JPH08503855A

JPH08503855A - 嚢胞性線維症に対する遺伝子治療

Info

Publication number: JPH08503855A
Application number: JP6513485A
Authority: JP
Inventors: グリゴリー，リチャード・ジェイ; アルメンタノ，ドンナ; クーチャー，ラリー・エイ; スミス，アラン・イー
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1992-12-03
Filing date: 1993-12-02
Publication date: 1996-04-30
Also published as: EP0905253A2; CA2145641A1; CA2592997A1; EP0911413A2; CA2145641C; EP0673431A1; WO1994012649A2; EP0911413A3; AU5734994A; EP1024198A2; WO1994012649A3; EP0905253A3; EP1024198A3; AU680459B2

Abstract

(57)【要約】嚢胞性線維症に特に有用な遺伝子治療ベクター、および該ベクターの使用方法を開示する。好ましい具体例において、該ベクターは、アデノウイルスに基づくものである。遺伝子治療に関するアデノウイルスに基づくベクターの利点は、それらが、比較的安全であると考えられ、しかも、所望遺伝子産物をコードするようにそれらを操作することができ、同時に、正常な溶解ウイルス生活環におけるそれらの複製能が不活性化されるということである。さらに、アデノウイルスは、気道上皮に対する本来的な屈性を有している。それゆえ、アデノウイルスに基づくベクターは、嚢胞性線維症に対する遺伝子治療のごとき呼吸器の遺伝子治療への適用に特に好ましい。１の具体例において、アデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターは、ウイルス複製の初期段階に必要とされるゲノムのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠失しており、対象とする遺伝物質（例えば、嚢胞性線維症経膜レギュレーター蛋白をコードしているＤＮＡ）により置換されている２型アデノウイルス血清型のゲノムからなる。もう１つの具体例において、アデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターは、偽アデノウイルス（ＰＡＶ）である。ＰＡＶｓは、潜在的に有害なウイルス遺伝子を含んでおらず、理論上、約３６ｋｂの外来物質のための容量があり、適度に高力価で産生ることができ、分裂性および非分裂性のヒト標的細胞系に対する親のアデノウイルスの屈性を保持している。

Description

【発明の詳細な説明】嚢胞性線維症に対する遺伝子治療関連出願本願は、１９９０年３月５日出願の米国出願第０７／４８８，３０７号の一部継続出願である、１９９０年９月２７日出願の米国出願第０７／５８９，２９５号の一部継続出願である、１９９０年１１月１５日出願の米国出願第０７／６１３，５９２号の一部継続出願である、１９９２年１２月２日出願の米国出願第０７／９８５，４７８号の一部継続出願である、１９９３年１０月１日出願の米国出願第０８／１３０，６８２号の一部継続出願である。すべての上記同時係属特許出願の内容を、参照により本明細書に取り入れる。本願に示されていない言語または用語の定義は、上記同時係属出願において示したものと同じである。本願実施例で使用する出所を特に示していない試薬または材料、例えば、ΔＦ５０８ＣＦＴＲ遺伝子およびＣＦＴＲ抗体もすべて上記同時係属出願のものと同じである。発明の背景嚢胞性線維症（ＣＦ）は、ヒトにおける最もありふれた致命的な遺伝病である（ボート,ティー・エフ（Boat,T.F.）ら，「ザ・メタボリック・ベイシス・オブ・インヘリティド・ディジージズ（The Metabolic Basis of Inherited Disease s）」（スクリバー,シー・アール（Scriver,C.R.）ら編,ニューヨークのマクグロー −ヒル（McGraw-Hill）（１９８９年））。米国において、幼児２５００人に約１人が、この疾患を持って生まれる。現在、米国には約３０，０００人のＣＦ患者がいる。現代の標準的な治療にもかかわらず、平均生存年令はわずか２６才である。肺気道の疾患は主要な罹患率の原因であり、死亡率のうちの９５％の原因である。肺疾患の最初の徴候は、しばしば、咳、そしてその後の進行性呼吸困難である。スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ついで、シュードモナス（Pseudomonas）でのコロニー形成により、執着性の啖が化膿性となる。慢性気管支炎および気管支拡張症は、現代の治療で部分的に治療することができるが、頻度を増す肺疾患の悪化により、その治療コースは限定されている。末期の肺疾患は、血中酸素減少、肺の高血圧および肺心症の進行により予知される。鼻および副鼻洞の上部気道もＣＦに関連する。大部分のＣＦ患者は、慢性的な副鼻洞炎の症状がある。鼻のポリプは患者の１５〜２０％に発生し、２０才台において普通に見られる。胃腸の問題もＣＦにおいて頻繁に見られる。幼児は胎便性イレウスにかかりうる。吸収不良の徴候を起こさせる外分泌性膵臓不全は、ＣＦ患者の大部分に見られる。男性はほとんど一様に男子不妊症であり、女性の受精率は減少している。遺伝的および分子的両方の分析に基づき、ＣＦ関連遺伝子が、２１個のそれぞれのｃＤＮＡクローンの一部として単離され、その蛋白生成物が予想された（ケレム,ビー・エス（Kerem,B.S.）ら，サイエンス（Science）第２４５巻：１０７３〜１０８０頁；リオーダン,ジェイ・アール（Riordan,J.R.）ら，（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁；ロメンス，ジェイ・エム（ Rommens,J.M.）ら，（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０５９〜１０６５頁）。米国出願第０７／４８８，３０７号には、連続したストランド中への遺伝子構築、機能的蛋白としての遺伝子発現および遺伝子の変異がＣＦに拘わっていることの確認が記載されている（グレゴリー,アール・ジェイ（Gregory,R.J.）ら，（１９９０年）ネイチャー（Nature）第３４７巻：３８２〜３８６頁；リッチ,ディー・ピー（Rich,D.P.）ら，（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３５８〜３６２頁も参照）。同時係属出願も、野生型であるが変異バージョンでないｃＤＮＡから発現された蛋白が、ＣＦの特徴であることがすでに示されているｃＡＭＰ調節クロライドチャンネルにおける欠陥を補うことを示す実験を開示している。ＣＦ関連遺伝子の蛋白生成物は、嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーター（Cyst ic fibrosis transmembrane conductance regulator）トランスメンブレンコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）と呼ばれる（リオーダン,ジェイ・アールら，（１９８９年）サイエンス第２４５巻１０６６〜１０７３頁）。ＣＦＴＲは、２つの繰り返しエレメントからなる約１４８０個のアミノ酸の蛋白であり、エレメントそれぞれが６個のトランスメンブランセグメントおよび１個のヌクレオチド結合ドメインからなっている。該２つの繰り返しは、多数の有効なホスホリレーション部位を有する、大型で極性の、いわゆるＲ−ドメインにより分離される。その予想されたドメイン構造に基づくと、ＣＦＴＲは、多薬剤耐性（ＭＤＲ）またはＰ−糖蛋白、ウシ・アデニルシクラーゼ、酵母・ＳＴＥ６蛋白のみならずアミノ酸輸送蛋白をも包含する関連蛋白のクラスの一員である（リオーダン,ジェイ・アールら，（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁；ハイデ,エス・シー（Hyde,S.C.）ら，（１９９０年）ネイチャー第３４６巻：３６２〜３６５頁）。このグループ蛋白は、性質上、細胞に出入りするポンピング分子に包含される。ＣＦＴＲは、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼＣによるホスホリレーションに応答した上皮細胞からののアニオン流出を調節すると考えられている（リオーダン,ジェイ・アールら，（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁；ウェルシュ，１９８６年；フリッゼル,アール・エイ（Frizzell,R.A.）ら，（１９８６年）サイエンス第２３３巻：５５８〜５６０頁；ウェルシュ,エム・ジェイ（Welsh,M.J.）およびリートケ，シー・エム（Liedtke,C.M.）（１９８６年）ネイチャー第３２２巻：４６７頁；リー,エム（Li,M.）ら，（１９８８年）ネイチャー第３３１巻：３５８〜３６０頁;フアング,ティー−シ−（Huang,T-C.）ら，（１９８９年）サイエンス第２４４巻：１３５１〜１３５３頁）。ＣＦ染色体のＣＦＴＲ遺伝子の配列分析により、種々の変異が明らかとなった（カッティング,ジー・アール（Cuttlng,G.R.）ら，（１９９０年）ネイチャー第３４６巻：３６６〜３６９頁；ディーン,エム（Dean,M.）ら，（１９９０年）セル（Cell）第６１巻：８６３〜８７０頁；およびケレム,ビー・エス（Kerem,B-S .）ら，（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０７３〜１０８０頁，ケレム, ビー・エスら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８７巻：８４４７〜８４５１頁）。個体群に関する研究により、最もありふれたＣＦ変異は、ＣＦＴＲのアミノ酸配列の５０８の位置のフェニルアラニンをコードしている３個のヌクレオチドの欠失（Δ５０８）であり、嚢胞性線維症のケースの約７０％に関連していることが示された。この変異は、上皮細胞細胞のクロライドチャンネルのｃＡＭＰへの応答を減少させる（フリッゼル,アール・エイら，（１９８６年）サイエンス第２３３巻：５５８〜５６０頁；ウェルシュ，エム・ジェイ（１９８６年）サイエンス第２３２巻：１６４８〜１６５０頁；リー,エムら，（１９８８年）ネイチャー第３３１巻:３５８〜３６０頁；クイントン,ピー・エム（Quinton,P.M.）（１９８９年）クリニ・ケミ（Clin.Chem.）第３５巻：７２６〜７３０頁）。気道細胞において、このことは、イオンおよび液体輸送のバランスの崩壊を引き起こす。このことが、異常な粘液分泌を引き起こし、ついには、肺の感染症および上皮細胞細胞の損傷を引き起こすと広く信じられている。ＣＦＴＲΔ５０８のみならず他のＣＦＴＲ変異種の生合成（チェング，エス・エイチ（Cheng,S.H.）ら，（１９９０年）セル第６３巻：８２７〜８３４頁；グレゴリー,アール・ジェイら，（１９９１年）モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー（Mol.Cell Biol.）第１１巻:３８８６〜３８９３頁）および局在化（デニング,ジー・エム（Denning,G.M.）ら，（１９９２年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロ（J.Cell Biol.）第１１８巻:５５１〜５５９頁）に関する研究により、多くのＣＦＴＲ変異蛋白が正確に加工されず、その結果として、形質膜に送達されないことが示されている（グレゴリー,アール・ジェイら，（１９９０年）モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー第１１巻：３８８６〜３８９３頁）。これらの結論は、ＣＦＴＲΔ５０８を発現する細胞におけるｃＡＭＰ剌激Ｃ１^- チャンネルの検出に失敗した初期の機能に関する研究と矛盾しない（リッチ,ディー・ピーら，（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３５８〜３６３頁；アンダーソン,エム・ピー（Anderson,M.P.）ら，（１９９１年）サイエンス第２５１巻：６７９〜６８２頁）。現在にいたるまで、ＣＦ治療の第１の目的は、感染を抑制し、粘膜のクリアランスを促進し、栄養状態を改善することであった（ボート,ティー・エフら,「ザ・メタボリック・ベイシス・オブ・インヘリティド・ディジージズ」（スクリバー，シー・アールら編，ニューヨークのマクグロー−ヒル（１９８９年））。意図的な抗生物質の使用および胸部打診を伴う姿勢上の廃液法のプログラムは、治療の主たるものである。しかしながら、疾患が進行するにつれ、頻繁な入院が必要となる。栄養面での養生法としては、膵臓酵素および脂溶性ビタミンが挙げられる。気管支拡張剤が時々使用される。炎症を抑制するためにコルチコステロイドが使用されているが、それらは明らかに不利な効果を有し、それらの利益は不確実である。極端な場合には、ときどき肺移植が試みられる（マーシャル，エス（Mars hall,S.）ら，（１９９０年）チェスト（Chest）第９８巻：１４８８頁。現在に至るまで、ＣＦに対する新しい治療を開発するための最も多くの努力が、肺の合併症に払われてきた。ＣＦ粘膜は溶解した好中球由来の高濃度のＤＮＡを含むため、１つのアプローチは、組み換え型ヒト・ＤＮａｓｅの開発であった（シャク,エス（Shak,S.）ら，（１９９０年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ第８７巻：９１８８頁）。予備的な報告には、粘膜の粘度を減少させるにはエアロゾル化した酵素が有効でりうるということが示唆されている。このことは、気道から障害物を除去すること、そして、おそらく、感染の減少の一助となりうる。過剰の好中球由来のエラスターゼにより引き起こされるダメージを抑える試みにおいて、プロテアーゼ阻害剤が試験された。例えば、ＣＦ患者の肺の酵素活性を送達するために、ヒト・血漿から精製されたアルファ−１−抗トリプシンがエアロゾル化された（マケルバニー,エヌ（McElvaney,N.）ら，（１９９１年）ザ・ランセト（The Lancet）第３３７巻：３９２頁）。もう１つのアプローチは、好中球由来の酸化剤の作用を抑制する薬剤の使用であろう。生化学的パラメーターはうまく測定されるのであるが、長期にわたるこれらの治療の有益な効果は得られていない。異なる原理を用いて、他の研究者らは、ＣＦ気道における異常に減少したクロライド分泌および増加したナトリウム吸収を逆転させるための薬剤の使用を試みた。気道上皮による不完全な電解質輸送は、呼吸分泌物および粘膜の組成を変化させると考えられる（ボート,ティー・エフら，「ザ・メタボリック・ベイシス・オブ・インヘリティド・ディジージズ」（スクリバー,シー・アールら編,ニューヨークのマクグロー−ヒル（１９８９年）；クイントン，ピー・エム（１９９０年）ＦＡＳＥＢジャーナル第４巻：２７０９〜２７１７頁）。それゆえ、電解質輸送における異常を修正する目的の薬理学的治療は有益でありうる。薬剤アメリオライド（amelioride）のエアロゾル化バージョンを用いて試行が続けられている。アメリオライドは、ナトリウムチャンネルを阻害する利尿剤であり、それゆえ、ナトリウム吸収を阻害する。初期の研究結果は、該薬剤が安全であり、肺機能試験により測定される疾患の進行速度をわずかに変化させることを示す（ノールズ,エム（Knowls,M.）ら，（１９９０年）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Eng.J.Med.）第３２２巻：１１８９〜１１９４頁；アップ，イー（App,E.）（１９９０年）アメ・レビ・リスペ・ディジ（Am.Rev.Res pir.Dis.）第１４１巻：６０５頁）。ＡＴＰまたはＵＴＰのごときヌクレオチドは、気道上皮のプリン作動性受容体を刺激する。結果として、それらは、ＣＦＴＲクロライドチャンネルとは異なるクラスのクロライドチャンネルを開ける。インビボにおける研究は、ＡＴＰおよびＵＴＰがクロライド分泌を刺激することを示す（ノールズ,エムら，（１９９１年）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン第３２５巻：５３３頁）。インビボにおける分泌を刺激し、それにより電解質輸送の異常を修正するヌクレオチドの能力を試験するための予備的な試行が進行中である。治療の進歩にもかかわらず、嚢胞性線維症は致命的疾患のままであり、現代の治療はこの基本的欠陥を治療できない。しかしながら、２つの一般的なアプローチが実行可能であることが証明されうる。これらは：１）野生型蛋白を患者に送達してその欠損蛋白を増加させるための蛋白置換療法、および２）野生型のＣＦ関連遺伝子のコピーを送達するための遺伝子置換療法である。最も生命を脅かすＣＦの徴候には肺の合併症が含まれるので、上部気道の上皮細胞は、治療のための適当な標的細胞である。遺伝子治療の実行可能性は、ＣＦ患者由来の上皮細胞中への野生型ｃＤＮＡの導入およびクロライドイオン輸送における致命的欠陥の相補を示すことにより確立される（リッチ,ディー・ピーら，（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３５８〜３６３頁）。しかしながら、それに続く研究により、遺伝子を全動物の気道に送達するには、欠陥アデノウイルスが使用可能であることが示されている（ローゼンフェルド（Rosenfeld）（１９９２年）セル第６８巻：１４３〜１５５頁）。しかしながら、欠陥アデノウイルスを用いることの安全性および効果が示される必要が残っている。発明の概要一般的には、本発明は、対象とする選択遺伝物質（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）をインビボにおいて細胞に転移するためのベクターに関する。好ましい具体例において、該ベクターはアデノウイルスに基づくものである。遺伝子治療に関するアデノウイルスに基づくベクターの利点は、それらが比較的安全で、所望遺伝子産物をコードするよう操作でき、同時に、その正常な溶菌性ウイルスの生活環における複製能について不活性化されるということである。さらに、アデノウイルスは、気道上皮に対する本質的な屈性を有する。それゆえ、アデノウイルスに基づくベクターは、嚢胞性線維症の遺伝子治療ごとき呼吸器の遺伝子治療への適用に特に好ましい。１の具体例において、アデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターは、ウイルス複製の初期段階に関与するゲノムのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠失され、対象とする遺伝物質（例えば、嚢胞性線維症トランスメンブレンレギュレーター蛋白）により置換されている２型アデノウイルス血清型ゲノムからなる。もう１つの具体例においてアデノウイルスに基づく治療ベクターは、偽−アデノウイルス（ＰＡＶ）である。ＰＡＶｓは、何ら潜在的に有害なウイルス遺伝子を有しておらず、理論上、約３６ｋｂの外来物質に対する容量を有し、適当に高力価で産生され、分裂性および非分裂性のヒト・標的細胞系に対する元のアデノウイルスの屈性を維持している。ＰＡＶｓは、アデノウイルスの逆方向反復塩基配列、およびヘルパーウイスルによる有効な複製ならびにパッケージングに必要な野生型の２型アデノウイルスのゲノムの最小配列、そして対象とする遺伝物質からなる。好ましい具体例において、ＰＡＶは、２型アデノウイルス配列を含んでいる。さらなる具体例において、アデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターは、Ｅ４プロモーター由来のアデノウイルス初期領域４（Ｅ４）のオープンリーディングフレームを含み、他のすべてのＥ４オープンリーディングフレームを欠失している。最適には、このベクターは、Ｅ１および／またはＥ３領域の欠失を含むことができる。別法として、アデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターは、Ｅ４プロモーター由来のアデノウイルスＥ４のオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）を含み、他のすべてのＥ４オープンリーディングフレームを欠失しているものである。さらに、最適には、このベクターは、Ｅ１および／またはＥ３領域の欠失を含むことができる。Ｅ４の不可欠でないオープンリーディングフレームの欠失は、細胞培養におけるウイルスの活性を有意に減じることなく、約２ｋｂのクローニング容量を増加させ、得られるベクターの理論的な挿入容量は８〜９ｋｂに増加する。本発明は、開示されたベクターおよび本発明方法により得られた遺伝子操作された細胞を用いる遺伝子治療の方法にも関する。表および図面の簡単な説明表および図面を参照することにより、本発明をさらに理解することができる。表Ｉは、ＣＦＴＲ変異体を示し、表中、ＣＦとの既知の関連（Ｙ，あり、またはＮ，なし）、エキソンの局在化、ドメインの局在化および変異ＣＦＴＲ種のバンドＡ、ＢならびにＣの存在（＋）または不存在（−）が示されている。ＴＭ６はトランスメンブレンドメイン６を表し；ＮＢＤはヌクレオチド結合ドメインを；ＥＣＤは細胞外ドメインを；Ｔｅｒｍは残基１３３７を過ぎて２１コドン行ったところでの終結を示す。表IIは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１のヌクレオチド配列を示す。表IIIは、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲのヌクレオチド分析を示す。変異体の命名に関する取り決めは、はじめに、特定の残基において通常見いだされるアミノ酸、残基番号、そして残基が変換されたアミノ酸とする（リオーダン,ティー・アールら，（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁）。１文字アミノ酸コードを用いる。Ｄ,アスパラギン酸；Ｆ，フェニルアラニン；Ｇ,グリシン；Ｉ,イソロイシン；Ｋ,リジン；Ｍ,メチオニン；Ｎ,アスパラギン；Ｑ,グルタミン；Ｒ,アルギニン；Ｓ,セリン；Ｗ,トリプトファン。よって、Ｇ５５１Ｄは、グリシン５５１がアスパラギン酸に変換されている変異種である。図１は、ＣＦＴＲの完全な暗号配列を含むｃＤＮＡの構築に用いるＣＦＴＲの部分ｃＤＮＡクローンの配置を示す。上記ＤＮＡ構造に関連した制限部位のみを示す。図２は、ＣＦＴＲのｃＤＮＡクローンｐＫＫ−ＣＦＴＲＩのプラスミド構築を示す。図３は、ＣＦＴＲのｃＤＮＡクローンｐＫＫ−ＣＦＴＲ２のプラスミド構築を示す。図４は、ＣＦＴＲのｃＤＮＡクローンｐＳＣ−ＣＦＴＲ２のプラスミド構築を示す。図５は、ＣＦＴＲのｃＤＮＡクローンｐＳＣ−ＣＦＴＲ２のプラスミド地図を示す。図６は、ＣＦＴＲのｃＤＮＡ配列中へのイントロンの挿入に用いる合成ＤＮＡ配列を、関連エンドヌクレアーゼ部位および記載されたヌクレオチド位置とともに示す。図７Ａおよび７Ｂは、ＣＦＴＲのｃＤＮＡクローンｐＫＫＣＦＴＲ３のプラスミド構築を示す。図８は、ヌクレオチド１７１６と１７１７間にイントロンを有するＣＦＴＲのｃＤＮＡｐＫＫ−ＣＦＴＲ３のプラスミド地図である。図９は、ＣＦＴＲのグリコシダーゼ処理を示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＯＳ−７トランスフェクション細胞から発現されたＣＦＴＲの分析を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＣＯＳ−７トランスフェクション細胞における野生型およびΔＦ５０８変異種ＣＦＴＲのパルスチェイスラベリングを示す。図１２Ａ〜１２Ｄは、野生型およびΔＦ５０８変異種ＣＦＴＲの免疫局在化と、ｐＭＴ−ＣＦＴＲまたはｐＭＴ−ＣＦＴＲ−ΔＦ５０８でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞を示す。図１３は、ＣＦＴＲ由来の変異種の分析を示す。図１４は、ＣＦＴＲ（Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１）をコードしている第１世代のアデノウイルスに基づくベクターの地図を示す。図１５は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１ベクターのプラスミド構築を示す。図１６は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１を与えられたコットンラットの肺ホモジネート物由来のネスティッドＲＴ−ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動からのＵＶ蛍光の例を示す。ゲルは、ホモジネート物は、ウイルスにコードされたＣＦＴＲｍＲＮＡに対して陽性であったことを示す。図１７は、コットンラットの器官ホモジネート物由来のネスティッドＲＴ−ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動からのＵＶ蛍光の例を示す。ゲルは、感染したラットのすべての器官は、小腸を除き、Ａｄ２／ＣＦＴＲに対して陰性であったことを示す。図１８Ａおよび１８Ｂは、対照および感染ラット由来の気管支肺胞洗浄物の分別細胞分析を示す。これらのデータは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１で処理されたラットは、感染４、１０ならびに１４日後（図１８Ａ）および感染３、７ならびに１４日後（図１８Ｂ）において全白血球細胞数または分別白血球細胞数の変化がなかったことを示す。図１９は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１に感染した後、異なる時点で屠殺した治療ラットおよび対照ラットからのコットンラット・気管のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片を示す。図２０Ａおよび２０Ｂは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１またはＡｄ２／β−Ｇａｌの適用後、アカゲザルの鼻のブラッシング物由来のＲＴ−ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動し、臭化エチジウム染色したもののＵＶ蛍光の例を示す。図２１は、サルの鼻のブラッシング物由来の光学顕微鏡図および免疫細胞化学による図を示す。顕微鏡図は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１に曝露されたサル由来の鼻上皮細胞をＣＦＴＲに対する抗体で染色した場合、陽性反応が見られたことを示す。図２２は、サルの鼻甲骨生検の免疫細胞化学による図を示す。この顕微鏡図は、対照のサルから得られた表面上皮の尖端膜において見られるよりも、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１９Ｂで処理されたサルから得られた生検物由来の表面上皮の尖端膜における免疫蛍光が増加しているを示す。図２３Ａ〜２３Ｄは、３種のベクター投与後のアカゲザルにおける血清抗体力価を示す。グラフは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１で処理された３匹のサルすべてがアデノウイルスに対する抗体を産生したことを示す。図２４は、サルの内側の鼻介骨生検由来のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片を示す。これらの切片は、別々の病理学者により検査された場合、対照のサル由来の鼻介骨生検標本は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１で処理されたサル由来の標本と区別されなかったことを示す。図２５Ａ〜２５Ｉは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１適用直前、適用中および適用後のヒト・鼻粘膜の顕微鏡写真を示す。これらの顕微鏡写真は、鼻粘膜の検査により、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１処理（図２５Ａ〜２５Ｃ）患者および対照（図２５Ｇ〜２５１）における穏やかないし中程度の紅斑、浮腫および滲出が示されたことを示す。局部麻酔および血管収縮を要しない方法でさらなる患者をＡｄ２／ＣＦＴＲに曝露した場合、何等兆候がなく、鼻粘膜は正常に見えた（図２５Ｄ〜２５Ｆ）ため、これらの変化は、おそらく、局部麻酔および血管収縮によるものであった。図２６は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与３日後の第３の患者から得たヒト・鼻粘膜のヘマトキシリンおよびエオシン染色生検の顕微鏡写真を示す。この切片は、ＣＦと矛盾しない形態、すなわち、厚くなった基底膜および粘膜下組織に時折見られる形態核細胞を示すが、アデノウイルスベクターによると考えられる異常を示さない。図２７は、正常なヒト対象の鼻上皮を横切る経上皮電圧（Ｖｔ）を示す。アミロライド（amiliride）（μＭ）およびターブタリン（terbutaline）（μＭ）を、示された時間の初めから粘膜表面に還流した。基底条件において、（Ｖｔ）は電気的に負であった。粘膜表面上のアミロライドの還流は、尖端Ｎａ⁺チャンネルを遮断することにより、（Ｖｔ）を抑制した。図２８Ａおよび２８Ｂは、正常なヒト対象（図２８Ａ）およびＣＦ患者（図２８Ｂ）の鼻上皮を横切る経上皮電圧（Ｖｔ）を示す。鼻粘膜上における基底条件、アミロライド（μＭ）での還流およびアミロライドおよびターブタリン（μＭ）の還流下において値を得た。データは、７人の正常対象および９人のＣＦ患者からのものである。ＣＦ患者においては、（Ｖｔ）は、正常対象におけるよりも電気的に陰性であった（図２８Ｂ）。アミロライドは、正常対象における（Ｖｔ）と同様にＣＦ患者における（Ｖｔ）を抑制した。しかしながら、アミロライド存在下の上皮上にターブタリンを還流した場合、Ｖｔは過剰分極しなかった。（Ｖｔ）が変化せず、あるいはより負にならないにもかかわらず、結果は、正常対象において観察されたものとは非常に異なっていた。図２９Ａおよび２９Ｂは、約２５ＭＯＩのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の投与前（図２９Ａ）および投与後（図２９Ｂ）の第３の患者の鼻上皮を横切る経上皮電圧（Ｖｔ）を示す。アミロライドおよびターブタリンを示された時間の初めから粘膜表面に還流した。図２９Ａは、処理前の第３の患者からの例を示す。図２９Ｂは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１適用前の応答とは対照的に、ウイルス複製後においてはアミロライド存在下においてターブタリンはＶｔを刺激したことを示す。図３０Ａ〜３０Ｆは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与前および後の経上皮電気特性の経時変化を示す。