DE10045687B4

DE10045687B4 - Expressionskassetten und Adenovirusvektoren

Info

Publication number: DE10045687B4
Application number: DE2000145687
Authority: DE
Inventors: Leopold Prof. Dr. Döhner; Dietmar Dr. Becher; Salah Dr. Salim
Original assignee: MICROMUN PRIVATES INST fur MI; Micromun Privates Institut fur Mikrobiologische Forschung Biotechnikum Greifswald GmbH
Current assignee: MICROMUN PRIVATES INST fur MI; Micromun Privates Institut fur Mikrobiologische Forschung Biotechnikum Greifswald GmbH
Priority date: 2000-09-15
Filing date: 2000-09-15
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2020-09-16
Also published as: DE10045687A1; WO2002022800A2; WO2002022800A3; AU2002221595A1

Abstract

Expressionskassette enthaltend in operativer Verbindung mindestens die Nucleotide 3515 bis 3611 und 4028 bis 4090 als regulatorische Sequenzen des Polypeptid IX-(pIX)-Gens von Human-Adenovirus der Gruppe C und eine ein Fremdpeptid oder Fremdprotein codierende Nucleinsäure.

Description

Die Erfindung betrifft eine Expressionskassette, diese enthaltende Vektoren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Expressionsvektoren, die aus dem Genom von Adenoviren abgeleitet sind.

Virale Vektoren ermöglichen die Expression exogener Nucleotidsequenzen in eukaryontischen Zellen und damit sowohl die Expression von Proteinen als auch deren post-translationale Modifikationen, die für die Wirksamkeit der Proteine von Bedeutung sind. Eine hierfür geeignete Virenart sind die Adenoviren. Sie können viele Arten von Zellen infizieren, weshalb sie sowohl für die Gentherapie als auch für die Expression von Fremdproteinen in Betracht gezogen wurden. Es sind etliche Gruppen von Adenoviren bekannt, z.B. solche, die Hunde, Affen oder Menschen infizieren. Von den Humanadenoviren werden Subtypen nach Neutralisationsreaktionen eingeteilt. Die Adenoviren vom Typ Ad2 und Ad5 wurden besonders intensiv untersucht und das Genom von Adenovirus Ad5 wurde vollständig sequenziert.

Die Sequenz ist bei der Genbank (EMBL) unter der Zugangsnummer M73260 zugänglich. Alle im Folgenden angegebenen Nukloeotid-Positionen von Adenovirus-DNA beziehen sich auf diese veröffentlichte Sequenz.

Der Infektionszyklus von Adenovirus wird in frühe und späte Phasen unterteilt und wichtige für die Infektion notwendige Proteine werden je nach ihrer Funktion in der frühen oder späten Phase mit E oder L bezeichnet. Für die Expression der Viren-DNA wichtige Proteine sind unter anderen die Proteine der E1-, E2- und E4-Region, wobei E1 entscheidend ist für die Replikation. Das Gen für das Polypeptid IX (pIX) liegt als eigenständige Transkriptionseinheit innerhalb der E1-Region und spielt unter anderem eine Rolle beim Aufbau der Virushülle. Die E3-Region ist für die Replikation nicht erforderlich. Daher ist die Region E3 ein bevorzugter Bereich des Virengenoms, um Fremd-DNA zu insertieren.

Die Expression des Adenovirus Typ5 pIX Gens setzt das Vorhandensein des 21 kDa Proteins der E1b Region aus Adeno5 voraus (Babiss and Vales, 1991). Dies ist im Fall der Verwendung eines Wildtyp Adeno5 Virus ohne Deletionen in der E1 b Region gewährleistet oder wird bei Verwendung von E1 deletierten Viren durch den Einsatz von Rezipientenzelllinien, die die Gene der E1 Region in ihr Genom integriert haben und die entsprechenden Proteine exprimieren (auf 293 basierende Zelllinien) erreicht.

Die begrenzte Kapazität von Adenoviren zur Aufnahme von zusätzlicher DNA (in etwa nur bis zu 5% der Genomgröße), erfordert es in der Regel, kompensierende Deletionen durchzuführen, die einerseits die Stabilität und Replikation des Virus nicht stören und andererseits groß genug sind, damit Nucleotide insertiert werden können, die gewünschte Proteine codieren. Für Deletionen wurden neben der Region E3 auch Deletionen in den Regionen E1, E2 und E4 in Betracht gezogen, wobei diese Deletionen ermöglicht werden, indem die deletierten Viren in Zelllinien gezüchtet werden, die entsprechenden Virusgene in ihr Genom integriert haben.

Derartige Zelllinien sind bekannt und in der Literatur beschrieben. Verwendet wird zum Beispiel die Zelllinie 293, die im Handel erhältlich ist, und z.B. in US-A 58 91 690 bzw. von Lochmuller et al. (in Hum. Gene Ther. 5:1485-1491, 1994) beschrieben wird. Bei Viren mit deletiertem pIX Gen wird als Phänotyp eine verringerte Thermostabilität und eine Verringerung der DNA-Aufnahmekapazität auf 2000bp unter der normalen Genomgröße angegeben (Caravokyri and Leppard, 1995). Dieses Gen wird daher für Insertionen von Fremd-DNA nicht inbetracht gezogen.

Expressionsplasmide, die den Promotor des pIX-Gens von menschlichem Adenovirus-Typ 12 in Kombination mit dem Chloramphenicolacetyltranferase-Gen enthalten, wurden bereits in den Datenbanken HCA PLUS (113:185984), BIOTECHABS (1984:09949) und MEDLINE (84170273) offenbart. Der Promotor des pIX-Gens von Adenovirus-Typ 12 ist jedoch sehr schwach und daher für die Expression von Fremdproteinen nicht geeignet.

Weiterhin wurden in WO 99/25861 adenovirale Vektoren beschrieben, die so ausgebildet sind, dass Rekombinationsereignisse vermieden werden. Es sollten Plasmide auf Basis von Adenovirus bereitgestellt werden, die eine schnelle und effiziente Produktion rekombinanter Adenoviren zulassen und die therapeutisch verwendet werden können. Das Grundprinzip gemäß WO 99/25861 ist es, im Adenovirusvektor ein größeres DNA-Stück zu deletieren, als dass das in die Wirtszellen zur Komplementierung der Deletion integriert wurde.

Auch in US 5932210 werden Expressionskassetten und adenovirale Vektoren beschrieben, die Sequenzen aus dem pIX-Gen in operativer Verbindung mit Fremd-DNA aufweisen, wobei jedoch auf jeden Fall vermieden werden soll, dass ein biologisch aktives Protein IX oder ein Fragment davon erzeugt wird. Bevorzugt soll daher auch die Polyadenierungsstelle vom Protein IX deletiert werden. Als Promotor wird hier bevorzugt der CMV-Promotor verwendet, nicht jedoch der pIX-Promotor.

Auch WO 95/11984 befaßt sich mit Adenovirusvektoren, bei denen allerdings das Polypeptid IX-Gen soweit möglich entfernt werden soll, um eine Rekombination zu vermeiden. Als Promotor wird bevorzugt der CMV-Promotor verwendet, nicht jedoch der p IX-Promotor.

