鼠白血病前病毒综合位点基因)是一类具有蛋白激酶特性的前癌基因，最初由Selten，G.等人从白血病病毒诱导的Moloney鼠淋巴细胞瘤中分离得到(Cell(1986)46，603-611)。随后，PIM家族其它成员相继被发现：1995年van der Lugt，N.M.等人克隆到了小鼠的Pim-2(EMBO J.14(11)，2536-2544(1995))，1998年，Jonathan D.Feldmant等人则采用膜去极化的方法从大鼠PC12和脑细胞中分离得到了PIM家族的新成员KID-1(1998，J Biol Chem，273(26)，16535)，即大鼠PIM-3。PIM家族成员在人体中表达的研究也在不断发展：1987年，Domen J克隆并研究了人PIM-1cDNA(Oncogene Res，1987，1(1)：103-112)；1999年，Baytel D等人又克隆到了人PIM-2并研究了其在精子细胞中的表达(Biochim Biophys Acta1998，1442(2-3)：274-85；2000，Oncogene，19(9)：1215-1224)。但是到目前为止，尚没有人报导过本发明的人KID-1编码序列或其多肽。

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码蛋白激酶基因家族的一个新成员，被命名为hKID-1(human Kinase Induced by Depolarization-1)。

本发明的另一个目的是提供一种新的蛋白激酶家族成员，该酶被命名为hKID-1。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人蛋白激酶的方法。

本发明还涉及这种人蛋白激酶的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人KID-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列杂交。

在本发明中，“分离”或“纯化”的DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的KID-1蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO：6氨基酸序列或其活性片段、其活性衍生物。

在本发明中，术语“KID-1蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有KID-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：5的简并序列。该简并序列是指，位于SEQID NO：5序列的编码框5-994位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQ ID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人KID-1相同功能的蛋白的、SEQID NO：5序列的变异形式。这些变异包括(但并不限于)：若干个(通常为1—90个，较佳地1—60个，更佳地1—20个，最佳地1—10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与hKID-1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗hKID-1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有KID-1蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有KID-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成KID-1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成KID-1蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达KID-1蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有KID-1蛋白活性的多肽。

本发明还提供hKID-1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然hKID-1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括hKID-1多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内hKID-1的表达。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有hKID-1多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码hKID-1的核酸分子。

本发明还包括检测hKID-1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hKID-1多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对hKID-1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于hKID-1基因产物或片段。较佳地，指那些能与hKID-1基因产物或片段结合但不识别或结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制hKID-1蛋白的分子，也包括那些并不影响hKID-1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的hKID-1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的hKID-1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达hKID-1或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHvbridomas.Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断hKID-l功能的抗体以及不影响hKID-1功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用hKID-1基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与hKID-1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人KID-1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

得到了全长的cDNA分子后就可以与特定载体连接，制成探针或作为微矩阵的底物以获得一系列相关核苷酸序列；得到了蛋白后，可制成抗体、受体、拮抗剂、药物或试剂盒诊断、治疗相关疾病。

以本发明的人KID-1蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人KID-1蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为998个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO：5，其中开放读框位于5-994位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-CGCGATGCTGCTCTCCAAGT TCG-3′(SEQ ID NO：1)为正向引物，寡核苷酸B1：5′-TAGCGGTGGTAGCG GATCCACTC-3(SEQ ID NO：2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、74℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。再用一对寡核苷酸为引物——A2：5′-GAGAGCTCAA GCTCATCGCC TTC-3′(SEQ ID NO：3)为正向引物，寡核苷酸B2：5′-CTAACAAGGT CTCGCTGCTGGAC-3′(SEQ ID NO：4)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的长度分别为678bp、447bp的核苷酸片段，通过拼接得到长度为998bp的目的片段。

