DE60117280T2

DE60117280T2 - Nicht-menschliches transgenes tier, welches ca-ahr exprimiert

Info

Publication number: DE60117280T2
Application number: DE60117280T
Authority: DE
Inventors: Lorenz Poellinger; Jaqueline Mcguire; Annika Hanberg Wiklund; Patrik Andersson
Original assignee: Index Pharmaceuticals AB
Current assignee: Index Pharmaceuticals AB
Priority date: 2000-10-26
Filing date: 2001-10-25
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2021-10-26
Also published as: EP1328652B1; AU2001296198A1; ATE317907T1; US7098376B2; WO2002034928A1; DE60117280D1; US20040088743A1; EP1328652A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verändertes Konstrukt für einen konstitutiv aktiven Aryl-Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR), ein CA-AhR exprimierendes transgenes nicht-menschliches Tier und ein Tiermodell zum Studium der molekularen Mechanismen von Krebs, besonders Magenkrebs. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Durchmustern und/oder Untersuchen von karzinogenen und anti-karzinogenen Verbindungen, das Durchmustern und/oder Untersuchen von Arzneimittel-Anwärtern als auch von Verbindungen, die beim Verwenden dieses Verfahrens entdeckt oder entwickelt wurden.
Hintergrund zur Erfindung
Der Dioxin/Aryl-Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) gehört zu einer speziellen Klasse von Transkriptionsfaktoren, einfachen Helix-Schleife-Helix/Per-Arnt-Sim-Domänen (bHLH/PAS)-Proteinen, aus denen eine wichtige Reihe von regulatorischen Faktoren, die sich anscheinend entwickelten, um auf Umweltsignale zu reagieren, hervorgeht. Andere Mitglieder dieser Familie schließen den durch Hypoxie induzierbaren Faktor HIF-1α, dass die Rhythmik regulierende Protein Clock, das neuroregulatorische Protein Sim und Arnt, einen essentieller Partnerfaktor für alle oben genannten Faktoren, einschließlich des AhRs, ein (1). Arnt wird auf eine ligandenabhängige Art und Weise vom AhR angebunden, um die Erkennung von xenobiotischen Reaktionselementen des Zielpromotors zu erleichtern.
Das durch Liganden aktivierte AhR vermittelt die Aktivierung der Transkription eines Netzwerkes von Genen, die für Enzyme, wie z.B. CYP1A1, CYP1A2, die Glutathion-S-Transferase Ya, die UDP-Glucuronosyl-Transferase 1A6 und die NAD(P)H-Chinon-Oxidoreduktase-1, die im oxidativen Metabolismus von Xenobioten wirken, kodieren (2). Gut charakterisierte Liganden des AhRs sind polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, die sich im Laufe von Verbrennungsprozessen bilden, und polychlorierte Dioxine und coplanare Biphenyle, die industrielle Chemikalien und die Umwelt kontaminieren (2). Daher stellen AhR-vermittelte Signalwege eine erste Verteidigungslinie gegen mögliche toxische Umweltschadstoffe dar. Andererseits kann das Auslösen von oxidativen metabolischen Prozessen durch AhR auch die Produktion von hochgradig karzinogenen Metaboliten verursachen, was eine starke Verbindung zwischen der AhR-Aktivierung und der chemischen Karzinogenese schafft (3). Zusätzlich scheint der Rezeptor durch bisher unklare Mechanismen einen großen Bereich von toxischen Wirkungen, einschließlich Geburtsfehler, beeinträchtigte Reproduktionsfähigkeit und Immunsuppression durch chlorinierte Dioxine zu vermitteln (1). Eine Anzahl von durch Genzerstörung in Mäusen durchgeführten unabhängigen Studien zum Funktionsverlust haben keine schlüssigen Informationen im Bezug auf eine mögliche Entwicklungsrolle des Rezeptors ergeben (4–7). Im Hinblick auf seine kritische Rolle bei der Vermittlung von metabolischen Reaktionen auf Umweltschadstoffe könnte die einzige biologische Funktion des AhRs daher auf die Regulation von adaptiven Reaktionen bei Xenobioten begrenzt sein. Diese Ansicht scheint durch die Tatsache bestätigt zu werden, dass es noch übrig bleibt eine vermeintliche physiologische Funktion des AhRs zu bestimmen. Auf Grundlage dieses Hintergrundes haben die Erfinder eine Studie zum Hinzugewinnen von Funktionen (gain-of-function study) durchgeführt, um mögliche biologische Funktionen des AhR-Systems zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine konstitutiv aktive AhR-Variante (CA-AhR) erzeugt und in transgenen Mäusen exprimiert, um mögliche durch AhR-vermittelte biologische Wirkungen zu studieren, die in Abwesenheit jeglicher Einwirkung durch Umweltkontaminanten generiert werden.