Es wurden bereits viele Expressionssysteme auf Basis von Adenoviren entwickelt, die jedoch noch nicht voll befriedigen. Häufig treten Probleme auf, die auf eine Verringerung der Vitalität und das Auftreten von genomischen Instabilitäten zurück zu führen sind und letztendlich zu reduzierten Proteinausbeuten führen.

Es war nun Aufgabe der Erfindung, ein neues Expressionssystem auf Basis von Adenovirus bereitzustellen, das hohe Expressionsraten liefert. Darüber hinaus war es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ohne Anwendung von Ligationen in einfacher Weise gentechnisch veränderte Adenoviren bereitgestellt werden können, die Fremd-DNA exprimieren können.

Die Aufgabe wird gelöst mit den in den Ansprüchen beschriebenen Expressionssystemen und Vektoren sowie dem beanspruchten Verfahren.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Verwendung der regulatorischen Sequenzen des Polypeptid IX-Gens, im Folgenden pIX bezeichnet, zu einer erhöhten Expressionsrate führt. Die regulatorischen Sequenzen von pIX werden daher erfindungsgemäß für die Expression von Fremdproteinen in Adenovirus verwendet.

Erfindungsgemäß werden daher Expressionskassetten bereitgestellt, die in operativer Verbindung neben der Nucleotidsequenz für eine zu experimentierende Fremd-DNA die regulatorischen Sequenzen des Polypeptid IX-Gens von Adenovirus enthalten.

Adenoviren, deren Genom für die erfindungsgemäßen Kassetten und Vektoren inbetracht kommt, sind insbesondere Hunde-, Affen- und Human-Adenoviren und bevorzugt Human-Adenoviren der Gruppe C, insbesondere der Subtypen 1, 2, 5 oder 6, oder der Subtypen 3, 4, 7 oder 8, besonders bevorzugt der Subtypen 2 oder 5.

Als "regulatorische Sequenzen", werden erfindungsgemäß zumindest Promotor und Terminator verwendet. Die Sequenzen können aber weitere Nucleotide einschließen, die zur Aktivitätssteigerung oder Stabilität beitragen, oder auch Enhancer. Der Promotor von pIX umfaßt dabei mindestens die Sequenz zwischen den Positionen 3515 und 3611 des Adenovirusgenoms, während der Terminator die Nucleotide an den Positionen 4028 bis 4090 umfaßt. Die entsprechenden analogen Abschnitte anderer Adenoviren können für die erfindungsgemäßen Kassetten ebenfalls verwendet werden. Sie lassen sich durch Analogie leicht auffinden.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette enthält neben den regulatorischen Sequenzen zu exprimierende Fremd-DNA. Unter dem Ausdruck "Fremd-DNA", wie er hier verwendet wird, soll jede Nucleotidsequenz verstanden werden, die natürlicherweise im Adenovirusgenom nicht vorhanden und daher fremd ist. Fremd-DNA kann Gene, Teile von Genen, fusionierte Gene, cDNA oder andere DNA-Sequenzen bedeuten, die beispielsweise Polypeptide oder Proteine oder auch RNA oder Antisense-RNA codieren. Fremd-DNA kann auch ein Reportergen sein. Die Fremd-DNA kann eine natürlich vorkommende, gentechnisch hergestellte oder chemisch synthetisierte Sequenz oder eine Kombination davon sein. Die verwendete Nucleotidsequenz ist nicht kritisch, solange sie unter dem Promotor von pIX exprimierbar ist und eine Größe hat, die die Kapazität des Adenovirenvektors nicht übersteigt.

Bevorzugt werden für die erfindungsgemäße Expressionskassette regulatorische Sequenzen des pIX-Gens von Adenoviren der Gruppe C und insbesondere von Adenovirus Typ 2 oder 5 verwendet.

Die Expressionskassette weist weiterhin in einer bevorzugten Ausführungsform an beiden Enden Nucleotide auf, die mindestens einen Teil der E3-Region von Adenovirus codieren, um die Insertion der Kassette durch homologe Rekombination in das Adenogenom zu erleichtern. Die zum Adenogenom homologen Bereiche sollten jeweils eine Länge von etwa 1000 bis 2500, bevorzugt etwa 1500 bis 2500 bp, aufweisen. Bevorzugt werden als flankierende E3-DNA-Abschnitte ebenfalls solche von Adenoviren der Gruppe C, insbesondere von Adenovirus Typ 2 oder 5 eingesetzt. Sie enden bevorzugt in originären HindIII-Schnittstellen, die als freie Enden als besonders rekombinogen angesehen werden und zum anderen eine einfache Klonierung der Kassetten ermöglichen.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten sind bevorzugt nach einem Baukastenprinzip aufgebaut, die den Austausch jeder funktionellen Untereinheit erlauben und damit verschiedensten Funktionen gerecht werden. Besonders bevorzugt Sie bestehen aus folgenden Bausteinen:

– E3 links flankierendes Fragment als HindIII-KpnI-Fragment,
– pIX-Gen-Promotor als KpnI-NcoI-Fragment,
– Fremd-DNA als NcoI-BcII-Fragment,
– pIX-Gen-Terminator als BcII-SacII-Fragment und
– E3 rechts flankierendes Fragment als SacII-XbaI-HindIII-Fragment.

Durch Substitution des Bereiches von KpnI bis SacII erhält man zum Beispiel eine Integrationskassette, mit deren Hilfe beliebige DNA in die E3-Region integriert werden kann (siehe dazu auch die Ausführungsbeispiele). Das den pIX-Gen-Promotor, den Polylinker (Fremd-DNA) und den pIX-Gen-Terminator enthaltende KpnI-SacII-Fragment kann zum Beispiel mit anderen flankierenden Fragmenten kombiniert werden und seine Integration an einer anderen Stelle im Virusgenom vorzunehmen usw.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten werden zur Insertion in Adenovirusvektoren verwendet. Da für Adenovirusvektoren in einer bevorzugten Ausführungsform eine E3-Deletion im Bereich von Position 28 308 bis 29 449 bzw. 30 471 vorgenommen wird, werden die regulatorischen Sequenzen bei besonders bevorzugten Expressionskassetten von DNA-Abschnitten des Adenovirus-Typ5-Genoms flankiert, die dieser E3-Deletion der Vektoren benachbart sind. Das bedeutet, daß bevorzugte Kassetten zum Beispiel auf einer Seite die Nucleotide von Position 26329 bis 28308 bzw. 26329 bis 28523 aus der E2/E3-Region und auf der anderen Seite (a) Nucleotide von Position 29449 bis 32012 bzw. (b) Nucleotide von Position 30471 bis 32012 enthalten.

Variante (b) dient der weiteren Erhöhung der Aufnahmekapazität des Vektors und damit der Expressionskassette. Durch Restriktion, z.B. mit XbaI, und Ligation können aus der E3-Region aus Variante (a) noch die rechts flankierenden Nucleotide zwischen Position 29449 und 30471 deletiert werden. Durch diese weitere, kompensierende Deletion erhöht sich die Aufnahmekapazität der Expressionskassetten von ca. 980 bp auf ca. 2000 bp, sodaß bei einer Insertion dieser Größe dann die normale Genomgröße des Adenovirus Typ5 (35935bp) nicht überschritten wird, sogar ohne Deletion der E1-Region. Für diesen Fall werden die die regulatorischen Sequenzen rechts flankierenden Nucleotide aus dem Bereich stromabwärts von Position 32012 gewählt.