分析本发明hKID-1蛋白，发现其序列中同时存在丝/苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点，如Ser³⁵、Ser²¹⁵、Ser²⁶⁷、Ser²⁷⁹、Ser²⁸³、Ser²⁸⁷、Ser³²²、Ser³²⁵；Thr⁷⁷、Thr¹³⁷、Thr³¹⁴、Thr³²⁴和Tyr⁴⁰、Tyr²⁰⁵等。此外，其氨基酸序列中还存在被认为是磷酸激酶的特征性序列[LIV]-G-{P}-G-{P}-[FYWMGSTNH]-[SGA]-{PW}-[LIVCAT]-{PD}-x-[GSTACLIVMFY]-x(5，18)-[LIVMFYWCSTAR]-[AIVP]-[LIVMFAGCKR]-K.[注：该序列中x为任意氨基酸，“5”等数字为氨基酸数目，“[LIV]”表示从这3个氨基酸中任选一个氨基酸]。在本发明中符合上述模式的序列片段是：LGSGGFGTVYAGSRIADGLPVAVK(SEQ ID NO：6中46-69位)和VVHRDIKDENLLV(SEQ ID NO：6中166-178位)。

蛋白磷酸化是神经信号传导系统中一个至关重要的部分，而膜去极化又可导致调节神经细胞突触可塑性基因的表达发生变化(1989，FASEB J.3，1583-1592)，本发明的人KID-1具有细胞膜蛋白激酶的结构特征并与去极化诱导的蛋白激酶rKID-1高度同源，所以认为它与神经细胞突触可塑性有密切关系。

突触可塑性是指神经细胞具有形成新的突触及突触回路的功能。神经细胞突触被认为是信息存储位点(1991，Principles of Neural Science，pp.1009-1031.)。由于神经细胞突触具有可塑性，所以神经系统发育成熟后，每一个神经细胞都保留着形成新突触及新突触连接的能力，因而成年人仍然能够不断学习新技术、新内容并记住它们、运用它们(Gordon.M..Sheperd，Neurobiology)。因此，可以利用本发明的hKID-1正确引导神经元形成新的突触，以加强记忆力或用于治疗神经细胞损伤及相关疾病。

研究表明，异常的突触可塑性会导致一系列疾病的产生。痴呆与海马突触可塑性发生明显变化有关(Trends Neurosci，2000，23(11)：542-549)。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)俗称老年性痴呆症，通常是由于成年人大脑中细胞持续高可塑性而导致的(Neurobiol Aging，2000，21(6)783-796)。此外，异常的突触可塑性还将导致神经元生长紊乱(Brain Res，2000，886(1-2)：47-53)从而引发脑梗塞、脊髓截瘫、脑瘤等疾病。因此，可将本发明的hKID-1蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等作为药物，用于诊断和治疗老年性痴呆、记忆力衰退、脑梗塞、脊髓截瘫、脑瘤等疾病。

最后，本发明的人KID-1可作为靶蛋白，筛选对诊断和治疗老年性痴呆、记忆力衰退、脑梗塞、脊髓截瘫、脑瘤及神经元术后恢复有重要价值的小分子药物。

表1为本发明的hKID-1与PIM家族某些成员的氨基酸序列同源比较，相同的氨基酸在用¨”标出，相似的氨基酸用“.”标出。表2为hKID-1与rKID-1的氨基酸序列同源比较，相同的氨基酸在两个序列之间用“｜”标出。相似的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1

hKID-1的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人脑λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5′-CGCGATGCTG CTCTCCAAGT TCG-3′(SEQ ID NO：1)为正向引物，寡核苷酸B1：5′-TAGCGGTGGTAGCG GATCCACTC-3′(SEQID NO：2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、74℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。再用一对寡核苷酸为引物——A2：5′-GAGAGCTCAA GCTCATCGCCTTC-3′(SEQ ID NO：3)为正向引物，寡核苷酸B2：5′-CTAACAAGGT CTCGCTGCTGGAC-3′(SEQ ID NO：4)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的长度分别为678bp、447bp的核苷酸片段，通过拼接得到长度为998bp的目的片段。

2.PCR产物的测序

将如上获得的PCR扩增产物与pGEM-T^载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(PHarmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiThermEXCEL^TM DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共998bp，详细序列见SEQ ID NO：5，其中开放读框位于5-994位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出hKID-1的氨基酸序列，共330个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO：6。

实施例2

同源比较

用hKID-1的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations＋PDB＋SwissProt＋Spupdate＋PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它与PIM家族成员显示了较高的同源性，如用PCGENE软件分析，它与人PIM—1(gi|4505811)基因在蛋白水平上显示了64.2％的同一性(表1)，与人PIM—2(gi|6470337)基因在蛋白水平上显示了51.8％的同一性(表1)，尤其是与大鼠的基因KID-1(gi|12083582)在蛋白水平上显示了92％的同一性(表2)。

