DE60209570T2

DE60209570T2 - Screening-verfahren unter verwendung eines fisch-modells zur beurteilung der sehkraft

Info

Publication number: DE60209570T2
Application number: DE60209570T
Authority: DE
Inventors: Paul Cambridge GOLDSMITH
Original assignee: Daniolabs Ltd
Current assignee: Daniolabs Ltd
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2022-12-03
Also published as: GB2382579A; EP1456375B1; ATE318897T1; US20050015823A1; JP2005511052A; DE60209570D1; GB2382579B; WO2003048356A1; EP1456375A1; AU2002365717A1; GB0128796D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von Erkrankungsmodellen, beispielsweise in Tests zur Identifikation und Untersuchung von Genen und Substanzen, die in Erkrankung und Erkrankungsbehandlung, Identifikation und Verwendung von Wirkstoff-Targets eingebunden sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung und Verwendung von Erkrankungsmodellen an Fischen wie Zebrafischen. Die Erfindung betrifft weiters die Verwendung von Erkrankungsmodellen von Fischen, z.B. Zebrafischen, bei genetischen Suppressor-Screens.
Für zahlreiche Erkrankungen verantwortliche Gene sind mittlerweile bekannt. In zahlreichen Fällen wurden für diese Erkrankungen Tiermodelle gebildet. Die meisten dieser Modelle existieren für Säugetiere wie Ratten und Mäuse oder für Wirbellose wie Drosophila. Der Vorteil der Verwendung von Säugetiermodellen ist ihre größere Ähnlichkeit zu Menschen, während die Verwendung von Wirbellosen die Gelegenheit bietet, eine hochentwickelte genetische Analyse durchzuführen, um Gene zu identifizieren, die in eine bestimmte Erkrankung eingebunden sind.
Während die Identifikation der Erkrankungen auslösenden Gene zur Unterstützung der Aufklärung von Krankheitsmechanismen nützlich ist, führt sie nicht notwendigerweise zu Behandlungsstrategien. Es wäre nützlich, über ein Modellsystem zu verfügen, in dem Screens durchgeführt werden können, um ein Gen zur Heilung einer bereits existierenden Erkrankung zu identifizieren. Solch ein System wäre besonders für menschliche Erkrankungen relevant, wenn es in einem Wirbeltier und in vivo durchgeführt werden würde.
Der Zebrafisch ist ein Organismus, der zahlreiche der Vorteile von Säugetier- und Wirbellosen-Modellsystemen kombiniert. Er ist ein Wirbeltier und somit für Modelle zu menschlichen Erkrankungen relevanter als Drosophila oder andere Wirbellose, kann jedoch im Gegensatz zu anderen Wirbeltiermodellen verwendet werden, um genetische Screens durchzuführen.
Der Zebrafisch hat eine kurze Reifungsperiode von zwei bis drei Monaten und ist äußerst fruchtbar, wobei ein einzelnes Paar erwachsener Fische in der Lage ist, 100 bis 200 Nachkommen pro Woche hervorzubringen. Sowohl die Embryonen als auch die Erwachsenen sind klein, billig und leicht zu erhalten und bieten somit die Möglichkeit von umfassender Skalierbarkeit. Es ist möglich, zufällige Mutationen in das Zebrafischgenom einzuführen, beispielsweise mittels der Verwendung von chemischer Mutagenese (Solnica-Krezel et al., Genetics 136(4), 1401–1420 (1994)). Auch ist es möglich, transgene Fische herzustellen, die exogene Gene in sich tragen. Zebrafische, die ein heterologes Ikaros-Protein exprimieren, wurden bereits verwendet, um Blutbildungs- und Lymphgewebsbildungs-Störungen in Modellen nachzubilden (WO 01/40273).
Die WO 99/42606 betrifft ein Verfahren zum Screenen eines Mittels auf eine angiogenetische Aktivität oder Zelltodaktivität oder toxische Aktivität, umfassend das Verabreichen des Mittels an einen Knochenfisch (z.B. Zebrafisch, Medaka, "Riesen-Zebrafisch" (Giant rerio) oder Kugelfisch) und das Nachweisen einer Reaktion im Knochenfisch, was auf angiogenetische Aktivität oder eine Wirkung auf die Zelltodaktivität oder eine toxische Wirkung in zumindest einem Gewebe oder Organ des Knochenfisches hinweist.
Die WO 01/12667 beschreibt die Verwendung eines Transgens, um Markerexpression im Auge zu steuern. Der Organismus kann ein Fisch sein. Diese Anmeldung schlägt vor, durch ein Verfahren, das das Einführen eines genetischen Konstrukts zur Expression eines Markers in ausreichender Weise, um den Marker in lichtrezeptiven Zellen oder im lichtrezeptiven Organ nachzuweisen, und das Selektieren auf Transgenese durch Detektion per Sichtprüfung des Markers in einer lichtrezeptiven Zelle oder einem lichtrezeptiven Organ umfasst, ein transgenes Tier zu bilden (das laut der Anmeldung ein Fisch sein kann).
Die WO 01/51604 (Exelixis) betrifft das Bereitstellen von Sensibilisatorgenen wie einem Tumorgen oder einem Onkogen in einem nicht-menschlichen Tier (für das Zebrafische als eine vorübergehende hypothetische Möglichkeit genannt werden) in Zellen, in denen Expression nicht letal ist. Es wird vorgeschlagen, Veränderungen nachzuweisen und bei Mutation oder anderer Behandlung zu vergleichen. Ziel ist die Identifikation von "Wechselwirkungsgenen", die, sofern mutiert, Targetgewebe (das dem Sensibilisatorgen ausgesetzt wurde) in spezifischer Weise töten oder die Größe von diesem Gewebe reduzieren.
Kennedy et al., J. Biol. Chem. 276, 14037–14043 (2001), betrachten die Expression eines Markergens wie GFP im Auge von Zebrafischen unter der Steuerung eines Zebrafisch-Stäbchen-Opsin-Promotors.
Die WO 98/56902 offenbart die Verwendung von transgenem Fisch, einschließlich Zebrafisch, und Verfahren zur Kreuzung von Fischstämmen, einschließlich Stämmen mit Mutationen, wobei dies darauf abzielt, Gene zu identifizieren, die Expression von Fischgenen beeinflussen.
Zusätzlich zu Zebrafischen sind auch andere Fische wie Fugu, Goldfisch, Medaka und Riesen-Zebrafisch für Manipulation, Mutation und Untersuchung sowie für Verwendungen in Aspekten und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie hierin offenbart, einsetzbar.
Die vorliegende Erfindung stellt Fisch- (z.B. Zebrafisch-)Erkrankungsmodelle bereit, die nicht nur Darstellungen der zugrundliegenden Erkrankung sind, sondern auch zur Verwendung in einem darauf folgenden Screen einsetzbar sind. Vorteilhafterweise ermöglicht die vorliegende Erfindung Untersuchung und Screenen in Fällen, in denen die Störung oder Erkrankung ohne die Erfindung zu Fischen führen würden, die wahrscheinlich weder lebensfähig noch fortpflanzungsfähig wären. Die Erfindung ist im Allgemeinen auf jegliche von zahlreichen verschiedenen Erkrankungen und Störungen anwendbar, und eine Reihe von Beispielen werden hierin insbesondere beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel, insbesondere transgene Fische wie Zebrafische, zur Verwendung in Verfahren zum Screenen auf und zur Identifikation von ein(em) Gen bereit, das, sofern mutiert, die Aktivität oder die Wirkung eines Krankheitsgens und somit eines Erkrankungs-Phänotyps verändert. Ein zweites Gen, dessen Mutation Aktivität oder Wirkung eines ersten Krankheitsgens beeinflusst, wird als Suppressorgen bezeichnet. Suppressorgene stellen Targets für Wirkstoffe zur Behandlung der Erkrankung dar.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein Gen, insbesondere ein Krankheitsgen, unter Regulationskontrolle eines Augen-spezifischen Promotors in einen Fisch, z.B. einen Zebrafisch, eingeführt. Somit wird genetische Modifikation, um ein Krankheitsgen einzuführen, das normalerweise zu Tiersterblichkeit, Mangel an Lebensfähigkeit und/oder Mangel an Fortpflanzungsfähigkeit führt, in solcher Weise durchgeführt, dass Sterblichkeit, Mangel an Lebensfähigkeit und/oder Mangel an Fortpflanzungsfähigkeit vermieden wird. Zu Screening-Zwecken ist es von großem Vorteil, dass der vorliegende mutierte oder genetisch modifizierte Organismus in der Lage ist, ein Fortpflanzungsalter zu erreichen und neue Nachkommenschaft hervorzubringen, die auch die genetische Veränderung in sich trägt.
In anderen Ausführungsformen kann ein transgener Modellfisch mit einer Testsubstanz behandelt werden, um durch Bewertung des Sehvermögens des Fisches auf eine Testsubstanz, die in der Lage ist, Aktivität oder Wirkung des Transgens zu beeinflussen, zu screenen, und/oder kann einer Mutation unterzogen werden, um ein Gen im Fisch zu identifizieren, das Aktivität oder Wirkung des Transgens auf das Sehvermögen bewirkt. In ähnlicher Weise kann ein Modellfisch durch Behandlung mit einer Substanz, z.B. mit einer Substanz, die das Sehvermögen beeinflusst, wie 2,5-Hexandedion (arch toxicol 72, 597–600 (1998)), N-3--pyridylmethyl-N'-p-nitrophenylharnstoff (Br. J. Ophthalmol. 78, 584–590 (1988)), oder durch eine physikalische Behandlung, z.B. mittels Licht, gebildet werden: Licht-induzierte Degeneration wurde auch bereits beschrieben (J. Neurobiol. 44, 289–307 (2000)). Ein Modellfisch, der mittels solch einer Behandlung bereitgestellt wurde, kann dann in einem Screen auf ein Gen, das die Wirkung der Behandlung beeinflusst, und/oder auf eine Testsubstanz, die die Wirkung der Behandlung beeinflusst, verwendet werden. Die Wirkung eines Gens oder einer Behandlung kann durch Vergleichen des Sehvermögens eines Modells und eines behandelten und/oder mutierten Fisches bewertet werden.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen auf eine Substanz oder ein Gen bereit (hierin als "erstes Gen" bezeichnet), die/das die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens, oder die Aktivität oder Wirkung einer Behandlung, an einem Fisch beeinflusst, umfassend:
das Bereitstellen, als Modellfisch zum Screenen, (i) eines Fisches, der für das zweite Gen transgen ist, worin das zweite Gen unter Regulationskontrolle eines Augen-spezifischen Promotors steht und Expression des zweiten Gens innerhalb des Auges des Fisches das Sehvermögen des Fisches beeinflusst; oder (ii) eines Fisches, der der Behandlung unterzogen wird, worin die Behandlung das Sehvermögen des Fisches beeinflusst;
das Mutieren des Modellfisches, um einen mutierten Fisch bereitzustellen, oder das Behandeln des Modellfisches mit einer Testsubstanz, um einen behandelten Fisch bereitzustellen;
das Vergleichen des Sehvermögens des mutierten Fisches oder behandelten Fisches mit dem Sehvermögen eines Modellfisches, um im Vergleich mit dem Modellfisch jeglichen mutierten Fisch oder behandelten Fisch mit verändertem Sehvermögen zu identifizieren;
um hierdurch eine Testsubstanz zu identifizieren, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens oder die Aktivität oder Wirkung der Behandlung beeinflusst, oder um, durch Identifikation eines genetischen Unterschieds zwischen Modellfisch und mutiertem Fisch mit solch einem veränderten Sehvermögen, ein erstes Gen zu identifizieren, das die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens oder die Aktivität oder Wirkung der Behandlung beeinflusst.
Das Verfahren kann das Mutieren des Modellfisches, der für das zweite Gen transgen ist, um mutierten Fisch bereitzustellen, und das Identifizieren eines ersten Gens umfassen, das die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens beeinflusst.
Das Verfahren kann die Behandlung des Modellfisches, der für das zweite Gen transgen ist, mit einer Testsubstanz, um behandelten Fisch bereitzustellen, und das Identifizieren einer Testsubstanz umfassen, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens beeinflusst.
Das Verfahren kann das Mutieren des Modellfisches, der der Behandlung unterzogen wurde, um mutierten Fisch bereitzustellen, und das Identifizieren eines ersten Gens umfassen, das die Aktivität oder Wirkung der Behandlung beeinflusst.
Das Verfahren kann die Behandlung des Modellfisches, der der Behandlung unterzogen wurde, mit einer Testsubstanz, um behandelten Fisch bereitzustellen, und das Identifizieren einer Testsubstanz umfassen, die die Aktivität oder Wirkung von der genannten Behandlung beeinflusst.
Das Verfahren kann die Identifikation eines ersten Gens umfassen, das die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens abschwächt.
Das zweite Gen kann ein Krankheitsgen sein.
Das Verfahren kann die Identifikation eines ersten Gens umfassen, das die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens fördert oder steigert.
Das Verfahren kann die Identifikation einer Testsubstanz umfassen, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens oder der Behandlung abschwächt.
Das zweite Gen kann ein Krankheitsgen sein.
Das Verfahren kann die Identifikation einer Testsubstanz umfassen, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens oder der Behandlung erhöht.
