JP2005535572A - 組換え抗インターロイキン−９抗体 - Google Patents

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Abstract

本出願は、中和キメラおよびヒト化抗ヒトIL-9抗体、ならびにヒトIL-9上の中和エピトープを同定するための、ならびに喘息、気管支過敏症、アトピー性アレルギー、および他の関連障害を予防および治療するための医薬としてのそれらの使用について記載する。特に、後にMH9A3、MH9D1、およびMH9L1として同定された3種類のマウス抗ヒトIL-9抗体に由来する組換え抗体を開示する。

Description

本発明は、組換え抗体分子、特にヒトインターロイキン-9(IL-9)に対する特異性を有するヒト化およびキメラ抗体ならびに抗体断片に関する。また、本発明は、マウスおよびヒト抗体配列の合理的設計ホモロジーアラインメント、およびフレームワークライブラリーの逐次ファージディスプレーパニングを含む、そのような抗体を作製する方法に関する。抗体は、例えば、ヒト患者における喘息発作を治療および予防するのに有用である。特に、本発明は、後述のいくつかのマウス抗IL-9モノクローナル抗体、MH9A3、MH9D1、およびMH9L1に由来するヒト化およびキメラ抗体分子、ならびに喘息および他のアレルギー性障害、ならびに異常なムチン産生が関与する障害を治療する際の単独使用または他の喘息治療薬との併用法に関する。
本発明の好ましい非排他的実施形態には、患者における気管支過敏症、アトピー性アレルギー、および/または喘息を治療、予防、および/または改善するための本発明のヒト化およびキメラ抗体分子の使用が含まれる。本発明の付加的な好ましい非排他的実施形態には、ムチン過剰産生、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、上皮細胞過形成、過剰なT細胞、B細胞、好酸球、マクロファージ、単球、好中球、または肥満細胞活性を治療、予防、および/または改善するための本発明のヒト化およびキメラ抗体分子の使用が含まれる。
天然の免疫グロブリンは、酵素的切断によって誘導することができるFab、(Fab')2、FvおよびFc断片などのそれらの様々な断片を有することが何年にもわたって知られている。天然の免疫グロブリンは、2本のタンパク質鎖(重鎖および軽鎖)を有するY字型分子からなり、各上腕の末端に向かって一般的に可変領域として知られる抗原結合部位を有している。一般的に定常領域ドメインとして知られている構造の残部は、免疫グロブリンに関係するエフェクター機能を媒介する。
天然の免疫グロブリンは、アッセイ、診断、およびより限られた程度で治療に用いられてきた。しかしながら、そのような、特に治療における使用は、天然の免疫グロブリンのポリクローナルな性質によって妨げられてきた。明確な特異性のモノクローナル抗体の出現は、治療目的使用の機会を増加させた。しかしながら、大部分のモノクローナル抗体は、標的タンパク質によるげっ歯類の宿主動物の免疫化と、それに続く目的抗体を産生するげっ歯類の脾臓細胞とげっ歯類の骨髄腫細胞との融合を経て作製される。したがって、本質的にげっ歯類のタンパク質は当然ヒトにおいて抗原性であり、HAMA(ヒト抗マウス抗体)反応と呼ばれる望ましくない免疫反応を生じることが多い。
多くのグループが治療用抗体の免疫原性を減らすための技法を考案してきた。これらの技法は、一般に抗体分子のポリペプチド鎖をコードするDNA配列を操作するための組換えDNA技術を使用するものである。初期の方法は、げっ歯類の抗体の完全可変ドメインを含む抗原結合部位がヒト抗体に由来する定常ドメインに連結されたキメラ抗体を作製するものであった。このようなキメラ化手順を行う方法は、当技術分野において現在よく知られている。より最近のキメラ化手順は、Fc受容体に対して特異的な抗体の可変ドメインによりキメラ化された標的特異的抗体の両可変領域ドメインを含むヘテロ抗体をもたらした。米国特許第6,071,517号(参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
キメラ抗体が非ヒトアミノ酸配列、すなわち完全非ヒト可変ドメインのかなりの部分を依然として含むことを考えると、それらの抗体は多少のHAMA反応を依然として引き起こす可能性がある。したがって、他のグループは、げっ歯類のモノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)がヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域にグラフトされたヒト化版の抗体を開発した。例えば、Winter(EP-A-0239400)は、重鎖および軽鎖可変領域の各々に由来する3種類の相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)をグラフトするため、長いオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的変異誘発によってそのような改変を行うことを提案した。このようなCDRグラフト(grafted)ヒト化抗体は、それらが含む非ヒトアミノ酸配列の割合がかなり少ないことを考えると、キメラ抗体に比べてHAMA反応を引き起こす可能性があまりない。
ヒト化抗体が、それらの天然のまたはキメラ対応物よりも免疫原性でなかったにもかかわらず、多くのグループは、CDRグラフトヒト化抗体が結合親和性の著しい低下を示すことを発見した(例えば、Riechmann、他、Nature、332巻、323〜327ページ、1988年)。例えば、Reichmann他は、CDR領域単独の移動は、CDRグラフト生成物において満足な抗原結合活性を提供するには不十分であり、ヒト配列の27位のセリン残基を対応するラットフェニルアラニン残基に変換する必要もあることを見いだした。これらの結果は、CDR領域外部のヒト配列の残基への変化、特にCDR1に隣接するループにおける変化が、効果的な抗原結合活性を得るために必要であることを示した。たとえそうであっても、結合親和性は、元のモノクローナル抗体の結合親和性に比べて著しく低いままである。
ごく最近、Queen他(参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,530,101号)は、マウスMAb(抗Tac)のCDRをヒト免疫グロブリンのフレームワークおよび定常領域と組み合わせることにより、インターロイキン2受容体と結合するヒト化抗体の調製について記載した。ヒトフレームワーク領域は、抗Tac MAb配列との相同性を最大にするように選ばれた。さらに、コンピュータモデリングを用い、CDRまたは抗原と相互作用する可能性の高いフレームワークアミノ酸残基を同定し、ヒト化抗体におけるこれらの位置でマウスアミノ酸を使用した。得られたヒト化抗Tac抗体は、p55に対して3×109M-1の親和性を有すると報告されたが、これは、依然としてマウスMAbの親和性の約3分の1に過ぎない。
他のグループは、その場所の残基のアミノ酸同一性が、満足な結合親和性を持つCDRグラフト生成物を得ることに寄与する可能性のある可変領域のフレームワーク内(すなわち、CDRおよび可変領域の構造ループの外部)の別の位置を同定した。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,054,297号および第5,929,212号を参照されたい。依然として、特定のCDRグラフティング配置が所与の目的抗体に対してどの程度効果的であるかを前もって知ることは不可能である。
最近、インターロイキン-9(IL-9)が、気管支過敏症、上皮ムチン産生、好酸球増加症ならびにT細胞、B細胞、肥満細胞、好中球および好酸球を含む気管支洗浄液中の炎症細胞カウント数の上昇、ならびに喘息に関係するアレルギー性炎症を象徴する血清総IgEの上昇を含むマウスにおける多くの抗原誘発性反応において重要な役割を果たすことが分かった。参照により本明細書に組み込まれるLevitt他、米国特許第6,261,559号を参照されたい。ヒトおよびマウスIL-9について構造類似性が観察されており、ヒトIL-9は、喘息性免疫反応の徴候において同様の役割を果たすと予想されるであろうことを示唆している。IL-9は、活性化T細胞および肥満細胞によって発現され、そのタンパク質は、T細胞成長因子ならびに赤血球前駆体、B細胞、好酸球および肥満細胞の成長を媒介するサイトカインとしての役割を果たし、肺上皮によるムチンの産生を促進する。
Levitt他は、マウスIL-9に対するポリクローナル中和抗体によるマウスの前処置は、マウス喘息モデルにおいてマウスの抗原チャレンジからの完全な防御をもたらすことを明らかにした。それは、低い免疫原性およびヒトIL-9に対する高い結合親和性を有する抗体がヒト治療で使用するために設計できるならば、喘息などのIL-9発現に関係する疾患または症状に苦しむヒト患者にとって有用であろう。本発明は、そのような抗体、ならびにIL-9活性のモジュレーションおよび/または阻害が治療上有益である状態、例えば気管支過敏症、および喘息を含むアトピー性アレルギーなどのアレルギー性症状を治療する際のそれらの使用を提供する。
本発明は、ドナー抗ヒトIL-9抗体の重鎖および/または軽鎖可変領域に由来する抗原結合領域を含み、IL-9媒介性免疫細胞反応の阻害に関係する抗IL-9結合特異性を有する組換え抗体分子を提供する。後で詳細に述べるように、ドナー抗ヒトIL-9抗体は、マウス抗ヒトIL-9モノクローナル抗体である本明細書においてMH9A3、MH9D1、またはMH9L1と呼ばれる3種類のげっ歯類モノクローナル抗体(Mab)のうち1種類を含む。本発明による組換え抗体およびそれらから誘導される断片は、このようなMabの可変領域(VHおよび/またはVL)、または1種類もしくは複数のCDR、または重要な結合残基のみを含むものとし、可変領域は後に開示するようにそれと実質的な配列同一性を有する。本発明は、特にMH9A3、MH9D1、およびMH9L1に由来するキメラ抗ヒトIL-9抗体とヒト化(例えば、CDRグラフト)抗ヒトIL-9抗体の双方を包含する。本発明の抗体は、ホモロジーアラインメントに基づく合理的設計アプローチを用い、またはファージディスプレーフレームワークライブラリーの逐次パニングによって単離されることが好ましい。
本発明には、例えば本明細書において同定された抗IL-9抗体を用いてIL-9の中和エピトープを同定する方法、およびIL-9またはIL-9受容体と結合し、IL-9のその受容体との結合を阻害するペプチドを同定するためのそのようなエピトープの使用も含まれる。そのようなエピトープは、本明細書に記載の方法によって線状であるか、またはコンフォメーションを有してもよい。本発明は、そのようなエピトープから設計される中和ペプチドをさらに意図している。
本発明は、in vitro、ex vivoまたはin vivoにおいて少なくとも1種類のIL-9反応を阻害または防止するための本発明の中和抗体およびペプチドの使用も包含する。好ましい実施形態では、本発明は、疾患症状を軽減するのに有効な量の本発明の組換え抗ヒトIL-9抗体または中和ペプチドを患者に投与することを含み、喘息症状に苦しむ患者を治療する方法を提供する。例えば、進行中の喘息発作の前または間に投与された場合、本発明の抗体およびペプチドは、インターロイキン-9を中和し、インターロイキン-9の活性をダウンレギュレートし、患者における気管支過敏症を低下させ、肺上皮におけるムチン産生を減少させ、かつ/または患者の肺における好酸球増加を軽減するはずである。本発明は、本明細書に記載の治療有効量の抗ヒトIL-9抗体およびペプチドを患者に送達するために使用することができる吸入装置も包含する。
本発明の抗体には、モノクローナル、多重特異的、ヒトまたはキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、抗イディオタイプの(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗ld抗体)、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA1)、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。本発明の抗体は、アミノ酸を有するVHドメイン、VH CDR、VLドメイン、もしくはVL CDR、またはその断片もしくは変異体を含む、あるいはそれらからなることが好ましい。
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる3種類の超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域からなる。重鎖可変領域と軽鎖可変領域は共に、4種類のフレームワーク領域および3種類のCDRを含む(図14を参照)。フレームワーク領域およびCDRは、E. Kabat(参照により本明細書に組み込まれる「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、E. Kabat他、U.S. Department of Health and Human Services、1983年)によって正確に定義されている。
本発明をより明確に記載するため、以下の定義を提供する。そのほかの点では、本明細書のすべての用語は、臨床使用のための組換え抗体の合成において当業者によって解釈されるような通常の意味を有すると理解されるべきである。
「IL-9と結合する」本発明の抗体は、IL-9、好ましくはヒトIL-9と検出可能に結合する抗体である。IL-9との結合を測定するアッセイには、受容体結合阻害アッセイまたは溶液からの可溶性IL-9の捕捉が含まれるが、これらに限定されるものではない。BIAcoreおよびELISAアッセイは、固体支持体と結合しているIL-9を検出する。中和アッセイは、反応性細胞系におけるIL-9誘発性増殖の減少を測定する。
本明細書で使用する用語「変異体」は、IL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗IL-9抗体もしくはその抗体断片と類似もしくは同一の機能を有するが、類似もしくは同一アミノ酸配列のIL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗IL-9抗体またはその抗体断片を必ずしも含まない、または類似もしくは同一構造のIL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗IL-9抗体もしくはその抗体断片を有するポリペプチドを指す。類似のアミノ酸を有する変異体は、本明細書に記載の(a)ポリペプチドが、IL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗IL-9抗体またはその抗体断片(VHドメイン、VHCDR、VLドメインを含む)のアミノ酸配列と少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれらからなること、あるいは(b)ポリペプチドが、IL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗IL-9抗体またはその抗体断片(少なくとも5個のアミノ酸残基、少なくとも10個のアミノ酸残基、少なくとも15個のアミノ酸残基、少なくとも20個のアミノ酸残基、少なくとも25個のアミノ酸残基、少なくとも30個のアミノ酸残基、少なくとも40個のアミノ酸残基、少なくとも50個のアミノ酸残基、少なくとも60個のアミノ酸残基、少なくとも70個のアミノ酸残基、少なくとも80個のアミノ酸残基、少なくとも90個のアミノ酸残基、少なくとも100個のアミノ酸残基、少なくとも125個のアミノ酸残基、または少なくとも150個のアミノ酸残基のVHドメイン、VHCDR、VLドメイン、またはVLCDRを含む)をコードするヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズする相補配列のヌクレオチド配列によってコードされること；および(c)ポリペプチドが、IL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗IL-9抗体またはその抗体断片(VHドメイン、VHCDR、VLドメイン、またはVLCDRを含む)をコードするヌクレオチド配列と少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされること、のうち1つを満たすポリペプチドを指す。本明細書に記載のIL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗IL-9抗体またはその抗体断片と類似の構造であるポリペプチドは、類似の二次、三次または四次構造の本明細書に記載のIL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗IL-9抗体またはその抗体断片を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドの構造は、X線結晶学、核磁気共鳴、および結晶学的電子顕微鏡を含むがそれらに限定されない当業者に知られている方法によって決定することができる。
2種類のアミノ酸配列または2種類の核酸配列の同一性パーセントを決定するためには、最適比較目的で配列を整列する(例えば、第2のアミノ酸または核酸配列による最適アラインメントのために第1のアミノ酸または核酸配列にギャップを導入することができる)。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置においてアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第2の配列の対応する位置において第1の配列の位置が同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、その位置において分子は同一である。2種類の配列間の同一性パーセントは、配列によって共有されている同一位置数の関数である(すなわち、％同一性は、同一の重なり合う位置の数/位置の総数×100%である)。一実施形態では、2種類の配列は同じ長さである。
2種類の配列間の同一性パーセントの決定は、当業者に知られている数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。2種類の配列を比較するための数学的アルゴリズムの例は、KarlinおよびAltschul、Proc. NatL. Acad. Sci. USA、4-90巻、5873〜5877ページ、1993年におけるように改良されたKarlinおよびAltschul、Proc. Nad. Acad. Sci.USA、87巻、2264〜2268ページ、1990年のアルゴリズムである。Altschul、他、J. MoL. BioL.、215巻、403〜410ページ、1990年のBLASTnおよびBLASTxプログラムは、そのようなアルゴリズムを組み入れている。スコア=100、ワード長=12のBLASTnプログラムによりBLASTヌクレオチド検索を行い、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。スコア=50、ワード長=3のBLASTxプログラムによりBLASTタンパク質検索を行い、本発明のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップ付きアラインメントを得るためには、Altschul、他、Nucleic Acids Res.、25巻、3389〜3402ページ、1997年に記載のようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BLASTを用い、分子間の遠距離関係を検出する累次検索を行うことができる(上記)。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTxおよびBLASTn)のデフォルトパラメータを使用することができる。(http://www.ncbi.nlm.nib.govを参照)
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の例は、MyersおよびMiller、CABIOS(1989年)のアルゴリズムである。GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)は、そのようなアルゴリズムを組み入れている。当技術分野において知られている配列解析のための他のアルゴリズムには、TorellisおよびRobotti、Comput. Appl. Biosci.、10巻、3〜5ページ、1994年に記載のADVANCEおよびADAM; ならびにPearsonおよびLipman、Proc. Nad. Acad. Sci.、85巻、2444〜8ページ、1988年に記載のFASTAが含まれる。FASTA内のktupは、感度および検索の速度を設定する制御オプションである。
本明細書で使用する用語「誘導体」は、IL-9と免疫特異的に結合し、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入によって変化させられたIL-9ポリペプチド、IL-9の断片、または本発明の抗体のアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなる本発明の変異ポリペプチドを指す。本明細書で使用する用語「誘導体」は、例えば、任意のタイプの分子とポリペプチドの共有結合によって修飾され、IL-9と免疫特異的に結合するIL-9ポリペプチド、IL-9の断片、抗体も指す。例えば、限定する目的ではないが、IL-9ポリペプチド、IL-9の断片、または抗IL-9抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、知られている保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との結合などによって修飾することができる。IL-9ポリペプチド、IL-9の断片、または抗IL-9抗体の誘導体は、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むがそれらに限定されない当業者に知られている技法を用いる化学修飾によって修飾することができる。さらに、IL-9ポリペプチド、IL-9の断片、または抗IL-9抗体の誘導体は、1種類または複数の非古典的アミノ酸を含むことができる。ポリペプチド誘導体は、本明細書に記載のIL-9ポリペプチド、IL-9の断片、または抗IL-9抗体と同様または同一の機能を有する。
本明細書で使用する用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳類において抗原性または免疫原性活性を有するIL-9の部分を指す。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体反応を誘発するIL-9の一部である。抗原性活性を有するエピトープは、当技術分野において知られている任意の方法、例えば、本明細書に記載のイムノアッセイによって測定されるように、抗体が免疫特異的に結合するIL-9の一部である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
本明細書で使用する用語「断片」は、ヒトIL-9の少なくとも5個のアミノ酸残基、少なくとも10個のアミノ酸残基、少なくとも15個のアミノ酸残基、少なくとも20個のアミノ酸残基、少なくとも25個のアミノ酸残基、少なくとも30個のアミノ酸残基、少なくとも35個のアミノ酸残基、少なくとも40個のアミノ酸残基、少なくとも45個のアミノ酸残基、少なくとも50個のアミノ酸残基、少なくとも60個のアミノ酸残基、少なくとも70個のアミノ酸残基、少なくとも80個のアミノ酸残基、少なくとも90個のアミノ酸残基、少なくとも100個のアミノ酸残基、少なくとも125個のアミノ酸残基、少なくとも130個のアミノ酸残基、少なくとも135個のアミノ酸残基、または少なくとも140個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す(プロセシングを受けた(126アミノ酸)およびプロセシングを受けていない(144アミノ酸)ヒトIL-9の配列についての米国特許第6,261,559号を参照。この特許は、IL-9のアミノ酸配列について参照により本明細書に組み込まれる。)
本明細書で使用する用語「融合タンパク質」は、本発明の抗IL-9抗体またはその断片もしくは変異体および別の部分、例えば、抗体もしくは抗体ドメインと無関係のポリペプチドのアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるポリペプチドを指す。
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、核酸分子を含む特定の細胞およびそのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す。子孫は、後の世代または宿主細胞ゲノムに核酸分子を組み込む際に起きる可能性のある変異または環境的影響のため、核酸分子をトランスフェクトした親細胞と同一でないことがある。
本発明は、IL-9またはIL-9の断片もしくは変異体と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を包含する。特に、本発明は、MH9A3、MH9D1、およびMH9L1に由来する、組換え抗体、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗体断片単鎖Fv(scFv)を提供する。特に、本発明は、ヒトIL-9すなわちヒトの活性化T細胞または肥満細胞上で発現されるIL-9のポリペプチド、ポリペプチド断片もしくは変異体、またはエピトープと免疫特異的に結合する抗体を包含する。
本発明の抗体は、以下に示す天然のヒトIL-9のアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなる、またはヒトIL-9をコードするゲノムもしくはcDNAヌクレオチド配列とハイブリダイズする(例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下)核酸によってコードされるポリペプチドと免疫特異的に結合する。
1 mllamvltsa lllcsvagqg cptlagildi nflinkmqed paskchcsan vtsclclgip
61 sdnctrpcfs erlsqmtntt mqtryplifs rvkksvevlk nnkcpyfsce qpcnqttagn
121 altflkslle ifqkekmrgm rgki(配列番号124)
本発明の抗体は、IL-9のアミノ酸配列の断片、またはヒトIL-9をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする(例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件に下)核酸によってコードされる断片とも結合する。このIL-9配列は、成熟について明らかにされた最初の18アミノ酸に相当するシグナル配列を含む。ヒトIL-9のcDNA配列は以下の通りである。
atgcttctgg ccatggtcct tacctctgcc ctgctcctgt gctccgtggc aggccagggg 60
tgtccaacct tggcggggat cctggacatc aacttcctca tcaacaagat gcaggaagat 120
ccagcttcca agtgccactg cagtgctaat gtgaccagtt gtctctgttt gggcattccc 180
tctgacaact gcaccagacc atgcttcagt gagagactgt ctcagatgac caataccacc 240
atgcaaacaa gatacccact gattttcagt cgggtgaaaa aatcagttga agtactaaag 300
aacaacaagt gtccatattt ttcctgtgaa cagccatgca accaaaccac ggcaggcaac 360
gcgctgacat ttctgaagag tcttctggaa attttccaga aagaaaagat gagagggatg 420
agaggcaaga tatga 435(配列番号125)
さらに、IL-9受容体のアミノ酸および核酸配列は以下の通りである。
MGLGRCIWEGWTLESEALRRDMGTWLLACICICTCVCLGVSVTGEGQGPRSRTFTCLTNNILRIDCHWSAPELGQGSSPWLLFTSNQAPGGTHKCILRGSECTVVLPPEAVLVPSDNFTITFHHCMSGREQVSLVDPEYLPRRHVKLDPPSDLQSNISSGHCILTWSISPALEPMTTLLSYELAFKKQEEAWEQAQHRDHIVGVTWLILEAFELDPGFIHEARLRVQMATLEDDVVEEERYTGQWSEWSQPVCFQAPQRQGPLIPPWGWPGNTLVAVSIFLLLTGPTYLLFKLSPRVKRIFYQNVPSPAMFFQPLYSVHNGNFQTWMGAHRAGVLLSQDCAGTPQGALEPCVQEATALLTCGPARPWKSVALEEEQEGPGTRLPGNLSSEDVLPAGCTEWRVQTLAYLPQEDWAPTSLTRPAPPDSEGSRSSSSSSSSSNNNNYCALGCYGGWHLSALPGNTQSSGPIPALACGLSCDHQGLETQQGVAWVLAGHCQRPGLHEDLQGMLLPSVLSKARSWTF(配列番号126)
1 agcagctctg taatgcgctt gtggtttcag atgtgggcgg cctgtgtgaa cctgtcgtgc
61 aaagctcacg tcaccaactg ctgcagttat ctcctgaatc aggctgaggg tctttgctgt
121 gcacccagag atagttgggt gacaaatcac ctccaggttg gggatgcctc agacttgtga
181 tgggactggg cagatgcatc tgggaaggct ggaccttgga gagtgaggcc ctgaggcgag
241 acatgggcac ctggctcctg gcctgcatct gcatctgcac ctgtgtctgc ttgggagtct
301 ctgtcacagg ggaaggacaa gggccaaggt ctagaacctt cacctgcctc accaacaaca
361 ttctcaggat cgattgccac tggtctgccc cagagctggg acagggctcc agcccctggc
421 tcctcttcac cagcaaccag gctcctggcg gcacacataa gtgcatcttg cggggcagtg
481 agtgcaccgt cgtgctgcca cctgaggcag tgctcgtgcc atctgacaat ttcaccatca
541 ctttccacca ctgcatgtct gggagggagc aggtcagcct ggtggacccg gagtacctgc
601 cccggagaca cgttaagctg gacccgccct ctgacttgca gagcaacatc agttctggcc
661 actgcatcct gacctggagc atcagtcctg ccttggagcc aatgaccaca cttctcagct
721 atgagctggc cttcaagaag caggaagagg cctgggagca ggcccagcac agggatcaca
781 ttgtcggggt gacctggctt atacttgaag cctttgagct ggaccctggc tttatccatg
841 aggccaggct gcgtgtccag atggccacac tggaggatga tgtggtagag gaggagcgtt
901 atacaggcca gtggagtgag tggagccagc ctgtgtgctt ccaggctccc cagagacaag
961 gccctctgat cccaccctgg gggtggccag gcaacaccct tgttgctgtg tccatctttc
1021 tcctgctgac tggcccgacc tacctcctgt tcaagctgtc gcccagggtg aagagaatct
1081 tctaccagaa cgtgccctct ccagcgatgt tcttccagcc cctctacagt gtacacaatg
1141 ggaacttcca gacttggatg ggggcccaca gggccggtgt gctgttgagc caggactgtg
1201 ctggcacccc acagggagcc ttggagccct gcgtccagga ggccactgca ctgctcactt
1261 gtggcccagc gcgtccttgg aaatctgtgg ccctggagga ggaacaggag ggccctggga
1321 ccaggctccc ggggaacctg agctcagagg atgtgctgcc agcagggtgt acggagtgga
1381 gggtacagac gcttgcctat ctgccacagg aggactgggc ccccacgtcc ctgactaggc
1441 cggctccccc agactcagag ggcagcagga gcagcagcag cagcagcagc agcagcaaca
1501 acaacaacta ctgtgccttg ggctgctatg ggggatggca cctctcagcc ctcccaggaa
1561 acacacagag ctctgggccc atcccagccc tggcctgtgg cctttcttgt gaccatcagg
1621 gcctggagac ccagcaagga gttgcctggg tgctggctgg tcactgccag aggcctgggc
1681 tgcatgagga cctccagggc atgttgctcc cttctgtcct cagcaaggct cggtcctgga
1741 cattctaggt ccctgactcg ccagatgcat catgtccatt ttgggaaaat ggactgaagt
1801 ttctggagcc cttgtctgag actgaacctc ctgagaaggg gcccctagca gcggtcagag
1861 gtcctgtctg gatggaggct ggaggctccc ccctcaaccc ctctgctcag tgcctgtggg
1921 gagcagcctc taccctcagc atcctgg(配列番号127)
ポリペプチド断片は、「独立して存在する」か、または断片が領域の一部を形成するより大きなポリペプチド内に、最も好ましくは単一の連続領域として含まれていてもよい。本発明の抗体が結合してもよいポリペプチド断片の代表的な例には、例えば、ヒトIL-9およびその断片に相当するアミノ酸配列のアミノ酸残基、1〜15、16〜30、31〜46、47〜55、56〜72、73〜104、105〜126を含む、あるいはそれらからなる断片が含まれる。さらに、本発明の抗体が結合してもよいIL-9のポリペプチド断片は、長さが少なくとも、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110または120または125個のアミノ酸であってもよい。この文脈において、「約」は、具体的に示される範囲ならびにアミノ末端とカルボキシ末端のどちらかまたは双方において数個の、少数の、5、4、3、2または1個のアミノ酸残基分大きなまたは小さな範囲を意味する。
別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ含有部分を含む、あるいはそれからなるポリペプチドと結合する抗体を提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープであってもよい。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合に、抗体反応を誘発するタンパク質の一部と定義される。一方、抗体が結合することができるタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は通常、抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81巻、3998〜4002ページ、1983年を参照されたい。
抗原性エピトープを有する(すなわち、抗体が結合することができるタンパク質分子の領域を含む)ポリペプチドの選択に関しては、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣したタンパク質と反応する抗血清をごく普通にもたらすことができることは当技術分野においてよく知られている。例えば、Sutcliffe, J. G.、Shinnick, T. M.、Green, N.およびLearner, R.A.、「Antibodies that react with predetermined sites on proteins」、Scielwe、219巻、660〜666ページ、1983年を参照されたい。タンパク質反応性血清をもたらすことができるペプチドは、タンパク質の一次配列で示されることが多く、一組の簡単な化学的法則によって特徴付けられ、インタクトなタンパク質の免疫優性領域(すなわち、免疫原性エピトープ)にもアミノ末端またはカルボキシル末端にも限定されない。したがって、本発明の抗原性エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を産生させるのに有用である。例えば、Wilson他、Cell、37巻、767〜778ページ、1984年の777ページを参照されたい。
具体的実施形態では、本発明の抗体は、IL-9の抗原性エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドと結合し、IL-9ポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、より好ましくは少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、最も好ましくは約15個から約30個のアミノ酸を含むことが好ましい。免疫原性または抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、長さが少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100個のアミノ酸残基である。
IL-9エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、従来の任意の手段によって作製することができる。例えば、Houghten, R. A.、「General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82巻、5131〜5135ページ、1985年を参照されたい。この「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)」法は、Houghten他、1986年による米国特許第4,631,211号にさらに記載されている。
本発明は、IL-9のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、またはIL-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によってコードされる、もしくはIL-9をコードするcDNA配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体を包含する。
本発明は、IL-9ポリペプチドのエピトープを含む、あるいはそれからなるポリペプチドと結合する抗体を包含する。