分析本发明hKID-1蛋白，发现其序列中同时存在丝/苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点，如Ser³⁵、Ser²¹⁵、Ser²⁶⁷、Ser²⁷⁹、Se²⁸³、Ser²⁸⁷、Ser³²²、Ser³²⁵；Thr⁷⁷、Thr¹³⁷、Thr¹³⁷、Thr³¹⁴、Thr³²⁴和Tyr⁴⁰、Tyr²⁰⁵等。此外，其氨基酸序列中还存在被认为是磷酸激酶的特征性序列[LIV]-G-{P}-G-{P}-[FYWMGSTNH]-[SGA]-{PW}-[LIVCAT]-{PD}-x-[GSTACLIVMFY]-x(5，18)-[LIVMFYWCSTAR]-[AIVP]-[LIVMFAGCKR]-K.[注：该序列中x为任意氨基酸，“5”等数字为氨基酸数目，“[LIV]”表示从这3个氨基酸中任选一个氨基酸]。在大鼠KID-1氨基酸序列中符合上述模式的序列片段是：LGSGGFGTVYAGSRIADGLPVAVK(SEQ ID NO：11中46-69位)和VVHRDIKDENLLV(SEQ ID NO：11中166-178位)；在本发明中符合上述模式的序列片段是：LGSGGFGTVYAGSRIADGLPVAVK(SEQ ID NO：6中46-69位)和VVHRDIKDENLLV(SEQ ID NO：6中166-178位)。这些说明本发明的hKID-1也属于PIM家族。

PIM(provirus integration site for Moloney murine leukemia virus)即Moloney鼠白血病前病毒综合位点。PIM-1最早是由Selten，G.等人在1986年从白血病病毒诱导的Moloney鼠淋巴细胞瘤中分离得到(Cell(1986)46，603-611)。Meeker TC等人推测人PIM—1基因与许多蛋白激酶同源并与SP1蛋白相结合(J Cell Biochem 1987 Oct；35(2)：105-12)。Baytel D经过研究认为人PIM-2基因是丝/苏氨酸激酶(Biochem Biophys Acta，(1998)1442(2-3)：274-285)。

Jonathan D.Feldmant等人发现海马经长期增效剂(long-term potentiation)刺激后会表达KID-1(PIM-3)，并认为KID-1(PIM-3)是通过磷酸化靶蛋白的方法在突触活性中起决定性作用(EMBO1999，18：3359-3369)。研究表明，rKID-1是一个能催化组蛋白磷酸化和自身磷酸化立即早期基因，表达谱分析表明rKID-1在脑中含量较高，可用红藻氨酸处理的方法在海马及大脑皮层中特异表达rKID-1(J Biol Chem，1998，273(26)：16535-16543)。蛋白磷酸化是神经信号传导系统中一个至关重要的部分，而膜去极化又可导致调节神经细胞突触可塑性基因的表达发生变化(1989，FASEB J.3，1583-1592)，rKID—1是细胞膜蛋白激酶和通过去极化诱导的立即早期基因，所以认为它对神经细胞突触可塑性有重要意义(J BiolChem，1998，273(26)：16535-16543)。

突触可塑性是指神经细胞具有形成新的突触及突触回路的功能。研究表明，痴呆与海马突触可塑性发生明显变化有关(Trends Neurosci，2000，23(11)：542-549)。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)通常是由于成年人大脑中细胞持续高可塑性而导致的(Neurobiol Aging，2000，21(6)783-796)。此外，异常的突触可塑性将导致神经元生长紊乱从而引发脑梗塞、脊髓截瘫、脑神经瘤(Brain Res，2000，886(1-2)：47-53)等。因此，可将本发明的hKID-1蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等作为药物，用于诊断和治疗老年性痴呆、记忆力衰退、脑梗塞、脊髓截瘫、脑瘤等疾病。

实施例3

hKID-1在大肠杆菌中的表达

编码hKID-1的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。

5’寡核苷酸引物序列为

5’-GTCGGTCGAC ATGCTGCTCT CCAAGTTCG-3’(SEQ ID NO：7)

该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的KID-1编码序列的19个核苷酸：

3’寡核苷酸引物序列为

5’-CAGCAAGCTT CAAGGTCTAG CTGCTAGAC-3’(SEQ ID NO：8)