Fische können auf zahlreiche Weisen mit einer Substanz behandelt werden. Fische können mit einer Testsubstanz kontaktiert werden, sie kann auf ihre Oberfläche aufgetragen oder eingerieben werden oder in sie injiziert werden. Eine Testsubstanz kann zu Wasser zugesetzt werden, in dem sie sich befinden. Eine andere Testsubstanz kann zu jedem Well einer Mehrfach-Well-Platte, wie beispielsweise einer 96-Well-Platte, zugesetzt werden, um zu identifizieren, ob diese Testsubstanz eine positive oder negative Wirkung zeigt. In jedem Well kann ein oder können mehrere Fische der Testsubstanz ausgesetzt werden. Die Testsubstanz kann vor dem Einsetzen des Erkrankungsphänotyps, gleichzeitig mit dem Einsetzen des Erkrankungsphänotyps oder nach dem Einsetzen des Erkrankungsphänotyps zugesetzt werden. Dieselbe Testsubstanz kann zu verschiedenen Wells bei verschiedenen Konzentrationen zugesetzt werden. Testsubstanz 1 kann beispielsweise zu Well A1 in einer Konzentration von 1 mM, zu Well A2 in einer Konzentration von 100 μM, zu Well A3 in einer Konzentration von 10 μM, zu Well A4 in einer Konzentration von 1 μM und zu Well A5 in einer Konzentration von 0,1 μM zugesetzt werden. Dann wird Testsubstanz 2 zu Well B1 zugesetzt usw. Die Auswahl an Testsubstanzen kann bekannte Wirkstoffe oder neue chemische Einheiten umfassen.
Darüber hinaus können die Testsubstanzen in Kombination zugesetzt werden. Beispielsweise kann Well A2 Testsubstanz 1 und 2 enthalten, Well A3 Testsubstanz 1 und 3, Well B2 Testsubstanz 2 und 3. Alternativ dazu kann jeder Well Testsubstanz x enthalten, wobei einzelne Wells eine Reihe von zusätzlichen Testsubstanzen enthalten.
In anderen Ausführungsformen kann eine Population von Fisch in einer Petrischale oder einem Gefäß verwendet und, z.B. über Zusatz einer oder mehrerer oder einer Kombination von Testsubstanzen im Wasser, zusammen behandelt werden.
Eine vielfältige Bibliothek von wirkstoffähnlichen Verbindungen, wie die LOPAC-Bibliothek (Sigma), kann verwendet werden, oder auch die vielfältige kombinatorische Bibliothek Chembridge PHARMACOphore. Andere Bibliotheken, die gegen bestimmte Target-Klassen gerichtet werden, können verwendet werden, wie z.B. Ionenkanal-Bibliotheken oder G-Protein-Bibliotheken. Letztere ist für das Sehvermögen von besonderer Bedeutung, da die Phototransduktionskaskade die archetypische G-Protein-Kaskade ist.
Die folgenden Wirkstoffe sind Beispiele, die zusammen eine gewisse synergistische Wirkung aufweisen: Natriumvalproat, Ethosuximid, Phenytoin, Carbamazepin, Lamotrigin, Gabapentin, Phenobarbiton, Diazepam, Clobazam, Tiagabin und Levetericatem. Jegliche Kombination dieser und/oder anderer Wirkstoffe oder Testsubstanzen können in jeder möglichen Kombination angeordnet und auf synergistische Wirksamkeit getestet werden. Geeignete Dosen variieren von 0,1 μM bis 10 mM, wobei 100 μM eine vernünftige Ausgangskonzentration zur Bewertung darstellt. Dies wird beispielsweise mit Diazepam, das bei Monotherapie bei einer Konzentration von 35 μM therapeutische Wirkungen zeigt, positive Wirkungen hervorbringen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Fisch, z.B. ein Zebrafisch, Fugu, Goldfisch, Medaka oder Riesen-Zebrafisch, der für ein Krankheitsgen unter Regulationsbedingungen eines Augen-spezifischen Promotors transgen ist, bereitgestellt, worin Expression des Krankheitsgens innerhalb des Auges des Fisches das Sehvermögen des Fisches beeinflusst.
Der zur Steuerung von Augen-spezifischer Expression verwendete Promotor kann induzierbar sein, was die Erstellung und/oder das Screenen einer Fischlinie erleichtern kann.
Ein Augen-spezifischer Promotor zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sorgt für Expression eines Krankheitsgens in einer Komponente oder einem Gewebe des Auges, die/das in einem der folgenden Vorgänge eingebunden ist: die Durchführung eines Lichtphotons durch das Auge, die Umsetzung von Photonenenergie in ein biologisches Signal und die Übertragung dieses Signals an die Sehzentren des Gehirns. Somit kann ein Promotor zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in einem oder mehreren der folgenden Gewebe und Zellen funktionell sein: Konjunktiva, Kornea, Humor aqueus, Corpus vitreum, Linse, Retina, Sehnerv, jegliche retinale Zelle, Stäbchen-Photorezeptor, Zapfen-Photorezeptor, Ganglionzelle, Gliazelle, Horizontalzelle, Bipolare und Amakrine.
Geeignete Augen-spezifische Promotoren werden an anderer Stelle hierin offenbart und erläutert, worin dies Beispiele sind, die jeweils in einer eigenen Ausführungsform der Erfindung bevorzugt werden, während auch andere Fachleuten zugänglich sind.
In besonderen Ausführungsformen resultiert das Krankheitsgen, wenn es exprimiert wird, in einem Erkrankungs-Phänotyp in dominanter Weise. Die Erfindung umfasst, dass das Gen der Steuerung eines Augen-spezifischen Promotors unterstellt wird, und nicht unter die Steuerung seines eigenen natürlichen Promotors, um Letalität zu vermeiden. Die Erkrankung ist dann nur im Auge manifestiert, sodass der Fisch blind ist oder zumindest ein eingeschränktes Sehvermögen oder eine beeinträchtigte Sehfunktion im Vergleich mit Wildtyp aufweist. Sehbehinderte und blinde Fische sind lebens- und fortpflanzungsfähig.
Ein alternatives Verfahren umfasst, dass das Gen der Steuerung eines Promotors unterstellt wird, der induzierbar ist und somit beliebig an- und abgeschaltet werden kann. Der Krankheitsprozess kann dann abgeschaltet werden, bevor der Fisch stirbt.
Ein Krankheitsgen, das in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann jegliches Gen in Wildtyp- oder mutierter Form sein, das, wenn es in einem Fisch wie Zebrafisch, in bevorzugten Ausführungsformen in einer Komponente des Fischauges, exprimiert wird, zu anormaler Entwicklung, Dysfunktion oder Degeneration von Gewebe- oder Zellfunktion führt und somit, wenn es in einer Komponente des Auges exprimiert wird, anormale Entwicklung, Dysfunktion oder Degeneration eines Gewebes oder einer Zelle des Auges (wie z.B. oben bereits erläutert) verursacht, was die Sehfunktion des Fisches beeinträchtigt. In manchen Ausführungsformen verursacht die Expression des Krankheitsgens in einer Komponente des Auges fehlerhafte Entwicklung oder Degeneration eines Teils des visuellen Systems. In anderen Ausführungsformen verursacht die Expression des Krankheitsgens in einer Komponente des Auges die Fehlfunktion einer Komponente des visuellen Systems.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Expression von menschlichem alpha-Synuclein, das eine A53T-Mutation in sich trägt, in retinalen Ganglionzellen von Fisch, z.B. Zebrafisch, exprimiert, was zu einer Degeneration der Ganglionzellen führt. Die Übertragung von visueller Information zum Gehirn wird folglich gestört, und dadurch wird die visuelle Funktion des Fisches negativ beeinflusst. Fische, die alpha-Synuclein in ihren retinalen Ganglionzellen exprimiert aufweisen, erzielen bei visuellen Tests weniger gute Ergebnisse als normale Fische.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird menschliches Rhodopsin, das die P347S-Mutation trägt, in Photorezeptoren von Fisch, z.B. Zebrafisch, exprimiert, was zu einer Degeneration der Photorezeptorzellen führt.
Folglich werden Photonen nicht mehr durch die Retina detektiert, und das Sehvermögen des Fisches ist daher beeinträchtigt, wie aufgrund von Sehtests bestimmt werden kann.
In bevorzugten einzelnen Ausführungsformen wird das dominant wirkende Krankheitsgen aus der aus Huntingtin, alpha-Synuclein, Presenilin-1, Presenilin-2, TNF, SMN und Rhodopsin bestehenden Gruppe, entweder in Wildtyp- oder mutierten Formen, ausgewählt.
Zugriffsnummern und Verweise für diese Gene lauten wie folgt und sind alle hierin durch Verweis aufgenommen:
Huntingtin: Zugriffsnummer für menschliches Wildtyp-Gen OMIM 143100; Huntington's Disease Collaborative Research Group, Cell 72, 971–983 (1993). PubMed ID: 8458085, Marsh et al., Hum. Mol. Genet. 9(1), 13–25 (2000);
Alpha-Synuclein: Zugriffsnummer für menschliches Wildtyp-Gen XM003494; Spillantini et al., Nature 388(6645), 839–840 (1997);
Presenilin-1: Zugriffsnummer für menschliches Wildtyp-Gen AH004968; Sherrington et al., Nature 375(6534), 754–760 (1995);
Presenilin-2: Zugriffsnummer für menschliches Wildtyp-Gen NM_000447; Levy-Lahad et al., Science 269(5226), 973–977 (1995), Levy-Lahad et al., Science 269(5226), 970–973 (1995), Rogaev et al., Nature 376(6543), 775–778 (1995), Levy-Lahad et al., Genomics 34(2), 198–204 (1996);
TNF: Zugriffsnummer für menschliches Wildtyp-Gen XM_055614; Bitsch et al., Glia 29(4), 366–375 (15. Feb. 2000), Liu et al., Nat. Med. 4(1), 78–83 (Jänner 1998), Probert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(24), 11294–11298 (21. Nov. 1995);
SOD-1: Zugriffsnummer für menschliches Wildtyp-Gen AY049787; Rosen et al., Nature 362(6415), 59–62 (1993), Parkes et al., Nat. Genet. 19(2), 171–174 (1998);
SMN: Zugriffsnummer für menschliches Wildtyp-Gen XM_041493; Pellizzoni et al., Cell 95(5), 615–624 (1998), Miguel-Aliaga et al., FEBS Lett 486(2), 99–102 (2000);
Rhodopsin: Zugriffsnummer für menschliches Wildtyp-Gen U49742, Kaushal et al., Biochemistry 33(20), 6121–6128 (1994), Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(24), 14176–14181 (1996), Colley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(7), 3070–3074 (1995).
Die Kodiersequenz eines Gens kann der Steuerung des ath5-, Opsin-, Rhodopsin-Promotors oder eines anderen Promotors unterstellt werden (oder "operabel an diesen gebunden" werden), der in einem Gewebe oder einer Zelle des Auges exprimiert. Siehe beispielsweise die folgenden Verweise: Mani et al., J. Biol. Chem. 276(39), 36557–36565 (2001) (Rhodopsin), Knox et al., FEBS Lett. 423(2), 117–121 (1998), Kennedy et al., J. Biol. Chem. 276(17), 14037–14043 (2001), und Quiambao et al., Vis. Neurosci. 14(4), 617–625 (1997), und Kido et al., Curr. Eye Res. 15(8), 833–844 (1996) (Opsin).
Die Kodiersequenz eines Gens kann der Steuerung eines induzierbaren Promotors, wie beispielsweise eines Promotors, der aus einem Hitzeschockpromotor oder einem Tetracyclin- oder Hormon-induzierbaren System ausgewählt ist, unterstellt werden.
Die Erfindung sorgt für die Manipulation von Nucleinsäure, um Zellen von Fisch wie Zebrafisch wie offenbart zu modifizieren. Nucleinsäure eines Krankheitsgens, das in Fisch gemäß der Erfindung exprimiert wird, gilt es, in das Chromosom von Zellen zu integrieren. Integration kann durch Einschluss von Sequenzen, die Rekombination mit dem Genom fördern, gemäß Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung verfügbar sind, gefördert werden. Das Krankheitsgen kann zum Fisch heterolog sein, z.B. kann es zum Zebrafisch heterolog sein (z.B. Säugetier wie Mensch), und kann in Wildtypform oder in jeglicher Allel- oder Mutantenform vorliegen. Das Krankheitsgen kann ein Zebrafisch- oder anderes Fischgen in Wildtypform oder mutierter Form sein, z.B. um eine Zusatzkopie eines Zebrafisch- oder eines anderen Fischgens, wie z.B. in einer mutierten Krankheitsform, bereitzustellen.
Nucleinsäuresequenzen, die für die Peptide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, können von Fachleuten leicht unter Verwendung der hierin enthaltenen Informationen und Verweise sowie der Verfahren nach dem Stand der Technik (siehe z.B. Sambrook & Russell, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1992), oder spätere Auflagen davon) hergestellt werden. Siehe Detrich et al., The Zebrafish: Biology. Methods in Cell Biology. Bd. 59 (1998), und Detrich et al., The Zebrafish: Genetics and Genomics. Methods in Cell Biology. Bd. 60 (1998), für Verfahren zur Erhaltung, Mutagenese, Transgenese und Kartierung von Zebrafisch.
Die erwünschte Kodiersequenz kann in ein Konstrukt inkorporiert werden, das eine oder mehrere Kontrollsequenzen umfasst, die operabel an die Nucleinsäure gebunden sind, um ihre Expression zu steuern. Geeignete Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminationsfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergene und anderer Sequenzen, können, je nach Bedarf, eingebunden werden.
Regionen, die für Promotor- und Enhancer-Aktivität eines Gens erforderlich sind, das dafür bekannt ist, in einem wünschenswerten Muster, wie z.B. ausschließlich in der Retina, exprimiert zu werden, können durch Ligieren von Sequenzabschnitten ausgehend von stromauf vom Translationsstartcodon im Gen an ein Reportergen isoliert werden. Konstrukte mit Deletionen in mutmaßlichen Promotor- und/oder Enhancer-Regionen werden gebildet, und die Konstrukte werden auf Gewebe-spezifische Genexpression in transgenem Fisch, z.B. transgenem Zebrafisch, Fugu, Goldfisch, Medaka oder Riesen-Zebrafisch, getestet.