本明細書で使用する用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性活性を有するポリペプチドの一部を指す。好ましい実施形態では、本発明は、エピトープを含むポリペプチドと結合する抗体を包含する。本明細書で使用する「免疫原性エピトープ」は、当技術分野において知られている任意の方法、例えば、後述の抗体を作製する方法(例えば、Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81巻、3998〜4002ページ、1983年を参照されたい)によって測定されるように、動物において抗体反応を誘発するタンパク質の一部と定義される。本明細書で使用する用語「抗原性エピトープ」は、当技術分野において知られている任意の方法、例えば、本明細書に記載のイムノアッセイによって測定されるように、抗体がその抗原と免疫特異的に結合することができるタンパク質の一部と定義される。免疫特異的結合から非特異的結合は除外されるが、他の抗原との交差反応は必ずしも排除されない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
エピトープとして機能するIL-9ポリペプチド断片は、従来の任意の手段によって作製することができる(例えば、Houghten、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82巻、5131〜5135ページ、1985年を参照されたい。米国特許第41631,211号にさらに記載されている。)
本発明では、本発明の抗体は、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、より好ましくは少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、最も好ましくは約15個から約30個のアミノ酸の配列を含むことが好ましい抗原性エピトープと結合する。本発明の抗体が結合することができる免疫原性または抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、長さが少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120または125個のアミノ酸残基である。追加の非排他的な好ましい抗原性エピトープには、本明細書に開示の抗原性エピトープ、ならびにそれらの部分が含まれる。抗原性エピトープは、例えば、エピトープと特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を産生するのに有用である。好ましい抗原性エピトープには、本明細書に開示の抗原性エピトープ、ならびにこれらの抗原性エピトープの2、3、4、5個またはそれ以上の任意の組合せが含まれる。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおける標的分子として使用することができる。(例えば、Wilson他、Cell、37巻、767〜778ページ、1984年; Sutcliffe他、Science、219巻、660〜666ページ、1983年を参照。)
同様に、免疫原性エピトープを用い、例えば、当技術分野においてよく知られている方法に従って抗体を誘導することができる(例えば、Sutcliffe他、同上; Wilson他、同上; Chow他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82巻、910〜914ページ; およびBittle他、J. Gen. Virol.、66巻、2347〜2354ページ、1985年を参照)。好ましい免疫原性エピトープには、本明細書に開示の免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性エピトープの2、3、4、5個またはそれ以上の任意の組合せが含まれる。IL-9の1種類または複数の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、動物系(ウサギまたはマウスなど)に対し、アルブミンなどのキャリアタンパク質と一緒に抗体反応を誘発するために提示され、またはポリペプチドが十分な長さ(少なくとも約25個のアミノ酸)である場合には、キャリアなしにポリペプチドを提示することができる。しかしながら、8から10個程度のアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、最低限でも変性ポリペプチドにおける線状エピトープと結合することができる抗体を産生するのに十分であることが分かっている(例えば、ウエスタンブロッティングにおいて)。
エピトープ含有IL-9ポリペプチドを用い、in vivo免疫化、in vitro免疫化、およびファージディスプレー法を含むがそれらに限定されない当技術分野においてよく知られている方法に従って抗体を誘導することができる。例えば、Sutcliffe他、同上; Wilson他、同上、およびBittle他、J. Gen. Virol.、66巻、2347〜2354ページ、1985年を参照されたい。in vivo免疫化を用いる場合、遊離ペプチドで動物を免疫化することができる。しかしながら、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)または破傷風トキソイドなどの巨大分子キャリアにペプチドをカップリングすることによって抗ペプチド抗体価を高めることができる。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)などのリンカーを用いてキャリアとカップリングすることができ、他のペプチドは、グルタルアルデヒドなどのより一般的な架橋剤を用いてキャリアとカップリングすることができる。ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物は、例えば、ペプチド約100マイクログラムまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントもしくは免疫反応を刺激することが知られているその他のアジュバントを含有する乳濁液の腹腔内および/または静脈内、皮内投与により遊離もしくはキャリア結合ペプチドにより免疫化される。例えば、約2週間間隔で数回ブースタ注射が必要であり、例えば、固体表面に吸着されている遊離ペプチドを用いるELISAアッセイによって検出することができる有用な抗ペプチド抗体価を得ることができる。免疫された動物からの血清における抗ペプチド抗体価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当技術分野においてよく知られている方法により、固体支持体上にペプチドを吸着させ、選択された抗体を溶離することによって高めることができる。
当業者が知っているように、また前述のように、本発明の抗体は、他のポリペプチド配列に融合されている免疫原性または抗原性エピトープを含むポリペプチドと結合することができる。例えば、IL-9ポリペプチドを、免疫グロブリン(IgA、IgE、IgG、IgM)の定常ドメイン、またはそれらの一部(CH1、CH2、CH3、またはそれらの任意の組合せまたはそれらの一部)、またはアルブミン(ヒトアルブミンまたはその断片もしくは変異体(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる1999年3月2日に発行された米国特許第5,876,969号、EP特許第0413622号、および1998年6月16に発行された米国特許第5,766,883号を参照))と融合させることが可能であり、キメラポリペプチドが得られる。このような融合タンパク質は、精製を容易にし、in vivoにおける半減期を延長させることができる。このことは、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2個のドメインおよび哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメインからなるキメラタンパク質について明らかにされている。例えば、EP 394,827; Traunecker他、Nature、331巻、84〜86ページ、1998年を参照されたい。上皮性関門を越える免疫系への抗原の送達の強化は、IgGまたはFc断片などのFcRn結合パートナーにコンジュゲートされている抗原(例えば、インスリン)について証明されている(例えば、PCT公開WO96/22024およびWO99/04813を参照)。IgG部分のジスルフィド結合のためにジスルフィド結合二量体構造を有するIgG融合タンパク質は、単量体ペプチドまたはそれらの断片単独に比べ、他の分子と結合し、かつ他の分子を中和する際により効率的であることが判明している。例えば、Fountoulakis他、J. Biochem.、270巻、3958〜3964ページ、1995年を参照されたい。また、上記エピトープをコードする核酸を、エピトープタグ(例えば、血球凝集素(「HA」)タグまたはフラッグタグ)として目的遺伝子により組み換えし、発現したポリペプチドの検出および精製を助けることができる。例えば、Janknecht他により記載された系は、ヒト細胞系において発現された非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする(Janknecht他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88巻、8972〜897ページ、1991年)。この系では、目的遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームが6個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと一時的に融合するように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングされる。タグは、融合タンパク質のマトリクス結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物は、Ni2+ニトリロ酢酸-アガロースカラム上に添加され、ヒスチジンタグ付きタンパク質は、イミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離することができる。
別の実施形態では、本発明の抗体は、IL-9ポリペプチドおよび/または異種抗原(例えば、ポリペプチド、炭水化物、リン脂質、または核酸)と融合されているそれらのエピトープ含有断片と結合する。具体的実施形態では、異種抗原は免疫原である。
別の実施形態では、本発明の抗体は、IL-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのランダム突然変異導入法により、組換えに先立つエラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法により作製された変異IL-9ポリペプチドと結合する。別の実施形態では、本発明の抗体は、1種類または複数の異種分子の1種類または複数の構成成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などにより組換えられたIL-9の1種類または複数の構成成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと結合する。
別の実施形態では、本発明の抗体は、例えば、PCT公開WO98/24904に記載のこれまでに知られている変異IL-9ポリペプチドと結合する。
IL-9ポリペプチドの特性を改善または変化させるため、タンパク質工学を用いることができる。当業者に知られている組換えDNA技術を用い、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む新規な変異タンパク質すなわち「ムテイン」を作製することができる。このような修飾ポリペプチドは、例えば、活性の強化または安定性の増加を示すことができる。さらに、それらは、少なくとも特定の精製および保存条件の下では対応する天然ポリペプチドよりも高収率で精製し、優れた溶解性を示すことができる。例えば、多くのタンパク質について、生物学的機能を実質的に失うことなくN末端またはC末端から1個または複数のアミノ酸を欠失できることは当技術分野において知られている。例えば、Ron他、J. Biol. Chem.、268巻、2984〜2988ページ、1993年は、たとえ3、8または27個のアミノ末端アミノ酸残基が失われていてもヘパリン結合活性を有する改変KGFタンパク質について報告している。したがって、本発明の抗体は、タンパク質工学によって作製されるIL-9ポリペプチド変異体またはバリアントと結合することができる。
したがって、本発明は、ヒトIL-9のアミノ酸配列のアミノ末端から除去された1個または複数の残基を有するポリペプチドと結合する抗体をさらに提供する。特に、本発明は、n'〜126のアミノ酸配列すなわちヒトIL-9(n'は、ヒトIL-9におけるアミノ酸配列のアミノ酸残基2〜125のアミノ酸位置の範囲における整数)を含む、あるいはそれからなるポリペプチドと結合する抗体を提供する。より具体的には、本発明は、残基2〜126、3〜126、4〜126、5〜126、6〜126、7〜126、8〜126、9〜126、50〜126、51〜126、52〜126、...75〜126、76〜126、77〜126、...100〜126、101〜126、102〜126、...および110〜126からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体を提供する。また、本発明は、前述のIL-9ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%または99%同一なアミノ酸配列の連続した配列を含む、あるいはそれらからなるIL-9ポリペプチドと結合する抗体に関する。
したがって、本発明は、IL-9のアミノ酸配列のアミノ末端から欠失された1個または複数の残基を有するポリペプチドと結合する抗体をさらに提供する。また、本発明は、IL-9ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%または99%同一なアミノ酸配列の連続した配列を含む、あるいはそれらからなるIL-9ポリペプチドと結合する抗体に関する。
本発明の極めて好ましい実施形態は、天然型のヒトIL-9ポリペプチドと少なくとも80%、85%、90%同一な、より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%または100%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体に関する。
本発明の好ましい実施形態は、ヒトIL-9のアミノ酸配列を有するIL-9ポリペプチドと少なくとも90%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体に関する。本発明のより好ましい実施形態は、天然のヒトIL-9のアミノ酸配列を有するIL-9ポリペプチドと少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体を対象とする。本発明のより好ましい実施形態は、天然のヒトIL-9のアミノ酸配列を有するIL-9ポリペプチドと少なくとも96%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体に関する。
本発明のより好ましい実施形態は、天然のヒトIL-9のアミノ酸配列を有するIL-9ポリペプチドと少なくとも97%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、天然のヒトIL-9のアミノ酸配列を有するIL-9ポリペプチドと少なくとも98%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、天然のヒトIL-9のアミノ酸配列を有するIL-9ポリペプチドと少なくとも99%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなるポリペプチドと結合する抗体に関する。
同様に、生物学的に機能的なC末端欠失ポリペプチドの多くの例が知られている。例えば、インターフェロンガンマは、タンパク質のカルボキシ末端から8〜10個のアミノ酸残基を欠失することによって10倍までの高い活性を示す(Dobeli他、J. Biotechnology、7巻、199〜216ページ、1988年)。しかしながら、たとえタンパク質のC末端からの1個または複数のアミノ酸の欠失がタンパク質の1種類または複数の生物学的機能について改変または喪失をもたらしても、他の機能的活性は依然として保持されたままである。したがって、完全すなわち成熟タンパク質を認識する抗体を誘導し、かつ/またはそれらと結合する短縮タンパク質の能力は、C末端から除去される完全すなわち成熟タンパク質の残基が過半数に満たない場合には一般的に保持されるはずである。完全タンパク質のC末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記載の、さもなければ当技術分野において知られているルーチンな方法によって容易に判定することができる。
したがって、本発明は、IL-9ポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から欠失された1個または複数の残基を有するポリペプチドと結合する抗体をさらに提供する。特に、本発明は、ヒトIL-9のアミノ酸配列のうち残基1〜n(nは、ヒトIL-9のアミノ酸残基30〜125のアミノ酸位置の範囲における任意の整数)のアミノ酸配列を含む、あるいはそれからなるポリペプチドと結合する抗体を提供する。
一般的にヒトIL-9の残基n1〜m1(n1およびm1は、上記で定義した整数である)を有すると記述される1個または複数のアミノ酸がアミノ末端とカルボキシ末端の双方から欠失されたIL-9ポリペプチドを含む、あるいはそれらからなるIL-9ポリペプチドと結合する抗体も提供される。
しかしながら、たとえポリペプチドのC末端からの1個または複数のアミノ酸の欠失がポリペプチドの1種類または複数の生物学的機能の改変または喪失をもたらしても、他の機能的活性は依然として保持されたままである。したがって、完全、成熟または細胞外型のポリペプチドを認識する抗体を誘導し、かつ/またはそれらと結合する短縮ポリペプチドの能力は、C末端から除去される完全、成熟または細胞外型のポリペプチドの残基が過半数に満たない場合には一般的に保持されるはずである。予測細胞外ドメインのC末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記載の、さもなければ当技術分野において知られているルーチンな方法によって容易に測定することができる。
また、前述のように、たとえタンパク質のC末端からの1個または複数のアミノ酸の除去がタンパク質の1種類または複数の機能的活性(例えば、生物活性)の改変または喪失をもたらしても、他の機能的活性は依然として保持されたままである。したがって、ポリペプチドの完全もしくは成熟型または細胞外ドメインを認識する抗体を誘導し、かつ/またはそれらと結合する短縮IL-9ムテインの能力は、C末端から除去されるポリペプチドの完全もしくは成熟型または細胞外ドメインの残基が過半数に満たない場合には一般的に保持されるはずである。完全ポリペプチドのC末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記載の、さもなければ当技術分野において知られているルーチンな方法によって容易に測定することができる。おそらく、C末端アミノ酸残基が多数除去されたIL-9ムテインは、いくつかの機能的(例えば、生物学的または免疫学的)活性を保持するであろう。
したがって、本発明は、IL-9のアミノ酸配列のカルボキシ末端から欠失された1個または複数の残基を有するポリペプチドと結合する抗体を別の実施形態においてさらに提供する。
本発明は、IL-9のアミノ末端とカルボキシ末端の双方から欠失された1個または複数の残基を有するポリペプチドと結合する抗体も提供する。
本発明の抗体は、(i)1個または複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基(好ましくは保存的アミノ酸残基)により置換され、そのような置換アミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされていてもいなくてもよいポリペプチド、または(ii)1個または複数のアミノ酸残基に置換基が含まれるポリペプチド、または(iii)ポリペプチドの細胞外ドメインが、ポリペプチドの半減期を増加する化合物(例えば、ポリエチレングリコール)などの別の化合物と融合されているポリペプチド、または(iv)追加のアミノ酸が、別のポリペプチドの細胞外ドメイン、IgG Fc融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列またはポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の細胞外ドメインの精製のために用いられる配列に融合されているポリペプチドなどのヒトIL-9ポリペプチドの断片、誘導体または類似体と結合することができる。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書の教示から当業者の範囲に入ると見なされる。
したがって、本発明の抗体は、自然変異あるいはヒト操作からの1個または複数のアミノ酸置換、欠失または付加が含まれるIL-9ポリペプチドと結合することができる。示されているように、変化は、タンパク質の折りたたみまたは活性に著しくは影響しない保存的アミノ酸置換などの軽度のものであることが好ましい。
本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも1個の保存的アミノ酸置換であるが、50個以下の保存的アミノ酸置換、より好ましくは40個以下の保存的アミノ酸置換、より好ましくは30個以下の保存的アミノ酸置換、より好ましくは20個以下の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するIL-9ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるペプチドと結合する。本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも1個の保存的アミノ酸置換であるが、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個以下の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するIL-9ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるペプチドと結合する。
例えば、IL-9のアミノ酸レベルにおける部位特異的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換で置き換えることによって行うことができる。本発明の抗体は、天然のヒトIL-9のポリペプチドの保存的置換変異を含むIL-9アミノ酸配列と結合することができる。
別の実施形態では、IL-9のアミノ酸レベルにおける部位特異的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換で置き換えることによって行うことができる。本発明の抗体は、IL-9ポリペプチドの保存的置換変異を含むIL-9アミノ酸配列と結合することができる。
別の実施形態では、IL-9のアミノ酸レベルにおける部位特異的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換で置き換えるこによって行うことができる。本発明の抗体は、保存的置換変異を含むIL-9アミノ酸配列と結合することができる。
機能に不可欠なIL-9ポリペプチドにおけるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの当技術分野において知られている方法によって同定することができる(CunninghamおよびWells、Science、244巻、1081〜1085ページ、1989年)。後者の手順は、分子中の残基ごとに単一アラニン変異を導入する。次いで、得られる変異分子を、例えば、増殖、分化、および/または活性化などのリガンド結合およびリンパ球(例えば、B細胞)を刺激する能力のような機能的活性について試験する。したがって、本発明の抗体は、機能に不可欠なIL-9ポリペプチド中のアミノ酸と結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、機能に不可欠でIL-9ポリペプチド機能を阻害するIL-9ポリペプチド中のアミノ酸と結合する。他の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、機能に不可欠でIL-9ポリペプチド機能を亢進するIL-9ポリペプチド中のアミノ酸と結合する。
荷電アミノ酸を、凝集しにくいなどの極めて望ましく特徴が改善されたタンパク質を作製することができる他の荷電または中性アミノ酸により置換することは特に興味深い。凝集が活性を低下させるばかりでなく、医薬製剤の調製の場合にも問題になるのは、凝集体が免疫原性である可能性があるためである(Pinckard他、Clin. Exp. 1mmunoL.、2巻、331〜340ページ、1967年; Robbins他、Diabetes、36巻、838〜845ページ、1987年; Cleland他、Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems、10巻、307〜377ページ、1993年)。
別の実施形態では、本発明は、ヒトIL-9アミノ酸配列の非保存的置換を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する抗体を提供する。
追加の実施形態では、本発明の抗体は、2個以上の(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30および50個)のアミノ酸が上述の置換アミノ酸(保存的あるいは非保存的)で置き換えられているIL-9アミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるIL-9ポリペプチドと結合する。
別の実施形態では、IL-9のアミノ酸レベルにおける部位特異的変化は、特定のアミノ酸を非保存的置換で置き換えるこによって行うことができる。本発明の抗体は、非保存的置換変異を含むIL-9アミノ酸配列と結合することができる。
追加の実施形態では、本発明の抗体は、2個以上の(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30および50個)のアミノ酸が上述の置換アミノ酸(保存的あるいは非保存的)で置き換えられているIL-9アミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるIL-9ポリペプチドと結合する。
当業者に知られている組換えDNA技術(例えば、DNAシャフリング、同上)を用い、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む新規な変異タンパク質すなわちムテインを作製することができる。このような組換えポリペプチドは、例えば、活性の強化または安定性の増加を示すことがある。さらに、それらは、少なくとも特定の精製および保存条件の下では対応する天然ポリペプチドよりも高収率で精製され、優れた溶解性を示すことができる。
したがって、本発明は、例えば、宿主細胞における発現、スケールアップなどに適しているIL-9ポリペプチドを作製するために1個または複数のアミノ酸残基が欠失、付加、または置換されたIL-9誘導体および類似体と結合する抗体も包含する。例えば、ジスルフィド架橋を除去するため、システイン残基を欠失するか、別のアミノ酸残基で置換することができる。N結合型グリコシル化部位を変化させるか除去し、例えば、N結合型部位を高グリコシル化する(hyperglycosylate)ことが知られている酵母宿主から容易に回収および精製される均一な産物の発現を行うことができる。この目的で、本発明のIL-9ポリペプチドにおけるいずれか1種類または複数のグリコシル化認識配列上の1番目または3番目のアミノ酸位置のうち一方または双方における様々なアミノ酸置換、および/またはいずれか1種類または複数のそのような認識配列の2番目の位置におけるアミノ酸欠失は、改変トリペプチド配列におけるIL-9のグリコシル化を妨げるはずである(例えば、Miyajimo他、EMBO J、5巻(6号)、1193〜1197ページを参照)。
本発明の他の抗体は、天然のヒトIL-9ポリペプチドと少なくとも80%、または少なくとも85%同一な、より好ましくは少なくとも90%または95%同一な、より好ましくは少なくとも96%、97%、98%または99%同一なポリペプチドを含むポリペプチドと結合し、少なくとも30個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも50個のアミノ酸を有する前記天然ヒトIL-9ポリペプチドの一部と結合する抗体も含まれる。
2種類のポリペプチドについての「％類似性」とは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for Unix（登録商標）、Genetics Computer Group、University Research Park、575 Science Drive、Madison、W1 53711)および類似性を判定するためのデフォルト設定を用い、2種類のポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって生じる類似性スコアを意図している。Bestfitは、2種類の配列間の類似性の最も高いセグメントを見つけるためのSmithおよびWaterman(Advances in Applied Mathematics、2巻、482〜489ページ、1981年)の局所ホモロジーアルゴリズムを使用している。
IL-9ポリペプチドの基準アミノ酸配列と、例えば、少なくとも95%「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が、IL-9ポリペプチドの基準アミノ酸の各100アミノ酸当たり5個までのアミノ酸変化を含むことができること以外はポリペプチドのアミノ酸配列は基準配列と同一であることを意図している。言い換えれば、基準アミノ酸配列と少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、基準配列内のアミノ酸残基の5%までを除去するか、別のアミノ酸により置換することができ、基準配列内の全アミノ酸残基のうち5%までの多くのアミノ酸を基準配列に挿入することができる。基準配列のこれらの変化は、基準アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に、または基準配列内の残基間に個別に、もしくは基準配列内の1個または複数の連続基内に散在している末端位置の間のどこにでも存在することができる。
実際問題として、任意の特定ポリペプチドが、例えばヒトIL-9、またはその断片のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるか否かは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for Unix（登録商標）、Genteics Computer Group、University Research Park、575 Science Drive、Madison、WI 53711)のような知られているコンピュータプログラムを用いて従来通りに判定することができる。特定の配列が、本発明による基準配列と、例えば95%同一であるか否かを判定するためのBestfitまたはその他の配列アラインメントプログラムを使用する場合には、同一性の割合が基準アミノ酸配列の全長にわたって計算され、基準配列内のアミノ酸残基総数の5%までの相同性のギャップが許されるようにパラメータが設定されることは言うまでもない。
具体的実施形態では、基準(クエリー)配列(本発明の配列)と対象配列の間の同一性は、グローバルな配列アラインメントと呼ばれ、Brutlag他(Comp. App. Biosci.、6巻、237〜245ページ、1990年)のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムを用いて決定される。FASTDBアミノ酸アラインメントにおいて使用される好ましいパラメータは、Matrix--PAM 0、k-tuple=2、Mismatch Penalty= 1、Joining Penalty=20、Randomization Group Length=O、Cutoff Score=l、Window Size=配列長、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty=0.05、Window Size=500または、短くても対象アミノ酸配列の長さである。この実施形態によれば、内部欠失のためではなく、NまたはC末端欠失により対象配列がクエリー配列より短い場合、FASTDBプログラムは、全体的な同一性パーセントを計算する場合に対象配列のNおよびC末端切断の理由を説明しないという事実を考慮に入れ、結果に対して手動の補正が行われる。NおよびC末端で切断された対象配列については、クエリー配列に対し、対象配列のNおよびC末端であり、対応する対象配列とマッチ/整列していないクエリー配列の残基数を、クエリー配列の全塩基に対する割合として計算することによって同一性パーセントが補正される。残基がマッチ/整列しているか否かの判定は、FASTDB配列アラインメントの結果によって判定される。次いで、このパーセンテージを、規定のパラメータを用いる上記FASTDBプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引くと、最終の同一性パーセントスコアに到着する。この最終の同一性パーセントスコアは、この実施形態の目的で使用されるスコアである。クエリー配列とマッチ/整列していない対象配列のNおよびC末端への残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で考慮される。それは、対象配列の最も遠いNおよびC末端残基の外側のクエリー残基位置のみである。例えば90個のアミノ酸残基対象配列を、100残基のクエリー配列と整列して同一性パーセントを決定する。欠失は、対象配列のN末端に存在するため、FASTD
Bアラインメントは、N末端における最初の10残基のマッチング/アラインメントを明らかにしない。10個の対になっていない残基は、配列の10%(マッチしていないNおよびC末端における残基の数/クエリー配列内の残基の総数)に相当するため、FASTDBプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから10%を差し引く。残りの90残基が完全にマッチしていれば、最終同一性パーセントは90%になるであろう。別の例では90残基の対象配列が100残基のクエリー配列と比較される。今度は、欠失が内部欠失であるためクエリーとマッチ/整列していない対象配列の残基はN末端にもC末端にも存在しない。この場合、FASTDBによって計算された同一性パーセントは、手動では補正されない。今度の場合も、FASTDBアラインメントに示されるように、クエリー配列とマッチ/アラインしていない対象配列のNおよびC末端の外側の残基位置のみが手動で補正される。
本発明は、IL-9ポリペプチドと免疫特異的に結合し、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1の重鎖および/または軽鎖可変領域のすべてまたは一部を含む、あるいはそれらからなる抗体(抗体断片またはその変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)も包含する。
本発明は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて異常もしくは亢進したIL-9発現または不適切なIL-9受容体機能に関係する疾患もしくは障害を検出、診断および/または予知するための、IL-9と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を使用することを含む方法および組成物も包含する。本発明の抗体により検出、診断および/または予知することができる疾患および障害には、喘息などのアレルギー性疾患が含まれるが、これに限定されるものではない。また、本発明は、ムチンの過剰産生が疾患病理に関与する、すなわち肺組織による状態の治療を包含する。例には、嚢胞性線維症、肺気腫およびCOPDが含まれる。
本発明は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて異常もしくは亢進したIL-9またはIL-9受容体、その発現または不適切なIL-9またはIL-9受容体機能に関係する疾患もしくは障害を予防、治療または改善するための、本発明のIL-9と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を使用することを含む方法および組成物を包含する。有効量の本発明の1種類または複数の抗体または分子を投与することにより予防、治療または阻害することができる疾患および障害には、自己免疫疾患(例えば、ループス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、橋本病、および免疫不全症)、炎症性疾患(例えば、喘息、アレルギー性疾患、および関節リウマチ)、感染性疾患(例えば、AIDS)、および増殖性障害(例えば、白血病、癌腫、およびリンパ腫)が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、対象抗体は、喘息を治療するために使用される。別の好ましい実施形態では、対象抗体は、病理の主要構成要素としてムチン産生が関わる疾患を治療するために使用される。そのような疾患には、例えば、嚢胞性線維症、肺気腫およびCOPDが含まれる。
本発明の抗体は、ファージディスプレー技術を用いて作製することができる。ファージ粒子の表面上に提示される単鎖抗体分子(「scFv」)をスクリーニングし、膜結合型および可溶型IL-9を含むIL-9と免疫特異的に結合するscFvを同定する。
本発明は、IL-9のポリペプチドまたはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を提供する。特に、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1の可変領域に由来する抗体を提供する。これらの抗体の抗体配列は、図1および2(MH9A3の軽鎖および重鎖)および図3(MH9D1およびMH9L1の重鎖および軽鎖)に含まれる。このような可変ドメインは、例えば、定常ドメイン配列を含む発現ベクター内にこれらの抗体のVHおよび/またはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を挿入することにより免疫グロブリン分子へルーチン的に「変換し」、免疫グロブリンの発現に導くように設計することができる。
一実施形態では、本発明は、抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のうちいずれか1種類のVHドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる抗体を提供する。本発明は、ヒトIL-9のポリペプチド、またはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDRのうちいずれか1、2、3種類またはそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる抗体も提供する。IL-9またはIL-9断片と免疫特異的に結合するこれらの抗体、または抗体断片もしくはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片および/または変異体をコードする核酸分子のように本発明に包含される。
