DE60023944T2

DE60023944T2 - Replikationsunfähige herpesvirus-vektoren

Info

Publication number: DE60023944T2
Application number: DE60023944T
Authority: DE
Inventors: Stuart Robert COFFIN
Original assignee: Biovex Ltd
Current assignee: Biovex Ltd
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: AU2208801A; EP1246930A1; US20030040500A1; GB9930419D0; CA2395578A1; EP1246930B1; WO2001046450A1; DE60023944D1; AU783691B2; JP2003518081A; ATE309384T1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft replikationsinkompetente Herpes-simplex-Viren mit der Fähigkeit, Gene auf Zellen des peripheren Nervensystems effizient zu übertragen. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung derartiger Viren bei der Untersuchung und Behandlung von Krankheiten und Zuständen des Nervensystems.
Hintergrund der Erfindung
Die Herpes-simplex-Viren 1 und 2 sind große DNA-Viren, deren Lebenszyklen durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind, lebenslang ein latentes Stadium in den sensorischen Ganglien eines infizierten Individuums einzunehmen, aus dem eine Reaktivierung des Virus intermittierend erfolgen kann. Während der Latenz ist das HSV-Genom, das extrachromosomal bleibt, überwiegend ruhend, obwohl die Tatsache, dass ein kleiner Teil des die Latenz-assoziierten Transkripte (LATs) codierenden Genoms während der Latenz transkribiert wird (Stevens, 1987), zeigt, dass die Bildung der Gen-übertragenden Vektoren, die die Expression eines Transgens erlauben, möglich sein sollte. Während der Latenz wird das HSV vom Immunsystem nicht auf natürliche Weise entfernt und die infizierten Zellen bleiben ohne Schädigung, was außerdem das Potenzial für einen langandauernden therapeutischen Nutzen einer Verwendung von HSV als Vektor zeigt (Übersicht von Coffin und Latchman 1996, Fink 1996). HSV besitzt unter den gegenwärtig als Vektoren in Entwicklung befindlichen Viren ebenfalls die einzigartige Fähigkeit, die axonalen Nervenenden zu infizieren und mit einem anschließenden effizienten retrograden axonalen Transport zum Zellkörper in den Spinalganglien zu gelangen. Folglich könnten HSV-Vektoren entwickelt werden, die eine periphere Vektor-Inokulation erlauben, um eine Genübertragung auf die Spinalganglien im Anschluss an einen derartigen retrograden Transport zu ergeben. Es gibt zahlreiche potenzielle Anwendungen für Vektoren, die zum axonalen Transport in das periphere Nervensystem in der Lage sind, einschließlich der Stimulierung des Wiederwachstums beschädigter Nerven, der Untersuchung/Behandlung verschiedener Schmerzstadien, des Schutzes von Neuronen vor weiterer Degeneration bei z.B. Motoneuron-Erkrankung, der Untersuchung/Behandlung verschiedener Neuropathien, der Untersuchung der neuronalen Entwicklung und der Durchmusterung der Bedeutung von Genen, die als bedeutsam für irgendeinen dieser Prozesse in Verbindung gebracht werden, mit Hilfe eines Versuchsansatzes der Genübertragung.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass HSV-Vektoren Gene auf Spinalganglien über derartige Wege übertragen können, aber hierfür sind in jedem Fall Vektoren verwendet worden, die wenigstens die gleiche Replikationskompetenz beibehalten haben, wie dies für eine effektive Genübertragung als notwendig erachtet worden ist. Hierfür sind verschiedene mutierte Viren verwendet worden, die in den nicht-essentiellen Genen verschieden mutiert waren, die für ICP6 (Goldstein und Wellen 1988), ICP0 (Leib et al. 1989), TK (Palella et al. 1988, Ho und Mokarski 1988), gC (Lokensgard et al. 1994, Dobson et al. 1995; Goins et al. 1994); vmw65 (Ecob Prince et al. 1995) codieren, nicht-defekt (Margolis et al. 1993, Lachman et al. 1996, Lachman und Efstathiou, 1997) oder ICP34.5 oder ICP34.5 und vmw65 deletiert sind (Coffin et al. 1996). Jedes dieser Viren ist im Vergleich zum Wildtyp-Virus attenuiert, selbst wenn die mutierten Gene nicht-essentiell sind und jedes Virus leidliche Levels einer wenigstens kurzzeitigen Genübertragung und/oder die Fähigkeit gezeigt hat, das Latenzstadium nach einer Inokulation von Tieren in den Pfotenballen oder in die Ohrmuschel einzunehmen. Wie allerdings diskutiert, behalten alle wenigstens das gleiche Ausmaß an Replikationskompetenz in vivo und in Kultur bei, da keine essentiellen Gene inaktiviert worden sind. Während replikationsinkompetente HSV-Vektoren schon über einen gewissen Zeitraum erhältlich gewesen sind, sind sie im peripheren Nervensystem deshalb nicht verwendet worden, weil bis heute vermutet worden ist, dass Viren, die in einer beliebigen Zelle replikationsunfähig sind (d.h. in einem essentiellen Gen oder Genen mutiert), keine Genübertragung auf Spinalganglien nach einer Inokulation über periphere Wege erlauben würden.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben bereits berichtet, dass ICP34.5 oder ICP34.5 und vmw65 mutierte HSV-Vektoren eine Genübertragung auf das periphere Nervensystem nach einer Pfotenballen-Inokulation ergeben können (Coffin of al., 1996). Ähnlich wie in anderen oben diskutierten Arbeiten behalten allerdings derartige Viren, während sie attenuiert sind, ein gewisses Ausmaß an Replikationskompetenz in vivo bei. Tatsächlich ist vermutet worden, dass eine derartige Replikationskompetenz für eine Genübertragung über einen derartigen Weg erforderlich sein könnte, da es erforderlich ist, dass das Virus von der Inokulationsstelle zum Zellkörper in der Wirbelsäule gelangt, wo das übertragene Gen exprimiert werden soll. Es wäre vorstellbar, dass eine Replikation für eine effiziente Übertragung notwendig sein könnte. Weil von vielversprechenden Ergebnissen einer Genübertragung zum peripheren Nervensystem, einschließlich der Sensitivitätsänderung für schmerzhafte Stimuli, durch einen HSV-Vektor-vermittelten Versuchsansatz berichtet worden ist (Wilson et al. 1999), behalten deshalb die verwendeten Vektoren eine Replikationskompetenz bei, was Probleme mit Sicherheit und Akzeptanz vergrößert, falls sie bei einer Humanbehandlung verwendet werden sollen. Wenn derartige Viren ein exogenes Gen oder exogene Gene tragen, können sich ebenfalls Probleme mit Sicherheit und Akzeptanz ergeben, wenn sie in einer Labor-gestützten vorklinischen Forschung und Grundlagenforschung verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt Vektoren, die für eine Genübertragung auf das periphere Nervensystem nach einer peripheren Inokulation hoch effizient sind und ein beträchtlich verbessertes Sicherheits-/Akzeptanzprofil gegenüber Vektoren besitzen, die früher für einen derartigen Zweck erhältlich gewesen sind.
Zusammengefasst haben wir die überraschende Feststellung gemacht, dass hoch defekte HSV-Vektoren, die in keiner Zelle außer denjenigen replizieren können, die zur Herstellung von Virus-Stocks verwendet werden (d.h. es ist in dem Vektor ein essentielles Gen oder Gene inaktiviert worden, die in der Produzentenzelllinie komplementiert werden), eine hoch effiziente Genübertragung auf das periphere Nervensystem nach einer direkten Injektion in einen peripheren Nerv ergeben können. Von einem derartigen Ergebnis, das eine sehr hoch effiziente Genübertragung ergibt, ist zuvor nicht berichtet worden und folglich werden Vektoren durch die vorliegende Er findung bereitgestellt, die ein verbessertes Sicherheits/Akzeptanzprofil gegenüber solchen Vektoren zeigen, die früher im peripheren Nervensystem verwendet worden sind. Derartige replikationsinkompetente Herpesvirus-Vektoren können in Verfahren zur Untersuchung und Behandlung von Störungen des peripheren Nervensystems verwendet werden. Insbesondere können derartige Vektoren in Verfahren zur Zielvalidierung verwendet werden, zum Beispiel mittels Durchmusterung von Genen, um zu identifizieren, welche Rolle, falls überhaupt, sie bei Störungen des peripheren Nervensystems spielen.