図３０Ａおよび３０Ｂは、約１ＭＯＩを与えられた第１の患者からのもの、図３０Ｃおよび３０Ｄは、約３ＭＯＩを与えられた第２の患者からのもの、図３０Ｅおよび３０Ｆは、約２５ＭＯＩを与えられた第３の患者のものてある。図３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｅは、基底経上皮電圧を示し、図３０Ｂ、３０Ｄおよび３０Ｆは、アミロライド存在下でのターブタリン還流後の経上皮電圧変化（ΔＶｔ）を示す。０日は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与の日を示す。図３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｅは、３人すべての患者についての基底Ｖｔの経時変化を示す。基底Ｖｔの低下は、Ａｄ２／ＣＨＴＲ適用により、３人すべての患者の鼻上皮におけるＣＦによる電解質輸送の欠陥が修正されたことを示す。さらなる証拠がターブタリンに対する応答試験から得られた。図３０Ｂ、３０Ｄおよび３０Ｆは、応答の経時変化を示す。これらのデータは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１が、ＣＦによるＣ１^-輸送の欠陥を修正したことを示す。図３１は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１のかわりにセイラインをＣＦ患者に投与する前および投与後の経上皮電気特性の経時変化を示す。０日は、模擬投与時を示す。上のグラフは、基底経上皮電圧（Ｖｔ）を示し、下のグラフは、アミロライド存在下でのターブタリン還流後の経上皮電圧変化（ΔＶｔ）を示す。黒いシンボルは、局部麻酔／血管収縮が行われ、３０分間アプリケーターを装着した２人の患者からのデータである。白いシンボルは、局部麻酔／血管収縮が行われたが、アプリケーターを装着しなかった患者からのデータである。症状の変化および身体的所見は、同様の投与方法およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−１で処理したＣＦ患者において観察されたものと同じであった。図３２は、第２世代のアデノウイルスに基づくベクターであるＰＡＶの地図を示す。図３３は、第２世代のアテノウイルス性ベクター６（ＡｄＥ４ＯＲＦ６）のプラスミド構築を示す。図３４は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１は内在性Ｅ１ａプロモーターを用いているという点でＡｄ２／ＣＦＴＲ−１と異なる、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲの図解であり、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲは、ＣＦＴＲの下流に直接ポリＡ付加シグナルを有しておらず、インタクトなＥ４領域を保持している。図３５は、多重度０．３、３および５０でＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲに感染したヒト・鼻ポリプ上皮細胞からの短絡電流を示す。示された時間において、（１）１０μＭアミロライド、（２）ｃＡＭＰアゴニスト（１０μＭフォルスコリンおよび１００μＭＩＢＭＸ）、（３）１ｍＭジヘニルアミン−２− カルボキシラートを粘膜溶液に添加した。図３６Ａ〜３６Ｄは、感染前（３６Ａ）およびＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ感染後７日目（３６Ｂ）、２４日目（３６Ｃ）ならびに３８日目（３６Ｄ）におけるアカゲザルＣのレーザースキャンニング顕微鏡による、鼻ブラッシング物の免疫細胞化学を示す。図３７Ａ〜３７Ｄは、感染前（３６Ａ）およびＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ感染後７日目（３６Ｂ）、２４日目（３６Ｃ）ならびに３８日目（３６Ｄ）におけるアカゲザルＤのレーザースキャンニング顕微鏡による、鼻ブラッシング物の免疫細胞化学を示す。図３８Ａ〜３８Ｄは、感染前（３６Ａ）およびＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ感染後７日目（３６Ｂ）、２４日目（３６Ｃ）ならびに３８日目（３６Ｄ）におけるアカゲザルＥのレーザースキャンニング顕微鏡による、鼻ブラッシング物の免疫細胞化学を示す。図３９Ａ〜３９Ｃは、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲでの感染の臨床的徴候（または徴候の欠如）のまとめを示す。図４０Ａ〜４０Ｃは、サルＣＦＴＲ、ＤおよびＥに関するＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ感染後の血球数、沈降速度および臨床化学のまとめを示す。全身的炎症応答または臨床化学の異常の証拠はなかった。図４１は、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ感染後のサルＣ、ＤおよびＥにおける白血球数のまとめを示す。これらのデータは、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ投与は、ウイルス投与後のいかなる時点においても炎症細胞の分配および数の変化を引き起こさなかったことを示す。図４２は、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲウイルスの２回目の点滴注入４日後のアカゲザルＣについての粘膜下組織生検物の組織学を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、炎症ならびに細胞変性の変化の証拠がないことが明らかとなった。図４３は、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲウイルスの２回目の点滴注入１１日後のアカゲザルＤについての粘膜下組織生検物の組織学を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、炎症ならびに細胞変性の変化の証拠がないことが明らかとなった。図４４は、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲウイルスの２回目の点滴注入１８日後のアカゲザルＥについての粘膜下組織生検物の組織学を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、炎症ならびに細胞変性の変化の証拠がないことが明らかとなった。図４５Ａ〜４５Ｃは、１回目および２回目のＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ投与の前後におけるアデノウイルスに対する抗体力価を示す。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ投与の前に、サルにＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を点滴注入した。ＥＬＩＳＡにより測定された抗体力価は、１回目および２回目のＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ投与後１週間以内に上昇した。血清中和抗体もウイルス投与１後１週間以内に上昇し、２４日目にピークとなった。抗−アデノウイルス抗体は、どのサルの鼻洗浄物のＥＬＩＳＡまたは中和アッセイによっても検出されなかった。詳細な説明および最良のモード遺伝子治療本明細書で用いる語句「遺伝子治療」は、対象とする遺伝物質（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主中に転移して、遺伝的または後天的な疾患もしくは症状を治療あるいは予防することをいう。対象とする遺伝物質は、インビボにおいてその生成が望まれる生成物（例えば蛋白、ポリペプチド、ペプチドまたは機能的ＲＮＡ）をコードしている。例えば、対象とする遺伝物質は、治療価値のあるホルモン、受容体、酵素または（ポリ）ペプチドをコードしていてもよい。対象とする遺伝物質の例としては、嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーター（ＣＦＴＲ）、因子VIII、低密度リポ蛋白受容体、ベータガラクトシダーゼ、アルファガラクトシダーゼ、ベータグルコセレブロシダーゼ、インスリン、甲状腺ホルモンおよびアルファ−１−抗トリプシンをコードしているＤＮＡが挙げられる。遺伝病を遺伝子治療する可能性について多年にわたり評価が行われてきたが、かかるアプローチが２人のアデノシンデアミナーゼ欠損患者について実用的となったのはごく最近のことである。そのプロトコールは、患者からのリンパ球の採取、組織培養で増殖させるための刺激、適当に遺伝子操作されたレトロウイルスでの感染、ついで、該リンパ球の患者への再導入からなる（カントフ,ピー（Kanto ff,P.）ら，（１９８７年）ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）第１６６巻：２１９頁）。最初の治療結果は非常に励みとなるものである。限定された臨床用途についての他の多くのヒトの遺伝子治療のプロトコールが是認され、遺伝子治療によりＣＦを補う可能性が示されれば、ＣＦに対する遺伝子治療は実行可能な選択となろう。嚢胞性線維症に対する遺伝子置換療法の概念は非常に単純である。ＣＦ患者の気道に直接送達されるウイルス性または他の担体中のある種の適当なベクター中にＣＦＴＲをコードする配列を作るのである。肺の気道の疾患は罹患率の主要な原因であり、死亡率の９５％の原因となっている。気道上皮細胞は、ＣＦ遺伝子治療にとり好ましい標的である。第１世代のＣＦ遺伝子治療は、一時的なものであり、気道に繰り返し送達することが必要であろう。しかしながら、最終的には、気道上皮細胞になる前駆細胞または幹細胞のアイデンティティーが知られるようになった場合には、遺伝子治療はＣＦに対する治癒を提供しうる。ＤＮＡが気道細胞中に取り込まれるならば、その後生じるかかる細胞のすべての世代は、組み込まれた配列から真正なＣＦＴＲを作り、ＣＦＴＲ作用の生化学的基礎にほとんど関係なく身体的欠陥を修正するであろう。概念においては単純であるが、科学的および臨床的問題が遺伝子治療のためのアプローチに直面する。現在に至るまでのヒトにおけるすべての遺伝子治療は、患者から採取され、ついで再導入される細胞に対するエクスビボでの処理を必要とするが、ＣＦはインビボでのアプローチを必要とする。遺伝子治療が実行可能な治療アプローチとなる前に克服されるべき１つの主な障害は、疾患を示している組織に感染し、治療的なＣＦＴＲ遺伝子を送達するための適当なベクターの開発である。ウイルスが、その核酸を細胞中に導入するための非常に有効な手段として開発されているので、遺伝子治療のための多くのアプローチに遺伝子操作された欠陥ウイルスが使用される。しかしながら、インビボでのウイルスの使用は安全性の問題を引き起こす。潜在的に安全であるとしても、最少の付加的ＤＮＡを含む単純なＤＮＡプラスミド構築物の使用は、他方では、しばしば非常に非効率的で、一時的な蛋白発現にしかならないこともありうる。宿主染色体中への導入ＤＮＡの組み込みは、かかるＤＮＡが娘細胞にまで継代されるであろうということにおいて利点を有する。ある環境においては、組み込まれたＤＮＡは、高発現またはより持続的な発現を引き起こすこともありうる。しかしながら、組み込みが起こるには、しばしば、そしておそらくいつも、細胞ＤＮＡの複製が必要である。これは、現段階のレトロウイルスの場合には確実にあてはまる。このことは、細胞の大部分において細胞分裂が起こる環境に対するかかるウイルスの使用を制限する。インビトロで培養された細胞に関しては、このことはめったに問題とならないが、気道細胞は、ごくまれにしか分裂しないことが報告されている（カワナミ,オー（Kawanami,O.）ら，（１９７９年）アニュ・レビュ・リスイエラ・ディジ（An.Rev.Respir,Dis.）第１２０巻：５９５頁）。ＣＦにおけるレトロウイルスの使用は、おそらく、細胞分裂を誘導ための気道の損傷を必要とする。このことは、ＣＦ患者においては実際的でないことがわかる。レトロウイルスを用いて効果的なＤＮＡ組み込みが行われ得るとしても、ヒト・ゲノムは、細胞増殖の調節に関与するエレメントを含んでおり、そのうちの小さなフラクションだけは現在同定されている。腫瘍原性遺伝子または抗−腫瘍遺伝子のごときエレメントに隣接した組み込みにより、そのエレメントの活性化または不活性化が起こり、コントロールされない改変細胞の増殖を起こさせる。通常は、いくつかのかかる活性化／不活性化ステップは、コントロールされない増殖を誘導するためには、いかなる細胞においても必要であり、そうすることは、潜在的危険性をいくらか減少させうると考えられよう（アール・エイ・ワインベルグ（R.A.Weinberg）（１９８９年）キャンサー・リサーチ（Cancer Research ）第４９巻：３７１３頁）。他方、腫瘍を誘導する挿入による変異誘発は、欠陥レトロウイルスを有する動物において確実に知られており（アール・エイ・ワインベルグ,上記；ペイン,ジー・エス（Payne,G.S.）ら，（１９８２年）ネイチャー第２９５巻：２０９頁）、インビボにおいてレトロウイルスで繰り返し治療された患者の生存期間において起こる有効な組み込みの大多数は、かかる方法の安全性に関する問題を生じる。ウイルスＤＮＡ組み込みに関連する潜在的な問題のほかに、多くの付加的な安全性の問題が生じる。多くの患者は、ベクターの候補となるいくつかのウイルス、例えばアデノウイルスに対する先在抗体を有している。さらに、かかるベクターの繰り返し使用は、免疫応答を誘導しうる。欠陥ウイルスベクターの使用は、この問題を幾分改善しうる。なぜならば、感染細胞における生産的ウイルス生活環、細胞溶解または多数の子孫ウイルスを誘導しないからである。ウイルスの使用に関連する他の問題は、治療された患者において自然に感染する関連ウイルスとの組換えの可能性、野生型ウイルス蛋白の同時発現によるウイルス欠陥の相補、および遺伝子操作されたウイルスのエアロゾルの含有である。ＣＦに対する遺伝子治療のアプローチは、蛋白治療におけるのと同じ多くの臨床的問題に直面する。これらの問題としては、粘膜形成による気道上皮のアクセス不能性、およびウイルス／ベクターを不活性化しうるＣＦ気道における環境敵対性が挙げられる。ベクター担体のエレメントは免疫原性でありうるし、ＮＡの導入は非効率的でありうる。蛋白治療に伴うこれらの問題は、疾患に関する良好な動物モデルがないこと、および治療効果を測定するための単純な臨床的終点が存在しないことにより改善されない。ＣＦ遺伝子治療ベクター−可能な選択レトロウイルス−欠陥レトロウイルスは最も特徴づけられた系であり、その限りにおいてはヒトの遺伝子治療における使用に関して是認されている唯一のものであるが（ミラー,エイ・ディー（Miller,A.D.）（１９９０年）ブラッド（Blood ）第７６巻：２７１頁）、ＣＦに関連する主な問題は、ＤＮＡ組み込みおよび遺伝子発現を達成するために分裂性の細胞を必要とすることである。気道細胞の分裂を誘導する条件が見いだされた場合には、レトロウイルスのインビボ適用は、特に何年にもわたり繰り返される場合には、挿入による変異誘発の安全性に対する評価が必要となろう。アデノ−関連ウイルス−（ＡＡＶ）は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのごとき他のウイルスを必要とする天然の欠陥ウイルスである（ムジクズカ，エヌ（Muzyczka,N.）（１９９２年）,「カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イミュノロジー（Current Topics in Microbiology and Immunology）第１５８巻：９７頁）。確実なことではないが、該ウイルスは、そのＤＮＡを非分裂性細胞中に組み込むことの出来る少ないウイルスの１つである。ＡＡＶの３００塩基対程度を有するベクターをパッケージングすることができ、組み込むことができるが、外来性ＤＮＡに対するスペースは約４．５ｋｂに限定されている。ＣＦＴＲＤＮＡは、おそらく、パケージングの上限であろう。さらにそのうえ、パッケージング法自体、現在のところ非効率的で、免疫原性、相補性およびエアロゾル含有のごとき安全性の問題もＡＡＶには存在する。それにもかかわらず、この系は、さらなる研究を保証することが十分に有望である。プラズミドＤＮＡ−組織への注射により、プラスミドをそのまま筋肉細胞中へ導入することが可能である。発現は何カ月にもわたり行われるが、使用可能な細胞の種類は少ない（ウォルフ，ジェイ（Wolff,J.）ら（１９８９年）サイエンス第２４７巻：１４６５頁）。カチオン性脂質は、ある種の培養細胞へのＤＮＡの導入を補助する（フェルグナー,ピー（Felgner,P）およびリンゴールド，ジー・エム（Ringold,G.M.）（１９８９年）ネイチャー第３３７巻:３８７頁）。マウスの循環系へのカチオン性脂質とプラスミドＤＮＡとの複合体の導入により、肺においてＤＮＡが発現されることが示されている（ブリンガム,ケイ（Bringham, K.）ら，（１９８９年）アメリカン・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンス（Am.J.Med.Sci.）第２９８巻：２７８頁）。カチオン性脂質とプラスミドＤＮＡとの複合体の肺への点滴注入によっても、上皮細胞における発現が誘導されるが、発現効率は比較的低く、一時的なものである（ハジンスキ，ティー・エイ（Haziski,T.A.）ら，（１９９１年）アメ・ジャー・リスピレ,セル・モレ・バイオロ（Am.J.Respir.,Cell Mol.Biol.）第４巻：２０６頁）。プラスミドＤＮＡの使用の１つの利点は、非複製細胞中に導入されうることである。しかしながら、すでに高濃度の外来性ＤＮＡを含んでいるＣＦ気道環境におけるプラスミドＤＮＡの使用は問題である。受容体により伝達される導入−プラスミドＤＮＡの取り込み効率を改善するための努力において、導入機構としての受容体によって伝達されるエンドサイトーシスの利用、およびポリリジンを伴う複合体中でのＤＮＡの保護が試みられた（ウー，ジー（Wu,G.）およびウー，シー・エイチ（Wu,C.H.）（１９８８年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２６３巻：１４６２１頁）。このアプローチに関する１つの潜在的な問題は、多くの流入物質が分解されるエンドソームからリソソームへと通じる経路にプラスミドＤＮＡが入るということである。この問題に対する１つの解決法は、アデノウイルスカプシドに結合したトランスフェリンＤＮＡ−ポリリジン複合体の使用である（クリエル，ディー・ティー（Criel,D.T.）ら，（１９９１年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８８巻：８８５０頁）。後者は効率的に導入されるが、エンドソームを自然に破壊するというさらなる利点を有しているので、リソソームへの往復を回避する。このアプローチは有望であるが、現在のところ、比較的一時的なものであり、他のアデノウイルスに基づく方法と同じ免疫原性についての潜在的問題がある。アデノウイルス−現在のところ、欠陥アデノウイルスは、ＣＦ遺伝子治療に対する有望なアプローチであると思われる（バークナー，ケイ・エル（Berkner,K. L.）（１９８８年）バイオ・テクニークス（Bio Techniques）第６巻：６１６頁）。所望遺伝子産物（例えばＣＦＴＲ）をコードし発現し、通常の溶解性ウイルス生活環における複製能が不活性化するように、アデノウイルスを操作することができる。さらに、アデノウイルスは、気道上皮に対する本質的な屈性を有している。アデノウイルスは、気道に見られるような静止細胞に感染でき、レトロウイルス以上の利点を有する。アデノウイルス発現は、宿主細胞染色体中へのウイルスＤＮＡの組み込みがなくても行われ、それゆえ、挿入による変異誘発に関する問題が改善される。さらにそのうえ、アデノウイルスは、長年にわたり優れた安全性を有する生腸ワクチンとして使用されている（シュワルツ，エイ・アール（Schwartz,A.R.）ら，（１９７４年）アメ・レビ・リスピレ・ディジ（Am.Rev. Respir.Dis.）第１０９巻：２３３〜２３８頁）。最終的には、アデノウイルスにより伝達される遺伝子転移は、コットンラットの肺へのアルファ−１−抗トリプシンおよびＣＦＴＲの転移をはじめとする多くの例において示されている（ローゼンフェルド，エム・エイ（Rosenfeld,M.A.）ら，（１９９１年）サイエンス第２５２巻：４３１〜４３４頁；ローゼンフェルドら，（１９９２年）セル第６８巻：１４３〜１５５頁）。そのうえ、アデノウイルスをヒトの癌の発生原因として位置づけるために試みられたさらなる研究結果は、一様に否定的なものであった（グリーン，エム（Green,M.）ら，（１９７９年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第７６巻：６６０６頁）。以下の特徴は、アデノウイルスをＣＦＴＲに関する遺伝子をＣＦ患者の気道細胞に転移するように設計することにおいて望ましい。最少のウイルス遺伝子発現を行う間、ベクターはＣＦＴＲを十分発現させなければならない。最少のウイルスＤＮＡ複製、および理想的にはウイルス複製がないことが必要である。最終的には、患者において新たなウイルス配列を生じる組換えおよび欠陥ウイルスを増殖させるための相補が最少でなければならない。ＣＦＴＲ（Ａｄ２／ＣＦＴＲ）をコードしている第１世代のアデノウイルスベクターは、実施例７記載のごとく作られ、これらの目的を最も達成するものであり、実施例１０記載のヒトにおける試験に用いられた。図１４は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１の地図を示す。図からわかるように、この第１世代のウイルスは、通常の比較的良性の２型アデノウイルス血清型由来のＤＮＡを含んでいる。ウイルス複製の初期段階に必要とされる関与するＥ１ａおよびＥ１ｂ領域は欠失されている。これらの除去は、ウイルス遺伝子発現およびウイルス複製を減じる。これらの遺伝子の蛋白産物も、ある種の非許容細胞において不死化および形質転換機能を有する。ＣＦＴＲをコードしている配列を、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ領域のかわりにウイルスゲノムに挿入し、その内在性Ｅ１ａプロモーターによりＣＦＴＲ配列の転写を作動させる。これは、種々の細胞において機能的な中程度の強さのプロモーターである。いくつかのアデノウイルスベクター（ローゼンフェルド，エムら，（１９９２年）セル第６８巻：１４３頁）とは対照的に、このアデノウイルスは、Ｅ３ウイルス暗号領域を有している。Ｅ３を含んでいることの結果として、該アデノウイルス−ＣＦＴＲＤＮＡの長さは野生型アデノウイルスのものよりも長い。組換えウイルスＤＮＡがより長いことは、パッケージングをより困難にする。このことは、喪失しているＥ１ａおよびＥ１ｂの機能を提供する許容細胞においてさえも、Ａｄ２／ＣＦＴＲウイルスの増殖が妨げられることを意味する。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１のＥ３領域は、種々の蛋白をコードしている。これらの蛋白の１つであるｇｐ１９は、主要組織適合抗原系（ＭＨＣ）のクラス１の蛋白と相互作用し、その出現を妨げると考えられている（グッディング，シー・アール（Gooding,C.R.）およびウォルド，ダブリュウ・エス・エム（Wold,W.S.M.）（１９９０年）クリティ・レビ・イミュノロ（Crit.Rev.Immunol.）第１０巻５３頁）。この特性は、感染細胞の認識を妨げ、よって、ウイルスの潜在性を許容しうる。それゆえ、Ｅ３配列の存在は、２つの有用な貢献を行う。１つは、大きなサイズのウイルスＤＮＡはその複製を２倍不完全にし（すなわち、初期の機能を欠き、パッケージングされにくい）、もう１つには、組換え型ウイルスに対する免疫応答が回避されるために、ＭＨＣ出現が起こらないということは、複数回投与を含む遺伝子治療におけるＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の遅れた適用において有用でありうる。Ｅ３の存在に関連する利点があるのみならず、その不存在に関連する不利な・も存在する。動物におけるＥ３欠失ウイルスの研究により、Ｅ３欠失が重大な病変を引き起こすことが示されている（ギンンスバーグ，エイチ・エス（Ginsberg ,H.S.）ら，（１９９０年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８６巻：３３８２３頁）。さらにそのうえ、Ｅ１およびＥ３欠失ウイルスと野生型ウイルスとの組換えにより得られるようなＥ３欠失ウイルスは、組織培養において野生型よりも早く増殖することが報告されている（バークナー，ケイ・エル（Barkner,K.L.）およびシャープ，ピー（Sharp,P.）（１９８３年）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Ac ids Research）第１１巻：６００３頁）。しかしながら、対照的に、Ｂ型肝炎表面抗原をコードしているＥ３置換ベクターに関する最近の報告は、生腸ワクチンとして送達された場合、かかるウイルスは、ヒトにおいて、野生型と比較すると殆ど複製しないことが示唆されている。アデノウイルスベクター（Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１）およびマーカーであるβ− ガラクトシダーゼをコードしている関連ウイルス（Ａｄ２／β−ｇａｌ）を構築し、ヒト・２９３細胞中で増殖させた。これらの細胞はアデノウイルスのＥ１領域を含み、構成的にＥ１ａおよびＥ１ｂを発現し、ベクターから欠失された遺伝子産物を提供することにより欠陥アテノウイルスを相補する。そのゲノムサイズは野生型ウイルスのものより大きいので、Ａｄ２／ＣＦＴＲは比較的産生されにくい。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１ウイルスは、２９３細胞における蛋白の存在を示すことにより、ＣＦＴＲをコードしていることが示された。Ａｄ２／β−ｇａｌウイルスは、サル・細気管支細胞系（４ＭＢＲ−５）、初代ハムスター・気管上皮細胞、ヒト・ＨｅＬａ、ヒト・ＣＦＰＡＣ細胞（実施例８参照）およびＣＦ患者からの気道上皮細胞（リッチ，オー（Rich,O.）ら，（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３５８頁）をはじめとする、組織培養において増殖した種々の細胞系においてその蛋白を産生することが示された。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１をアデノウイルス２（Ａｄ２）ＤＮＡ配列から構築する。他のアデノウイルス変種（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５およびＡｄ７）も遺伝子治療ベクターとして有用であることが証明されうる。単一血清型に対する免疫応答が治療の有効性を減じる場合に、このことは不可欠であることがわかる。第２世代のアデノウイルスベクター現在使用されているアデノウイルスベクターは、親ウイルスの遺伝物質の大部分（≧８０％）を保持しているが、その安全性は試験されておらず疑わしい。それゆえ、最少限のアデノウイルスの調節、パッケージングおよび複製配列を有する第２世代のベクター系が開発された。偽−アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）−ＰＡＶｓは、アデノウイルスの反転した末端重複およびヘルパーウイルス依存性複製およびベクターのパッケージングに必要な最少のアデノウイルスの５’末端配列を含んでいる。これらのベクターは、潜在的に有害なウイルス遺伝子を含んでおらず、外来物質に対する理論容量は約３６ｋｂであり、適度に高力価で産生されることができ、分裂性および非分裂性のヒト・標的細胞系に対する親ウイルスの屈性を維持している。プラスミド由来の構築物としても、あるいは感染性ウイルス粒子としても、ＰＡＶベクターを維持することができる。プラスミド構築物として、ＰＡＶは、効率的な複製およびこれらの配列のパッケージングに必要な野生型アデノウイルス２型由来の最少配列と、野生型または欠陥ヘルパーウイルスにより必要とされるすべてのさらなる外来性遺伝物質からなる。特別には、ＰＡＶは、図１７に示すようなアデノウイルス２（Ａｄ２）配列、すなわち、ベクターの５’末端を形成するアデノウイルス２のヌクレオチド０〜３５６および構築物の３’末端を形成するアデノウイルス２の最後の１０９個のヌクレオチドを含んでいる。該配列は、Ａｄ２のフランキング側面末端重複（５ ’ＩＴＲ）および既知のパッケージングシグナルおよびＥ１ａエンハンサーを含む５’ＩＴＲに隣接する配列を包含する。種々の便利な制限部位が、該フラグメント中に組み込まれており、ＰＡＶウイルス粒子中にパッケージングされ、遺伝子転移（例えば、遺伝子治療）に使用されうるプロモーター／遺伝子カセットの挿入が可能となっている。ＰＡＶの構築および増殖は、下記実施例１１に詳細に記載されている。大部分のネイティブなアデノウイルスＤＮＡを含まないことにより、本明細書記載のＰＡＶｓは、親の免疫応答の生成または宿主中での複製をする可能性がより少ない。さらに、ＰＡＶベクターは、最大約３６ｋｂまでの外来ＤＮＡを受け入れることができる。それゆえ、ＰＡＶベクターは、従来のベクターが受け入れることのできないより大きな遺伝子（例えば、ＣＦＴＲ（７．５ｋｂ）；因子VIII（８ｋｂ）；因子IX（９ｋｂ））のクローニングに特に有用である。さらに、ＰＡＶベクターを用いて１個以上の遺伝子または１コピー以上の特定遺伝子を転移することができる。例えば、嚢胞性線維症の遺伝子治療については、ＰＡＶｓを用いて、抗プロテアーゼ（例えば、抗プロテアーゼアルファ−１−抗トリプシン）、金属プロテイナーゼの組織阻害剤、抗酸化剤（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、局部的宿主防御のエンハンサー（例えば、インターフェロン）、粘液溶解剤（例えば、ＤＮＡアーゼ）および炎症サイトカインをブロックする蛋白のごとき他の遺伝子と結合したＣＦＴＲを送達することができる。Ａｄ２−Ｅ４／ＯＲＦＦ６アデノウイルスベクター初期領域４（Ｅ４）由来のアデノウイルスＥ４のオープンリーディングフレーム６（ＯＲＦ６）のみを発現し、他の既知Ｅ４オープンリーディングフレームを欠失しているアデノウイルス構築物を、実施例１２に詳細に記載するようにして構築した。Ｅ４オープンリーディングフレーム３の発現もまた、ＤＮＡ複製および後期蛋白合成に必要なＥ４機能を提供するには十分である。しかしながら、ＯＲＦ６の発現と比較すると、それは、低い効率でこれらの機能を提供するので、低レベルのウイルス生成となる可能性がある。それゆえ、ＯＲＦ３よりもむしろＯＲＦ６を発現することは、組換え型アデノウイルスベクターの製造にとってより良い選択であるように思われる。アデノウイルスのＥ４領域は、ウイルスＤＮＡ複製、後期ｍＲＮＡ合成および宿主蛋白合成の閉鎖のみならず、ウイルス構築においても役割を果たしていると考えられる（ファルゴウト，ビー（Falgout,B.）