Ein selektierbarer Marker, beispielsweise ein Gen, das für ein fluoreszierendes Protein wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, kann eingebunden werden, um Selektion von Klonen zu erleichtern, in die das Genkonstrukt in das Genom insertiert wurde. Wird ein fluoreszierender Marker verwendet, so können Embryonen unter einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop gescreent werden. Embryonen, oder Fisch, zu dem sie heranwachsen, können auf die Gegenwart eines Defekts, der aus dem Transgen resultiert, gescreent werden. In einem anderen Ansatz können Embryonen vor der Extraktion von genomischer DNA und Analyse der genomischen DNA durch PCR und/oder Restriktionsenzymverdau gepoolt werden. Positive Klone können vermehrt werden und sich zu fortpflanzendem Fisch entwickeln. Diese Fische können dann gezüchtet werden, um Fische hervorzubringen, die eine Kopie des Genkonstrukts in ihrer Keimlinie tragen. Diese heterozygoten Fische können dann gezüchtet werden, um Fische zu bilden, die das Gen in homozygoter Form in sich tragen.
Ein weiterer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, das das Einführen eines Nucleinsäurekonstrukts in einen Embryonalzelle von Fisch, z.B. Zebrafisch, umfasst, worin eine Kodiersequenz eines erwünschten Krankheitsgens der Steuerung eines Augen-spezifischen Promotors unterstellt wird. DNA kann direkt in vivo in Zellen eines frühen Embryos injiziert werden. Mit der Erstellung einer Kultur von Embryonalstammzellen können andere Verfahren, die im Allgemeinen, ohne Einschränkung, als "Transformation" bezeichnet werden, verwendet werden, ausgewählt aus jeglichen Verfahren, die nach dem Stand der Technik verfügbar sind, wie beispielsweise aus der Verwendung von Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposomen-vermittelter Transfektion und Transduktion unter Verwendung von Retrovirus oder einem anderen Virus. Markergene wie Antibiotikaresistenz- oder -empfindlichkeitsgene können zur Identifikation von Klonen, die Nucleinsäure von Interesse enthalten, verwendet werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
In einer bestimmten Ausführungsform wird eine Kodiersequenz eines Krankheitsgens, das es in den Fisch, z.B. Zebrafisch, einzuführen gilt, der Regulationskontrolle des ath5-Promotors unterstellt. Ath5 ist das Zebrafischaugen-spezifische Ortholog des grundlegenden Drosophila-Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktors Atonal und wird insbesondere in retinalen Ganglionzellen exprimiert (Kay et al., Neuron. 30(3), 725–736 (Juni 2001)). In einer anderen Ausführungsform wird der Promotor des Krankheitsgens durch den Opsin-Promotor (Kennedy et al., J. Biol. Chem. 276(17), 14037–14043 (2001)) oder den Rhodopsin-Promotor ersetzt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fisches, wie z.B. eines Zebrafisches, bereit, der in einem Screen oder zur Verwendung in einem Screen, wie hierin offenbart und nachstehend näher erläutert ist, geeignet ist. Solch ein Verfahren kann das Bereitstellen eines Genkonstrukts, worin eine Kodiersequenz eines Krankheitsgens operabel an einen Promotor gebunden ist, der ein Augen-spezifischer Promotor im Fisch, z.B. Zebrafisch, ist, das Einführen des Genkonstrukts in einen Fisch-, z.B. Zebrafisch-, Embryo, das Verursachen oder Ermöglichen der Integration des Genkonstrukts in das Fischembryogenom und das Heranwachsenlassen des Fischembryos zu einem lebensfähigen Fisch umfassen.
Ein lebensfähiger und sich vermehrender Fisch, z.B. Zebrafisch, kann sich mit einem oder mehreren anderen Fischen paaren und eine Fischlinie, z.B. Zebrafisch, hervorbringen, die bezüglich des Genkonstrukts, das das Krankheitsgen operabel daran gebunden umfasst, transgen ist, und dies unter der Regulationskontrolle des Augen-spezifischen Promotors. Eine Linie eines solchen Fisches, z.B. Zebrafisches, ist in Suppressorgen-Screens wie offenbart nützlich.
Um ein Krankheitsgen in einen Fischembryo, z.B. einen Zebrafischembryo, einzuführen, wird ein Genkonstrukt unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten zugänglich sind, hergestellt. Das Konstrukt kann aus einem Vektor durch Restriktionsverdau freigesetzt werden und gelgereinigt werden, beispielsweise durch Elution in 1 × TE (pH 8,0) und Verdünnung bei einer Arbeitskonzentration von 50–100 μg/ml KCl, das einen Markerfarbstoff wie Tetramethylrhodamindextran (0,125%) enthält. Typischerweise können 1 bis 3 nl dieser Lösung in einzellige Zebrafischembryonen injiziert werden. Mehreren tausend Embryonen können so Injektionen verabreicht werden.
Injizierte Embryonen werden wachsen gelassen und dann miteinander oder mit einem nicht-transgenen Wildtyp-Fisch gepaart. Übertragung des Transgens auf die darauf folgende Generation ist üblicherweise Chimärentransmission im Bereich von 2 bis 90%. Zumindest 100 Nachkommen werden typischerweise analysiert, um festzustellen, ob der Stammfisch das Transgen in sich trägt.
Die injizierten Embryonen können heranwachsen gelassen werden und bezüglich ihrer visuellen Funktion in Intervallen (z.B. von 2 Tagen) mittels modifizierter optokinetischer und optomotorischer Tests, wie z.B. nachstehend noch näher erläutert wird, bewertet werden.
Fische, die eine Sehbehinderung aufweisen, können weiter heranwachsen gelassen werden und können mit Wildtyp-Fischen gepaart werden. Die Eltern und die Nachkommenschaft können verglichen und die Nachkommenschaft ähnlich auf visuelle Dysfunktion bewertet werden. Jene Nachkommenschaft mit visueller Dysfunktion und somit mit wahrscheinlicher Keimlinienübertragung eines integrierten Krankheitsgenkonstrukts können selektiv gezüchtet werden. Manche der Nachkommenschaft können für eine detailliertere Analyse getötet werden, z.B. um die Beschaffenheit der Blindheit zu bestätigen. Diese Analyse kann In-situ-Hybridisierungsuntersuchungen unter Verwendung von Sense- und Antisense-Sonden zum eingeführten Gen, um auf Expression des Konstrukts in der Ganglionzellschicht zu prüfen, anatomische Bewertung wie z.B. mit plastischen Schnitten, um auf die Degeneration der Ganglionzellschicht zu prüfen, und terminale Desoxyuridinnucleotid-Endmarkierung (TUNEL), um auf apoptotischen Zelltod in der Ganglionzellschicht zu prüfen, umfassen.
Familien, aus denen Fische mit den geeigneten Eigenschaften stammen, können durch nachfolgende Generationen erhalten werden. Diese Erhaltung ermöglicht dann, dass dieser neue mutierte Stamm in einem zweiten Suppressor-Screen gemäß weiteren Aspekten der Erfindung eingesetzt wird.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Zellen von transgenem Fisch, wie Zebrafisch, Fugu, Goldfisch, Medaka oder Riesen-Zebrafisch wie offenbart, bereit, entweder isolierte Zellen oder Zelllinien, die vom Fisch abstammen und sich gegebenenfalls unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren unbegrenzt vermehren.
Eine Gensequenz wie beispielsweise eine Krankheitsgensequenz (z.B. heterolog zum Fisch, wie heterolog zum Zebrafisch), die in Aspekten und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, kann ein Wildtyp-Gen verwenden, oder es kann auch eine mutierte, variierte oder derivatisierte Sequenz verwendet werden. Die Sequenz kann sich vom Wildtyp durch eine Änderung unterscheiden, die einem oder mehreren Elementen von Addition, Insertion, Deletion und Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden der gezeigten Sequenzen entspricht. Änderungen an einer Nucleotidsequenz können zu einer Aminosäureänderung auf Proteinebene führen oder auch nicht, wie durch den genetischen Code bestimmt wird.
Es ist durchwegs bekannt, dass pharmazeutische Forschung, die zur Identifikation eines neuen Wirkstoffs führt, das Screenen von sehr großen Anzahlen an Kandidatensubstanzen einbinden kann, sowohl bevor als auch nachdem eine Leitverbindung gefunden wurde. Dies ist ein Faktor, der pharmazeutische Forschung sehr kostspielig und zeitaufwendig gestaltet. Ein Mittel zur Unterstützung des Screening-Verfahrens kann beträchtliche kommerzielle Bedeutung und Nützlichkeit haben. Solch ein Mittel zum Screenen auf Substanzen, die möglicherweise nützlich zur Behandlung oder Prävention einer Störung oder Erkrankung sind, wird mittels Fischen wie Zebrafischen gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Suppressorgene, die unter Verwendung der Erfindung identifiziert werden, und Substanzen, die Aktivität solcher Suppressorgene beeinflussen, stellen einen Fortschritt im Kampf gegen Erkrankungen dar, da sie eine Grundlage für den Entwurf und die Untersuchung von Therapeutika zur In-vivo-Verwendung liefern, wie z.B. Testsubstanzen, die in der Lage sind, Aktivität oder Wirkung einer Behandlung zu beeinflussen, und Substanzen, die Aktivität oder Wirkung von Expression eines Krankheitsgens in einem Fisch beeinflussen.
In verschiedenen weiteren Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung Screenen, Testverfahren und Mittel sowie dadurch identifizierte Substanzen.
Die Erfinder der vorliegenden Beschreibung erkannten, dass Fische wie Zebrafische in einem zweiten Suppressor-Screen nützlich sind. Ein zweiter Suppressor-Screen umfasst das Einführen von einer oder mehreren Mutationen in das Genom und das Screenen oder Selektieren auf Aufhebung oder Suppression der Wirkung einer primären Mutation.
Das Prinzip kann anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf ein hypothetisches Gen B, dessen normale Funktion es ist, Fischgröße zu steuern, veranschaulicht werden. Wird dieses Gen mutiert, sodass es überaktiv ist, so werden sich daraus größere Fische ergeben. Nun nimmt man ein weiteres hypothetisches Gen S, dessen normale Funktion es ist, Zellen kleiner zu machen. Wird dieses Gen mutiert, so werden die Zellen größer. Wird also eine Mutation in das S-Gen in einer Zelle eingeführt, die bereits ein mutiertes B-Gen in sich trägt, so werden sich die zwei gegenseitig aufheben, und die Zelle wird eine normaler Größe aufweisen. Das mutierte S-Gen unterdrückt den Phänotyp des mutierten B-Gens.
Es gibt jedoch eine Schwierigkeit, wenn Gen B ein dominantes Krankheitsgen ist, da, wenn es dem Fisch die Lebensfähigkeit nimmt, dazu führt, dass er rasch stirbt oder sich nicht fortpflanzen kann, es nicht möglich sein wird, erwachsene Fische zu züchten, die eine Mutation in Gen B aufweisen.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Lösung für dieses Problem durch Einschränken von Expression des Krankheitsgens auf das Auge, und zwar dadurch, dass es der Steuerung eines Augen-spezifischen Promotors unterstellt wird. Als ein Resultat dieser eingeschränkten Expression ist der Erkrankungsprozess auf diese spezifischen Zellen eingeschränkt. Die Fische sind lebensfähig, können erhalten werden, bis sie erwachsen sind und sich fortpflanzen, und sind somit für die Verwendung in einem zweiten Suppressor-Screen verfügbar.
Weiters stellt die Erfindung ein exaktes, einstellbares und rasches Screening-Verfahren zum Screenen auf die Gegenwart von Erkrankungsaktivität und das Ausmaß von Erkrankungsaktivität bereit. Degeneration der Retina führt zu Erblindung, und das Verfahren ist zum direkten Testen auf Erblindung und Einschränkung der visuellen Funktion an Fischen wie Zebrafischen gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Fische, z.B. Zebrafische, sind in Screens auf Suppressorgene nützlich, die die Aktivität oder Wirkung eines Krankheitsgens reduzieren. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Fisches, z.B. Zebrafisches, Fugu, Goldfisches, Medaka oder Riesenzebrafisches, in solch einem Screen bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen auf ein Suppressorgen bereit, das die Aktivität oder Wirkung eines Krankheitsgens abschwächt, worin das Verfahren folgende Schritte umfasst:
das Bereitstellen, als Modellfisch zum Screenen, eines Fisches, z.B. Zebrafisches, der für ein Krankheitsgen unter Regulationskontrolle eines Augen-spezifischen Promotors transgen ist, worin Expression des Krankheitsgens innerhalb des Auges des Fisches das Sehvermögen des Fisches beeinflusst;
das Mutieren des Modellfisches, um einen mutierten Fisch bereitzustellen;
das Vergleichen des Sehvermögens des mutierten Fisches mit dem Sehvermögen eines Modellfisches, um im Vergleich mit dem Modellfisch jeglichen mutierten Fisch mit verändertem Sehvermögen zu identifizieren;
das Identifizieren eines genetischen Unterschieds zwischen Modellfisch und jeglichem mutiertem Fisch mit solch einem veränderten Sehvermögen, um hierdurch ein Suppressorgen zu identifizieren, das die Aktivität oder Wirkung des Krankheitsgens herabsetzt.
Wie bereits angemerkt verwenden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in ihren verschiedenen Aspekten Zebrafische.
Ein Fisch wie ein Zebrafisch, der eine krankheitsauslösende oder Phänotyp-verändernde Mutation in sich trägt, die sich durch Einschränkung des Sehvermögens als ein Resultat von Expression des Krankheitsgens im Auge manifestiert, kann ausgehend davon identifiziert werden, dass er aufgrund der Wirkung einer Mutation in einem zweiten Gen die visuelle Einschränkung nicht aufweist oder nicht in demselben Maße aufweist, da dieses mutierte zweite Gen die Aktivität des Krankheitsgens unterdrückt.
Visuelle Funktion eines Fisches wie z.B. eines Zebrafisches kann beispielsweise auf eine der folgenden Weisen getestet werden:

(1) Zebrafische verändern ihre Farbe, um farblich mit dem Hintergrund zu verschmelzen. In einer dunklen Umgebung wird der Fisch dunkler und in einer hellen Umgebung heller. Blinde Fische nehmen ihre Umgebung als dunkel wahr und werden somit selbst schwarz. Dies ermöglicht einen sehr raschen Screen mittels Sichtprüfung – die schwarzen Fische sind blind (Neuhauss).
(2) Die optokinetischen Reaktionen von Zebrafischen oder anderen Fischen können durch Vorbeiführen von Streifen vor den Augen getestet werden. Wie bei menschlichen Probanden können die resultierenden reflexartigen Augenbewegungen nicht unterdrückt werden. Somit liefert das Vorbeiführen von Streifen vor Fischen wie Zebrafischen und die Bewertung der Gegenwart oder Abwesenheit von optokinetischen Reaktionen einen weiteren Test für die visuelle Funktion. Ein ähnlicher visueller Test arbeitet mit der optomotorischen Reaktion. Stimuli können weiter entwickelt und verfeinert werden, um eine detaillierte, abgestufte Bewertung des Sehvermögens von Fischen, z.B. Zebrafischen, zu ermöglichen (Orger). Darüber hinaus ermöglichen die Bewertungsmechanismen das Testen von zahlreichen Fischen innerhalb von kurzer Zeit.