Dementsprechend stellt die Erfindung bereit:
die Verwendung eines replikationsinkompetenten Herpesvirus, welchem/s

(i) mindestens ein funktionelles Immediate-Early-Gen fehlt, ausgewählt aus Genen, die ICP4 und ICP27 codieren;
(ii) ein funktionelles VMW65-Gen fehlt aufgrund einer Mutation in diesem Gen, welche seine Transkriptionsaktivierungs-Aktivität aufhebt; und
(iii) ein heterologes Gen umfasst, das operativ an die LAT P2-Region und an einen nicht-Lat-Promotor geknüpft ist;

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Viren
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines Gens bereit, das als ein Ziel für eine therapeutische Intervention in der Behandlung oder Prävention einer peripheren Nervensystemstörung verwendet werden kann. Identifiziert werden derartige Gene durch eine Expression eines Testgens in einer Zelle des peripheren Nervensystems eines nicht-menschlichen Tieres unter Verwendung eines replikationsinkompetenten Herpesvirus-Vektors, um das Gen auf die Zelle zu übertragen, und mittels Bestimmung, ob eine Expression des Gens einen mit einer peripheren Nervensystemstörung assoziierten Phänotyp beeinflusst. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Gen einen mit einer peripheren Nervensystemstörung assoziierten Phänotyp beeinflusst, besteht im Wesentlichen aus den folgenden Schritten:

(i) Inokulation eines peripheren Nervs eines nicht-menschlichen Tieres mit einem replikationsinkompetenten Herpesvirus, das in der Lage ist, eine Zelle des peripheren Nervensystems effizient zu infizieren, wobei dieses Virus ein Testgen umfasst;
(ii) Überwachen eines Phänotyps dieser Krankheit, um dadurch zu bestimmen, ob eine Expression dieses Gens eine Wirkung auf diesen Phänotyp besitzt.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Durchmusterung von Genen bereit, um ein Gen zu identifizieren, das bei einer peripheren Nervensystemstörung wichtig ist und das als ein Ziel für die Identifizierung von Agentien zur Behandlung der Störung verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines replikationsinkompetenten Herpesvirus-Vektors in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer peripheren Nervensystemstörung bereit. Der Herpesvirus-Vektor ist typischerweise replikationsinkompetent und ist in der Lage, eine Zelle des peripheren Nervensystems effizient zu infizieren. Vorzugsweise umfasst der Herpesvirus-Vektor ein heterologes Gen. Das heterologe Gen umfasst typischerweise ein Polypeptid zur therapeutischen Anwendung.
Eine Verabreichung des Herpesvirus-Vektors an eine Person, die an einer Störung des peripheren Nervensystems leidet, lindert typischerweise die Symptome der Störung und/oder verhindert die Progression der Störung.
Ein Virus für die Verwendung in der Erfindung ist in der Lage, eine Zelle des peripheren Nervensystems nach einer peripheren Inokulation effizient zu infizieren, ist aber nicht in der Lage, in irgendeiner Zelle zu replizieren, außer wenn nicht wenigstens ein Gen, das in dem Virus funktionsunfähig gemacht worden ist, in der Zelle ebenfalls exprimiert wird, d.h. das Virus ist replikationsinkompetent, außer in den Zellen, in denen die Virus-Stocks hergestellt werden. Ein Virus ist replikationsinkompetent, falls es in einer Zelle nicht zur Replikation in der Lage ist, die nicht wenigstens ein funktionsfähiges essentielles virales Gen exprimiert.
Ein Virus, das in der Lage ist, eine Zelle des peripheren Nervensystems nach einer peripheren Inokulation effizient zu infizieren, infiziert typischerweise wenigstens 50 Zellen, zum Beispiel wenigstens 60, wenigstens 70, wenigstens 80, wenigstens 90 oder wenigstens 100 Zellen, bevorzugter wenigstens 200, zum Beispiel wenigstens 500 oder wenigstens 1000 Zellen nach einer Virus-Direktinjektion mit einem Titer von 1 × 1 × 10⁸ pfu/ml bis 1 × 10⁹ pfu/ml, bevorzugt von 3 × 10⁸ pfu/ml bis 7 × 10⁸ pfu/ml, bevorzugter von 4 × 10⁸ pfu/ml bis 6 × 10⁸ pfu/ml, bevorzugter von 5 × 10⁸ pfu/ml in einen peripheren Nerv, zum Beispiel den Ischiasnerv eines Versuchstieres. Dies kann durch Überwachung der Expression eines heterologen Markergens wie LacZ oder GFP, das operativ an eine Kontrollsequenz gebunden ist, vorzugsweise an eine Kontrollsequenz, die während der Herpesvirus-Latenz aktiv ist, bestimmt werden. Vorzugsweise sind die peripheren Nervensystemzellen Hinterwurzelganglionzellen (DRG). Vorzugsweise ist das Versuchstier ein Primat oder ein Nager wie eine Ratte oder eine Maus.
Per Definition sind derartige Viren attenuiert, so dass sie replikationsinkompetent sind. Ein Virus kann durch die Mutation wenigstens eines essentiellen Gens replikationsinkompetent gemacht sein, so dass das essentielle Gen funktionsunfähig ist. Zum Zwecke einer derartigen Attenuierungen veränderte virale Regionen können eliminiert sein (komplett oder partiell), funktionsunfähig gemacht oder durch andere Sequenzen, insbesondere durch eine heterologe Gensequenz, substituiert sein. Attenuierende Mutationen, die ein replikationsinkompetentes Virus ergeben, sind für alle bis heute beschriebenen neurotrophen Herpesviren beschrieben worden. Replikationsinkompetente Viren sind im Allgemeinen zur Replikation in Zelllinien in der Lage, die ein funktionsfähiges essentielles virales Gen exprimieren, welches das fehlende funktionsfähige essentielle virale Gen in dem replikationsinkompetenten Virus kompensiert. Derartige Zelllinien können zur Herstellung von Virus-Stocks verwendet sein.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Herpes-simplex-Viren beispielhaft veranschaulicht worden ist, ist es zu verstehen, dass andere neurotrophe Viren aus der Familie der Herpesviren modifiziert werden können, so dass sie replikationsinkompetent sind und eine effiziente Genübertragung auf Zellen des peripheren Nervensystems nach einer peripheren Inokulation bewerkstelligen können. Insbesondere können derartige Viren Varicella-Zoster-Virus, Pseudorabies-Virus oder bovine Herpesviren umfassen. Darüber hinaus sind Herpes-Amplikonvektoren replikationsinkompetente Herpesviren. Folglich können Herpes-Amplikonvektor-Stocks, die zur Infektion von Zellen des peripheren Nenvensystems nach einer Inokulation in periphere Nerven fähig sind, ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet sein.
Wenn das Virus der vorliegenden Erfindung ein Herpes-simplex-Virus ist, kann das Virus zum Beispiel von HSV1- oder HSV2-Stämmen oder von Abkömmlingen davon, bevorzugt HSV1, abstammen. Abkömmlinge umfassen Intertyp-Rekombinanten, die DNA von HSV1- und HSV2-Stämmen enthalten. Derartige Intertyp-Rekombinanten sind in der Technik beschrieben, zum Beispiel in Thompson et al. 1998 und Meignier et al. 1988. Abkömmlinge besitzen bevorzugt wenigstens eine 70% Sequenzhomologie entweder zum HSV1- oder HSV2-Genom, bevorzugter wenigstens 80%, noch bevorzugter wenigstens 90 oder 95% und am bevorzugtesten wenigstens 96, 97, 98 oder 99%. Bevorzugtere Abkömmlinge besitzen wenigstens eine 70% Sequenzidentität entweder mit dem HSV1- oder HSV2-Genom, bevorzugter wenigstens 80%, noch bevorzugter wenigstens 90 oder 95% und am bevorzugtesten wenigstens 96, 97, 98 oder 99%.