およびジー・ケトナー（G.Ketn er）（１９８７年）ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）第６１巻：３７５９〜３７６８頁）。アデノウイルス初期領域４は、効率的なウイルス粒子構築、後期遺伝子発現、および宿主細胞閉鎖に必要である（ハルバート，ディー・エヌ）ら（１９８５年）ジャーナル・オブ・ウイロロジー第５６巻：２５０〜２５７頁）。Ｅ４の不可欠でないオープンリーディングフレームの欠失は、細胞培養におけるウイルスの活性を有意に減じることなく、組換え型アデノウイルスウイルスベクターのクローニング容量を２ｋｂ増加させる。アデノウイルスベクターのＥ１および／またはＥ３領域における欠失を組み込んだ場合、得られるベクターの理論上の挿入容量は８〜９ｋｂに増加する。この増大したクローニング容量が有用であると証明される例としては、ＣＦＴＲをコードしている遺伝子治療ベクターの開発においてである。上記のごとく、第１世代のアデノウイルスベクターは、ウイルスＤＮＡのカプシド挿入に関しては最大パッケージング容量に到達している。結果として、このウイルスは増殖が悪く、時おり、欠陥のある子孫を生じうる。アデノウイルス中にＥ４欠失を包含させることは、これらの問題を改善するはずである。さらに、そのことは、ウイルスからＣＦＴＲを発現させるためのプロモーターの選択を柔軟なものにする。例えば、第１世代のアデノウイルスには大きすぎる、アデノウイルス主要後期プロモーター、サイトメガロウイルス即時型初期プロモーターまたはＣＦＴＲプロモーターのごとき細胞性プロモーターのような強力なプロモーターを用いて発現を行うことができる。さらに、Ｅ４のＯＲＦ６のみを発現させることによって、これらの第２世代のアデノウイルスベクターは、遺伝子治療における使用に関して安全となりうる。ＯＲＦ６の発現は、不死化細胞におけるウイルスＤＮＡ複製および後期蛋白合成には十分であるが、Ｅ４のＯＲＦ６／７もまた、非分裂性初代細胞において必要とされうることが示唆されている（ヘムストロム，シー（Hemstrom,C.）ら，（１９９１年）ジャーナル・オブ・ウイロロジー第６５巻：１４４０〜１４４９頁）。オープンリーディングフレーム６および７（ＯＲＦ６／７）複合体から生じる１９ｋＤの蛋白は、初期領域２の最大活性化に必要な細胞性転写因子Ｅ２Ｆを活性化する。初期領域２は、ウイルスＤＮＡの複製に必要な蛋白をコードしている。活性化された転写因子Ｅ２Ｆは増殖中の細胞に存在し、細胞増殖に必要な遺伝子（例えばＤＨＦＲ、ｃ−ｍｙｃ）の発現に必要とされる。しかるに、活性化されたＥ２Ｆは非分裂性細胞には低レベルで存在する。それゆえ、Ｅ４のＯＲＦ６のみの発現は、ウイルスが組織培養細胞（例えば、２９３細胞）中で正常に複製することを可能にするが、ＯＲＦ６／７の不存在は、非分裂性初代細胞における転写因子Ｅ２Ｆの有効な活性化を妨げ、そのことにより、ウイルスＤＮＡ複製能を低下させる。標的組織ＣＦ患者の９５％が肺疾患で死亡するため、肺は、遺伝子治療の好ましい標的である。疾患の異常性は、気道に並んでいる上皮細胞による欠陥のある電解質輸送である。多くの研究者は以下のことを観察している（クイントン，エフ（１９９０年）ＦＡＳＥＢジャーナル第４巻：２７０９に概説あり）：ａ）ｃＡＭＰにより媒介される経上皮クロライド分泌の完全な消失、およびｂ）Ｎａ⁺吸収速度の２ないし３倍の増加。ｃＡＭＰにより刺激されるクロライド分泌は、尖端膜におけるクロライドチャンネルを必要とする。（ウェルシュ，エム・ジェイ（Wels h,M.J.）（１９８７年）フィジオロ・レビュ（Physiol.Rev.）第６７巻：１１４３〜１１８４頁）。ＣＦＴＲはホスホリレーションにより調節されるクロライドチャンネルであり、ＣＦＴＲクロライドチャンネルの特性は、尖端膜におけるクロライドチャンネルの特性と同じであるという発見は、ＣＦＴＲそれ自身が経上皮クロライド分泌を媒介することを示すものである。この結論は、肺組織にＣＦＴＲを局存化させる研究により支持された。ＣＦＴＲは気道上皮細胞の尖端膜に局存しており（デニング，ジー・エム（Denning,G.M.）ら（１９９２年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell Biol.）第１１８巻：５５１頁）、粘膜下組織腺に存在している（タウシッヒ（Taussig）ら，（１９７３年）ジャーナル・オブ・クキニカル・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.）第８９巻：３３９頁）。ＣＦＴＲ機能の喪失の結果として、ｃＡＭＰにより調節される経上皮クロライド分泌が消失する。この時点では、ＣＦＴＲ機能不全がどのようにしてＮａ⁺吸収速度の増加をもたらすのかがはっきりしない。しかしながら、欠陥のあるクロライド分泌および増加したＮａ⁺吸収は、呼吸管流体の変化を引き起こし、それゆえ、粘膜繊毛のクリアランス機構および正常な肺の防御機構に欠陥を与えることになる。結果として、吸入された物質の肺からのクリアランスが損なわれ、ついで、繰り返し感染が起こる。呼吸管流体および粘膜繊毛のクリアランスにおける推定される異常により、疾患に対するもっともらしい説明が提供されるが、その病理に対する正確な理解がやはり欠けている。気道上皮細胞における遺伝的欠陥の修正は、ＣＦ肺の表現型を逆転させる可能性がある。蛋白が豊富でないために、気道上皮においてＣＦＴＲを発現する特異的細胞の同一性は、免疫細胞化学によっては正確に決定することはできない。しかしながら、機能に対する研究により、表面上皮の、繊毛を有する上皮細胞、およびおそらくは繊毛のない細胞も、電解質輸送に関与する主な細胞系に属する。よって、実際的には、遺伝子治療のための目下好ましい標的細胞は、肺気道に並んでいる成熟細胞であると思われる。これらは、急速に分裂する細胞さはなく、むしろ、それらの大部分は非増殖性であり、その多くは最終分化細胞でありうる。気道における前駆細胞の同定は不確かであろう。ＣＦＴＲもまた粘膜下組織腺に存在しうるが（トレザイス，エイ・イー（Trezjse,A.E.）およびブフワクド，エム（Buchwald,M.）（１９９１年）ネイチャー第３５３巻：４３４頁，エングレハルド，ジェイ・エフ（Englehardt,J.F.）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション第９０巻：２５９８〜２６０７頁）、当該部位におけるその機能についてはデータがなく、そのうえ、かかる腺は比較的アクセスし難い。気道上皮は、遺伝子治療に関して、２つの主要な利点を提供する。第１に、気道上皮へのアクセスは比較的侵入的でない可能性がある。このことは、送達方法の開発において重要な利点であり、それゆえ研究者は治療応答をモニターできるであろう。第２に、上皮は、気道管腔と間質との間に障壁を形成する。よって、間質へのベクターの適用は、標的細胞へのアクセスを可能にするであろうが、少なくともある程度までは、上皮障壁を越えた間質への移動および障壁から身体の残りの部分への移動を制限するであろう。遺伝的欠陥を修正するのに必要な遺伝子送達の効率いかなる遺伝子治療プロトコールも、正常にＣＦＴＲを発現する細胞の１００％を修正することは不可能であろう。しかしながら、いくつかの観察結果は、多様な細胞のわずかの部分の修正、または正常量のＣＦＴＲフラクションの発現は、治療上の利益となりうることを示唆している。ａ．ＣＦは、常染色体性劣性疾患であり、ヘテロ接合体は肺疾患を有していない。よって、正常な機能のためには、５０％の野生型ＣＦＴＲで十分であると思われる。ｂ．この問題は、ＣＦ細胞と野生型ＣＦＴＲ細胞を発現する組換えＣＦ細胞とを用いた混合実験において試験された（ジョンソン，エル・ジー（Johnson/L.G. ）ら（１９９２年）ネイチャー・ジェネ（Nature Gen.）第２巻：２１頁）。得られたデータは、６〜１０％程度の修正された細胞とともに再構築する場合、クロライド分泌は、１００％修正細胞において観察されるクロライド分泌に匹敵することを示すものである。組換え細胞におけるＣＦＴＲ発現は、おそらく、正常細胞においてよりも多いであろうが、この結果は、インビボでのすべてのＣＦ気道細胞の修正が必要であるとは限らないことを示すものである。ｃ．最近の観察結果は、いくつかのＣＦ関連変異を有するＣＦＴＲは、残存するクロライドチャンネル活性を保持していることを示す（シェッパード，ディー・エヌ（Sheppard,D.N.）ら，（１９９２年）ペディアトリ・パルモナ・サプレ（Pediatr.Pulmon.Suppl.）第８巻：２５０頁；ストロング，ティー・ブイ（Str ong,T.V.）ら，（１９９１年）ニュー・イングランド・ジャーンナル・オブ・メディシン（N.Eng.J.Med.）第３２５巻：１６３０頁）。これらの変異は、軽度の肺疾患に関連している。よって、低レベルのＣＦＴＲ活性であっても、少なくとも部分的に電解質輸送異常を改善しうる。ｄ．下記実施例８に記載する実験において示されるように、おそらくＣＦＴＲの発現がすべての細胞においては起こらない条件下でのＣＦ上皮の相補は、ｃＡＭＰにより刺激されるクロライド分泌を回復させた。ｅ．正常なヒト・気道上皮におけるＣＦＴＲのレベルは非常に低く、かろうじて検出できる。免疫沈降法または免疫ブロッティング法のごとき常用される生化学的手法を用いては検出されず、免疫細胞化学的手法での検出は非常に困難である（デニング，ジー・エムら（１９９２年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第１１８巻：５５１頁）。レーザースキャンニング共焦顕微鏡を用いるいくつかの場合においてＣＦＴＲが検出されているが、そのシグナルは検出限界にあり、すべての場合においてバックグラウンド以上では検出できない。その最小レベルのＣＦＴＲにもかかわらず、実質的なｃＡＭＰ刺激クロライド分泌を起こすにはかかる少量で十分である。非常に少数のＣＦＴＲクロライドチャンネルが大きなクロライド分泌速度を保持できるという理由は、多数のイオン（１０⁶〜１０⁷個／秒）が単一のチャンネルを通過できるということである（ヒル，ビー（H ille,B.）（１９８４年），マサチューセッツ州サンダーランド（Sunderland）のシナウアー・アソシ・インク（Sinauer Assoc.Inc.），４２０〜４２６頁）。ｆ．定量的ＰＣＲを用いた以前の研究により、気道上皮細胞は、細胞あたり多くとも１ないし２個の転写物を有することが報告されている（トラプネル，ビー・シー（Trapnell,B.C.）ら，（１９９１年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８８巻：６５６５頁）。ＣＦに対する遺伝子治療は、広範な治療インデックスを有すると思われる。部分的発現が治療的価値を有しうるのと同じように、野生型ＣＦＴＲの過剰発現は意義のある問題を生じそうにないと思われる。この結論は、理論的考察および実験結果に基づく。ＣＦＴＲは調節されたチャンネルであり、さらに、ＣＦＴＲは上皮において特異的機能を有しているので、ＣＦＴＲの過剰発現が、調節されないクロライド分泌を誘導する可能性はない。まず、分泌は、ｃＡＭＰ依存性ホスホリレーションによるＣＦＴＲの活性化を必要とする。このキナーゼの活性化は、高度に調節されたプロセスである。次に、ＣＦＴＲクロライドチャンネルが尖端膜において開いたとしても、間質空間から細胞へのクロライドの導入に必要とされる基底外側膜トランスポーターの調節なしでは分泌は引き続き起こらないであろう。基底外側膜において、ナトリウムーカリウムークロライドコトランスポーターおよびカリウムチャンネルが経上皮分泌の重要なレギュレーターとして役立つ（ウェルシュ、エム・ジェイ（１９８７年）フィジオロ・レビュ（Physiol. Rev.）第６７巻１１４３〜１１８４頁）。界面活性剤プロテインＣ（ＳＰＣ）遺伝子プロモーター（ホワイトセットジェイ・エイ（Whitesett,J.A.）ら（１９９２年）ネイチャー・ジェネ第２巻：１３頁）およびカゼインプロモーター（ディツリオ、ピー（Ditullio,P.）ら（１９９２年）バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）第１０巻：７４頁）の調節下で、トランスジェニックマウスにおいてヒト・ＣＦＴＲが発現された。それらのマウスにおいて、細気管支および肺胞上皮細胞ならびに乳腺において、それぞれ、ＣＦＴＲが過剰発現された。しかし、トランスジェニック動物における多量の過剰発現にもかかわらず、目立った形態学的または機能的以上はなかった。さらに、コットンラットの肺におけるＣＦＴＲ発現による異常は報告されなかった（ローゼンフェルド，エム・エイら（１９９２年）セル第６８巻：１４３〜１５５頁）。本発明を、以下の実施例により、さらに詳細に説明するが、実施例は、さらに限定的なものではない。本明細書全体にわたり引用されたすべての参考文献の内容を、参照により本明細書に特別に取り入れる。実施例実施例１−全長にわたるＣＦＴＲｃＤＮＡの取得通常に使用されるほとんどすべてのＤＮＡクローニングベクターは、修飾されたｐＭＢ１複製開始点を含むプラスミドに基づいており、細胞あたり５００ないし７００までのコピー数で存在している（サムブルック（Sambrook）ら，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Press）１９８９年）。リオーダンらにより単離された部分ＣＦＴＲｃＤＮＡクローンは、かかるプラスミド中に維持された。高コピー数のプラスミドを用いて全長にわたるＣＦＴＲ蛋白をコードしているクローンを回収することが明らかに不可能であることを説明するための、本来的なクローンの不安定性に対する別の理論は、イー・コリ（E.coli）に多量の遺伝子を与えてＣＦＴＲｃＤＮＡの大きなセグメントをクローニングすることは不可能であるということである。細菌細胞において転写および／または翻訳を指令することのできる調節配列からのＣＦＴＲまたはＣＦＴＲの部分の発現は、転写物または全長にわたるＣＦＴＲ蛋白もしくはそのフラグメントの毒性による細胞の不活性化を引き起こす可能性がある。この不注意の遺伝子発現は、イー・コリにおいて機能化されうるプラスミドの調節配列または組換えＣＦＴＲプラスミド中の潜在的な調節配列のいずれからも生じうる。多コピー数プラスミドが使用されたために、ＣＦＴＲｃＤＮＡの多量のコピーが細胞中に存在する場合には、ＣＦＴＲ暗号配列の毒性発現が大いに増加するであろう。生成物が、予想したように毒性であれば、全長および正しい配列を含む細胞は、実際には好ましくない。この新規な仮説に基づいて、以下の方法が行われた。図２を参考にすると、部分ＣＦＴＲクローンＴ１６−４．５を制限酵素ＳｐｈＩおよびＰｓｔＩで開裂し、得られたエキソン１１ないしエキソン２４の大部分を含む３．９ｋｂの制限フラグメント（リオーダンにより報告された特徴不明の１１９ｂｐの挿入配列がヌクレオチド１７１６と１７１７との間に含まれている）を、アガロースゲル精製により単離し、ｐＭＢ１に基づくベクターｐｋｋ２２３−３（ブロシウス（Brosius）およびホリー（Holy），（１９８４年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８１巻：６９２９頁）のＳｐｈＩ部位とＰｓｔＩ部位との間にライゲーションした。このプラスミド中に含まれているｐＭＢ１オリジンが、宿主イーコリ細胞あたり該プラスミドを１５〜２０コピー複製させることが望まれた（サムブルックら，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１９８９年）。得られたプラスミドをｐｋｋ−４．５と称した。部分ＣＦＴＲクローンＴ１１を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｃIIで開裂し、ＣＦＴＲｃＤＮＡの最初の１７８６個のヌクレオチドおよび５’末端においてさらに１００ｂｐのＤＮＡをコードしている１．９ｋｂのバンドを、アガロースゲル精製により単離した。この制限フラグメントを、プラスミドブルースクリプトＳｋ（Bluescript Sk）（ストラタジーン（Stratagene）製、カタログ番号２１２２０６）のＥｃｏＲＩ部位とＡｍａＩ制限部位との間に挿入して、クローニングベクターのＳａｌＩ部位によりＣＦＴＲ配列が上流（５’）側び並ぶようにした。Ｔ１１−Ｒと命名したこのクローンを、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで開裂し、得られた１．８ｋｂのバンドをアガロースゲル精製により単離した。プラスミドｐｋｋ−４．５を、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで開裂し、大きいフラグメントをアガロースゲル精製により単離した。精製されたＴ１１−Ｒフラグメントおよびｐｋｋ−４．５フラグメントをライゲーションしてｐ１１−ＣＦＴＲ１を構築した。ｐｋｋ−ＣＦＴＲ１は、ＣＦＴＲｃＤＮＡのエキソン１ないしエキソン２４を含んでいた。このプラスミドがイー・コリ細胞中で安定に維持され、宿主細胞に測定可能な不利な増殖特性を付与しないことが発見された。ｐｋｋ−ＣＦＴＲ１は、ヌクレオチド１７１６と１７１７との間に、上記部分ｃＤＮＡクローンＴ１６−４．５由来の１１９ｂｐの挿入ＤＮＡを含んでいる。さらに、引き続きｐｋｋ−ＣＦＴＲ１の配列分析を行ったところ、部分ｃＤＮＡクローンＴ１１と公表されたＣＦＴＲｃＤＮＡ配列との間の暗号配列における報告されていない相違が明らかとなった。これらの思いがけない相違は、位置９５５における１塩基対の欠失および位置１５０７におけるＣＦＴＲからＴへのトランジションを有していた。変異または挿入のないインタクトな正しいＣＦＴＲ暗号配列の構築を完成するために、図３に示す構築スキームを参考にして、ｐｋｋ−ＣＦＴＲ１をＸｂａＩおよびＨｐａＩで開裂し、子ウシ・腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。さらに、元のクローンへの復帰可能性を減じるために、ｐｋｋ−ＣＦＴＲ１由来の小型の所望でないＸｂａＩ／ＨｐａＩ制限フラグメントをＳｐｈＩで消化した。Ｔ１６−１をＸｂａＩおよびＡｃｃＩで開裂し、１．１５ｋｂのフラグメントをアガロースゲル精製により単離した。Ｔ１６−４．５をＡｃｃＩおよびＨｐａＩで開裂し、アガロースゲル精製により０．６５ｋｂのバンドも単離した。これら２つのアガロースゲル精製された制限フラグメントおよび脱リン酸化されたｐＫＫ−ＣＦＴＲ１をライゲーションしてｐＫＫ−ＣＦＴＲ２を得た。別法として、ｐＫＫ−ＣＦＴＲ２を、部分ＣＦＴＲｃＤＮＡクローンＣ１−１／５由来の対応する制限フラグメントを用いて構築することもできた。ｐＫＫ−ＣＦＴＲ２は、連続したＣＦＴＲ蛋白暗号配列を有しており、それが挿入されたイー・コリ宿主細胞の増殖を遅くした。一方、ｐＫＫ−ＣＦＴＲ２は増殖を遅くしなかった。ｐＫＫ−ＣＦＴＲ２の複製開始点はｐＭＢ１由来であり、宿主細胞あたりプラスミドコピー数を１５〜２０とする。実施例２−宿主細胞活性の改善宿主細胞のさらなる活性の向上を、宿主細胞あたりのＣＦＴＲｃＤＮＡコピー数をさらに減少させることにより行った。これを、ＣＦＴＲｃＤＮＡをプラシミドベクターｐＳＣ−３Ｚ中に移すことにより行った。低コピー数プラスミドｐＬＧ３３８（ストウカー（Stoker）ら，ジーン（Gene）第１８巻，３３５頁（１９８２年））のｐＳＣ１０１複製開始点およびｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ（Pr omega）より市販）のアンピシリン耐性遺伝子ならびにポリリンカーを用いてｐＳＣ−３Ｚを構築した。ｐＬＧ３３８をＳｐｈＩおよびＰｖｕIIで開裂し、複製開始点を含む２．８ｋｂのフラグメントをアガロースゲル精製により単離した。ｐＧＥＭ−３ＺをＡｌｗＮＩで開裂し、得られた制限フラグメント末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、デオキシヌクレオチドトリホスフェートをＳｐｈＩで開裂し、アンピシリン耐性遺伝子およびポリリンカーを含む１．９ｋｂのバンドをアガローセゲル精製により単離した。ｐＬＧ３３８およびｐＧＥＭ−３Ｚフラグメントをライゲーションして低コピー数のクローニングベクターｐＳＣ −３Ｚを得た。ｐＳＣ１０１複製開始点を含むｐＳＣ−３Ｚおよび他のプラスミドを、細胞１個あたり約５コピーとして維持した（サムブルックら，上記）。さらに図４を参照して、ｐＫＫ−ＣＦＴＲ２をＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩおよびＳａＩＩで開裂し、ついで、製造者の指示に従い、セファクリル（Sephacryl）Ｓ４００スパンカラム（ファルマシア（Pharmacia）より市販）に通してＳａｌＩからＥｃｏＲＶまでの制限フラグメント（カラムに保持されている）を除去した。ｐＳＣ−３ＺをＳｍａＩおよびＰｓｔＩで消化し、さらにセファクリルＳ４００スパンカラムに通して小型のＳｍａＩ／ＰｓｔＩ制限フラグメント（カラム低い保持されている）を除去した。ｐＫＫ−ＣＦＴＲ２消化物およびｐＳＣ−３Ｚ消化物からのカラム溶出フラクションを混合し、ライゲーションしてｐＳＣ−ＣＦＴＲ２を得た。このプラスミドの地図を図５に示す。この遺伝子量および同様の遺伝子量のＣＦＴＲｃＤＮＡｓを含む宿主細胞はよく増殖し、全長にわたるＣＦＴＲ暗号配列を伴う組み替えプラスミドを安定に維持した。さらに、このプラスミドは、ＣＦＴＲ暗号配列と並んでいるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含んでおり、それゆえ、ＣＦＴＲ蛋白のインビボにおける転写／翻訳に便利である。ｐＳＣ−ＣＦＴＲ２プラスミド由来のＣＦＴＲ暗号領域のヌクレオチド配列を、配列リスト１に配列番号：１として示す。この配列は、以前公表されたＣＦＴＲ配列（リオーダン，ジェイ・アールら，（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁）とは、位置１９９０において異なり、報告されたものはＡであるのにＣが存在している。グレゴリー，アール・ジェイら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁参照。細胞内においてｐＳＣ−ＣＦＴＲ２／ＡＧ１と同数であると確認されたｐＳＣ− ＣＦＴＲ２を含むイー・コリ宿主細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託し、受託番号：ＡＴＣＣ６８２４４を与えられた。実施例３−宿主細胞活性向上のための別法宿主細胞活性向上のための第２の方法は、ＣＦＴＲ蛋白暗号領域を破壊することからなる。この目的のためには、ヌクレオチド１７１６と１７１７との間に挿入するための合成イントロンを設計する。容易に管理できるサイズため、このイントロンは特に有利である。さらにそのうえ、真核細胞中で発現する場合に、ＣＦＴＲの１次転写産物から効率良くスプライシングされるように設計する。いずれも、位置１７００のＳｐｈＩ開裂部位から位置１７８５のＨｉｎｃＩＩ開裂部位まで伸長しており、１７１６から１７１７の間にさらに８３個のヌクレオチドを含んでいる４種の合成オリゴヌクレオチドを合成した（１１９５Ｇ、１１９６Ｇ、１１９７Ｇおよび１１９８Ｇ）（図６参照）。これらのオリゴヌクレオチドを、サムブルックらにより記載されたようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、リン酸化の間に使用したのと同じ緩衝液中、９５℃で５分間加熱し、ついで、数時間かけて室温まで冷却して１本鎖オリゴヌクレオチドをアリーリングさせた。ＣＦＴＲ暗号配列中にイントロンを挿入するために、図７Ａおよび７Ｂを参照して、ポリリンカーのＳａｌＩ部位を開裂し、デオキシヌクレオチドトリホスフェートとＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントでもって開裂されたＤＮＡの欠損した末端を修復し、ついで、該ＤＮＡを再ライゲーションすることにより、プラスミドＴ１１のサブクローンを作成した。ついで、このプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＮｒｕＩで消化し、再ライゲーショした。得られたプラスミドＴ１６−Δ５’は、ＣＦＴＲｃＤＮＡの位置４９０のＮｒｕＩ部位からクローンＴ１６の３’末端まで伸長しており、ＣＦＴＲｃＤＮＡのヌクレオチド１７００および１７８５に対応するＳｐｈＩおよびＨｉｎｃIIに対する単一部位を有していた。Ｔ１６−Δ５’プラスミドをＳｐｈＩおよびＨｉｎｃIIで開裂し、大きいフラグメントをアガロースゲル精製により単離した。アニーリングされた合成オリゴヌクレオチドをこのベクターフラグメント中にライゲーションしてＴ１６−イントロンを得た。ついで、Ｔ１６−イントロンをＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化し、大きいフラグメントをアガロースゲル精製により単離した。Ｔ１６−４．５をＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩで消化し、７９０ｂｐのフラグメントもアガロースゲル精製により単離した。精製Ｔ１６−イントロンとＴ１６−４．５フラグメントをライゲーションしてＴ１６−イントロン−２を得た。Ｔ１６−イントロン−２は、位置４９０のＮｒｕＩ部位から位置２８１８のＳｃａＩ部位まで伸長したＣＦＴＲｃＤＮＡ配列を有し、Ｔ１６−１にもＴ１６−イントロン−１にも存在しない、位置２４６３の単−ＨｐａＩ部位を有する。ついで、Ｔ１６−イントロン−２をＸｂａＩおよびＨｐａＩで開裂し、１８００ｂｐのフラグメントをアガロースゲル精製により単離した。ｐＫＫ−ＣＦＴＲ１をＸｂａＩおよびＨｐａＩで消化し、大きなフラグメントもアガロースゲル精製により単離し、Ｔ１６−イントロン−２４６３由来のフラグメントとライゲーショして図８に示すｐＫＫ−ＣＦＴＲ３を得た。ｐＫＫ−ＣＦＴＲ３中のＣＦＴＲｃＤＮＡは、ヌクレオチド１７１６とヌクレオチド１７１７との間に８３ｂｐのイントロンの挿入を除いてはｐＳＣ−ＣＦＴＲ２およびｐＫＫ−ＣＦＴＲ２中のＣＦＴＲｃＤＮＡと同じであった。このイントロンの挿入は、ｐＫＫ−ＣＦＴＲ２中の未修飾ＣＦＴＲｃＤＮＡを含む細胞に比べて、ｐＫＫ−ＣＦＴＲ３を含む細胞の増殖特性を改善した。実施例４−インビトロ転写／翻訳配列の分析のほかに、ＣＦＴＲｃＤＮＡノオープンリーディングフレームの完全性を、インビトロ転写／翻訳により証明した。さらに、この方法は、同定目的の１次ＣＦＴＲ蛋白産物を提供した。ｐＳＣ−ＣＦＴＲ２プラスミドＤＮＡ５マイクログラムをＳａｌＩで直鎖状にし、製造者（ストラタジーン（Stratagene ））による記載のごとく、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでのＣＦＴＲＲＮＡの直接合成に使用した。この転写物をフェノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。転写物を２５マイクロリットルの水に再懸濁し、インビトロ翻訳系（プロメガ（Promega）社製）における網状赤血球溶解物に量を変えて添加した。供給者による記載のごとく、イヌ・膵臓ミクロソーム膜（プロメガ）の存在下、新たに合成された蛋白を標識するために³⁵Ｓ−メチオニンを用いて反応をこなった。インビトロ翻訳産物を、０．１％ＳＤＳ存在下、８％ゲルを用いる不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動（レムリ，ユー・ケイ（Laemmli，U.K.）（１９７０年）ネイチャー第２２７巻：６８０〜６８５頁）により分析した。電気泳動前に、インビトロ翻訳反応物を、０．６５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中の３％ＳＤＳ、８Ｍ尿素および５％２−メルカプトエタノールで変性させた。電気泳動後、ゲルをメタノール：酢酸：水（３０：１０：６０）中で固定し、水で濯ぎ、ついで、１Ｍサリチル酸メチルで飽和させた。³⁵Ｓ標識蛋白をフルオログラフィーにより検出した。全長にわたるＣＦＴＲ挿入物の翻訳と矛盾しない約１８０ｋＤのバンドを検出した。実施例５−潜在的な調節シグナルの除去ＣＦＴＲのＤＮＡ配列の分析により、イー・コリ・プロモーターに関する推定配列（レズニコフ（Reznikoff）およびマクルア（McClure）、マキシマイジング・ジーン・イクスプレッション，１（Maximizing Gene Expression，１），バタワース・パブリッシャーズ（Butterworth Publishers），マサチューセッツ州ストーンハム（Stoneham））とよく一致する、ヌクレオチド７４８と７７８との間の潜在的なイー・コリＲＮＡポリメラーゼプロモーターの存在が明らかとなった。この配列がイーコリにおいてプロモータープロモーター機能を発揮するならば、この配列は、潜在的に毒性を有する部分ＣＦＴＲポリペプチドの合成を指令しうる。よって、ＣＦＴＲを含むプラスミドをイー・コリ中で維持するためのさらなる有利な方法は、この潜在的なプロモーターの配列をイー・コリ中で機能しないように変更することであろう。ＣＦＴＲｃＤＮＡによりコードされているアミノ酸配列を変更することなく、これを行うことができる。詳細には、完全または部分ＣＦＴＲｃＤＮＡを含むプラスミドを、合成オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異法（ゾラー（Zoller）およびスミス（Smith）（１９８３年）メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth.Enzymol.）第１００巻：４６８頁）により変更するものであろう。より詳細には、ヌクレオチド配列を位置９０８においてＴからＣへ、位置７７４においてＡからＧへ変更することは、ＣＦＴＲオープンリーディングフレームの能力をコードしているアミノ酸を変更することなく、このプロモーター配列の活性を除去する。転写および翻訳に関する、ＣＦＴＲｃＤＮＡ内の他の潜在的な調節シグナルを、同じ方法により、有利に、変更および／または欠失することもできる。さらなる分析により、転写プロモーターエレメントとしてイー・コリ中で有効に機能する、ヌクレオチド９０８から９３６まで伸長している配列が同定された（グレゴリー，アール・ジェイら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁）。位置９３６における変異は、このプロモーターを不活性化し、ＣＦＴＲｃＤＮＡをイー・コリ中のプラスミドとして安定に維持することができる（チェン，エス・エイチ（Cheng，S.H.）ら（１９９０年）セル第６３巻：８２７〜８３４頁）。詳細には、ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列の変更なしに位置９３６がＣからＴ残基に変更された。グレゴリー，アール・ジェイら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁に記載されたこの調節エレメント内の他の変異を用いて該プロモーター活性を不活性化させることもできる。詳細には、９０８から９１３まで（ＴＴＧＴＧＡ）、および９３１から９３６まで（ＧＡＡＡＡＴ）の配列を、ｃＤＮＡによりコードされているアミノ酸配列を変更することなく、部位特異的突然変異法により変更することができる。