Die hier beschriebenen bevorzugt verwendeten Ad5-Expressionsvektoren besitzen üblicherweise ein intaktes pIX Gen an der originären Genomposition, was ihre maximale Aufnahmekapazität sogar bis ca. 4000bp erhöht. Die weitere Erhöhung der Aufnahmekapazität durch kompensierende Deletionen in weiteren bekannten Regionen des Adenovirusgenoms möglich. Es können daher Expressionskassetten zur Verfügung gestellt werden, die insertiert in Adenovirus exprimiert werden können, die codierende DNA bis zu einer Größe von mehr als 4 kb und sogar bei Ausnutzung aller möglichen Deletionen, bis 7 oder 8 kb enthalten.

Beispiele für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten und deren Herstellung sind im experimentellen Teil beschrieben. So wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Expressionskassette bereitgestellt, die ein Reportergen enthält, die dann für ein Verfahren zur ligationslosen Herstellung eines Expressionssystems dienen kann. In diesem Fall ist die zu exprimierende Nucleotidsequenz ein Reportergen. Reportergene sind an sich bekannt und der Fachmann kann das jeweils geeignete hierfür auswählen. Ein Beispiel für ein Reportergen, das erfindungsgemäß bevorzugt verwendet wird, ist eine Sequenz, die das grün fluoreszierende Protein "GFP" codiert.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können in an sich bekannter Weise in bakteriellen Vektorplasmiden (allgemeine Klonierungsvektoren wie pBR322 oder pUC19) in Escherichia coli vermehrt und aus dem Vektorplasmid durch Spaltung mit Restriktions-Endonucleasen, z.B. HindIII, als lineare DNA-Fragmente (d.h. in Form der Expressionskassette) isoliert werden.

Um die Herstellung einer Expressonskassette mit einer zu exprimierenden Nucleotidsequenz zu erleichtern, wird erfindungsgemäß eine Expressionskassette bereitgestellt, die die regulatorischen Sequenzen des Polypeptid IX-Gens von Adenovirus aufweist und zwischen Promotor und Terminator eine Insertionsstelle hat, in die dann eine zu exprimierende Sequenz eingesetzt werden kann. Diese Insertionsstelle wird von einer Sequenz gebildet, die Schnittstellen für verschiedene Restriktionsendonucleasen aufweist. Durch geeignete Auswahl der Schnittstellen bei dieser "leeren" Kassette und indem bei der einzusetzenden Nucleotidsequenz entsprechende Schnittstellen vorgesehen werden, kann die Insertion in der richtigen Richtung bewirkt werden, sodaß die insertierte DNA korrekt abgelesen werden kann. Eine oder beide Restriktionsschnittstellen können dabei in an sich bekannter Weise durch Fill-in-Reaktionen in stumpfe Enden umgewandelt werden.

Bevorzugt ist daher die Insertionsstelle ein Polylinker, der verschiedene unikale Schnittstellen bereitstellt, um eine gerichtete Insertion zuzulassen. Solche Polylinkersequenzen sind an sich bekannt und die im Stand der Technik bekannten Sequenzen können hierfür verwendet werden. Ein Beispiel ist die in dem Plasmid pSL1180 enthaltene Insertionssequenz.

Ein Beispiel für eine erfindungsgemäße Kassette ist im experimentellen Teil beschrieben und als Plasmid hinterlegt. Bei dieser Kassette, die ausgehend von einem Adenovirusgenom-Fragment erhalten wurde, sind aufeinanderfolgend an der Stelle der E3-Region des Ursprungsfragments der Promoter des Adenovirus Typ5 pIX Gens (Position 3515 bis 361 1), eine modifizierte Insertionsstelle (NcoI–BclI wie im Polylinkerfragment des bakteriellen Klonierungsvektors pSL1180, J. Brosius, 1998) zur gerichteten Insertion eines Leserahmens des zu exprimierenden Fremdgens, und der Terminator des Adenovirus Typ5 pIX Gens (Position 4028 bis 4090), der downstream in einer synthetischen XbaI-SacII Schnittstelle endet, angeordnet. Die regulatorischen Sequenzen des pIX Gens werden damit zusätzlich zum originären pIX Gen in das Ad5 Genom eingebracht, sodaß das für die Funktion wichtige Gen erhalten bleibt und die Kapazität für Fremd-DNA durch diese Manipulationen nicht eingeschränkt wird.

Weitere Beispiele für "leere" Kassetten und deren Herstellung sind ebenfalls im experimentellen Teil beschrieben und verschiedene Ausführungsformen wurden bei der DSM als Plasmide mit den Hinterlegungsnummern DSM 13703, DSM 13704, DSM 13705 und DSM 13706 hinterlegt.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten dienen dazu, Fremd-DNA in Adenovirus, das als Vektor verwendet wird, zu insertieren. Sie werden daher in an sich bekannter Weise zur Herstellung von Adenovirus-Expressionsvektoren zur Expression gewünschter Peptide und Proteine verwendet. Sie sind auch zur Insertion in übliche Vektoren, wie sie allgemein auf dem Gebiet der Gentechnik verwendet werden, geeignet. Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können z.B. zuerst in einen E. coli-Vektor eingesetzt werden, um die Kassette zu amplifizieren. Anschließend kann dann der amplifizierte Vektor gewonnen und die Kassette wieder daraus ausgeschnitten werden, um dann in Adenovirusgenom zur Expression in eukaryontischen Zellen eingesetzt zu werden. Vektoren, die zur Amplifikation der Expressionskassette in Mikroorganismen geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht näher erläutert zu werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren erfolgt durch Einsetzen einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in die geeignete Stelle des Adenovirusgenoms. Die Insertion erfolgt in an sich bekannter Weise. Der Insertionsort bzw. der Ort der substituierenden Deletion und die Größe des deletierten Teils werden abhängig von der ausgewählten Expressionskassette bestimmt.

Für die Expression des gewünschten Peptids oder Proteins werden eukaryontische Zellen mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor infiziert. Es kommen eine Vielzahl von Zellen tierischen und menschlichen Ursprungs in Betracht, die von Adenovirus infiziert werden könnnen und es wird die für das jeweilige Peptid oder Protein geeignete Zelle ausgewählt.

Die Größe der Deletionen hängt, wie oben ausgeführt, von der Größe der Nucleotidsequenz, die exprimiert werden soll, ab. Da die Kapazität des Adenovirus für Fremd-DNA nicht sehr hoch ist, müssen bei größeren zu exprimierenden Nucleotidsequenzen größere Deletionen vorgenommen werden. Dem Fachmann sind derartige Verfahren und die für Deletionen geeigneten Bereiche bekannt.