Ein Abkömmling kann die Sequenz eines HSV1- oder HSV2-Genoms besitzen, das durch Nukleotidsubstitutionen, zum Beispiel 1, 2 oder 3 bis 10, 25, 50 oder 100 Substitutionen, modifiziert ist. Das HSV1- oder HSV2-Genom kann alternativ oder zusätzlich durch eine oder mehrere Insertionen und/oder Deletionen oder durch eine Extension an einem oder beiden Enden modifiziert sein.
Zum Beispiel stellt das UWGCG-Package das BESTFIT-Programm bereit, das zur Berechnung der Homologie angewandt werden kann (zum Beispiel in seinen Standardeinstellungen angewandt) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, Seiten 387–395). Die PILEUP und BLAST-Algorithmen können zur Berechnung der Homologie oder zum Abgleich von Sequenzen (typischerweise in ihren Standardeinstellungen) verwendet werden, zum Beispiel wie von Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36: 290–300; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10 beschrieben.
Die Software für die Durchführung der BLAST-Analysen ist über das National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich zugänglich. Dieser Algorithmus beinhaltet erstens die Identifizierung von high scoring Sequenzpaaren (HSPs) durch die Identifizierung kurzer Wörter der Länge W in der Abfragesequenz, die entweder paaren oder einen gewissen positiv bewerteten Schwellenwert T erfüllen, wenn sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz abgeglichen werden. T ist als eine nachbarliche Wort-Score-Schwelle bezeichnet (Altschul et al., 1990). Diese ersten nachbarlichen Worttreffer dienen als Ausgangsbasis für erste Suchen nach HSPs, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beide Richtungen über jede Sequenz erweitert, sofern der kumulative Alignment-Score erhöht werden kann. Erweiterungen für die Worttreffer in jeder Richtung kommen zum Stillstand, wenn: der kumulative Alignment-Score um die Größe X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; der kumulative Score auf null oder darunter fällt, aufgrund der Akkumulation eines oder mehrerer negativer Scoring-Residue-Alignments; oder das Ende einer Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmenparameter W, T und X legen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit des Alignments fest. Das BLAST-Programm verwendet als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62 Scoring-Matrix (siehe Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 10915–10919) Alignments (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und ein Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; siehe Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787. Ein Maß für die von dem BLAST-Algorithmus gelieferte Ähnlichkeit ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit liefert, mit der eine Paarung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen zufälligerweise erfolgen würde. Zum Beispiel wird eine Sequenz als ähnlich mit einer anderen Sequenz erachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit beim Vergleich der ersten Sequenz mit der zweiten Sequenz kleiner als etwa 1, bevorzugt kleiner als etwa 0,1, bevorzugter kleiner als etwa 0,01 und am bevorzugtesten kleiner als etwa 0,001 ist.
Viren der Erfindung können in einem einzigen (z.B. ICP27 oder ICP4) oder in mehreren (ICP27 und/oder ICP4 und/oder ICP22 und/oder ICP0 und/oder ICP47) Immediate-Early-Genen funktionell inaktiv sein. Sie können zusätzlich eine Mutation in dem vmw65 codierenden Gen enthalten, was ihr Transkriptionsaktivierungsvermögen vermindert/verhindert. Alternativ können essentielle Gene, die keine Immediate-Early-Gene sind, wie an der Virusreplikation beteiligte essentielle Gene, zum Beispiel die Produkte der UL29- und UL30-Gene, einzelsträngige DNA-bindendes Protein beziehungsweise DNA-Polymerase, entweder allein oder in beliebiger Kombination oder auch in Kombination mit der Inaktivierung eines oder mehrerer Immediate-Early-Gene und/oder vmw65 deletiert sein. Beispiele derartiger Viren umfassen von Samaniego et al. 1998, Krisky et al. 1998 oder Thomas et al. 1999 beschriebene Viren. Besonders bevorzugte Viren sind diejenigen, in denen die Expression von Immediate-Early-Genen verhindert oder minimiert ist, zum Beispiel ist ein Virus mit inaktivierenden Mutationen in den Genen oder Deletionen von Deletionen der Gene bevorzugt, die ICP4, ICP27, ICP0 und ICP22 codieren. Viren mit inaktivierenden Mutationen in oder Deletionen von ICP27 und/oder ICP4 und ebenfalls ein derartiges Virus mit einer Mutation in vmw65, die seine trans-aktivierende Aktivität vermindert/verhindert, sind ebenfalls bevorzugt.
Bevorzugte Viren der Erfindung exprimieren nicht oder nur auf sehr niedrigen Niveaus wenigstens zwei Immediate-Early-Gene. Sehr niedrige Niveaus bedeuten Niveaus unter der Nachweisgrenze eines Western-Blot unter Verwendung eines Antikörpers für ein Proteinprodukt eines Immediate-Early-Gens. Ein Virus kann eine beliebige geeignete Mutation umfassen, die eine Expression von Immediate-Early-Genen minimiert. Bevorzugt exprimiert ein Virus nicht oder nur auf sehr niedrigen Niveaus wenigstens drei Immediate-Early-Gene. Bevorzugter exprimiert ein Virus nicht oder nur auf sehr niedrigen Niveaus wenigstens vier Immediate-Early-Gene. Die Immediate-Early-Gene, die nicht oder nur auf minimalen Niveaus exprimiert werden dürfen, sind ICP0, ICP4, ICP22 und ICP27. Die beiden Immediate-Early-Gene können ICP27 und ICP4, ICP27 und ICP0, ICP27 und ICP22, ICP4 und ICP0, ICP4 und ICP22 oder ICP0 und ICP22 sein.
Die Kombinationen von Gen-Deletionen, die gemäß der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, sind diejenigen, bei denen Mutationen nicht nur eine Replikation verhindern, sondern welche ebenfalls die Toxizität des Virus minimieren oder vermindern. Folglich ist ein Virus besonders bevorzugt, das zur Infektion einer Zelle des peripheren Nervensystems nach einer peripheren Inokulation fähig ist und Mutationen in ICP4 und/oder ICP27 besitzt. Diese Mutationen verhindern nicht nur eine Expression einer funktionsfähigen Form des mutierten Gens, sondern auch eine Expression anderer viraler Gene, die zytotoxisch sein können. Zusätzlich sind Viren mit Mutationen in Kombinationen von oder in einzelnen essentiellen Genen bevorzugt, die von einer für die Anzucht dieser Viren hergestellten Zelllinie effizient komplementiert werden können. Insbesondere können hohe Titer des Virus ohne weiteres hergestellt werden. Derartige Zelllinien für Viren sind in der Technik beschrieben, z.B. von Samaniego et al. 1998 und Krisky et al. 1998. Die bei der Beschreibung der verschiedenen HSV-Gene verwendete Terminologie entspricht der von Coffin und Latchman, 1996.
Produktion replikationsinkompetenter Viren
Wenn den Herpes-simplex-Viren der Erfindung ein bestimmtes funktionsfähiges essentielles Gen fehlt, zum Beispiel ein ICP4 oder ICP27 codierendes Gen, wird das Virus auf einer Zelllinie vermehrt, die dieses essentielle Gen exprimiert. Zum Beispiel wenn dem Virus ein funktionsfähiges ICP27-Gen fehlt, kann das Virus in V27-Zellen (Rice und Knipe, 1990), 2-2-Zellen (Smith et al., 1992) oder B130/2-Zellen (Howard et al. 1998) vermehrt werden. Wenn dem Virus ein funktionsfähiges ICP4-Gen fehlt, kann das Virus auf einer ICP4-exprimierenden Zelllinie, zum Beispiel E5-Zellen (De-Luca et al., 1985), vermehrt werden. Wenn dem Virus ein funktionsfähiges ICP4-Gen und ein funktionsfähiges ICP27-Gen fehlt, wird das Virus auf einer Zelllinie vermehrt, die sowohl ICP4 als auch ICP27 exprimiert (wie E26-Zellen; Samaniego et al., 1995), und wenn dem Virus zusätzlich ein funktionsfähiges vmw65-Gen fehlt, kann das Virus auf einer Zelllinie vermehrt werden, die auch ein nicht-HSV Homolog von vmw65 enthält (z.B. von einem equinen Herpesvirus wie in Thomas et al., 1999). Mutationen von vmw65 können ebenfalls durch Hinzufügen von Hexamethylenbisacetamid (HMBA) zu den Virusanzuchtmedien partiell kompensiert werden (MacFarlane et al. 1992).