実施例６−交互宿主系におけるＣＦＴＲのクローニングＣＦＴＲｃＤＮＡはイー・コリにおいて明らかな毒性を示すが、他のタイプの宿主細胞はこのようにして影響を受けることはない。全ＣＦＴＲｃＤＮＡ蛋白暗号領域が維持および／または発現されうる交互宿主系は、他の細菌種および酵母を包含する。特に、いずれの細胞が耐性であり、いずれの細胞が耐性でないかを予測することは、不可能である。全長にわたる蛋白または潜在的に毒性のあるそのフラグメントの発現に対して耐性のある適当な宿主を見いだすためには、多くの異なる宿主／ベクターの組み合わせが必要である。実施例７−ＣＦＴＲをコードしているアデノウイルスベクター（Ａｄ２／ＣＦＴＲ）の生成１．ＤＮＡの調製−組み換えＡｄ２／ＣＦＴＲ−１ウイルス（その配列を表IIおよび配列番号：３に示す）の構築を以下のようにして行った。制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃＩＩ３６１を用いて、ＣＦＴＲｃＤＮＡをプラスミドｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ−９３６Ｃから切り出した。ｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ−９３６Ｃは、合成リンカーを用いてｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロジェン・コーポ（Invitrogen Corp.）製）の多重クローニング部位中に組み込まれた、公表さているＣＦＴＲ配列のヌクレオチド１２３〜４６２２を包含する最小ＣＦＴＲｃＤＮＡからなる。このプラスミド内のＣＦＴＲｃＤＮＡは、完全に配列決定されている。ＳｐｅＩ／ＥｃＩＩ３６１制限フラグメントは、合成リンカー由来の５’配列およびベクター由来の多重クローニング部位を含んでいる。ＣＦＴＲｃＤＮＡ（その配列を配列番号：１に、該ＣＦＴＲｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に示す）を、アデノウイルス遺伝子転移ベクターｐＢＲ−Ａｄ２−７のＮｈｅＩ制限部位とＳｎａＢＩ制限部位との間に挿入した。ｐＢＲ−Ａｄ２−７は、ｐＢＲ３２２のＣｌａＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に挿入されたＡｄ２の５’側の１０６８０ｂｐ由来の７ｋｂの挿入物を含んでいるｐＢＲ３２２に基づくプラスミドである。このＡｄ２フラグメントから、Ａｄ２のヌクレオチド５４６〜３４９７に対応する配列を欠失させ、１個のＮｈｅＩ部位、１個のＭｌｕＩ部位および１個のＳｎａＢＩ部位を含む１２ｂｐの多重クローニング部位で置換した。さらにその構築物は、５’逆方向反復塩基配列およびウイルスパッケージングシグナル、Ｅ１ａエンハンサーならびにプロモーター、Ｅ１ｂ３’イントロン、および３’非翻訳領域ならびにポリアデニル化部位を含んでいる。得られたプラスミドをｐＢＲ−Ａｄ２−７／ＣＦＴＲと呼んだ。ウイルス構築へのその利用を下記に示す。２．ＤＮＡからのウイルスの調製−組み換えＡｄ２／ＣＦＴＲ−１アデノウイルスを得るために、Ａｄ２中の１０６７０における部位の単一ＢｓｔＢ１部位に対応する部位において、ベクターｐＢＲ−Ａｄ２／ＣＦＴＲをＢｓｔＢ１で開裂した。開裂したプラスミドＤＮＡをＢｓｔＢ１で制限的に切断したＡｄ２ＤＮＡにライゲーションした。ライゲーション後、反応物を用いて、リン酸カルシウム法により、２９３細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション７〜８日後、単一プラークが出現し、これを用いてディッシュ中の２９３細胞を感染させた。細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られた後、培地を取り、保存した。全ＤＮＡを感染細胞から調製し、複数の酵素での制限分析により分析を行って構築物の完全性を証明した。ついで、ウイルス上清を、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）免疫沈降アッセイ（グレゴリー，アール・ジェイら，（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２頁）によりアッセイした。これらの証明方法を行った後、２ラウンドのプラーク精製によりウイルスをさらに精製した。１０％子ウシ・血清補足９２５培地中単層となっている２９３細胞上に低い感染の多重度で接種することにより、プラーク精製したウイルスを小規模な種ストック中で増殖させた。この段階の材料にはリサーチ・ウイラル・シード・ストック（Research Viral Seed Stock）（ＲＶＳＳ）のものを選定し、すべての予備実験に使用した。３．ウイルスの宿主細胞−Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１をヒト・２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）中で増殖させた。これらの細胞は、ヒト・Ａｄ５ＤＮＡの共有フラグメントで不死化されたヒト・胚腎臓細胞系である。２９３細胞系はアデノウイルス初期領域１５７３）遺伝子産物を発現し、結果として、Ｅ１欠損アデノウイルスの増殖を支援するであろう。レトロウイルスと同様に、２９３細胞は、パッケージング細胞系と考えられるが、それらは、失われたウイルス性構造蛋白を提供するのではなく、むしろ、いくつかの失われたウイルスの初期機能だけ提供するのである。ウイルスの生産ロットを、ワーキング・セル・バンク（Working Cell Bank）（ＷＣＢ）から得た２９３細胞中で増殖させた。ＡＴＣＣから得られる新鮮細胞バイアルから増殖させたマスター・セル・バンク（Master Cell Bank）（ＭＣＢ）からＷＣＢが得られた。２９３細胞はヒト起源であるため、生物学的要因の存在に関して広く試験されている。ＭＣＢおよびＷＣＢは、メリーランド州ロックビルのマイクロバイオロジカル・アソシエーツ（Microbiological Associates）により、アイデンティティが特徴づけられており、アデノウイルス性要因の不存在が確認されている。４．ウイルスの生産ロットの増殖Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１の生産ロットを、約５〜１０ｘ１０⁷ｐｆｕのＭＶＳＳを、９２５培地２５ｍｌを入れたＴ１７５フラスコ中で増殖した約１〜２ｘ１０⁷ 個のＷＣＢの２９３細胞上に接種することにより得る。ウイルスを直接各フラスコに添加することにより接種を行う。５０〜６０フラスコのバッチが１ロットを構成する。３７℃で４０〜４８時間インキュベーション後、細胞をフラスコから振り出し、培地とともに２５０ｍｌの遠心管に移し、１０００ｘｇで遠心分離する。細胞ペレットを、０．１ｇ／ｌのＣａＣｌ₂および０．１ｇ／ｌのＭｇＣｌ₂を含有する４ｍｌリン酸緩衝化セイライン中に懸濁し、細胞を凍結融解サイクルに付してウイルスを遊離させる。１０００ｘｇ、１５分の遠心分離により細胞残渣を除去する。この遠心分離から得た上清をＣｓＣｌの段階的グラジエントの頂上に置いた。すなわち、１０ｍＭＴｒｉｓおよび１ｍＭＥＤＴＡ（ＴＥ）中の、２ｍｌの１．４ｇ／ｍｌＣｓＣｌおよび３ｍｌの１．２５ｇ／ｍｌＣｓＣｌの頂上に置いて、ベックマン（Beckmen）ＳＷ４１ローター中で３５０００ｒｐｍ、１時間遠心分離した。ついで、ウイルスを２つのＣｓＣｌ層の界面から除去し、ＴＥ中１．３５ｇ／ｍｌＣｓＣｌと混合し、ついて、ＴＬＮ−１００ローター中、７５０００ｒｐｍで２．５時間の平衡密度勾配遠心分離に付す。皮下注射用針でチューブの側面に小孔をあけ、バンド状のウイルスをゆっくりと除去する。ＣｓＣｌ濃度を低下させるために、試料を１０％スクロース含有リン酸緩衝化セイライン２リットルで２回透析する。この工程後、透析したウイルスは４℃において数週間安定、または−８０℃ではより長期間保存可能である。ヒト用途の部分試料を試験し、これらの試験結果を待つ間、残りを凍結保存しておく。行うべき試験を以下に記載する。５．ウイルスの構造および純度生成ウイルス粒子のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、多くのポリペプチドの存在が明らかとなり、その大部分が特徴づけられた。ウイルス標品をさらに１または２ラウンドのＣｓＣｌ遠心分離に付した場合、得られた蛋白プロフィールは区別できないものであった。このことは、さらに平衡密度勾配遠心分離を行ってもウイルスをさらに精製できないことを示すものであり、ウイルス標品中に検出されたより弱いバンドでさえも、混入蛋白というよりはむしろ少数のウイルス粒子成分を示すものであるということを示唆しうる。該蛋白バンドのアイデンティティは、直ちに、Ｎ末端配列分析により確認される。６．混入物質−患者に投与すべき物質は、２ｘ１０⁶ｐｆｕ、２ｘ１０⁷ｐｆｕおよび５ｘ１０⁷ｐｆｕの精製Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１であろう。ｐｆｕに対する粒子の最小の比を５００と仮定すると、これらの値は、１ｘ１０⁹、１ｘ１０¹⁰および２．５ｘ１０¹⁰個のウイルス粒子に相当し、アデノウイルスの分子量を１５０ｘ１０⁶と仮定すると、０．２５μｇ、２５μｇおよび６．２５μｇの用量に相当する。精製Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１の生産ロットが由来する該物質の起源は、上に城塞に記載してあり、図６にフローダイアグラムとして示してある。精製ウイルスが作成されるすべての出発物質（すなわちＭＣＢおよびＷＣＢ、ならびにＭＶＳＳ）は、広範囲に試験されるであろう。さらに、使用する増殖用培地が試験され、血清は、試験検定書を提供する認められた供給者のみから得られるであろう。このようにして、生産ロットを得るために用いるすべての成分が特徴づけられるであろう。増殖後、生産ロットのウイルスは、２ラウンドのＣｓＣｌ遠心分離により精製され、透析され、そして試験されるであろう。生産ロットは、１〜５ｘ１０¹⁰ｐｆｕのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を構成するはずである。上記のごとく、何らかの混入物質の一部を検出するために、生産ロットの一部をＳＤＳゲル電気泳動および制限酵素マッピングにより分析されるであろう。しかしながら、これらの試験の感度は限られている。実際、精製された１本鎖組み換え蛋白に関する状況とは異なり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（または同様の方法）を用いてＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の精製を定量化することは困難である。別法は、混入蛋白（ＩＤＣＰ）の免疫的検出である。かかるアッセイには模擬精製において精製された蛋白に対して産生された抗体を使用する。かかるアッセイの開発は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１のＣｓＣｌ精製スキームに関して試みられたことはなかった。しかしながら、最初に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生された組み換え蛋白中の混入物の検出のために開発されたＩＤＣＰアッセイが用いられるであろう。さらに、ハムスター蛋白に対しては、これらのアッセイにより、ウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）、増殖培地に添加された血清由来のトランスフェリンおよびＩｇＧ重鎖ならびに軽鎖が検出される。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット双方によりＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の研究バッチを試験するための、かかる試薬を用いる試験が進行中である。ウイルス標品に混入している他の蛋白は、２９３細胞により産生されるようであり、すなわちヒト由来であろう。ヒト由来の治療薬に混入しているヒト蛋白ハ、通常は、問題とならない。しかしながら、本発明の場合、生産ロットを形質転換因子に関して試験することを計画する。かかる因子は、ヒト・蛋白またはＡｄ２／ＣＦＴＲ−１ベクターに混入する可能性があり、あるいは他の混入因子となりうる。試験に関して、１０ディッシュのＲａｔ１細胞（２ｘ１０⁶個（患者における標的細胞の数）の細胞を含む）は、高用量のヒト・Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１（２ｘ１０⁸ｐｆｕ）で感染させられるであろう。感染後、細胞を寒天に撒き、形質転換フォーカスの出現について調べる。野生型アデノウイルスが対照として使用されよう。核酸および蛋白は、密度勾配遠心分離によりウイルス標品から分離されると期待される。そのうえ、２９３細胞はＶＬ３０配列を含まないと期待される。生物学的に活性な核細胞が検出されるはずである。実施例８−Ａｄ２／βＧａｌまたはＡｄ２／ＣＦＴＲウイルスが気道上皮細胞に侵入する能力を試験する予備実験ａ．ハムスターでの研究ヒト・アデノウイルスに使用可能であると報告されているシリアンハムスターへのＡｄ−βＧａｌウイルスベクターの気管内点滴注入を用いる最初の研究を行う。１番目の研究、すなわち１回のＡｄ−βＧａｌウイルスベクターの気管内点滴注入に対する肺および全身的炎症応答の経時変化による評価を行った。この研究において、３つの処理群に分配された２４匹の動物（担体対照８匹、低用量ウイルス（粒子１ｘ１０¹¹個；３ｘ１０⁸ｐｆｕ）８匹、および高用量ウイルス（粒子１．７ｘ１０¹²個；５ｘ１０⁹ｐｆｕ）８匹）を用いた。各処理群において、ウイルスベクター点滴注入後４時点（６時間、２４時間、４８時間、および７日）のそれぞれにおいて２匹の動物を分析した。各動物の屠殺時に、肺洗浄物および血液試料を分析用に取った。肺を固定し、通常の光量を用いる組織学分析用に加工した。血液および洗浄液を、全白血球数および白血球の相違について評価した。炎症プロセスのさらなる測定として、さらに洗浄液を全蛋白について評価した。包埋、切片化、ついで、ヘマトキシリン／エオシン染色後、肺切片を、炎症および気道上皮の損傷に関して評価した。小試料サイズであったが、この予備実験から得られたデータは統計学的分析によるものではないが、いくつかの一般的傾向が確認できた。末梢血試料、全白血球数は、明らかな用量−または時間−依存性変化を示さなかった。白血球分別計数において、６時間目における好中球のパーセンテージのわずかな用量依存性増加が見られたが、他の時点のデータは好中球のパーセンテージの上昇を示さなかった。まとめると、これらのデータは、ウイルス投与に対する全身的炎症はほとんどないかまたはないことを示唆するものである。肺洗浄液からは、全好中球数の増加が、はじめの３時点（６時間、２４時間、４８時間）において観察された。７日目までには、動物内変異により、好中球の全数およびパーセンテージはいずれも評価が困難とたったが、用量−または時間 −依存性高かは明らかでなかった。第１に、気道上皮に対するダメージは、いかなる時点あるいはウイルス投与レベルにおいても観察されなかった。第２に、高用量ウイルスを与えた動物において４８時間目に最大となる、時間−および用量 −依存性の穏やかな炎症応答が観察された。７日目までには、炎症応答は完全に解消し、すべての処理群の動物の肺は区別できなかった。まとめると、穏やかで一時的な肺の炎症応答はシリアンハムスターへの上記用量のアデノウイルスの気管内投与に関連しているようであった。２回目の単一の気管内投与によるハムスターでの研究を開始した。この研究は、肺の外側の器官への有効でないウイルスベクターの拡散およびアデノウイルスベクターに対する動物の抗体応答の可能性を評価するために計画された。この研究において、それぞれ３つの処理群（担体対照、低用量ウイルス、高用量ウイルス）は１２匹の動物を含んでいた。動物を、３つの時点（１日、７日、および１カ月）において評価する。この研究において、肺、腸、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、脳および生殖腺をはじめとする多くの器官における感染性ウイルスの存在を評価することにより、ウイルスベクター持続性および可能な拡散を評価する。アデノウイルス抗体力価の変化を、末梢血および肺洗浄物において測定する。さらに、肺洗浄物、末棺血および肺組織を、上記研究と同様にして評価する。ｂ．霊長類での研究組み換えアデノウイルスも霊長類において研究される。これらの研究の目的は、アデノウイルスがインビボにおいて遺伝子を呼吸器上皮に送達する能力を評価し、霊長類における該遺伝子構造物の安全性を評価することである。鼻上皮が下部気道上皮に類似していること、その受容性、および鼻上皮が最初のヒトにおける研究に使用されたことにより、霊長類における最初の研究は、感染部位として鼻上皮を標的とした。ヒトに類似した鼻上皮を有しているため、アカゲザル（Ma cacamulatta）を研究用に選択した。いかにしてＣＦＴＲ発現が鼻上皮の電解質輸送に影響するのかを、嚢胞性線維症の患者において研究することができる。しかし、霊長類は正常なＣＦＴＲ機能を有しているため、レポーター遺伝子を転移する能力を評価した。それゆえ、Ａｄ−βＧａｌウイルスを用いた。アカゲザルの鼻腔の上皮細胞密度は２ｘ１０⁶ 個／ｃｍ（平均鼻上皮細胞直径を７μｍとして）、表面積は２５〜５０ｃｍ²と評価される。かくして、アカゲザルの鼻上皮には約５ｘ１０７個の細胞が存在する。特に安全性に注意して、比較的高用量のウイルス（２０〜２００ＭＯＩ）をインビボにおいて使用した。よって、１０⁹〜１０¹⁰ｐｆｕの範囲の用量を用いた。最初の試行研究において、サルＡの右の鼻孔にＡｄ−βＧａｌ（〜１ｍｌ）を感染させた。このウイルス標品はＣｓＣｌ密度勾配遠心分離により精製され、ついで、１週間後にゲル濾過クロマトグラフィーにより精製された。典型的には、アデノウイルスは、ＣｓＣｌ中、４℃において１ないし２週間安定である。しかしながら、このウイルス標品は欠点が見いだされた（すなわち、２９３許容細胞において検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を産生しなかった）。よって、標品中には生きたウイルス活性は存在しないと結論した。サルＡの鼻上皮における β−ガラクトシダーゼ活性も検出されなかった。それゆえ、次の研究においては、２つの異なるＡｄ−βＧａｌウイルス標品を用いた。ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離で精製され、ついで、Ｔｒｉｓ−緩衝化セイラインに対して透析してＣｓＣｌを除去したものと、粗未精製のものであった。アデノウイルスウイルスの力価はそれそれ〜２ｘ１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌおよび＞１ｘ１０¹³ｐｆｕ／ｍｌであり、両標品とも２９３細胞において検出可能なβ−ガラクトシダーゼを産生した。ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射によりサルを麻酔した。ウイルス投与１週間前に、各サルの鼻粘膜をブラッシングして基準細胞分裂およびβ−ガラクトシダーゼレベルを確立した。血液を抜いて基準となる細胞分裂、血液化学、アデノウイルス抗体力価、およびウイルス増殖の決定を行った。感染前に、各サルを、さらに体重、体温、食欲、および全身的健康度について試験した。各サルにつき１個の鼻腔の上皮全体を使用した。フォーリーカテーテル（fole y catheter）（サイズ１０）を各鼻穴から咽頭中へ挿入し、２〜３ｍｌの空気で膨張させ、ついで、前方に引いて後方の後鼻孔を固く閉塞した。ついで、両方の鼻腔を、りん酸緩衝化セイライン（ＰＢＳ）中０．２Ｕ／ｍｌのノイラミニダーゼ含有５ｍＭジチオスイレイトール溶液で５分間洗浄した。この溶液を用いて上皮に重なっている残存粘膜のすべてを溶解した。（結局、かかる処理は不要であることが判明した）。さらに該洗浄方法により、バルーンが効果的に鼻腔を隔離しているかどうかを調べることができた。ついで、後部のバルーンを膨らませながら、ウイルス（Ａｄ−βＧａｌ）を右の鼻孔にゆっくりと点滴注入した。ウイルス溶液は３０分間鼻粘膜に接触したままであった。３０分経過時に、残存ウイルス溶液を吸引により除去した。バルーンをしぼませ、カテーテルを除去し、サルを麻酔から覚醒させた。サルＡにＣｓＣｌ精製ウイルス（〜１．５ｍｌ）を与え、サルＢに粗ウイルス（〜６ｍｌ）を与えた。（これは、サルＡにとっては２回目の組み換えアデノウイルスに対する曝露であることに注意）。両方のサルは、鼻粘膜の外観、結膜炎、元気さ、食欲、および通便について追跡された。その後、各サルを、１、４、７、１４および２１日目に麻酔して鼻、咽頭および気管細胞試料を下記のごとく得た（綿棒またはブラシいずれかにより）。血液学、ＥＳＲ、一般的スクリーニング、抗体血清学およびウイルス増殖のために同じタイムコースにおいて静脈切開術を行った。毎週便を集めてウイルス増殖を評価した。麻酔したサルから鼻上皮細胞を得るために、５滴のアフリン（Afrin）（０．０５％オキシメタゾリン塩酸，シェリングープロウ（Schering-Plough）および１ｍ１の２％リドカインを５分間鼻粘膜に浸透させた。ついで、サイトブラシ（典型的に幼児用の種類のもの）を用いて粘膜をおだやかに約１０秒間こすった。気管のブラッシング物については、フレキシブル・フィブロプティック・ブロンコスコープ；３ｍｍ細胞学用ブラシ（バード（Bard））をブロンコスコープを通して前進させて気管中に入れ、約１０秒間、小部分をブラッシングした。この方法を２回繰り返し、全部で〜１０⁶個／ｍｌの細胞を得た。ついで、その後の染色にために、細胞をスライドグラス上に集めた（サイトスピンＣ（CytospinC）（ペンシルベニア州のシャンドン（Shandon）社製）を用いて約２ｘ１０⁴個／スライドとした）。ウイルス効率を調べるために、鼻、咽頭、および気管細胞を、Ｘ−ｇａｌ（５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）をい用いてβ−ガラクトシダーゼに関して染色した。β−ガラクトシダーゼによるＸ−ｇａｌの開裂により光学顕微鏡で見ることのできる青色を発色する。Ａｄ−βＧａ１ベクターは、β−ガラクトシダーゼ配列のアミノ末端において、この蛋白の核への発現を指令するための核−局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０大Ｔ−抗原由来）を有していた。かくして、染色後の青い核の数が決定された。さらにＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）を用いてウイルス効率を決定した。このアッセイは、ブラッシングまたは綿棒により得られた細胞中の β−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの存在を示すものである。ＰＣＲプライマーを、アテノウイルス配列およびＬａｃＺ配列の両方に使用してウイルスにより産生されたｍＲＮＡを内在性ｍＲＮＡと区別した。さらにＰＣＲを用いて組み換えアデノウイルスＤＮＡの存在を検出した。サイトスピン標本を用いて、インシチュ（ in situ）でのハイブリダイゼーションを用いて呼吸器上皮細胞中においてウイルスにより産生されたβ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの存在について評価した。この方法は、非常に特異的であり、どの細胞がｍＲＮＡを産生しているのかを評価することができるという長所を有する。鼻粘膜に対する目で見ることのできる検査により、そして、ライト（Wright）染色細胞（サイトプシン）に対する細胞学的試験により、何らかの炎症性応答が存在するかどうかを評価した。好中球およびリンパ球のパーセンテーシを、対照の鼻孔および４匹の対照サルから得た正常値と比較した。白血球数、沈降速度、および発熱により、全身的応答も評価した。各時点でのウイルス複製を、綿棒またはブラシにより得た細胞の上清中の生ウイルスのパーセンテージを調べることにより評価した。各上清（数種の希釈率で）を用いてウイルス感受性２９３細胞系を感染させた。２９３細胞における細胞変性を１週間モニターし、ついで、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼに関して染色した。細胞変性効果および青く染まる細胞は、生ウイルスの存在を示した。さらに、陽性の上清を、非組み込みＤＮＡの分析に付して、寄与しているウイルスを同定（確認）する。２型アデノウイルスおよび組み換えアデノウイルスに対する抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより調べた。血液／血清の分析を、自動化学分析装置ヒタチ（Hitachi ）７３７および自動血液学分析装置テクニコン（Technicon）Ｈ６を用いて行った。血液軟膜を、野生型アデノウイルスについてはＡ５４９細胞中で培養し、２９３許容細胞中で培養した。結果：両方のサルは当該方法に十分耐えた。毎日の試験は、鼻風邪、結膜炎または下痢を示さなかった。両方のサルに関して、鼻粘膜は感染側および対照側双方においておだやかな赤斑が見られ、このことは、器具の使用によるものと解釈された。食欲および体重は、ウイルス投与によっては、いずれのサルにおいても影響を受けなかった。１、４、７、１４および２１日目における身体的試験は、リンパ腺症、頻呼吸または頻脈を示さなかった。２１日目に、サルＢは３９．１℃の体温（アカゲザルの通常体温は３８．８℃）となったが、身体的検査または研究質的データの他の異常はなかった。サルＡは、感染１日目に白血球増加症を示したが、４日目までに正常に戻った。すなわち、感染日のＷＢＣは４９２０、１日目８０７０、４日目５２００。ＥＳＲは感染後変化なかった。電解質およびトランスアミナーゼは期間中正常であった。鼻ブラッシング物由来のライト染色を、４、７、１４および２１日目に行った。それにより、好中球およびリンパ球が５％以下であることがわかった。感染サルと対照との間の相違はなかった。咽頭の綿棒採細胞のＸ−Ｇａｌ染色により、両方のサルにおいて、４、７、および１４日目に、青く染まる細胞が示された。ごく少数の細胞は、明確な色素の核局在化を示し、色素は細胞外残渣において見られた。感染７日後、サルＡの右の鼻孔からのＸ−Ｇａｌ染色物は、核局在化して青く染まる全部で１３５個の繊毛細胞を示した。対照スライドにはわずか４個の青色細胞しかなかった。サルＢは、感染鼻孔からの２個の青色細胞を有し、対照側には青色細胞はなかった。青色細胞は７、１４、または２１日目において見られなかった。感染３日後のＲＴ−ＰＣＲにより、β−Ｇａｌプローブとハイブリダイズする正確なサイズのバンドが示され、これは、サルＡの対照鼻孔およびサルＢの感染鼻孔由来の試料中のβ−ＧａｌｍＲＮＡと矛盾しなかった。７日目に、サルＡの感染鼻孔由来の試料中（青色細胞を示したのと同じ標本）に陽性バンドが存在した。両方のサルの各鼻孔、咽頭および気管からの液体を２９３細胞上に撒いて、細胞変性効果およびＸ−Ｇａｌ染色により生ウイルスの存在をチェックした。サルＡにおいては、感染３日後、両方の鼻孔において生ウイルスが検出されたが、感染後１または２週間後いずれにおいても生ウイルスは検出されなかった。サルＢにおいては、３日目において、両方の鼻孔、咽頭、気管において生ウイルスが検出されたが、感染７日後には、感染させられた鼻孔においてのみ検出された。感染２週間後には、生ウイルスは検出されなかった。ｃ．ヒト・移植物についての研究第２のタイプの実験において、ＣＦ患者の鼻ポリプ由来の上皮細胞を、透過性フィルター支持体上で培養した。これらの細胞は、培養数日後に電気的に強固な単層を形成する。接種８日後に、細胞をＡｄ−βＧａｌに６時間曝露した。３日後、単層を横切る短絡電流（ｌｓｃ）を測定した。ｃＡＭＰアゴニストはｌｓｃを増加させなかった。このことは、クロライド分泌の変化がないことを示すものであった。しかしながら、この欠陥は、組み換えＡｄ２／ＣＦＴＲでの感染後に修正された。組み換えＡｄ２／ＣＦＴＲ（ＭＯＩ＝５；ＭＯＩは感染の多重度をいう；１ＭＯＩは１ｐｆｕ／細胞を示す）に感染した細胞は機能的なＣＦＴＲを発現した。ｃＡＭＰアゴニストはｌｓｃを剌激した。このことは、Ｃｌ^-分泌を示すものである。Ａｄ２／ＣＦＴＲはさらに、ＣＦの気管上皮細胞におけるＣＦクロライドチャンネルの欠陥を修正した。さらなる研究は、Ａｄ２／ＣＦＴＲが、経上皮電気抵抗を変化させずにクロライド分泌の欠陥を修正する能力を有することを示した。この結果は、上皮細胞の完全性および強固な結合は、Ａｄ２／ＣＦＴＲによっては壊されないことを示すものである。１ＭＯＩのＡｄ２／ＣＦＴＲの適用は、ＣＦのクロライド分泌の欠陥を修正するに十分であることがわかった。ヒト・気道上皮細胞の初代培養を用いる実験は、Ａｄ２／ＣＦＴＲウイルスが、ＣＦ気道上皮細胞に侵入し、クロライド輸送の欠陥を修正するに十分なＣＦＴＲを発現することができることを示す。実施例９−コットンラットおよびアカゲザル・上皮へのインビボ送達およびＣＦＴＲ発現材料および方法アデノウイルスベクターＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を実施例７記載のごとく調製する。該ＤＮＡ構築物は、初期領域１遺伝子（ヌクレオチド５４６ないし３４９７）がＣＦＴＲ（さらに５３個のリンカーヌクレオチドを伴う公表ＣＦＴＲ配列のヌクレオチド１２３ないし４６２２）に対するｃＤＮＡにより置換されている約３７．５ｋｂのＡｄ２ゲノムコピー全長からなる。終結／ポリアデニル化は、Ｅｌｂおよび蛋白ＩＸ転写物により通常用いられる部位において起こる。組み換えウイルスＥ３領域が保存されていた。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１ベクターのサイズは、野生型アデノウイルスのサイズの約１０４．５％である。Ｅ１初期ウイルスプロモーターを相補する２９３細胞中で、組み換えウイルスを増殖させた。細胞を３回凍結融解してウイルスを遊離させ、その標品をＣｓＣｌ勾配で精製し、ついで、上記のごとくＴｒｉｓ−緩衝化セイライン（ＴＢＳ）に対して透析してＣｓＣｌを除去した。動物ラット．２０匹のコットンラット（cotton rat）（６〜８週齢、体重８０〜１００ｇ）をこの研究に使用した。メトキシフラン（イリノイ州マンデレンのピットマン・ムーア・インク（Pitman Moore，Inc.）製）吸入によりラットを麻酔した。呼吸中に鼻に点滴注入することによりウイルスを適用した。コットンラットについて２つの研究を行った。最初の研究において、７匹のラットを、４．１ｘ１０⁹プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＡｄ２／ＣＦＴＲ−１ウイルスを含む１００μ１の溶液で同時に肺に感染させ、３匹のラットを対照とした。１匹の対照ラットおよび２ないし３匹の実験ラットをメトキシフラン麻酔して屠殺し、３つの時点それぞれにおいて（感染後４、１１または１５日目）研究を行った。２番目の群のラットを用いて組み換えウイルスの繰り返し投与の効果を試験した。０日目に、１２匹すべてのラットに２．１ｘ１０⁸ｐｆｕのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１ウイルスを与え、１４日後に、９匹に３．