So wird beispielsweise erfindungsgemäß ein rekombinanter "Transfervektor" auf Basis von Adenovirus Typ5 bereitgestellt, der ein Reportergen beinhaltet. Dieser Transfervektor besteht aus Adenovirusgenom oder Ad5 und trägt in der E3-Region eine Substitution, die Nucleotide umfaßt, die dem Bereich von Position 28308 bis 30471 des Ad5 Virusgenoms entsprechen. Dieser Bereich ist für die Virusvermehrung nicht essentiell und kann als kompensierende Deletion für die Unterbringung von Expressionskassetten genutzt werden. In einem der unten näher beschriebenen Ausführungsbeispiele ist dieser Bereich des Adenovirus Typ5 Genoms durch ein 2045bp großes DNA-Fragment (Bst 1107–ClaI) aus dem Plasmid pGREEN- LANTERN^TM-1 (Life Technologies), bestehend aus CMV-Promoter, Green Fluoreszenz Protein (GFP) und SV40 Terminator, bzw. durch die im folgenden beschriebene pIX-Promoter-GFP-pIX-Terminator Kassette ersetzt. Die Expression des GFP führt bei Bestrahlung mit Blau- bzw. UV-Licht zur Fluoreszens der mit rekombinanten Adenovirus Typ5 Transfervektoren infizierten Zellen. Der Vektor, der die Kassette mit CMV-Promotor enthielt, zeigte bei der Expression weniger Fluoreszens, als der Vektor, der die erfindungsgemäße Kassette enthielt. Zwei Vektoren mit der erfindungsgemäßen Kassette wurden bei der DSM mit den Hinterlegungsnummern DSM 13707 und DSM 13708 hinterlegt.

Die erfindungsgemäßen Adenovirusvektoren werden abhängig von den vorgenommenen Deletionen in beliebigen Zelllinien oder komplementierenden Zelllinien gezüchtet.

Ein vorteilhaftes System zur Expression von Proteinen oder Peptiden ist beispielsweise die Kombination eines Adenovirusvektors, bei dem die Regionen der Gene E1 und E3 und gegebenenfalls auch E2 und/oder E4 durch eine Nucleotidsequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, kompensierend ersetzt sind in Kombination mit einer Zelllinie, die die von E1 codierten Proteine bereitstellt. Derartige Zellen sind verfügbar und beispielsweise als Zelllinie 293 erhältlich.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der regulatorischen Sequenzen des Gens für Polypeptid pIX aus Adenoviren, insbesondere solche der Gruppe C, zur Herstellung von Expressionskassetten zur Expression von Fremd-DNA in Adenovirus-Expressionssystemen.

Es wurde gefunden, dass die regulatorischen Sequenzen von pIX zur Expression von Fremd-DNA in Adenoviren sehr gut geeignet sind und zu hohen Expressionsraten führen. Es sind sehr viele Expressionssysteme bekannt, auch für Adenoviren, die jedoch nicht zu befriedigenden Ausbeuten führen. Wenn jedoch die regulatori schen Sequenzen von pIX zur Expression für Fremd-DNA in Adenovirus herangezogen werden und Bedingungen bereitgestellt werden, die die Expression zulassen, werden im Vergleich zu anderen Expressionssystemen höhere Ausbeuten erzielt.

Die Gewinnung der regulatorischen Sequenzen erfolgt in an sich bekannter Weise, z.B. durch Bereitstellung von Primern und mit PCR unter Verwendung dieser Primer oder aber durch Klonierung entsprechender Genabschnitte als Restriktionsfragmente des Adenogenoms und Insertion in Plasmide, die in geeigneten Mikroorganismen vermehrt werden. Dem Fachmann sind Verfahren hierzu bekannt und diese bedürfen keiner weiteren Erläuterung.

Um die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren und allgemein Expressionssysteme ohne Ligationen herstellen zu können, wurde ein Verfahren entwickelt, das die Herstellung der Vektoren und Systeme erleichtert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Virus-Expressionssystems zur Expression von Fremd-DNA, das die folgenden Stufen umfasst:

I. Bereitstellung eines Transfervektors, der eine Expressionskassette enthält, die ein Reportergen exprimiert, wobei der Vektor aus Virusgenom abgeleitet ist, und wobei die Expressionskassette einen Teil des Virusgenoms substituiert;
II. Bereitstellung einer Expressionskassette, die regulatorische Sequenzen und die DNA für eine unter den regulatorischen Sequenzen zu exprimierende Nucleotidsequenz enthält und von DNA aus Virusgenom, die der Insertionsstelle der Kassette benachbart ist, flankiert wird,
III. Transfektion der Kassette in Zellen, in denen die DNA exprimiert werden soll,
IV. Infektion der Zellen aus Stufe III mit dem Transfervektor von Stufe I;
V. Gewinnung eines Viruslysates aus den in Stufe IV erhaltenen Zellen, das rekombinante Viren enthält, die durch Rekombination zwischen Expressionskassette und Transfervektor entstanden sind;
VI. Infektion von Zellen mit dem Viruslysat von Stufe V;
VII. Selektion der Zellen, in denen das Expressionsprodukt des Reportergens durch das Expressionsprodukt der Ziel-DNA ersetzt ist, wodurch das Expressionsprodukt des Reportergens nicht mehr nachweisbar ist und
VIII. Gewinnung von Viruslysat, das dem Virus-Expressionsvektor entspricht, aus den in Stufe VII selektierten Zellen.

Mit diesem Verfahren ist es möglich, Expressionsvektoren ohne Durchführung von Ligationen herzustellen, was die Gewinnung von Vektoren vereinfacht. Dazu wird das Expressionsprodukt eines Reportergens ausgenutzt, um einerseits die Infektion von Zellen durch Nachweis des Reportergenproduktes und andererseits den Austausch der Ziel-DNA gegen das Reportergen durch Nachweis des Verschwindens des Reportergenproduktes zu verfolgen. Dieses Verfahren gestattet es daher unter Ausnutzung von in-vivo-Rekombinationen, reproduzierbar Vektoren und andere Expressionssysteme unter Verwendung von vorbereiteten Expressionskassetten zu erzeugen, da die Insertion über Reportergen-Produkte, zum Beispiel fluoreszierende Farbstoffe, verfolgt werden kann.

Dieses Verfahren ist geeignet zur Herstellung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren daher zur Herstellung eines Adenovirus-Expressionssystems zur Expression von Fremd-DNA verwendet, das die folgenden Stufen umfasst:

1. Bereitstellung eines Transfervektors auf Basis von Adenovirus, der eine Expressionskassette in der E3-Region enthält, die ein Reportergen exprimiert und mindestens einen Teil der E3-Region des Adenovirusgenoms substituiert;
2. Bereitstellung einer Expressionskassette, die die DNA für eine unter den regulatorischen Sequenzen des pIX-Gens zu exprimierende Nucleotidsequenz enthält und von DNA aus Adenovirus flankiert wird, die homolog zur Adenovirus-DNA ist, die die Substitution in der E3-Region des Transfervektors flankiert;
3. Transfektion der Kassette in eukaryontische Zellen;
4. Infektion der Zellen aus Stufe 3 mit dem Transfervektor von Stufe 1;
5. Gewinnung eines Viruslysates aus den in Stufe 4 erhaltenen Zellen, das rekombinante Adenoviren enthält, die durch Rekombination zwischen Expressionskassette und Transfervektor entstanden sind;
6. Infektion eukaryontischer Zellen mit dem Viruslysat von Stufe 5;
7. Selektion der Zellen, in denen das Expressionsprodukt des Reportergens durch das Expressionsprodukt des Zielgens ersetzt ist, wodurch das Expressionsprodukt des Reportergens nicht mehr nachweisbar ist und
8. Gewinnung von Viruslysat, das dem Adenovirus-Expressionsvektor entspricht, aus den in Stufe 7 selektierten Zellen.