Hergestellt werden können ICP27-exprimierende Zelllinien durch Co-Transfektion von Säugerzellen, zum Beispiel Vero- oder BHK-Zellen, mit einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmid-Vektor, der ein funktionsfähiges HSV-ICP27-Gen, das in besagten Zellen exprimiert werden kann, und einen Vektor, vorzugsweise einen Plasmid-Vektor, umfasst, der einen selektierbaren Marker, zum Beispiel die Neomycinresistenz, codiert. Klone, die den selektierbaren Marker besitzen, werden dann durchmustert, um unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren außerdem zu bestimmen (zum Beispiel wie von Rice und Knipe 1990 beschrieben), welche Klone ebenfalls funktionsfähiges ICP27 exprimieren, zum Beispiel aufgrund ihrer Fähigkeit, das Wachstum von IPC27- HSV-Stämmen zu unterstützen. Zelllinien, die keine Reversion eines ICP27- mutierten HSV-Stammes zu einem Stamm mit einem funktionsfähigem ICP27 erlauben, werden wie oben beschrieben hergestellt, was sicherstellt, dass der ein funktionsfähiges ICP27-Gen umfassende Vektor keine Sequenzen enthält, die sich mit Sequenzen überschneiden (d.h. homolog sind zu Sequenzen), die in dem ICP27- mutierten Virus verbleiben.
Wo HSV-Stämme der Erfindung inaktivierende Modifikationen in anderen essentiellen Genen, zum Beispiel ICP4, enthalten, umfassen komplementierende Zelllinien ein funktionsfähiges HSV-Gen, welches das modifizierte essentielle Gen auf dieselbe wie für ICP27 beschriebene Art und Weise komplementiert. Zum Beispiel im Falle von HSV-Stämmen, die Mutationen sowohl in ICP27 als auch ICP4 enthalten, wird eine Zelllinie wie E26 verwendet, die sowohl ICP27 als auch ICP4 exprimiert (Samaniego et al., 1995). HSV-Stämme, die andere essentielle Gene exprimieren, können auf ähnliche Weise, wie für ICP27 beschrieben, konstruiert werden. Hier wird wieder die Möglichkeit einer Reversion des Virus zu einer weniger defekten Form während der Anzucht minimiert, wenn es sichergestellt ist, dass es keine Sequenzüberschneidung zwischen der verbleibenden Virus-DNA und der in die Zelllinie für die Virusanzucht inserierten DNA gibt.
Mutationsverfahren
Die betreffenden verschiedenen viralen Gene können mit jeder geeigneten Technik funktionell inaktiv gemacht werden. Zum Beispiel können sie mit Hilfe von Deletionen, Substitutionen oder Insertionen, vorzugsweise mit Hilfe einer Deletion, funktionell inaktiv gemacht werden. Bei Deletionen können Teile der Gene oder das gesamte Gen entfernt sein. Zum Beispiel kann eine Deletion nur eines Nukleotids gemacht werden, was zu einer Leserahmenverschiebung führt. Allerdings werden bevorzugt größere Deletionen gemacht, zum Beispiel wenigstens 25%, bevorzugter wenigstens 50% der gesamten codierenden und nicht-codierenden Sequenz (oder alternativ in absoluten Zahlen wenigstens 10 Nukleotide, bevorzugter wenigstens 100 Nukleotide, am bevorzugtesten wenigstens 1000 Nukleotide). Besonders bevorzugt ist das Entfernen des gesamten Gens und gleichfalls der flankierenden Sequenzen. Inserierte Sequenzen können die unten beschriebenen heterologen Gene umfassen. Insbesondere ist das Inserieren des heterologen Gens in ICP27 oder ICP4 bevorzugt. Im Falle des vmw65-Gens wird nicht das gesamte Gen deletiert, da es ein essentielles Strukturprotein codiert, sondern es wird eine kleine inaktivierende Mutation gemacht, die die Fähigkeit von VMW65 aufhebt, IE-Gene transkriptional zu aktivieren (z.B. wie in Ace et al., 1989 oder Smiley et al., 1997).
Mutationen werden in Herpesviren mit Hilfe homologer Rekombinationsverfahren hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel wird HSV-genomische DNA zusammen mit einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmidvektor, transfiziert, der die von homologen HSV-Sequenzen flankierte mutierte Sequenz umfasst. Die mutierte Sequenz kann Deletionen, Insertionen oder Substitutionen umfassen, die alle mit Hilfe von Routinetechniken hergestellt werden können. Insertionen können selektierbare Markergene, zum Beispiel IacZ oder GFP, für eine Durchmusterung rekombinanter Viren mittels beispielsweise β-Galactosidase-Aktivität oder Fluoreszenz umfassen.
Heterologe Gene und Promotoren
Für eine Verwendung in der Erfindung sind die Viren typischerweise modifiziert, um ein heterologes Gen zu tragen. Der Ausdruck „heterologes Gen" umfasst ein beliebiges Gen. Ein heterologes Gen kann ein Testgen für eine Verwendung in einem Verfahren zur Zielvalidierung oder ein Gen für eine therapeutische Anwendung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder in der Herstellung eines Medikaments sein. Obwohl ein heterologes Gen typischerweise ein Gen ist, das nicht im Genom eines Herpesvirus vorhanden ist, kann ein Herpesgen verwendet sein, vorausgesetzt, dass die codierende Sequenz nicht an die viralen Kontrollsequenzen operativ geknüpft ist, mit denen sie natürlicherweise verbunden ist.
Das heterologe Gen kann eine beliebige Allelvariante eines Wildtyp-Gens sein oder es kann ein mutiertes Gen sein. Der Ausdruck „Gen" soll für Nukleinsäure-Sequenzen stehen, die in der Lage sind, mindestens transkribiert zu werden. Folglich sind von dieser Definition Sequenzen umfasst, die mRNA, tRNA und rRNA codieren. Allerdings bezieht sich die vorliegende Erfindung primär eher auf die Expression von Polypeptiden und/oder mRNA und Antisense-RNA als auf tRNA und rRNA. Der Ausdruck „Gen" steht für ein Polynukleotid, das die für ein Polypeptid codierende Sequenz umfasst. Das Polynukleotid kann ein oder mehrere Introns enthalten, zum Beispiel kann es genomische DNA umfassen. Vorzugsweise umfasst das Polynukleotid cDNA. mRNA codierende Sequenzen umfassen gegebenenfalls einen Teil oder die gesamten 5' und/oder 3' transkribierten aber nicht-translatierten flankierenden Sequenzen, die natürlicherweise oder anderweitig mit der translatierten codierenden Sequenz verbunden sind. Sie können gegebenenfalls außerdem die verbundenen transkriptionellen Kontrollsequenzen umfassen, die normalerweise mit den transkribierten Sequenzen verbunden sind, zum Beispiel Transkriptionsstopsignale, Polyadenylierungsstellen und stromabwärts liegende Enhancer-Elemente.
Inseriert werden kann ein heterologes Gen in das virale Genom mit Hilfe einer homologen Rekombination von HSV-Stämmen mit zum Beispiel Plasmidvektoren, die das heterologe Gen flankiert von HSV-Sequenzen tragen. Das heterologe Gen kann in einen geeigneten Plasmidvektor, der Herpesvirus-Sequenzen umfasst, unter Anwendung in der Technik bekannter Klonierungstechniken eingeführt werden. Das heterologe Gen kann in das virale Genom an einer beliebigen Stelle inseriert sein, vorausgesetzt das Virus kann noch vermehrt werden. Vorzugsweise ist das heterologe Gen in ein essentielles Gen inseriert. Heterologe Gene können an mehreren Stellen des viralen Genoms inseriert sein.