２ｘ１０⁸ｐｆｕの２回目のＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を与えた。対照ラット１匹および実験ラット３匹を、２回目のウイルス投与３、７、または１４日後に屠殺した。剖検の前に、気管にカニューレを挿入し、３ｍｌのりん酸緩衝化セイラインで気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。中央の胸骨切開を行い、血液採取のために右心室にカニューレを挿入した。右の肺および気管を４％ホルムアミド中で固定し、左肺を液体窒素中で凍結し、免疫化学、逆転写酵素によるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびウイルス増殖用に−７０℃に保った。他の器官を除去し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用に素早く液体窒素中で凍結した。サル．３匹のメスのアカゲザルをこの研究に使用した。４匹目のメスのサルを同じ部屋に置いて対照として用いた。ウイルス適用のため、ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）筋肉内注射によりサルを麻酔した。各サルの片方の鼻孔の全上皮をウイルス適用に使用した。フォーリーカテーテル（foley catheter）（サイズ１０）を各鼻孔から咽頭内へ挿入し、２〜３ｍｌの空気で膨張させ、ついで、前方に引いて後鼻孔において固い後側咬合を得た。ついで、後部のバルーンを膨らませながら、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１ウイルスを右の鼻孔にゆっくりと点滴注入した。ウイルス溶液は３０分間鼻粘膜に接触したままであった。バルーンをしぼませ、カテーテルを除去し、サルを麻酔から覚醒させた。ＴＢＳ溶液を対照として点滴注入する以外は同様の方法を左の鼻孔について行った。サルは、５カ月間にわたり、３回ウイルス投与された。全用量は、１回目に２．５ｘ１０⁹ｐｆｕ、２回目に２．３ｘ１０⁹ｐｆｕ、そして３回目に２．８ｘ１０⁹ｐｆｕとした。鼻上皮細胞密度は２ｘ１０⁶個／ｃｍ²、表面積２５ないし５０ｃｍ²と評価された。これは、感染の多重度（ＭＯＩ）約２５に相当する。１回目のウイルス投与１週間前、投与日、感染後１、３、６、１３、２１、２７および４２日目に動物を評価した。２回目のウイルス投与を５５日目に行った。５５日目、ついで、５６、５９、６２、６９、７６、８３、８９、９６、１０３、および１１１日目に評価した。３回目の投与については、１３４日目に行い、左の鼻孔のみにカニューレを挿入し、ウイルスに曝露した。対照のサルには、ウイルスのかわりにＰＢＳを点滴注入した。１３５日目に、感染したサルの１匹について左の内側の鼻介骨の生検を行い、１３８日目に２匹目のサル、１４２日目に３匹目のサルおよび対照のサルについて生検を行った。評価のために、ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）筋肉内注射によりサルを麻酔した。鼻上皮細胞を得るために、５滴のアフリン（Afrin）（０．０５％オキシメタゾリン塩酸，シェリング−プロウ（Schering-Plough）および１ｍｌの２％リドカインを５分間鼻粘膜に浸透させた。ついで、サイトブラシを用いて粘膜をおだやかに約３秒間こすった。咽頭上皮試料を得るために、咽頭後部を約２〜３回綿棒でこすった。得られた細胞を、ブラシまたは綿棒から２ｍｌの滅菌ＰＢＳ中へ移した。直接内視鏡でコントロールしながら、吸い玉付き鉗子を用いて内側の鼻介骨の生検を行った。身体的徴候の異常行動の証拠について、動物を評価した。餌および液体の摂取の記録を用いて食欲および全身的健康度のチェックを行った。それぞれの評価時点において、直腸温度、呼吸数、および心拍数を測定した。鼻粘膜、結膜、および咽頭を視覚的に検査した。リンパ腺症について、サルをさらに検査した。サルからの静脈血を、標準的な静脈穿孔により集めた。アイオワ大学病院（Un iversity of Iowa Hospital and Clinics）でヒタチ７３７自動化学分析装置およびテクニコンＨ６自動血液学分析装置を用いて、血液／血清の分析を行った。血清学血清を得、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により抗アテノウイルス抗体力価を測定した。ＥＬＩＳＡ用に、０．１ＭＮａＨＣＯ₃中の充填アデノウイルス（カリフォルニア州サンジェゴのリー・バイオモレキュラー・リサーチ・ラボラトリーズ（Lee Biomolecular Research Laboratories）製）（５０ｎｇ／ウェル）を、９６ウェルプレート上に、４℃で一晩コーティングした。適当に希釈した試験試料（１／５０希釈から開始）を添加した。試料を１時間インキュベーションし、プレートを洗浄し、ついで、ヤギ・抗ヒトＩｇＧＨＲＰ結合物（ペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソン・イミュノリサーチ・ラボラトリーズ（Jackson ImmunoReaearch Laboratories）製）を添加し、１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社製）を３０分間添加した。４．５ＭＨ₂ＳＯ₄で反応停止し、モレキュラー・ディバイス（Molecular De vice）社製のマイクロプレートリーダーで４９０ｎｍにおいて読み取った。はじめの希釈率の逆数と最後のウェル（ＯＤ＞０．１００）の希釈率の逆数から力価を計算した。中和抗体により、サル・血清がアデノウイルスウイルスによる２９３細胞の感染を防止する能力を測定した。サル・血清（１：２５希釈）［あるいは鼻洗浄物（１：２希釈）］を２倍系列希釈して９６ウェルプレートに添加した。アデノウイルス（２．５ｘ１０⁵ｐｆｕ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。ついで、２９３細胞をすべてのウェルに添加し、無血清対照ウェルが＞９５％の細胞変性効果を示すまでインキュベーションした。はじめの希釈率の逆数と最後のウェル（９５％の細胞変性効果を示す）の希釈率の逆数から力価を計算した。細胞学的研究用の気管支肺胞洗浄物および鼻ブラッシング物シラスティックカテーテル（silastic catheter）で気管にカニューレを挿入し、５ｍｌのＰＢＳを注入することにより、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ゆるやかな吸引を行って液体を回収した。ＢＡＬ試料を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を、１０⁶個／ｍｌの濃度となるように２９３培地に再懸濁液した。サイトブラシでゆるやかに約３秒間サルの鼻粘膜をこすることにより、サルの鼻上皮から細胞を集めた。得られた細胞をブラシから２ｍｌのＰｂｓ中に移した。細胞懸濁液４０マイクロリットルをスライド上に遠心沈降し、ライト染色を行った。光学顕微鏡により試料を調べた。肺切片および鼻生検物の組織学各コットンラットの右肺を除去し、４％ホルムアミドで膨張させ、切片化用にパラフィン中に埋め込んだ。サルの鼻生検物も、４％ホルムアミドで固定した。組織学的切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。少なくとも１人の研究員により、そして各ラットが受けた処理を知らない病理学者により、切片が再検査された。免疫細胞化学コットンラットの肺および気管の小片と、鼻生検をを、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド上で液体窒素中で凍結した。標本の冷凍切片およびパラフィン切片を、免疫蛍光顕微鏡用に使用した。鼻ブラッシング物のサイトプシンスライドを、ゼラチンコートしたスライド上に調製し、パラホルムアルデヒドで固定した。トリトンＸ−１００（TritonX-100）で組織を透過性にし、ついで、ＣＦＴＲに対するモノクローナル抗体（Ｍ１３−１、Ｍ１３−４）（デニング，ジー・エム（Dennin g，J.M.）ら，（１９９２年）ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲーション（J.Clin.Invest.）第８９巻：３３９〜３４９頁）を添加し、１２時間インキュベーションした。１次抗体を除去し、抗マウスビオチン化抗体（カリフォルニア州フォスターシティーのバイオメダ（Biomeda）社製）を添加した。２次抗体を除去した後、ストレプトアビジンＦＩＴＣ（カリフォルニア州フォスターシティーのバイオメダ社製）を添加し、レーザースキャンニング共焦顕微鏡下でスライドを観察した。対照動物試料および非−免疫性ＩｇＧ染色試料の双方を対照として用いた。ＰＣＲコットンラットの小腸、脳、心臓、腎臓、肝臓、卵巣および脾臓の小片について、ＰＣＲを行った。約１ｇのラットの器官を機械的にすりつぶし、滅菌水５０ μｌと混合し、５分間煮沸し、遠心分離した。上清のうち５μｌを取りさらに分析した。サル・鼻ブラッシング物懸濁液もＰＣＲに使用した。アデノウイルス配列中の各セット由来の一方のプライマーおよびＣＦＴＲ配列中の他方のプライマーを配置することにより内在性ＣＦＴＲを包含するＡｄ２／ＣＦＴＲ−１ＤＮＡを選択的に増幅するために、ネスティッドＰＣＲプライマーを設計した。最初のプライマーセットは７２３ｂｐを増幅し、該セットを以下に示す：Ａｄ２５’ＡＣＴＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧ３’（配列番号：４）ＣＦＴＲ５’ＧＣＡＡＡＧＧＡＧＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＡＡＡＴＧＴＧＣＣ３’（配列番号：５）ネスティッドプライマーセットは５０６ｂｐフラグメントを増幅する。該セットを以下に示す：Ａｄ２５’ＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣＣＧＡＧＣＴＡＧ３’（配列番号：６）ＣＦＴＲ５’ＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣ３’（配列番号：７）１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．００１％（ｗ／ｖ）セラチン、４００μｌ各ｄＮＴＰ、０．６ μｌ各プライマー（最初のセット）、およびＡｍｐｌｉＴａｑ（パーキンン・エルマー（Perkin Elmer）社製）２．５ユニットを含有する反応混合物を、別々の試験管に入れた。ついで、各試料標品のうち５μｌを添加し、混合物に５０μｌの軽鉱油を重層した。９４℃１分、６５℃１分、ついて、７２℃２分からなる４０サイクルを行うようプログラムされたバルンステッド／サーモライン（デュブク，ＩＡ）サーマル・サイクラー（Barnstead/Thermolyte(Dubuque,IA)thermal cycl er）で試料を処理した。５μｌを取り、プライマーのネスティッドセットを用い、上記のごとくサイクルさせる第２のＰＣＲ反応系に添加した。最終増幅反応物のうち１０μｌを１％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムで可視化した。この方法の感度を調べるために、対照ラットの肝臓上清を含有するＰＣＲ混合物の一部を何本かの試験管に入れ、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１希釈物を添加した。上記増幅プロトコールを行った後、ネスティッドＰＣＲ法は、５０ｐｆｕ程度のウイルスＤＮＡを検出できることがわかった。ＲＴ−ＰＣＲコットンラット肺組織およびサルの鼻ブラッシング物由来の試料中のベクターにより生じたｍＲＮＡを検出するためにＲＴ−ＰＣＲを用いた。イソチオシアン酸グアニジン溶液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％サルコシル、および０．１Ｍ β−メルカプトエタノール）のうち２００μｌを、各肺および鼻ブラッシング物ペレットの凍結切片に添加し、組織を機械的に破壊した。１段階法（コムジンスキ，ピー（Chomcz ynski，P.）およびサッチ，エヌ（Sacchi，N.）ら（１９８７年）アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）第１６２巻：１５６〜１５９頁；ハンソン，シー・エイ（Hanson，C.A.）ら（１９９０年）アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Am.J.Pathol.）第１３７巻：１〜６頁）を用いて全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを、１ユニットのＲＱ１ＲＮase不含ＤＮase（ウィスコンシン州マジソンのプロメガ・コーポレイテッド（Promaga Corp.）社製）とともに３７℃で２０分間インキュベーションし、９９℃で５分間変性させ、酢酸アンモニウムおよびエタノールで沈殿させ、２０ユニットのＲＮａｓｅブロック１（カリフォルニア州ラジョラのストラタジーン（Stratagene）社製）を含有するシエチルピロカルボナート処理水４μｌ中に溶解した。精製ＤＮＡのうち２ｕｌを、ＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲキット（パーキン・エルマー・シータス社製）および上の部分で述べた最初のプライマーセットからの下流プライマーを用いて逆転写した。上記ネスティッドプライマーセットおよびＰＣＲプロトコールを用いて標品（＋／−ＲＴいずれも）が後ほど増幅される、対照としての精製ＲＮＡ標品の残りの２μｌとの反応から逆転写酵素を除いた。最終増幅反応物のうち１０μｌを１％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムで可視化した。サザン分析ＰＣＲ精製物の同一性を証明するために、サザン分析を行った。記載されたように（サムブルック（Sambrook）ら、上記）、ナイロン膜にＤＮＡを移した。オリゴラベリングキット（ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア（Ph armacia）社製）を用いて、ＣＦＴＲｃＤＮＡフラグメント（アミノ酸＃１〜５２５）を［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ（カルフォルニア州アービンのＩＣＮバイオケミカルズ，インク（ICN Biochemicals，Inc.）社製）で標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するためにＮＩＣＫカラム（ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア社製）で精製した。標識プローブを変性させ、冷却し、ついで、プレハイブリダイズしたフィルターと４２℃で１０分間ハイブリダイズさせた。ついで、ハイブリダイズしたフィルターをフィルム（コダック（Koda k）ＸＡＲ−５）に１０分間曝露した。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１の培養２９３細胞系でウイルス培養を行った。肺組織由来のウイルスの培養については、１ｇの肺を３〜６回凍結／融解し、ついて、２００μｌの２９３培地中で機械的に破壊した。ＢＡＬおよびサル・鼻ブラッシング物の培養については、細胞懸濁液を５分間遠心分離し、上清を集めた。９６ウェル中で５０％集密で増殖した２系の２９３細胞に上清５０μｌを添加した。２９３細胞を３７℃で７２時間インキュベーションし、ついで、等量のメタノールおよびアセトンで１０分間固定し、ＦＩＴＣ標識抗アデノウイルスモノクローナル抗体（カルフォルニア州テメクラのケミコン・ライト・ダイアグノスティクス（Chemicon，Light Diagnost ics）社製）とともに３０分間インキュベーションした。陽性の核免疫蛍光は、陽性の培養であると解釈された。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１希釈物を対照ラットのうち１匹からの肺磨砕物５０μｌに添加することによりアッセイの感度を評価した。１ｐｆｕ程度を添加した場合にウイルス複製が検出された。結果コットンラットの肺におけるＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の効果Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１がＣＦＴＲｃＤＮＡを肺内部の気道上皮に転移させる能力を試験するために、いくつかの研究を行った。１００μｌ中の４ｘ１０ｐｆｕ−ＩＵのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を７匹のコットンラットに与えた。３匹の対照ラットには１００μｌのＴＢＳ（ウイルス用担体）を与えた。４、１０または１４日後にラットを屠殺した。ＣＦＴＲをコードしているウイルス転写物を検出するために、逆転写酵素を用いて肺磨砕物からｃＤＮＡを調製した。アデノウイルスおよびＣＦＴＲにコードされている配列にまたがるプライマーを用いるＰＣＲでｃＤＮＡを増幅した。かくして、該方法によっては内在性ラット・ＣＦＴＲは検出されなかった。図１６は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１を与えられた動物の肺が、ウイルスによりコードされたＣＦＴＲｍＲＮＡに関して陽性であったことを示す。蛋白を検出するために、肺切片をＣＦＴＲ特異的抗体で免疫染色した。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１に曝露したすべてのラットの気管支上皮先端膜においてＣＦＴＲが検出されたが、対照ラットからは検出されなかった。先端膜における組み換えＣＦＴＲの局在化は、ヒト・気道上皮における内在性ＣＦＴＲの局在化と矛盾しない。気道上皮におけるＣＦＴＲの内在性レベルは非常に低く、免疫細胞化学によっては検出が困難（トラプネル，ビー（Trapnall，B.）ら（１９９１年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８８巻：６５６５〜６５６９頁；デニング，ジー・エムら（１９９２年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第１１８巻：５５１〜５５９頁）であるため、バックグラウンドレベル以上の組み換えＣＦＴＲが検出された。これらの結果は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１が、コットンラットの肺におけるＣＦＴＲｍＲＮＡおよび肺内部気道におけるＣＦＴＲ蛋白の発現を指令することを示すものである。コットンラットにおけるＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の安全性Ａｄ２のＥ１領域はＡｄ２／ＣＦＴＲ−１ウイルスにおいて欠失しているので、ベクターは複製減損しており（バークナー，ケイ・エル（Berkner，K.L.）（１９８８年）バイオテクニークス（BioTechniques）第６巻：６１６〜６２９頁）、宿主細胞の蛋白合成を遮断できない（バスス，エル・イー（Bassus，L.E.）ら（１９８９年）ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）第５０巻：２０２〜２１２頁）と考えられる。以前のインビトロでの研究は、このことは、ヒト・気道上皮細胞の初代培養を含む種々の細胞の場合にあてはまることを示唆するものである（リッチ，ディー・ピー（Rich，D.P.）ら（１９９３年）ヒューマン・ジーン・セラピー（Human Gene Therapy）第４巻：４６１〜４７６頁）。しかしながら、このことを、コットンラットにおいてインビボで確認することは重要である。コットンラットは、ヒトのアデノウイルス感染に関する最も許容できる動物モデルである（ギンスバーグ，エイチ・エス（Ginsberg，H.S.）ら（１９８９年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８６巻：３８２３〜３８２７頁；プリンス，ジー・エイ（Pr ince，G.A.）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・ウイロロジー第６７巻：１０１〜１１１頁）。ｋｇあたり４．１ｘ１０¹⁰ｐｆｕのウイルス用量を用いた場合でさえ、ラットは死亡しなかった。より重要なことに、各コットンラットの肺磨砕物抽出物を２９３許容細胞系において培養した。このアッセイで、１ｐｆｕの組み換えウイルスが肺磨砕物中に検出された。しかしながら、処理動物の肺における培養によってはウイルスは検出されなかった。よって、ウイルスは、インビボにおいて複製しないと思われた。ウイルスの直接的効果により、またはウイルス粒子の投与の結果として、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与が炎症応答を引き起こすこともありうる。ラットは、全および分別白血球数の変化を有しなかった。このことは、大きな全身的炎症応答がなかったことを示す。肺の炎症応答を、より直接的に評価するために、各ラットにつき気管支肺胞洗浄を行った（図１７Ａおよび１７Ｂ）。図１７Ａは、洗浄物から回収された全細胞数または分別細胞数においては変化がなかったことを示す。Ｈ＆Ｅにより染色された肺切片も調製した。ウイルスが含まれていること、またはアデノウイルス感染の特徴である他の変化に関する証拠は見られなかった（プリンス，ジー・エイら（１９９３年）ジャーナル・オブ・ウイロロジー第６７巻：１０１〜１１１頁）。どの切片が処理されているかを知らない熟練者がコード化された肺切片を読む場合、処理および未処理の肺を区別することはできないであろう。組み換えアデノウイルスが肺から脱出して他の組織中に入ることは可能であると思われる。この可能性を試験するため、ウイルスＤＮＡを検出するためのネスティッドＰＣＲを用いてラットの他の器官を評価した。７匹中３匹の小腸が陽性であったこと以外は、感染ラットの試験されたすべての器官は陰性であった。図１８は、感染後４日目に屠殺された２匹の感染ラットおよび１匹の対照ラットの結果を示す。屠殺された感染ラットの器官磨砕物は、小腸を除いて、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１に関して陰性であった。感染後４日目に屠殺された対照ラットの器官磨砕物は陰性であった。小腸におけるウイルスＤＮＡの存在は、ラットが点滴注入の際にいくらかのウイルスを飲み込んだ可能性があるか、または正常な気道クリアランス機構によりウイルスＤＮＡが胃腸消化管にたまった可能性があることを示す。小腸磨砕物中のウイルスＤＮＡの存在にかかわらず、ラットは下痢を示さなかった。この結果は、ウイルスが小腸上皮においてＣＦＴＲを発現したとしても、明らかに悪い結果は生じないことを示すものである。コットンラットに対するＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の繰り返し投与染色体ＤＮＡ中へのアデノウイルスＤＮＡ組み込みは、遺伝子発現に必須ではなく、非常に低頻度でしか起こらないので、与えられた処理後の発現は限定されたものであり、ＣＦ気道疾患の治療には組み換えアデノウイルスの繰り返し投与が必要である。それゆえ、コットンラットに対する繰り返しＡｄ２／ＣＦＴＲ− １投与の効果について調べた。１２匹のコットンラットに５０μｌのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を与えた。２週間後、９匹のラットに２回目の５０μｌのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を与え、３匹のラットに５０μｌのＴＢＳを与えた。ウイルス投与３、７、または１４日目にラットを屠殺した。２回目のベクター投与の時以降、すべてのラットはアデノウイルスに対する抗体力価を増加させた。２回目の肺内ウイルス投与後、ラットは死亡しなかった。そのうえ、安全性および有効性を評価する研究結果は、１回目のアデノウイルス投与を受けた動物において得られた結果と同様であった。２９３細胞での肺磨砕物のウイルス増殖はすべての時点において陰性であった。このことは、ウイルス複製が起こらなかったことを示すものである。いかなる時点においても、全または分別白血球数における、処理および対照ラット間の相違はなかった。Ｈ＆Ｅで染色した組織学的切片により肺を評価し、我々または処理を知らない熟練者により切片が観察された場合、対照および処理ラット間の観察しうる相違は見られなかった。いくつかの切片の例を図１９に示す。ＰＣＲを用いて器官をウイルスＤＮＡについて調べた場合、ウイルスＤＮＡは、２匹の小腸においてのみ見いだされた。２回目の投与時においてラットが血清反応陽性であるにもかかわらず、単一回の投与を受けた動物において見られるのと同様のＣＦＴＲ発現（ＲＴ−ＰＣＲおよびＣＦＴＲ抗体で染色した切片の免疫細胞化学により評価）が観察された。これらの結果は、先のＡｄ２／ＣＦＴＲ−１投与および抗体応答の発生は、ラットにおいて炎症応答を引き起こさず、ウイルス依存性ＣＦＴＲ産生を妨害しなかったことを示すものである。霊長類の気道上皮においてＡｄ２／ＣＦＴＲ−１がＣＦＴＲを発現することの証拠霊長類の呼吸器気道に並んでいる細胞および免疫系の細胞は、ヒトのものと類似である。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１がＣＦＴＲを霊長類の呼吸器上皮に転移する能力を試験するために、３匹のアカゲザルの鼻上皮に関して記載した３つの場合にＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を適用した。呼吸器上皮細胞を得るために、気管支ファイバースコープを使用してヒトの気道上皮を試料化するのに用いるのと同様の方法を用いて上皮をブラッシングした。遺伝子転移を評価するために、コットンラットに関して上記のごとく記載したＲＴ−ＰＣＲを使用した。３匹すべてのサルの右鼻孔からブラッシングした細胞に対してはＲＴ−ＰＣＲは陽性であったが、それは、ウイルス投与１８日後にのみ検出可能であった。結果の一例を図２０Ａに示す。左鼻孔からの細胞における陽性の反応の存在は、排液による左鼻孔へのいくらかのウイルスの移動による可能性が最も高く、あるいは麻酔から覚めたサルが指でウイルスを一方の鼻孔から他方の鼻孔に移動させた可能性もある。ＲＴ−ＰＣＲの特異性を図２０Ｂに示す。ＣＦＴＲに対するプローブでのサザンブロットは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１に感染したサル由来のＲＴ−ＰＣＲ生成物とハイブリダイズした。対照として、１匹のサルに、β−ガラクトシダーゼをコードしている別のウイルス（Ａｄ２／βＧａｌ１）を与えた。異なるプライマーを用いてβ−ガラクトシダーゼを逆転写し、そのｃＤＮＡを増幅し、適当なＰＣＲ生成物を検出した。しかしながら、ＰＣＲ生成物は、サザンブロットにおいてＣＦＴＲプローブとハイブリダイズしなかった。この結果は、アデノウイルスにより指令されるＣＦＴＲ転写物の増幅に対する反応特異性を示すものである。１８日目またはそれ以降においてアデノウイルスによりコードされたＣＦＴＲｍＲＮＡの存在証拠を検出することの失敗は、逆転写酵素の限られた効率のため、あるいは細胞取得後にＲＮＡａｓｅがＲＮＡを分解したかもしれないために、ＲＴ−ＰＣＲの感度が低い可能性がある。しかしながら、ウイルスＤＮＡは、ウイルス適用後７０日目の鼻上皮からのブラッシング物におけるＰＣＲによっては検出されなかった。この結果は、２週間後にはｍＲＮＡは検出されなかったが、ウイルスＤＮＡは長期間存在し、転写的に活性を有していたことを示すものである。ＣＦＴＲ蛋白の存在を直接評価するために、ブラッシングにより得られた細胞を、サイトスピンによりスライドグラス上に薄く乗せ、ＣＦＴＲに対する抗体で染色した。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１に暴露した細胞において陽性反応が明確であった。試料のことを知らない観察者により評価された場合、該細胞は、免疫細胞化学により陽性であるとスコアされた。免疫細胞化学は、３匹のサルにおいて５ないし６週間陽性であり、２回目のＡｄ２／ＣＦＴＲ−１投与後でさえも陽性であった。時折、少量の陽性染色細胞が、サルの反対側の鼻孔から観察された。しかしながら、これは短期間であり、長くとも１週間続いただけであった。３回目の感染後１週間以内に得られた鼻介骨生検切片も調べた。対照のサルの切片においては、表面上皮由来の免疫蛍光が観察されたとしてもごくわずかであったが、粘膜下腺は有意なＣＦＴＲ染色を示した（図２２）。これらの観察結果は、以前の研究結果（エンゲルハルト，ジェイ・エフ（Engelhardt，J.F.）およびウィルソン，ジェイ・エム（Wilson，J.M.）（１９９２年）ネイチャー・ジェネ（Nature Gene）第２巻：２４０〜２４８頁）と矛盾しない。対照的に、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１を与えられたサルからの切片は、表面上皮の先端膜における免疫蛍光の増加を示した。粘膜下腺は、対照条件下で観察されたものよりも大きな免疫染色性を示さなかったようである。これらの結果は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１は、血清反応陽性動物においてさえも、ＣＦＴＲｃＤＮＡをアカゲザルの気道上皮に転移させることができることを示すものである（下記参照）。サルに投与されたＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の安全性図２３は、処理された３匹すべてのサルがアテノウイルスに対する抗体を発生させたことを示す。ＥＬＩＳＡにより測定される抗体力価は、最初の感染ごく１週間以内に上昇した。続いての感染では、力価は数日以内に上昇した。見張りのサルは実験期間中低い力価を有していた。中和抗体の存在に関する試験も行った。最初の投与後は、中和抗体は観察されなかったが、２回目の投与後および３回目のウイルス投与の間に検出された（図２３）。ウイルスを検出するために、鼻ブラッシング物および綿棒かきとり物から得た上清を２９３細胞上で培養した。すべてのサルは、鼻腔感染後１および２または４にちめにおいて陽性の増殖を示した。培養物は、１匹のサルにおいては投与ご７日目まで陽性のままであったが、７日目以降は、培養物は陽性でなかった。感染後最初の４日間は、反対側の鼻孔からの綿棒かきとり物中に、時折、生ウイルスが検出された。検出可能なウイルスの急激な減少は、ウイルス複製が起こらなかったことを示す。大便を常に培養したが、どのサルの大便にもウイルスは検出されなかった。サルは、ウイルス感染または炎症の臨床的徴候を表さなかった。鼻上皮に対するウイルス検査により、感染初日に、わずかな紅斑がすべてのサルの両鼻孔において示された。しかし、同様の紅斑が対照のサルにも見られ、器具の使用により生じたようであった。