Ein sich bewegendes Gitter oder ein Film, z.B. als ein computeranimiertes Display auf einem Bildschirm, ruft angeborenes optomotorisches Verhalten bei Zebrafisch-Larven hervor; sie schwimmen in die Richtung der wahrgenommenen Bewegung (Orger et al., Nat. Neurosci. 3(11), 1128–1133 (Nov. 2000)). Zebrafisch-Larven beginnen aufgrund dieser angeborenen Fähigkeit kurz nach dem Schlüpfen, auf Bewegungsstimuli zu reagieren. Dies ist in einem Screen der vorliegenden Erfindung wie hierin offenbart von Vorteil, da es rasche Bestimmung der Wirkung von Mutation auf einen Modell-Zebrafisch ermöglicht. Andere Fische zeigen ähnliche Reaktionen.
Visuelle Funktion von Zebrafischen kann durch Betrachten ihrer Farbe oder der Hintergrundpigmentierung bestimmt werden, da eine Veränderung davon, wie bereits erläutert, ein Hinweis auf Erblindung sein kann. Visuelle Funktion kann mittels Beobachtung der Reaktion auf ein Muster von z.B. Streifen, die vor den Augen des Fisches vorbeigeführt werden, bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden schwarze Fische; von denen angenommen wird, dass sie blind sind, und heller gefärbte Fische, von denen angenommen wird, dass sie Sehvermögen aufweisen, auf Grundlage ihrer Farbe voneinander getrennt, bevor der Grad oder das Ausmaß des Sehvermögens mittels eines Sehtests näher bestimmt wird.
Das Testen auf visuelle Funktion eines Fisches wie z.B. eines Zebrafisches kann mit der Beobachtung einer Veränderung der Hintergrundpigmentierung, der Beobachtung von visueller Schreckreaktion, von optokinetischer Reaktion und/oder von optomotorischer Reaktion arbeiten. Die zwei letztgenannten umfassen typischerweise das Vorbeiführen eines Musters, z.B. waagrechter Streifen. In einem optokinetischen Test können Fische in 3% Methylcellulose immobilisiert werden, und das Muster wird vor den Augen vorbeigeführt. In einem optomotorischen Test schwimmen die Fische frei in einem oder mehreren langen, engen Kanälen, und das Muster wird entlang der Länge des Kanals vorbeigeführt. Fische schwimmen in Richtung der wahrgenommenen Bewegung der Streifen und sammeln sich so an einem Ende des Kanals, außer wenn sie blind sind und sich somit zufällig im Kanal verteilen.
Ein typischer, sehr starker Stimulus ist eine Rechteckwelle mit 100%igem Kontrast, die das gesamte Sichtfeld ausfüllt, eine Streifenbreite von 36° aufweist und sich bei 4 Hz bewegt. Die unterschiedlichen Grenzen des Sehvermögens sind in Orger et al., s.o., definiert, wenn auch für teilweise erblindete Fische diese Grenzen tiefer anzusetzen sind. Der Grad von visueller Dysfunktion kann durch Senken des Kontrasts und/oder der Streifenbreite eines Musters, bis der Fisch nicht mehr darauf reagiert, bestimmt werden. Andere Aspekte der visuellen Dysfunktion können durch Variieren der Farbe der Streifen oder durch andere Muster analysiert werden.
Das Muster kann Streifen oder gewellte Linien aufweisen, die sich über das gesamte Sichtfeld bewegen. Andere Nicht-Fourier-Stimuli oder Stimuli zweiter Ordnung können verwendet werden, wie z.B. in Orger et al., s.o., beschrieben wird.
Somit können in Ausführungsformen der Erfindung Fische wie Zebrafische, die für ein Krankheitsgen transgen sind, das im Fisch unter der Steuerung eines Augen- spezifischen Promotors exprimiert wird, über mehrere Generationen hinweg erhalten werden. Diese Erhaltung ermöglicht es, dass dieser Stamm in einem sekundären Suppressor-Screen eingesetzt wird, durch den eine zweite Mutation per Zufallsprinzip in das Genom dieses Stamms eingeführt wird. Die visuelle Funktion von Fischen, die nun sowohl die krankheitsauslösende Mutation als auch die möglicherweise unterdrückende, zweite Mutation in sich tragen, kann mittels eines modifizierten optomotorischen oder optokinetischen Tests bewertet werden. Fische, deren Sehfunktion besser als in den anfänglichen mutierten Testtieren ist, tragen vermutlich eine zweite Mutation in sich, die die Wirkung der ersten, krankheitsauslösenden Mutation unterdrückt. Dieses zweite mutierte Gen und sein Proteinprodukt sind therapeutische Targets für die Behandlung der Krankheit, die durch die erste Mutation hervorgerufen wird.
Ein mutierter Fisch wie z.B. ein mutierter Zebrafisch, der für ein Krankheitsgen unter der Steuerung eines Augen-spezifischen Promotors transgen ist und eine Mutation innerhalb eines Suppressorgens enthält, das die Aktivität oder Wirkung des Krankheitsgens auf die visuelle Funktion des Fisches abschwächt, ist selbst für einen weiteren Test nützlich, der auf eine Testsubstanz untersucht, die in der Lage ist, die Unterdrückungswirkung des Suppressorgens zu modulieren oder zu beeinflussen, vorzugsweise zu potenzieren oder zu steigern. Natürlich gilt dasselbe, wenn eine Mutation in einem Gen identifiziert wird, das die Aktivität eines zweiten Gens fördert oder steigert.
Fachleute werden selbstverständlich jegliche geeigneten Kontrollversuche entwerfen können, mit denen aus den Test-Assays gewonnene Resultate verglichen werden können.
Zahlreiche verschiedene Strategien sind durchschnittlichen Fachleuten zur Einführung einer sekundären Mutation in einen primären mutierten Stamm verfügbar. Solche Vorgehensweisen umfassen das Züchten weiblicher Fische, die das Transgen in sich tragen, bis zur Homozygotie und anschließend das Kreuzen dieser mit männlichen Tieren aus der F1- oder F2-Generation, die von männlichen F0- Tieren abstammen, die Ethylnitrosoharnstoff (ENU) ausgesetzt wurden. Das Mutageneseverfahren, wie es von van Eeden et al. (Methods Cell Biol. 60 (1999)) beschrieben wird, ergibt typischerweise Mutationsraten von 0,9–3,3 × 10^–3 pro Locus. Eine Ausgangszahl von 100 gesunden, fruchtbaren männlichen Fischen wird als erforderlich erachtet, um 20–30 fruchtbare männliche Fische nach 6 Behandlungen mit 3 mM ENU zu erhalten.
Mutagenese kann wie folgt durchgeführt werden:
Ethylnitrosoharnstoff (ENU) wird in Essigsäure zu einer Endkonzentration von 10 mM aufgelöst, wie durch die optische Dichte bei 238 nm bei einem pH von 6,0 bestimmt wird (Extinktionskoeffizient = 5830/M/cm), und anschließend auf eine Arbeitskonzentration von 3,0 mM in 10 mM Natriumphosphatpufter, pH 6,6, verdünnt. Männchen, die verlässlich befruchtete Nachkommen hervorbringen, werden 1 h lang in ENU-Lösung gegeben. Nach dem Verfahren werden die Fische in zweimal frischem Aquariumwasser, jeweils 1 h lang, gewaschen, bevor sie in das Aquarium zurückkehren. Das Mutageneseverfahren wird bis zu sechsmal in Wochenintervallen wiederholt.
Die Häufigkeit von induzierten Mutationen ist proportional zur exakten Anzahl der durchgeführten Mutageneseverfahren. Die Anzahl der Verfahren kann somit je nach Anzahl der pro Genom erwünschten Mutationen variiert werden.
Das tatsächliche Mutageneseverfahren wird am besten im Dunkeln durchgeführt, um die Belastung für die Fische zu minimieren.
Die anfängliche Nachkommenschaft von den mutagenisierten Fischen ist eine chimäre Nachkommenschaft. Die mutagenisierten Fische werden daher nach dem letzten Mutageneseverfahren dreimal in wöchentlichen Intervallen gepaart. Die hiernach erhaltene Nachkommenschaft ist nicht chimär, da jegliche Mutationen in spermatogonialen Stammzellen entstehen.
Andere nützliche Mutagenesemittel umfassen durch gamma-Strahlung oder Röntgenstrahlung vermittelte Mutagenese und Retrovirus-vermittelte Insertionsmutagenese.
Ein alternatives Verfahren zur Lösung der Probleme von Letalität, die es ermöglichen, dominant wirkende Krankheitsmutationen in einem sekundären Suppressor-Screen einzusetzen, umfasst, dass das mutierte Gen der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie z.B. eines Hitzeschockpromotors, des Tetracyclin-induzierbaren Systems (Clontech) oder eines hormonellen induzierbaren Promotors, unterstellt wird.
Das Tetracyclin-induzierbare System (Clontech) beruht auf zwei unterschiedlichen Konstrukten. Das tet-on-Plasmid exprimiert den Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator, rtTA, der aus einem mutierten tet-Repressorprotein, rTetR, besteht, das an die VP16-Aktivierungsdomäne des Herpes-Simplex-Virus (AD) gebunden ist. Das rtTA-Protein bindet sich an und aktiviert das Tetracyclin-Reaktionselement (TRE), das Teil des zweiten Plasmids ist. Das aktivierte TRE wirkt mit dem stummen CMV-Promotor, um Expression des Gens von Interesse zu steuern. Der Schlüssel zum System ist, dass der rtTA-Transaktivator das TRE-Reaktionselement nur in Gegenwart von Tetracyclin (oder seinem Analogon Doxycyclin) bindet. In Abwesenheit von Tetracyclin findet Bindung nicht statt, das Reaktionselement ist "abgeschaltet", und Proteinexpression ist minimal, sodass sogar toxische Proteine wirksam an- und abgeschaltet werden können (Harkin et al., Cell 97, 575–586 (1999); Lee et al., PNAS 95, 11371–11376 (1988)).
Das Tetracyclin-induzierbare System wurde bereits an Säugetieren verwendet, um regulierte Überexpression von Interleukin 11 in den Lungen von Mäusen bereitzustellen (Ray et al., J. Cline. Inv. 100, 2501- (1997)). Es gab keine augenscheinliche Toxizität gegenüber Embryonen, die mit Doxycyclin in utero behandelt worden waren, oder gegenüber jungen Tieren oder Erwachsenen. In Abwesenheit von Doxycyclin lagen die Konzentrationen von IL-11 unter 50 pg/ml. Doxycyclin-Induktion ließ die Konzentrationen auf mehr als 0,3 ng/ml ansteigen. Bei der Entfernung von Doxycyclin aus dem Trinkwasser fielen die IL-11-Konzentrationen um >80% innerhalb von 24 h. Veränderungen am Reaktionselement sind möglich und bieten eine noch strengere Kontrolle.
Eine weitere Modifikation umfasst das Binden des TRE-Reaktionselements an einen bidirektionalen Promotor. Dies ermöglicht, dass eGFP exprimiert wird, wann immer das Targetgen auch exprimiert wird. Dies liefert einen einfachen visuellen Marker von Gentransport und -aktivierung.
Bei der praktischen Durchführung eines zweiten Suppressor-Screens wird also ein mutiertes Gen in Fische, z.B. Zebrafische, unter der Steuerung eines induzierbaren Systems (z.B. Tetracyclin-induzierbar) eingeführt. Das Gen wird durch Zusatz des Induktors (z.B. Tetracyclin) angeschaltet, und jene Fische, die das Gen exprimieren, werden zur weiteren Untersuchung selektiert. Das Gen wird dann abgeschaltet, was die Aufzucht des Fisches über mehrere nachfolgende Generationen ermöglicht und somit die Einführung zusätzlicher Mutationen als Teil eines zweiten Suppressor-Screens möglich macht.
Folglich stellt in einem weiteren Aspekt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen auf ein Suppressor-Gen bereit, das die Aktivität oder Wirkung eines Krankheitsgen abschwächt, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
das Bereitstellen von Fischen wie Zebrafischen als Modellfische zum Screenen, worin diese Modellfische transgen für ein Genkonstrukt sind, worin eine Kodiersequenz für ein Krankheitsgen, das in den Fischen letal ist oder die Fische die Lebensfähigkeit oder die Fortpflanzungsfähigkeit nimmt, unter der Steuerung eines induzierbaren Promotors bereitgestellt wird und worin die Modellfische unter Bedingungen gezüchtet und aufgezogen werden, unter denen der induzierbare Promotor nicht induziert wird und/oder unterdrückt wird;
das Einführen einer Mutation in die Modellfische, um mutierte Fische bereitzustellen, und das Induzieren und/oder das Aufheben der Unterdrückung des induzierbaren Promotors, um Expression des Krankheitsgens in den Modellfischen hervorzurufen;
das Bestimmen der Lebensfähigkeit und/oder Fortpflanzungsfähigkeit mutierter Fische, in denen das Krankheitsgen exprimiert wird, im Vergleich zu den Modellfischen, in denen das Krankheitsgen exprimiert wird;
das Identifizieren eines genetischen Unterschieds zwischen Modellfischen und jeglichen mutierten Fischen mit veränderter Lebensfähigkeit und/oder Fortpflanzungsfähigkeit, um dadurch ein Suppressorgen zu identifizieren, das die Aktivität oder Wirkung des Krankheitsgens abschwächt.
Der unterdrückte Fischstamm weist zumindest zwei Mutationen auf: die krankheitsauslösende/Phänotyp-induzierende Mutation, die aus der Einführung des Krankheitsgens resultiert, und die Krankheits-/Phänotyp-unterdrückende oder -abschwächende Mutation.
Es gilt auch anzumerken, dass die vorliegende Erfindung anstelle der Identifikation einer Suppressor-Mutation und eines Suppressorgens in jeglichem ihrer Aspekte und jeglicher ihrer Ausführungsformen verwendet werden kann, um eine Mutation und ein Gen zu identifizieren, die/das das Ausmaß des primären Phänotyps fördert oder steigert. Dies kann verwendet werden, um zusätzliche Gene zu identifizieren, die in einen bestimmen Erkrankungsstoffwechselweg eingebunden sind.
In ähnlicher Weise kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um eine Testsubstanz zu identifizieren, die die Aktivität oder Wirkung eines Gens in einem Fisch oder einer Behandlung eines Fisches beeinflusst, worin das Gen z.B. ein Transgen ist, das im Auge exprimiert wird, und das Transgen oder die Behandlung eine Wirkung auf das Sehvermögen des Fisches zeigt.
Ein Screening- oder Testverfahren gemäß einem Aspekt oder einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Identifikation eines Suppressorgens umfassen, das die Aktivität oder Wirkung eines Krankheitsgens abschwächt.
Ein Screening- oder Testverfahren gemäß einem Aspekt oder einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Identifikation eines Gens, das die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens fördert oder steigert, oder einer Testsubstanz umfassen, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens beeinflusst, eine solche Aktivität oder Wirkung entweder abschwächt oder reduziert, oder aber fördert oder steigert.
Nach der Identifikation eines Gens, das die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens, z.B. eines Suppressorgens, beeinflusst, kann das Gen (einschließlich eines Homologs in einer anderen Spezies, z.B. Mensch) oder das kodierte Genprodukt kloniert oder anders in einer isolierten oder gereinigten Form bereitgestellt werden und kann in einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst.
Das Gen, z.B. Suppressorgen, (einschließlich eines Homologs in einer anderen Spezies, z.B. Mensch) oder ein Genprodukt, für das das Gen, z.B. Suppressorgen, kodiert, kann in einem Screeningsystem zum Testen der Fähigkeit einer Testsubstanz, die Aktivität des Gens oder Genprodukts, für das das Gen kodiert, zu beeinflussen, verwendet werden.
Eine Testsubstanz, die die Aktivität eines Gens, z.B. eines Suppressorgens, oder des Genprodukts, für das das Gen kodiert, beeinflusst, kann in einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst.
Nach der Identifikation eines Suppressorgens für ein Krankheitsgen von Interesse oder eines anderen Gens, das die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens beeinflusst, kann das Suppressorgen oder andere Gen und/oder ein kodiertes Genprodukt als ein Target zur Identifikation von potenziellen Therapeutika oder selbst als ein Therapeutikum verwendet werden. Auch ist es möglich, die Beschaffenheit der unterdrückenden oder anderen Wirkung näher zu untersuchen.
Das Suppressorgen oder andere Gen, das die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens beeinflusst, kann ein neues Gen sein oder kann ein bekanntes Gen sein, das davor noch nicht dafür bekannt war, über eine Funktion zur Beeinflussung oder Unterdrückung von Aktivität oder Wirkung des relevanten Krankheitsgens zu verfügen. Das Gen kann eines sein, für das bereits bekannt ist oder angenommen wird, eine Funktion zur Beeinflussung oder Unterdrückung von Aktivität zu besitzen, wobei in diesem Fall die Resultate aus den Fischtests eine Bestätigung der bereits verfügbaren Ergebnisse darstellen. Insbesondere die Tatsache, dass die Suppression oder andere Wirkung in vivo auftritt, erhöht die Zuversicht bezüglich der Verwendung des Gens oder des kodierten Genprodukts oder Fragments davon oder einer Komponente im Wirkungs-Stoffwechselweg des Gens oder Genprodukts als ein Wirkstoff-Target. Zur weiteren Untersuchung und Verwendung kann, sofern verfügbar, ein Homolog aus einer anderen Spezies verwendet werden, z.B. unter Verwendung von Klonierungs- oder Sequenzierungsverfahren.
Die verantwortliche Mutation, z.B. suppressive Mutation, kann unter Verwendung von Kartierungsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung verfügbar sind, identifiziert werden (siehe z.B. H. W. Detrich, L. I. Zon & M. Westerfield, The Zebrafish: Genetics and Genomics. Methods in Cell Biology; Bd. 60, 182–192 (1998)).
Somit wird, um die Position der relevanten Mutation, z.B. einer suppressiven Mutation, zu identifizieren, der mutierte Locus in Bezug auf die Position eines Markers, dessen Position bekannt ist, kartiert. DNA-Marker umfassen kurze DNA-Sequenzen, klonierte Gene oder andere Mutationen. Das zur Zeit beste Verfahren für Zebrafische umfasst einfache Sequenzlängenpolymorphismen (SSLPs), da diese das gesamte Genom bei hoher Dichte abdecken. Es ist daher möglich, innerhalb von 0,5 cM zu kartieren, von wo aus entweder ein Chromosomen-Walk initiiert werden kann, weitere Kartierung unter Verwendung einzelsträngiger Konformationspolymorphismen unternommen werden kann oder Kandidatengene direkt selektiert werden können.
Kartierung unter Verwendung von SSLP
Diese Marker bestehen aus 2 Primern, die eine Dinucleotid-(CA)Wiederholung flankieren. Diese sind extrem variabel bezüglich ihrer Länge und sind zwischen Zebrafisch-Stämmen polymorph. Die SSLP-Kartierung umfasst die folgenden Schritte:

1. Bilden einer Karten-Kreuzung, Identifizieren mutierter Träger, Fixieren von Mutanten- und Geschwister-Nachkommenschaft in getrennter Weise
2. Isolieren genomischer DNA sowohl aus Mutanten als auch aus Geschwistern
3. Genom-Scanning unter Verwendung von gepoolter DNA sowohl aus Mutanten als auch aus Geschwistern, um Bindungsgruppen zu bestimmen
4. Überprüfen potenzieller Bindungen mit einzelner Embryonen-DNA
5. Suchen nach eng miteinander verbundenen Markern
6. Positionieren der Mutation auf der genetischen Karte durch Bestimmen der Anzahl an Rekombinationen zwischen Marker und Mutation

Isolieren genomischer DNA
Um DNA aus einzelnen Embryonen zu extrahieren, werden Embryonen, die in 100% Methanol fixiert sind, in eine Petrischale geschüttet. Mehr Ethanol wird zur Schale zugesetzt, um sicherzustellen, dass die Embryonen bedeckt bleiben. Die Embryonen werden dann in eine 96-Well-Platte pipettiert: ein einzelner Embryo pro Well. Eine Pipette wird dann verwendet, um soviel Methanol wie möglich von der unmittelbaren Umgebung der Embryonen zu entfernen. Das verbleibende Methanol wird dann an einem PCR-Blockset bei 70°C 15 min lang abgedampft. 25 μl eines Gemisches aus 250 μl Proteinase K (17 mg/ml, Merck) und 2,25 ml 1 × TE werden zu jedem Well zugesetzt. Die PCR-Platte wird dann mit Hybaid-Folie abgedeckt und in einem PCR-Gerät 240 min lang bei 55°C erhitzt, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 75°C, um die Proteinase K zu inaktivieren. Die Platten bis zu ihrer Verwendung können bei –20°C gehalten werden.
Genom-Scanning
Gepoolte DNA wird durch Abnehmen von 10 μl aus jeder der 48 einzelnen Proben hergestellt und dann auf eine Endkonzentration von 50 ng/μl verdünnt. Primer für Marker werden an einer Masterprimer-96-Well-Platte auf solche Weise angeordnet, dass die mutierte Probe und die Geschwisterprobe, die mit demselben Marker analysiert wurden, daraufhin nebeneinander auf einem Agarosegel laufen gelassen werden. Die für die PCR-Platten selektierten Marker sind jene, die dafür bekannt sind, nützliche Polymorphismen aufzuzeigen, und die das gesamte Genom gleichmäßig überspannen.
PCR-Reaktionen werden anschließend in einem 96-Well-Format konzipiert. Jeder Well enthält 14,28 μl PCR-Gemisch, 0,16 μl jeweils von 20 μM Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 0,4 μl von 5 U/μl Taq-Polymerase und 5,0 μl von Matrix-DNA. PCR wird mit anfänglicher Denaturierung bei 94°C 3 min lang durchgeführt, gefolgt von 35 Denaturierungs-Zyklen bei 94°C 30 s lang, Anellieren bei 60°C 30 s lang und Primärextension bei 72°C 1 min lang. Die Reaktion wird durch abschließende 5-minütige Extension bei 72°C abgeschlossen.
PCR-Gemisch

0,2 mM dATP
0,2 mM dCTP
0,2 mM dGTP
0,2 mM dTTP

in PCR-Puffer
PCR-Puffer (10×)

100 mM Tris-HCl, pH 8,3
500 mM KCl
15 mM MgCl₂
0,1% (Gew./Vol.) Gelatine

PCR mit einzelnen Embryonen
PCR-Reaktionen werden wie zuvor beschrieben konzipiert und durchgeführt, mit der Ausnahme, dass eine einzelne Embryo-DNA als Matrix verwendet wird.
Die PCR-Produkte werden auf Polymorphismen durch Laufenlassen auf einem 2%igen Agarosegel bei 200 V 80 min lang in 1 × TBE bewertet.
Kartieren unter Verwendung von SSCP
Hierbei wird einzelsträngige DNA verwendet. Jeder Strang nimmt seine thermodynamisch bevorzugte Konformation an. Einzelne Nucleotidsubstitutionen können die Konformation für einen Unterschied im Migrationsmuster ausreichend ändern, um an einem nicht-denaturierenden Gel nachgewiesen zu werden. Dies ermöglicht die Analyse von Nicht-SSLP-Markern, die fest an die Mutation gebunden sind.
Die zur Amplifikation eines Markers verwendete Arbeitsvorschrift ist dieselbe wie für SSLP-Kartierung. Um die PCR-Produkte zu fällen, werden 2 Volumina an vorgekühltem 100%igem Ethanol und 0,1 Volumina von 3 M Na-Acetat zum PCR-Produkt zugesetzt, gut gemischt, zumindest 20 min bei –20°C inkubiert und in einer gekühlten Zentrifuge bei 13.000 U/min 25 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, das DNA-Pellet luftgetrocknet und in 8 μl von ddH₂O resuspendiert. Zu 5,4 μl von PCR-Produkt werden 0,6 μl denaturierende Lösung und 2,4 μl Ladepuffer zugesetzt und kurz vermischt, bevor das Gemisch bei 85°C 10 min lang inkubiert wird. Die Probe wird dann rasch auf Eis gekühlt. 6–8 μl von jeder Probe werden dann auf ein natives, vorgefertigtes Acrylamidgel (CleanGel SSCP, ETC Elektrophorese-Technik) geladen und bei 200 V und 15°C gemäß den Anweisungen des Herstellers laufen gelassen.
Denaturierungslösung