Die transkribierte Sequenz eines heterologen Gens ist vorzugsweise an eine Kontrollsequenz operativ geknüpft, was eine Expression des heterologen Gens in einer Säugerzelle, vorzugsweise in einer Zelle des peripheren Nervensystems, erlaubt. Der Ausdruck „operativ verknüpft" bezeichnet eine nebeneinander liegende Anordnung, worin die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die ihnen die Funktion in ihrer beabsichtigten Weise gestatten. Eine Kontrollsequenz, die an eine codierende Sequenz „operativ geknüpft" ist, ist auf eine Weise verbunden, dass eine Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erhalten wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
Typischerweise steht das heterologe Gen unter Kontrolle eines Promotors, der während der Herpeslatenz aktiv ist. Derartige Promotoren umfassen typischerweise Fragmente der Latenz-assoziierten Transkript-(LAT)-Region des Virus oder sind chimäre Promotoren, die Fragmente der LAT-Region zusammen mit einem nicht-LAT-Promotor umfassen. Derartige in der Latenz aktive Promotoren können die Expression eines endogenen Gens oder endogener Gene innerhalb der LAT-Region des Virus oder, wenn in einem ökotopen inseriert, nicht-LAT-Stelle innerhalb des HSV-Genoms steuern.
Die Kontrollsequenz umfasst einen Promotor, der eine Expression des heterologen Gens erlaubt, und ein Signal für eine Transkriptionstermination. Der Promotor ist aus Promotoren ausgewählt, die in Zellen des peripheren Nervensystems von Säugern, vorzugsweise Ratte, Maus, Meerschweinchen, Frettchen oder Mensch, funktionsfähig sind. Der/die Promotoren) können von Promotorsequenzen eukaryotischer Gene abgeleitet sein. Zum Beispiel kann der Promotor von einem Genom einer Zelle abgeleitet sein, in der eine Expression des heterologen Gens erfolgen soll, die vorzugsweise eine Säugerzelle ist, vorzugsweise eine menschliche Zelle des peripheren Nervensystems ist. Was eukaryotische Promotoren anbelangt, können diese Promotoren sein, die ubiquitär funktionsfähig sind (wie Promotoren von β-Actin, Tubulin) oder alternativ Gewebe-spezifisch sind, wie der Neuron-spezifische Enolase-(NSE)-Promotor. Sie können auch Promotoren sein, die auf spezifische Stimuli antworten, zum Beispiel Promotoren, die Steroidhormon-Rezeptoren binden. Virale Promotoren können ebenfalls verwendet sein, zum Beispiel der Promotor der langen terminalen Wiederholungssequenz des Moloney murinen Leukämievirus (MMLV LTR) oder andere retrovirale Promotoren, der menschliche oder murine Cytomegalovirus (CMV) IE-Promotor oder Promotoren vom Herpesvirus-Gen, einschließlich derjenigen, die eine Expression der Latenz-assoziierten Transkripte steuern.
Expressionskassetten und andere geeignete Konstrukte, die ein heterologes Gen und Kontrollsequenzen umfassen, können unter Anwendung dem Fachmann bekannter Routineklonierungstechniken hergestellt werden (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press).
Es kann ebenfalls von Vorteil sein, induzierbare Promotoren zu verwenden, so dass die Expressionsniveaus des heterologen Gens während der Lebenszeit der Zelle reguliert werden kann. Induzierbar bedeutet, dass die unter Verwendung des Promotors erhaltenen Expressionsniveaus reguliert werden können. Zum Beispiel in einer bevorzugten Anwendungsform, wo mehr als ein heterologes Gen in das HSV-Gen inseriert ist, würde ein Promotor einen Promotor umfassen, der auf das bereits beschriebene tet-Repressor/VP16 Transkriptionsaktivator-Fusionsprotein reagiert (Gossen und Bujard, 1992, Gossen et al., 1995) und das heterologe Gen steuern, dessen Expression reguliert werden soll. Der zweite Promotor würde einen starken Promotor (z.B. den CMV-IE-Promotor) umfassen, der die Expression des tet/VP16-Fusionsproteins steuert. Folglich würde in diesem Beispiel die Expression des ersten heterologen Gens von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Tetracyclin abhängen.
In bevorzugten Anwendungsformen der vorliegenden Erfindung ist ein Promotor verwendet, der eine Genexpression während der Herpesvirus-Latenz erlaubt. Derartige Promotoren können von der LAT-Region abgeleitet sein (z.B. LAP2; Goins et al. 1994) und können chimäre Promotoren sein, die an einen LAT oder nicht-LAT-Promotorfusionierte Sequenzen von der LAT-Region oder andere Elemente enthalten (z.B. Lachmann und Efstathiou, 1997). Diese Promotoren können innerhalb der endogenen LAT-Region des Virus arbeiten oder, wenn sie an einer heterologen Stelle inseriert sind, im Virusgenom arbeiten. In besonders bevorzugten Anwendungsformen sind chimäre Promotoren verwendet, die aus nicht-LAT-Promotoren wie den CMV-, MMLV- oder NSE-Promotoren oder Fragmenten davon bestehen, die an LAT-abgeleitete Sequenzen, einschließlich der in LAP1 (Goins et al. 1994), LAP2 (Goins et al. 1994) und/oder LAT P2 vorhandenen, geknüpft sind. Die LAT P2-Region ist hier als die HSV1-Nukleotide 118866–120219 vom HSV-Stamm 17+ (GenBank HE1CG: von Pstl-BstXI Stellen) definiert und enthält Fragmente oder Derivate dieser Region, einschließlich homologer Regionen anderer HSV1-Stämme und HSV2-Stämme, die in der Lage sind, für ein langandauerndes Expressionsvermögen von den Promotoren zu sorgen, mit denen sie verknüpft sind. Derartige chimäre Promotoren können auch die Expression mehrerer heterologer Gene erlauben, indem Promotorpaare von einem zentralen LAT-abgeleiteten Element entfernt positioniert werden, so dass zwei Gene von einer einzigen Expressionskassette exprimiert werden können (z.B. wie in Thomas et al. 1999).
Heterologe Gene in Viren für therapeutische Anwendungen codieren typischerweise Polypeptide für eine therapeutische Anwendung. Zum Beispiel stimulieren Gene, die Schmerzen modulieren, das Nervenwiederwachstum oder verhindern eine Nervendegeneration. Heterologe Gene können Wildtyp-Gene oder können mutierte Gen sein, um die Funktion des Gens zu verstärken oder um die Funktion des Gens zu hemmen. Zum Beispiel kann, wo ein endogenes Gen bei einer peripheren Nervensystemstörung überexprimiert wird, ein nicht-funktionsfähiges Gen, das die Funktion des endogenen Gens zerstört, für die Behandlung der Störung zweckdienlich sein.
Insbesondere kann/können das/die heterologe(n) Gen(e) ein Polypeptid codieren, das in der Lage ist, Reaktionen auf Schmerzstimuli zu verändern oder chronischen Schmerz zu vermindern, zum Beispiel ein Protein, das in der Lage ist, zum Beispiel einen Nervenwachstumsfaktor, einen anderen Schmerz modulierenden neurotrophen Faktor oder neurotrophen Faktor ähnliche Moleküle oder Substanz P oder andere Neuropeptide abzugeben. Das/die heterologe(n) Gene) kann/können ebenfalls ein Polypeptid codieren, das in der Lage ist, das Wiederwachstum von defekten Nerven zu stimulieren oder die weitere Degeneration von Nerven bei degenerativen Zuständen zu verhindern.
Geeignete heterologe Gene umfassen Wachstumsfaktoren wie NT-3, NT-4, NT-5, Reg-2, CNTF, GDNF, BDNF, NGF, TrkA und TrkB, Neuropeptide wie Substanz P und Galanin, anti-apoptotische Gene wie Bcl2 und Schmerzmodulatoren wie Enkephalin.