感染後３または４日目、あるいは毎週の検査において、目に見える異常はなかった。いかなる時点においても、身体的試験は、発熱、リンパ節症、結膜炎、頻呼吸、頻脈を示さなかった。完全血カウントあるいは沈降速度において異常は見られず、血清電解質、電気伝導度、または血液、尿の窒素およびクレアチニンにおいても異常は見られなかった。鼻ブラッシング物由来のライト染色細胞に対する試験により、３匹すべてのサルにおいて、好中球およびリンパ球数が、全細胞の５％未満であることが示された。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与は、ウイルス投与後のいかなる時点においても炎症細胞の分配または数の変化を引き起こさなかった。標本が独立した病理学者により検査された場合、対照のサルの鼻介骨標本のＨ＆Ｅ染色は、実験されたサルのものと区別できなかった（図２４）。これらの結果は、繰り返し投与中のコットンラットおよびサルの気道上皮においてＣＦＴＲｃＤＮＡを発現する、ＣＦＴＲをコードしている組み換えアテノウイルス（Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１）の能力を示すものである。これらの結果はさらに、ウィルスの適用は、あったとしても危険はわずかであることを示すものである。よって、これらの結果は、かかるベクターが、嚢胞性線維のヒトの気道上皮におけるＣＦＴＲの発現に価値があることを示すものである。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１が、コットンラットおよび霊長類の気道上皮においてＣＦＴＲを発現することを示すために、２つの方法を用いた。すなわち、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＣＦＴＲｍＲＮＡを検出し、免疫細胞化学により蛋白を検出した。免疫細胞化学的に評価された発現の遅延は５ないし６週間であった。ごくわずかの蛋白がＣｌ^-分泌を起こすのに必要であるので（ウェルシュ，エム・ジェイ（１９８７年）フィジオロ・レビュ（Physiol.Rev.）第６７巻：１１４３〜１１８４頁；トラプネル，ビー・シーら（１９９１年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８８巻：６５６５〜６５６９頁；デニング，ジー・エムら（１９９２年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第１１８巻：５５１〜５５９頁）、ＣＦＴＲが免疫細胞化学により検出される期間よりもＣＦＴＲの機能的発現が実質的に長く継続する可能性がある。この確証に対する支持は、２つの考え方に由来する。第１は、気道上皮において、ＣＦＴＲを免疫細胞化学的に検出することは非常に困難であるが、ＣＦＴＲのＣｌ^-チャンネルの存在により先端膜のＣｌ^-透過性の発現が容易に検出されるということである。最少量のＣＦＴＲが重要な機能的効果を有する能力は、単一のイオンチャンネルが非常に多数のイオン（１０⁶〜１０⁷個／秒）を伝達するという事実の結果であろう。よって、イオンチャンネルは、上皮中の豊富な蛋白ではない。第２は、以前の研究は、わずか６〜１０％の細胞が気道上皮において野生型ＣＦＴＲを過剰産生した場合であっても、ＣＦの欠陥ある電解質輸送が修正されうるということである（ジョンソン，エル・ジー（Johnson，L.G.）ら（１９９２年）ネイチャー・ジェネ第２巻：２１〜２５頁）。よって、わずかのパーセントの細胞がＣＦＴＲを発現した場合に、ＣＦ患者における生物学的欠陥の修正が可能である。このことは、比較的感染の多重度が低いＡｄ２／ＣＦＴＲ−１が、ＣＦの上皮においてｃＡＭＰにより刺激されるＣｌ^-分泌応答を発生させるということを示す我々のインビトロでの研究と矛盾しない（リッチ，ディー・ピーら（１９９３年）ヒューマン・ジーン・セラピー第４巻：４６１〜４７６頁）。さらにこの研究は、気道上皮への遺伝子転移に関するアデノウイルスの安全性についての最初のわかりやすいデータを提供する。研究のいくつかの局面は我々を勇気づける。ウイルス複製の証拠がないというよりはむしろ、感染性ウイルス粒子がコットンラットおよび霊長類からすみやかに除去されたのである。これらのデータは、われわれの以前のインビボにおける研究とともに、ヒトにおける組み換えウイルスの複製は問題とならないであろうということを示唆するものである。データは、コットンラットおよびサル両方において、ウイルスが抗体応答を生じさせたことを示す。このことにもかかわらず、全身的または局所的炎症応答に対する証拠は観察されなかった。気管支肺胞洗浄およびブラッシングならびに綿棒でのかきとりにより得られた細胞は、ウイルス適用により変化しななかった。そのうえ、アデノウイルスで処理した上皮の組織は、対照上皮の組織と区別できなかった。これらのデータは、上皮のアデノウイルスに対する少なくとも３回の連続した曝露は有害な炎症応答を引き起こさなかったことを示唆する。これらのデータは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１が効果的にＣＦＴＲｃＤＮＡを気道上皮に転移させ、ＣＦＴＲの発現を指令しうることを示唆する。これらのデータは、転移は動物内において比較的安全であることを示唆する。よって、これらのデータは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１がＣＦでの患者の治療にための良いベクターでありうることを示唆する。このことを以下の実施例において確認した。実施例１０−ヒトＣＦ対象由来の鼻上皮におけるＣＦＴＲ遺伝子治療実験方法アデノウイルスベクター組み換えアデノウイルスＡｄ２／ＣＦＴＲ−１をＣＦＴＲｃＤＮＡの送達に使用した。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１の構築および調製、およびその動物におけるインビトロならびにインビボでの使用は、すでに記載されている（リッチ，ディー・ピー（Rich，D.P.）ら（１９９３年）ヒューマン・ジーン・セラピー（Human Gene Therapy）第４巻：４５１〜４７６ページ，ザブナー，ジェイ（Zabner，J. ）ら（１９９３年）ネイチャー・ジェネ（Nature Gen.）（印刷中））。該ＤＮＡ構築物は、初期領域１遺伝子（ヌクレオチト５４６７〜３４９７）がＣＦＴＲに対するｃＤＮＡにより置換されているＡｄ２ゲノムの全長にわたるコピーからなる。ウイルスのＥ１ａプロモーターをＣＦＴＲｃＤＮＡ用に使用した。これは弱ないし中程度の強度のプロモーターである。終結／ポリアデニル化はＥ１ｂおよび蛋白IX転写物により通常用いられる部位において起こる。患者３人のＣＦ患者について研究した。ＩＧラブズ（IG Labs）（マサチューセッツ州フラミンガム）により遺伝子型が決定された。３人すべての患者は、ＮＩＨスコア＞７０（タウシッヒ，エル・エム（Taussig，L.M.）ら（１９７３年）ジャーナル・オブ・ペディアトリ（J.Pediatr.）第８２巻：３８０〜３９０頁）により決定される軽度のＣＦ、高率の正常体重、予想値の５０％以上の１秒間の強制呼吸体積（forced expiratory volume in one second）（ＦＥＶ１）、および７２以上の動脈ＰＯ₂を有していた。すべての患者は２つのタイプのアテノウイルスに対して血清陽性であり、最近ウイルス疾患にかかっていなかった。鼻腔の綿棒かきとり物、咽頭の綿棒かきとり物、痰、尿、便および血液の白血球の前処理培養はアデノウイルスに関して陰性であった。アデノウイルスＥ１領域に対するプライマーを用いた前処理した鼻ブラッシング物のＰＣＲは陰性であった。患者を、少なくとも２回、ＦＥＶ１、鼻粘膜の細胞学的試験、視覚的検査、および治療前のＶｔの測定により評価した。治療に先立ち、副鼻洞の冠側のコンピューター断層撮影および胸部Ｘ線を得た。１人目の患者は、生後３カ月に診断された２１歳の女性であった。該患者は、膵臓不全を有しており、汗のＣｌ^-が陽性で（１０１ｍＥｑ／ｌ）、ΔＦ５０８変異に関してホモ接合である。該患者のＨＩＮスコアは９０で、ＦＥＶ１は予想値８３％であった。２人目の患者は、膵臓不全症状を表した１３歳の時に診断された３６歳の男性であった。汗のクロライド試験は７０ｍＥｑ／ｌの濃度を示した。該患者はΔＦ５０８およびＧ５５ＩＤ変異に関してヘテロ接合である。該患者のＮＩＨスコアは８８で、ＦＥＶ１は予想値６６％であった。３人目の患者は、汗のクロライド試験で陽性の（１０４ｍＥｑ／ｌ）、９歳の時に診断された５０歳の女性であった。該患者は膵臓不全およびインスリン依存性糖尿病を有していた。該患者はΔＦ５０８変異に関してホモ接合である。該患者のＮＩＨスコアは７３で、ＦＥＶ１は予想値６５％であった。経上皮電圧以前記載された方法（アルトン，イー・ダブリュ・エフ・ダブリュ（Alton，E .W.F.W.）ら（１９８７年）ソラックス（Thorax）第４２巻：８１５〜８１７頁；クノウルズ，エム（Knowles，M.）ら（１９８１年）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Eng.J.Med.）第３０５巻：１４８９〜１４９５頁）と同様の方法で鼻上皮を横切る経上皮電位差を測定した。銀／塩化銀ペレット（ＣＴギルフォードのイー・ダブリュ・ライト（E.W.Eright）社製）に対する通常の滅菌セイラインに接続した２３ゲージの皮下注射針を対照電極として使用した。探査電極は、先端に横穴を有するサイズ８のゴム製カテーテル（ミズーリ州セントルイスのフォーリーカテーテル社のアージル^Rを改変したもの）であった。カテーテルをリンゲル溶液（ｍＭで、ＮａＣｌ１３５、ＫＨ₂ＰＯ₄，Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ２．４、ＣａＣｌ₂ １．２、ＭｇＣｌ₂ １．２およびＨｅｐｅｓ１０（ＮａＯＨでｐＨを７．４にした））で満たし、銀／塩化銀ペレットに接続した。チャート記録計（日本のワタナベ・インスツルメンツ（Watanabe Instrumen ts）のサーボコーダー（Servocorder））に接続した電圧計（オハイオ州クリーブランドのキースリー・インスツルメンツ・インク（Keithley instruments Inc .）製）で電圧を測定した。測定の前に、銀／塩化銀ペレットを直列にしてリンゲル溶液に接続した。記録されるｖｔが±４ｍＶより大きければペレットを交換した。テレスコープ下で（ドイツのツトリンゲンのカール・シュトルツ（Karl S torz）社のホプキンステレスコープ（Hopkins Telescope））ゴム製カテーテルを鼻孔中に導入し、下方鼻介骨の疾患が認められる研究すべき領域にカテーテルの横穴を隣接させた。下方鼻介骨の前方先端からの距離、内側の鼻介骨との腔の関係、上顎の入り口の副鼻洞、および１人の患者における小ポリプを用いて、測定のためのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１投与部位を定めた。写真およびビデオレコーダーの映像も使用した。ゆっくりした間欠的な１００μｌ／分でのリンゲル溶液の注入後、Ｖｔの変化がなくなるまで基底Ｖｔを記録した。ベースラインが達成されたならば、１００μＭのアミロライド（amiloride）（ペンシルベニア州ウェストポイントのメルク・アンド・カンパニー・インク（Merck an d Co.Inc.）製）を含む２００μｌのリンゲル溶液をカテーテルを通して点滴注入し、間欠的な点滴注入後さらに変化が見られなくなるまでＶｔの変化を記録した。最後に、１００μＭのアミロライドおよび１０μＭのターブタリン（terbut aline）（ニューヨーク州アーズリーのガイギー・ファーマシューティカルズ（G eigy Pharmaceuticals）社製）を含有する２００μｌのリンゲル溶液を点滴注入し、Ｖｔの変化を記録した。基底Ｖｔの測定値は常に再現性があった。治療を受けた３人の患者において、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与前の変動率は３．６％、１２％および１２％であった。ターブタリンにより誘導される変化も再現性があった。９人のＣＦ患者における３０個の測定値中、ターブタリンにより誘導されたＶｔ（ΔＶｔ）の変化は０ｍＶないし＋４ｍＶの範囲であり、Ｖｔの過分極は観察されなかった。対照的に、７人の正常対象のΔＶｔは−１ｍＶないし−５ｍＶであり、過分極が常に観察された。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１適用および細胞取得患者を手術室に入れ、連続的な心電図、脈拍、酸素消費量の記録のみならず自動的な間欠的血圧測定を用いてモニタリングを行った。穏やかな鎮静後、５％コカイン０．５ｍｌを噴霧して鼻粘膜を麻酔した。ついで、前以て０．１％アドレナリン（adrenaline）２ｍｌおよび１％テトラケイン（tetracane）８ｍｌからなる混合物に浸した綿撤子で下方鼻介骨部位の粘膜を覆った。綿撤子をその場所に１０〜４０分置いた。内視鏡をテレビモニターするシステムを用いて、アプリケーターを鼻孔から導入し、下方鼻介骨の前方の先端から少なくとも３センチメーター離れた下方鼻介骨の内側部分に設置した（図２５Ａ〜２５Ｉ）。接続カテーテルを通してウイルス懸濁液をアプリケーター中に注入した。アプリケーターの位置を内視鏡でモニターして、アプリケーターが動かないようにし、漏れを防止するのに十分な圧をかけた。ウイルスが鼻上皮に３０分間接触した後、ウイルス懸濁液を除去し、アプリケーターを引き出した。Ｖｔ測定に使用した改変フォーリーカテーテルを用いて３人目の患者の左の鼻孔にウイルスを適用した。カテーテルの横穴が下方鼻介骨対象部位に接触するまで内視鏡を用いて麻酔せずにカテーテルを導入した。溶液の液滴がテレスコープで見えるまでウイルス溶液をゆっくりと注入した。カテーテルを３０分間その場所に置き、ついで、除去した。治療約２週間前にウイルス投与部位から細胞を得、ついで、治療後は１週間間隔で細胞を得た。前以て５％コカインに浸した綿撤子で下方鼻介骨を１０分間覆った。内視鏡コントロール下で、投与部位をゆるやかに５秒間ブラッシングした。ブラッシングで得た細胞をＰＢＳ中に落とした。鼻粘膜の綿棒かきとり物を、麻酔せずに綿を先端に付けたアプリケーターを用いて集めた。サイトプシンスライドを調製し、ライト染色を行った。光学顕微鏡を用いて呼吸器上皮細胞および炎症細胞を評価した。生検には、ウイルス適用方法に記載したように鎮静剤／麻酔剤を投与した。内視鏡検査および生検すべき部位の同定後、粘膜下組織に１／１０００００のエンケファリンを含有する１％キシロケイン（xylocaine）を注射した。下方鼻介骨へのウイルス適用部位を取った。標本を４％ホルムアルデヒドで固定し、染色した。結果Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与１日後およびそれ以降のすべての時点において、鼻上皮、咽頭、血液、尿、または便からのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１は培養されなかった。該培養アッセイの感度に対する対照として、試料に１０および１００ＩＵのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を添加した。いずれの場合にも、添加された試料は陽性出あり、最小でも１０ＩＵのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１が検出されることが示された。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与前後における組織学的、全身的試験、血清化学的試験または細胞数、胸部および副鼻洞のＸ線撮影、肺機能試験、または動脈血のガス検査によって評価されるような全身的応答の証拠はなかった。アデノウイルスに対する抗体の増加は、治療３５日後のＥＬＩＳＡまたは中和によって検知されなかった。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与３ないし４時間後、局所麻酔および局部的血管収縮が軽減した時に、すべての患者は、鼻のうっ血を訴え、１つのケースにおいては鼻漏があった。これらは１８時間後に軽減し、２８ないし４２時間後までには解消する独立した徴候であった。鼻粘膜の検査により、弱ないし中程度の紅斑、浮腫、滲浸が示された（図２５Ａ〜２５Ｃ）。これらの身体的知見は該徴候と同様に経時変化をたどった。たとえアプリケーターを用いた予備研究が、マーカーであるメチレンブルーが適用部位に限定されていたことを示すものであっても、該身体的知見はウイルス適用部位に限られていなかった。さらに２人のＣＦ患者においては、同じ麻酔および適用方法を用い、ウイルスのかわりにセイラインを適用したが、これらの患者において同じ徴候および身体的知見が観察された（図２５Ｇ〜２５Ｉ）。そのうえ、アプリケーターを使用しなかった場合でさえも局所的な麻酔および血管収縮が起こり、麻酔／血管収縮が、すべてではないが、いくらかの障害を引き起こしたことが示された。適用２４時間後、鼻の綿棒かきとり物から取られた細胞の分析により、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１またはセイラインで治療した患者の好中球のパーセント値の同量の増加が明らかとなった。適用１週間後、好中球増加は両群とも消失した。鼻ブラッシング物から得られた呼吸器上皮細胞は、１週間目およびそれ以降の時点において正常な外観を呈し、封入体があるという証拠を示さなかった。粘膜をさらに評価するために、１人目の患者において３日目に、そして２人目の患者において１日目に上皮を生検した。当該研究とは関係のない２人の病理学者による別々の評価により、軽度の外傷および我慢できる虚血（おそらく、ウイルス投与前の麻酔／血管収縮による２次的なもの）と矛盾しない変化が示されたが、ウイルスによる損傷を示す異常はなかった。該適用方法は、最初の２人の患者においていくらかの軽度の障害を起こしたので、３人目の患者においては投与方法を変更した。使用した方法は局所麻酔または血管収縮を必要とせず、よって、障害をより引き起こしにくいが、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１を正確に決められた部位に送達する能力においてあまり確実性がないものであった。右側の鼻孔において、最初の２人の患者と同様にＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を投与し、左側の鼻孔において、小型のフォーリーカテーテルを使用するかわりに麻酔またはアプリケーターなしでウイルスを投与して相対的に決定された部位に表面張力によりＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を適用し、維持した（図２５Ｅ）。右側の鼻孔において、徴候および身体的知見は最初の２人の患者において観察されたのと同じであった。対照的に、左側の鼻孔において、徴候は見られず、検査時に鼻粘膜は正常な外観であった（図２５Ｄ〜２５Ｆ）。右の鼻孔から得た鼻の綿棒かきとり物は、最初の２人の患者において観察されたのと同様の好中球増加を示した。対照的に、麻酔を行わず、最少の操作を行った左の鼻孔は好中球増加を起こさなかった。投与後３日目の左に鼻孔の生検（図２６）は、ＣＦと矛盾しない形態（厚い基底膜および粘膜下組織に時折見られる多形核細胞）を示したが、アデノウイルスベクターに起因しうる異常はなかった。１人目の患者は、治療３週間後から喉の痛みおよび咳の増加を訴え、２日間続いた。治療６週間後、該患者は気管支炎／気管支拡張症を悪化させ、入院が必要な喀血を起こした。２人目の患者は、治療３日後に一時的な最少の喀血を起こした。喀血の前後には他の徴候を伴わなかった。３番目の患者は治療３週間後に気管支炎を悪化させ、そのため、経口的に抗生物質を投与された。各患者の予備治療の臨床的経過、症状の評価およびウイルス培養に基づいて、Ａｄ２／ＣＦＴＲ −１投与に対するこれらの症状に関連した証拠を識別することはできなかった。むしろ、症状は、各個体における疾患の正常な経過と矛盾しないと思われた。ＣＦＴＲのＣｌ^-チャンネル機能の損失は、罹患した上皮を横切る異常なイオン輸送を引き起こし、ついで、これがＣＦ関連軌道疾患の病因に貢献する（ボート，ティー・エフ（Boat，T.F.）ら「ザ・メタボリック・ベイシス・オブ・インヘリテッド・ディジージズ（The Metabolic Basis of Inherited Diseases）」（スクライバー（Scriber）ら編、マクグローヒル（McGraw-Hill）、ニューヨーク（１９８９年）；クイントン，ピー・エム（１９９０年）ＦＡＳＥＢジャーナル第４巻：２７０９〜２７１７頁）。気道上皮において、イオン輸送は２つの導電性プロセスにより支配されている。該２つのプロセスは、アミロライド感受性の粘膜から粘膜下組織へのＮａ⁺吸収およびｃＡＭＰにより刺激される反対方向のＣｌ^-分泌である（クイントン，ピー・エム（１９９０年）ＦＡＳＥＢジャーナル第４巻：２７０９〜２７１７頁；ウェルシュ，エム・ジェイ（１９８７年）フィジオジロ・レビュ（Physiol.Rev.）第６７巻：１１４３〜１１８４頁）。これら２つの輸送プロセスを、鼻粘膜上皮を横切る電圧（Ｖｔ）をインビボで測定することにより非侵略的に評価することができる（ノウルズ，エムら（１９８１年）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン第３０５巻：１４８９〜１４９５頁；アルトン，イー・ダブリュ・エフ・ダブリュら（１９８７年）ソラックス（Thorax）第４２巻：８１５〜８１７頁）。図２７は、正常対象からの例を示す。基底条件下では、Ｖｔは電気的に陰性であった（管腔は粘膜下組織表面をいう）。アミロライド（１００μＭ）の粘膜表面への拡散は、先端のＮａ⁺チャンネルを遮断することによりＶｔを抑制する（ノウルズ，エムら（１９８１年）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン第３０５巻：１４８９〜１４９５頁；クイントン，ピー・エム（１９９０年）ＦＡＳＥＢジャーナル第４巻：２７０９〜２７１７頁；ウェルシュ，エム・ジェイ（１９９２年）ニューロン（Neuron）第８巻：８２１〜８２９頁）。引き続いて起こるβ−アドレナリン作用性アゴニストであるターブタリン（１０μＭ）の拡散は、ｃＡＭＰの細胞におけるレベルを上昇させ、ＣＦＴＲのＣｌ^-チャンネルを開き、ついで、クロライド分泌を刺激することにより、Ｖｔを過分極させた（クイントン，ピー・エム（１９９０年）ＦＡＳＥＢジャーナル第４巻：２７０９〜２７１７頁；ウェルシュ，エム・ジェイ（１９９２年）ニューロン（Neuron）第８巻：８２１〜８２９頁）。図２８Ａは、７人の正常対象からの結果を示す。基底Ｖｔは−１０．５±１．０ｍＶであり、アミロライド存在下では、ターブタリンはＶｔを−２．３ｍＶ ±０．５ｍＶ分極させた。ＣＦ患者においては、以前報告されているように（ノウルズ，エムら（１９８１年）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン第３０５巻：１４８９〜１４９５頁）、Ｖｔは正常対象よりも電気的に陰性であった（図２８Ｂ）。基底Ｖｔは−３７．０±２．４ｍＶであり、正常対象よりもずっと陰性であった（ｐ＜０．００１）。（図２８Ａおよび図２８Ｂのにおいて目盛りが異なることに注意）アミロイライドは、正常対象におけるのと同様にＶｔを抑制した。しかしながら、アミロライド存在下においてターブタリンを上皮上に拡散させた場合、Ｖｔは過分極しなかった。それにもかかわらず、Ｖｔは変化しないか、またはより陰性でなくなった。平均Ｖｔは＋１．８ｍＶ±０．６ｍＶ分極し、正常対象において観察された結果とは非常に異なる結果であった（ｐ＜０．００１）。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１適用後、基底Ｖｔは、３人すべての患者において、より陰性でなくなった。図２９は、３人目の患者の治療前の例（図２９Ａ）および治療後の例（図２９Ｂ）を示し、図３０Ａ、３０Ｃ、および３０Ｅは、すべての患者の基底Ｖｔの変化の経時変化を示す。基底Ｖｔの減少は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ− １の適用が、３人すべての患者において、鼻上皮におけるＣＦの電解質輸送の欠陥を修正したことを示す。さらなる確証は、ターブタリンに対する応答の試験から得られた。図３０Ｂは、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１適用前の応答とは対照的に、ウイルス適用後は、アミロライド存在下において、ターブタリンはＶｔを刺激したことを示す。図３０Ｂ、３０Ｄおよび３０Ｆは、応答の経時変化を示す。Ｃｌ^- 輸送の欠陥の修正は、麻酔／適用方法によるものではありえない。なぜなら、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１のかわりにセイラインで治療した患者においては修正が起こらなかったからである（図３１）。そのうえ、麻酔の効果は、鼻粘膜上で普通に見られたが、基底Ｖｔは、ウイルス投与部位においてのみ減少した。結局、３人目の患者の左の鼻粘膜において同様の変化が観察され、改変適用法を行った後に徴候的または全身的応答は見られなかった。逆転写酵素−ＰＣＲ、および鼻ブラッシング物および生検の細胞における免疫細胞化学によりＣＦＴＲ転写物を検出するために行った試行はうまく行かなかった。動物における同様の研究はうまく行っている（ザブナー，ジェイ（Zabner， J.）ら（１９９３年）ネイチャー・ジェネ（印刷中））のであるが、これらの研究はずっと高用量のＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を使用していた。本ケースにおける成功の欠如は、使用組織が少量であったこと、低いＭＯＩ、細胞フラクションのみを集めたという事実、そしてＡｄ２／ＣＦＴＲが、ずっと強力なＣＭＶプロモーターを用いた構築物（好評していない観察結果）と比較するとずっと少ないｍＲＮＡならびに蛋白しか作らない弱ないし中程度の強度のプロモーター（Ｅｌａ）を有していることを反映しているようである。ＣＦＴＲは、通常、非常に低レベルで気道上皮細胞中に発現される（トラプネル，ビー・シーら（１９９１年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８８巻：６５６５〜６５６９頁）ので、Ｅｌａプロモーターを選択した。また、単一のイオンチャンネルは１秒あたり非常に多数のイオンを誘導し、よって有効にＣｌ^-輸送を支援しうるので、その機能は容易に検出されるのであるが、正常なヒトの気道上皮におけるＣＦＴＲ蛋白およびｍＲＮＡを検出することは困難である。時間とともに、ＣＦ欠陥の修正を示す電気的変化は治療前のレベルに戻った。しかしながら、基底Ｖｔは、ターブタリンにより生じるＶｔの変化の戻りよりもゆっくりと戻るように思われた。この相違の意義は不明であるが、正常なＣＦＴＲの発現に対する２つの測定値の相対的感度を反映しいるのかもしれない。いずれにせよ、一方の治療部位を生検により除去し、ウイルス投与７ないし１０日後、ついで、１週間間隔での分析のためにもう一方の鼻粘膜をブラッシングしたという理由で、本研究は修正の持続時間を試験するために計画されたものではなかった。粘膜をブラッシングすることは、細胞を除去し、上皮を破壊し、その後少なくとも２日間は基底Ｖｔをゼロまで減少させる。よって、Ａｄ２／ＣＦＴＲ− １の効果の持続時間に対する正確な評価が妨げられる。アデノウイルスによる遺伝子転移の効能この研究の主な結論は、ＣＦＴＲをコードしている組み換えアデノウイルスのインビボでの適用が、ＣＦ上皮に特徴的な気道上皮のＣｌ^-輸送における欠陥を修正しうるということである。ヒト・鼻粘膜におけるＣｌ^-チャンネル欠陥の相補を、基底電圧の変化およびｃＡＭＰアゴニストに対する応答の変化として測定することができた。プロトコールは持続時間を確認するために計画されたものではないが、これらのパラメーターの変化を少なくとも３週間にわたり調べた。これらの結果は、ヒトへの組み換えアデノウイルス投与は、機能面のアッセイにより測定される全身的な病変を修正しうるという最初の報告を提供する。患者からの細胞の採取、培養における細胞のトランスダクション、ついで、患者への細胞の再導入を含むインビトロでのプロトコールを用いるというよろもむしろ、組み換えウイルスベクターを直接ヒトに投与するという点で、この研究は、ヒトへの遺伝子の転移における最初期の試みと対照をなす。１、３および２５ＭＯＩに相当する３回のウイルス投与すべてにおいてＣＦのＣｌ^-輸送の欠陥が修正されたという証拠が得られた。この結果は、同程度のＭＯＩが、透過性フィルター担体上で増殖したＣＦ気道細胞の初代培養物におけるＣＦの液体および電解質輸送の欠陥を逆転させたということを示す初期の研究（リッチ，ディー・ピーら（１９９３年）ヒューマン・ジーン・セラピー第４巻：４６１〜４７６頁およびサブナーら，出版中）と矛盾しない。すなわち、１未満のＭＯＩにおいて、ｃＡＭＰにより剌激されるＣｌ^-分泌が部分的に回復し、１ＭＯＩのＡｄ２／ＣＦＴＲ−１での治療後、ｃＡＭＰアゴニストが、正常対象由来の上皮において観察される範囲内での液体の分泌を刺激したのである。１ＭＯＩにおいて、関連アデノウイルスベクターは、蛍光活性化細胞分析により評価されたように（ザブナーら，出版中）感染上皮細胞の２０％において、β−ガラクトシダーゼ活性を産生した。かかるデータは、ＣＦ気道における薬理学的用量のアデノウイルスが１ＭＯＩに相当しうることを示す。２ｘ１０⁶個／ｃｍ²の細胞が気道に存在し（ＣＲＣプレス，ボカ・ラトン（Boca Raton）１９９２年）、気管から細気管支に至る気道が１４００ｃｍ²の表面積を有する（マリアシー，エイ・テイー（Mariassy，A.T.）「コンパラティブ・バイオロジー・オブ・ザ・ノーマル・ラング（Comparative Biology of the Normnal Lung）」，ハイデルベルクのシュプリンガー出版，１９６３年）と見積もられたならば、約３ｘ１０⁹ 個の可能な標的細胞が存在するであろう。ＩＵに対する粒子の比を１００と考えると、これは約７５μｇの質量を有する約３ｘ１０¹¹個のアデノウイルス粒子に相当する。粗い見積ではあるが、かかる情報は、ヒトへの投与に対する可能な安全性を確立するための動物実験の計画に有用である。組み換えアデノウイルスの有効なＭＯＩは、本研究で試験した最も低いＭＯＩよりも小さいであろう。いくつかの証拠は、ＣＦの電解質輸送の欠陥を修正するには上皮単層中のすべての細胞がＣＦＴＲを発現する必要はないことを示唆する。混合実験は、おそらく５〜１０％の細胞がＣＦＴＲを発現した場合、単層は、野生型の電気的特性を示すであろうということを示した（ジョンソン，エル・ジー（Johnson，L.G.）ら（１９９２年）ネイチャー・ジェネ第２巻：２１〜２５頁）。破壊されたＣＦＴＲ遺伝子を有するマウスにおいてＣＦＴＲ発現させるためにリポソームを使用する実験も、ほんのわずかの割合の細胞が修正に必要であることを示唆している（ハイド，エス・シー（Hyde，S.C.）ら（１９９３年）ネイチャー第３６２巻２５０〜２５５頁）。気道上皮単層および０．１程度の低い多重度のＡｄ２／ＣＦＴＲ−１を用いた上で参照した結果は、Ｃｌ^-分泌の測定可能な変化を示した（リッチ，ディー・ピーら（１９９３年）ヒューマン・ジーン・セラピー第４巻：４６１〜４７６頁およびザブナーら，印刷中）。