该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和KID-1的编码序列。

限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用SalI和HindIII消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明hKID-1的cDNA插入片段已正确装入载体。

过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的KID-1。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱KID-1。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为36.3KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：6的序列一致。

实施例4

hKID-1在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，将编码hKID-1的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5’-GTCGAAGCTT ATGCTGCTCT CCAAGTTCG-3’(SEQID NO：9)

该引物含有HindIII限制性限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的KID-1编码序列的19个核苷酸；

3’端引物序列为：

5’-CAGCGAATTC CAAGGTCTAG CTGCTAGAC-3’(SEQ ID NO：10)

该引物含有EcoRI限制性限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和KID-1的编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(f1ori)、一个病毒复制起点(SV40ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用HindIII、EcoRI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证结果表明KID-1的cDNA插入片段已正确装入载体。

质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养：对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为36.3KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：6的序列一致。

实施例5：

表达谱分析

多种组织Northern(MTNTM)印迹膜(16种组织)购自Clontech公司，以引物A1(5’-CGCGATGCTG CTCTCCAAGT TCG-3’)和B1(5’-TAGCGGTGGT AGCGGATCCA CTC-3’)从人骨骼肌cDNA文库(Clontech)中扩增得到678bp的片段，以此片段为探针，用α-³²P-dATP(DuPont公司)对其进行随机引物标记，条件为37℃1小时，具体操作见MegaprimeDNA标记系统说明书(Amersham)。Northern杂交按用户手册操作。主要步骤如下：(1)配制MTN杂交液(终浓度如下：5XSSPE，10Xdenhardt′s，100μg/mlCTDNA，50％甲酰胺，2％SDS)，68℃预热杂交液，彻底溶解沉淀物。(2)烫膜，倒入少许烧开的0.05％SDS溶液于膜上，震荡、冷却后测信号(3)将尼龙膜放在杂交管中，加入预杂交液，42℃预杂交12小时(4)变性后探针加入杂交管中，42℃杂交24小时(5)洗膜，42℃，用2XSSC，0.05％SDS溶液洗两次，每次20分钟(6)用X光片进行放射自显影。

结果显示hKID-1基因为广谱表达的转录本，在16种组织中均有表达，在外周血白细胞、骨骼肌、胎盘中表达量稍高，在脑中、睾丸表达量很高。

实例6：

作为微矩阵的底物

微矩阵(Microarrays)，又称DNA芯片。芯片可通过使用喷墨技术及一系列化学方法如射线、化学、热力学、机械方法等把样品固定在底物上得到，形成的元件有点状、条形等等。一块典型的芯片通常含有一定数量的元件，可通过手工或用适当的仪器设备制备。杂交反应后，洗去未结合的探针，然后用扫描仪来检测发生杂交反应的元件及反应的程度。探针与每一个芯片元件的互补性和结合量都可通过对扫描出的图像的分析来判断。

全长cDNA、EST、或基因片段都可以作为固定于底物上的样品。适合于杂交的片段可通过用一些著名的生物软件(如LASERGENE SOFTWARE(DNASTAR))，来选择。这些全长cDNA、EST、与本发明的核酸序列相关的片断、或与这项发明有关的cDNA库中随机选出的片段被有序的排列于玻璃等载体上。cDNA固着于玻片的方法是：紫外线交联、热学、化学处理、干燥(Schena，M.et al.(1995)Science270：467-470；and Shalon，D.et al.(1996)Genome Res.6：639-645.)等。将探针用荧光标记后，再与固着地反应元件杂交。杂交结果可用于推断基因功能，理解疾病产生的基因基础，诊断疾病，并可改进及监测药剂的活性。

本发明的hKID-1核苷酸序列或其全长片段可作微矩阵的对象，检测出基因变异、突变及多态现象，从而对相关疾病，如老年性痴呆、记忆力衰退、脑梗塞、脊髓截瘫、脑瘤的诊断治疗起辅助作用。

实施例7：

试剂盒的制备

试剂盒1：

它含有(1)特异性扩增人KID-1的引物对，和使用说明。该试剂盒还可含有或不含有将mRNA逆转录成cDNA的所需试剂。其中，该特异性引物的序列衍生自SEQ ID NO：5的序列。对逆转录成的cDNA进行特异性扩增，以检测样品中是否含有RTN4B的核酸序列。该试剂盒还可含有进行PCR反应所需的其他试剂，例如缓冲液等。