Heterologe Gene können ebenfalls Markergene (zum Beispiel Gene, die p-Galactosidase oder grün fluoreszierendes-Protein oder andere fluoreszierende Proteine codieren) oder Gene umfassen, deren Produkte die Expression anderer Gene regulieren (zum Beispiel die Transkription regulierende Faktoren, einschließlich des oben beschriebenen tet-Repressor/vmw65 Transkriptionsaktivierungsfusionsproteins).
Zielvalidierung, Gentherapie und andere therapeutische Anwendungen können auch die Verabreichung mehrerer Gene erfordern. Die Expression mehrerer Gene kann für die Behandlung verschiedener Zustände von Vorteil sein. Herpesviren eignen sich einzigartig, da sie nicht die eingeschränkten Verpackungsfähigkeiten anderer viraler Vektorsysteme besitzen. Folglich können mehrere heterologe Gene in ihrem Genom untergebracht sein. Es gibt zum Beispiel wenigstens zwei Möglichkeiten, mit denen dies erreicht werden könnte. Zum Beispiel könnten mehr als ein heterologes Gen und assoziierte Kontrollsequenzen in einem besonderen HSV-Stamm entweder an einer einzigen Stelle oder an mehreren Stellen im Virusgenom eingeführt sein. Es wäre ebenfalls möglich, Promotorpaare (die gleichen oder verschiedene Promotoren) zu verwenden, die zueinander in entgegengesetzter Orientierung positioniert sind, wobei diese Promotoren jeweils, wie oben beschrieben, die Expression eines heterologen Gens (des gleichen oder eines anderen heterologen Gens) steuern.
Ein Virus kann ein, zwei, drei, vier oder mehr heterologe Gene umfassen. Wo das Gen ein Testgen für die Verwendung in einem Verfahren zur Zielvalidierung ist, umfasst das Virus typischerweise ein heterologes Gen. Das Virus kann ein, zwei oder mehr Kopien eines heterologen Gens umfassen. Ein Virus für die Verwendung in einem Verfahren zur Zielvalidierung kann mehr als ein heterologes Testgen umfassen. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Durchmusterung mehrerer Gene, zum Beispiel 2 bis 20 Gene, vorzugsweise 2 oder 4 bis 10 Gene, oder eine Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Genen im Test, die geprüft werden sollen. Falls eine Wirkung eines Testgens beobachtet wird, können weitere Viren, die weniger Testgene, zum Beispiel ein oder zwei Testgene, tragen, verwendet werden, um zu bestimmen, welches der Gene für die beobachtete Wirkung verantwortlich ist.
Von heterologen Genen für eine Verwendung in Verfahren zur Zielvalidierung wird typischerweise vermutet, dass sie für eine periphere Nervensystemstörung von Bedeutung sind. Zum Beispiel kann ein Gen mit einer Störung in Verbindung gebracht werden aufgrund seines Vorhandenseins auf einer Region eines Chromosoms, das mit der Störung verbunden ist. Alternativ kann ein Gen mit einer peripheren Nervensystemstörung in Verbindung gebracht werden, falls es bekanntlich in dem peripheren Nervensystem exprimiert wird. Ein Gen kann ganz besonders mit einer peripheren Nervensystemstörung in Verbindung gebracht werden, wenn es in einer Zelle des peripheren Nervensystems oder in einem Gewebe auf- oder herabreguliert ist, das von einer Zelle des peripheren Nervensystems innerviert ist während eines natürlichen, künstlichen oder induzierten Krankheitsstadiums oder nach einer Nervenschädigung oder nach einer Verabreichung eines Stimulus, der ein akutes oder chronisches Schmerzstadium induziert, oder eines anderen Stimulus, der eine Dysfunktion in oder Änderung der normalen Funktionsweise des peripheren Nervensystems oder einer peripheren Nervenzelle induziert.
Überwachender Phänotyp
Der Ausdruck „Phänotyp", wie er hier verwendet wird, wird zur Bezeichnung eines beliebigen physischen Anzeichens einer Störung des Zentralnervensystems verwendet. Der Ausdruck „Phänotyp" soll folglich Änderungen auf molekularer, zellulärer, geweblicher, kognitiver Ebene und Verhaltensebene umfassen. Schädigung und Trauma des Zentralnervensystems, zum Beispiel als Folge einer physikalischen und chemischen Verletzung, sind ebenfalls von dem Ausdruck „Phänotyp" umfasst.
Jeder geeignete Phänotyp, der mit einer Störung des peripheren Nervensystems verbunden ist, kann überwacht werden. Zum Beispiel kann die Empfindlichkeit eines Tieres auf Schmerz unter Anwendung eines beliebigen geeigneten Tests zur Überwachung der Verhaltensreaktion eines Tieres auf Schmerzstimuli überwacht werden. Ein Testgen, das die Schmerzempfindlichkeit beeinflusst, wird typischerweise die Reaktion eines Tieres auf einen gegebenen Stimulus erhöhen oder verringern. Kontrollreaktionen können durch Testen eines Tieres vor der Inokulation mit dem Virus oder durch Testen eines oder mehrerer Kontrolltiere bestimmt werden. Ein Kontrolltier ist ein Tier, dem kein Virus inokuliert oder dem ein Kontrollvirus inokuliert worden ist, das kein heterologes Gen exprimiert oder ein heterologes Gen exprimiert, das den Phänotyp von Interesse nicht beeinflusst. Ein Phänotyp, der mit einer Störung des peripheren Nervensystems verbunden ist, kann auch auf zellulärer oder molekularer Ebene überwacht werden. Dies ist besonders wichtig, wenn die Wirkung eines Testgens in vitro überwacht wird, zum Beispiel im Anschluss einer Isolierung von Zellen des peripheren Nervensystems, die nach einer peripheren Inokulation mit einem Virus der Erfindung transduziert worden sind. Zum Beispiel kann die Zellreaktion auf die Applikation eines chemischen Reizes wie Capsaicin überwacht werden. Dies kann unter Anwendung elektrophysiologischer Techniken durchgeführt werden. Alternativ kann jede Änderung bei der Genexpression in einer Zelle des peripheren Nervensystems als Reaktion auf das Testgen überwacht werden, wie Reaktionen auf Stimuli, die sonst einen Zelltod auslösen könnten.
Ein Testgen kann als ein Ziel für eine Gentherapie oder Modulatoren für kleine Moleküle geeignet sein, die bei der Behandlung einer peripheren Nervensystemstörung zweckdienlich sind, wenn es einen mit der Störung verbundenen Phänotyp beein flusst. Ein Gen, das als ein Ziel unter Anwendung eines Verfahrens der Erfindung identifiziert worden ist, kann in einem Verfahren zur Durchmusterung von Agentien verwendet werden, die in der Behandlung einer peripheren Nervensystemstörung zweckdienlich sind, wenn das Gen einen mit der Störung verbundenen Phänotyp beeinflusst. Im Allgemeinen kann ein Testgen für die Beeinflussung eines Phänotyps in Betracht kommen, wenn es den Phänotyp hemmt oder verstärkt, zum Beispiel kann die Expression eines Phänotyps um wenigstens 5%, zum Beispiel um wenigstens 10%, wenigstens 15%, wenigstens 20% oder wenigstens 25%, bevorzugt um wenigstens 30%, zum Beispiel wenigstens 40% oder wenigstens 50%, bevorzugter um wenigstens 70%, zum Beispiel wenigstens 80% oder wenigstens 90% verglichen mit Kontrollen erhöht oder vermindert sein.
Inokulation eines peripheren Nervs
Ein replikationsinkompetentes Herpesvirus wird typischerweise in einen peripheren Nerv durch direkte Applikation auf den Nerv inokuliert, zum Beispiel mittels Injektion. Im Allgemeinen wird das Virus mit einem Titer von 10⁴ bis 10¹⁰ pfu, bevorzugt von 10⁷ bis 10¹⁰ pfu, bevorzugter wenigstens 10⁸ pfu, appliziert. Typischerweise wird 1 μl bis 20 μl, bevorzugt 2 μl bis 10 μl, bevorzugter 2 μl bis 5 μl, Virussuspension injiziert.