電解質輸送アッセイが非常に高感度（単一のＣｌ^-チャンネルが多数のイオンを１秒間に輸送しうるため）であり、ＣＦＴＲ転写に使用されるＥ１ａプロモーターが低活性である場合に、ＣＦＴＲ蛋白およびＣＦＴＲｍＲＮＡの検出ができないことは、おそらく驚くことではない。ＣＦＴＲｍＲＮＡは逆転写酵素− ＰＣＲにより検出されることはありえないが、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１は、標準的なＰＣＲにより試料中に検出されうる。このことは、導入したＤＮＡの存在を示し、かつ、逆転写酵素反応が最適条件でなかったかもしれないことを示唆する。このことは、逆転写酵素を阻害する組織中の因子により起こった可能性がある。本研究で測定した電解質輸送の変化がＣＦＴＲ発現から生じるものであるというわずかな疑いがあるけれども、このことが肺機能における測定可能な臨床的変化を導くかどうかは依然として検討されるべきである。安全性の検討これら３人の患者の鼻上皮へのアデノウイルスベクターの適用は、十分耐えられるものであった。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与後、３人すべての患者の鼻上皮において軽度の炎症が観察されたが、同様の変化は、ウイルスベクターのかわりにセイラインを模擬投与された２人のボランティアにおいても観察された。麻酔および投与方法に関連した外傷の組み合わせは、鼻粘膜の変化を明確に引き起こした。炎症がウイルス投与により生じたと結論するには証拠が不十分である。しかしながら、１人の患者において最高ＭＯＩのウイルス（２５ＭＯＩ）を改変方法で投与した場合、３日目の生検により当該部分を除去するまで継続した生物物理学的効能に関する確証を提供した条件下では炎症が観察されなかった。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１の複製に関する証拠はなかった。初期の研究により、組織培養および実験動物におけるＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の複製はひどく妨げられることが確認された（リッチ，ディー，ピーら（１９９３年）ヒューマンジーンセラピー第４巻：４６１〜４７６頁；ザブナー，ジェイら（１９９３年）ネイチャー・ジェネ（印刷中））。２９３細胞のごときアデノウイルスのＥ１領域の失われた初期蛋白を供給する細胞中、あるいはＥ１を有するアデノウイルスとの同時感染もしくは組み換えによりＥ１領域が提供される条件下においてのみ、複製が起こる（グラハム，エフ・エル（Graham，F.L.）およびプレベッツ，エル（Prev ec，L.）「ワクチンズ：ニュー・アプローチズ・トゥ・イミュノリジカル・プロブレムズ（Vaccines:New Approaches to Immunoligical Problems）」（アール・ダブリュ・エリス編、ボストンのバターワースーハイネルマン（Butterworth- Heinermann）１９９２年；バークナー，ケイ・エル（Berkner，K.L.）（１９８８年）バイオテクニークス第６巻：６１６〜６２９頁）。研究前にはアデノウイルス２型および５型に対して血清陽性であった本研究の患者は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１投与の前の鼻の綿棒かきとり物の培養によるとアデノウイルスに対して陰性であり、いくつかのヒト対象において報告されたように（マツセ，ティー（Ma tsuse，T.）ら（１９９２年）アメ・レビュ・リスピレ・ディジ（Am.Rev.Respir .Dis.）第１４６巻：１７７〜１８４頁）、内在性Ｅ１ＤＮＡ配列の欠如がＰＣＲ法により示された。実施例１１−偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）の構築およびパッケージング図３２を参照して、Ａｄ２パッケージングシグナルおよびＥ１エンハンサー領域（ヌクレオチド０〜３５８）をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（カリフォルニア州ラジョラのストラタジーン社製）中に挿入することによりＰＡＢＶ構築物を調製した。Ａｄ２パッケージングシグナルおよびＥ１エンハンサー領域がヌクレオチド０〜３８０であることを除いて、ＰＡＶIIとして知られるこのベクターの変種を同様にして構築した。５’末端のヌクレオチド添加は大きなＰＡＶを生じ、より効果的にパッケージングが行われるが、より大きなアデノウイルス配列を含んでいるため、潜在的により免疫原性あるいはより複製可能性が大きい。遺伝子暗号領域の挿入または完全な切形、および感染性粒子を生じさせる目的のトランスフェクションにおける使用に関する操作を容易にするために、相補的プラスミドをもｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫII中に組み込んだ。この相補的プラスミドは、Ａｄ２の大後期プロモーター（ＭＬＰ）３分節系リーダー（ＴＰＬ）ＤＮＡ、およびＳＶ４０のＴ抗原核局在化シグナル（ＮＬＳ）ならびにポリアデニレーションシグナル（ＳＶｐＡ）を含んでいる。図３２からわかるように、このプラスミドは、ＭＬＰ／ＴＰＬとＳＶ４０ポリＡとの間に対象とする遺伝子の挿入用の便利な制限部位を有している。この構築物を加工して全カセットが切形され、先に述べたＰＡＶＩまたはＰＡＶII構築物中に挿入されうるようにする。ＡｐａＩおよびＳａｃII制限エンドヌクレアーゼでプラスミドからＰＡＶを切形し、２９３細胞（Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ発現細胞系）（グラハム，エフ・エルら（１９７７年）ジャーナル・ジェ１１ネジェ・ウイロロ（J.Gen.Virol.）第３６巻：５９〜７４頁）中への野生型Ａｄ２またはパッケージング／複製欠損ヘルパーウイルスとの同時トランスフェクションにより、ＰＡＶ感染性粒子の生成を行った。ヘルパーからのＰＡＶの精製を、ＣｓＣｌ密度勾配遠心により行うことができ、ＰＡＶウイルス粒子は低密度であり、グラジエント中の高い位置にバンドを形成するであろう。遺伝子治療には、ヘルパーウイルスが混入していない十分量のＰＡＶウイルス粒子を得ることが望ましい。標準的なアデノウイルスベクターに優るＰＡＶの第１の利点は、大きなＤＮＡ挿入物をウイルス粒子中にパッケージングしうることである（約３６ｋｂまで）。しかしながら、ＰＡＶは複製およびパッケージングにヘルパーウイルスを必要とし、このヘルパーウイルスは、いかなるＰＡＶ標品においても優勢種となるであろう。ウイルス標品中のＰＡＶ比率を増加させるために、いくつかのアプローチを用いることができる。例えば、ウイルス粒子中へのパッケージングに関して部分的に欠陥のあるヘルパーウイルスを用いることができる（パッケージング配列の変異により（グレイブル，エム（Grable，M.）およびヒアリング，ピー（Hearing，P.）（１９９２年）ジャーナル・オブ・ウイロロジー第６６巻：７２３〜７３１頁）、あるいはウイルスのサイズ（約３７．５ｋｂよりも大きなゲノムサイズを有するウイルスはパッケージングが不十分）により）。パッケージングに欠陥のあるウイルスとの混合感染において、ＰＡＶは、パッケージングに欠陥のないヘルパーウイルスと混合感染した場合よりも高いレベルでウイルス混合物中に存在することが期待されよう。もう１つのアプローチは、複製に関してＰＡＶ依存性であるヘルパーウイルスを調製することである。ヘルパーウイルスから必須遺伝子（例えば、IXまたは末端蛋白）を除去し、該遺伝子をＰＡＶベクター中に入れることにより、これを最も容易に行うことができる。このようにすれば、ＰＡＶもヘルパーウイルスも、独立して複製することはできなくなる。それゆえ、ＰＡＶおよびヘルパーウイルスは相互依存的となる。これにより、得られるウイルス標品においてＰＡＶは高い割合で存在するはずである。第３のアプローチは、新規パケージング細胞系を開発することである。これにより、混入しているヘルパーウイルスのない十分量のＰＡＶ粒子を得ることができる。新規蛋白IX（pIX）パッケージングシステムが開発されているこのシステムは、アテノウイルスの分子生物学のいくつかの確証となる特徴を開拓するものである。第１には、アテノウイルス欠陥粒子は、３０％まであるいはそれ以上の標準的な野生型アデノウイルス標品からなることが知られている。これらの欠陥または不完全粒子は安定で、１５〜９５％、典型的には１５〜３０％のアデノウイルスゲノムを含んでいる。ＰＡＶゲノム（１５〜３０％の野生型ゲノム）のパッケージングは同等にパッケージするはずである。第２には、全長にわたるＡｄゲノム（しかし９５％未満）の安定なパッケージングにはｐＩＸと命名されたアデノウイルス遺伝子の存在が必要である。新規パッケージングシステムは、Ａｄ蛋白ｐＩＸを発現する２９３細胞系の生成に基づく。さらに、Ｅ１領域が欠失しているが十分な外来性物質が挿入されて全長３６ｋｂまたはそれ以上になるように加工されたアデノウイルスヘルパーウイルスがある。これら２つの構築物はともに、精製ＤＮＡと同様に２９３／ｐＩＸ細胞系中に導入される。ｐＩＸの存在下、現に行うＰＡＶ／Ａｄ２産生実験において見られるように、両方の予想される子孫ウイルスを得ることができる。ついで、これらの細胞のウイルス含有溶解物を、別々に力価測定し（いずれかのベクターの特異的なマーカー遺伝子活性に関して）、ＰＡＶに対して感染多重度１で標準的な２９３細胞（ｐＩＸを欠く）を感染させるのに使用する。全長にわたるゲノムは競争的なパッケージングの利点を有するので、この細胞系を用いた研究のみならず不完全または欠陥粒子を用いた研究は、ＰＡＶに対してＭＯＩ１での感染は、必然的に、１より大きいヘルパーに対する効果的なＭＯＩと等価であろうということが予想される。すべての細胞は、多分、ＰＡＶ（少なくとも１）およびヘルパー（１より大）の両方を含むであろう。通常は、この細胞中で複製およびウイルスカプシド生成が起こるはずであるが、ＰＡＶゲノムのみがパッケージングされるであろう。これらの２９３／pIX培養の収穫により、本質的にヘルパーのないＰＡＶが得られることが予想される。実施例１２−Ａｄ２−Ｅ４／ＯＲＦ６の構築Ａｄ２−Ｅ４／ＯＲＦ６は、ヌクレオチド３２８１５ないし３５５７７間のすべてのＡｄ２配列を欠失したアデノウイルス２型に基づくベクターである（図３３は、Ａｄ２−Ｅ４／ＯＲＦ６プラスミド構築を示す）。この欠失により、Ｅ４のすべてのオープンリーディングフレームが除去されるが、Ｅ４ｍＲＮＡのＥ４プロモーターおよび最初のヌクレオチト３２〜３７はインタクトのまま残される。欠失した配列のかわりに、ＯＲＦ６特異的ＤＮＡプライマー（ジェンザイム社のオリゴ＃２３７１−ＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＴＡＣ（配列番号：８）およびオリゴ＃２３７２−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧ（配列番号：９））を用いたＡｄ２ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応により誘導されたＯＲＦ６をコードしているＤＮＡフラグメント（Ａｄ２ヌクレオチド３４０８２〜３３１７８）が挿入された。オリゴヌクレオチドにより供給されるさらなる配列は、ＰＣＲフラグメントの５’および３’末端にクローニング部位（それぞれ、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩ）、およびＯＲＦ６ｍＲＮＡの正確なポリアデニレーションを確実にするための３’末端におけるポリアデニレーション配列を有していた。図３３に示すように、まずＰＣＲフラグメントを、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）およびＡｄ２のＥ４プロモーター領域（Ａｄ２のヌクレオチド３５９３７〜３５５７７）を含むＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ついで、細菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）中に組み込んでプラスミドＯＲＦ６を得た。配列決定してＯＲＦ６リーディングフレームが無傷であることを証明した後、ＩＴＲおよびＯＲＦ６を包含するフラグメントを、フランキング制限部位を用いて、第２のプラスミドｐＡｄΔＥ４中にサブクローニングした。ｐＡｄΔＥ４は、ＳａｃＩ部位から３’ＩＴＲ（Ａｄ２のヌクレオチド２８５６２〜３５９３７）に至るＡｄ２の３’末端を含み、すべてのＥ４配列（プロモーターからポリＡ部位に至るまで、Ａｄ２の３２８１５〜３５６４１の位置）が欠失している。この第２のプラスミドにおいて、Ｅ４ＯＲＦ６のみを発現するウイルスであるｐＡｄＯＲＦ６を制限酵素ＰａｃＩで切断し、ＰａｃＩで消化したＡｄ２ＤＮＡにライゲーションした。このＰａｃＩ部位はＡｄ２ヌクレオチド２８６１２に対応する。このライゲーション物で２９３細胞をトランスフェクションし、得られたウイルスを制限分析に付して、Ａｄ２Ｅ４領域が対応するｐＡｄＯＲＦ６の領域で置換されていること、およびただ１つ残っているＥ４オープンリーディングフレームがＯＲＦ６であることを証明した。理論的には、組み換えウイルス由来の欠失したＥ４機能を完全に相補する細胞系を確立することは可能であった。このアプローチに関する問題は、Ｅ４が、宿主細胞の蛋白合成の調節において機能し、それゆえ、細胞に対して毒性であることである。本発明組み換えアテノウイルスはＥ１領域を欠失しており、Ｅ１機能を相補する２９３細胞中で増殖するにちがいない。Ｅ４プロモーターはＥ１ａ遺伝子産物により活性化され、それゆえ、毒性のあるＥ４のＥ４転写物発現を防止するには堅く調節されなければならない。かかるプロモーターまたはトランスアクティベーティングシステムにおいて必要なことは、誘導されていない状態の発現は、宿主細胞に対する毒性を回避するには十分に低くなければならいが、誘導されている状態においては、ウイルス産生中はＥ４欠陥ウイルスを相補する十分なＥ４遺伝子産物を産生するように十分活性化されなければならないということである。実施例１３Ｅ１ａプロモーターのかわりにホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを用いて、実施例７記載のごとくアデノウイルスベクターを調製する。実施例１４Ａｄ２大後期プロモーター（ＭＬＰ）のかわりにＰＧＫプロモーターを用いて、実施例１１記載のごとくアデノウイルスベクターを調製する。実施例１５：Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲの調製このプロトコールては、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲと命名された第２世代のアデノウイルスベクターを使用する。このウイルスはＥ１を欠き、その位置に、ＣＦＴＲｃＤＮＡに隣接しているＰＧＫブロモーターおよびポリＡ付加部位を伴う修飾された転写ユニットを有する。ＰＧＫプロモーターは中程度の強度であるにすぎずないが、持続時間が長く、遮断される対象でない。該ベクターのＥ４領域も修飾されており、その全暗号領域配列が除去され、組織培養におけるＡｄの増殖に必須の唯一のＥ４遺伝子であるＯＲＦ６により置換されている。このことは、野生型Ａｄ２の１０１％のサイズのゲノムが得られるという効果がある。該ＤＮＡ構築物は、初期領域（Ｅ１）遺伝子（ウイルスゲノムの５’末端の存在する）が欠失され、ＣＦＴＲをコードしている発現カセットにより置換されているＡｄ２ゲノムの全長のコピーからなる。発現カセットは、ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）に関するプロモーターおよびウシ・成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨ）由来のポリアデニレーション（ポリＡ）付加シグナルを含んでいる。さらに、Ａｄ２のＥ４領域が欠失され、Ａｄ２Ｅ４領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ６）のみで置換されている。該アデノウイルスベクターをＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲと命名し、図式的に図式的に３４に示す。野生型Ａｄ２ゲノム全体は、すでに配列決定されており（ロバーツ，アール・ジェイ（Roberts，R.J.）（１９８６年）「アデノウイルスＤＮＡ（Adenovirus DNA）」（ダブリュ・オーバーフラー（W.Oberfler）編、ボストンのマティナス・ニホフ・パブリッシング（Matinus Nihoff Publishing））、そこに用いられている番号付けシステムを、野生型ゲノムに言及する場合に、本明細書に適用する。Ｅ１およびＥ４欠失に隣接するＡｄ２ゲノム領域および該ゲノム中への挿入物は完全に配列決定されている。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ構築物は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１がＥ１ａプロモーターを用い、ＣＦＴＲの直接下流のポリＡ付加シグナルを有さず、インタクトなＥ４領域を保持していたという点で、我々のはじめのプロトコールに使用したもの（Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１）とは異なる。組織培養および動物実験におけるＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の特性は報告されている（リッチら（１９９３年）ヒューマン・ジーン・セラピー第４巻：４６１〜４６７頁；およびザブナーら（１９９３年）ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genetics）（印刷中））。ゲノムの５’末端において、Ａｄ２のヌクレオチド３５７ないし３３２８を欠失させ、２２個のヌクレオチドのリンカー、５３４個のヌクレオチドのＰＧＫプロモーター、公表されているＣＦＴＲ配列（リオーダンら（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁）、２１個のヌクレオチドのリンカー、および１１個のヌクレオチドのリンカーにつながった２３個のヌクレオチドの合成ＢＧＨポリＡ付加シグナル（順に５’から３’方向）で置換した。該組み換え分子の５’末端の形態を図３４に示す。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲのゲノムの３’末端において、ヌクレオチド３２８１５ないし３５５７７の間のＡｄ２配列が欠失されて、Ｅ４プロモーター、Ｅ４キャップ部位およびＥ４ｍＲＮＡの最初のヌクレオチド３２〜３７を保持している以外、Ｅ４のすべてのオープンリーディングフレームが除去されている。欠失された配列は、Ａｄ２のオープンリーディングフレーム６（ヌクレオチド３４０８２〜３３１７８）および合成ポリＡ付加シグナルを含むＰＣＲによるフラグメントで置換されている。該分子の３’末端の形態を図３４に示す。該分子のこのセグメントの配列が確認されるであろう。Ａｄ２ウイルスＤＮＡ配列の残りの部分は、ロバーツ，アール・ジェイ「アデノウイルスＤＮＡ」（（ダブリュ・オーバーフラー編、ボストンのマティナス・ニホフ・パブリッシング）。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲベクターの全体のサイズは３６３３６ｂｐで、Ａｄ２の全長の１０１．３％である。ＣＦＴＲ転写物は、組み換えベクターのヌクレオチド８２８、８２９および８３７において組み込まれたＰＧＫプロモーター（シンガー−サム（Singer-Sam）ら（１９８４年）ジーン第３２巻：４０９〜４１７頁）中のこれらの近接した転写開始部位の１つを開始させると予想される。ハイブリッドな５’非翻訳領域は、７２、８０または８１個のヌクレオチドのＰＧＫプロモーター領域、８６個のヌクレオチドのリンカー配列、およびＣＦＴＲ挿入物由来の１０個のヌクレオチドからなる。約４．７ｋｂの転写物を生じる転写の終結は、該組み換えベクターのヌクレオチド５５３０におけるＢＧＨポリＡ付加シグナルにより指令されると予想される。ＣＦＴＲ暗号領域は、組み換えウイルスのヌクレオチド１０１０〜５４５４、およびＰＧＫ−ＣＦＴＲ−ＢＧＨｍＲＮＡの、それそれヌクレオチド１８２、１８１または１７３ないし４６２４、４６２３または４６１５からなる（それそれに応じて転写開始部位が使用される）。ＣＦＴＲｃＤＮＡ中に、公表されたｃＤＮＡ配列（リオーダンら、上記）とは異なる２つの相違がある。もとの公表配列における誤りであったＣＦＴＲｃＤＮＡ（公表ｃＤＮＡ配列と対等）の位置１９９０におけるＡからＣへの変化、および位置９３６において導入されたＴからＣへの変化である。位置９３６における変化は、翻訳上は影響ないが、細菌プラスミドにおいて増殖する際にｃＤＮＡの安定性を増大させる（グレゴリーら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁；およびチェングら（１９９０年）セル第６３巻：８２７〜８３４頁）。予想ＣＦＴＲ転写物の３’比翻訳領域は、２１個のヌクレオチドのリンカー配列および約１０個のヌクレオチドの合成ＢＧＨポリＡ付加シグナルからなる。ＣＦＴＲの活性を、電気医学的方法により測定することができるが、特に、発現レベルが低い場合には、生化学的または免疫細胞化学的に検出することは比較的困難である（グレゴリーら、上記；およびデニングら（１９９２年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジ一第１１８巻：５５１〜５５９頁）。それゆえ、ＳＶ４０Ｔ抗原由来の核局在化シグナルに融合したイー・コリ（E.coli）・β− ガラクトシダーゼ蛋白をコードしている高発現レベルのレポーター遺伝子を構築した。レポーター遺伝子の転写は、強力なＣＭＶ初期遺伝子の構成的プロモーターにより行われる。詳細には、ヌクレオチド３５７〜３４９８の間の野生型Ａｄ２のＥ１領域を欠失させ、ＣＭＶプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードしている３２５２ｂｐのフラグメントで置換する。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲのエレメントの調節特性一般的に、該ベクターは、ＣＦＴＲをコードしているいくつかの初期アデノウイルスベクターに類似しているが、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１構築物とは３つの特別なやり方で異なる。ＰＧＫプロモーターＣＦＴＲの転写は、ＰＧＫプロモーターによるものである。これは中程度の強度しか有しないプロモーターであるが、いわゆるハウスキーピングプロモーター（house keeping promoter）であるため、該プロモーターは、おそらく低レベルの発現にもかかわらず長時間作動できるだろうと考えられた。さらに該プロモーターは、他の研究、特にレトロウイルスでの研究に使用される非常に強力ないくつかのプロモーターと比較して、「妨害」の対象になる可能性も低い。ＣＦＴＲは多く存在する蛋白でないので、発現の持続は、おそらく、高レベル発現よりも重要である。レトロウイルスベクターにおけるＰＧＫプロモーターからの発現は、長時間にわたることが示されている（アパーリー（Apperley）ら（１９９１年）ブラッド（Blood）第７８巻：３１０〜３１７頁）。ポリアデニレーションシグナルＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲは、ＣＦＴＲ暗号領域の後であってＡｄ２Ｅ１領域の蛋白IX暗号配列の前に、外来性ポリＡ付加シグナルを有している。蛋白はウイルス粒子のパケージングに必要とされると考えられているため、この暗号領域は保有された。そのうえ、蛋白IXは、それ自身のプロモーターでもって、別々の転写物から合成されるので、蛋白IXプロモーターにおいて起こり得るプロモーターの閉塞を防止するために、ＢＧＨポリＡ付加シグナルを挿入した。プロモーターの閉塞は、Ａｄ２／ＣＭＶβＧａｌが２９３細胞上でＡｄ２／βｇａｌ−１よりも低いウイルス力価で増殖するという点で問題となりうるという間接的な証拠がある。これらの構築物は、β−ガラクトシダーゼ発現に用いるプロモーターを除いては同じものである。ＣＭＶプロモーターはＥ１ａプロモーターよりもずっと強力であるため、ＣＭＶプロモーターからβ−ガラクトシダーゼＤＮＡを経て蛋白IX暗号領域通に至るまでの豊富な発現は、プロモーター閉塞により蛋白IXのそれ自身のプロモーターからの発現を減少させること、およびこのことが、得られるＡｄ２／ＣＭＶ−βｇａｌの低い力価によるという可能性がある。Ｅ４領域の変更Ａｄ２ゲノムのＥ４領域の大部分が２つの理由により欠失された。第１の理由は、ＣＦＴＲ発現に用いるベクターのサイズを縮小することである。野生型よりもずっと大きなゲノムを有するアデノウイルスベクターはパッケージング効率が低く、それゆえ、高力価で増殖することが困難である。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲにおけるＥ１およびＥ４領域の欠失の組み合わせは、野生型の１０１％にまでゲノムサイズを縮小させた。実際には、このウイルスの高力価のロットの調製が容易となる。第２の理由は、アデノウイルスベクターの安全性に関連するＥ４配列の除去である。これらの研究の目的は、可能な限り多くのウイルス遺伝子を除去してＡｄ２骨格をできるだけ多くのやり方で不活性化させることである。Ｅ４領域のＯＦ６／７遺伝子は、順次アデノウイルスのＥ２領域の活性化に必要となる細胞の転写因子Ｅ２−Ｆをコードしている（ヘムストロム（Hemstrom）ら（１９９１年）ジャーナル・オブ・ウイロロジー第６５巻：１４４０〜１４４９頁）。それゆえ、非増殖性細胞中で増殖させた場合、アデノウイルスからのＯＲＦ６／７の除去は、さらなる安全性のマージンを提供する可能性がある。一部には、Ｅ１ａが存在する場合には、網膜芽腫遺伝子産物由来のＥ２−Ｆと置き換わることができ、そのことにより、さらにＥ２転写の刺激に貢献するという理由で、Ｅ１領域の除去は、もはや、かかるベクターを無能にする。ＯＲＦ６機能は、２９３細胞におけるウイルスの産生に必須であるため、Ａｄ２のＯＲＦ６リーディングフレームをＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲベクターのＥ１−Ｅ４バックボーンの後ろに加えた。ＯＲＦ６は、アデノウイルス生活環におけるＤＮＡ複製、宿主細胞の遮断および後期ｍＲＮＡ蓄積に必要であると考えられている。Ｅ１−Ｅ４−ＯＲＦ６⁺をバックボーンとするＡｄ２ベクターは、２９３細胞において複製する。Ｅ４のＯＲＦ６領域を作動させるためのプロモーター／エンハンサーの使用は、内在性Ｅ４プロモーターである。このプロモーターは、活性化のためにＥ１ａを必要とし、Ｅ１ａコアエンハンサーエレメントおよびＳＰ１転写因子結合部位（バーク，エイ・ジェイ（Berk，A.J．）（１９８６年）アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Ann.Rev.Genet.）第２０巻：７５〜７９頁に概説されている）を含んでいる。複製開始点Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ中に存在する複製開始点のみが、Ａｄ２親ゲノム中に存在する複製開始点である。野生型Ｅ１活性と相補した場合以外は、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ配列の複製は検出されなかった。ＤＮＡ構築物を誘導するために用いるステップＡｄ２−ＯＲＦ６ＤＮＡと、ＰＧＫプロモーターにより作動させられるヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡをコードしている発現カセットを有するように加工された１０．７ｋｂのアデノウイルスならびにＥ１暗号領域に代替するＢＧＨポリＡシグナルを含むプラスミドとのインビボ組み換えにより、組み換えＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲウイルスの構築を行った。プラスミドｐＢＲＡｄ２／ＰＧＫ−ＣＦＴＲの生成をここに記載する。出発プラスミドは、ｐＢＲ３２２のＣｌａＩおよびＢａｍＨＩ部位中に挿入された約７．５ｋｂの挿入物を有し、ヌクレオチド３５６ないし３３２８の間のＡｄ２配列の欠失を伴うＡｄ２の最初の１０６８０ヌクレオチドからなる。このプラスミドは、Ｅ１欠失領域のＣｌａＩおよびＳｐｅＩ部位中に挿入されたＣＭＶプロモーターを有し、ｐＢＲＡｄ２／ＣＭＶと命名される。このプラスミドは、さらに、Ａｄ２５’ＩＴＲ）パーケージングならびに複製配列、およびＥ１エンハンサーを有している。Ｅ１プロモーター、Ｅ１ａおよび大部分のＥ１ｂ暗号領域を欠失させた。Ｅ１ｂ暗号領域の３’末端部分は、保持されていたｐＩＸプロモーターと符号する。ＣＭＶプロモーターを除去し、プラスミドＰＧＫ−ＧＣＲ由来のＣｌａＩおよびＳｐｅＩフラグメントとしてのＰＧＫプロモーターで置換した。得られたプラスミドｐＢＲＡｄ２／ＰＧＫをＡｖｒＩＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、切り取ったフラグメントをプラスミド構築物ｐＡｄ２Ｅ１ａ／ＣＦＴＲ由来のＳｐｅＩないしＢｓｔＢＩフラグメントで置換した。このプラスミド構築物は、ＣＦＴＲｃＤＮＡ、ＢＧＨポリＡシグナルおよび３３２７から１０６７０までのＡｄ２ゲノム配列を含むフラグメントを転移させた。得られたプラスミドをｐＢＲＡｄ２／ＰＧＫ−ＣＦＴＲと命名する。ＣＦＴＲｃＤＮＡフラグメントは、もともと、プラスミトｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ−９３６Ｃから制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃ１１３６IIを用いて得られたものであった。ｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ−９３６Ｃは、合成リンカーを用いてｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロジェン・コーポ（Invi torogen Corp.）社製）の多重クローニング部位中に挿入された、公表されているＣＦＴＲ配列のヌクレオチド１２３〜４６２２を含む最小のＣＦＴＲｃＤＮＡからなる。このプラスミド中のＣＦＴＲｃＤＮＡを完全に配列決定した。オープンリーディングフレーム６のみを発現するＥ４領域を伴うＡｄ２バックボーンを次のようにして構築した。ＯＲＦ６（Ａｄ２ヌクレオチド３４０８２〜３３１７８）をコードしているＤＮＡフラグメントを、ＯＲＦ６特異的ＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲにより誘導した。付加的配列を、ＰＣＲフラグメントの５’および３’末端におけるクローニング部位（それぞれ、ＣｌａＩならびにＢａｍＨＩ）、およびＯＲＦ６ｍＲＮＡの正確なポリアデニル化を確実にするための３’末端におけるポリＡ付加配列ＡＡＴＡＡＡを含むオリゴヌクレオチドにより補充した。