Stand der Technik
U.S. 5,378,822 offenbart rekombinante DNA Moleküle, die für murine und menschliche AhR-Rezeptoren kodieren, die zur Erzeugung großer Mengen des AhR-Rezeptorproteins zur Verwendung in kompetitiven Bindungsassays, die zum Detektieren von Umweltschadstoffen oder zum Regulieren der Genexpression in Reaktion auf Rezeptoragonisten verwendet werden, erzeugt werden. Eine andere Verwendung ist die Erzeugung von rekombinanten Organismen, die zur biologischen Überwachung von Umweltschadstoff oder zum Detektieren von menschlichen und wildlebenden Populationen, die eine hohe Anfälligkeit für Umweltschadstoffe aufweisen, dienen. U.S. 5,650,283 offenbart Säugetierzellen, die AhR konstitutiv exprimieren, zum Studium von Schadstoffen. Es wird darin vorgeschlagen, AhR in der ligandenbindenden Region zu verändern. Das Dokument "Breast Cancer Research and Treatment", Vol. 63, 2000, S.117–131 diskutiert die Beteiligung der konstitutiven Expression von AhR am Tumorzellwachstum.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung macht ein wirksames Werkzeug zum Studium von Krebs, das auf einem neuen Expressionskonstrukt für einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor CA-AhR basiert, zugänglich. Die Erfindung umfasst weiterhin transgene nicht-menschliche Tiere, bevorzugt Säugetiere, die CA-AhR in einem oder mehreren Geweben exprimieren. Ein Tiermodell, das auf diesen transgenen nicht-menschlichen Tieren aufbaut, bildet die Grundlage für neue Verfahren, z.B. für das Studium von Krebs; für das Durchmustern von Verbindungen, wie z.B. Arzneimittel-Anwärtern; für die Untersuchung von molekularen Mechanismen von Krebs, besonders Magenkrebs; für die Untersuchung der Mechanismen von hochgradig differenzierten Adenokarzinomen etc. Es wird gleichfalls ein in vitro-Modell offenbart, das auf transformierten Zellen oder Zelllinien, die das erfinderische Konstrukt funktionell enthalten, basiert.
Die Erfindung wird in der Beschreibung, den Beispielen und den angehängten Ansprüchen, die hiermit in ihrer Gänze aufgenommen werden, weiter definiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird in der unten stehenden Beschreibung und den Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen detailliert beschrieben, wobei
1 die konstitutive Aktivität von CA-AhR zeigt. (A) Schematische Darstellung der Wildtypmaus AhR (mAhR) und von CA-AhR. (B)Funktionelle Aktivität von CA-AhR in CHO-Zellen. Die Zellen werden mit einem AhR-abhängigen Luziferase-Reportergen und Expressionsvektoren, die für Arnt, Wildtyp AhR oder CA-AhR kodieren, transient transfiziert. Die Kontrollbahnen (Ctrl) stellen die Aktivität des Reportergens alleine und des leeren Expressionsplasmids dar. Die Daten stammen von einem Experiment, das zweimal durchgeführt wurde, und sind für wenigstens drei unabhängige Experimente charakteristisch. (C) Die Detektion der AhR- und CA-AhR-Proteine, die nach der transienten Transfektion der CHO-Zellen exprimiert wurden. Zellvollextrakte wurden durch Immun- Blotting mittels Anti-AhR-Antikörpern analysiert. Der Stern zeigt eine nicht spezifische Immunoreaktivität an. (D) Expression und funktionale Aktivität von CA-AhR in acht Monate alten weiblichen Mäusen. RNA-Blotanalyse (2μg poly-A RNA), die die Expression von endogenem AhR, CA-AhR und den Zielgenen CYP1A1 und CYP1A2 zeigen. Die Expression der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) wird als RNA-Ladekontrolle für entsprechende Gewebe dargestellt.
2 die funktionale Aktivität von CA-AhR im Mäusethymus und den Zeitverlauf der Sterblichkeit zeigt. (A) Der RNA-Blot (30 μg Gesamt-RNA) zeigt die Expression von CYP1A1 mRNA im Thymus von sechs Monate alten Wildtypen gegen gleichaltrige heterozygote und homozygote CA-AhR Mäuse, die mit einem Trägerstoff (Maisöl) oder TCDD, wie angegeben, behandelt wurden. (B) Das relative Gewicht des Thymus (g/g Körpergewicht) wurde in bis zu sechs Monate alten homozygoten CA-AhR Tieren verringert. Geschlossene Balken stellen den Wildtyp dar und offene Balken stellen die CA-AhR Tiere dar. Wenigstens vier weibliche Tiere jedes Genotyps und Alters wurden untersucht. Der Stern gibt an p < 0,05, was mit dem zweiseitigen Studenten t-Test überprüft wurde. (C) Das Alter der tot aufgefundenen, homozygoten CA-AhR Mäuse, aufgeteilt nach Geschlecht (geschlossene Symbole für Männchen, offene für Weibchen) und Stamm (Dreiecke für den Stamm "A3" und Kreise für den Stamm "Y8").