此外，较佳地，至少一个所用的引物跨越了两个外显子，因为此时对应于人KID-1的基因组序列将不产生扩增产物。

试剂盒2：

该试剂盒含有针对人KID-1的特异性的抗体(例如实施例5中制备的多克隆抗体，或者用标准的杂交瘤技术产生的抗人KID-1的单克隆抗体)，和使用说明。该试剂盒用于直接检测样品中是否存在人KID-1蛋白。先通过特异性免疫反应形成免疫复合物，然后用常规技术检测免疫复合物。

试剂盒3：

该试剂盒含有可特异性地与人KID-1的mRNA杂交的探针。它还可含有或不含有杂交缓冲液。该试剂盒通过核酸分子与人KID-1特异性探针之间的杂交反应来检测样品中是否存在人KID-1的核酸分子。

试剂盒也可用于检测出基因变异、突变及多态现象，并检测出一系列与本发明的hKID-1相关的基因，从而对相关疾病，如老年性痴呆、记忆力衰退、脑梗塞、脊髓截瘫、脑瘤等疾病的诊断、治疗起辅助作用。

实例8：

基因定位

发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins UniversityWelch Medical Library在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。

实施例9：

制备抗体

将按实例3、实例4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀hKID-1基因翻译产物的能力加以评估。针对本发明人KID-1的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

实例10：

制成药物

本发明的hKID-1蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等可作为药物，用于诊断和治疗老年性痴呆、记忆力衰退、脑梗塞、脊髓截瘫、脑瘤等疾病。本发明的人KID-1蛋白多肽还可作为靶蛋白，筛选对诊断和治疗上述疾病有重要价值的小分子药物。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

此外，本发明人KID-1核酸(编码序列或反义序列)可以直接引入细胞，以提高人KID-1的表达水平或者抑制人KID-1的过度表达。本发明的人KID-1蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人KID-1缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

当本发明的人KID-1蛋白多肽被用作药物时，治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重—约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明涉及的序列信息分析如下：(1)SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征

 (A)长度：23碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CGCGATGCTG CTCTCCAAGT TCG                  23(2)SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征

 (A)长度：23碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：2TAGCGGTGGT AGCGGATCCA CTC                  23(3)SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征

 (A)长度：23碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GAGAGCTCAA GCTCATCGCC TTC                  23(4)SEQ ID NO：4的信息   (i)序列特征

 (A)长度：23碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：4CTAACAAGGT CTCGCTGCTG GAC                   23(5)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：998bp