逆方向反復塩基配列、Ｅ４プロモーター、Ｅ４ｍＲＮＡキャップ部位およびｐＯＦ６を作成するためのＥ４ｍＲＮＡの最初の３２〜３７ヌクレオチドを含むＡｄ２フラグメント（ヌクレオチド３５９３７〜３５５７７）とともに、ＰＣＲフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）中にクローン化した。ＩＴＲおよびＯＲＦ６を含むＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを用いて、ＩＴＲおよびｐＡｄΔＥ４におけるＥ４欠失を含んでいるＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを置換した。ｐＡｄΔＥ４は、ＳｐｅＩ部位から３ ’ＩＴＲに至るＡｄ２の３’末端（ヌクレオチド２７１２３〜３５９３７）を含み、プロモーターおよびポリＡシグナルをはじめとするすべてのＥ４配列（ヌクレオチド３２８１５〜３５６４１）を欠失している。得られた構築物ｐＡｄＥ４ＯＲＦ６をＰａｃＩで切断し、ＰａｃＩ（ヌクレオチド２８６１２）で消化したＡｄ２ＤＮＡとライゲーションさせた。２９３細胞をライゲーション反応物でトランスフェクションしてＥ４領域由来のオープンリーディングフレーム６のみを含むウイルスを得た。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲを用いるインビトロでの研究ヒト・ＨｅＬａ細胞、ヒト・２９３細胞、および正常ならびにＣＦのヒト・気道上皮の初代培養物をはじめとするいくつかのヒト・細胞系において、Ａｄ２− ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲがＣＦＴＲを発現する能力を試験した。一例として、ヒト・２９３細胞で得られた結果をここに示す。ヒト・２９３細胞を培養ディッシュ上で増殖させた場合、免疫沈降法およびハライド放出に関する機能的アッセイにより評価されたように（グレゴリー，アール・ジェイら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁；チェン，エス・エイチら（１９９０年）セル第６３巻：８２７〜８３４頁）、該ベクターはＣＦＴＲｃＤＮＡを転移し、ＣＦＴＲを発現することができた。より詳細には、細胞溶解物の調製法、抗ＣＦＴＲ抗体を用いる蛋白の免疫沈降法、１次元ペプチド分析およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、チェンらにより記載されている（チェン，エス・エイチら（１９９０年）セル第６３巻：８２７〜８３４頁）。チェン，エス・エイチら（１９９０年）セル第６６巻：１０２７〜１０３６頁記載のごとく、ハライド流出アッセイを行った。ｃＡＭＰにより剌激されるＣＦＴＲクロライドチャンネル活性を、５００ＩＵ／細胞のＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲで処理された２９３細胞におけるハライド感受性フルオロフォアＳＰＱを用いて測定した。フォルスコリン（２０μＭ）およびＩＢＭＸ（１００μＭ）での感染細胞の刺激によりＳＰＱ蛍光が増加し、該ベクターにより産生された機能的クロライドチャンネルの存在が示された。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲに感染したヒト・気道（鼻ポリプ）上皮細胞（ＣＦ患者由来）の初代培養物を用いたさらなる研究は、鼻ポリプ上皮細胞のＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ感染はｃＡＭＰ依存性Ｃｌ^-チャンネルの発現を引き起こすこと示した。図３５は、かかる研究から得られた結果の一例である。ＣＦの鼻ポリプ上皮細胞の初代培養物を、多重度０．３、３、および５０でＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲに感染させた。感染３日後、単層をユッシングチャンバー（Ussing chambers）中にマウントし、短絡回路電流を測定した。示された時間において、（１）１０μＭアミロライド、（２）ｃＡＭＰアゴニスト（１０μＭフォルスコリンならびに１００μＭＩＢＭＸ）、および（３）１ｍＭジフェニルアミン−２−カルボキシラートを、粘膜溶液に添加した。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲを用いるインビポでの研究ウイルス標品Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲウイルスの２種の標品を、この研究に使用した。両方とも、ジェンザイム・コーポレイション（Genzyme Corporation）のリサーチ・ラボラトリー（Research Laboratory）において調製された。ＣｓＣｌ密度勾配遠心により標品を生成し、ついで、ｔｒｉｓ−緩衝化セイラインに対して透析してＣｓＣｌを除去した。１回目の投与（ロット＃２）は、２ｘ１０¹⁰ ＩＵ／ｍｌの力価を有していた。２回目の投与（ロット＃６）は、４ｘ１０¹⁰ の力価を有していた。動物３匹のアカゲザル（Macaca mulata）を、この研究に使用した。サルＣ（＃２００４６）は体重６．４ｋｇであった。サルＤ（＃２００４７）は体重６．２５ｋｇであった。サルＥ（＃２００４８）は体重１０ｋｇであった。研究開始前に、サルをアイオワ大学において少なくとも３６０日間飼育した。研究中ずっと、サルに水およびエサを自由に与えた。動物は、異なるウイルスベクター（Ａｄ２／ＣＦＴＲ−１）に関する安全性の研究および効率の研究の一部であり、サルに、１年に３回のウイルス点滴注入を行った。サルは、本研究１１６日前にＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の点滴注入を受けていた。各ウイルス点滴注入後のＥＬＩＳＡにより検出されたように、３匹すべてのアカゲザルは、抗アデノウイルス抗体応答を有していた。本研究の結果を妨害すると考えられる既知汚染物質は存在しなかった。１１１蛍光灯照明を調節して自動的に１２時間交互の明／暗サイクルを提供した。隔離された部屋中の別々のケージに入れてサルを飼育した。厳密な呼吸および体液単離の予防措置を講じた。ウイルス投与ウイルス適用のため、ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）筋肉内注射によりサルを麻酔した。各サルの片方の鼻孔の全上皮をウイルス適用に使用した。フォーリーカテーテル（foley catheter）（サイズ１０）を各鼻孔から咽頭内へ挿入し、２〜３ｍｌの空気で膨張させ、ついで、前方に引いて後方の後鼻孔を固く閉塞した。ついで、後部のバルーンを膨らませながら、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲウイルスを右の鼻孔にゆっくりと点滴注入した。ウイルス溶液は３０分間鼻粘膜に接触したままであった。バルーンをしぼませ、カテーテルを除去し、サルを麻酔から覚醒させた。１回目の投与において、ウイルス標品は２ｘ１０¹⁰ＩＵ／ｍｌの力価を有しており、各サルに０．３ｍｌを与えた。かくして、各サルに適用した全用量は、約６．５ｘ１０⁹ＩＵであった。この全用量は、ヒトでの研究について提案した最高用量の約半分である。ＩＵ／ｋｇを基本にして考えた場合、体重６ｋｇのサルは、体重６０ｋｇのヒトに対して提案された用量の約３倍も多い用量を与えられたことになる。評価時期投与日、および感染後３、７、２４、３８、ならびに４４日目に動物を評価した。２回目のウイルス投与を４４日目に行った。サルを、４８日目、ついで、５５、６２、ならびに１２９日目に評価した。評価のために、ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）筋肉内注射によりサルを麻酔した。１回目のウイルス投与後、鼻上皮細胞を得るために、５滴のアフリン（Afrin ）（０．０５％オキシメタゾリン塩酸，シェリング−プロウ（Schering-Plough ）および１ｍｌの２％リドカインを５分間鼻粘膜に浸透させた。ついで、サイトブラシを用いて粘膜をおだやかに約３秒間こすった。咽頭上皮試料を得るために、咽頭後部を約２〜３回綿棒でこすった。得られた細胞を、ブラシまたは綿棒から２ｍｌの滅菌ＰＢＳ中へ移した。２回目のＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ投与後、サルを３週間臨床的に追跡し、４、１１および１８日目に、内側の鼻介骨の粘膜生検物を得た。動物の評価身体的徴候の異常行動の証拠について、動物を毎日評価した。餌および液体の摂取の記録を用いて食欲および全身的健康度の評価を行った。通便についても記録して下痢の可能性をチェックした。それぞれの評価時点において、直腸温度、呼吸数、および心拍数を測定した。鼻粘膜、結膜、および咽頭を視覚的に検査した。リンパ腺症について、サルをさらに検査した。血液学および血清化学サルからの静脈血を、標準的な静脈穿孔により集めた。アイオワ大学病院（Un iversity of Iowa Hospital and Clinics）でヒタチ７３７自動化学分析装置およびテクニコンＨ６自動血液学分析装置を用いて、血液／血清の分析を行った。血清学血清を得、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により抗アデノウイルス抗体力価を測定した。ＥＬＩＳＡ用に、０．ＩＭＮａＨＣＯ₃中の充填アテノウイルス（カリフォルニア州サンジェゴのリー・バイオモレキュラー・リサーチ・ラボラトリーズ（Lee Biomolecular Research Laboratories）製）（５０ｎｇ／ウェル）を、９６ウェルプレート上に、４℃で一晩コーティングした。適当に希釈した試験試料（１／５０希釈から開始）を添加した。試料を１時間インキュベーションし、プレートを洗浄し、ついで、ヤギ・抗ヒトＩｇＧＨＲＰ結合物（ペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソン・イミュノリサーチ・ラボラトリーズ（Jackson ImmunoReaearch Laboratories）製）を添加し、１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社製）を３０分間添加した。４．５ＭＨ₂ＳＯ₄で反応停止し、モレキュラー・ディバイス（Molecular Device）社製のマイクロプレートリーダーで４９０ｎｍにおいて読み取った。はじめの希釈率の逆数と最後のウェル（ＯＤ＞０．１００）の希釈率の逆数から力価を計算した。サルから鼻洗浄物を得、１／４希釈から始めて、抗アデノウイルス抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。鼻洗浄物鼻洗浄物を得て中和抗体として作用しうる分泌抗体の存在可能性について試験した。３ｍｌの滅菌ＰＢＳをサルの鼻腔中に点滴注入し、液体を重力により集めた。洗浄物を１０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を、抗アデノウイルスおよび中和抗体測定に用いた。細胞学サイトブラシで鼻粘膜を約３秒間ゆるやかにこすることにより、サルの鼻上皮から細胞を得た。得られた細胞をブラシから２ｍｌのＰＢＳ中へ落とした。細胞懸濁液を５０００で５分間遠心分離し、１０⁶個／ｍｌとなるよう２９３培地に再懸濁した。サイトスピンを用いて細胞懸濁液４０μｌをスライドグラス上に置いた。サイトスピンスライドをライト染色し、光学顕微鏡を用いて細胞の種類を分析した。Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＦＫ−ＣＦＴＲの培養感染性ウイルス粒子の存在を評価するために、サルの鼻のブラッシング物および咽頭の綿棒かきとり物を用いた。上清４５μｌを２系にして２９３細胞に添加した。２９３細胞は５０％集密で使用され、９６ウェルプレートに接種された。２９３細胞を３７℃で７２時間培養し、ついで、等部のメタノールおよびアセトン混合物で１０分間固定し、ＦＩＴＣ標識抗アデノウイルスモノクローナル抗体（アリフォルニア州テメクラのケミコン，ライト・ダイアグノスティクス（Chem icon，Light Diagnostics）社製）とともに３０分間インキュベーションした。陽性の核免疫蛍光は陽性培養であると解釈された。ＣＦＴＲ検出のための免疫細胞化学ブラッシングにより細胞を得た。細胞懸濁液８０μｌを遠心分離し、ゼラチン被覆スライド上に置いた。スライドを風乾し、ついで、４％パラホルムアルデヒドで固定した。０．２％トリトン−Ｘ（Triton-X）（イリノイ州ロックフォードのピアス（Pierce）社製）で透過性にし、ついで、５％ヤギ・血清（ミズーリ州のシグマ社製）で６０分間ブロッキングした。モノクローナル抗体（Ｍ１３−１、Ｍ１−４およびＭ６−４）（グレゴリーら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁；デニングら（１９９２年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第１１８巻（３）５５１〜５５９頁；デニングら（１９９２年）ネイチャー第３５８巻：７６１〜７６４頁）の貯留物を添加し、１２時間インキュベーションした。１次抗体を洗浄し、抗マウスビオチン化抗体（カリフォルニア州フォスターシティーのバイオメダ（Biomeda）社製）を添加した。洗浄後、２次抗体ストレプトアビジンＦＩＴＣ（カリフォルニア州フォスターシティーのバイオメダ社製）を添加し、レーザースキャンニング共焦顕微鏡でスライドを観察した。生検安全性に関する組織学的証拠を評価するために、以前記載されたようにして（ザブナーら（１９９３年）ヒューマン・ジーン・セラピー（印刷中））、２回目のウイルス投与後、４、１１および１８日目に、鼻の内側の鼻介骨生検物を得た。鼻の生検物を４％ホルムアミドで固定し、Ｈ＆Ｅ染色切片を検査した。結果効率の研究ＣＦＴＲの存在を直接評価するために、ブラッシングにより得た細胞を、サイトスピンによりスライド上に塗り、ＣＦＴＲに対する抗体で染色した。Ａｄ２− ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲに曝露された細胞において陽性反応が明確に示された。当該試料を知らない検査者により評価された場合に、免疫細胞化学により細胞を陽性であると評点した。感染前に得た細胞および他のサルから得た細胞を陰性対照として用いた。図３６Ａ〜３６Ｄ、３７Ａ〜３７Ｄおよび３８Ａ〜３８Ｄは、各サルからの例を示す。安全性の研究サルは、ウイルス感染または炎症の臨床的徴候を示さなかった。３、４、７日目またはその後の毎週の検査において、目に見える異常はなかった。身体検査によっても、発熱、リンパ腺症、結膜炎、鼻風邪、頻呼吸または頻脈は、いかなる時点においても示されなかった。咳、くしゃみまたは下痢はなかった。サルは発熱がなかった。食欲および体重は、いずれのサルにおいても、ウイルス投与により影響を受けなかった。データを図３９Ａ〜３９Ｃにまとめてある。生きたウイルスの存在を、各鼻孔および咽頭の綿棒かきとり物ならびにブラッシング物由来の細胞懸濁液上清において試験した。各上清を用いてウイルス感受性の２９３細胞系を感染させた。生きたウイルスはいかなる時点においても検出されなかった。生きたウイルスの急激な消失は、ウイルス複製がないことを示唆する。完全血の血球数、沈降速度、および臨床化学の結果を図４０Ａ〜４０Ｃに示す。全身的炎症応答または臨床化学の他の異常の証拠はなかった。鼻上皮のブラッシング物から得られたライト染色細胞（サイトスピン）の細胞学的試験により、上皮炎症を評価した。感染した鼻孔由来の好中球およびリンパ球のパーセンテージを、対照鼻孔のパーセンテージおよび４匹の対照サルから得られた値と比較した。それぞれの評価日において、鼻ブラッシング物由来の細胞のライト染色を行った。好中球およびリンパ球は、すべての時点において、全細胞の５％未満であった。データを図４１に示す。該データは、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ投与は、ウイルス投与後のいかなる時点においても、２回目のウイルス投与期間でさえも、炎症細胞の分配および下図の変化を引き起こさなかったことを示す。独立した病理学者が２回目のＡｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ投与後に得た生検スライドを検査したところ、炎症または他のいかなる細胞変性効果の証拠は見いだされなかった。図４２から４４は、各サルからの例を示す。図４５Ａから４５Ｃは、３匹すべてのサルが、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲの１回目の投与前に、アデノウイルスに対する抗体力価を発現していたこと（ザブナーら（１９９３年）ヒューマン・ジーン・セラピー（印刷中））を示す。ＥＬＩＳＡにより測定される抗体力価は、１回目および２回目の投与後１週間のうちに上昇し、２４日目にピークとなった。ＥＬＩＳＡまたは中和アッセイによっては、抗アデノウイルス抗体は、どのサルの鼻洗浄物においても検出されなかった。これらのデータは、ＣＦＴＲをコードしている組み換えアデノウイルス（Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲ）がサルの気道上皮においてＣＦＴＲｃＤＮＡを発現する能力を示すものである。１回目のウイルス投与後、これらのサルを臨床的に追跡したが、併発症は観察されなかった。安全性の研究は我々を勇気づける。ウイルス複製の証拠は見いだされず、感染性ウイルスはすみやかに除去された。ＣＦ治療におけるアデノウイルスベクターに関する他の考えは、炎症応答の可能性である。データは、ウイルスは抗体応答を発生させたが、これにもかかわらず、全身的または局所的炎症応答は観察されなかったことを示す。ブラッシングおよび綿棒により得られた細胞は、ウイルス適用により変化しなかった。これらのサルを、前以てＡｄ２／ＣＦＴＲ−１の３回曝露しておいたので、これらのデータは、少なくとも５回連続したアデノウイルスに対する気道上皮の曝露は有害な炎症応答を引き起こさないことを示すのもである。これらのデータは、Ａｄ２−ＯＲＦ６／ＰＧＫ−ＣＦＴＲが有効にＣＦＴＲｃＤＮＡを気道上皮に転移させ、ＣＦＴＲ発現を指令しうることを示す。これらのデータはさらに、転移および発現が霊長類において安全であることを示す。均等物当業者は、常用される実験以上のものを用いずに、本明細書記載の本発明の特別な具体例に対する多くの均等物を認識するであろうし、あるいは確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の請求の範囲に包含されることを意図される。配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：グレゴリー，アール・ジェイ、アルメンタノ，ディー、クーチャー，エル・エイ、スミス，エイ・イー（ｉｉ）嚢胞性線維症に対する遺伝子治療（ｉｉｉ）配列の数：９（ｉｖ）連絡先：（Ａ）住所：レイハイブ・アンド・コックフィールド(LAHIVE & COCKFIELD) （Ｂ）通り名：６０ステイト・ストリート，スイート５１０(60STATE STREET,SUITE 510) （Ｃ）都市名：ボストン（Ｄ）州名：マサチューセッツ（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：０２１０９（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：（Ａ）媒体形態：フロッピー・ディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ＡＳＣＩＩ（ｖｉ）現在の出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：１９９３年１２月２日（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先の出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０７／９８５，４７８（Ｂ）出願日：１９９２年１２月２日（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）代理人等の情報（Ａ）氏名：ハンリー，エリザベス・エイ（Hanley，Elizabeth A.）（Ｂ）登録番号：３３，５０５（Ｃ）代理人等における整理番号：ＮＺＩ−０１４ＣＰ２ＰＣ（ｉｘ）テレコミュニケーションの情報（Ａ）電話番号：（６１７）２２７−７４００（Ｂ）ファックス番号：（６１７）２２７−５９４１（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：６１２９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：ｃＤＮＡ（ｉｘ）特徴：（Ａ）特徴を示す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１３３．．４５７２（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１４８０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：（２）配列番号：３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５６３５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：（２）配列番号：４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：（２）配列番号：５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２９塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：（２）配列番号：６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：（２）配列番号：７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：（２）配列番号：８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３４塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：（２）配列番号：９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子形態：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ１２Ｎ 5/10 (31)優先権主張番号０８／１３６，７４２ (32)優先日 1993年10月13日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者クーチャー，ラリー・エイアメリカ合衆国01701マサチューセッツ州フラミンガム、サークル・ドライブ67番 (72)発明者スミス，アラン・イーアメリカ合衆国02181マサチューセッツ州ウェルスレイ、クリーブランド・ロード88 番【要約の続き】ベクターは、偽アデノウイルス（ＰＡＶ）である。ＰＡＶｓは、潜在的に有害なウイルス遺伝子を含んでおらず、理論上、約３６ｋｂの外来物質のための容量があり、適度に高力価で産生ることができ、分裂性および非分裂性のヒト標的細胞系に対する親のアデノウイルスの屈性を保持している。

Claims

【特許請求の範囲】１．ウイルス複製の初期段階に必要とされるゲノムのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠失しており、対象とする遺伝物質により置換されている２型アデノウイルス血清型のゲノムからなるアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。２．対象とする遺伝物質が嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡである請求項１記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。３．さらに対象とする遺伝物質に作動可能に結合したＰＧＫプロモーターからなる請求項１記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。４．表II（配列番号：３）に示すヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する請求項２記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。５．逆方向末端反復ヌクレオチド配列、十分な複製ならびにパッケージングに必要な最小限のヌクレオチド配列および対象とする遺伝物質からなるアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。６．図１７に示す２型アデノウイルス配列を有する請求項５記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。７．さらに対象とする遺伝物質に作動可能に結合したＰＧＫプロモーターからなる請求項５記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。８．対象とする遺伝物質が、嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡ、因子VIIIをコードしているＤＮＡおよび因子IXをコードしているＤＮＡからなる群より選択される請求項５記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。９．オープンリーディングフレーム６以外のすべてのＥ４オープンリーディングフレームを欠失したアデノウイルスゲノムからなり、さらに対象とする遺伝物質からなるアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。１０．さらに対象とする遺伝物質に作動可能に結合したＰＧＫプロモーターからなる請求項９記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。１１ウイルス複製の初期段階に必要とされるゲノムのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠失している請求項９記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。１２．Ｅ３領域が欠失している請求項９記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。１３．オープンリーディングフレーム３以外のすべてのＥ４オープンリーディングフレームを欠失したアデノウイルスゲノムからなり、さらに対象とする遺伝物質からなるアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。１４．ウイルス複製の初期段階に必要とされるゲノムのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠失している請求項１３記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。１５．さらに対象とする遺伝物質に作動可能に結合したＰＧＫプロモーターからなる請求項１３記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。１６．Ｅ３領域が欠失している請求項１３記載のアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクター。１７．嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡからなる遺伝子治療ベクターを患者の肺の気道に投与することからなる患者における嚢胞性線維症の治療または予防方法。１８．遺伝子治療ベクターが、ウイルス複製の初期段階に必要とされるゲノムのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠失されており、嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡにより置換されている２型アデノウイルス血清型のゲノムからなるアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターである請求項１７記載の方法。１９．遺伝子治療ベクターが、さらに嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡに作動可能に結合しているＰＧＫプロモーターからなる請求項１７記載の方法。２０．遺伝子治療ベクターが、アデノウイルスの逆方向末端反復、十分な複製ならびにパッケージングに必要な最小限の配列および嚢胞性線維症伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡからなるアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターである請求項１７記載の方法。２１．遺伝子治療ベクターが、さらに嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡに作動可能に結合しているＰＧＫプロモーターからなる請求項２０記載の方法。２２．遺伝子治療ベクターが、オーブンリーディングフレーム６以外のすべてのＥ４オープンリーディングフレームを欠失したアデノウイルスゲノムからなり、さらに嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡからなるアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターである請求項１７記載の方法。２３．遺伝子治療ベクターが、さらに嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡに作動可能に結合しているＰＧＫプロモーターからなる請求項２２記載の方法。２４．遺伝子治療ベクターが、オープンリーディングフレーム６以外のすべてのＥ４オープンリーディングフレームを欠失したアデノウイルスゲノムからなり、ウイルス複製の初期段階に必要とされるゲノムのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域を欠失しており、さらに嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡからなるアデノウイルスに基づく遺伝子治療ベクターである請求項１７記載の方法。２５．遺伝子治療ベクターが、さらに嚢胞性線維症経膜伝導レギュレーターをコードしているＤＮＡに作動可能に結合しているＰＧＫプロモーターからなる請求項２４記載の方法。