Jedem peripheren Nerv, zum Beispiel Ischias-, Femoralis-, Ulnaris-, Medianus- oder Radialisnerv, kann das Virus injiziert werden. Der Nerv ist bevorzugt ein Nerv, eines Säugers, zum Beispiel eines Nagers wie Maus oder Ratte, eines Primaten wie Affe oder eines Wiesels oder Schweins. Der Nerv kann in einem nicht-menschlichen Tier vorhanden sein, das eine periphere Nervensystemstörung nachbildet. Das Tier kann ein transgenes Tier sein.
Therapeutische Anwendungen
Replikationsinkompetente Herpesviren, die in der Lage sind, Zellen des peripheren Nervensystems zu infizieren, wie es hier beschrieben ist, können in Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Störungen des peripheren Nervensystems verwendet sein. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck „Störung" jeden Zustand des peripheren Nervensystems umfassen, der die normale Funktion des peripheren Nervensystems beeinflusst. „Zustände", „Krankheiten" und „Verletzung" des peripheren Ner vensystems sind folglich von dem Ausdruck „Störung" umfasst. Der Ausdruck „Störung" umfasst ebenfalls Tiermodelle von Störungen des peripheren Nervensystems. Insbesondere können Viren der Erfindung für die Behandlung von Schmerzstadien oder zur Stimulierung des Nervenwiederwachstums oder zur Prävention einer Nervendegeneration verwendet sein.
Die Herpesviren der vorliegenden Erfindung können folglich zur Übertragung therapeutischer Gene auf einen Menschen oder Tier, der/das einer Behandlung bedarf, verwendet werden. Eine Übertragung therapeutischer Gene unter Verwendung der Herpesviren der Erfindung kann zur Behandlung peripherer Nervensystemstörungen, zum Beispiel Schmerz, degenerativen Zuständen, oder zur Stimulierung des Nervenwiedenroachstums verwendet werden. Im Allgemeinen wird der Zustand eines Patienten, der an einer peripheren Nervensystemstörung leidet, durch die Verabreichung des Virus verbessert.
Ein Verfahren zur Durchführung einer Therapie umfasst ein Inserieren eines therapeutischen Gens in das Genom des Herpesvirus der Erfindung, wie es oben beschrieben ist, und dann die Kombination des resultierenden rekombinanten Virus, als aktiven Bestandteil, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. Geeignete Träger und Verdünnungsmittel umfassen isotonische Saline, zum Beispiel Phosphatgepufferte Saline.
Eine Genübertragung auf Zellen des peripheren Nervensystems kann durch eine Direktinjektion der Vektorzusammensetzung in einen peripheren Nerv eines Menschen oder Tieres durchgeführt werden. Die Menge an verabreichtem Virus liegt im Bereich von 10⁴ bis 10¹⁰ pfu, bevorzugt 10⁵ bis 10⁸ pfu, bevorzugter etwa 10⁶ bis 10⁸ pfu oder 10⁸ bis 10¹⁰ pfu. Bei einer Injektion werden typischerweise 1–200 μl, bevorzugt 1 bis 10 μl Virussuspension, abhängig von Spezies und Nerv in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht.
Die beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sind nur als Richtschnur gedacht, da ein erfahrener praktischer Arzt in der Lage ist, ohne weiteres den opti malen Verabreichungsweg und die optimale Dosierung zu bestimmen. Die Dosis eines Modulators kann gemäß verschiedenen Parametern, besonders gemäß der eingesetzten Substanz, dem Alter, Gewicht und Zustand des zu behandelnden Patienten; dem Verabreichungsweg und dem erforderlichen Dosierungsschema bestimmt werden. Ein Arzt ist in der Lage, die erforderliche Dosierung für jeden bestimmten Patienten zu bestimmen.
Die Erfindung wird mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, die sie nur veranschaulichen und nicht beschränken sollen.
BEISPIELE
Material und Methoden
Virusstämme
Replikationsinkompetente Virusstämme stammen vom HSV1 Stamm 17+, dessen Nukleotidsequenz bei GenBank (Hinterlegungsnummer HE1 CG) hinterlegt ist. Diese können auf 27/12/M:4-Zellen vermehrt werden, welche BHK-Zellen sind, die die HSV ICP27 und ICP4-codierenden Gene und das equine Herpesvirus-Gen 12 enthalten (Thomas et al., 1999). Diese Zelle erlauben ein effizientes Wachstum von Viren mit Mutationen in ICP4, ICP27 und mit Mutationen in vmw65, die ihre Transaktivierungsaktivität vermindern. Viren, die keine Mutationen in ICP27 aber Mutationen in ICP4 und vmw65 enthalten, können in B4/2-Zellen vermehrt werden, die den 27/12/M:4-Zellen ähnlich sind, aber nicht das ICP27-codierende Gen enthalten. Alternativ können B130/2-Zellen entweder mit oder ohne HMBA, das Mutationen nur für ICP27 komplementiert (Howard et al., 1998), für die Anzucht von Viren verwendet werden, die keine Mutationen von ICP4 umfassen.
Die vorliegende Erfindung wurde unter Verwendung von Virusstamm 1764/27-/4-/pR19lacZ und 1764/4-pR19lacZ beispielhaft veranschaulicht. Das erste Virus ist ICP34.5, ICP27 und ICP4 deletiert mit einer inaktivierenden Mutation in vmw65, wie es zuvor für den Virusstamm 1764/27-/4-/pR20.5 beschrieben wurde (Thomas et al. 1999). Das zweite Virus ist mit dem ersten Virus identisch, außer dass ICP27 nicht deletiert ist. Diese Viren enthalten eher eine CMV-Promotor-Kassette (von pcDNA3; Invitrogen)/lacZ (pCH110; Pharmacia)/poly A (von pcDNA3), inseriert in beide Kopien der LAT-Region zwischen den BstXI Stellen bei Nukleotid 120.219 und 120.413, als die von Thomas et al 1999 beschriebene Insertion in ICP4. Virusstamm 1764/27-/4-/pR19GFP ist mit Virusstamm 1764/27-/4-/pR19lacZ identisch, außer dass das lacZ-Gen direkt durch das GFP-Gen ersetzt worden ist (Clontech). Andere Virusstämme 17+/pRlacZ (Wagstaff et al. 1998; ICP27-Deletion) und 1764/27-/pR20.5/vhs (ICP34.5, ICP27 deletiert, inaktivierende Mutation in vmw65) wurden ebenfalls für Pfotenballenversuche verwendet.
Beispiel 1. Replikationsinkompetentes HSV zeigt nur eine wenig effiziente Genübertragung auf Zellen des peripheren Nervensystems nach einer Pfotenballen-Inokulation.
Balb/c Mäuse wurden über den Pfotenballen-Weg, wie bereits beschrieben (Coffin et al. 1996), mit 20 μl Virusstamm 1764/27-/4-/pR19lacZ, 17+/pR19lacZ oder 1764127-/pR20.5/vhs mit einem Titer von 1 × 10⁷ pfu/ml, 1 × 10⁸ pfu/ml und 5 × 10⁸ pfu/ml inokuliert. DRGs wurden 1 Woche nach Inokulation entnommen und fixiert und wie bereits beschrieben mit X-gal gefärbt (Coffin et al. 1996). Im Gegensatz zu Ergebnissen, die mit replikationsinkompetenten Viren mit Mutationen in ICP34.5 oder vmw65 und ICP34.5 bereits erhalten wurden (Coffin et al. 1996), war nur eine sehr geringe Genexpression mit jedem Virus bei jedem getesteten Titer zu beobachten. Allerdings war mit 1764/27-/4-/pR19lacZ ein Maximum von X-gal gefärbten Zellen bei dem höchsten verwendeten Titer verglichen mit einem Maximum von 5 Zellen mit weniger defekten Viren, die ebenfalls getestet wurden, zu beobachten. Deshalb können keine replikationsinkompetente HSV für eine effiziente Genübertragung auf Hinterwurzelganglionzellen nach einer Pfotenballen-Inokulation in Mäuse verwendet werden, obwohl der am höchsten defekte replikationsinkompetente Vektor leicht verbesserte Ergebnisse verglichen mit anderen getesteten replikationsinkompetenten Vektoren ergab.