 (B)类型：核酸

 (C)链性：双链

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：51   CGCGATGCTG  CTCTCCAAGT  TCGGCTCCCT  GGCGCACCTC  TGCGGGCCCG  GCGGCGTGGA61  CCACCTCCCG  GTGAAGATCC  TGCAGCCAGC  CAAGGCGGAC  AAGGAGAGCT  TCGAGAAGGC121  GTACCAGGTG  GGCGCCGTGC  TGGGTAGCGG  CGGCTTCGGC  ACGGTCTACG  CGGGTAGCCG181  CATCGCCGAC  GGGCTCCCGG  TGGCTGTGAA  GCACGTGGTG  AAGGAGCGGG  TGACCGAGTG241  GGGCAGCCTG  GGCGGCGCGA  CCGTGCCCCT  GGAGGTGGTG  CTGCTGCGCA  AGGTGGGCGC301  GGCGGGCGGC  GCGCGCGGCG  TCATCCGCCT  GCTGGACTGG  TTCGAGCGGC  CCGACGGCTT361  CCTGCTGGTG  CTGGAGCGGC  CCGAGCCGGC  GCAGGACCTC  TTCGACTTTA  TCACGGAGCG421  CGGCGCCCTG  GACGAGCCGC  TGGCGCGCCG  CTTCTTCGCG  CAGGTGCTGG  CCGCCGTGCG481  CCACTGCCAC  AGCTGCGGGG  TCGTGCACCG  CGACATTAAG  GACGAAAATC  TGCTTGTGGA541  CCTGCGCTCC  GGAGAGCTCA  AGCTCATCGC  CTTCTGTTCG  AGCGTGCTCT  GCTCATGTGG601  CGCGCGTGCT  AAGCACTACA  CTGACTTCGA  CGGCACCCGA  GTGTACAGCC  CCCCGGAGTG661  GATCCGCTAC  CACCGCTACC  ACGGGCGCTC  GGCACCTGTG  TGGTCGCTGG  GCGTGCTTCT721  CTACGATATG  GTGTGTGGGG  ACATCCCCTT  CGAGCAGGAC  GAGGAGATCC  TCCGAGGCCG781  CCTGCTCTTC  CGGAGGAGGG  TCTCTCCAGA  GTGCCAGCAG  CTGATCCGGT  GGTGCCTGTC841  CCTGCGGCCC  TCAGAGCGGC  CGTCGCTGGA  TCAGATTGCG  GCCCATCCCT  GGATGCTGGG901  GGCTGACGGG  GGCGCCCCGG  AGAGCTGTGA  CCTGCGGCTG  TGCACCCTCG  ACCCTGATGA961  CGTGGCCAGC  ACCACGTCCA  GCAGCGAGAC  CTTGTGAG(6)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：330个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：61 Met Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ser Leu Ala His Leu Cys Gly Pro16 Gly Gly Val Asp His Leu Pro Val Lys Ile Leu Gln Pro Ala Lys31 Ala Asp Lys Glu Ser Phe Glu Lys Ala Tyr Gln Val Gly Ala Val46 Leu Gly Ser Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr Ala Gly Ser Arg Ile61 Ala Asp Gly Leu Pro Val Ala Val Lys His Val Val Lys Glu Arg76 Val Thr Glu Trp Gly Ser Leu Gly Gly Ala Thr Val Pro Leu Glu91 Val Val Leu Leu Arg Lys Val Gly Ala Ala Gly Gly Ala Arg Gly106 Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg Pro Asp Gly Phe Leu121 Leu Val Leu Glu Arg Pro Glu Pro Ala Gln Asp Leu Phe Asp Phe136 Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Asp Glu Pro Leu Ala Arg Arg Phe151 Phe Ala Gln Val Leu Ala Ala Val Arg His Cys His Ser Cys Gly166 Val Val His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Leu Leu Val Asp Leu181 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Leu Ile Ala Phe Cys Ser Ser Val Leu196 Cys Ser Cys Gly Ala Arg Ala Lys His Tyr Thr Asp Phe Asp Gly211 Thr Arg Val Tyr Ser Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr226 His Gly Arg Ser Ala Pro Val Trp Ser Leu Gly Val Leu Leu Tyr241 Asp Met Val Cys Gly Asp Ile Pro Phe Glu Gln Asp Glu Glu Ile256 Leu Arg Gly Arg Leu Leu Phe Arg Arg Arg Val Ser Pro Glu Cys271 Gln Gln Leu Ile Arg Trp Cys Leu Ser Leu Arg Pro Ser Glu Arg286 Pro Ser Leu Asp Gln Ile Ala Ala His Pro Trp Met Leu Gly Ala301 Asp Gly Gly Ala Pro Glu Ser Cys Asp Leu Arg Leu Cys Thr Leu316 Asp Pro Asp Asp Val Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ser Glu Thr Leu(7)SEQ ID NO：7的信息(i)序列特征

 (A)长度：29碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GTCGGTCGAC ATGCTGCTCT CCAAGTTCG                  29(8)SEQ ID NO：8的信息(i)序列特征

 (A)长度：29碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CAGCAAGCTT CAAGGTCTAG CTGCTAGAC                  29(9)SEQ ID NO：9的信息(i)序列特征

 (A)长度：29碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GTCGAAGCTT ATGCTGCTCT CCAAGTTCG                  29(10)SEQ ID NO：10的信息(i)序列特征

