DE69912118T2

DE69912118T2 - Entomopoxvirus vektor zur abgabe und expression von dns heterologen in vertebratenzellen

Info

Publication number: DE69912118T2
Application number: DE69912118T
Authority: DE
Inventors: W. Richard MOYER; Yi 100 Laval LI
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1999-06-01
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2019-06-02
Also published as: EP1079864B1; DE69912118D1; EP1079864A1; WO1999061069A1; ATE251915T1; US6127172A; AU4327199A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Gentherapie ist ein leistungsfähiges Konzept, welches gerade eben beginnt, Anwendungen zu erfahren, die angelegt sind, um menschliche Krankheiten, wie genetische Störungen und Krebs, zu behandeln. Die Einführung von Genen in einen Organismus kann auf vielfältige Weise erzielt werden, einschließlich durch Vektoren auf Virus-Basis. Virale Gentherapie-Vektoren können so konstruiert sein, dass sie Gene liefern und entweder permanent (stabile Integration eines fremden Gens in ein Wirtschromosom) oder vorübergehend (über eine beschränkte Zeitspanne) exprimieren.
Derzeitige Genübertragungs-Vektoren auf Virus-Basis sind typisch von Tier- bzw. Menschenviren, wie Retroviren, Herpesviren, Adenoviren oder Adenoassoziierten Viren, abgeleitet. Im Allgemeinen werden diese Viren gentechnisch behandelt, um ein oder mehrere Gene des Virus zu entfernen. Diese Gene können entfernt werden, da sie an der Virus-Replikation beteiligt sind und/oder um für die Fähigkeit zur Insertion und Verpackung von fremden Genen zu sorgen. Jeder dieser bekannten Vektoren weist einige einzigartige Vorteile sowie Nachteile auf. Ein Hauptnachteil besteht in der Unfähigkeit, große DNA-Inserts, die eine Größe von mehr als 10 kb aufweisen, ohne weiteres zu verpacken und zuzuführen.
Um das Problem der Kapazität der meisten Gentherapie-Vektoren zu veranschaulichen, muss man nur Adeno-assoziiertes Virus (AAV), einen der vielversprechendsten Gentherapie-Vektoren, betrachten. Adeno-assoziiertes Virus (AAV) ist ein Parvovirus, das aus einem einzelsträngigen 4,7-kb-DNS-Genom besteht (Nienhus et al., 1983). Das Virusgenom besteht aus der Familie von rep-Genen, die für die Regulationsfunktion und DNS-Replikation verantwortlich sind, und den cap-Genen, welche die Kapsid-Proteine kodieren. Die AAV kodierende Region wird von invertierten terminalen Sequenzwiederholungen (ITR) mit 145 Nucleotiden flankiert, welche die minimalen cis-wirkenden Elemente sind, die für die Replikation und Enkapsidierung des Genoms wesentlich sind. In Abwesenheit eines Helfervirus, wie Adenovirus, verursacht AAV eine latente Infektion, die durch die Integration von Virus-DNS in das zelluläre Genom charakterisiert ist. Die Hauptvorteile von rekombinanten AAV-(rAAV-)Vektoren umfassen ein Fehlen von Pathogenität beim Menschen (Berns und Bohenzky, 1987), die Fähigkeit von Wildtyp-AAV, sich stabil in den langen Arm des Chromosoms 19 zu integrieren (Kotin et al., 1992), die potentielle Fähigkeit, sich nicht teilende Zellen zu infizieren (Kaplitt et al., 1994), und einen breiten Bereich von Infektiosität. Jedoch beschränkt die Verpackungskapazität von AAV die Größe von inserierter heterologer DNS auf etwa 4,6 kb.
Entomopox-Viren und -Vektoren sind beispielsweise in der US-A-5,721,352 und US-A-5,753,258 beschrieben. Entomopox-Viren (EPVs) infizieren und töten nur Insekten produktiv (Granados, 1981) und können aus Amsacta moorei, der rothaarigen Raupe, isoliert werden (AmEPV). Wie andere EPVs kann AmEPV Vertebraten-Zellen nicht produktiv infizieren. In der Tat werden nach Zugabe von AmEPV zu Vertebraten-(Maus L-929-) Zellen mit Multiplizitäten bis zu 10 Partikeln/Zelle keine Änderungen der Zellmorphologie nachgewiesen (wie durch Phasenkontrast-Mikroskopie beurteilt) (Langridge, 1983).