本発明の一実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDRのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。好ましい実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVH CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。さらに別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVH CDRI; MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVH CDR2および/またはMH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVH CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。本発明の抗体は、同一の可変ドメインに由来するVH CDRを含む、あるいはそれらからなることが好ましい。IL-9と免疫特異的に結合するこれらの抗体の断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片または変異体をコードする核酸分子のように本発明に包含される。
本発明は、IL-9のポリペプチド、またはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を提供する。特に、本発明は、抗体であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体を提供する。本発明は、IL-9のポリペプチドまたはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1配列に含まれているVL CDRのうちいずれか1、2、3種類またはそれ以上のアミノ酸配列を有するVL CDRを含む、あるいはそれらからなる抗体も提供する。IL-9と免疫特異的に結合するこれらの抗体の断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片または変異体をコードする核酸分子のように本発明に包含される。
本発明の一実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVL CDRのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。特に、本発明は、IL-9と免疫特異的に結合し、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVL CDRIのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる抗体を提供する。別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVL CDR2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。好ましい実施形態では、抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVL CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。さらに別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVL CDRI; MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVL CDR2; およびMH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれているVL CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1の同一可変ドメインに由来するVL CDRを含む、あるいはそれらからなることが好ましい。IL-9と免疫特異的に結合するこれらの抗体の断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片または変異体をコードする核酸分子のように本発明に包含される。
本発明は、IL-9のポリペプチドまたはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1の可変ドメインのうち1種類のVLドメイン、または他のVLドメインと組み合わされた可変ドメインMH9A3、MH9D1、またはMH9L1のうち1種類のVHドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体を提供する。本発明は、IL-9のポリペプチドまたはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体であって、前記抗体は、後に開示するscFvのうち1種類のVHドメイン、または他のVHドメインと組み合わされた、後に開示する可変ドメインのうち1種類のVLドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体を提供する。好ましい実施形態では、IL-9のポリペプチドまたはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVHドメインおよびMH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVLドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体は、同一の可変ドメイン由来のVHおよびVLドメインを含む、あるいはそれらからなる。IL-9と免疫特異的に結合するこれらの抗体の断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片または変異体をコードする核酸分子のように本発明に包含される。
本発明は、IL-9のポリペプチドまたはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1の1、2、3種類またはそれ以上のVH CDRおよび1、2、3種類またはそれ以上のVL CDRを含む、あるいはそれらからなる抗体も提供する。特に、本発明は、IL-9のポリペプチドまたはポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のVH CDRおよびVL CDRのうちVH CDRIおよびVL CDR1、VH CDRIおよびVL CDR2、VH CDR1およびVL CDR3、VH CDR2およびVL CDRI、VH CDR2およびVL CDR2、VH CDR2およびVL CDR3、VH CDR3およびVL CDRI、VH CDR3およびVL CDR2、VH CDR3およびVL CDR3、ならびにそれらの任意の組合せを含む、あるいはそれらからなる抗体を提供する。好ましい実施形態では、1種類または複数のこれらの組合せは、同一の可変ドメインに由来する。IL-9と免疫特異的に結合するこれらの抗体の断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片または変異体をコードする核酸分子のように本発明に包含される。
本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。したがって、用語「抗体」は、全抗体分子ばかりでなく、抗体断片、ならびに抗体および抗体断片の変異体(誘導体を含む)も包含する。本発明の抗体には、モノクローナル、多重特異的、ヒトまたはキメラ抗体、単鎖抗体、単鎖Fv(scFv)、Fab断片、F(ab')2断片、Fd断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、抗イディオタイプの(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。本発明の抗体は、後に開示するMH9A3、MH9D1、およびMH9L1抗体配列のVHドメイン、VH CDR、VLドメイン、またはVL CDRのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなることが好ましい。本発明の抗体には、IL-9と免疫特異的に結合する上記抗体の断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる分子も含まれる。
本発明の抗体は、ヒトIL-9と免疫特異的に結合する全抗体または抗体断片であることが最も好ましい。ヒトIL-9と免疫特異的に結合する抗体断片には、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fd断片、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、VLあるいはVHドメインを含む、あるいはこれらからなる断片、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。
単鎖抗体を含むIL-9結合抗体断片は、1種類または複数の可変領域単独またはヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH 3ドメインの全体もしくは一部と組み合わされた可変領域を含む、あるいはそれらからなることができる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、IL-9と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれている1、2、3、4、5、6種類またはそれ以上のCDRを含む、あるいはそれらからなるペプチド、好ましくはMH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDR3および/またはVL CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1の同一scFv由来の1、2、3、4、5、6種類またはそれ以上のCDRを含む、あるいはそれらからなることが最も好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーおよびヒト抗体を産生するように遺伝子組み換えされた異種(xenomic)または他の生物体から単離された抗体が含まれる。数少ないヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するための技術ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコルについての詳細な論議については、全体として参照により本明細書に組み込まれるPCT公開WO98/24893; WO92/01047; WO96/34096; WO96/33735; 欧州特許第0598877号; 米国特許第5,413,923号; 第5,625,126号; 第5,633,425号; 第5,569,825号; 第5,661,016号; 第5,545,806号; 第5,814,318号; 第5,885,793号; 第5,916,771号; および第5,939,598号; ならびにLonbergおよびHuszar、Int. Rev. Immunol.、13巻、65〜93ページ、1995年を参照されたい。ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体は、本明細書に記載の、さもなければ当技術分野において知られている技法を用いて作製することができる。例えば、キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野において知られている。総説については、全体として参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献を参照されたい。Morrison、Science、229巻、1202ページ、1985年; Oi他、BioTechniques、4巻、214ページ、1986年; Cabilly他、米国特許第4,816,567号; Taniguchi他、EP 171496; Morrison他、EP 173494; Neuberger他、WO 8601533; Robinson他、WO 8702671; Boulianne他、Nature、312巻、643ページ、1984年; 121 Neuberger他、Nature、314巻、268ページ、1985年。さらにAbgenix, Inc.(Freemont、CA)およびGenpharm(San Jose、CA)などの会社は、前述と同様の技術を用いる選択された抗原を対象とするヒト抗体を提供することができる。
本発明の抗体は、1価、2価、3価であるか、あるいは多価であってもよい。例えば、1価scFvは、化学的に、あるいは別のタンパク質もしくは物質との会合によって多量体化することができる。ヘキサヒスチジンタグまたはFlagタグと融合されたscFvは、Ni-NTAアガロース(Qiagen)または抗Flag抗体(Stratagene, Inc.)を用いて多量体化することができる。
本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的であるか、あるいはより大きな多重特異的であってもよい。多重特異的抗体は、IL-9ポリペプチド、もしくはその断片の様々なエピトープに対して特異的であるか、あるいはIL-9ポリペプチド、もしくはその断片と異種ポリペプチドなどの異種エピトープもしくは固体支持体材料双方に対して特異的であってもよい。例えば、PCT公開WO93/17715; WO92/08802; WO91/00360: WO92/05793; Tutt、他、J. Immunol.、147巻、60〜69ページ、1991年; 米国特許第4,474,893号; 第4,714,681号: 第4,925,648号; 第5,573,920号; 第5,601,819号; Kostelny他、J. Immunol.、148巻、1547〜1553ページ、1992年を参照されたい。
本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、ヒトIL-9と免疫特異的に結合することができる。
本発明の抗体は、それらの交差反応性の面からも記述または特定することができる。IL-9ポリペプチドのその他の類似体、オルソログ、または相同体と結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドとの同一性(当技術分野において知られている、および本明細書に記載の方法を用いて計算した)が少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、および少なくとも50%同一であるポリペプチドと結合する抗体も本発明に含まれる。具体的実施形態では、本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウス、ラットおよび/またはウサギ相同体ならびにそれらの対応するエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドとの同一性が95%未満、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、および50%未満であるポリペプチドと結合しない抗体も本発明に含まれる。具体的実施形態では、上述の交差反応性は、任意の単一特異的抗原性もしくは免疫原性ポリペプチド、または本明細書に開示の特異的抗原性および/または免疫原性ポリペプチドのうち2、3、4、5種類またはそれ以上の1種類または複数の組合せに関する。本発明には、ハイブリダイゼーション条件下(本明細書に記載)で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと結合する抗体がさらに含まれる。
好ましい実施形態では、本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、IL-9と免疫特異的に結合し、その他の抗原と交差反応しない。
本発明は、本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)をコードする、一般的には単離された核酸分子も提供する。一実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVHドメインのいずれか1種類のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のアミノ酸配列を有するVH CDR1を含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDR2のいずれか1種類のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。さらに別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。IL-9と免疫特異的に結合し、VHドメインおよび/またはVH CDRの断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVLドメインのいずれか1種類のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)をコードする。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVL CDR1のいずれか1種類のアミノ酸配列を有するVL CDR1ドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVL CDR2のいずれか1種類のアミノ酸配列を有するVL CDR2ドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。さらに別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVL CDR3のいずれか1種類のアミノ酸配列を有するVL CDR3ドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。IL-9と免疫特異的に結合し、VLドメインおよび/またはVL CDRの断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVHドメインのいずれか1種類のアミノ酸配列を有するVHドメイン、およびMH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVLドメインのいずれか1種類のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のアミノ酸配列を有するVH CDR1、VL CDR1、VH CDR2、VL CDR2、VH CDR3、VL CDR3、またはそれらの任意の組合せを含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする。IL-9と免疫特異的に結合し、VLおよび/またはドメインおよび/または1種類もしくは複数のVHCDRおよび/または1種類もしくは複数のVLCDRの断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
本発明は、本明細書に記載のVHドメイン、VH CDR、VLドメイン、およびVL CDRの変異体(誘導体を含む)を含み、あるいはそれらからなり、IL-9と免疫特異的に結合する抗体も提供する。例えば、部位特異的変異誘発およびPCR媒介性変異誘発を含む当業者に知られている標準的技法を用い、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列にアミノ酸置換をもたらす変異を導入することができる。変異体(誘導体を含む)は、基準VHドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLドメイン、VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3に対して50個未満のアミノ酸置換、40個未満のアミノ酸置換、30個未満のアミノ酸置換、25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、2個未満のアミノ酸置換をコードすることが好ましい。具体的実施形態では、変異体は、VHCDR3の置換をコードする。好ましい実施形態では、変異体は、1個または複数の予想非必須アミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の荷電を持つ側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる置換である。同様の荷電を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、荷電していない極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ枝分かれ側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を持つアミノ酸が含まれる。あるいは、飽和変異誘発などによってコーディング配列のすべてまたは一部に沿って変異をランダムに導入することができ、得られる変異体を生物活性についてスクリーニングし、活性(例えば、IL-9と結合する能力)を保持する変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、コードされているタンパク質をルーチン的に発現させ、コードされているタンパク質の機能および/または生物活性(例えば、IL-9と免疫特異的に結合する能力)を、本明細書に記載の技法を用い、または当技術分野において知られている技法をルーチン的に改変することにより測定することができる。
本発明の抗体には、例えば、抗体に任意のタイプの分子を共有結合させることにより、共有結合がIL-9と免疫特異的に結合する抗体の能力に影響しないように修飾された誘導体(すなわち、変異体)が含まれる。例えば、限定する目的ではないが、本発明の誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、知られている保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との結合などによって修飾されている抗体が含まれる。多くの化学的修飾のいずれも、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むがそれらに限定されない当業者に知られている技法によって行うことができる。さらに、誘導体は、1種類または複数の非古典的アミノ酸を含むことができる。
具体的実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVHまたはVLドメインのうち1種類をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列と、ストリンジェント条件下、例えば、約45℃における6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中のフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーションと、それに続く約50℃〜65℃における0.2×SSC/0.1%SDS中の1回または複数回の洗浄、極めてストリンジェント条件下、例えば、約45℃における6×SSC中のフィルター結合核酸とのハイブリダイゼーションと、続く約68℃における0.1×SSC/0.2%SDS中の1回または複数回の洗浄、または当業者に知られている他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件(例えば、Ausubel, F. M.他、編、1989年、Current Protocols In Molecular Biology、第1巻、Green Publishing 126 Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc.、New York 6.3.1〜6.3.6および2.10.3ページ)下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなる。
別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDRまたはVL CDRのうち1種類をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列と、ストリンジェント条件下、例えば、上述の条件下、または当業者に知られている他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDR3のうち1種類をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列と、ストリンジェント条件下、例えば、上述の条件下、または当業者に知られている他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVHドメインのいずれか1種類と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDRのいずれか1種類と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDR3のいずれか1種類と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVLドメインのいずれか1種類と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVL CDRのいずれか1種類と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVL CDR3のいずれか1種類と少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、IL-9ポリペプチドまたはIL-9ポリペプチドの断片もしくは変異体に対する結合親和性という面からも記述または特定することができる。
具体的実施形態では、本発明の抗体は、5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、または10-5M以下の解離定数すなわちKdでIL-9ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体と結合する。本発明の抗体は、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、または10-8M以下の解離定数すなわちKdでIL-9ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体と結合することがより好ましい。さらに、本発明の抗体は、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、または10-15M以下の解離定数すなわちKdでIL-9ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体と結合することがより好ましい。
本発明は、各々の個別に示された値の間にある範囲のいずれか1つに含まれる解離定数すなわちKdでIL-9ポリペプチドと結合する抗体を包含する。
具体的実施形態では、本発明の抗体は、5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1または10-3sec-1以下のオフレイト(Koff)でIL-9ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体と結合する。本発明の抗体は、5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1、10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1または10-7sec-1以下のオフレイト(Koff)でIL-9ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体と結合することがより好ましい。本発明は、各々の個別に示された値の間にある範囲のいずれか1つに含まれるオフレイト(Koff)でIL-9ポリペプチドと結合する抗体を包含する。
具体的実施形態では、本発明の抗体は、10-3M-1sec-1、5×10-3M-1sec-1、10-4M-1sec-1または5×10-4M-1sec-1以上のオンレイト(Kon)でIL-9ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体と結合する。本発明の抗体は、105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1、または5×106M-1sec-1または107M-1sec-1以上のオンレイト(Kon)でIL-9ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体と結合することがより好ましい。本発明は、各々の個別に示された値の間にある範囲のいずれか1つに含まれるオンレイト(Kon)でIL-9ポリペプチドと結合する抗体を包含する。
本発明は、1種類または複数の本明細書に記載の抗体と同一の1種類または複数の生物学的特徴を有する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)も包含する。「生物学的特徴」とは、例えば、IL-9および/またはIL-9の抗原性および/またはエピトープ領域と結合する能力、IL-9/IL-9受容体結合を実質的にブロックする能力、またはIL-9媒介性生物活性をブロックする能力などの抗体のin vitroまたはin vivo活性または特性を意味する。場合により、本発明の抗体は、本明細書で具体的に言及される抗体の少なくとも1種類として同一エピトープと結合するはずである。そのようなエピトープ結合は、当技術分野において知られているアッセイを用いてルーチン的に測定することができる。今日まで、中和している抗体は、競合結合試験(ELISA、BIA Core)によって測定されるように、同一エピトープと結合する。
本発明は、IL-9またはその断片を中和する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のscFv、またはそれらの断片もしくは変異体の一部(すなわち、VHドメイン、VLドメイン、VH CDRI、VH CDR2、VH CDR3、VL CDRI、VL CDR2、またはVL CDR3)を含む、あるいはそれらからなる抗体も提供する。IL-9またはその断片を中和する抗体とは、IL-9がその受容体と結合する能力もしくはIL-9の別の生物活性を減少または消滅させる抗体を意味する。一実施形態では、IL-9またはその断片を中和する抗体は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVHドメイン、またはそれらのヒト化したもの、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。
別の実施形態では、IL-9またはその断片を中和する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のVLドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9またはその断片を中和する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のVH CDRドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。好ましい実施形態では、IL-9またはその断片を中和する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のVH CDR3、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9またはその断片を中和する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVL CDRドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の好ましい実施形態では、IL-9またはその断片を中和する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVL CDR3、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
本発明は、例えば、後の実施例に記載のアッセイなどの当技術分野において知られている任意の方法によって測定されるように、IL-9媒介性細胞増殖を阻害する(すなわち、減少または消滅させる)抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のアミノ酸配列を有するscFv、またはそれらの断片もしくは変異体の一部(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VH CDRI、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、またはVL CDR3)を含む、あるいはそれらからなる抗体も提供する。一実施形態では、IL-9媒介性細胞増殖を阻害する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVHドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9媒介性細胞増殖を阻害する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVLドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。好ましい実施形態では、IL-9媒介性細胞増殖を阻害する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVH CDR3、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の好ましい実施形態では、IL-9媒介性細胞増殖を阻害する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVL CDR3、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
本発明は、IL-9またはその断片の活性を亢進する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)であって、前記抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に由来するscFv、またはそれらの断片もしくは変異体の一部(すなわち、VHドメイン、VLドメイン、VH CDRI、VH CDR2、VH CDR3、VL CDRI、VL CDR2、またはVL CDR3)を含む、あるいはそれらからなる抗体も提供する。IL-9またはその断片の活性を「亢進する」抗体とは、IL-9がその受容体と結合する能力を増加させる抗体を意味する。一実施形態では、IL-9またはその断片の活性を亢進する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVHドメイン、またはそれらの変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9またはその断片の活性を亢進する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVLドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9またはその断片の活性を亢進する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVH CDRドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。好ましい実施形態では、IL-9またはその断片の活性を亢進する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVH CDR3、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、IL-9またはその断片の活性を亢進する抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれているVL CDRドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる。
本発明は、IL-9と免疫特異的に結合する(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)、および異種ポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる融合タンパク質も提供する。抗体に融合される異種ポリペプチドは、抗体を望ましい細胞に向けるのに有用であることが好ましい。別の実施形態では、抗体に融合される異種ポリペプチドは、アルブミンである(組換えヒト血清アルブミンまたはその断片もしくは変異体を含むがそれらに限定されない(全体として参照により本明細書に組み込まれる、例えば、1999年3月2日に発行された米国特許第5,876,969号、EP特許0413622、および1998年6月16日に発行された米国特許第5,766,883号を参照))。好ましい実施形態では、本発明の抗体(その断片または変異体を含む)は、成熟型のヒト血清アルブミンと融合される。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体(その断片または変異体を含む)は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基1〜x(xは、1〜575の整数であり、アルブミン断片は、ヒト血清アルブミン活性を有する)を含む、あるいはそれらからなるポリペプチド断片と融合される。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体(その断片または変異体を含む)は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基1〜Z(zは、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,766,883号に記載のように、369〜419の整数である)を含む、あるいはそれらからなるポリペプチド断片と融合される。本発明の抗体(その断片または変異体を含む)は、異種タンパク質(例えば、免疫グロブリンFcポリペプチドまたはヒト血清アルブミンポリペプチド)のNあるいはC末端に融合させることができる。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVHドメインのいずれか1種類または複数のアミノ酸配列、またはMH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のVLドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および異種ポリペプチド配列を含む、あるいはそれらからなる。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDRのいずれか1、2、3種類またはそれ以上のアミノ酸配列、またはMH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のVL CDR、またはそれらの断片もしくは変異体のいずれか1、2、3種類またはそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および異種ポリペプチド配列を含む、あるいはそれらからなる。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDR3、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および異種ポリペプチド配列を含む、あるいはそれらからなり、融合タンパク質は、IL-9と免疫特異的に結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1の少なくとも1種類のVHドメインのアミノ酸配列、およびMH9A3、MH9D1、またはMH9L1の少なくとも1種類のVLドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および異種ポリペプチド配列を含む、あるいはそれらからなる。融合タンパク質のVHおよびVLドメインは、同一scFvに対応していることが好ましい、さらに別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のVH CDRのいずれか1、2、3種類またはそれ以上のアミノ酸配列、およびMH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1のVL CDR、またはそれらの断片もしくは変異体のいずれか1、2、3種類またはそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および異種ポリペプチド配列を含む、あるいはそれらからなる。2、3、4、5、6種類またはそれ以上のVHCDRまたはVLCDRは、同一抗体に対応していることが好ましい。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に包含される。