10 mM EDTA
500 mM NaOH

Ladepuffer

2% Bromphenolblau
2% Xylolcyanol
in Formamid

Die Gele werden unter Verwendung eines Silberfärbungssets (PlusOne DNA Silver Staining Kit, Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt.
Durch diese Verfahren wird die Mutation ausreichend genau kartiert, um ein Kandidatengen auszuwählen. Dieses Gen wird dann sowohl in mutierten als auch in Wildtypfischen sequenziert, um Mutationen zu identifizieren.
Kodiert das Suppressorgen oder ein anderes Gen, das die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens beeinflusst, für ein Protein, so kann es sein, dass das Protein mit dem zweiten Gen wechselwirkt, z.B. mit dem Krankheitsgen oder dem Genprodukt, oder sich daran bindet. So kann beispielsweise ein neues Protein-Protein-Bindungspaar identifiziert werden, was unmittelbar die Möglichkeit bietet, solche Bindung als ein Target zur Identifikation von Kandidaten für Therapeutika zu modulieren oder zu beeinflussen.
Müssen Wechselwirkung oder Bindung zwischen Genprodukten näher untersucht werden oder in Testverfahren verwendet werden, um weitere Substanzen zu identifizieren, die in der Lage sind, die Bindung oder Wechselwirkung zu beeinflussen, so sind geeignete Ansätze nach dem Stand der Technik verfügbar, beispielsweise Verfahren, die Radioimmuntest, Co-Immunfällung, Szintillationsproximitätstest, ELISA-Verfahren und Zwei-Hybrid-Tests einbinden (siehe z.B. Fields & Song, Nature 340, 245–246 (1989)), beispielsweise unter Verwendung der zwei Bindungsdomänen des GAL4-Transkriptionsfaktors oder des LexA/VP60-Systems.
Weitere Mutation im Suppressor- oder in einem anderen Gen kann verwendet werden, um Varianten mit gesteigerter oder anders veränderter Suppressorfunktion zu identifizieren.
Somit kann das Suppressorgen oder ein anderes Gen oder ein kodiertes Genprodukt, in Wildtyp-Form oder in einer mutierten Form (die eine mutierte Form, wie sie im ursprünglichen Screen identifiziert wird, oder eine andere mutierte Form sein kann), in einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet werden.
In verschiedenen weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament, einen Wirkstoff oder eine andere Zusammensetzung, die/das/der ein Suppressorgen oder ein anderes Gen oder ein Genprodukt oder eine Substanz umfasst, für das bzw. die erkannt wird, dass es bzw. sie das Krankheitsgen von Interesse beeinflusst oder das Krankheitsgen von Interesse unterdrückt, die Verwendung eines solchen Materials in einem medizinischen Behandlungsverfahren, ein Verfahren, das die Verabreichung eines solchen Materials an einen Patienten umfasst, z.B. zur Behandlung (die auch eine Präventivbehandlung umfassen kann) eines medizinischen Leidens, die Verwendung eines solchen Materials bei der Herstellung einer Zusammensetzung, eines Medikaments oder Wirkstoffs zur Verabreichung zu solch einem Zweck, z.B. zur Behandlung einer proliferativen Störung, und ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das das Vermischen eines solchen Materials mit einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger, Vehikel oder Träger und gegebenenfalls mit anderen Bestandteilen umfasst, bereit.
Welches Material in einem Verfahren zur medizinischen Behandlung der vorliegenden Erfindung auch verwendet wird, so erfolgt die Verabreichung vorzugsweise in einer "prophylaktisch wirksamen Menge" oder einer "therapeutisch wirksamen Menge" (je nachdem, wenn auch Prophylaxe ebenfalls als Therapie betrachtet werden kann), wobei diese Menge ausreichend ist, um für die behandelte Person eine positive Wirkung zu zeigen. Die tatsächliche verabreichte Menge sowie die Häufigkeit und die zeitliche Abfolge der Verabreichung hängt von der Beschaffenheit und dem Ausmaß des zu behandelnden Zustandes ab. Die Verordnung der Behandlung, z.B. Entscheidungen bezüglich Dosierung usw., liegt innerhalb der Entscheidungskompetenz von allgemeinen Ärzten und Fachärzten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung und zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können, zusätzlich zu den aktiven Bestandteilen, einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Materialien, die Fachleuten durchwegs bekannt sind, umfassen. Solche Materialien sollten nicht toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des aktiven Bestandteils nicht stören. Die exakte Beschaffenheit des Trägers oder anderen Materials hängt von der Art der Verabreichung ab, die oral oder mittels Injektion, z.B. kutan, subkutan oder intravenös, erfolgen kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder Flüssigform vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger wie Gelatine oder ein Adjuvans umfassen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen flüssigen Träger wie Wasser, Petroleum, Tier- oder Pflanzenöle, Mineralöle oder synthetische Öle. Physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder andere Saccharidlösungen oder Glykole wie Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol können eingebunden werden.
Zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion oder Injektion an der Stelle der Beschwerde liegt der Wirkstoff in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die pyrogenfrei ist und geeignete(n) pH, Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute werden durchwegs in der Lage sein, geeignete Lösungen unter Verwendung von beispielsweise isotonischen Vehikeln wie Natriumchloridinjektion, Ringer-Injektion oder Ringerlaktat herzustellen. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidanzien und/oder andere Additive können je nach Bedarf eingebunden werden.
Beispiele für zuvor erwähnten Verfahren und Arbeitsvorschriften sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980), zu finden.
Vektoren wie Virusvektoren wurden nach dem Stand der Technik verwendet, um Nucleinsäure in eine umfassende Auswahl von verschiedenen Targetzellen einzuführen. Typischerweise werden die Vektoren gegenüber Targetzellen ausgesetzt, sodass Transfektion in einem ausreichenden Anteil der Zellen stattfinden kann, um eine nützliche therapeutische oder prophylaktische Wirkung aus der Expression des erwünschten Peptids zu gewinnen. Die transfizierte Nucleinsäure kann dauerhaft in das Genom von jeder Target-Zelle inkorporiert werden, wodurch eine lang anhaltende Wirkung bereitgestellt wird, oder alternativ dazu kann die Behandlung auch periodisch wiederholt werden müssen.
Zahlreiche verschiedene Vektoren, sowohl Virusvektoren als auch Plasmidvektoren, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, siehe z.B. das US-Patent Nr. 5.252.479 und die WO 93/07282. Insbesondere wurden einige Viren als Gentransfervektoren verwendet, einschließlich Papovaviren, wie beispielsweise SV40, Vakzinia-Virus, Herpesviren, einschließlich HSV und EBV, und Retroviren. Zahlreiche Gentherapie-Arbeitsvorschriften nach dem Stand der Technik verwendeten funktionslose murine Retroviren.
Als eine Alternative zur Verwendung von Virusvektoren in Gentherapie umfassen andere bekannte Verfahren zum Einführen von Nucleinsäure in Zellen mechanische Verfahren wie Mikroinjektion, Liposomen-vermittelten Transfer und Rezeptor-vermittelten DNA-Transfer sowie die Verabreichung von nackter DNA oder RNA durch einfache Verabreichung, z.B. Injektion, von Nucleinsäure wie einem Plasmid, beispielsweise intramuskulär.
Spezifische Erkrankungsmodelle, die von solch einem Ansatz profitieren, werden im Anschluss beschrieben. Diese spezifischen Beispiele werden als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung beschrieben.
Alle in dieser Beschreibung genannten Dokumente sind hierin durch Verweis aufgenommen.
BEISPIEL 1 – Parkinson-Krankheit
1 von 100 Personen der Bevölkerung erkranken an Parkinson-Krankheit. 0,5% von Multiplexfamilien mit Parkinson-Krankheit tragen eine pathogene Mutation im alpha-Synucleingen (Polymeropolous et al. (1996)). Während dies keinen Hauptrisikofaktor für familiäre und nicht-familiäre Parkinson-Krankheit zu sein scheint, liefert es ein nützliches allgemeines Modell für die Pathogenese von Parkinson-Krankheit. Neuronale Überexpression von Wildtyp-α-Synuclein resultierte in progressiver Ansammlung von Einschlüssen im Neocortex, Hippocampus und der Substantia nigra mit einhergehendem Verlust von dopaminergen Termini und motorischer Behinderung (Masliah et al. (2000)), und α-Synuclein ist in den Lewy-Körpern von Patienten mit sporadischer Parkinson-Krankheit vorhanden (Spillantini et al., Nature (1997)), was zur Schlussfolgerung führt, dass eine Ansammlung von Wildtyp-alpha-Synuclein in die Pathogenese von Parkinson-Krankheit eingebunden sein kann. Tatsächlich entwickelt sich der Begriff der Synucleinopathien zu einer Sammelbezeichnung, die Parkinson-Krankheit, Multisystematrophie (MSA) und Lewy-Körper-Demenz (LBD) umfasst. (MSA ist bei etwa 10% der Parkinson-Patienten die zugrundeliegende Diagnose; Lewy-Körper-Demenz wird mittlerweile als die häufigste Ursache für Demenz nach Alzheimer-Krankheit betrachtet.)
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine für mutiertes α-Synuclein kodierende Sequenz an einen Augen-spezifischen Promotor ligiert, und das resultierende Konstrukt wird in das Zebrafisch-Genom eingeführt. In einem bestimmten Beispiel wird mutiertes menschliches α-Synuclein an den Zebrafisch-ath5-Promotor ligiert. Das Konstrukt wird in Zebrafisch-Embryonen eingeführt, und das Sehvermögen der resultierenden Fische getestet, um Fische zu identifizieren, in denen α-Synuclein im Auge exprimiert wird. Diese Fische werden zur Verwendung in einem sekundären Suppressor-Screen selektiert.
BEISPIEL 2 – Huntington-Krankheit
Huntington-Krankheit ist ein unheilbares Demenz-Leiden, an dem 4–7 von 100.000 Menschen der Bevölkerung erkranken. Genetische Tests ermöglichen die Identifikation von erkrankten Patienten, lange bevor sie die ersten Symptome zeigen, es gibt jedoch noch immer keine Behandlung für diese Krankheit.
Huntington-Krankheit ist auf eine erweiterte CAG-Wiederholungssequenz im Huntingtin-Gen mit einer resultierenden erweiterten Polyglutaminkette im Protein zurückzuführen. Ein ähnlicher Mechanismus unterliegt den anderen Triplett-Wiederholungs-Krankheiten, die bereits beschrieben wurden (SCA1-8, Kennedy-Krankheit oder X-gebundene bulbospinale Neuropathie und DRPLA oder dentatorubrale-pallidolysiane Atrophie). Es wird angenommen, dass die Pathogenese von allen Triplett-Wiederholungs-Krankheiten ähnlich ist. Tatsächlich führen verlängerte Polyglutaminpeptide selbst zu Zelltod und Neurodegeneration (Marsh et al., HMG 9, 13–25 (2000)). Es scheint, dass der Rest des Proteins die intrinsische Toxizität der Polyglutamin-Wiederholung modifiziert und dadurch bestimmte Zellgruppen entweder resistenter oder empfindlicher machen (Marsh et al. (2000)).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Zebrafischmodell von Huntington-Krankheit, das zur Verwendung in einem sekundären Suppressor-Screen einsetzbar ist, durch Ligation von mutiertem menschlichem oder Zebrafisch-Huntingtin an einen Zebrafischaugen-spezifischen Promotor, wie den ath5-Promotor, und die anschließende Bildung einer ath5-Promotor-mutierten Huntingtin-Zebrafisch-Linie hergestellt. Diese Fische sind dann in einem sekundären Screen nützlich, um Gene zu identifizieren, die Huntington-Krankheit lindern können.
BEISPIEL 3 – Spinale Muskelatrophie
Spinale Muskelatrophie (SMA) ist die häufigste autosomale rezessive Erkrankung nach zystischer Fibrose mit einer Inzidenz von 1 unter 6.000 Geburten. Sie ist auf die Degeneration der Vorderhornzellen im Rückenmark mit sich daraus ergebendem Schwund und Schwäche aller Muskeln zurückzuführen. Die Häufigkeit und Schwere von Muskelschwund variiert bei milderen Fällen, die bis zum Erwachsenenalter überleben. Unglücklicherweise ist die häufigste Todesursache Atemversagen in der frühen Kindheit. Für SMA gibt es bis heute keine Behandlung und auch noch keine in der klinischen Versuchsphase.
Wenn auch die Pathologie örtlich den Vorderhornzellen zugeschrieben werden kann, wird das verursachende Gen, SMN1 oder "Survival of Motor Neuron Gen", im gesamten Körper exprimiert. Das SMN-Protein ist in RNA-Spleißen, teilweise durch seine Teilnahme an Niedermolekular-Ribonucleinprotein-(snRNP)Anordnung im Zytoplasma, eingebunden (Pellizzoni et al., Cell 96, 1167 (1999)). Das Paradoxon, das SMN-Forschern Rätsel aufgibt, ist, warum ein Protein, das in einen Prozess eingebunden ist, der eindeutig für alle Zellen wesentlich ist, in seiner mutierten Form nur für Vorderhornzellen schädlich sein sollte.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Schaffung eines Zebrafischmodells von SMA, das zur Verwendung in einem sekundären Suppressor-Screen geeignet ist, durch Ligation von menschlichem SMN an einen Zebrafischaugen-spezifischen Promotor, wie den ath5-Promotor, und darauf folgende Bildung einer ath5-Promotor-mutierten SMN-Zebrafisch-Linie. Diese Fische sind in einem sekundären Suppressor-Screen nützlich, um Gene zu identifizieren, die SMA lindern. Überexpression des menschlichen Wildtyp-SMN in Fliegen ist dafür bekannt, über einen dominanten negativen Phänotyp zu einem SMN-Phänotyp zu führen (Miguel-Aliaga et al., FEBS Letters 486, 99–102 (2000)).
BEISPIEL 4 – Motoneuron-Krankheit
Motoneuron-Krankheit (MND) ist eine zerstörende Neurodegeneration, in der progressives Absterben von jeglichen Kombinationen der Motoneuronen, Vorderhornzellen oder des Tractus corticospinalis zu progressivem Schwund aller Muskeln im Laufe von mehreren Jahren führt und schließlich den Patienten an den Rollstuhl bindet, der nicht mehr fähig ist, zu sprechen, schlucken und schließlich zu atmen. Diese Krankheit betrifft jeden Tausendsten in der Bevölkerung. 10% der Fälle sind familiäre Erkrankungsfälle, und 20% sind auf Mutationen im Cu/Zn-Superoxiddismutase-(SOD-1)Gen zurückzuführen (Rosen et al. (1993)). Die Rolle von SOD-1 beim Abbau von freien Radikalen ließ darauf schließen, dass exzitotoxische Mechanismen für MND-Pathogenese wichtig sein könnten. Dies wurde durch Resultate sowohl aus Motoneuronen-Kulturen als auch aus Studien an Nicht-SOD-1-MND-Patienten (z.B. Rothstein et al. (1992 und 1995); Aoki et al. (1998); Rothstein & Kuncl (1995)) untermauert. In der Spezies Drosophila verkürzen SOD1-Mutationen die Lebenserwartung der Fliege, während Überexpression von normaler menschlicher SOD-1 den mutierten Phänotyp rettet und auch die Lebenserwartung von Wildtyp-Fliegen erhöht, sogar wenn die menschliche SOD-1 nur in Motoneuronen überexprimiert wird (Parkes et al., Nat. Gen. 19, 171–174 (1998)).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sorgt für die Schaffung eines Zebrafischmodells von MND, das zur Verwendung in einem sekundären Suppressor-Screen geeignet ist, umfassend die Ligation von mutierter menschlicher oder Zebrafisch-SOD-1 an einen Zebrafischaugen-spezifischen Promotor, wie den ath5-Promotor, und darauf folgende Bildung einer ath5-Promotor-mutierten Huntingtin-Zebrafisch-Linie. Ein sekundärer Suppressor-Screen kann dann solche Fische einsetzen, um Gene zu identifizieren, die MND lindern.
BEISPIEL 5 – Multiple Sklerose
An diesem chronischen behindernden Leiden erkrankt jeder Hundertste aus der Bevölkerung. Aktuelle immunmodulierende Therapien wie betaIFN zeigen in einer kleinen Gruppe von Betroffenen nur geringe Wirksamkeit. Darüber hinaus müssen sie subkutan verabreicht werden und bringen häufig Nebenwirkungen mit sich.
Überexpression von TNF-alpha wurde als ein Versuchsmodellsystem in Mäusen bestätigt (Probert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(24), 11294–11298 (1995)). Ein Zebrafischmodell von MS, das zur Verwendung in einem sekundären Suppressor-Screen geeignet ist, kann als eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch Ligation von einem TNF-alpha-Gen an einen Zebrafischaugen-spezifischen Promotor, wie den ath5-Promotor, und darauf folgende Bildung einer ath5-Promotor-TNF-alpha-Zebrafisch-Linie hergestellt werden. Das Einsetzen dieser Fische in einem sekundären Suppressor-Screen kann die Identifikation von Genen ermöglichen, die MS lindern. Dieses Modell ist besonders nützlich, da die Ganglionzellen in der Retina darin einmalig sind, dass aus ihren Axonen der Sehnerv entsteht, der wiederum eine übliche Erkrankungsstelle im Fall von MS darstellt. Solch ein Modell würde nicht funktionieren, wenn das TNF-alpha-Gen in irgendeinem anderen retinalen Zelltyp überexprimiert werden würde. Es ist die besondere Eigenschaft der Ganglionzellen, einen Zentralnervensystemtrakt aus myelinisiertem Gewebe entstehen zu lassen, der dies ermöglicht. Das Einsetzen der Erkrankung in Zebrafischen würde daher zu Demyelinisierung des Sehnervs und folglich zu Erblindung und einem leicht erkennbaren MS-Phänotyp führen.