AmEPV infiziert Vertebraten-Zellen auf nicht-zelltötende Weise, und die Infektion ist abortiv. Wie alle Poxviren ist das Virus zytoplasmatisch und tritt normalerweise nicht in den Zellkern ein. Eine Folge dieser ungewöhnlichen Biologie ist, dass jede Poxvirus-vermittelte Genexpression in der infizierten Zelle im Zytoplasma stattfindet. AmEPV-Promotoren und diejenigen der eurkaryotischen Zelle sind vollständig verschieden; zelluläre Promotoren werden nicht von der AmEPV-Transcriptionsmaschine erkannt, noch werden AmEPV-Viruspromotoren von der RNS-Polymerase II der Wirtszelle erkannt.
Die WO-A-98/50571 ist Stand der Technik gemäß Art. 54(3) EPÜ. Sie offenbart die Verwendung eines rekombinanten Entomopoxvirus für die Zufuhr eines heterologen Gens in eine Zelle in vivo oder in vitro.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst ein rekombinanter Entomopoxvirus-Vektor ein Polynukleotid-Insert, das eine Sequenz umfasst, die ein Protein kodiert, das in der Lage ist, für eine therapeutische Wirkung bei einem Tier oder Menschen zu sorgen, wenn es in dem Tier oder Menschen exprimiert wird, wobei das Insert invertierte terminate Sequenzwiederholungen umfasst, welche die Sequenz flankieren.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung umfasst ein rekombinanter Entomopoxvirus-Vektor ein Polynukleotid-Insert, das eine Sequenz umfasst, die ein Protein kodiert, das für eine therapeutische Wirkung in einem Tier oder Menschen sorgen kann, wenn es in dem Tier oder Menschen exprimiert wird, wobei das Insert größer als 10 kb ist.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung umfasst ein rekombinanter Entomopoxvirus-Vektor ein Polynukleotid-Insert, das eine Sequenz umfasst, die ein Protein kodiert, das für eine therapeutische Wirkung in einem Tier oder Menschen sorgen kann, wenn es in dem Tier oder Menschen exprimiert wird, wobei das Insert eine Herpes-TK-Promotorsequenz zum Antreiben der Expression der kodierenden Sequenz umfasst.
Ein virales Vektorsystem der Erfindung ist für die Gentherapie nützlich. Für Gentherapieverfahren, die nachstehend beschrieben werden, wird ein Vektor, ein Viruspartikel oder eine Zelle der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments für die Zufuhr des Proteins an ein Tier oder einen Menschen verwendet.
Die Erfindung beruht auf einem Insekten-Poxvirus, das so konstruiert ist, dass es Gene für die Integration und stabile permanente Expression in einer Vertebratenzelle zuführt. In einer beispielhaften Ausführungsform wurde ein rekombinanter AmEPV-Vektor konstruiert, der heterologe Gene unter der Kontrolle von Promotoren enthält, welche die Expression der heterologen Gene in Vertebratenzellen antreiben. Das gfp-Gen und das Gen, das eine G418-Resistenz kodiert, wurden in einem beispielhaften Konstrukt verwendet. Das rekombinante AmEPV wurde verwendet, um Vertebratenzellen zu infizieren, und nach der Infektion wurden die Zellen in Medium überführt, das G418 enthielt. Zellen, die sowohl GFP als auch G418-Resistenz exprimierten, wurden erhalten. So können die Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um große DNS-Segmente für die gentechnische Behandlung von Vertebratenzellen zuzuführen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zellen, die mit einem rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung infiziert oder transformiert worden sind. Die vorliegenden Erfindung betrifft auch Verfahren zur Bereitstellung einer Gentherapie für Zustände oder Störungen eines Tiers oder eines Menschen, das bzw. der einer Therapie bedarf (wie Störungen mit einem Gendefekt).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine physikalische Karte eines beispielhaften rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung (pAmEPV TKUF5), in dem ein Teil des Plasmids pTKUF5 innerhalb der das AmEPV TK-Gen flankierenden Regionen kloniert worden ist. TR ist die AAV terminale Wiederholung, pA ist eine Polyadenylierungsstelle, SD/SA ist die SV40 späte Splice-Donor/Splice-Akzeptor-Sequenz. GFP steht unter der Kontrolle eines CMB-Promotors, Neo steht unter der Kontrolle eines Herpes-TK-Genpromotors.