本発明は、IL-9と免疫特異的に結合する抗体(scFvおよび抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)の混合物であって、混合物は、少なくとも1、2、3、4、5種類またはそれ以上の本発明の様々な抗体を有する混合物も提供する。
本発明は、IL-9と免疫特異的に結合する抗体(scFvおよび抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)のパネルであって、パネルは、少なくとも1、2、3、4、5種類またはそれ以上の本発明の様々な抗体を有するパネルも提供する。特に、本発明は、可溶型のIL-9、膜結合型のIL-9、および/または膜結合型と可溶型双方のIL-9と免疫特異的に結合する様々な抗体のパネルを提供する。具体的実施形態では、本発明は、IL-9に対する様々な親和性、IL-9に対する様々な特異性、または様々な解離速度を有する抗体のパネルを提供する。本発明は、少なくとも10種類、好ましくは少なくとも25種類、少なくとも50種類、少なくとも75種類、少なくとも100種類、少なくとも125種類、少なくとも150種類、少なくとも175種類、少なくとも200種類、少なくとも250種類、少なくとも300種類、少なくとも350種類、少なくとも400種類、少なくとも450種類、少なくとも500種類、少なくとも550種類、少なくとも600種類、少なくとも650種類、少なくとも700種類、少なくとも750種類、少なくとも800種類、少なくとも850種類、少なくとも900種類、少なくとも950種類、または少なくとも1000種類の抗体のパネルを提供する。抗体のパネルは、例えば、ELISAなどのアッセイ用96ウエルプレートで使用することができる。
本発明は、1種類または複数の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を含む組成物を提供する。一実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれるVHドメイン、またはそれらの変異体のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれるVH CDR1、またはそれらの変異体のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1に含まれるVH CDR2、またはそれらの変異体のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、図1〜4に示すように、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1に含まれるVH CDR3のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。
本発明は、1種類または複数の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を含む組成物を提供する。一実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVHドメインのいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVH CDR1のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVH CDR2のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVH CDR3のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。
本発明は、1種類または複数の抗体(scFv、または本発明の抗体断片もしくは変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を含む組成物を提供する。一実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVHドメインのいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVH CDR1のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVH CDR2のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVH CDR3のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。
1種類または複数の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を含む組成物を提供する本発明の他の実施形態を以下に列挙する。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVLドメインのいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVL CDR1のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVL CDR2のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVL CDR3のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。
1種類または複数の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を含む組成物を提供する本発明の他の実施形態を以下に列挙する。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVLドメインのいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVL CDR1のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体のVL CDR2のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVL CDR3のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。
1種類または複数の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を含む組成物を提供する本発明の他の実施形態を以下に列挙する。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVLドメインのいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVL CDR1のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体のVL CDR2のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体に含まれるVL CDR3のいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体のVHドメインのいずれか1種類または複数のアミノ酸配列、およびMH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体のVLドメインのいずれか1種類または複数のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる1、2、3、4、5種類またはそれ以上の抗体を含む(VHおよびVLドメインは、同一の特異性を持つscFvに由来する)。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、1種類または複数の融合タンパク質を含む。
以下でより詳細に述べるように、本発明の組成物は、単独または他の組成物と組み合わせて使用することができる。抗体(scFvおよび本発明の抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)は、NまたはC末端において異種ポリペプチドと組換えにより融合させ、またはポリペプチドもしくは他の組成物と化学的にコンジュゲートさせる(共有結合的および非共有結合的コンジュゲーションを含む)ことができる。例えば、本発明の抗体は、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などの検出アッセイおよびエフェクター分子における標識として有用な分子と組み換え的に融合またはコンジュゲートさせることができる。例えば、PCT公開WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 米国特許第5,314,995号; およびEP 396,387を参照されたい。
本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)は、例えば、IL-9を精製および検出するため、およびin vitroとin vivoにおける診断法および治療法を含む、膜結合IL-9またはIL-9受容体を発現する細胞に本発明のポリペプチドを標的とするために使用することができるが、これらに限定されるものではない。例えば、抗体には、生物試料中のIL-9のレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用がある。例えば、Harlow他、Antibodies: A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988年)を参照されたい(全体として参照により本明細書に組み込む)。
本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)は、抗体の合成について当技術分野において知られている任意の方法、特に、化学合成、または好ましくは組換え発現技法によって作製することができる。
IL-9と免疫特異的に結合する単鎖Fvは、当技術分野において知られているファージディスプレーを用いて作製することができる。ファージディスプレー法では、ファージ粒子の表面上に機能性抗体ドメインが提示され、それらをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶ。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列は、動物cDNAライブラリー(例えば、リンパ組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー)または合成cDNAライブラリーから増幅される。VHおよびVLドメインをコードするDNAは、PCRによりscFvリンカーによって連結され、ファージミドベクター中にクローニングされる。ベクターは、大腸菌(E. coli)に電気穿孔され、大腸菌はヘルパーファージに感染する。これらの方法で使用されるファージは、通常はfdおよびM13を含む繊維状ファージであり、VHおよびVLドメインは、通常はファージ遺伝子IIIあるいは遺伝子VIIIと組換え的に融合される。目的抗原(すなわち、IL-9またはその断片)と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉されている抗原を用い、選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するのに用いることができるファージディスプレー法の例には、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれるBrinkman他、J. Immunol. Methods、182巻、41〜50ページ、1995年; Ames他、J. Immunol. Methods、184巻、177〜186ページ、1995年; Kettleborough他、Eur. J. Immunol.、24巻、952〜958ページ、1994年; Persic他、Gene、187巻、9〜18ページ、1997年; Burton他、Advances in Immunology、57巻、191〜280ページ、1994年; PCT出願番号PCT/GB91/01; PCT公開WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401; W097/13844; および米国特許第5,698,426号; 第5,223,409号; 第5,403,484号; 第5,580,717号; 第5,427,908号; 第5,750,753号; 第5,821,047号; 第5,571,698号; 第5,427,908号; 第5,516,637号; 第5,780,225号; 第5,658,727号; 第5,733,743号および第5,969,108号に記載の方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、例えば後述のように、ファージ由来の領域をコードする抗体を単離および使用してヒト抗体を含む全抗体、またはその他の望ましい抗原結合断片を作製し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の望ましい宿主において発現させることができる。Fab、Fab'およびF(ab')2断片を組換え的に作製するための技法は、PCT公開WO 92/22324; Mullinax他、BioTechniques、12巻(6号)、864〜869ページ、1992年; Sawai他、AJR1、34巻、26〜34ページ、1995年; およびBetter他、Science、240巻、1041〜1043ページ、1988年に開示されている方法などの当技術分野において知られている方法を使用して用いることができる(前記参考文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれる)。
全抗体を作製するため、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを用い、scFvクローン中でVHまたはVL配列を増幅することができる。当業者に知られているクローニング技法を利用し、PCR増幅VHドメインを、VH定常領域、例えばヒトガンマ4定常領域を発現するベクター中にクローニングし、PCR増幅VLドメインを、VL定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができる。VHまたはVLドメインを発現させるためのベクターは、選ばれた発現系における重鎖および軽鎖、分泌シグナル、免疫グロブリン可変ドメイン用のクローニング部位、免疫グロブリン定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーの直接発現に適しているプロモーターを含むことが好ましい。VHおよびVLドメインは、必要な定常領域を発現するベクター中にもクローニングすることができる。次いで、重鎖転換ベクターおよび軽鎖転換ベクターを細胞系中に同時形質移入し、当業者に知られている技法を用い、完全長抗体、例えば、IgGを発現する安定または一過性の細胞系を作製することができる。
他の好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のscFvの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて1%〜10%減少させる抗体を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて1%〜10%減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来のscFvの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも10%かつ20%まで減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも20%かつ30%まで減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも30%かつ40%まで減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも40%かつ50%まで減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも50%かつ60%まで減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも60%かつ70%まで減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも70%かつ80%まで減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも80%かつ90%まで減少させる抗体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の可変ドメインの断片(例えば、VHドメイン、VLドメイン、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3)または変異体を含む抗体のIL-9ポリペプチドとの結合を競合阻害アッセイにおいて少なくとも90%かつ100%まで減少させる抗体を提供する。
ヒトにおける抗体のin vivoの使用およびin vitroの検出アッセイを含む一部の使用については、ヒトまたはキメラ抗体を使用することが好ましいことがある。完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療上の処置には特に望ましい。各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,444,887号および第4,716,111号; ならびにPCT公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、W098/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741も参照されたい。具体的実施形態では、本発明の抗体は、本発明のヒト可変ドメインおよび別の免疫グロブリン分子、好ましくはヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域に対応する1種類または複数のVHおよびVLドメインを含む。具体的実施形態では、本発明の抗体は、本発明のヒト可変ドメインおよび別の免疫グロブリン分子、好ましくはヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域に対応する1種類または複数のCDRを含む。他の実施形態では、本発明の抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの断片もしくは変異体に由来するヒト可変領域の1種類または複数に対応する1、2、3、4、5、6種類またはそれ以上のVL CDRまたはVH CDR、およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域(および、場合によりMH9A3、MH9D1、またはMH9L1の可変領域に由来しないCDR)を含む。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、同一の可変ドメイン、またはそれらの断片もしくは変異体に対応するVH CDR3、VL CDR3、または両者、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域を含む。
キメラ抗体は、抗体の様々な部分が、ヒト抗体に由来する可変領域および非ヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの様々な免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野において知られている。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるMorrison、Science、229巻、1202ページ、1985年; Oi他、BioTechniques、4巻、214ページ、1986年; Gillies他、J. Immunol. Methods、125巻、191〜202ページ、1989年; 米国特許第5,807,715号; 第4,816,567号; および第4,816,397号を参照されたい。ヒト種由来の1種類または複数のCDRおよび非ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域(例えば、イヌまたはネコ免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域)を含むキメラ抗体は、例えば、CDRグラフティング(EP 239,400; PCT公開WO 91/09967; 米国特許第5,225,539号; 第5,530,101号; および第5,585,089号)、ベニアリング(veneering)またはリサーフェイシング(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan、Molecular Immunology、28巻(4/5号)、489〜498ページ、1991年; Studnicka他、Protein Engineering、7巻(6号)、805〜814ページ、1994年; Roguska他、PNAS、96巻、969〜973ページ、1994年)、およびチェインシャフリング(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)を含む当技術分野において知られている様々な技法を用いて作製することができる。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの変異体のVH CDR3またはVL CDR3のいずれか1つのアミノ酸配列を有するヒトCDR3、および非ヒトフレームワーク領域または対応するMH9A3、MH9D1、またはMH9L1のscFv内のフレームワークと異なるヒトフレームワーク領域を含む。フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、好ましくは改善するため、CDRドナー抗体由来の対応する残基により置換されることが多い。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において知られている方法により、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置において異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較により同定される(全体として参照により本明細書に組み込まれるQueen他、米国特許第5,585,089号; Riechmann、他、Nature、332巻、323ページ、1988年を参照)。
さらに、本発明の抗体を利用し、当業者によく知られている技法を用いてIL-9ポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製することができる。(例えば、GreenspanおよびBona、FASEB、17巻(5号)、437〜444ページ、1993年; およびNissinoff、J Immunol.、147巻(8号)、2429〜2438ページ、1991年を参照。)例えば、IL-9と結合し、その受容体とのIL-9の結合を競合的に阻害する(例えば、後の開示するような当技術分野においてよく知られているアッセイによって測定されるように)本発明の抗体を用い、IL-9リガンド/受容体結合ドメインを模倣し、その結果としてIL-9受容体と結合しかつIL-9受容体を中和する抗イディオタイプを作製することができる。このような中和抗イディオタイプ(このような抗イディオタイプのFab断片などの抗体断片または変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を治療計画において用い、IL-9を中和することができる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を用い、IL-9リガンド/受容体と結合させることにより、IL-9媒介性生物活性を遮断することができる。あるいは、IL-9結合ドメインを「模倣する」抗イディオタイプは、IL-9受容体と結合し、IL-9受容体媒介性シグナル伝達を低下させることができる。このようなアゴニスト抗イディオタイプ(これらの抗イディオタイプのアゴニストFab断片を含む)を治療計画において用い、IL-9受容体媒介性シグナル伝達を減少または亢進させることができる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を用い、IL-9リガンド/受容体と結合させることにより、IL-9媒介性生物活性を刺激することができる。
本発明の抗体分子(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)が化学的に合成、または組換えにより発現されたら、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインAの後の特異的抗原に対する親和性により、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解性の差によるなどの免疫グロブリン分子、より一般にはタンパク質分子を精製するための当技術分野において知られている任意の方法により、またはタンパク質を精製するためのその他の標準的技法により精製することができる。さらに、本発明の抗体を、本明細書に記載の、さもなければ当技術分野において知られている異種ポリペプチド配列と融合させ、精製を容易にすることができる。
本発明は、本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)をコードするヌクレオチド配列を含む、あるいはそれらからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明は、例えば、後に定義するような、高いストリンジェンシー、あるいは中程度もしくは低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の下で本発明の抗体またはそれらの断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸と相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている任意の方法によって得られ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列も決定することができる。表1に記載するようにscFV抗体およびそのVHドメイン、VLドメインおよびCDRのアミノ酸配列は知られているため、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野においてよく知られている方法を用いて決定することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンは、本発明の抗体をコードする核酸を作製するように構築される。抗体をコードするこのようなポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから構築することができ(例えば、Kutmeier他、BioTechniques、17巻、242ページ、1994年に記載のように)、手短に言うと、抗体をコードする配列の部分を含む重複オリゴヌクレオチドを合成し、それらのオリゴヌクレオチドをアニールし連結し、次いで連結されたオリゴヌクレオチドをPCRにより増幅するものである。
あるいは、抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)をコードするヌクレオチドは、適当な源由来の核酸から作製することができる。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手できないが抗体分子の配列が知られている場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、配列の3'および5'末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるPCR増幅または例えば、抗体をコードするcDNAライブラリー由来のcDNAクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングにより、適当な源(例えば、抗体cDNAライブラリー、または本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から作製されるcDNAライブラリー、またはそれらから単離される核酸、好ましくはポリA+RNA)から化学的に合成または入手することができる。次いで、PCRによって作製された増幅核酸を、当技術分野においてよく知られている任意の方法を用い、複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)のヌクレオチド配列が決定されたら、抗体のヌクレオチド配列の操作について当技術分野においてよく知られている方法、例えば、組換えDNA技法、部位特異的変異誘発、PCRなど(例えば、どちらも全体として参照により本明細書に組み込まれるSambrook他、1990年、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NYおよびAusubel他、編、1998年、Current Protocols In Molecular Biology、John Wiley & Sons、NYに記載の技法を参照)を用いて操作し、例えば、アミノ酸置換、欠失、および/または挿入を作り出すために異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製することができる。具体的実施形態では、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの断片もしくは変異体のVHおよびVLドメインの1種類または複数は、当技術分野において知られている組換えDNA技術を用いてフレームワーク領域内に挿入される。具体的実施形態では、MH9A3、MH9D1、もしくはMH9L1、またはそれらの断片もしくは変異体のCDRの1、2、3、4、5、6種類またはそれ以上は、当技術分野において知られている組換えDNA技術を用いてフレームワーク領域内に挿入される。フレームワーク領域は、天然に存在する領域またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、ヒトフレームワーク領域であることが好ましい(例えば、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、ヒトフレームワーク領域のリスト作製についてのChothia他、J. Mol. Biol.、278巻、457〜479ページ、1998年を参照)。フレームワーク領域とCDRの組合せによって作製されるポリヌクレオチドは、IL-9と特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)をコードすることが好ましい。後述のように、1種類または複数のアミノ酸置換を有する抗体または抗体断片の変異体をコードするポリヌクレオチドは、フレームワーク領域内に作製されることが好ましく、アミノ酸置換は、抗体のその抗原との結合を改善することが好ましい。さらに、このような方法を用い、抗体分子、または抗体断片もしくは変異体を作製するために鎖内ジスルフィド結合に関与し、1個または複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く1種類または複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換もしくは欠失を作ることができる。ポリヌクレオチドに対する他の変化は、本発明に包含され、当業者の範囲に含まれる。
抗体の組換え発現
本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子(例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの一部、または本発明の単鎖抗体)を含む)の組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。本発明の抗体分子(例えば、全抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの一部(重鎖または軽鎖可変ドメインを含むことが好ましいが必ずしも含むとは限らない))をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野においてよく知られている技法を用いる組換えDNA技術により、抗体分子を作製するための1種類または複数のベクターを作製することができる。すなわち、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法は、本明細書に記載されている。当業者によく知られている方法を用い、抗体コーディング配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技法、合成技法、およびin vivo遺伝的組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターと動作可能に連結された本発明の抗体分子(例えば、全抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、もしくはそれらの一部、または重鎖もしくは軽鎖CDR、単鎖Fv、もしくはそれらの断片もしくは変異体)をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターには、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列(例えば、各々の内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるPCT公開WO 86/05807; PCT公開WO 89/01036; および米国特許第5,122,464号を参照)が含まれ、抗体の可変ドメインを、全重鎖、全軽鎖、または全重鎖と全軽鎖の双方を発現させるためのこのようなベクター中にクローニングすることができる。
1種類または複数の発現ベクターは、従来の技法によって宿主細胞に伝達され、次いで、従来の技法によって培養されて本発明の抗体を産生する。したがって、本発明には、異種プロモーターと作動可能に連結された本発明の抗体分子(例えば、全抗体、その重鎖もしくは軽鎖、またはその一部、本発明の単鎖抗体、またはそれらの断片もしくは変異体)をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。好ましい実施形態では、全抗体分子の発現のため、以下に詳述するように、重鎖と軽鎖の双方をコードするベクターを、全免疫グロブリン分子を発現するための宿主細胞中で同時発現させることができる。
様々な宿主発現ベクター系を利用し、本発明の抗体分子を発現させることができる。このような宿主発現系は、目的コーディング配列が作製され、続いて精製される媒体であり、適切なヌクレオチドコーディング配列により形質転換または形質移入された場合にin situにおいて本発明の抗体分子を発現する細胞でもある。これらには、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA、抗体コーディング配列を含む発現ベクターにより形質転換された細菌(例えば、大腸菌、枯草菌); 抗体コーディング配列を含む組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス属、ピキア); 抗体コーディング配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系; 抗体コーディング配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV; タバコモザイクウイルス、TMV)に感染した、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)により形質転換された植物細胞系; 哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳類ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター; ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を持つ哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3細胞)が含まれるが、これらに限定されるものではない。組換え抗体分子の発現、特に全組換え抗体分子の発現には、大腸菌などの細菌が用いられることが好ましく、真核細胞が用いられることがより好ましい。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併用するチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、抗体にとって有効な発現系である(Foecking他、Gene、45巻、101ページ、1986年; Cockett他、Bio/Technology、8巻、2ページ、1990年)。
細菌系では、多くの発現ベクターを、発現される抗体分子の目的とされる使用に応じて有利に選択することができる。例えば、抗体分子の薬剤組成物を作製するために、そのようなタンパク質を大量に製造しなければならない場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルな発現を導くベクターが望ましい。このようなベクターには、抗体コーディング配列が、融合タンパク質が産生されるように、lacZコーディング領域と共にフレーム内のベクター中に個別に連結されている大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther他、EMBO J.、2巻、1791ページ、1983年); pINベクター(InouyeおよびInouye、Nucleic Acids Res.、13巻、3101〜3109ページ、1985年; Van HeekeおよびSchuster、J. Biol. Chem.、24巻、5503〜5509ページ、1989年)などが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、ベクターを用い、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)を有する融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合と、続く遊離グルタチオン存在下の溶離によって溶解細胞から容易に精製することができる。場合により、このようなベクターは、クローン化標的遺伝子産物がGST部分から放出されるように、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位が含まれるように設計される。