Claims

Verfahren zum Screenen auf eine Substanz oder ein Gen (hierin als "erstes Gen" bezeichnet), die/das die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens an einem Fisch beeinflusst, umfassend: das Bereitstellen, als Modellfisch zum Screenen, eines Fisches, der für das zweite Gen transgen ist, worin das zweite Gen unter Regulationskontrolle eines Augen-spezifischen Promotors steht und Expression des zweiten Gens innerhalb des Auges des Fisches das Sehvermögen des Fisches beeinflusst; das Mutieren des Modellfisches, um einen mutierten Fisch bereitzustellen, oder das Behandeln des Modellfisches mit einer Testsubstanz, um einen behandelten Fisch bereitzustellen; das Vergleichen des Sehvermögens des mutierten Fisches oder behandelten Fisches mit dem Sehvermögen eines Modellfisches, um im Vergleich mit dem Modellfisch jeglichen mutierten Fisch oder behandelten Fisch mit verändertem Sehvermögen zu identifizieren; um hierdurch eine Testsubstanz zu identifizieren, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens beeinflusst, oder um, durch Identifikation eines genetischen Unterschieds zwischen Modellfisch und mutiertem Fisch mit solch einem veränderten Sehvermögen, ein erstes Gen zu identifizieren, das die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens oder die Aktivität beeinflusst.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Mutation eines Modellfisches, der für das zweite Gen transgen ist, um einen mutierten Fisch bereitzustellen, und die Identifikation eines ersten Gens, das die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens beeinflusst.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Behandlung des Modellfisches, der für das zweite Gen transgen ist, mit einer Testsubstanz, um einen behandelten Fisch bereitzustellen, und die Identifikation einer Testsubstanz, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens beeinflusst.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Identifikation eines ersten Gens, das die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens reduziert.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das zweite Gen ein Krankheitsgen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Identifikation eines ersten Gens, das die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens fördert oder steigert.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Identifikation einer Testsubstanz, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens reduziert.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das zweite Gen ein Krankheitsgen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Identifikation einer Testsubstanz, die die Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens steigert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Augen-spezifische Promotor induzierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Augen-spezifische Promotor aus der aus ath5-, Opsin-, Rhodopsin-, Nocturnin-, PAX6- oder Brn3-Promotor bestehenden Gruppe ausgewählt ist oder ein spezifischer Phototransduktions-Kaskadenpromotor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das zweite Gen ein Krankheitsgen ist und aus der aus menschlichem SMN, einer trunkierten Form von SMN, Wildtyp- oder mutiertem Huntingtin, Wildtyp- oder mutierem SOD-1, TNF-alpha, Wildtyp- oder mutiertem alpha-Synuclein, Wildtyp- oder mutiertem Rhodopsin, Wildtyp- oder mutiertem ELOVL4 oder Wildtyp- oder mutiertem Presenilin-1 oder -2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Identifikation eines ersten Gens, das ein Suppressorgen eines zweiten Gens ist, und zusätzlich zur Durchführung der in Anspruch 1 genannten Schritte das Bereitstellen des Suppressorgens oder eines Genprodukts, für das das Suppressorgen kodiert, in einer Zusammensetzung, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, zusätzlich zur Durchführung der in Anspruch 13 genannten Schritte weiters umfassend die Bereitstellung des Suppressorgens oder eines Genprodukts, für das das Suppressorgen kodiert, in einem Screening-System zum Testen der Fähigkeit einer Testsubstanz, die Aktivität des Suppressorgens oder des Genprodukts, für das das Suppressorgen kodiert, zu beeinflussen.
Verfahren nach Anspruch 14, zusätzlich zur Durchführung der in Anspruch 13 und Anspruch 14 genannten Schritte weiters umfassend die Bereitstellung einer Testsubstanz, die die Aktivität des Suppressorgens oder des Genprodukts, für das das Suppressorgen kodiert, beeinflusst, in einer Zusammensetzung, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Identifikation einer Testsubstanz, die die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens beeinflusst, und zusätzlich zur Durchführung der in Anspruch 1 genannten Schritte die Bereitstellung der Testsubstanz in einer Zusammensetzung, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin der Fisch aus der aus Zebrafisch, Fugu und Goldfisch bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin der Fisch ein Zebrafisch ist.
Fisch, der für ein Krankheitsgen transgen ist, unter der Regulationskontrolle eines Augen-spezifischen Promotors, worin die Expression des Krankheitsgens innerhalb des Auges des Fisches das Sehvermögen des Fisches beeinflusst.
Fisch nach Anspruch 19, worin der Augen-spezifische Promotor induzierbar ist.
Fisch nach Anspruch 20, worin der Augen-spezifische Promotor aus der aus ath5-, Opsin-, Rhodopsin-, Nocturnin-, PAX6- oder Brn3-Promotor bestehenden Gruppe ausgewählt ist oder ein spezifischer Phototransduktions-Kaskadenpromotor ist.
Fisch nach einem der Ansprüche 19 bis 21, worin das Krankheitsgen aus der aus menschlichem SMN, einer trunkierten Form von SMN, Wildtyp- oder mutiertem Huntingtin, Wildtyp- oder mutiertem SOD-1, TNF-alpha, Wildtyp- oder mutiertem alpha-Synuclein, Wildtyp- oder mutiertem Rhodopsin, Wildtyp- oder mutiertem ELOVL4 oder Wildtyp- oder mutiertem Presenilin-1 oder -2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Fisch nach einem der Ansprüche 19 bis 22, worin der Fisch aus der aus Zebrafisch, Fugu und Goldfisch bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Fisch nach Anspruch 23, worin der Fisch ein Zebrafisch ist.
Verwendung eines Fisches nach einem der Ansprüche 19 bis 24 in einem Screen zur Identifikation eines ersten Gens, das die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens beeinflusst.
Verwendung nach Anspruch 25, worin das erste Gen ein Suppressorgen der Aktivität oder Wirkung des zweiten Gens ist, worin das zweite Gen ein Krankheitsgen ist.
Verwendung eines Fisches nach einem der Ansprüche 19 bis 24 in einem Screen zur Identifikation einer Testsubstanz, die die Aktivität oder Wirkung eines zweiten Gens beeinflusst.