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue rekombinante Vektoren und Verfahren zur Zufuhr und Expression von heterologen Polynukleotiden in Vertebratenzellen. Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung sorgen für eine stabile Integration und Expression von heterologer DNS in der Wirtszelle. Vorteilhaft sind die Vektoren der Erfindung zur Aufnahme großer heterologer Polynukleotid-Inserte angepasst, die zugeführt werden und in einer infizierten oder transformierten Zelle stabil exprimiert werden können. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um eine Gentherapie für Zustände oder Störungen von Wirbeltieren, wie Säugetieren oder Menschen, die einer solchen Therapie bedürfen, bereitzustellen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen rekombinanten EPV-Vektor, der gegebenenfalls heterologe DNS einschließen kann, die in einer Zelle exprimiert werden kann, die mit dem vorliegenden Vektor infiziert oder transformiert ist. Vorzugsweise ist der EPV-Vektor von AmEPV abgeleitet. Die rekombinanten EPV-Vektoren der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls invertierte terminate Sequenzwiederholungen (ITR) eines Virus, wie beispielsweise Adeno-assoziierten Virus, einschließen, welche die heterologe DNS-Insertionsstelle in dem Vektor flankieren. Demgemäß wird, wenn heterologe DNS in den rekombinanten EPV-Vektor kloniert wird, die heterologe DNS stromaufwärts und stromabwärts von den ITR-Sequenzen flankiert.
In einer beispielhaften Ausführungsform umfassen die vorliegenden Vektoren heterologe DNS, die in den Vektor inseriert ist. Die heterologe DNS, die in den rekombinanten Vektoren der Erfindung enthalten ist, kann Polynukleotid-Sequenzen einschließen, die ein biologisch funktionelles Protein kodieren. Vorzugsweise kodieren die Polynukleotide Proteine, die für eine therapeutischen Ersatz oder eine therapeutische Ergänzung in Tieren oder Menschen sorgen können, die an Störungen leiden, die zur Folge haben, dass das Tier oder der Mensch abnormale oder defiziente Mengen des Proteins exprimiert, welche für eine normale biologische Funktion erforderlich sind. Proteine, welche von der heterologen DNS kodiert werden, können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Interleukine, Cytokine, Wachstumsfaktoren, Interferone, Enzyme und Strukturproteine einschließen. Protein, welches von der heterologen DNS kodiert wird, kann auch Proteine einschließen, die eine selektierbare Markierung für die Expression bereitstellen, wie eine Antibiotikaresistenz in Eukaryoten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist heterologe DNS in den vorliegenden Vektoren operabel verknüpft mit und unter der Kontrolle von Regulationssequenzen wie Promotoren. Die rekombinanten Vektoren der Erfindung umfassen bevorzugt einen konstitutiven oder regulierbaren Promotor, der ausreichende Expressionsniveaus der heterologen DNS, die in dem Virusvektor enthalten ist, in einer Vertebratenzelle anregen kann. Promotoren, die bei den vorliegenden Vektoren nützlich sind, schließen beispielsweise Cytomegalovirus-(CMV-)Promotoren und den Herpes-TK-Gen-Promotor ein. Die Vektoren können auch andere Regulationselemente, wie Introns, einschließen, die in die Polynukleotid-Sequenz des Vektors inseriert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zellen, die rekombinante Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten. Bei den Zellen kann es sich beispielsweise um Vertebratenzellen, wie Säugerzellen, handeln. Vorzugsweise sind die Zellen menschliche Zellen. Zell-Linien, die mit den rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung infiziert oder transformiert sind, liegen ebenfalls innerhalb des Bereichs der Erfindung.
Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung können durch in der Technik bekannte Verfahren in geeignete Zellen oder Zell-Linien eingeführt werden. Wenn die rekombinanten Vektoren in Viruspartikeln verpackt sind, können die Zellen oder Zell-Linien mit dem Virus infiziert werden, der den rekombinanten Vektor enthält. Verfahren, die zur Einführung eines rekombinanten Vektors in Zellen oder Zell-Linien in Betracht gezogen werden, schließen auch Transfektion, Transduktion und Injektion ein. Beispielsweise könne Vektoren unter Verwendung von Liposomen, welche die vorliegenden rekombinanten Vektoren enthalten, in Zellen eingeführt werden. Rekombinante Viruspartikel und Vektoren der vorliegenden Erfindung können durch In-vitro- oder In-vivo-Mittel in Zellen eingeführt werden.
Die Infektion von Vertebratenzellen ist nicht-permissiv, indem eine frühe, aber keine späte AmEPV-Genexpression stattfindet (Li et al., 1997). Speziell wird, wenn ein Reportergen, wie lacZ, von einem späten Poxvirus-Promotor, entweder dem AmEPV-Spheroidin- oder dem Kuhpockenvirus ATI-(Inklusion vom A-Typ) Promotor, angetrieben wird, keine Expression von Galactosidase beobachtet. Wenn jedoch lacZ stattdessen von einem der beiden frühen EPV-Promotoren (dem Melolontha melolontha EPV-Fusolingen-Promotor (Gauthier et al., 1995) oder dem 42 kDa frühen AmEPV-Protein (Li et al., 1997)) angetrieben wird, werden hohe Konzentrationen an Galactosidase in den mit rekombinantem AmEPV infizierten Vertebratenzellen beobachtet. Diese Ergebnisse stellen einen klaren Nachweis des AmEPV-Eintritts in Vertebratenzellen dar, gefolgt von einer frühen, aber nicht späten Virus-Genexpression.
Es wurde auch gefunden, dass Vertebratenzellen eine Infektion durch AmEPV überleben. Wenn CV-1-Zellen mit einer AmEPV-Rekombinanten infiziert werden, die das grüne fluoreszierende Protein-(GFP-)Gen enthält, das durch den 42 kDa AmEPV frühen Promotor (auch als esp-Promotor bezeichnet) reguliert wird, werden anfänglich einzelne fluoreszierende Zellen beobachtet, die dann fortfahren zu wachsen und sich zu teilen, wobei sie schließlich kleine Cluster von fluoreszierenden Zellen bilden. Deshalb tritt AmEPV in Vertebtratezellen ein, um eine nicht-permissive, abortive Infektion zu erzeugen, frühe Virusgene werden exprimiert und infizierte Zellen scheinen zu überleben und fortzufahren, sich zu teilen. Diese Eigenschaften, plus einer sehr großen Kapazität des Virus für fremde Gene, macht AmEPV zu einem ausgezeichneten Vektor für die Zufuhr von Genen zur Expression auf vorübergehende Weise.
Materialien und Methoden
Zellen und Virus
AmEPV (Hall und Moyer, 1991) wurde in IPLB-LD-652-Zellen (Goodwin et al., 1990) repliziert, welche bei 28°C in einem 1 : 1 gemischten Medium (TE-Medium) aus TC-100-Medium (Gibco. Gaithersburg, MD) und EX-CELL 401-Medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS), das mit 10% fetalem Rinderserum ergänzt war, gehalten. Eine TK-negative Zell-Linie, die als C11.3 bezeichnet wurde, wurde durch ein Verfahren der Adaption von TK(+) LD652-Zellen an zunehmende Mengen 5-Brom-2'-desoxyuridin (BudR), 10 μg/ml alle 5 Wochen über ein Jahr bis zu 100 μg/m BudR, selektiert und in einem TE-Medium gehalten, das BudR (100 μg/ml) enthielt. 293 Zellen wurden in DMEM-Medium gezüchtet, das mit 5 % fetalem Rinderserum ergänzt war.