昆虫系では、Autographa califomica核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして用い、外来遺伝子を発現させることができる。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞内で増殖する。抗体コーディング配列を、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個別にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。
哺乳類宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、目的抗体コーディング配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび3つの部分からなるリーダー配列に連結することができる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivoの組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)における挿入は、生存可能であり、感染宿主において抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらすはずである(例えば、LoganおよびShenk、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81巻、355〜359ページ、1984年を参照)。挿入された抗体コーディング配列の効率的翻訳には、特異的開始シグナルも必要である。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を保証するため、望ましいコーディング配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然と合成の双方の様々な起源であってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー因子、転写終結因子などを含めることによって強化することができる(例えば、Bittner他、Methods in Enzymol.、153巻、51〜544ページ、1987年を参照)。
さらに、挿入配列の発現をモジュレートし、または望まれる特異的様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選ぶことができる。このようなタンパク質産物の修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要なことがある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対する特徴および特異的機序を有する。適切な細胞系または宿主系を選び、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証することができる。この目的で、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳類宿主細胞には、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、NSO、MDCK、293、3T3、W138、特に、例えばBT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47Dなどの乳癌細胞系、および例えば、CRL7030およびHsS78Bstなどの正常な哺乳類腺細胞系が含まれるが、これらに限定されるものではない。
組換えタンパク質の長期で高収率な産生には、安定な発現が好ましい。例えば、抗体を安定に発現する細胞系を設計することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いることよりはむしろ、適切な発現制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など)、および選択マーカーによって制御されるDNAにより宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後、設計した細胞を富裕培地中で1〜2日間成長させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞をそれらの染色体中にプラスミドを安定に組み入れて成長させてフォーカスを形成し、細胞系にクローニングおよび拡大することができる。この方法を有利に使用し、抗体分子を発現する細胞系を設計することができる。このように設計された細胞系は、抗体分子と直接または間接に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用である。
それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞において用いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler他、Cell、11巻、223ページ、1977年)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskiおよびSzybalski、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、48巻、202ページ,1992年)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy他、Cell、22巻、817ページ、1980年)遺伝子を含むがそれらに限定されない多くの選択系を使用することができる。また、以下の遺伝子、すなわちメトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr(Wigler他、Natl. Acad. Sci. USA、77巻、357ページ、1980年; OHare他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78巻、1527ページ,1981年); ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(MulliganおよびBerg、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、78巻、2072ページ、1981年); アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Clinical Pharmacy、12巻、488〜505ページ; WuおよびWu、Biotherapy、3巻、87〜95ページ、1991年; Tolstoshev、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.、32巻、573〜596ページ、1993年; Mulligan、Science、260巻、926〜932ページ、1993年; およびMorganおよびAnderson、Ann. Rev. Biochem.、62巻、191〜217ページ、1993年; T1B TECH、11巻(5号)、155〜215ページ、1993年5月); およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerre他、Gene、30巻、147ページ、1984年)の選択を基礎として、代謝拮抗剤耐性を利用することができる。組換えDNA技術の当技術分野において一般に知られている方法をルーチン的に応用し、望ましい組換えクローンを選択することができ、そのような方法は、例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるAusubel他(編)、Current Protocols In Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY、1993年; Kriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY、1990年; およびDracopoli他(編)、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons、NY、1994年、12および13章; Colberre-Garapin他、J. Mol. Biol.、150巻、1ページ、1981年に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって高めることができる(総説については、BebbingtonおよびHentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、第3巻(Academic Press、New York、1987年)を参照)。抗体を発現するベクター系内のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養液中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるはずである。増幅領域は、抗体のコーディング配列に関係しているため、抗体の産生も増加するはずである(Crouse他、Mol. Cell. Biol.、3巻、257ページ、1983年)。
宿主細胞を、本発明の2種類の発現ベクター、すなわち重鎖由来のポリペプチドをコードする第1のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第2のベクターにより同時形質移入することができる。この2種類のベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含むことができる。あるいは、重鎖と軽鎖ポリペプチドの双方をコードし、双方を発現することができる単一ベクターを使用することができる。このような状況では、有毒な遊離重鎖の過剰を避けるため、軽鎖は、重鎖の前に置かれることが好ましい(Proudfoot、Nature、322巻、52ページ、1986年; Kohler、Proc. Natl. Acad. Sci., USA、77巻、2197ページ、1980年)。重鎖および軽鎖用のコーディング配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含むことができる。
本発明の抗体分子が組換え発現によって産生されたら、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインAの後の特異的抗原に対する親和性により、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解性の差によるなどの免疫グロブリン分子、より一般にはタンパク質分子を精製するための当技術分野において知られている任意の方法、またはタンパク質を精製するためのその他の標準的技法により精製することができる。さらに、本発明の抗体を、本明細書に記載の、さもなければ当技術分野において知られている異種ポリペプチド配列と融合させ、精製を容易にすることができる。
本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)は、様々な方法で特徴付けることができる。特に、本発明の抗体および関連分子は、本明細書に記載の技法または当技術分野において知られているルーチン的に改良された技法を用い、IL-9またはIL-9の断片と免疫特異的に結合する能力についてアッセイすることができる。本発明の組成物が免疫特異的に結合することができるIL-9またはIL-9の断片には、天然のヒトIL-9またはそれらの断片もしくは変異体が含まれるが、それらに限定されるものではない。本発明の組成物は、ヒトIL-9またはそれらの断片と結合することが好ましい。IL-9またはそれらの断片と免疫特異的に結合する本発明の抗体の能力についてのアッセイは、溶液中(例えば、Houghten、Bio/Techniques、158巻13、412〜421ページ、1992年)、ビーズ上(例えば、Lam、Nature、354巻、82〜84ページ、1991年)、チップ上(例えば、Fodor、Nature、364巻、555〜556ページ、1993年)、細菌上(例えば、米国特許第5,223,409号)、胞子上(例えば、特許第5,571,698号; 第5,403,484号; および第5,223,409号)、プラスミド上(例えば、Cull他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、1865〜1869ページ、1992年)またはファージ上(例えば、ScottおよびSmith、Science、249巻、386〜390ページ、1990年; Devlin、Science、249巻、404〜406ページ、1990年; Cwirla他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87巻、6378〜6382ページ、1990年; およびFelici、J. Mol. Biol.、222巻、301〜310ページ、1991年)で行うことができる(これらの参考文献の各々は、全体として参照により本明細書に組み込まれる)。次いで、IL-9またはIL-9の断片と免疫特異的に結合すると同定された抗体は、本明細書に記載の、さもなければ当技術分野において知られている技法を用いまたはルーチン的に改良し、それらの特異性およびIL-9またはIL-9の断片に対する親和性についてアッセイすることができる。
本発明の抗体は、当技術分野において知られている任意の方法により、IL-9との免疫特異的結合および他の抗原との交差反応性についてアッセイすることができる。特に、可溶型または膜結合型のIL-9と免疫特異的に結合する抗体の能力および特定の種(例えば、マウス、サルまたはヒト、好ましくはヒト)由来のIL-9ポリペプチドに対する抗体、断片、または変異体の特異性は、本明細書に記載の、さもなければ当技術分野において知られている技法を用いまたはルーチン的に改良し測定することができる。
免疫特異的結合および交差反応性を分析するのに使用することができるイムノアッセイには、数例を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの技法を用いる競合的および非競合的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなアッセイは決まりきっており、当技術分野においてよく知られている(例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるAusubel他、編、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、New Yorkを参照)。例示的イムノアッセイを以下に簡単に記載する(しかし、限定するものとは意図していない)。
免疫沈降プロトコルは、一般的に、タンパク質ホスファターゼおよび/またはプロテアーゼ阻害剤(例えば、EDTA、PMSF、159アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)が添加されたRIPA緩衝液(１% NP-40またはTriton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム(pH7.2)、1%トラジロール)などの溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解すること、細胞溶解液に抗体を加えること、40℃において一定時間(例えば、4時間まで)インキュベートすること、細胞溶解液にプロテインAおよび/またはプロテインGセファロースビーズを加えること、40℃において約1時間以上インキュベートすること、溶解緩衝液中でビーズを洗浄すること、およびSDS/試料緩衝液中にビーズを再懸濁することを含む。目的抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、抗体の抗原との結合を増加させバックグラウンドを減少させるために改変することができるパラメータ(例えば、セファロースビーズにより細胞溶解液を予め澄明にすること)について精通しているであろう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる論議については、例えば、Ausubel他、編、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、New Yorkの10.16.1を参照されたい。
ウエスタンブロット分析は、一般的に、タンパク質試料を調製すること、ポリアクリルアミドゲル(例えば、抗原の分子量に応じて8%〜20% SDS-PAGE)におけるタンパク質試料の電気泳動、ニトロセルロース、PVDFまたはナイロンなどの膜にポリアクリルアミドゲルからタンパク質試料を移すこと、ブロッキング溶液(例えば、3% BSAまたは無脂肪乳を含むPBS)中で膜をブロックすること、洗浄緩衝液(例えば、PBS-Tween 20)中で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液中で希釈された一次抗体(目的抗体)により膜をブロックすること、洗浄緩衝液中で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)または放射性分子(例えば、12Pまたは121I)にコンジュゲートされた二次抗体(一次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する)により膜をブロックすること、洗浄緩衝液中で膜を洗浄すること、および抗原の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増加させバックグラウンドノイズを減少させるために改変することができるパラメータについて精通しているであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる論議については、例えば、Ausubel他、編、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、New Yorkの10.8.1を参照されたい。
ELISAは、抗原を調製すること、抗原により96ウエルマイクロタイタープレートのウエルをコーティングすること、ウエルに結合しなかった抗原を洗い流すこと、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物にコンジュゲートされた抗体をウエルに加えて一定時間インキュベートすること、非結合抗体または非特異的結合抗体を洗い流すこと、およびウエルをコーティングする抗原と特異的に結合している抗体の存在を検出することを含む。ELISAにおいて、目的抗体は、検出可能な化合物にコンジュゲートされている必要はなく、その代わり、検出可能な化合物にコンジュゲートされた第2の抗体(目的抗体を認識する)をウエルに加えてもよい。さらに、抗原によりウエルをコーティングする代わりに、抗体をウエルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な分子は、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物にコンジュゲートされた抗原ということになる。当業者は、検出されるシグナルを増加させるために改変することができるパラメータ、ならびに当技術分野において知られているELISAの他の変形例について精通しているであろう。ELISAに関するさらなる論議については、例えば、Ausubel他、編、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、New Yorkの11.2.1を参照されたい。
抗体(scFvまたは本発明の抗体断片もしくはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)の抗原との結合親和性および抗体-抗原相互作用のオフレイトは、競合的結合アッセイによって測定することができる。競合的結合アッセイの一例は、増加量の非標識抗原の存在下における標識抗原(例えば、3Hまたは121I)と目的抗体とのインキュベーション、および標識抗原と結合している抗体の検出を含むラジオイムノアッセイである。IL-9に対する本発明の抗体の親和性および結合オフレイトは、スキャッチャード解析によるデータから測定することができる。第2の抗体との競合は、ラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。この場合、IL-9は、増加量の非標識第2抗IL-9抗体の存在下に、標識化合物(例えば、3Hまたは125I)にコンジュゲートされた本発明の抗体と一緒にインキュベートされる。
好ましい実施形態では、BIAcore速度解析を用い、抗体(scFvまたは本発明の抗体断片もしくはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)のIL-9、またはIL-9の断片との結合オンおよびオフレイトを測定する。BIAcore速度解析は、表面上に抗体が固定化されたチップからのIL-9の結合および解離を解析することを含む。
本発明の抗体(scFvまたは本発明の抗体断片もしくはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)は、当業者に知られている技法を用い、IL-9受容体に対するIL-9の結合を阻害、増加、または顕著ではないが変化させる能力についてもアッセイすることができる。例えば、IL-9の受容体を発現する細胞を、抗体の存在下または非存在下でIL-9と接触させ、細胞に対するIL-9結合を阻害、増加、または顕著ではないが変化させる抗体の能力を測定することができる。細胞に対するIL-9結合は、例えば、フローサイトメトリーまたはシンチレーションアッセイによって測定することができる。IL-9または抗体を放射性標識(例えば、32P、35S、および1251)または蛍光標識(例えば、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒドおよびフルオレサミン)などの検出可能な化合物により標識し、IL-9とIL-9受容体および/またはIL-9と本発明の抗体の間の相互作用の検出を可能にすることができる。あるいは、IL-9受容体に対するIL-9結合を阻害、増加、または顕著ではないが変化させる本発明の抗体の能力は、無細胞アッセイにおいて測定することができる。例えば、天然もしくは組換えIL-9またはそれらの断片を抗体と接触させることができ、IL-9受容体に対するIL-9結合を阻害、増加、または顕著ではないが変化させる本発明の抗体の能力を測定することができる。抗体は、固体支持体上に固定化され、IL-9またはIL-9断片は、検出可能な化合物により標識されていることが好ましい。あるいは、IL-9またはIL-9断片は、固体支持体上に固定化され、抗体は、検出可能な化合物により標識される。IL-9は、部分的または完全に精製することができる(例えば、他のポリペプチドまたは細胞溶解液の一部を部分的または完全に含まない)。さらに、IL-9ポリペプチドは、IL-9またはその生物活性部分および免疫グロブリンFcまたはグルタチオニンS-トランスフェラーゼなどのドメインを含む融合タンパク質であってもよい。あるいは、当業者によく知られている技法を用い、IL-9をビオチン化することができる(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals; Rockford、IL)。
本発明の抗体(scFvまたは本発明の抗体断片もしくはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)は、当業者に知られている技法を用い、IL-9誘発性細胞増殖を阻害、刺激、または顕著ではないが変化させる能力についてもアッセイすることができる。さらに、本発明の抗体、またはそれらの断片もしくは変異体は、細胞のシグナル伝達分子および転写因子のIL-9誘発性活性化を遮断、刺激、または顕著ではないが変化させる能力についてもアッセイすることができる。
本発明の抗体、またはそれらの断片もしくは変異体は、IL-9活性を中和、亢進、または顕著ではないが変化させる能力についてもアッセイすることができる。例えば、本発明の抗体、またはそれらの断片もしくは変異体は、IL-9の受容体を発現する細胞にIL-9が結合するのを阻害する能力についてルーチン的に試験することができる。
本発明は、融合タンパク質を作製するために、異種ポリペプチド(またはその部分、好ましくはポリペプチドの少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個または少なくとも100個のアミノ酸)に組換え的に融合、または化学的にコンジュゲートされた(共有結合性と非共有結合性コンジュゲーションを共に含む)抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を包含する。融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して生じることがある。例えば、本発明の抗体を用い、本発明の抗体または特定の細胞に結合する抗原と結合する本発明の抗体に異種ポリペプチドを融合またはコンジュゲートさせることによりin vitroあるいはin vivoにおいて異種ポリペプチドを特定の細胞タイプの標的とすることができる。異種ポリペプチドに融合またはコンジュゲートされた抗体は、当技術分野において知られている方法を用いるin vitroのイムノアッセイおよび精製方法でも使用することができる。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるHarbor他、同上、およびPCT公開WO 93/2 1232; EP 439,095; Narainura.他、Immanol. Lett.、39巻、91〜99ページ、1994年; 米国特許第5,474,981号; Gillies他、PNAS、89巻、1428〜1432ページ、1992年; Fell他、J. Immunol.、146巻、2446〜2452ページ、1991年)を参照されたい。
本発明には、抗体断片に融合またはコンジュゲートされた異種ポリペプチドを含む、あるいはそれらからなる組成物がさらに含まれる。例えば、異種ポリペプチドは、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、またはそれらの部分に融合またはコンジュゲートされていてもよい。抗体部分にポリペプチドを融合またはコンジュゲートさせる方法は、当技術分野において知られている。例えば、米国特許第5,336,603号; 第5,622,929号; 第5,359,046号; 第5,349,053号; 第5,447,851号; 第5,112,946号; EP 307,434; EP 367,166; PCT公開WO 96/04388; WO 9 1/06570; Ashkenazi他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88巻、10535〜10539ページ、1991年; Zheng他、J. Immunol.、154巻、5590〜5600ページ、1995年; およびVil他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、11337〜11341ページ、1992年を参照されたい(前記参考文献は参照により本明細書に組み込まれる)。
本発明の追加の融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および/またはコドンシャフリング(「DNAシャフリング」と総称される)の技法により作製することができる。DNAシャフリングを用い、本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)の活性をモジュレートすることができ、このような方法を用い、活性の変化した抗体(例えば、親和性がより高く解離速度がより遅い抗体)を作製することができる。一般的に、米国特許第5,605,793号; 第5,811,238号; 第5,830,721号; 第5,834,252号; および第5,837,458号、ならびにPatten他、Curr. Opinion Biotechnol.、8巻、724〜33ページ、1997年; Harayama、Trends Biotechnol.、16巻(2号)、76〜82ページ、1998年; Hansson、他、J. Mol. Biol.、287巻、265〜76ページ、1999年; およびLorenzoおよびBlasco、Biotechniques、24巻(2号)、308〜13ページ、1998年を参照されたい。(これらの特許および刊行物の各々は、全体として参照により本明細書に組み込まれる)。一実施形態では、本発明の抗体をコードするポリペプチドは、組み換えの前にエラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発にさらされることにより、変化させることができる。別の実施形態では、一部がIL-9と免疫特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドの1個または複数の部分を、例えば、1種類または複数の異種分子の1種類または複数の構成成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などにより組換えることができる。
さらに、本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を、ポリペプチドなどのマーカー配列と融合させ、精製を容易にすることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、とりわけpQEベクター(QIAGEN, Inc.、9259 Eton Avenue、Chatsworth、CA、91311)内に提供されるタグなどのヘキサヒスチジンポリペプチドであり、それらの多くは市販されている。例えば、Gentz他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、821〜824ページ、1989年に記載されているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する血球凝集素「HA」タグ(Wilson他、Cell、37巻、767ページ、1984年)および「フラッグ」タグ(DYKDDDDK、(配列番号3238)Stratagene、La Jolla、CA)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、診断薬または治療薬にコンジュゲートされている抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)をさらに包含する。抗体を診断的に用い、例えば、臨床試験手順の一部として腫瘍の増殖または進行をモニターまたは予知し、例えば、所与の治療計画の有効性を判定することができる。検出は、抗体を検出可能な物質とカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々なポジトロン放出断層撮影を用いるポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。検出可能な物質は、当技術分野において知られている技法を用い、抗体と直接的に、または中間体(例えば、当技術分野において知られているリンカーなど)を介して間接的にカップリングまたはコンジュゲートさせることができる。例えば、本発明による診断薬として使用する抗体にコンジュゲートさせることができる金属イオンについては米国特許第4,741,900号を参照されたい。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジンIビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれるが、これらに限定されるものではない。好適な蛍光材料の例には、169ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが含まれるが、これらに限定されるものではない。発光材料の例には、ルミノールが含まれるが、これに限定されるものではない。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれるが、これらに限定されるものではない。好適な放射性材料の例には、ヨウ素の放射性核種、炭素(14C)、イオウ(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115mIn、113mIn、112mIn)、およびテクネチウム、タリウム、ガリウム(67Ga)、パラジウム、モリブデン、キセノン(133Xe)、フッ素Rc、Bi、Lu、La、Yb、Ho、Ru、Sr、Sc、Sn、Gd、およびYが含まれるが、これらに限定されるものではない。
さらに、本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を、細胞毒、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療薬または放射性金属イオン、例えば、213Biなどのアルファ放射体などの治療部分とコンジュゲートさせることができる。具体的実施形態では、本発明の抗体は、放射性イオンをポリペプチドにコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレート剤に取り付けられる。好ましい実施形態では、本発明の抗体に取り付けられた大環状キレート剤に関係する放射性金属イオンは、inである。好ましい実施形態では、本発明の抗体に取り付けられた大環状キレート剤に関係する放射性金属イオンは、90Yである。具体的実施形態では、大環状キレート剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"-四酢酸(DOTA)である。他の具体的実施形態では、DOTAは、リンカー分子を介して本発明の抗体に取り付けられる。DOTAをポリペプチドにコンジュゲートさせるのに有用なリンカー分子の例は、当技術分野において一般に知られており、例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるDeNardo他、Clin Cancer Res.、4巻(10号)、2483〜90ページ、1998年; Peterson他、Biocoujug. Chem.、10巻(4号)、553〜7ページ、1999年; およびZimmerman他、Nucl. Med. Biol.、26巻(8号)、943〜50ページ、1999年を参照されたい。
細胞毒すなわち細胞傷害性薬剤には、細胞に対して有害な任意の薬剤が含まれ、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の小分子毒素および酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片などの分子が含まれる。例には、パクリタキソル(paclitaxol)、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド(VP-16)、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、RNAse、およびピューロマイシンならびにそれらの断片、変異体または相同体が含まれるが、これらに限定されるものではない。治療薬には、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5フルオロウラシル デカルバジン(decarbazine))、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオープ4(thioep4)、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン(AMC))、および有糸分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)、インプロスルファン、ピポサルファン、ベンゾドパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドパ(meturedopa)、ウレドパ(uredopa)、アルトレタミン、トリート4イルエネメタルニン(triet4ylenemetarnine)、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、トリメチロロメラミン(trimethylolomelamine)、クロルナファジン、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムス
チン、イホスファミド、ノベンビキン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フルテムスチン(flutemustine)、ニムスチン、ラニムスチン、アクラシノマイシン、アザセリン、カクチノマイシン、カリケアルニシン(calichearnicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルチノフィリン、クロモマイシン、デトルビシン(detorubicin)、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、デノプテリン(denopterin)、プテロプテリン、トリメトレキサート、フルダラビン、チアミプリン、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸(frolinic acid)、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル(bestrabucil)、ビスアントレン(bisantrene)、エダトラキセート(edatraxate)、デフォファミン(defofamine)、デメコルチン、ジアジクォン、エルフォルニチン(elfornithine)、酢酸エリプチニウム、エトグルシド(etoglucid)、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン(mitoguazone)、モピダモール(mopidamol)、ニトラクリン(nitracrine)、ペントスタチン、フェナメット(phenamet)、ピラルビシン、ポドフィリン酸(podophyllinic acid)、2-エチルヒドラジド、プロカルバジン、PSKO、ラゾキサン(razoxane)、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトル、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド(「Ara-C」)、タキソイド、例えば、パクリタキセル(「タキソール」、Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、NJ)、ドキセタキセル(「タキソテール」、Rhone-Poulenc Rorer、Antony、France)、ゲムシタビン、イホスファミド、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、CPT-11、トポイソメラーゼ阻害薬RFS 2000、ジフルオロメチルオルニチン(DMFO)、レチノイン酸、エスペラミシン、カペシタビン、および上記のいずれかの薬剤として許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)-イミダゾール、4ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケトキシフェン(keoxifene)、LY 117018、オナプリストン(onapristone)、トレルニフェン(torernifene)(フェアストン)を含む抗エストロゲン剤、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤、ならびに上記のいずれかの薬剤として許容される塩、酸または誘導体などの腫瘍に対してホルモン作用を調節または阻害する働きをする抗ホルモン剤も含まれる。