Erfindungsgemäß wird dabei als Transfervektor ein solcher Vektor verwendet, der die Sequenz des Reportergens unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen, bevorzugt den regulatorischen Sequenzen von pIX, exprimiert und außerdem an beiden Seiten Sequenzen enthält, die Sequenzen der E3-Region des Adenovirusgenoms entsprechen. Dieser Transfervektor wird zur Infektion von solchen Zellen, in denen das gewünschte Produkt der Fremd-DNA exprimiert werden soll, verwendet. Gleichzeitig werden die Zellen aber auch mit einer Kassette transfiziert, die die gewünschte Fremd-DNA mit den regulatorischen Sequenzen von pIX und flankierenden Sequenzen aus der E3-Region des Adenovirus aufweist. Die Kassette kommt in der Zelle in Kontakt mit dem Transfervektor und übereinstimmende Bereiche lagern sich aneinander, wodurch Rekombinationsereignisse möglich werden. Alle Zellen, die mit Adenovirus infiziert wurden, werden lysiert, wobei bei den Zellen, bei denen der Transfervektor unverändert erhalten geblieben ist, das Reportergenprodukt nachweisbar ist, während in den Zellen, in denen es zu einem Rekombinationsereignis gekommen ist, kein Reportergenprodukt mehr nachzuweisen ist. Das Verschwinden des Reportergenprodukts dient zur Selektion solcher Zellen, die den gewünschten Expressionsvektor mit insertierter Expressionskassette enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Reportergen das Gen für das grün fluoreszierende Protein verwendet, da dessen Fluoreszenz leicht nachzuweisen ist. Die Fluoreszenz kann dann verwendet werden, um Zellen, die fluoreszieren, von nicht fluoreszierenden Zellen zu trennen. Dies kann entweder manuell, mikroskopisch (Selektion von cytopathischen Effekten CPE aus Titrationsreihen) oder aber mit Hilfe von automatisierten Vorrichtungen, z.B. mit Hilfe eines FACS, erfolgen.

Es werden die Zellen selektiert, in denen das Reportergenprodukt nicht nachweisbar ist und aus deren Lysat kann dann der gewünschte Vektor, der die Ziel-DNA enthält, gewonnen werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auch der Transfervektor mit einem Verfahren, wie eben beschrieben, gewonnen. Dazu wird eine Expressionskassette verwendet, die einen DNA-Bereich enthält, der für ein Reportergen codiert. Dieser Bereich wird von regulatorischen Sequenzen flankiert, bevorzugt von den regulatorischen Sequenzen von pIX von Adenovirus. Außerdem weist die Kassette an den beiden Enden Sequenzen aus der E3-Region oder an die E3-Region angrenzenden Bereichen des Adenovirus auf. Es werden dann eukaryontische Zellen mit Wildtyp Adenovirus infiziert und mit der das Reportergen enthaltenden Expressionskassette transfiziert. Zellen, die mit Virus infiziert sind, werden lysiert und solche Zellen, in denen es zu einem Rekombinationsereignis zwischen der Wildtyp-DNA und der Expressionskassette gekommen ist, enthalten das Reportergenprodukt, das nachweisbar ist. Auf diese Weise können nach Selektion der Zellen, in denen das Reportergenprodukt nachweisbar ist und Gewinnung des Viruslysates Vektoren gewonnen werden, die als Transfervektoren geeignet sind.

Der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Adenovirus-Expressionsvektor, der eine zu exprimierende DNA enthält, kann dann verwendet werden, um das Expressionsprodukt herzustellen, indem in an sich bekannter Weise eukaryontische Zellen mit diesem Adenovirus-Expressionsvektor infiziert werden, die infizierten Zellen unter solchen Bedingungen, die die Expression des Fremdproteins zulassen, gezüchtet werden und anschließend das exprimierte Protein gewonnen und gegebenenfalls gereinigt wird.

Im Folgenden ist beispielhaft eine Ausführungsform des Verfahrens erläutert. Es werden Expressionskassetten in bakteriellen Vektorplasmiden (allgemeine Klonierungsvektoren wie pBR322 oder pUC19) in Escherichia coli vermehrt und aus dem Vektorplasmid durch Spaltung mit der Restriktions-Endonuclease HindIII als lineare DNA-Fragmente (Expressionskassetten) isoliert.

Die Expressionskassetten werden dann in Rezipientenzelllinienen wie 293 mittels Transfektion übertragen und die transfizierten Zellen werden anschließend mit dem GFP-Transfervektor infiziert. Während der Adenovirusinfektion und Vermehrung kommt es zu homologen Rekombinationen zwischen Sequenzen der E3 Region im Genom des GFP-Transfervektors und den flankierenden Sequenzen der Expressionskassetten. Dabei wird die GFP-Sequenz des Transfervektors durch den zu exprimierenden Leserahmen der Expressionskassette ausgetauscht.

Die Selektion rekombinanter Expressionsvektoren, die das GFP-Gen gegen das zu exprimierende Gen ausgetauscht haben, erfolgt bevorzugt, nach Infektion mit entsprechend verdünnten Lysaten, durch mikroskopische Detektion nicht fluoreszierender CPEs. Diese können nach Agaroseüberschichtung ausgestochen und zur weiteren Reinigung erneut titriert werden.

Es wird somit ein Verfahren zur Gewinnung von Proteinen bereitgestellt, mit dem eine hohe Ausbeute erzielt werden kann und wobei der für die Expression verwen dete Vektor in einfacher Weise ohne Ligationsverfahren durch in-vivo-Rekombination gewonnen werden kann.

Die Erfindung wird durch die folgenden 1 bis 8 erläutert, wobei

1 die Genkarte des Plasmids pMBAC01 (DSM 13703) zeigt, das eine leere Expressionskassette mit einem Linker enthält;

2 die Genkarte des Plasmids pMBAC02 (DSM 13704) zeigt, das eine leere Expressionskassette mit einem Linker enthält;

3 die Genkarte des Plasmids pMBAC03 (DSM 13705) zeigt, das eine leere Expressionskassette mit einem Linker enthält;

4 die Genkarte des Plasmids pMBAC04 (DSM 13706) zeigt, das eine leere Expressionskassette mit einem Linker enthält;

5 die Genkarte des Plasmids pMBAC05 (DSM 13707) zeigt, das eine Expressionskassette enthält, in die das Gen für GFP insertiert wurde;

6 die Genkarte des Plasmids pMBAC06 (DSM 13708) zeigt, das eine Expressionskassette enthält, in die das Gen für GFP insertiert wurde;

7 die Genkarte des Plasmids pMBAC31 (DSM 13709) zeigt, das eine Expressionskassette enthält, in die das Gen für das Oberflächenglykoprotein von Tollwutvirus insertiert ist (Ra-GP1) und

8 die Genkarte das Plasmids pMBAC37 (DSM 13710) zeigt, das eine Expressionskassette enthält, in die Ra-GP1 insertiert wurde.