Plasmidkonstruktion und Herstellung einer AmEPV-Rekombinanten
pTR-UF5 (siehe 1, bereitgestellt von Vector Core, Gene Therapy Center, University of Florida) enthält GFP- und Neon-Gene unter der Kontrolle des CMV-Promotors bzw. Herpesvirus-TK-Promotors und flankiert von ITR-Sequenzen von AAV. Das Pst I-Fragment, das GFP- und Neon-Markierungen enthält, wurde in die Pst I-Stelle von pTKDU inseriert (Li et al., 1998), um pTKUF5 zu erzeugen. Die AmEPV-Rekombinante mit einem Insert in dem TK-Gen wurde wie früher beschrieben erhalten (Li et al., 1998).
Das folgenden sind Beispiele, welche Verfahren zur Durchführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sollten nicht als beschränkend angesehen werden. Alle Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen, und alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind bezüglich Volumen, falls nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1 - Genexpression in Zellen, die mit rekombinantem AmEPV infiziert sind
293 Zellen (1 × 10⁶) wurden in eine Platte mit 6 Vertiefungen gegeben und mit rekombinantem AmEPVpTKUF5- oder AmEPVpTKespgfp- (Li et al., 1997) Viren mit einer Multiplizität von fünf (5) Viruspartikeln/Zelle infiziert. Als Kontrollen wurden Zellen gesondert entweder mit dem Plasmid pTR-UF5 oder pTKUF5 mit 5 μg/Vertiefung Plasmid-DNS transfiziert. Zwei Tage später wurden mit Virus infizierte oder mit Plasmid transfizierte Zellen in 60 mm-Schalen überführt, nach 24 Stunden wurden Neomycin-resistente Kolonien durch Zugabe von G418 mit einer Endkonzentration von 200 μg/ml selektiert. Das G418-haltige Medium wurde alle 3–4 Tage ausgetauscht.
Bei Zellen, die mit rekombinantem AmEPV pTKespgfp infiziert waren, wurde keine Neomycin-resistente Kolonie beobachtet, ein erwartetes Ergebnis, da dieses Virus kein NeoR-Gen aufweist. Jedoch wurden bei Zellen, die mit rekombinantem AmEPV pTKUF5 infiziert oder mit Plasmiden pTR-UF5 transfiziert waren, Kolonien beobachtet. Alle Kolonien aus Zellen, die mit einem der beiden Plasmide transfiziert waren, waren sowohl G418-resistent als auch GFP-positiv. Jedoch waren Kolonien aus Zellen, die mit rekombinantem pTKUF5 infiziert waren, anfänglich nur G418-resistent und nicht GFP-positiv. G418-resistente Kolonien, die von der AmEPV-Rekombinanten abstammten, wuchsen auch langsamer als diejenigen, die nach Plasmid-Transfektion erzeugt wurden. Sehr wahrscheinlich ist die Erklärung für diese Ergebnisse, dass die GFP- und NeoR-Gen-Kopienzahl in von AmEPV abstammenden Kolonien geringer ist als bei denjenigen, die mit Plasmiden transfiziert wurden. Diese Erklärung ist wahrscheinlich richtig, da wir in der Lage waren zu zeigen, dass die von AmEPV abstammenden Kolonien allmählich mehr und mehr gegen G418 resistent wurden und dass bald einige GFP-positive Cluster von Zellen beobachtet wurden, die zahlreicher und heller wurden. Nach mehreren Auswechslungen des Mediums waren schließlich alle Zellen in der Vertiefung GFP-positiv.
Literaturstellen
US-Patente

US-Patent Nr. 5,721,352
US-Patent Nr. 5,753,258

Andere Literaturstellen
Berns, K. I. und R. A. Bohenzky (1987) "Adeno-associated viruses: an update. Adv. Virus Res. 32: 243–306.