当技術分野において知られている技法を応用し、本発明の抗体を標識することができる。このような方法には、二官能性コンジュゲート剤(例えば、米国特許第5,756,065号; 第5,71.4,631号; 第5,696,239号; 第5,652,361号; 第5,505,931号; 第5,489,425号; 第5,435,990号; 第5,428,139号; 第5,342,604号; 第5,274,119号; 第4,994,560号; および第5,808,003号を参照されたい; 各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる)および直接カップリング反応(例えば、ボルトン-ハンターおよびクロラミン-T反応)の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。
コンジュゲートである本発明の抗体は、所与の生物学的反応を改変するために使用することができ、治療薬または薬物部分は、古典的化学治療剤に限定されると解釈するべきではない。例えば、薬物部分は、望ましい生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、アルファ毒素、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素、サポリン、モモルジン、ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アルファ-サルシンおよびコレラ毒素などの毒素; 腫瘍壊死因子、アルファ-インターフェロン、ベータ-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、TNF-アルファ、TNFベータ、AIM I(国際公開WO 97/33899を参照)、AIM II(国際公開WO 97/34911を参照)、Fasリガンド(Takahashi他、Int. Immunol.、6巻、1567〜1574ページ、1994年)、VEGI(国際公開WO 99/23105を参照)、血栓剤すなわち抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチンなどのタンパク質; または、例えば、リンホカイン、インターロイキン-I(1L-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン6(IL-6)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、または他の成長因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)は、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に取り付けることができる。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
治療部分を抗体にコンジュゲートさせる技法はよく知られており、例えば、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeld他(編)、243〜56ページ(Alan R. Liss, Inc.、1985年)中のAmon他、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、; Controlled Drug Delivery(第2版)、Robinson他(編)、623〜53ページ(Marcel Dekker, Inc.、1987年)中のHellstrom.他、「Antibodies For Drug Delivery」; Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications、Pinchera他(編)、475〜506ページ、1985年中のThorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: At Review」、; Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin他(編)、303〜16ページ(Academic Press、1985年)中の「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、およびThorpe他、「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」、Immunol. Rev.、62巻、119〜58ページ、1982年を参照されたい。
あるいは、本発明の抗体を第2の抗体とコンジュゲートさせ、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,676,980号においてSegalによって記載されている抗体ヘテロコンジュゲートを作製することができる。
単独または1種類または複数の細胞傷害性因子および/または1種類または複数のサイトカインと組み合わせて投与され、治療部分がコンジュゲートされている、またはされていない本発明の抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)は、治療薬として使用することができる。
本発明は、IL-9のエピトープを同定するのに使用することができる抗体(scFvおよび本発明の抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる他の分子を含む)を提供する。特に、本発明の抗体を用い、ヒトIL-9のエピトープを同定することができる。エピトープとして機能する断片は、任意の従来の手段によって作製することができる(例えば、Houghten、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82巻、5131〜5135ページ、1985年を参照、米国特許第4,631,211号にさらに記載されている)。標識抗体の診断的使用。IL-9と特異的に結合する抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を診断目的で使用し、IL-9またはIL-9受容体の異常な発現および/または活性に関係する疾患および/または障害を検出、診断、予知、またはモニターすることができる。本発明は、(a)IL-9と免疫特異的に結合する1種類または複数の本発明の抗体を用い、個人由来の生物試料においてIL-9の発現をアッセイすること; および(b)そのIL-9レベルを、例えば、正常な生物試料におけるIL-9の標準レベルと比較することを含み、IL-9の標準レベルと比較したIL-9のアッセイレベルの増加または減少は、異常な発現を示す、IL-9の異常発現の検出を提供する。
「生物試料」とは、個人から得られた任意の液体および/または細胞、体液、体組織、体細胞、細胞系、組織培養液、またはIL-9タンパク質またはmRNAを含有することができる他の供給源を意図している。体液には、血清、血漿、尿、滑液、気管支肺胞洗浄液、脊髄液、唾液、および粘液が含まれるが、これらに限定されるものではない。組織試料は、体内の事実上すべての組織から採取することができる。組織試料は、剖検材料からも入手することができる。哺乳類から組織生検および体液を入手する方法は、当技術分野においてよく知られている。生物試料にmRNAが含まれなければならない場合、組織生検が好ましい供給源である。
本発明は、(a)可溶性IL-9とのみ免疫特異的に結合するが、IL-9/IL-9受容体結合を阻害しない1種類または複数抗体、またはそれらの断片もしくは変異体を用い、個人由来の生物試料においてIL-9受容体の発現をアッセイすることを含むIL-9受容体の異常発現の検出を提供する。
IL-9と特異的に結合する本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を診断目的で使用し、IL-9に関係する自己免疫疾患および/または免疫不全症、および/または疾患または状態を検出、診断、予知、またはモニターすることができる。本発明は、(a)IL-9と免疫特異的に結合する1種類または複数の本発明の抗体を用い、個人由来の生物試料においてIL-9の発現をアッセイすること; および(b)そのIL-9レベルを、例えば、正常な生物試料におけるIL-9の標準レベルと比較することを含み、IL-9の標準レベルと比較したIL-9のアッセイレベルの増加または減少は、自己免疫疾患および/または免疫不全症を示す、IL-9の異常発現の検出を提供する。具体的実施形態では、IL-9のアッセイレベルの増加は、自己免疫などのアレルギー性障害または疾患を示す。他の具体的実施形態では、IL-9のアッセイレベルの減少は、免疫不全症を示す。異常なIL-9またはIL-9受容体産生は、骨髄組織、リンパ組織および/または上皮組織において見ることができる。
IL-9と特異的に結合するが、IL-9/IL-9受容体結合を阻害しない本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を診断目的で使用し、IL-9に関係する自己免疫疾患および/または免疫不全症、および/または疾患または状態を検出、診断、予知、またはモニターすることができる。本発明は、(a)IL-9と免疫特異的に結合する1種類または複数の本発明の抗体を用い、個人由来の生物試料においてIL-9受容体の発現をアッセイすること; および(b)そのIL-9受容体レベルを、例えば、正常な生物試料におけるIL-9受容体の標準レベルと比較することを含み、IL-9受容体の標準レベルと比較したIL-9受容体のアッセイレベルの増加または減少は、自己免疫疾患および/または免疫不全症を示す、IL-9受容体の異常発現の検出を提供する。具体的実施形態では、IL-9受容体のアッセイレベルの増加は、自己免疫などのアレルギー性障害または疾患を示す。他の具体的実施形態では、。IL-9受容体のアッセイレベルの減少は、免疫不全症を示す。
本発明の一態様は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおけるIL-9またはIL-9受容体の異常な発現に関係する疾患または障害の検出および診断である。一実施形態では、診断は、a)有効量の、IL-9と免疫特異的に結合する1種類または複数の本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を対象に投与すること(例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に); b)IL-9が発現される対象の部位に標識抗体を選択的に濃縮させるため(および、非結合標識分子をバックグラウンドレベルまで除去するため)に投与後、ある時間間隔を待つこと; c)バックグラウンドレベルを測定すること; およびd)バックグラウンドレベル以上、および疾患または障害のない者で観察されるレベル以上または以下の標識抗体またはその断片の検出が、対象がIL-9またはIL-9受容体の異常な発現に関係する特定の疾患または障害を有していることを示すように、対象における標識抗体を検出することを含む。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を、特定の系についてこれまでに測定された標準値と比較することにより決定することができる。上述のように、IL-9の異常な発現は、特にリンパ細胞および骨髄性細胞タイプにおいて起きることがある。IL-9受容体の異常な発現は、リンパおよび上皮組織において起きることがある。
当技術分野では、対象のサイズおよび使用する撮像システムが、診断画像を作製するのに必要な撮像部分の量を決定することは理解されているはずである。放射性同位元素部分の場合、ヒト被験者については、注入される放射能の量は、通常99Tc約5〜20ミリキューリーである。次いで、標識抗体は、特異的タンパク質を含む細胞の場所において優先的に蓄積するはずである。In vivoの腫瘍撮像は、S.W. Burchiel他、「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.」(Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer、S.W. BurchielおよびB. A. Rhodes、編、Masson Publishing Inc.、19 82年中の第13章)に記載されている。使用される標識のタイプおよび投与方法を含むいくつかの変数に応じ、被験者中の部位に標識分子を選択的に濃縮させるため、および非結合標識分子をバックグラウンドレベルまで除去するための投与後の時間間隔は、6〜48時間または6〜24時間または6時間〜である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、5〜20日または5〜10日である。
ある実施形態では、疾患または障害のモニタリングは、例えば、初期診断後1カ月、初期診断後6カ月、初期診断後1年など、疾患または障害を診断するための方法を繰り返すことによって行われる。
標識分子の存在は、in vivoスキャニングのための当技術分野において知られている方法を用い、患者において検出することができる。これらの方法は、使用される標識のタイプによって異なる。当業者は、特定の標識を検出するのに適切な方法を決定できるはずである。本発明の診断方法において使用することができる方法および装置には、コンピュータ断層撮影法(CT)、ポジトロン放出断層撮影(PET)などの全身スキャン、磁気共鳴映像法(MRI)、および超音波検査が含まれるが、これらに限定されるものではない。
具体的実施形態では、分子は放射性同位元素により標識され、放射線応答性の外科用器具を用いて患者において検出される(Thurston他、米国特許第5,441,050号)。別の実施形態では、分子は蛍光化合物により標識され、蛍光応答性の走査器具を用いて患者において検出される。別の実施形態では、分子はポジトロン放出金属により標識され、ポジトロン放出断層撮影を用いて患者において検出される。さらに別の実施形態では、分子は常磁性標識により標識され、磁気共鳴映像法を用いて患者において検出される。
本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、IL-9発現またはIL-9受容体発現によって細胞系および生物試料の免疫表現型検査に利用することができる。細胞母集団(IL-9および/またはIL-9受容体を発現する)、特に免疫細胞、すなわち、TおよびBリンパ球、肥満細胞、好酸球、マクロファージ、好中球および上皮細胞またはIL-9受容体についてスクリーニングするための本発明の抗体、断片、または変異体を用い、様々な技法を利用することができ、そのような技法には、抗体をコーティングした磁気ビーズ、固体マトリクス(すなわち、プレート)に取り付けられた抗体にによる「パニング」、およびフローサイトメトリーが含まれる(米国特許第5,985,660号; およびMorrison他、Cell、96巻、737〜49ページ、1999年)。
これらの技法は、血液学的悪性疾患(すなわち、急性白血病患者における微小残存病変(MRD))のある状態で見いだされる特定の細胞母集団および移植片対宿主病(GVHD)を予防するための移植における非自己細胞のスクリーニングを可能にする。あるいは、これらの技法は、ヒト臍帯血において見いだされるように、増殖および/または分化を受けることができる造血幹細胞および前駆体細胞のスクリーニングを可能にする。
本発明は、開示の疾患、障害、または状態のうち1種類または複数を治療するため、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒト患者に本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を投与することを含む抗体ベースの療法をさらに対象にする。本発明の治療用化合物には、本明細書に記載の本発明の抗体および本発明の抗体(および抗イディオタイプの抗体)をコードする核酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体を用い、本明細書に記載の疾患、障害、または状態のうちいずれか1種類または複数を含むがこれらに限定されない、IL-9またはIL-9受容体の異常な発現および/または活性に関係する疾患、障害、または状態を治療、改善または予防することができる。異常なIL-9発現および/または活性または異常なIL-9受容体発現および/または活性に関係する疾患、障害、または状態の治療および/または予防には、これらの疾患、障害、または状態に関係する症状を軽減することが含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の抗体は、当技術分野において知られている、または本明細書に記載の薬剤として許容される組成物として提供することができる。
IL-9、好ましくはIL-9誘発性シグナル伝達の作用薬または拮抗薬として機能する本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を動物に投与し、異常なIL-9発現、IL-9機能の欠如、異常なIL-9受容体発現、またはIL-9受容体機能の欠如に関係する疾患もしくは障害、またはIL-9の変調が治療の上で有益である任意の疾患もしくは候補疾患を治療、予防、または改善することができる。例えば、IL-9とその受容体間の相互作用を妨害する本発明の抗体を動物に投与し、異常なIL-9発現、過剰なIL-9機能、異常なIL-9受容体発現、または過剰なIL-9受容体機能に関係する疾患または障害を治療、予防、または改善することができる。
IL-9と免疫特異的に結合する1種類または複数の本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)を、治療薬として体内で局所的または全身的に使用することができる。本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、他のモノクローナルもしくはキメラ抗体、またはリンホカインと組み合わせて有利に利用することができる。
さらに、対象抗体は、他の喘息治療薬と併せて投与することができる。それらの例は、以下の表1に列挙される喘息治療薬である。
Figure 2005535572
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本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、単独または他のタイプの治療法(例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、抗腫瘍剤、抗血管形成剤および抗炎症剤)と組み合わせて投与することができる。一般に、患者の種と同一の種である種起源または種反応性(抗体の場合)の生成物の投与が好ましい。したがって、好ましい実施形態では、ヒトの抗体、断片、または変異体、(例えば、誘導体)、または核酸は、治療または予防のためヒト患者に投与される。
本発明の抗体には、以下の実施例において例示されるように、当技術分野においてよく知られている方法を用い、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のCDRがヒトフレームワーク領域と組み合わされたヒト化抗体が含まれる。これらのヒトフレームワーク領域は、便宜上4個の領域に分けられる。第1のフレームワーク領域は、第1のCDRの前に(N末端に)あり、第2のフレームワーク領域は、第1と第2のCDR間に存在し、第3のフレームワーク領域は、第2と第3のCDR間に存在し、第4のフレームワーク領域は、第3のCDRの後ろに(C末端に)存在する。以下の表2は、重鎖および軽鎖について知られているフレームワーク配列を列挙している。第1のカラムは、第1、第2、および第3のフレームワーク領域が含まれる重鎖のVHドメインを、第1および第2の生殖細胞系列CDRを含めて(すなわち、重鎖フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、フレームワーク3)列挙している。全ヒトIgh遺伝子座を配列決定した研究では、44個のVH配列が報告されている(全体として参照により本明細書に組み込まれるMatsuda, F.、他、J. Exp. Med.、188巻、1973ページ、1998年を参照)。第2のカラムは、様々なJH領域を列挙し、第4の重鎖フレームワーク領域を提供している。第3のカラムは、ラムダ軽鎖の第1、第2、および第3のフレームワーク領域が含まれるV1領域を、第1および第2の生殖細胞系列CDRを含めて(すなわち、ラムダ軽鎖フレームワーク1--CDR1--フレームワーク2--CDR2--フレームワーク3)列挙している。これらのラムダ配列は、全体として参照により本明細書に組み込まれるKawasaki K、Genome Res.、7巻(3号)、250〜61ページ、1997年3月の遺伝子座において報告されている。第4のカラムは、カッパ軽鎖の第1、第2、および第3のフレームワーク領域が含まれるカッパ軽鎖フレームワーク領域を、第1および第2の生殖細胞系列CDRを含めて(すなわち、カッパ軽鎖フレームワーク1--CDR1--フレームワーク2--CDR2--フレームワーク3)列挙している。これらのカッパ配列は、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれるKawasaki K、他、Eur. J. Immunol.、31巻(4号)、1017〜28ページ、2001年4月; Schable KFおよびZachau HG、Biol. Chem. Hoppe Seyler、374巻(11号)、1001〜22ページ、1993年11月; Brensing-Kuppers J.他、Gene、191巻(2号)、173〜81ページ、1997年6月3日で報告されている。第5のカラムは、様々なJκ領域を列挙し、第4の軽鎖フレームワーク領域を提供している。
このように、ヒト化重鎖を作製するため、第1のカラムにおいて参照される配列由来のフレームワーク領域1、2、および3、ならびに第2のカラム由来のフレームワーク領域4は、抗体MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の重鎖CDRと組み合わせられる。これらのフレームワーク配列の生殖細胞系列CDRは、省略され、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1 CDRにより置き換えられることが好ましい。同様に、ヒト化ラムダ軽鎖を作製するため、第3のカラムにおいて参照される配列由来のフレームワーク領域1、2、および3、ならびに第5のカラム由来の軽鎖フレームワーク領域4は、抗体MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の軽鎖CDRと組み合わせられる。あるいは、ヒト化カッパ軽鎖を作製するため、第4のカラムにおいて参照される配列由来のフレームワーク領域1、2、および3、ならびに第5のカラム由来の軽鎖フレームワーク領域4は、抗体MH9A3、MH9D1、またはMH9L1由来の軽鎖CDRと組み合わせられる。フレームワーク領域1、2、および3はすべて、同一配列由来であってもよく(例えば、重鎖についてはすべてVH1-18由来、ラムダについてはすべてV1-11由来)、または異なるフレームワーク源から組み合わされていてもよい(例えば、重鎖についてVH1-18由来のフレームワーク1、VH1-2由来のフレームワーク2、およびVH1-24由来のフレームワーク3)。この例は、例示的目的に過ぎず、作製することができるフレームワーク領域の組合せに関して限定しているとは決して見なすべきではない。同じように、軽鎖フレームワーク領域は、異なるラムダまたは異なるカッパフレームワーク源から組み合わされていてもよい。第1のカラムの重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列、第3のカラムのラムダ鎖フレームワーク配列、および第4のカラムのカッパ鎖フレームワーク配列は、国立医学図書館データベースのhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgiにおいて見いだすことができ、各々の配列は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本発明は、抗体MH9A3、MH9D1、またはMH9L1のCDRの1、2、3、4、5または6種類すべてが、表2に列挙されている個々のフレームワーク
のフレームワーク領域と組み合わされているヒト化抗体および抗体断片、ならびに表2に列挙されているフレームワーク領域の混合的組合せを包含する。
Figure 2005535572
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それらの断片を含むIL-9ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを対象とするイムノアッセイと、それらに関連する障害の治療の双方にとって、IL-9と免疫特異的に結合する本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)、または IL-9と免疫特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドをin vivoにおいて阻害および/または中和する高い親和性および/または効力を使用することが好ましい。このような抗体は、IL-9および/またはIL-9断片に対して親和性を有していることが好ましい。好ましい結合親和性には、解離定数すなわちKdが5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5Mまたは10-5M以下である親和性が含まれる。本発明の抗体は、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-4M、5×10-8M、または10-8M以下の解離定数すなわちKdでIL-9ポリペプチドまたはそれらの断片もしくは変異体と結合することがより好ましい。本発明の抗体は、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、または10-15以下の解離定数すなわちKdでIL-9ポリペプチドまたはそれらの断片もしくは変異体と結合することがより好ましい。本発明は、示された個々の値の間にあるいずれか1つの範囲内にある解離定数すなわちKdでIL-9ポリペプチドと結合する抗体を包含する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、IL-9活性を中和する。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、IL-9媒介性細胞増殖を阻害する。
好ましい実施形態では、本発明の抗体(抗体断片またはそれらの変異体を含む、あるいはそれらからなる分子を含む)は、可溶型IL-9のIL-9受容体との結合を阻害または低減する。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、可溶型IL-9によって誘発される細胞増殖を阻害または低減する。
別の実施形態では、本発明の治療または医薬組成物は、気管支過敏症、喘息を含むアトピー性アレルギー、および他のアレルギー性疾患、肺疾患、ならびに自己免疫疾患を治療、予防、または改善するため動物に投与される。自己免疫疾患には、例えば、関節炎、移植片拒絶、橋本甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症、選択的IgA欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、一般変異型免疫不全症(CVID)、X染色体無ガンマグロブリン血症、重症複合型免疫不全症(SCID)、ウィスコットアルドリッチ症候群、特発性好酸球増加症候群、単球性類白血病反応、単球性白血球増多症、単球性白血病、単球減少症、単球増加症、および移植片または移植拒絶反応が含まれる。アレルギー性疾患には特に喘息が含まれる。
本発明の治療または医薬組成物により治療、予防、改善、診断、および/または提案される可能性のあるこれらの障害に関係する自己免疫疾患および状態には、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、グルテン感受性腸疾患、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎(例えば、IgA腎症)、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎、多腺性内分泌障害、紫斑病(例えば、ヘンロッホ-シェンライン紫斑病)、ライター病、スティフマン症候群、自己免疫性肺炎症、心筋炎、IgA糸球体腎炎、高密度沈着疾患(dense deposit disease)、リウマチ性心疾患、ギランバレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の治療または医薬組成物により治療、予防、改善、診断、および/または提案される可能性のあるこれらの障害に関係する追加の自己免疫疾患および状態には、自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症(すなわち、橋本甲状腺炎)(例えば、細胞性および体液性甲状腺細胞傷害性を特徴とすることが多い)、全身性エリテマトーデス(例えば、循環および局所生成免疫複合体を特徴とすることが多い)、円板状狼瘡、グッドパスチャー症候群(例えば、抗基底膜抗体を特徴とすることが多い)、天疱瘡(例えば、表皮棘融解性抗体を特徴とすることが多い)、例えば、(a)グレーブス病(例えば、TSH受容体抗体を特徴とすることが多い)、(b)重症筋無力症(例えば、アセチルコリン受容体抗体を特徴とすることが多い)、および(c)インスリン抵抗性(例えば、インスリン受容体抗体を特徴とすることが多い)などの受容体自己免疫、自己免疫性溶血性貧血(例えば、抗体感作 RBCのファゴサイトーシスを特徴とすることが多い)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(例えば、抗体感作血小板のファゴサイトーシスを特徴とすることが多い)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の治療または医薬組成物により治療、予防、改善、診断、および/または提案される可能性のあるこれらの障害に関係する追加の自己免疫疾患および状態には、関節リウマチ(例えば、関節中の免疫複合体を特徴とすることが多い)、抗コラーゲン抗体による強皮症(例えば、核および他の核抗体を特徴とすることが多い)、混合結合組織病(例えば、抽出可能核抗原(例えば、リボ核タンパク質)に対する抗体を特徴とすることが多い)、多発性筋炎/皮膚筋炎(例えば、非ヒストンANAを特徴とすることが多い)、悪性貧血(例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体を特徴とすることが多い)、特発性アジソン病(例えば、体液性および細胞性副腎細胞傷害性を特徴とすることが多い)、不妊症(例えば、抗精子抗体を特徴とすることが多い)、原発性糸球体腎炎およびIgA腎症などの糸球体腎炎(例えば、抗基底膜抗体または免疫複合体を特徴とすることが多い)、水疱性類天疱瘡(例えば、基底膜中のIgGおよび補体を特徴とすることが多い)、シェーグレン症候群(例えば、複数の組織抗体、および/または特異的非ヒストン ANA(SS-B)を特徴とすることが多い)、糖尿病(例えば、細胞性および体液性島細胞抗体を特徴とすることが多い)、およびアドレナリン作用性薬物抵抗性(喘息または嚢胞性線維症によるアドレナリン作用性薬物抵抗性を含む)(例えば、ベータ-アドレナリン受容体抗体を特徴とすることが多い)、慢性活動性肝炎(例えば、平滑筋抗体を特徴とすることが多い)、原発性胆汁性肝硬変(例えば、ミトコンドリア抗体を特徴とすることが多い)、他の内分泌腺不全(例えば、場合によって特異的組織抗体を特徴とすることが多い)、白斑(例えば、メラニン細胞抗体を特徴とすることが多い)、血管炎(例えば、血管壁中のIgおよび補体および/または低い血清補体を特徴とすることが多い)、心筋梗塞後(例えば、心筋抗体を特徴とすることが多い)、開心術症候群(例えば、心筋抗体を特徴とすることが多い)、じんま疹(例えば、IgEに対するIgGおよびIgM抗体を特徴とすることが多い)、アトピー性; 皮膚炎(例えば、IgEに対するIgGおよびIgM抗体を特徴とすることが多い)、喘息(例えば、IgEに対するIgGおよびIgM抗体を特徴とすることが多い)、炎症性筋疾患、ならびに多くの他の炎症性、肉芽腫性、変形性、および萎縮性障害が含まれるが、これらに限定されるものではない。
好ましい実施形態では、本発明の治療または医薬組成物は、気管支過敏症またはアレルギー性疾患もしくは状態を治療、予防または改善するために動物に投与される。そのようなアレルギー性状態の例には、喘息、鼻炎、湿疹、慢性じんま疹、およびアトピー性皮膚炎が含まれるが、これらに限定されるものではなく、アレルギー性喘息を含むことが好ましい。別の好ましい実施形態では、組成物は、肺気腫、COPDおよび嚢胞性線維症などの異常なムチン産生が関与する障害を治療するために用いられる。
具体的実施形態では、抗体またはそれらの機能性誘導体をコードする配列を含む核酸は、遺伝子治療のため、IL-9および/またはその受容体の異常な発現および/または活性に関係する疾患または障害を治療、阻害または予防するために投与される。遺伝子治療は、発現されたまたは発現可能な核酸を被験者に投与することによって行われる治療を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療効果を媒介するそれらの核酸によってコードされたタンパク質を産生する。当技術分野において利用可能な遺伝子治療の方法はいずれも、本発明に従って使用することができる。例示的方法を以下に述べる。
遺伝子治療の方法に関する一般総説については、Goldspiel他、Clinical Pharmacy、12巻、488〜505ページ、1993年; WuおよびWu、Biotherapy、3巻、87〜95ページ、1991年; Tolstoshev、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.、32巻、573〜596ページ、1993年; Mulligan、Science、260巻、926〜932ページ、1993年; およびMorgan'およびAnderson、Ann. Rev. Biochem.、62巻、191〜217ページ、1993年; May、TIBTECH、11巻(5号)、155〜215ページ、1993年を参照されたい。使用することができる組換えDNA技術について当技術分野において一般的に知られている方法は、Ausubel他(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY、1993年; およびKriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY、1990年に記載されている。
好ましい態様では、本発明の組成物は、抗体をコードする核酸であって、前記核酸は、好適な宿主において抗体または断片またはキメラタンパク質またはそれらの重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である核酸を含む、あるいはそれらからなる。特に、このような核酸は、抗体コーディング領域と作動可能に連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターであって、前記プロモーターは、誘導性または構成性、場合により組織特異的であるプロモーターを有する。別の具体的実施形態では、核酸分子は、抗体コーディング配列およびその他の望ましい配列が、ゲノム中の望ましい部位において相同的組換えを促進する領域に挟まれ、抗体をコードする核酸の染色体内発現を提供する場合に使用される(KollerおよびSmithies、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、8932〜8935ページ、1989年; Zijlstra他、Nature、342巻、435〜438ページ、1989年)。具体的実施形態では、発現される抗体分子はscFvである。あるいは、核酸配列には、抗体の重鎖と軽鎖の双方を、またはそれらの断片もしくは変異体をコードする配列が含まれる。
患者への核酸の送達は、直接的(その場合、患者は核酸または核酸を運ぶベクターに直接曝露される)、あるいは間接的(その場合、細胞はまずin vitroにおいて核酸により形質転換され、次いで患者に移植される)のどちらであってもよい。これら2つのアプローチは、それぞれin vivoまたはex vivo遺伝子治療として知られている。
具体的実施形態では、核酸配列は、in vivoにおいて直接投与され、そこで発現してコードされている産物を産生する。これは、例えば、当技術分野において知られている多くの方法のいずれかにより、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸配列を構築し、例えば、欠陥もしくは弱毒化レトロウイルスもしくは他のウイルスベクターを用いる感染によって細胞内になるように核酸配列を投与することにより(米国特許第4,980,286号を参照)、または裸のDNAの直接注入により、またはマイクロパーティクルボンバードメント(例えば、遺伝子銃; Biolistic、Dupont)の使用、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤によるコーティング、リポソーム、マイクロパーティクル、もしくはマイクロカプセル中の封入により、または核に入ることが知られているペプチドに連結させて投与することにより、受容体媒介性エンドサイトーシスをうけやすいリガンドと連結させて投与することにより(例えば、WuおよびWu、J Biol. Chem.、262巻、4429〜4432ページ、1987年を参照)(受容体を特異的に発現する細胞タイプを標的とするのに使用することができる)行うことができる。別の実施形態では、リガンドが、エンドソームを崩壊させる融合誘導性ウイルスペプチドを含み、核酸をリソソーム分解から回避させる核酸-リガンド複合体を作製することができる。さらに別の実施形態では、特異的受容体を標的にすることにより、核酸をin vivoにおける細胞特異的取り込みおよび発現の標的とすることができる(例えば、PCT公開WO 92/06 180; WO 92/22635; W092/203 16; W093/14188, WO 93/2022 1を参照)。あるいは、核酸を細胞内導入し、相同的組換えによって発現用の宿主細胞DNA内に組み込むことができる(KollerおよびSmithies、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、8932〜8935ページ、1989年; Zijlstra他、Nature、342巻、435〜438ページ、1989年)。
具体的実施形態では、本発明の抗体またはそれらの断片もしくは変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる(Miller他、Meth. Enzymol.、217巻、581〜599ページ、1993年を参照)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みに必要な構成要素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、1種類または複数のベクター中にクローニングされ、患者への遺伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関する詳細は、Boesen他、Biotherapy、6巻、291〜302ページ、1994年に見いだすことができ、化学療法に対してより抵抗性のある幹細胞を作製するため造血幹細胞へmdr I遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示している他の参考文献は、Clowes他、J. Clin. Invest.、93巻、644〜651ページ、1994年; 219 Klein他、Blood、83巻、1467〜1473ページ、1994年; SalmonsおよびGunzberg、Human Gene Therapy、4巻、129〜141ページ、1993年; ならびにGrossmanおよびWilson、Curr. Opin. in Genetics and Devel.、3巻、110〜114ページ、1993年である。