Die in den Figuren gezeigten Plasmide wurden alle bei der DSM, Mascher oder Weg 1b, 38124 Braunschweig, hinterlegt mit den in Klammern angegebenen Hinterlegungsnummern. Die Herstellung und Verwendung der Plasmide ist in den folgenden Ausführungsbeispielen erläutert.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1
Generelle Expressionskassetten: MBAC01, MBAC02, MBAC03 und MBAC04
Zur Klonierung von Teilstücken der Expressionskassetten wurde das Plasmid pSL1180 verwendet. Als DNS-Matritze für PCR Reaktionen diente die DNS des Wildtyp Adenovirus Typ5 Stamm: Adenoid 75 (ATCC Nummer: VR-5). Einzelne Abschnitte des Adenovirus Genoms wurden mit sequenzspezifischen Primer-Oligonukleotiden, an die Sequenzen für Restriktionsenzym Erkennungsstellen angehängt wurden, durch PCR amplifiziert und in folgenden Schritten in pSL1180 kloniert:

1. Amplifikation des pIX Promoterbereiches mit dem Primerpaar BA1A/BA10 P9 Promoter Ende revers: ab Position 3611 mit 5' angehängtem NcoI Ort GAACCATGGCGGCGGCGGCTGCTGC = BA10 P9 Promoter Anfang vorwärts: ab Position 3515 mit 5' angehängtem KpnI Ort ATATAGGTACCGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGG = BA1A Klonierung als KpnI/NcoI Fragment in pSL1180 ergibt Plasmid „p1P".
2. Amplifikation der „linken" E3 flankierenden Sequenz mit dem Primerpaar: BA8/BA9 bzw. BA8A/BA9: HindIII vorwärts ab Position 26329 ATATAGAAGCTTCCGAGGTCGAAGAGG = BA9 KpnI angesetzt revers ab Position 28308 ATATAGGTACCGGGTTGAAACTGTTGTAAATCAC = BA8 KpnI angesetzt revers ab Position 28523 ATATAGGTACCTGGCCTAATACCCTAAGGGTTTTC = BA8A Klonierung als HindIII/KpnI Fragment in Plasmid p1P ergibt „p2P8", bzw. „p2P8A"
3. Amplifaktion des pIX Terminatorbereiches mit dem Primerpaar BA3C/BA4B: P IX Terminator vorwärts Primer ab Position 4028 mit angehängtem BclI-Ort TATATGATCATAAAACATAAATAAAAAACCAG = BA3C P IX Terminator Reversprimer ab Position 4090 mit angehängten XbaI und SacII Orten ATATCCGCGGTCTAGAGACAGCAAGACACTTGCTTGATCC = BA4B Klonierung als BclI/SacII Fragment in pSL1180 ergibt Plasmid „p1T".
4. Amplifikation der „rechten" E3 flankierenden Sequenz mit dem Primerpaar BA6/BA7A: SacII Ort vorwärts ab Position 29449 ATATACCCGCGGATTTGTTCCAGTCCAAC = BA6 HindIII Ort revers ab Position 32012 AGGTTAACCTCAAGCTTTTTGGAATTG = BA7A Klonierung als HindIII/SacII Fragment in p1T ergibt „p2T".
5. Gewinnung der Inserts: HindIII/NcoI aus p2P8 bzw. p2P8A
6. Gewinnung des Inserts: HindIII/BclI aus P2T
7. Gewinnung des Polylinkerfragmentes: NcoI/BclI aus pSL1180
8. Ligation des Gemisches der drei DNS-Fragmente und anschließende Spaltung mit HindIII
9. Größenfraktionierung des mit HindIII gespaltenen Ligationsansatzes im Agarosegel
10. Klonierung in, mit HindIII gespaltenes Plasmid pBR322 ergibt bei Verwendung von p2P8A als Ausgangsmaterial die leere Expressionskassette „MBAC02" bzw. im Falle der Verwendung von p2P8 als Ausgangsmaterial die leere Expressionskassette „MBAC01 ".
11. Durch Spaltung mit XbaI und Rezirkularisierung mittels Ligase können in den Plasmiden MBAC01 und MBAC02 1028bp der E3 rechts flankierenden Sequenz deletiert werden. Es entstehen die Expressionskassetten MBAC03 aus MBAC01 und MBAC04 aus MBAC02 mit entsprechend erweiterter DNS-Aufnahmekapazität.

Beispiel 2
Expressionskassetten für GFP: MBAC5 und MBAC6

1. Amplifikation des pIX Promoterbereiches mit Hilfe des Primerpaares BA 1A/BA2 Der pIX Promoter revers Primer umfaßt die Position 3611-3593. Am 5' Ende des Primers sind die ersten 16 Basen der codierenden Sequenz des GFP angehängt. GTTCCTCGCCCTTGCTCATGGCGGCGGCGGCTGCT = BA2
2. Amplifikation des pIX Terminatorbereiches mit Hilfe des Primerpaares BA4B/BA3 Der pIX Terminator vorwärts Primer ab Position 4028: Am 5' Ende des Primers sind die letzten 16 Basen (einschließlich Stopcodon) der codierenden Sequenz des GFP-Endes angehängt. CGAGCTGTACAAGTGATAAAACATAAATAAAAAACCAG = BA3
3. Erzeugung eines DNS Fragmentes mittels PCR, das aus pIX Promoter, GFP und pIX Terminator besteht. Das Plasmid pGREEN LANTERN-1 wird als DNS Matritze verwendet. Als Primer werden die PCR Produkte aus Schritt 1 und 2 eingesetzt.
4. Spaltung des PCR Produktes aus Schritt 3 mit den Restriktionsenzymen KpnI und SacII und Klonierung des 878bp großen Restriktionsfragmentes in die mit den gleichen Restriktionsenzymen gespaltenen Plasmide MBAC01 bzw. MBAC02. Dadurch werden die Expressionskassetten MBAC5 und MBAC6 erzeugt.

Beispiel 3
Expressionskassetten für GFP: MBAC15 und MBAC17
Im Plasmid MBAC01 wird durch Spaltung mit KpnI und SacII das die regulatorischen Sequenzen des pIX Gens beinhaltende DNS Fragment deletiert und durch ein KpnI/SacII Fragment des Polylinkers des Plasmides pSL1180 ersetzt. Das entstehende Plasmid wird MBA17 benannt. Aus MBA17 wird duch Spaltung mit HindIII das Insert, bestehend aus E3 links, Polylinkerfragment aus pSL1180 und E3 rechts, gewonnen und in das Plasmid pUC19 kloniert. Es entsteht das Plasmid MBA21. MBA21 besitzt im Polylinkerfragment des Plasmides pSL1180 die unikalen Spaltstellen für die Restriktionsenzyme ClaI und SnaBI.
Aus dem Plasmid pGREEN LANTERN-1 wird durch Spaltung mit Bst1107I und ClaI ein DNS Fragment gewonnen, das den GFP Leserahmen unter der Kontrolle des CMV Promoters und des SV40 Terminators beinhaltet. Da SnaBI und Bst1107I stumpfe Restriktionsspaltstellen liefern, kann das Fragment aus pGREEN LANTERN-1 in das mit SnaBI und ClaI gespaltene Plasmid MBA21 ligiert werden. Es entsteht das Expressionsplasmid MBAC13. Aus MBAC13 kann die Expressionskassette als HindIII Fragment herausgeschnitten werden und in das Plasmid pBR322 ligiert werden. Es entsteht das Expressionsplasmid MBAC15. Aus MBAC15 wird durch Spaltung mit SacII und XbaI ein 1022bp großes Fragment der E3 rechts flankierenden Sequenz deletiert und durch ein 116bp großes SacII/XbaI Fragment aus dem Polylinker des Plasmides pSL1180 ersetzt. Es entsteht das Expressionsplasmid MBAC17.
Beispiel 4
Expressionskassetten für Oberflächenglycoproteingen des Tollwutvirus:
MBAC31 und MBAC37