 (A)长度：29碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑：线性(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：CAGCGAATTC CAAGGTCTAG CTGCTAGAC                  29(11)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：326个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：111 Met Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ser Leu Ala His Leu Cys Gly Pro16 Gly Gly Val Asp His Leu Pro Val Lys Ile Leu Gln Pro Ala Lys31 Ala Asp Lys Glu Ser Phe Glu Lys Val Tyr Gln Val Gly Ala Val46 Leu Gly Ser Gly Gly Phe Gly Thr Val Tyr Ala Gly Ser Arg Ile61 Ala Asp Gly Leu Pro Val Ala Val Lys His Val Val Lys Glu Arg76 Val Thr Glu Trp Gly Ser Leu Gly Gly Met Ala Val Pro Leu Glu91 Val Val Leu Leu Arg Lys Val Gly Ala Ala Gly Gly Ala Arg Gly106 Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg Pro Asp Gly Phe Leu121 Leu Val Leu Glu Arg Pro Glu Pro Ala Gln Asp Leu Phe Asp Phe136 Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Asp Glu Pro Leu Ala Arg Arg Phe151 Phe Ala Gln Val Leu Ala Ala Val Arg His Cys His Asn Cys Gly166 Val Val His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Leu Leu Val Asp Leu181 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Val196 Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Asp Phe Asp Gly Thr Arg Val Tyr211 Ser Pro Pro Glu Trp Ile Arg Tyr His Arg Tyr His Gly Arg Ser226 Ala Thr Val Trp Ser Leu Gly Val Leu Leu Tyr Asp Met Val Cys241 Gly Asp Ile Pro Phe Glu Gln Asp Glu Glu Ile Leu Arg Gly Arg256 Leu Phe Phe Arg Arg Arg Val Ser Pro Glu Cys Gln Gln Leu Ile271 Glu Trp Cys Leu Ser Leu Arg Pro Ser Glu Arg Pro Ser Leu Asp286 Gln Ile Ala Ala His Pro Trp Met Leu Gly Thr Glu Gly Ser Val301 Pro Glu Asn Cys Asp Leu Arg Leu Cys Ala Leu Asp Thr Asp Asp316 Gly Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ser Glu Ser Leu

   表1人KID-1与PIM家族某些成员氨基酸序列的同源比较人KID-1    MLLSKFGSLAHLCGPGGVDHLPVKILQPAKADKESFEKAYQVGAVLGSGG    50大鼠KID-1  MLLSKFGSLAHLCGPGGVDHLPVKILQPAKADKESFEKVYQVGAVLGSGG    50人PIM-1    MLLSKINSLAHL-RAAPCNDLHATKLAPGK-EKEPLESQYQVGPLLGSGG    48人PIM-2    MLTKPLQ--------GPPAPPGTPTPPPGGKDREAFEAEYRLGPLLGKGG    42

       **. .         .  .   .    .*.  ..*..* *.. *..**.**人KID-1    FGTVYAGSRIADGLPVAVKHVVKERVTEWGSL-GGATVPLEVVLLRKVGA    99大鼠KID-1  FGTVYAGSRIADGLPVAVKHVVKERVTEWGSL-GGMAVPLEVVLLRKVGA    99人PIM-1    FGSVYSGIRVSDNLPVAIKHVEKDRISDWGELPNGTRVPMEVVLLKKVSS    98人PIM-2    FGTVFAGHRLTDRLQVAIKVIPRNRVLGWSPLSDSVTCPLEVALLWKVGA    92

       **.*..* *..* *.**.*.  ..*..*.  *..    *.**.** **..人KID-1    AGGARGVIRLLDWFERPDGFLLVLERPEPAQDLFDFITERGALDEPLARR   149大鼠KID-1  AGGARGVIRLLDWFERPDGFLLVLERPEPAQDLFDFITERGALDEPLARR   149人PIM-1    --GFSGVIRLLDWFERPDSFVLILERPEPVQDLFDFITERGALQEELARS   146人PIM-2    GGGHPGVIRLLDWFETQEGFMLVLERPLPAQDLFDYITEKGPLGEGPSRC   142

       * .**********...*.*.****  *.*****.***.*.* *  .*人KID-1    FFAQVLAAVRHCHSCGVVHRDIKDENLLVDLRSGELKLIAFCSSVLCSCG   199大鼠KID-1  FFAQVLAAVRHCHNCGVVHRDIKDENLLVDLRSGELKLIDFGSGAV----   195人PIM-1    FFWQVLEAVRHCHNCGVLHRDIKDENILIDLNRGELKLIDFGSGAL----   192人PIM-2    FFGQVVAAIQHCHSRGVVHRDIKDENILIDLRRGCAKLIDFGSGAL----   188