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用することができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸器上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的な運搬体である。アデノウイルスは、呼吸器上皮に自然感染し、軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。KozarskyおよびWilson、Current Opinion in Genetics and Development、3巻、499〜503ページ、1993年は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の総説を提示している。Bout他、Human Gene Therapy、5巻、3〜10ページ、1994年は、アカゲザルの呼吸器上皮へ遺伝子を伝達するためにアデノウイルスベクターの使用を明らかにした。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用についての他の例は、Rosenfeld他、Science、252巻、431〜434ページ、1991年; Rosenfeld他、Cell、68巻、143〜155ページ、1992年; Mastrangeli他、J. Clin. Invest.、91巻、225〜234ページ、1993年; PCT公開W094/12649; およびWang、他、Gene Therapy、2巻、775〜783ページ、1995年に見いだすことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。アデノ随伴ウイルス(AAV)も、遺伝子治療における使用が提案されている(Walsh他、Proc. Soc. Exp. Biol. Med.、204巻、289〜300ページ、1993年; 米国特許第5,436,146号)。
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性形質移入、またはウイルス感染などの方法によって組織培養中の細胞に遺伝子を導入するものである。通常、導入の方法には、細胞への選択マーカーの導入が含まれる。次いで、細胞を選択の下に置き、導入された遺伝子を取り込み発現している細胞を単離する。次いで、これらの細胞を患者に送達する。
この実施形態では、核酸は、得られた組換え細胞のin vivo投与に先立って細胞中に導入される。このような導入は、形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小核体媒介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含むがそれらに限定されない、当技術分野において知られている任意の方法によって行うことができる。当技術分野においては、細胞への外来遺伝子の導入について多くの技法が知られており(例えば、LoefflerおよびBehr、Meth. 220 Enzymol.、217巻、599〜618ページ、1993年; Cohen他、Meth. Enzymol.、217巻、618〜644ページ、1993年; Clin. Pharma. Ther.、29巻、69〜92ページ、1985年を参照)、本発明に従って使用することができるが、ただし、受容細胞の必要な発生的および生理学的機能は妨げられないこととする。これらの技法は、細胞への核酸の安定な導入を提供し、核酸は細胞によって発現可能であり、遺伝性でかつ細胞子孫によって発現可能であることが好ましい。
得られる組換え細胞は、当技術分野において知られている様々な方法によって患者に送達することができる。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞または前駆体細胞)は、静脈内投与されることが好ましい。使用が想定される細胞の量は、望ましい効果、患者の状態によって異なり、当業者が決定することができる。
遺伝子治療の目的で核酸を導入することができる細胞は、任意の望ましく入手可能な細胞タイプを包含し、それらには、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞; Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞; 例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られる様々な幹細胞または前駆体細胞、特に造血幹細胞または前駆体細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は、患者にとって自己である。
組換え細胞が遺伝子治療で使用される実施形態では、抗体またはその断片をコードする核酸配列は、それらが細胞またはそれらの子孫によって発現可能であるように細胞中に導入され、次いで、組換え細胞は、治療効果のためにin vivoにおいて投与される。具体的実施形態では、幹細胞または前駆体細胞が使用される。in vitroにおいて単離および維持することができるいずれの幹細胞および/または前駆体細胞も、本発明のこの実施形態に従って使用できる可能性がある(例えば、PCT公開WO 94/08598; StempleおよびAnderson、Cell、71巻、973〜985ページ、1992年; Rheinwald、Meth. Cell Bio.、21A巻、229ページ、1980年; ならびにPittelkowおよびScott、Mayo Clinic Proc.、61巻、771ページ、1986年を参照)。
具体的実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コーディング領域と作動可能に連結された誘導性プロモーターを含み、核酸の発現は、適切な転写の誘導因子の有無を制御することにより制御可能である。
本発明の抗体は、ヒトで使用するのに先立ち、in vitro、次いでin vivoにおいて望ましい治療または予防活性について試験されることが好ましい。例えば、本発明の特異的抗体または組成物の投与が適応しているか否かを判定するのに使用することができるin vitroアッセイには、患者組織試料を培養で増殖させ、本発明の抗体または組成物に曝露、さもなければそれらを投与し、そのような本発明の抗体または組成物の組織試料に対する効果を観察するin vitroの細胞培養アッセイが含まれる。様々な具体的実施形態では、in vitroアッセイを、患者の障害に関与する細胞タイプの代表的細胞について行い、本発明の抗体または組成物がこのような細胞タイプに対して望ましい効果を有しているか否かを判定することができる。本発明の抗体または組成物は、ヒトへの投与に先立ち、in vitroアッセイおよび動物モデル系でも試験されることが好ましい。
治療で使用する本発明の抗体または組成物は、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、およびウサギを含むがそれらに限定されない好適な動物モデル系においてそれらの毒性について試験することができる。抗体または組成物の毒性をin vivoで試験するためには、当技術分野において知られている任意の動物モデル系を使用することができる。
本発明は、有効量の本発明の抗体(またはその断片もしくは変異体)または医薬組成物、好ましくは本発明の抗体を患者に投与することによる治療、阻害および予防の方法を提供する。好ましい態様では、抗体またはその断片もしくは変異体は、実質的に精製される(すなわち、効果を制限するまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。被験者は、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含むがこれらに限定されない動物であることが好ましく、哺乳類であることが好ましく、ヒトであることが最も好ましい。
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に用いることができる製剤および投与の方法は前述の通りであり、追加の適切な製剤および投与の経路は、以下の本明細書に記載の中から選択することができる。
様々な送達システムが知られており、例えば、リポソーム、マイクロパーティクル、マイクロカプセルへの封入、抗体または抗体断片を発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス(例えば、WuおよびWu、J. Biol. Chem.、262巻、4429〜4432ページ、1987年を参照)、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築を用いて本発明の抗体またはそれらの断片もしくは変異体を投与することができる。導入の方法には、皮内、224筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれるが、これらに限定されるものではない。組成物は、任意の好都合な経路、例えば、注入またはボーラス注入法により、上皮または粘膜皮膚上皮(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)を介する吸収により投与することができ、他の生物活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身的または局所的のどちらであってもよい。さらに、脳室内およびくも膜下注入を含む任意の好適な経路によって中枢神経系に本発明の医薬組成物を導入することが望ましいことがあり、脳室内注入を、例えば、オンマヤ槽などのリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易にすることができる。例えば、吸入器およびエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって肺投与を用いることができる。
具体的実施形態では、治療を必要とする領域へ局所的に本発明の薬剤組成物を投与することが望ましいことがあり、これは、例えば、手術中の局所注入、局所適用、例えば、手術後の創傷包帯と併用して、注射により、カテーテルにより、坐剤により、インプラントにより(前記インプラントは、シアラスティック(sialastic)膜などの膜を含む多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン状材料、または繊維である)行うことができるが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない材料を使用するよう注意することが好ましい。
別の実施形態では、組成物を、小胞、特にリポソームで送達することができる(Langer、Science、249号、1527〜1533ページ、1990年; Treat他 et al, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-BeresteinおよびFidler(編)、Liss、New York、353〜365ページ、1989年中; Lopez-Berestein、同書、317〜327ページを参照; 一般に同書を参照)。
さらに別の実施形態では、組成物を、制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる(Langer、同上; Sefton、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.、14巻、201ページ、1987年; Buchwald他、Surgery、88巻、507ページ、1980年; Saudek他、N. Engl. J. Med.、321巻、574ページ、1989年を参照)。
別の実施形態では、ポリマー材料を用いることができる(Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise(編)、CRC Pres.、Boca Raton、Florida、1974年; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance、SmolenおよびBall(編)、Wiley、New York、1984年; 225 RangerおよびPeppas、J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.、23巻、61ページ、1983年を参照; また、Levy他、Science、228巻、190ページ、1985年; During他、Ann. Neurol.、25巻、351ページ、1989年; Howard他、J.Neurosurg.、71巻、105ページ、1989年を参照)。さらに別の実施形態では、制御放出系を、治療標的、すなわち、全身投与量の一部分のみを必要とする脳の近くに置くことができる(例えば、Goodson、Medical Applications of Controlled Release、同上、第2巻、115〜138ページ、1984年を参照)。他の制御放出系は、Langer(Science、249巻、1527〜1533ページ、1990年)による総説中で議論されている。
本発明の組成物がタンパク質をコードする核酸である具体的実施形態では、核酸をin vivoにおいて投与し、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、例えば、レトロウイルスベクターを用いることにより(米国特許第4,980,286号を参照)、または直接注入により、またはマイクロパーティクルボンバードメント(例えば、遺伝子銃; Biolistic、Dupont)の使用、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤によるコーティングにより、または核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させて投与することにより(Joliot他、Proc. Natl. Acad.-Sci. USA、88巻、1864〜1868ページ、1991年を参照)、核酸にコードされるタンパク質の発現を促進することができる。あるいは、核酸を、相同的組換えによって発現用の宿主細胞DNA内に組み込むことができる。
本発明は、医薬組成物も提供する。このような組成物は、治療有効量の抗体またはその断片、および薬剤として許容される担体を含む。具体的実施形態では、用語「薬剤として許容される」は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されている、または動物、より具体的にはヒトにおいて使用するための米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
用語「担体」は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指す。このような薬剤担体は、水およびピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源の油を含む油などの無菌液体であってもよい。医薬組成物が静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。食塩溶液および水性ブドウ糖およびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射用液体の場合に用いることができる。好適な薬剤賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。望ましい場合、組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形をとることができる。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体により、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含むことができる。好適な薬剤担体の例は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、患者に適切な投与の形態を提供するように、適当量の担体と一緒に治療有効量の抗体またはその断片を、好ましくは精製された形で含有する。製剤は、投与の方法に適していなければならない。
好ましい実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物としてルーチンな手順に従って製剤化される。通常、静脈内投与用組成物は、無菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤および注射部位における痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔剤も含むことができる。一般に、成分は、別々に、あるいは単位剤形中で一緒に混ぜられ、活性剤の量を表示するアンプルもしくはサシェなどの密閉容器中の乾燥凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、無菌の医薬品グレードの水または食塩水が入った注入瓶で投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与に先立って成分を混ぜることができるように無菌の注射用水または食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明の組成物は、中性または塩の形態として製剤化することができる。薬剤として許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する陰イオンにより形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する陽イオンにより形成される塩が含まれる。
本発明のポリペプチドの異常な発現および/または活性に関係する疾患または障害の治療、阻害および予防に有効であるはずの本発明の組成物の量は、標準な臨床技法によって決定することができる。さらに、場合によりin vitroアッセイを用い、最適な用量範囲の同定を助けることができる。製剤において用いられる正確な投与量は、投与の経路、および疾患または障害の重症度によって異なるはずであり、医師の判断および各患者の環境に従って決定すべきである。有効投与量は、in vitroまたは動物モデル試験系から導かれる用量反応曲線から外挿することができる。
抗体の場合、患者に投与される用量は、通常、患者の体重1kg当たり0.1mg〜100mgである。患者に投与される用量は、患者の体重1kg当たり0.1mg〜20mgであることが好ましく、患者の体重1kg当たり1mg〜10mgであることがより好ましい。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫反応が原因で、他の種由来の抗体に比べてヒト体内でより長い半減期を有する。したがって、ヒト抗体の用量を下げ、投与の回数を減らすことが可能であることが多い。さらに、本発明の治療または医薬組成物の用量および投与回数は、例えば、脂質化(lipidation)などの修飾により抗体の取り込みおよび組織透過(例えば、脳内へ)を強化することによって軽減することができる。
本発明の抗体および抗体組成物は、単独または他のアジュバントと組み合わせて投与することができる。本発明の抗体および抗体組成物と一緒に投与することができるアジュバントには、ミョウバン、ミョウバン+デオキシコール酸塩(ImmunoAg)、MTP-PE(Biocine Corp.)、QS21(Genentech, Inc.)、BCG、およびMPLが含まれるが、これらに限定されるものではない。具体的実施形態では、本発明の抗体および抗体組成物は、ミョウバン(alum)と組み合わせて投与される。別の実施形態では、本発明の抗体および抗体組成物は、QS-21と組み合わせて投与される。本発明の抗体および抗体組成物と一緒に投与することができる他のアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫調節物質、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、アルミニウム塩、MF-59、およびビロゾーム(Virosomal)アジュバント技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体および抗体組成物と一緒に投与することができるワクチンには、N4MR(麻疹、おたふく風邪、228風疹)、ポリオ、水痘、破傷風/ジフテリア、A型肝炎、B型肝炎、B型インフルエンザ菌、百日咳(wooping cough)、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、灰白髄炎、狂犬病、腸チフス、および百日咳(pertussis)に対する予防を対象とするワクチン、および/またはPNEUMOVAX-23が含まれるが、これらに限定されるものではない。組合せは、同時に、例えば、混合剤として、別々にであるが同時もしくは同時的に; または順次投与することができる。これには、混合薬剤を治療用混合物として一緒に投与するプレゼンテーション、および、例えば、同一人へ別々の静脈ラインを介して混合薬剤を別々にであるが同時に投与する手順も含まれる。さらに、「一緒の」投与には、所与の化合物または薬剤のうち1つを最初に、続いて第2の化合物または薬剤を投与するという分離投与が含まれる。
本発明の抗体および抗体組成物は、単独、または化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症薬、従来の免疫療法薬およびサイトカインを含むがこれらに限定されない他の治療薬と組み合わせて投与することができる。組合せは、同時に、例えば、混合剤として、別々にであるが同時もしくは同時的に; または順次投与することができる。これには、混合薬剤を治療用混合物として一緒に投与するプレゼンテーション、および、例えば、同一人へ別々の静脈ラインを介して混合薬剤を別々にであるが同時に投与する手順も含まれる。さらに、「一緒の」投与には、所与の化合物または薬剤のうち1つを最初に、続いて第2の化合物または薬剤を投与するという分離投与が含まれる。
本発明は、本発明の薬剤組成物の1種類または複数の成分が充填された1個または複数の容器を含む薬剤パックすなわちキットも提供する。場合により、このような1個または複数の容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定される形の注意書(この注意書は、ヒト投与に関して製造、使用または販売の当局による承認を反映している)を添付することができる。
本発明は、上記方法で使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キットは、1個または複数の容器中に本発明の抗体、好ましくは精製抗体を含む。代替実施形態では、キットは、IL-9と免疫特異的に結合する抗体断片を含む。具体的実施形態では、本発明のキットは、対照として実質的に単離されたIL-9ポリペプチドを含む。本発明のキットは、IL-9と反応しない対照抗体をさらに含むことが好ましい。別の具体的実施形態では、本発明のキットは、抗体のIL-9との結合を検出する手段を含む(例えば、抗体を、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物などの検出可能な基質にコンジュゲートさせる、または第1の抗体を認識する第2の抗体に検出可能な基質をコンジュゲートさせることができる)。具体的実施形態では、キットは、組換え的に作製されたまたは化学的に合成されたIL-9を含むことができる。キット内に提供されるIL-9は、固体支持体に結合されていてもよい。より具体的実施形態では、上述のキットの検出手段には、IL-9が結合されている固体支持体が含まれる。このようなキットには、取り付けられていないリポーター標識抗ヒト抗体も含まれる。この実施形態では、抗体のIL-9との結合は、前記リポーター標識抗体によって検出することができる。
追加の実施形態では、本発明には、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血清のスクリーニングにおいて使用するための診断キットが含まれる。診断キットには、IL-9と特異的に免疫反応性の実質的に単離された抗体、および抗体とのIL-9の結合を検出する手段が含まれる。一実施形態では、抗体は、固体支持体に結合される。具体的実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。キットの検出手段には、第2の標識モノクローナル抗体が含まれる。あるいは、またはさらに、検出手段には、標識された競合抗原が含まれる。
本発明の好ましい実施形態
したがって、本発明は、ヒト免疫細胞、特に喘息免疫反応に関与する細胞のIL-9反応を阻害する組換え抗ヒトインターロイキン9(IL-9)抗体を包含する。特に、本発明は、MH9A3、MH9D1、およびMH9L1と呼ばれる3種類のマウス抗ヒトIL-9抗体に由来する組換え抗ヒトIL-9抗体に関し、その作製を以下の実施例において開示する。このような組換え抗ヒトIL-9抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、F(Ab)断片、F(Ab)2断片、Fv断片およびヒト抗体からなる群から選択される抗体が含まれる。通常、本発明のキメラ抗ヒトIL-9抗体は、げっ歯類、すなわちマウスまたはラットの可変鎖配列を含む。このような抗体は、ヒトIg定常領域ドメイン配列を含むことが好ましい。全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,824,307号に記載のヒトIgG1定常領域が最も好ましい。
本発明の特に好ましいキメラ抗ヒトIL-9抗体は、本質的に配列番号3、配列番号4、あるいは配列番号128(それぞれ、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1キメラ重鎖の配列)(図3)と少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖CDR配列、および配列番号5、配列番号6、あるいは配列番号129(それぞれ、MH9A3、MH9D1、またはMH9L1キメラ軽鎖の配列)(図4)と少なくとも90%の配列同一性の軽鎖CDR配列を有する。「本質的に同一の」は、本質的に、それぞれ配列番号3、4または128、および5、6または129と同一の配列を有する重鎖および軽鎖を有する抗体を意味し、抗体の少なくとも1種類のIL-9阻害機能を保持し配列中に重要度の低い変化のある抗体が含まれる。
本発明には、本明細書に記載の抗体重鎖および軽鎖配列をコードするDNA分子も含まれる。例えば、配列番号1は、キメラMH9A3抗体の軽鎖をコードするDNA配列であり(図1)、配列番号2は、MH9A3重鎖をコードするDNA配列である(図2)。このような配列を含むベクター、ならびにこのような配列およびベクターを含む宿主細胞も含まれる。
本発明の特に好ましいヒト化抗ヒトIL-9抗体は、ヒト抗体とのホモロジーマッチング(ホモロジーマッチングに基づく合理的設計)に基づくマウス抗ヒト抗体IL-9のPCRベースの突然変異誘発によって作製される。特に、このような抗体は、配列番号7(A3-1〜69)、8(A3-5〜51)、9(D1-1〜69)および10(D1-3〜21)(このように作製されたA3およびD1の各々の2種類のヒト化版の重鎖配列である)(図6および8)からなる群から選択される重鎖配列を有する。配列番号7および8の配列を有する重鎖は、本質的に配列番号11(B3、MH9A3誘導体のヒト化軽鎖配列)(図6)の配列を有する軽鎖と対をなしていることが好ましい。配列番号9および10の配列を有する重鎖は、本質的に配列番号12(L1、MH9D1誘導体のヒト化軽鎖配列)(図8)の配列を有する軽鎖と対をなしていることが好ましい。
本発明のヒト化抗ヒトIL-9抗体を単離するための代替アプローチは、ファージディスプレーフレームワークライブラリーの逐次パニングによる。このアプローチは、全体として参照により本明細書に組み込まれるRader他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻、8910〜15ページ、1998年に開示の方法に基づいている。この方法には、一般的に、ヒト生殖細胞系列重鎖および軽鎖から増幅された核酸配列を用いてヒト化分子のファージミドベクターライブラリーを作製し、固定化ヒトIL-9と結合する抗体配列を示すファージについてファージミドベクターライブラリーを順次選び出すことが必要である。このようにして同定される特に好ましい抗体は、配列番号13〜18(3回のパニング後に同定されるA3について6種類の異なる軽鎖配列が存在した)からなる群から選択される軽鎖配列を有する。
本発明には、本明細書に記載の抗体によって認識されるエピトープを同定すること含む、IL-9の中和エピトープを同定する方法も含まれる。このようなエピトープは、ペプチド断片のライブラリー、すなわちM13などのファージの表面上に示される断片に抗体を結合させ、抗体が結合する断片を同定することによって同定することができる。このようなライブラリーは、ランダムペプチド断片、またはIL-9断片のライブラリーからなる。IL-9断片が使用される場合、このような断片は、連続、すなわち線状であっても、あるいは、非連続、すなわち立体的もしくはより小さな非線状ペプチドで構成されていてもよい。
本発明の中和エピトープは、変異IL-9タンパク質またはペプチドのライブラリーに本発明の抗体を結合させることによっても同定することができる。好ましいライブラリーは、露出されている可能性のある残基がアラニン残基に変異しているタンパク質およびペプチドからなる。本発明の抗体のIL-9との結合は、様々な方法により、例えば、ELISAおよび/または熱量測定および/またはBIAcoreにより試験することができる。
本発明は、抗ヒトIL-9抗体および/または本発明のペプチドを含む組成物、特に、適切な薬剤担体および場合により他の薬剤化合物、例えば、喘息またはIL-9活性のモジュレーションまたは阻害が治療の上で有益である他の状態の治療に有用な化合物も含まれる医薬組成物も包含する。本発明の抗体またはペプチドまたは組成物を培養液に加えることによりin vitroにおける細胞のIL-9反応を阻害または予防する方法、ならびに本発明の抗体またはペプチドまたは組成物を患者に投与することによりin vivoにおけるそのような反応を阻害または予防する方法も含まれる。MH9A3、MH9D1、およびMH9L1に由来する本発明の組換え抗体を用い、IL-9発現および/または少なくとも1種類のIL-9機能のモジュレーションが有益である任意の疾患状態を治療および/または予防することができる。
特に、対象抗体は、ムチン産生、T細胞、B細胞、肥満細胞、好酸球および好中球などの炎症細胞の浸潤を阻害し、かつ/または上皮細胞過形成を阻害することができる。
好ましい実施形態では、本発明のin vivo法を用い、COPDに関連する気管支過敏症、嚢胞性線維症、もしくは他の慢性呼吸器状態を有する患者、または喘息症状を含むアトピー性アレルギーに苦しむ患者を治療することができる。このような方法は、気管支過敏症を有するまたは喘息を含むがこれに限定されないアトピー性アレルギーに苦しむ患者に、症状を軽減するのに有効な量の組換え抗ヒトIL-9抗体またはペプチドを投与することを含む。抗体またはペプチドは、患者におけるインターロイキン9の中和、患者におけるインターロイキン9の1種類または複数の活性のダウンレギュレーション(前述)、患者における気管支過敏症の軽減、および/または患者の肺における好酸球増加症の軽減を含む様々な機能的効果を示すことができる。このような効果は、喘息マウスに対するポリクローナル抗マウスIL-9抗体の投与によって示されてきた。このタンパク質のヒトとマウス間の保存およびこのような抗体に予想される利点(低い免疫原性およびIL-9に対する高い親和性)を考えると、ヒト患者に抗ヒトIL-9抗体を投与すると同様の結果が生じることが予想される。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,824,307号を参照されたい。
本発明の治療方法では、抗体またはペプチドを、静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下および経口からなる群から選択される経路を含む、好適な任意の経路によって投与することができる。鼻炎または喘息に苦しむ患者を治療するために特に好ましい投与経路は、吸入経路を介するため、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の組換え抗ヒトIL-9抗体を患者に送達するのに使用することができる吸入装置も包含する。
好ましい実施形態では、対象抗体は、他の喘息療法と併用される。それらの例には、ステロイド、抗炎症剤、IL-13、IL-4およびIL-5などの他のリンホカインに対する抗体、ゾレア、C3a拮抗薬、ロイコトリエン阻害薬などが含まれる。対象抗体との併用療法に好ましい化合物には、ロイコトリエン阻害薬、抗IL-13、および抗アドレビン(anti-adrevin)剤、単独または組合せが含まれる。
以下の実施例は、例示的であり、本発明を限定するものではない。
中和マウス抗ヒトIL-9抗体の単離
R+D Systemsから購入し、Sigma製オボアルブミンと複合体を形成させたバキュロウイルス発現組換えIL-9でSJLマウスを免疫化する。この手順では、SBAS-1Cと呼ばれるGlaxo Smith Klineの専売アジュバントを使用した。3種類の中和抗体(MH9A3、MH9D1、およびMH9L1)を含むいくつかのIL-9特異的抗体を単離する。免疫化マウスに由来する血清およびモノクローナル抗体は、まずELISAアッセイにおいてR+D Systems組換えヒトIL9との反応性についてスクリーニングする。続いて、後述のようにTS1-RA3増殖を阻害する能力について抗体を試験することにより、陽性の血清およびモノクローナル抗体をin vitroの中和活性について試験する。
キメラ抗体の作製
各中和抗体について、ヒトIgG1定常バックグラウンド(シナジス)上に可変領域配列をグラフトすることによりCγ1 シナジスおよびCκシナジスとキメラを構築する。クローニングは、標準PCRプロトコルを用いて行った。XmaI/BsiWIおよびXbaI/ApaI制限部位を用い、それぞれ軽鎖および重鎖を発現ベクター中にクローニングした。図1および2は、それぞれ軽鎖および重鎖のMH9A3キメラ構築物のDNA配列を提供している。以下のオリゴヌクレオチドを用いる(制限部位に下線を引いた)。
MH9A3軽鎖用:
5'-TATATATATATATATACCCCGGGGCCAAATGTGACATTGTGATGACCCAGTCTC-3'
(配列番号33)
5'-TATATATATATATACGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGC-3'(配列番号34)
MH9A3重鎖用:
5'TATATATATATATATCTAGACATATATATGGGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTC-3'(配列番号35)
5'GCCAGGGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCCCCAGTAGTC-3'(配列番号36)
MH9D1軽鎖用:
5'-TCGCTACCCGGGGCCAAATGTGACATCCTGATGACCCAA-3'(配列番号37)
5'-AGCCACCGTACGTTTCATTTCCAGCTTGGT-3'(配列番号38)
MH9D1重鎖用:
5'GCTTGCGGTCTAGACATATATATGGGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAGCTGCAGCAG-3'(配列番号39)
5'-GTATCCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAG-3'(配列番号40)
MH9A3およびMH9D1由来のキメラを293細胞中に形質移入し、プロテインAカラムで精製し、後述のin vitro中和アッセイを用いて活性について試験した。MH9A3およびMH9D1抗体の重鎖のCDR領域のアミノ酸配列を図3に示す。MH9A3およびMH9D1抗体の軽鎖のCDR領域のアミノ酸配列を図4に示す。
in vitro中和アッセイ
TS1-RA3は、ヒトIL-9受容体アルファ(IL9Ra)を過剰発現するように遺伝子組み換えされたマウスT細胞系TS1である。得られる細胞系TS1-RA3の増殖は、組換えヒトIL-9に絶対的に依存する。抗IL-9抗体の有効性を試験するため、抗IL-9抗体の存在下、TS1-RA3細胞を既知の濃度の組換えIL-9中で増殖させる。抗IL-9抗体が中和性である場合、TS1-RA3細胞は48〜72時間の間に死滅する。非中和抗体は、TS1-RA3増殖に影響しない。
図5に示すように、抗体MH9A3の全体およびF(Ab)断片、ならびに抗体MH9D1(以後D1とする)は、これらの抗体にTS1-RA3を曝露すると、72時間後に培養液中の生細胞が用量依存的に減少する点で中和性である。A3のキメラ版も中和性である。一方、抗体MH9A1は、TS1-RA3細胞の生存度に影響しないことから、Il-9を中和しない。
合理的設計ホモロジーマッチングによるヒト化
MH9A3とMH9D1の双方について、重鎖および軽鎖の可変領域をNCBIヒト生殖細胞系列データベースに対して整列させる。ドナー配列と最高にマッチし(ホモロジーマッチング)、重要な標準残基の最大数を保持する(機能的マッチング)フレームワークを同定する。ヒト化は、PCRベースの変異誘発法(オーバーラップエクステンションによるPCR)および標準プロトコルを用いて行い、必要な変化をマウス配列中に導入する(図6〜9を参照)。
以下のオリゴヌクレオチドを使用する。
MH9A3軽鎖の生殖細胞系列B3へのヒト化用:
5'GCAGCCACAGCCCGTTTGATCTCGACCTTGGTCCCACCACCGAACGTGAGAGGATAGCTGTA-3'(配列番号41)
5'TTCACTCTCACCATCAGTAGTTTGCAGGCTGAAGACGTGGCAGTGTATTACTGTCAGCAATTTTAC-3'(配列番号42)
5'GTAAAATTGCTGACAGTAATACACTGCCACGTCTTCAGCCTGCAAACTACTGATGGTGAGAGTGAA-3'(配列番号43)
5'-CCCTGATCGCTTCAGTGGCAGTGGATC-3'(配列番号44)
5'-GATCCACTGCCACTGAAGCGATCAGGG-3'(配列番号45)
5'-CAGAAACCAGGGCAACCCCCTAAACTGCTGATTTACTCG-3'(配列番号46)
5'-CGAGTAAATCAGCAGTTTAGGGGGTTGCCCTGGTTTCTG-3'(配列番号47)
5'GTGATGACCCAGTCTCCCGACAGCCTGGCTGTCTCACTGGGAGAGAGGGCTACCATCAATTGCAAGGCCAGTCAG-3'(配列番号48)
5'-TATATATATATATATACCCCGGGGCCAAATGTGACATTGTGATGACCCAGTCTC-3'(配列番号49)
5'GCAGCCACCGTACGTTTGATCTCGACCTTGGTCCCACCACCGAACGTGAGAGGATAGCT-3'(配列番号50)
MH9A3重鎖の生殖細胞系列1〜69へのヒト化用:
5'-CTCAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTGCAAGAGCG-3'(配列番号51)
5'-GGAGGCTGAGGAGACTGTGACCAGGGTGCCTTGGCCCCAG-3'(配列番号52)
5'CGCTCTTGCACAGTAATAGACGGCTGTGTCCTCAGAGCGCAGGCTGCTGAG-3'(配列番号53)
5'GAGAAGTTCAAGGGCCGCGTCACAATCACAGCAGATAAATCCACATCTACAGCCTACATGGAACTCAGC-3'(配列番号54)
5'GCTGAGTTCCATGTAGGCTGTAGATGTGGATTTATCTGCTGTGATTGTGACGCGGCCCTTGAACTTCTC-3'(配列番号55)
5'CTGGATAGAGTGGGTCCGCCAGGCTCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATGGGAGAGATTTTACC-3'(配列番号56)
5'GGTAAAATCTCTCCCATCCACTCAAGGCCCTGTCCAGGAGCCTGGCGGACCCACTCTATCCAG-3'(配列番号57)