Gauthier, L., F. Coussrans, J. C. Veyrunes, M. Bergoin (1995) "The Melolontha melolontha entomopoxvirus (MmEPV) fusolin is related to the fusolins of lepidoptera EPVs and to the 37 K baculovirus glycoprotein", Virology 208: 427-436.
Granados, R. R. (1981) "Entomopoxvirus infections in insects, In Pathogenesis of invertebrate Microbial Disease, S. 102–126, Davidson, E. W. (Hsg.) New Jersey, Allanheld Totowa.
Kaplitt et al. (1994) "Long term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain", Nat. Genet. 8: 148–154.
Kotin, R. M., R. M. Linden, K. I. Berns (1992) "Characterization of a preferred site on human chromosome 10 q for integration of adeno-associated virus DNA by nonhomologous recombination" EMBOJ 11: 5071–5078.
Langridge, W. H. (1983) "Detection of Amsacta moorei entomopoxvirus and vaccinia virus proteins in cell cultures restrictive for poxvirus multiplication", J. Invertebr. Pathol. 42: 77–82.
Li, Y., R. L. Hall, R. W. Moyer (1997) "Transient, nonlethal expression of genes in vertebrate cells by recombinant entomopoxviruses" J. Virol. 71: 9557– 9562.
Li, Y., R. L. Hall, S. L. Yuan, R. W. Moyer (1998) "High level expression of Amsacta moorei entomopoxvirus Spheroidin depends on sequences within the gene" J. Gen. Virol. 79: 613–622.
Nienhuis, A. W., C. E. Walsh, J. M. Liu (1993) "Viruses as therapeutic gene transfer vectors" In: N. S. Young (Hsg.) Viruses and bone marrow, Marcel Decker, New York, S. 353–414.

Claims

Rekombinanter Entomopoxvirus-Vektor, umfassend ein Polynukleotid-Insert, welches eine Sequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, das eine therapeutische Wirkung bei einem Tier bzw. Menschen bereitstellen kann, wenn es in dem Tier bzw. Menschen exprimiert wird, wobei das Insert invertierte terminale Sequenzwiederholungen umfasst, welche die Sequenz flankieren.
Rekombinanter Entomopoxvirus-Vektor, umfassend ein Polynukleotid-Insert, das eine Sequenz umfasst, welche für ein Protein kodiert, das eine therapeutische Wirkung bei einem Tier bzw. Menschen bereitstellen kann, wenn es in dem Tier bzw. Menschen exprimiert wird, wobei das Insert größer als 10 kb ist.
Rekombinanter Entomopoxvirus-Vektor, umfassend ein Polynukleotid-Insert, das eine Sequenz umfasst, welche für ein Protein kodiert, das eine therapeutische Wirkung bei einem Tier bzw. Menschen bereitstellen kann, wenn es in dem Tier bzw. Menschen exprimiert wird, wobei das Insert eine Herpes TK-Promotorsequenz zum Antreiben der Expression der kodierenden Sequenz umfasst.
Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, in dem das Insert größer als 10 kb ist.
Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem das Insert eine Promotor-Sequenz umfasst, welche die Expression des Polynukleotids antreiben kann.
Vektor nach Anspruch 5, in dem der Promotor aus CMV und Herpes TK ausgewählt ist.
Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 6, in dem das Insert invertierte terminale Sequenzwiederholungen umfasst, welche die Sequenz flankieren.
Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 7, in dem die invertierten terminalen Sequenzwiederholungen von Adeno-assoziiertem Virus abstammen.
Vektor nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Entomopoxvirus Amsacta moorei ist.
Vektor nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Protein aus Interleukinen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Interferonen, Enzymen und Strukturproteinen ausgewählt ist.
Vektor nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Insert auch für ein selektierbares Markerprotein kodiert.
Viruspartikel, umfassend einen Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11.
Zelle, umfassend einen Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11.
Zelle nach Anspruch 13, welche das Protein exprimiert, das von der Sequenz kodiert wird.
Verwendung eines Vektors nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, eines Viruspartikels nach Anspruch 12 oder einer Zelle nach Anspruch 13 oder Anspruch 14 für die Herstellung eines Medikaments zur Zufuhr des Proteins an ein Tier bzw. einen Menschen.