      ** **..*..***. **.********.*.**..*  ***.*  *...人KID-1    ARAKHYTDFDGTRVYSPPEWIRYHRYHGRSAPVWSLGVLLYDMVCGDIPF   249大鼠KID-1  LKDTVYTDFDGTRVYSPPEWIRYHRYHGRSATVWSLGVLLYDMVCGDIPF   245人PIM-1    LKDTVYTDFDGTRVYSPPEWIRYHRYHGRSAAVWSLGILLYDMVCGDIPF   242人PIM-2    LHDEPYTDFDGTRVYSPPEWISRHQYHALPATVWSLGILLYDMVCGDIPF   238

       ...   ****************. *.**..*.*****.************人KID-1    EQDEEILRGRLLFRRRVSPECQQLIRWCLSLRPSERPSLDQIAAHPWMLG   299大鼠KID-1  EQDEEILRGRLFFRRRVSPECQQLIEWCLSLRPSERPSLDQIAAHPWMLG   295人PIM-1    EHDEEIIRGQVFFRQRVSSECQHLIRWCLALRPSDRPTFEEIQNHPWMQD   292人PIM-2    ERDQEILEAELHFPAHVSPDCCALIRRCLAPKPSSRPSLEEILLDPWMQT   288

       *.*.**. . . *. .**..*   ** .**. .**.**....*  .***.人KID-1    -ADGGAPESCDLRLCT--------------LDPDDVASTTSSSETL       330大鼠KID-1  -TEGSVPENCDLRLCA--------------LDTDDGASTTSSSESL       326人PIM-1    -VL-LPQETAEIHLHS--------------LSPGPSK--------        313人PIM-2    PAEDVTPQPLQRRPCPFGLVLATLSLAWPGLAPNGQKSHPMAMSQG       334

                    .    ..  . .  .              *...

      表2：人KID-1与大鼠KID-1的氨基酸序列同源比较人KID-1      -MLLSKFGSLAHLCGPGGVDHLPVKILQPAKADKESFEKAYQVGAVLGSGG -50|||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||大鼠KID-1    -MLLSKFGSLAHLCGPGGVDHLPVKILQPAKADKESFEKVYQVGAVLGSGG -50人KID-1      -FGTVYAGSRIADGLPVAVKHVVKERVTEWGSLGGATVPLEVVLLRKVGAA -100|||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||大鼠KID-1    -FGTVYAGSRIADGLPVAVKHVVKERVTEWGSLGGMAVPLEVVLLRKVGAA -100人KID-1      -GGARGVIRLLDWFERPDGFLLVLERPEPAQDLFDFITERGALDEPLARRF -150|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||大鼠KID-1    -GGARGVIRLLDWFERPDGFLLVLERPEPAQDLFDFITERGALDEPLARRF -150人KID-1      -FAQVLAAVRHCHSCGVVHRDIKDENLLVDLRSGELKLIAFCSSVLCSCGA -200|||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| | |大鼠KID-1    -FAQVLAAVRHCHNCGVVHRDIKDENLLVDLRSGELKLIDFGSGAVL---- -196人KID-1      -RAKHYTDFDGTRVYSPPEWIRYHRYHGRSAPVWSLGVLLYDMVCGDIPFE -250|||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||大鼠KID-1    -KDTVYTDFDGTRVYSPPEWIRYHRYHGRSATVWSLGVLLYDMVCGDIPFE -246人KID-1      -QDEEILRGRLLFRRRVSPECQQLIRWCLSLRPSERPSLDQIAAHPWMLGA -300||||||||||| |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||大鼠KID-1    -QDEEILRGRLFFRRRVSPECQQLIEWCLSLRPSERPSLDQIAAHPWMLGT -296人KID-1      -DGGAPESCDLRLCTLDPDDVASTTSSSETL -330| || ||||||| || || |||||||| |大鼠KID-1    -EGSVPENCDLRLCALDTDDGASTTSSSESL -326同一性：92％

Claims (13)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人KID-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，

该核苷酸序列与SEQ ID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列有至少85％的同源性；

或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQID NO：6所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列。

4.一种分离的hKID-1蛋白多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：6序列的多肽。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

6.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

9.一种产生具有hKID-1蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有hKID-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hKID-1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：5中从核苷酸5-994位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hKID-1蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达hKID-1蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有hKID-1蛋白活性的多肽。

10.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该方法可产生如序列为SEQID NO：5中从5-994位的核苷酸。

11.一种能与权利要求4所述的hKID-1蛋白多肽特异性结合的抗体。

12.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

13.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。