1. Amplifikation des pIX Promoterbereiches mit Hilfe des Primerpaares BA 1A/BA 10 P9 Promoter: ab 3515 Vorwärtsprimer mit 5' angehängtem KpnI-Ort ATATAGGTACCGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGG = BA1A P9 Promoter Ende – Rabies GP1 Anfang Reversprimer (ab 3591)5'GCAGCAGC000CGCCGCCATG3' P9 Promoter Ende 5'ATGGTTCCTCAGGTTCTTTTG3' Rabies Anfang 5'CAAAAGAACCTGAGGAACCATGGCGGCGGCGGCTGCTGC3'= BA10 Als DNS Matritze diente das Plasmid „p1P" (Ausführungsbeispiel Nr.1).
2. Im GP1 Gen des Rabiesvirus befindet sich an Position +86 ein Restriktionsort für HindIII. Um die einfache Gewinnung von Expressionskassetten durch HindIII Spaltung beibehalten zu können, wurde der HindIII Ort durch eine „silent" Punktmutation mittels PCR korrigiert. Dabei wird das Codon für Lysin AAG in AAA umgewandelt. Für diese PCR dient das eine cDNS des GP1 Gens enthaltende Plasmid : pUC18-TWG als Matritze. Als Vorwärtsprimer fungiert das PCR Produkt aus Schritt 1 und als Reversprimer wird der Mutageneseprimer BA16, der die Position +86 des GP1 Gens überdeckt verwendet. Gp1 Rabies HindIII Korrekturprimer revers: 5'CACGATACCAGACAAGCTTGGT0003' = Gp1 Originalsequenz 5'CACGATACCAGACAAACTTGGT0003' = Gp1 korrigierte Sequenz 5'000ACCAAGTTTGTCTGGTATCGTG3' = BA16 revers
3. Amplifikation des pIX Terminatorbereiches mit Hilfe des Primerpaares BA3A/BA4A P9 Terminator Reversprimer 5' bei 4090 bis 4066 mit angehängtem SacII-Ort 5'ATATCCGCGGGACAGCAAGACACTTGCTTGATCC3'= BA4A P9 Terminator Vorwärtsprimer (4028 bis 4054) mit 5' angehängtem RabiesGP-Genende 5'AAGAGTGGAGGTGAGATCAGACTGTGATAAAACATAAATAAAAAACCAGACT C3' = BA3A
4. Erzeugung eines DNS Fragmentes mittels PCR, das aus pIX Promoter, Rabies Glycoproteingen Leserahmen (von ATG bis TGA 1575bp) und pIX Terminator besteht. Als DNS Matritze diente das Plasmid pUC18-TWG, das einen c-DNS Klon der Rabiesvirus Glycoproteingen RNS trägt. Als Primer- Oligonukleotide wurden die PCR Produkte aus Schritt 2 und 3 eingesetzt.
4. Spaltung des PCR Produktes aus Schritt 4 mit den Restriktionsenzymen KpnI und SacII und Klonierung des 1735bp großen Restriktionsfragmentes in das mit den gleichen Restriktionsenzymen gespaltene Plasmid MBAC5. Es entsteht das Expressionsplasmid MBAC31. In Analogie zu MBAC17 wird in MBAC31 durch Spaltung mit SacII und XbaI ein 1022bp großes Fragment der E3 rechts flankierenden Sequenz deletiert und durch ein 116bp großes SacII/XbaI Fragment aus dem Polylinker des Plasmides pSL1180 ersetzt. Es entsteht das Expressionsplasmid MBAC37.

Beispiel 5
Erzeugung des GFP Transfervektors Ad-PGFPT.IX (Grün/weiß Selektion):
Die DNS der Expressionskassette MBAC5 wird nach Spaltung des entsprechenden Plasmides pMBAC5 mit HindIII über ein präparatives Agarosegel gereinigt und aus dem Gel eluiert. Routinemäßig werden zur Transfektion Gewebekulturplatten (6 Weil) mit einem Well-Durchmesser von 35mm verwendet. Pro Well werden 2 × 10⁵ A549 Zellen eingesetzt. Bei Verwendung von 6μl GENEJAMMER^TM (STRATAGENE) und 1μg Cassetten- DNS wurden ca 10% der eingesetzten Zellen transfiziert. Gleiche Ergebnisse konnten bei Verwendung von 3μl FuGENE ^TM 6 (Roche) erzielt werden. Sechs Stunden nach Transfektion wird das Zellmedium erneuert und es erfolgt die Infektion der Zellen mit Wildtyp Ad5 Virus (Adenoid 75) mit einer Multiplizität von 5 (1 × 10⁶ Viren pro Well). Ca. 48h nach Infektion können durch UV-Mikroskopie fluoreszierende Zellen identifiziert werden. Diese Zellen sind mit Virus infiziert und exprimieren die zuvor transfizierte Kassette. Zur Gewinnung eines Zelllysates werden die infizierten Kulturen nach 4 bis 5 tägiger Inkubation bei 37°C dreimal bei –70°C eingefroren und bei Raumtemperatur aufgetaut. Das Lysat wird auf A549 Zellen in 96 Well Platten titriert. Die Titrationsplatten werden, beginnend nach 48h, durch UV-Mikroskopie auf fluoreszierende Zellen untersucht und nach 7 Tagen Inkubation wird ein vorläufiger Virus-Endtiter durch Auszählung der cytopatischen Effekte (CPE) bestimmt. Fluoreszierende Zellen sind durch Infektion mit mindestens einem rekombinanten Virus entstanden. Damit kann der Anteil rekombinanter Viren im primären Lysat bestimmt werden. Das Verhältnis zu Wildtyp Viren beträgt durchschnittlich 1:10.000. Entsprechende Verdünnungsstufen der primären Lysate werden zur Infektion von 6Well Platten eingesetzt. Nach drei- bis fünftägiger Inkubation können fluoreszierende CPE identifiziert werden. Durch Überschichtung der Wells mit Low Gelling Point Agarose können die Bereiche mit fluoreszierenden CPE ausgestochen und in Zellmedium aufgenommen werden. Durch mechanische Homogenisierung der Agarose und 3 Frier/Tau Zyklen werden daraus sekundäre Viruslysate gewonnen in denen das Verhältnis zwischen rekombinanten und Wildtypviren durchschnittlich bei 1:300 liegt. Die sekundären Lysate werden erneut auf A549 Zellen in 96Well Platten titriert und rekombinante Einzelplaques gewonnen. Zum Ausschluß der Kontamination mit nicht rekombinierten Ad5 Viren werden die Lysate aus rekombinanten Einzelplaques durch mindestens zwei weitere Titrationspassagen gereinigt. Der durch dieses Ausführungsbeispiel beschriebene Ad5 GFP-Transfervektor (Ad-PGFPT.IX) stellt gleichzeitig den Grundtyp des Ad5 pIX Expressionsvektors dar und steht stellvertretend für das Konstruktions und Selektionsprinzip.