5'TCTGGAGCTGAGGTCAAAAAGCCTGGGTCTTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTC-3'(配列番号58)
5'GAATGTGTAGCCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAAGACCCAGGCTTTTTGACCTCAGCTCCAGA-3'(配列番号59)
5'-AAGCTTGTTGACTAGTGAGATC-3'(配列番号60)
5'TATATATATATAGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGACCAGGGTGCCTTGGCCCC-3'(配列番号61)
5'-CAGGTTCAGCTGGTCCAGTCTGGAGCTGAG-3'(配列番号62)
5'-CTCAGCTCCAGACTGGACCAGCTGAACCTG-3'(配列番号63)
MH9A3重鎖の生殖細胞系列5〜51へのヒト化用:
5'TATATATATATAGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGACCAGGGTGCCTTGGCCCC-3'(配列番号64)
5'-AGCAGCCTGAAAGCTTCTGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGCG-3'(配列番号65)
5'-CGCTCTTGCACAGTAATACATGGCTGTGTCAGAAGCTTTCAGGCTGCT-3'(配列番号66)
5'AAGTTCAAGGGCCAGGTCACAATCTCTGCAGATAAATCCATCTCTACAGCCTACCTGCAATGGAGCAGCCTG-3'(配列番号67)
5'CAGGCTGCTCCATTGCAGGTAGGCTGTAGAGATGGATTTATCTGCAGAGATTGTGACCTGGCCCTTGAACTT-3'(配列番号68)
5'CTGGATAGAGTGGGTCCGCCAGATGCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGATGGGAGAGATTTTACC-3'(配列番号69)
5'GGTAAAATCTCTCCCATCCACTCAAGGCCTTTTCCAGGCATCTGGCGGACCCACTCTATCCAG-3'(配列番号70)
5'TCTGGAGCTGAGGTCAAAAAGCCTGGGGAATCACTGAAGATCTCCTGCAAGGGGTCTGGCTACACATTC-3'(配列番号71)
5'GAATGTGTAGCCAGACCCCTTGCAGGAGATCTTCAGTGATTCCCCAGGCTTTTTGACCTCAGCTCCAGA-3'(配列番号72)
5'-AAGCTTGTTGACTAGTGAGATC-3'(配列番号73)
5'-GGTGTCCACTCCGAAGTTCAGCTGGTCCAGTCTGGAGCT-3'(配列番号74)
5'-AGCTCCAGACTGGACCAGCTGAACTTCGGAGTGGACACC-3'(配列番号75)
MH9D1軽鎖の生殖細胞系列L1へのヒト化用:
5'TGGCTCCCCGGGGCCAAATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGG-3'(配列番号76)
5'GCAAGTCAGGACATTGGCAGTAATATAGGGTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCC-3'(配列番号77)
5'GGATCCAATTTGGAAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACC-3'(配列番号78)
5'-TACTGCGTACAGTTTGCTCAGTTTCCGTACACTTTTGGCCAGGGG-3'(配列番号79)
5'CTGCCAATGTCCTGACTTGCATGACAAGTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGATGCAGACAGTGAGG-3'(配列番号80)
5'ATCTTCCAAATTGGATCCATGATAGATCAGGGACTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCTGC-3'(配列番号81)
5'GCAAACTGTACGCAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGATGGTGAGAGTGAAATCTGTCCC-3'(配列番号82)
5'-GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGGCCAAAAGTGTACGG-3'(配列番号83)
MH9D1重鎖の生殖細胞系列VH 1〜69へのヒト化用:
5'TTGAGGTCTAGACATATATATGGGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCC-3'(配列番号84)
5'GAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTACTACATAGGTTGGG-3'(配列番号85)
5'GGAGATATTTACCCTGGAAGTACTTATATTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACG-3'(配列番号86)
5'GAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATCGGATGATGGTTACTACGGGTTTCC-3'(配列番号87)
5'CGAGGACCCAGGCTTCTTCACCTCAGCCCCAGACTGCACCAGCTGCACCTGGGAGTGGACACCTGTGG-3'(配列番号88)
5'AGGGTAAATATCTCCCATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCTGTCGCACCCAACCTATGTAGTAG-3'(配列番号89)
5'TCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCTGTGCTCGTGGATTTGTCCGCGGTAATCGTGACTCTGCCCTTG-3'(配列番号90)
5'ACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCCAGTAAGGAAACCCGTAGTAACC-3'(配列番号91)
MH9D1重鎖の生殖細胞系列VH 3〜21へのヒト化用:
5'CTTGAGGTCTAGACATATATATGGGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCG-3'(配列番号92)
5'GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTACTACATAGGTTGGGTCCGCCAGG-3'(配列番号93)
5'GGAAGTACTTATATTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAC-3'(配列番号94)
5'CGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATCGGATGATGGTTACTACGGGTTTCCTTACTGGGGC-3'(配列番号95)
5'TCTCAGGGACCCCCCAGGCTTGACCAGGCCTCCCCCAGACTCCACCAGCTGCACCTCGGAGTGGACACCTGTGG-3'(配列番号96)
5'AATATAAGTACTTCCAGGGTAAATATCTGAGACCCACTCCAGCCCCTTCCCTGGAGCCTGGCGGACCCAACC-3'(配列番号97)
5'CAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTGTTCATTTGCAGATACAGTGAGTTCTTGGCGTTGTCTC-3'(配列番号98)
5'GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCCAGTAAGGAAACCCG-3'(配列番号99)
MH9A3とMH9D1の各々について、重鎖/軽鎖対形成の異なる2種類のヒト化版、すなわちMH9A3についてはVH1〜69/B3およびVH5〜51/B3、ならびにMH9D1についてはVH1〜69/L1およびVH3〜21/L1を作製し、活性について試験する。
様々な構築物を293細胞中に形質移入し、プロテインAカラムで精製し、TS1-RA3中和アッセイを用いて活性について試験する。初期ホモロジーマッチングに基づくヒト化版は、元の抗体およびキメラ抗体の中和活性を減少させる。例えば、図10に示すように、VH1〜69/B3(169B3)は、IL-9依存性TS1-RA3増殖を中和せず、非中和抗体MH9A1に類似した活性を示す。さらに、抗体配列の微調整により、一部の中和活性が回復する。
ホモロジーマッチングに基づくヒト化抗体の微調整最適化
B3は、完全なヒト化軽鎖であるが、結合/活性の喪失をもたらす(図10参照)。したがって、結合活性を強化するため軽鎖を「微調整(fine tuned)」する。元のMH9A3キメラ版およびMH9A3(B3)ヒト化版と比較しながら図11に示す軽鎖配列(配列番号18〜25)を有するいくつかの新たな構築物を設計する。図12に示すように、in vitroの阻害がもたらされる。図12に示すように、FRIIおよびL46A構築物は特に、中和活性の増加を示す。さらに、図12に示すように、FRII構築物(A3の重鎖配列とマッチする配列番号19の軽鎖配列を含む)は、元のMH9A3抗体に迫る中和活性を示す。
ファージディスプレーによるヒト化
このアプローチは、Rader他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻、8910〜8915ページ、1998年の方法により設計し、A3抗IL-9阻害性モノクローナル抗体に適用した。
A-ファージミドベクター中へのMH9A3のクローニング
MH9A3のscFv版を、標準PCRプロトコル(オーバーラップエクステンションによるPCR)および以下のオリゴヌクレオチド(SfiIおよびNotI部位に下線を引いた)を用い、SfiI/NotI断片としてpCANTAB5Eファージミドベクター(Pharmacia、APB Biotech)(図13参照)中にクローニングする。
5'TATATATATATATATATATAGGCCCAGCCGGCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAG-3'(配列番号100)
5'TATATATATATATATATATAGCGGCCGCAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGC-3'(配列番号101)
5'GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTC-3'(配列番号102)
5'CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCCCC-3'(配列番号103)
B-重鎖および軽鎖ライブラリー構築
軽鎖
I(a)-MH9A3軽鎖の不活性化
MH9A3軽鎖は、Stratagene製QuikChange XL部位特異的変異誘発キットおよび以下のオリゴヌクレオチドを用い、2個の終止コドンの導入によって変異誘発させた。
5'-ACCTGGTATCAACAGTAATAAGGGCAATCTCCTAAAG-3'(配列番号104)
5'-CTTTAGGAGATTGCCCTTATTACTGTTGATACCAGGT-3'(配列番号105)
作製された構築物を以後pCANTAB5E/A3VH-A3VL(TAA)と名付ける。
I(b)-ヒト生殖細胞系列軽鎖のライブラリーの構築
全RNAは、以下のようにヒト骨髄(Poietic technology)から抽出する。髄2.5mlをPAXgene Blood RNAチューブ(PreAnalytiX, Inc.)に移し、緩やかに混ぜて室温において2時間以上インキュベートする。PAXgene Blood RNA Kitハンドブックに記載のように全RNAを正確に抽出する。第一鎖cDNAは、製造業者のマニュアルに記載のオリゴ(dT)プライミングによるRT-PCR(Invitrogen)用SuperScript First-Strand Synthesis Systemを用いて合成する。次いで、以下に列挙するオリゴヌクレオチドを用いてcDNAを増幅する。
5'-GCGGTGGCGGATCGGAGATCCAGWTGACCCAGTCTCC-3' プライマー1(配列番号106)
5'-GCGGTGGCGGATCGGAGATCGTGATGACYCAGWCTCC-3' プライマー2(配列番号107)
5'-GCGGTGGCGGATCGGAGATCGTGWTGACRCAGTCTCC-3' プライマー3(配列番号108)
5'-GCGGTGGCGGATCGGAGATCACACTCACGCAGTCTCC-3' プライマー4(配列番号109)
5'-CGTGAGAGGATAGCTGTAAAATTGCTGACAGTAATACACTGCAAAATCTTC-3' プライマー5(配列番号110)
5'-CGTGAGAGGATAGCTGTAAAATTGCTGACAGTAATAAACCCCARCATCCTC-3' プライマー6(配列番号111)
5'-CGTGAGAGGATAGCTGTAAAATTGCTGACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTC-3' プライマー7(配列番号112)
様々な組合せを用いる: 1/5、1/6、1/7、2/5、2/6、2/7、3/5、3/6、3/7、4/5、4/6および4/7。すべての増幅は、Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)およびアニーリング温度55〜60℃を用い、標準PCR条件下で行う。等量(約200ng)の様々なPCR産物を一緒に混ぜ、以下のオリゴヌクレオチド(BSU36IおよびNotI制限部位に下線を引いた)を含む5サイクルのPCR反応におけるテンプレートとして使用した。
5'TATATATATATATACCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAG-3'(配列番号113)
5'TATATATATATATAGCGGCCGCAGCCCGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGACCGAACGTGAGAGGATAGCTGTA-3'(配列番号114)
pCANTAB5E/A3VH-A3VL(TAA)8μgおよび混合PCR産物1.5μgを、BSU36IおよびNotIにより消化し、QIAquickゲル精製キット(Qiagen)を用いて精製する。消化されたpCANTAB5E/A3VH-A3VL(TAA)5μgおよび消化されたPCR産物1μgを、最終容積100μlでT4 DNAリガーゼ(NEB)4000単位を用いる15℃における18時間の連結に設定する。連結産物は、QIAquickゲル精製キット(Qiagen)を用いて精製し、水(pH8.0)50μlで溶離する。混合物を、抵抗200Ωおよび電気容量25μFを用いる2.5kVの電界中でTG1 エレクトロコンピテント細胞(アリコート5μl /コンピテントTG1 200μl中)中に形質転換する。各エレクトロポレーション後、細胞を氷冷SOC培地2mlに再懸濁し、SOC培地(Invitrogen)50mlに加える。緩やかに振盪しながら37℃において45分間インキュベートした後、細胞を3Krpmで25分の遠心分離によってペレット化し、100μg/mlアンピシリンおよびヘルパーファージ(約1011pfu)75μlを含有する2×YT培地500mlに再懸濁し、一夜振盪しながら37℃においてインキュベートする。ライブラリー多様性は、100μg/mlアンピシリンを含有するLBプレート上のエレクトロポレーション直後に形質転換細胞を滴定することにより推定される。1×107までの多様化が得られる。
II-重鎖
II(a)-MH9A3重鎖の不活性化
MH9A3重鎖は、Stratagene製QuikChange XL部位特異的変異誘発キットおよび以下のオリゴヌクレオチドを用い、2個の終止コドンの導入によって変異誘発させた。
5'-CTTGAGTGGCTTGGATAATAATTACCTGGAAGTGGT-3'(配列番号115)
5'-ACCACTTCCAGGTAATTATTATCCAAGCCACTCAAG-3'(配列番号116)
次いで、軽鎖ライブラリーのパニング後に同定された不活化重鎖および軽鎖を含むファージミドを構築した。作製された構築物を以後pCANTAB5E/A3VH(TAA)-VL(Germ)と名付ける。
II(b)-ヒト生殖細胞系列重鎖のライブラリーの構築
このライブラリーは、以下に列挙されるオリゴヌクレオチドを用い、基本的にセクションIIaに記載のように構築する。
5'-TATATATATATAGGCCCAGCCGGCCCAGRTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3' プライマー1(配列番号117)
5'-TATATATATATAGGCCCAGCCGGCCCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG-3' プライマー2(配列番号118)
5'-TATATATATATAGGCCCAGCCGGCCGAGGTGCAGCTGKTGSAGTCTGG-3' プライマー3(配列番号119)
5'-TATATATATATAGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3' プライマー4(配列番号120)
5'-GACGTAACTACTACCGTAGTAATCCGCTCTCGCACAGTAATACADGGCCYTGTC-3' プライマー5(配列番号121)
様々な組合せを用いた: 1/5、2/5、3/5および4/5。すべての増幅は、Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)およびアニーリング温度55〜60℃を用い、標準PCR条件下で行う。等量(約200ng)の様々なPCR産物を一緒に混ぜ、以下のオリゴヌクレオチド(SfiIおよびStyI制限部位に下線を引いた)を含む5サイクルのPCR反応におけるテンプレートの代わりとした。
5'-TATATATATATAGGCCCAGCCGGCC-3'(配列番号122)
5'TATATATATATATACCTTGGCCCCAGTAGTCAAACTTGACGTAACTACTACCGTAGTA-3'(配列番号123)
pCANTAB5E/A3VH(TAA)-A3VL(Germ)約8μgおよび混合PCR産物1.5μgをSfiIおよびStyIにより消化し、QIAquickゲル精製キット(Qiagen)を用いて精製する。消化したpCANTAB5E/A3VH(TAA)-A3VL(Germ)5μgおよび消化した混合PCR産物1μgを最終容積100μlでT4 DNAリガーゼ(NEB)4000単位を用いる15℃における18時間の連結に設定する。次いで、ライブラリーのエレクトロポレーションは、基本的にIIbに記載のように行う。
C-ライブラリーのパニング
ライブラリーを以下の通りスクリーニングする。通常、非阻害性抗IL-9抗体A4の100ng/μl溶液100μlを96ウエルマイクロタイタープレートの24個の各ウエルに加え、PBS緩衝液中4℃において一夜インキュベートする。ウエルをPBS 250μlで3回洗浄し、37℃において2時間、PBS/3%ミルク250μlでブロックする。次いで、組換えヒトIL9(R&D)の0.2ng/μl溶液100μlを各ウエルに加える。室温において1時間インキュベートした後、ウエルをPBS 250μlで3回洗浄する。PBS/4%ミルク/0.1%ツイーン20中の組換えファージ100μl(約1011pfu)を各ウエルに加え、撹拌下室温において90〜120分間インキュベートする。第1回目のパニングのため、ウエルをPBSで10回、0.1%ツイーン20を含有するPBSで10回洗浄する。洗浄の数は、第2回目および第3回目のパニングについてそれぞれ15および20回まで増加させる。指数関数的に増殖するTG1大腸菌細胞をウエルに加え(200μl細胞/ウエル)、37℃において1時間インキュベートする。感染細胞を、100μg/mlアンピシリン/VCSM13ヘルパーファージ1011pfuが添加された2×YT培地200mlに移し、37℃において一夜インキュベートする。エレクトロポレーションおよび各回のパニング後、20% PEG 8000/5M NaCl(1/5 v/v)によりファージを沈殿させ、PBS/0.1%ツイーン20 5mlに再懸濁する。パニングプロセスの図を図14に示す。3回のパニング後に得られる7種類の異なるA3軽鎖(配列番号26〜32)の配列を図16に示す。比較目的で元のMH9A3軽鎖、ヒト化版B3、最適化されたヒト化版FRIIおよびL46A、ならびにファージディスプレー由来版V12およびL2のアラインメントを図16に提供する。
MH9L1抗ヒトIL-9抗体の単離、キメラ化および特徴
中和マウス抗ヒトIL-9抗体の単離
R+D Systemsから購入し、Sigma製オボアルブミンと複合体を形成させたバキュロウイルス発現組換えIL-9でSJLマウスを免疫化する。中和抗体(MH9L1)は、ImmuneEasy(Qiagen)と呼ばれる市販のアジュバントを用いて作製する。免疫化マウスに由来する血清およびモノクローナル抗体は、まずELISAアッセイにおいてR+D Systems組換えヒトIL9との反応性についてスクリーニングする。続いて、後述のようにTS1-RA3増殖を阻害する能力について抗体を試験することにより、陽性の血清およびモノクローナル抗体をin vitroの中和活性について試験する。
キメラ抗体の作製
MH9L1マウス抗体を用い、ヒトIgG1定常バックグラウンド(シナジス)上に可変領域配列をグラフトすることによりCγ1シナジスおよびCκシナジスを用いてキメラを構築する。クローニングは、標準PCRプロトコルを用いて行う。XmaI/BsiWIおよびXbaI/ApaI制限部位を用い、それぞれ軽鎖および重鎖を発現ベクター中にクローニングする。
MH9L1由来キメラを293細胞中に形質移入し、プロテインAカラムで精製し、後述のin vitro中和アッセイを用いて活性について試験する。MH9L1の重鎖のCDR領域のアミノ酸配列を図3に示す。抗体の軽鎖MH9L1のCDR領域のアミノ酸配列を図4に示す。
In vitro中和アッセイ
TS1-RA3は、Ludwig Instituteにおいて開発された。これは、ヒトIL-9受容体アルファ(IL9Ra)を過剰発現するように遺伝子組み換えされたマウスT細胞系TS1である。得られる細胞系TS1-RA3の増殖は、組換えヒトIL-9に絶対的に依存する。抗IL-9抗体の有効性を試験するため、抗IL-9抗体の存在下、TS1-RA3細胞を既知の濃度の組換えIL-9中で増殖させる。抗IL-9抗体が中和性である場合、TS1-RA3細胞は48〜72時間の間に死滅する。非中和抗体は、TS1-RA3増殖に影響しない。
TS1-RA3をMH9L1に曝露すると。このアッセイ系を用い、MH9L1がIL-9活性を中和することが判明する(図19を参照)。この中和活性は、72時間後に培養液中の生細胞が用量依存的に減少することで観察される。MH9L1のキメラ版もこのアッセイを用いると中和性である。
抗ヒトIL-9抗体のヒト化
合理的設計ホモロジーマッチングによるヒト化
MH9L1の重鎖および軽鎖の可変領域をNCBIヒト生殖細胞系列データベースに対して整列させる。ドナー配列と最高にマッチし(ホモロジーマッチング)、重要な標準残基の最大数を保持する(機能的マッチング)、フレームワークを同定する。ヒト化は、PCRベースの変異誘発法(オーバーラップエクステンションによるPCR)および標準プロトコルを用いて行い、必要な変化をマウス配列中に導入する。図17に示すように、MH9L1重鎖は、ヒトゲノム重鎖配列VH1〜69およびVH5〜51と実質的に同一の配列を示す。図18に示すように、MH9L1軽鎖は、ヒトゲノム配列A26およびL15と実質的に同一の配列を示す。
上述の方法によって作製される様々な構築物を293細胞中に形質移入し、プロテインAカラムで精製し、TS1-RA3中和アッセイを用いて活性について試験する。初期ホモロジーマッチングに基づくヒト化版は、元のマウス抗体およびキメラMH9L1抗体との比較で中和活性について評価する。さらに、抗体配列の微調整により、中和活性が増強されるはずである。
ファージディスプレーによるヒト化
このアプローチは、Rader他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻、8910〜8915ページ、1998年の方法により設計し、MH9L1抗ヒトIL-9阻害性モノクローナル抗体に適用した。
A-ファージミドベクター中へのMH9L1のクローニング
MH9L1のscFv版を、標準PCRプロトコル(オーバーラップエクステンションによるPCR)を用い、SfiI/NotI断片としてpCANTAB5Eファージミドベクター(Pharmacia、APB Biotech)(図13参照)中にクローニングする。
B-重鎖および軽鎖ライブラリー構築
軽鎖
I(a)-MH9L1軽鎖の不活性化
MH9L1軽鎖は、Stratagene製QuikChange XL部位特異的変異誘発キットを用い、2個の終止コドンの導入によって変異誘発させた。
I(b)-ヒト生殖細胞系列軽鎖のライブラリーの構築
全RNAは、以下のようにヒト骨髄(Poietic technology)から抽出する。髄2.5mlをPAXgene Blood RNAチューブ(PreAnalytiX, Inc.)に移し、緩やかに混ぜて室温において2時間以上インキュベートする。PAXgene Blood RNA Kitハンドブックに記載のように全RNAを正確に抽出する。第一鎖cDNAは、製造業者のマニュアルに記載のオリゴ(dT)プライミングによるRT-PCR(Invitrogen)用SuperScript First-Strand Synthesis Systemを用いて合成する。次いで、以下に列挙する適切なオリゴヌクレオチドを用いてcDNAを増幅する。
増幅は、Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)およびアニーリング温度55〜60℃を用い、標準PCR条件下で行う。等量(約200ng)の様々なPCR産物を一緒に混ぜ、適切なオリゴヌクレオチドを含む5サイクルのPCR反応におけるテンプレートとして使用した。
得られる混合PCR産物を、制限酵素により消化し、QIAquickゲル精製キット(Qiagen)を用いて精製する。消化したPCR産物を、最終体積100μlでT4 DNAリガーゼ(NEB)4000単位を用いる15℃における18時間の連結に設定する。連結産物は、QIAquickゲル精製キット(Qiagen)を用いて精製し、水(pH8.0)50μlで溶離する。混合物を、抵抗200Ωおよび電気容量25μFを用いる2.5kVの電界中でTG1 エレクトロコンピテント細胞(in 5μlアリコート/200μlコンピテントTG1)中に形質転換する。各エレクトロポレーション後、細胞を氷冷SOC培地2mlに再懸濁し、SOC培地(Invitrogen)50mlに加える。緩やかに振盪しながら37℃において45分間インキュベートした後、細胞を3Krpmで25分の遠心分離によってペレット化し、100μg/mlアンピシリンおよびヘルパーファージ(約1011pfu)75μlを含有する2×YT培地500mlに再懸濁し、一夜振盪しながら37℃においてインキュベートする。ライブラリー多様性は、100μg/mlアンピシリンを含有するLBプレート上のエレクトロポレーション直後に形質転換細胞を滴定することにより推定される。1×107までの多様化が得られる。
II-重鎖
IIa-MH9L1重鎖の不活性化
MH9L1重鎖は、Stratagene製QuikChange XL部位特異的変異誘発キットおよび好適なオリゴヌクレオチドを用い、2個の終止コドンの導入によって変異誘発させた。
II(b)-ヒト生殖細胞系列重鎖のライブラリーの構築
このライブラリーは、好適なオリゴヌクレオチドを用い、基本的にセクションIIaに記載のように構築する。
様々な組合せを用いた: 1/5、2/5、3/5および4/5。すべての増幅は、Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)およびアニーリング温度55〜60℃を用い、標準PCR条件下で行う。等量(約200ng)の様々なPCR産物を一緒に混ぜ、好適なオリゴヌクレオチドを含む5サイクルのPCR反応におけるテンプレートとして使用した。
得られる混合PCR産物を、適切な制限酵素により消化し、QIAquickゲル精製キット(Qiagen)を用いて精製する。消化されたPCR産物5μgを、最終容積100μlでT4 DNAリガーゼ(NEB)4000単位を用いる15℃における18時間の連結に設定する。次いで、ライブラリーのエレクトロポレーションは、基本的にIIbに記載のように行う。
C-ライブラリーのパニング
ライブラリーを以下の通りスクリーニングする。通常、非阻害性抗IL-9抗体MH9L1の100ng/μl溶液100μlを96ウエルマイクロタイタープレートの24個の各ウエルに加え、PBS緩衝液中4℃において一夜インキュベートする。ウエルをPBS 250μlで3回洗浄し、37℃において2時間、PBS/3%ミルク250μlでブロックする。次いで、組換えヒトIL9(R&D)の0.2ng/μl溶液100μlを各ウエルに加える。室温において1時間インキュベートした後、ウエルをPBS 250μlで3回洗浄する。PBS/4%ミルク/0.1%ツイーン20に溶かした組換えファージ100μl(約1011pfu)を各ウエルに加え、撹拌下室温において90〜120分間インキュベートする。第1回目のパニングのため、ウエルをPBSで10回、0.1%ツイーン20を含有するPBSで10回洗浄する。洗浄の数は、第2回目および第3回目のパニングについてそれぞれ15および20回まで増加させる。指数関数的に増殖するTG1大腸菌細胞をウエルに加え(200μl細胞/ウエル)、37℃において1時間インキュベートする。感染細胞を、100μg/mlアンピシリン/VCSM13ヘルパーファージ1011pfuが添加された2×YT培地200mlに移し、37℃において一夜インキュベートする。エレクトロポレーションおよび各回のパニング後、20% PEG 8000/5M NaCl(1/5 v/v)によりファージを沈殿させ、PBS/0.1%ツイーン20 5mlに再懸濁する。パニングプロセスの図を図14に示す。
2002年4月12日に出願された米国仮出願第60/371,728号、および2002年4月12日に出願された米国仮出願第60/371,683号は、参照により本明細書に組み込まれる。
MH9A3に由来するキメラ抗体の軽鎖をコードするcDNA配列(配列番号1)を示す図である。 MH9A3に由来するキメラ抗体の重鎖をコードするcDNA配列(配列番号2)を示す図である。 それぞれMH9A3、MH9L1、およびMH9D1キメラ重鎖CDRのアミノ酸配列(それぞれ、配列番号3、128、および4)を示す図である。 それぞれMH9A3、MH9L1、およびMH9D1キメラ軽鎖CDRのアミノ酸配列(それぞれ、配列番号5、129、および6)を示す図である。 MH9A1(−●−)、MH9A3全体(・・○・・)、MH9A3F(Ab)(-- 黒塗り逆三角--)、MH9A3キメラ(-・・-▽-・・-)およびMH9D1(- -■- -)抗体を含む抗IL-9抗体によるTS1-RA3増殖の阻害を示すグラフである。 天然MH9A3ならびに相同的ヒトH1(1〜69)(配列番号13)およびH2(5〜51)(配列番号14)配列と比較した、MH9A3キメラ抗体の合理的設計最適化を介して得られる抗体重鎖VH1〜69およびVH5〜51の配列(配列番号7および8)を示す図である。 MH9A3と比較した、MH9A3キメラ抗体の合理的設計最適化を介して得られる抗体軽鎖B3の配列を示す図である。これは、アラインメントに示すように、ヒトL1(B3)配列(配列番号11)と本質的に同一である。 MD9D1および相同的ヒトH1(1〜69)(配列番号15)およびH2(3〜21)(配列番号16)配列と比較した、MH9D1キメラ抗体の合理的設計最適化を介して得られる抗体重鎖VH1〜69およびVH3〜21の配列(配列番号9および10)を示す図である。 MH9D1と比較した、MH9D1に由来するMH9D1キメラ抗体の合理的設計最適化を介して得られる抗体軽鎖L1の配列を示す図である。これは、アラインメントに示すように、ヒトL1(L1)配列(配列番号12)と本質的に同一である。 MH9A1(−●−)、MH9A3全体(・・○・・)、MH9A3F(Ab)(黒塗り逆三角)、1〜69(Ｂ3)ヒト化(-・・-▽-・・-)およびMH9D1(- -■- -)抗体を含む抗IL-9抗体によるTS1-RA3増殖の阻害を示すグラフである。 MH9A3(B3)軽鎖の合理的設計最適化および微調整(fine-tuning)によって得られる軽鎖のアミノ酸配列(配列番号18〜25)を示す図である。 P43S(元のMH9A3重鎖と対をなすP43S軽鎖変異体)(−●−)、FRIII(元のMH9A3重鎖と対をなすFRIII軽鎖変異体)(−○−)、FRIV(元のMH9A3重鎖と対をなすFRIV軽鎖変異体)(黒塗り逆三角)、V12551(ヒト化MH9A3 5〜51重鎖と対をなすV12軽鎖)(−▽−)、V12A3(元のMH9A3重鎖と対をなすV12軽鎖)(−■−)、V83L(元のMH9A3重鎖と対をなすV83L軽鎖変異体)(−□−)、FRII(元のMH9A3重鎖と対をなすFRII軽鎖変異体)(−◆−)、V11551(ヒト化MH9A3 5〜51重鎖と対をなすV11軽鎖)(−◇−)、V11A3(元のMH9A3重鎖と対をなすV11軽鎖)(黒塗り三角)、FRI(元のMH9A3重鎖と対をなすFRI軽鎖変異体)(黒塗り逆三角)、およびMH9A3(黒塗り六角)およびMH9A4(白抜き破線円)抗体を含む抗IL-9抗体によるTS1-RA3増殖の阻害を示すグラフを示す図である。 pCANTAB5Eファージミドベクター中への抗IL-9抗体配列のクローニングを示し、タグ(eTag)およびM13の遺伝子IIIコートタンパク質を含む、フレーム内単鎖Fvフォーマットでクローニングされた抗体を示す概略図である。遺伝子IIIコートタンパク質に連結される機能性抗体断片は、サプレッサ宿主株で作製され、scFv: E-Tagと遺伝子IIIとの間に位置するアンバー終止コドンの漏出性によってM13の表面上に提示される。ノンサプレッサ株では、可溶性scFv断片が作製される。 ファージディスプレー技法において用いられるグラフティングおよびパニング過程を示す概略図である。 MH9A3軽鎖の3回のパニング後に得られる軽鎖の配列(配列番号26〜32)を示す図である。 MH9A3重鎖ヒト化版VH1〜69(配列番号7)およびVH5〜51(配列番号8)に由来する元のMH9A3キメラ重鎖由来のCDR領域(配列番号3)、MH9A3キメラ軽鎖由来のCDR領域(配列番号5)、MH9A3軽鎖ヒト化版B3(配列番号11)、MH9A3合理的設計最適化ヒト化軽鎖版FRII(配列番号20)およびL46A(配列番号24)、ならびにファージディスプレーパニングによって得られるMH9A3ヒト化軽鎖版V12(配列番号29)およびL2(配列番号32)の配列の比較を示す図である。 ヒト重鎖配列VH1〜69およびVH5〜51に対してア整列されたMH9L1重鎖のアミノ酸配列を示す図である。 ヒト軽鎖配列A26およびL15に対して整列されたMH9L1軽鎖を示す図である。 MH9L1およびMH9A3を含む、TS1-RA3増殖を阻害する様々な抗IL-9抗体の能力を比較するデータを含むグラフである。 ヒト抗体フレームワーク領域におけるMH9A3、MH9L1、およびMH9D1のヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す図である。
【配列表】
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Claims (10)

  1. (a)抗体MH9A3由来の、もしくは抗体MH9D1由来の、もしくは抗体MH9L1由来の少なくとも1種類のCDR、
    (b)抗体MH9A3由来の、もしくは抗体MH9D1由来の、もしくは抗体MH9L1由来の少なくとも2種類のCDR、
    (c)抗体MH9A3由来の、もしくは抗体MH9D1由来の、もしくは抗体MH9L1由来の少なくとも3種類のCDR、
    (d)抗体MH9A3由来の、もしくは抗体MH9D1由来の、もしくは抗体MH9L1由来の少なくとも4種類のCDR、
    (e)抗体MH9A3由来の、もしくは抗体MH9D1由来の、もしくは抗体MH9L1由来の少なくとも5種類のCDR、または
    (f)抗体MH9A3由来の、もしくは抗体MH9D1由来の、もしくは抗体MH9L1由来の6種類すべてのCDRを含む、IL-9と特異的に結合する単離抗体もしくは抗体断片。
  2. a)表2に記載の軽鎖生殖細胞系列配列のうち1種類からの軽鎖フレームワーク領域と組み合わされた抗体MH9A3由来の、または抗体MH9D1由来の、または抗体MH9L1由来の軽鎖CDR、およびb)表2に記載の重鎖生殖細胞系列配列のうち1種類からの重鎖フレームワーク領域と組み合わされた抗体MH9A3由来の、または抗体MH9D1由来の、または抗体MH9L1由来の重鎖CDRを含む、IL-9と特異的に結合する単離抗体または抗体断片。
  3. a)請求項2に記載の抗体の軽鎖可変領域の軽鎖可変領域と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
    b)請求項2に記載の抗体の重鎖可変領域の重鎖可変領域と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、または
    c)(a)と(b)の双方を含む単離抗体。
  4. a)請求項2に記載の抗体の軽鎖可変領域の軽鎖可変領域と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
    b)請求項2に記載の抗体の軽鎖可変領域の重鎖可変領域と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、または
    c)(a)と(b)の双方を含む請求項3に記載の抗体。
  5. 前記抗体または抗体断片は、
    (a)全免疫グロブリン分子、
    (b)scFv、
    (c)モノクローナル抗体、
    (d)ヒト、
    (e)キメラ、
    (f)ヒト化、
    (g)Fab断片
    (h)Fab'断片、
    (i)F(ab)2、
    (j)Fv、
    (k)ジスルフィド結合Fv、または
    (l)二重特異的抗体である、請求項1、2、3、または4に記載の単離抗体または抗体断片。
  6. 抗体は、
    (a)107M〜108Mの解離定数(Kd)、
    (b)108M〜109Mの解離定数(Kd)、
    (c)109M〜1010Mの解離定数(Kd)、
    (d)1010M〜1011Mの解離定数(Kd)、
    (e)1011M〜1012Mの解離定数(Kd)、および
    (f)1012M〜1013Mの解離定数(Kd)からなる群から選択される解離定数(Kd)を有する請求項5に記載の単離抗体または抗体断片。
  7. IL-9活性を阻害する請求項6に記載の単離抗体。
  8. 気管支過敏症、アトピー性アレルギー、喘息、ムチン過剰産生、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、上皮細胞過形成、過剰なT細胞、B細胞、好酸球、マクロファージ、単球、好中球、または肥満細胞活性を予防、改善、または治療する方法であって、有効量の請求項7に記載の抗体をそのような予防、改善、または治療を必要とする患者に投与することを含む方法。
  9. マウス抗体MH9A3、MH9D1、またはMH9L1の単離抗体または抗体断片誘導体であって、誘導体はIL-9と特異的に結合し、前記マウス抗体の1種類または複数のCDRは変異している単離抗体または抗体断片誘導体。
  10. CDRは、1種類の変異、2種類の変異、3種類の変異、4種類の変異、または5種類の変異を有している請求項9に記載の単離抗体または抗体断片。
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