Beispiel 2. Gene können auf Zellen des peripheren Nervensystems unter Verwendung eines replikationsinkompetenten HSV-Vektors mit Mutationen in ICP27, ICP4 und vmw65 nach einer Direktinjektion in einen peripheren Nerv effizient übertragen werden.
Balb/c-Mäuse wurden mit einer Direktinjektion in den Ischiasnerv mit 2–5 μl Virusstamm 1764/27-/4-/pR19lacZ mit einem Titer von 1 × 10⁷ pfu/ml, 1 × 10⁸ pfu/ml und 5 × 10⁸ pfu/ml inokuliert. Für die Inokulation wurden die Tiere betäubt, der Ischiasnerv freigelegt und die Virussuspension mit einer Glasmikropipette injiziert. Die Wunde wurde dann verschlossen und die Tiere durften genesen. DRGs wurden 1 Woche nach Inokulation entnommen und fixiert und wie oben mit X-gal gefärbt. Im Gegensatz zu den obigen Ergebnissen erfolgte eine geringe Genübertragung mit den beiden geringeren Titern (z.B. < 20 Zellen X-gal + ve bei 1 × 10⁷ pfu/ml und 1 × 10⁸ pfu/ml) und eine sehr hohe Genübertragungseffizienz konnte bei einem Titer von 5 × 10⁸ pfu/ml erhalten werden mit vielen Hunderten bis Tausenden zu beobachtenden X-gal gefärbten, lacZ + ve Zellen. Deshalb kann bei einem hinreichenden Titer replikationsinkompetentes HSV für eine hoch effiziente Genübertragung auf Hinterwurzelganglionzellen nach einer direkten Injektion von Vektorsuspensionen in periphere Nerven verwendet werden.
Beispiel 3. Gene können auf Zellen des peripheren Nervensystems unter Verwendung eines replikationsinkompetenten HSV-Vektors mit Mutationen in ICP4 und vmw65 nach einer Direktinjektion in einen peripheren Nerv effizient übertragen werden.
Balb/c-Mäuse wurden mit einer Direktinjektion in den Ischiasnerv mit 2–5 μl Virusstamm 1764/4-/pR19lacZ mit einem Titer von 3 × 10⁸ pfu/ml inokuliert. Für die Inokulation wurden die Tiere betäubt, der Ischiasnerv freigelegt und die Virussuspension mit einer Glasmikropipette injiziert. Die Wunde wurde dann verschlossen und die Tiere durften genesen. DRGs wurden 1 Woche nach Inokulation entnommen und fixiert und wie oben mit X-gal gefärbt. Ähnlich den oberen Ergebnissen in Beispiel 2 konnten viele X-gal gefärbte, lacZ + ve Zellen beobachtet werden.
Beispiel 4. Cre-Rekombinase exprimierende replikationsinkompetente HSV-Vektoren steuern effizient die Exzision intervenierender Gensequenzen in loxP enthaltenden transgenen Mäusen.
Virusstamm 1764/27-/4-/pR19Cre wurde durch Ersetzen des lacZ-Gens in Virusstamm 1764/27-/4-/pR19lacZ durch das Cre-Rekombinase-Gen mit Hilfe homologer Rekombination mit Plasmid pR19Cre konstruiert. Plasmid pR19Cre wurde durch Ersetzen des lacZ-Gens in Plasmid pR19 (Wagstaff et al. 1998) durch das Cre-Rekombinasegen (Sterberg und Hamilton, 1981) konstruiert. Modifizierte Rosa26-Mäuse (Mao et al. 1999), die eine transgene Linie sind, die IacZ an einer die konstitutive Expression erlaubenden Genomposition enthalten, aber vor dem Neomycin-Resistenzgen, das von loxP Stellen flankiert ist, was eine lacZ-Expression bei Ausbleiben einer vorherigen Cre-Rekombinase-vermittelten Rekombination verhindert, wurden über den Ischiasnerv mit 2–5 μl je Virusstamm 1764/27-/4-/pR19Cre oder Virusstamm 1764/27-/4-/pR19GFP mit Titern von 3 × 10⁸ pfu/ml inokuliert. Zwei Tage später wurden DRGs entnommen und fixiert und mit X-gal wie oben nach Beobachtung auf GFP-Fluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskopie gefärbt. DRGs von Mäusen, denen Virusstamm 1764/27-/4-/pR19GFP inokuliert wurde, zeigten keine X-gal-Färbung, wie erwartet, sondern zeigten eine übermäßige GFP-Fluoreszenz. Folglich stimuliert eine Virus-Infektion per se nicht eine Rekombination an den loxP-Stellen in Rosa26-Mäusen und erlaubt deshalb keine lacZ-Expression. DRGs von Mäusen, denen allerdings Virusstamm 1764/27-/4-/pRCre inokuliert wurde, zeigten, während sie wie erwartet keine GFP-Fluoreszenz zeigten, eine übermäßige lacZ-Expression, in einer ähnlichen Anzahl an Zellen wie GFP nach einer Inokulation mit Virusstamm 1764/27-/4-/pR19GFP exprimiert wurde, was andeutet, dass eine Cre-vermittelte Rekombination an den loxP-Stellen stattgefunden hatte und dass deshalb funktionsfähige Cre-Rekombinase produziert worden war.
Literaturnachweise

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Claims

Verwendung eines replikationsinkompetenten Herpesvirus, welchem/s: (i) mindestens ein funktionelles Immediate-Early-Gen fehlt, ausgewählt aus Genen, die ICP4 und ICP27 codieren; (ii) ein funktionelles VMW65-Gen fehlt aufgrund einer Mutation in diesem Gen, welche die Transkriptionsaktivierungs-Aktivität aufhebt; und (iii) ein heterologes Gen, das operativ an die LAT P2-Region geknüpft ist, oder ein Fragment davon, und einen nicht-LAT-Promotor umfasst, wobei die LAT P2-Region oder ein Fragment davon zur Verleihung eines langfristigen Expressionsvermögens an den nicht-LAT-Promotor fähig ist; in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung oder Verhütung einer peripheren Nervensystemstörung druch Verabreichen des Medikaments an einen peripheren Nerv durch Direktinjektion in den Nerv.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Virus ein Herpes-simplex-Virus 1 oder 2 ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei dem Virus sowohl ein funktionelles Gen, das ICP4 codiert, als auch ein funktionelles Gen, das ICP27 codiert, fehlt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dem Virus funktionelle Gene fehlen, die ICP0, ICP4, ICP22 und ICP27 codieren.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die LAT P2-Region eine HSV2 LAT P2-Region ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die LAT P2-Region eine HSV1 LAT P2-Region ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die HSV1 LAT P2-Region die Nukleotide 118866-120219 des HSV1-Stamms 17+, oder ein Fragment davon, umfasst.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Virus ein Herpesvirus-Amplikonvektor ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das heterologe Gen ein Polypeptid oder eine Antisense-RNA von therapeutischem Nutzen codiert.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Polypeptid oder die RNA zum Modulieren von Schmerz, Stimulieren der Nervenregeneration oder Verhüten einer Nervendegeneration fähig ist.
Verfahren zum Untersuchen einer peripheren Nervensystemstörung in einem nicht-menschlichen Tier, welches Verfahren das Überwachen einer Wirkung der Expression eines heterologen Gens in einem peripheren Nerv umfasst, wobei das heterologe Gen zu dem Nerv durch Direktinjektion eines replikationsinkompetenten Herpesvirus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, in den Nerv transportiert worden ist, wobei das Gen mit einer peripheren Nervensystemstörung in Verbindung steht und wobei die Störung ausgewählt ist aus Motoneuron-Erkrankung, Schmerz, peripherer Nervenschädigung und einer Neuropathie.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Gen ein Protein codiert, ausgewählt aus einem Neuropeptid und einem Wachstumsfaktor.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das nicht-menschliche Tier ein Modell für die Störung bildet.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Tier ein transgenes Tier ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Empfindlichkeit für Schmerzreize, die Nervenregeneration und die Nervendegeneration überwacht wird.