Claims

Expressionskassette enthaltend in operativer Verbindung mindestens die Nucleotide 3515 bis 3611 und 4028 bis 4090 als regulatorische Sequenzen des Polypeptid IX-(pIX)-Gens von Human-Adenovirus der Gruppe C und eine ein Fremdpeptid oder Fremdprotein codierende Nucleinsäure.
Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die das Peptid oder Protein codierende Nusäure an einer Insertionsstelle zwischen Promotor und Terminator des pIX-Gens mit unicalen Schnittstellen eingesetzt ist.
Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Sequenzen zusätzlich an beiden Seiten von DNA-Abschnitten aus der Adenovirus-E3-Region und sich an die E3-Region anschließenden Adenovirus-Genomabschnitten von bevorzugt je 1 bis 2,5 kb Größe flankiert sind.
Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie E3-DNA Abschnitte aus Adenovirus Typ 5 Genom enthält.
Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die E3-DNA-Abschnitte und die die E3-Region flankierenden DNA-Abschnitte Nucleotide aus dem Bereich von Position 26329 bis 28308 bzw. aus dem Bereich von Position 29449 bis 32012 von Adenovirus Typ 5 oder die analogen Genbereiche aus Adenoviren der Gruppe C enthalten.
Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie die regulatorischen Sequenzen des pIX Gens von Adenovirus Typ 5 enthält.
Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuresequenz ein Reportergen codiert.
Kassette enthaltend in operativer Verbindung mindestens die Nucleotide 3515 bis 3611 und 4028 bis 4090 als regulatorische Sequenzen des Polypeptids IX (pIX) von Adenovirus der Gruppe C und zwischen den Nucleotiden 3515 bis 3611 und den Nucleotiden 4028 bis 4090 eine Insertionsstelle für eine ein Peptid oder Protein codierende Nucleinsäure, die zwei unikale Schnittstellen aufweist.
Kassette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Sequenzen zusätzlich an beiden Seiten von DNA-Abschnitten aus dem Adenovirus-Gen E3 flankiert sind.
Adenovirusvektor bei dem zumindest ein Teil des Gens E3 durch eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 9 ersetzt ist.
Adenovirusvektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das gesamte Gen E3 durch eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 10 ersetzt ist.
Adenovirusvektor nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Nucleinsäureen aus den Genen E1, E2 und/oder E4 deletiert sind.
Adenovirusvektor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Nucleinsäureen der E1-Region deletiert sind.
Adenovirusvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß er als Fremdnucleinsäure ein Reportergen enthält.
Adenovirusvektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen eine fluoreszierende Verbindung codiert.
Adenovirusvektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Verbindung Green-Fluoreszenz-Protein (GFP) ist.
Adenovirusvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß er als Fremdnucleinsäure eine transkribierbare DNA enthält.
Expressionssystem für ein Protein bestehend aus einer Rezipienten-Zellinie und einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 17.
Expressionssystem für ein Protein bestehend aus Zellen der Zellinie A549 oder 293 und Adenovirusvektoren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, bei denen die Nucleinsäureen der E1- und E3-Region deletiert sind.
Verwendung mindestens der Nukleotide 3515 bis 3611 und 4028 bis 4090 der regulatorischen Sequenzen des Gens für Polypeptid pIX aus Adenovirus der Gruppe C zur Herstellung von Expressionskassetten zur Expression von Fremdproteinen in Adenovirus-Expressionssystemen.
Verfahren zur Herstellung eines Adenovirus-Expressionssystem zur Expression von Fremdprotein, das die folgenden Stufen umfaßt: 1. Bereitstellung eines Transfervektors, der eine Expressionskassette in der E3-Region enthält, die ein Reportergen exprimiert und mindestens einen Teil der E3-Region des Adenovirusgenoms substituiert, 2. Bereitstellung einer Expressionskassette, die mindestens die Nucleotide 3515 bis 3611 und 4028 bis 4090 als regulatorische Sequenzen des Polypeptid IX-(pIX)-Gens von Adenovirus der Gruppe C und eine unter diesen regulatorischen Sequenzen des pIX-Gens zu exprimierende Nucleinsäure enthält und von DNA aus Adenovirus flankiert wird, die homolog zu dem Teil der Adenovirus-DNA ist, die die Substitution in der E3-Region des Transfervektors flankiert, 3. Transfektion der Kassette in eukaryotische Zellen, 4. Infektion der Zellen aus Stufe 3 mit dem Transfervektor von Stufe 1 5. Gewinnung eines Viruslysats aus Zellen der Stufe 4, das rekombinante Adenoviren enthält, die durch Rekombination zwischen Expressionskassette und Transfervektor entstanden sind, 6. Infektion eukaryotischer Zellen mit Viruslysat aus Stufe 5 7. Selektion der Zellen, in denen das Expressionsprodukt des Reportergens durch das Expressionsprodukt des Zielgens ersetzt ist und damit das Expressionsprodukt des Reportergens nicht mehr nachweisbar ist und 8. Gewinnung von Viruslysat, das dem Adenovirusvektor entspricht, aus selektierten Zellen der Stufe 7.
Verwendung eines Adenovirus-Expressionssystems, das gemäß Anspruch 21 erhalten wurde, zur – Masseninfektion eukaryotischer Zellen, – Züchtung der infizierten Zellen unter Bedingungen, die die Expression des Fremdproteins zulassen, – und Gewinnung des exprimierten Proteins.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen das fluoreszierende Protein GFP codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die in Stufe 1 und/oder in Stufe 2 verwendete Expressionskassette eine Kassette nach einem der Ansprüche 1 bis 8 ist.
E.coli MBAC01 enthaltend Plasmid pMBAC01 mit einer Expressionskassette hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnr. 13703.
E.coli MBAC02 enthaltend Plasmid pMBAC02 mit einer Expressionskassette hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnr. 13704.
E.coli MBAC03 enthaltend Plasmid pMBAC03 mit einer Expressionskassette hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnr. 13705.
E.coli MBAC04 enthaltend Plasmid pMBAC04 mit einer Expressionskassette hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnr. 13706.
E.coli MBAC5 enthaltend Plasmid pMBAC5 mit einer Expressionskassette hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnr. 13707.
E.coli MBAC6 enthaltend Plasmid pMBAC6 mit einer Expressionskassette hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnr. 13708.
E.coli MBAC31 enthaltend Plasmid pMBAC31 mit einer Expressionskassette hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnr. 13709.
E.coli MBAC37 enthaltend Plasmid pMBAC37 mit einer Expressionskassette hinterlegt bei der DSM mit der Hinterlegungsnr. 13710.