3 zeigt, wie auffallend neoplastische Läsionen im Magen beobachtete werden. (A) Der normale Magen eines zwölf Monate alten Wildtypmännchens, das den Vormagen (fs) und den glandulären Magen (gs) zeigt. (B) Im Alter von 3–4 Monaten sah man einzelne kleine Zysten nahe der Grenzfalte in CA-AhR-Mäusen (Pfeil). (C) In älteren CA-AhR-Tieren (6–12 Monate) waren die zystischen Tumore zahlreicher und bedeckten einen größeren Bereich des Magens. (D) In den schwersten Fällen (9–12 Monate alt) haftete der Magen benachbarten Organen, wie z.B. der Milz (sp), dem Pankreas (pank) und der Leber (liv) an. (E) Der normale Magen einer sechs Monate alten männlichen Wildtypmaus zeigt die Muskularis propria-Schicht (mp) und die Grenzfalte (lr), die die Grenze zwischen dem Plattenepithel und dem Vormagen (fs) und dem glandulären Epithel (ge; Hämatoxylin und Eosin-Färbung [HE], bar = 0,5 mm) bildet. (F) Nahe der Grenzfalte sieht man einen Bruch der Submucosa durch neoplastische Krypten in einem 3,5 Monate alten CA-AhR Männchen. Man beachte die Drüsen innerhalb des Stromas der Grenzfalte (HE, bar = 0,5 mm). (G) Eine höhere Vergrößerung des umrahmten Bereichs in 3F (HE, bar = 0,15 mm). (H) Magen eines 12-Monate alten CA-AhR Männchens mit schwer zerstörter Gewebearchitektur (HE, bar = 1,25 mm). (I) Der Serosa (ser) unterliegende Drüsen in einem 12-Monate altem CA-AhR Weibchen mit Charakteristika eines Hamartoms (har), d.h. eine definierte Struktur, die lymphatisches Gewebe, Gefäße und Fett (HE, bar = 0,5 mm) enthält. Man beachte auch die Inversion (Pfeil) von Drüsen aus dem glandulären Epithel (ge) in den Muskularis propria (mp).
4 zeigt eine intestinale Metaplasie, die an benachbarten Organen anhaftet und die Expression von CA-AhR im Gastrointestinaltrakt. (A, B) Glanduläre Strukturen, die im Muskularis propria mit Zellen, die foveoläres Epithel (fe) und Pylorusdrüsen (pg) ähneln, angeordnet sind, zeigen eine intestinale Metaplasie in einem 9-Monate alten CA-AhR Männchen. Färbungen: Hämatoxylin und Eosin (HE; Feld A) und Alcian Blue pH 2,5 (Feld B). Bars = 0,1 mm. (C, D) Von Bindegewebe (ct) umgebene eindringende Krypten dringen mittels Penetration durch den Muskularis mucosa (mm), die Submucosa (sm)-Schichten und in den Muskularis propria (mp) in einem 9-Monate alten CA-AhR Weibchen in die Submucosa (sm) ein.
Färbungen: HE (Feld C) und van Gieson (Feld D). Bars = 0,1 mm. (E, F) Squamöse Zysten auf dem Blinddarm zeigen Darmdrüsen (cg) und Plattenepithel (sq.e) eines 9-Monate alten CA-AhR Männchens (HE, bar = 0,5 mm). (G) Die Expression und Aktivität von CA-AhR im Verdauungskanal ist im glandulären Magen am höchsten. Der RNA-Blot (2 μg poly-A RNA) zeigt die Expression von CA-AhR, endogenem AhR (AhR), CYP1A1 und GAPDH mRNA in unterschiedlichen Abschnitten des Verdauungstraktes von 3-Monate alten homozygoten CA-AhR-Mäusen.
Beschreibung
Vor dem vorliegenden Konstrukt werden transgene Tiere, die das Konstrukt enthalten, Tiermodelle und Verfahren, die auf der Verwendung dieser Tiere basieren, offenbart und beschrieben, verständlicherweise soll diese Erfindung nicht auf bestimmte Konfigurationen, Verfahrensschritte und Materialien, die hierin offenbart werden, beschränkt sein, da solche Konfigurationen, Verfahrensschritte und Materialien etwas variieren können. Verständlicherweise wird die hierin gebrauchte Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen verwendet und dient nicht der Begrenzung, da der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente beschränkt wird.
In der Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: AhR = Aryl-Kohlenwasserstoff (Dioxin)-Rezeptor; Arnt = AhR nukleärer Translokator; CA-AhR = konstitutiv aktives AhR; CYP1A1 = Cytochrom P450 1A1; HE = Hämatoxylin-Eosin; TCDD = 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass die Expression von CA-AhR in transgenen Mäusen eine ausgeprägte Sterblichkeit, beginnend mit dem sechsten Lebensmonat, auslöst, die mit der Entwicklung von schweren Tumoren im Magen korreliert. Daher verdeutlicht diese Studie eindeutig das onkogene Potential von AhR. Es war schwierig die Histopathologie der Magentumore in den CA-AhR-Mäusen unzweifelhaft zu interpretieren. Die gut organisierten glandulären Strukturen und die niedrigen Niveaus der zellulären Atypie sprechen für einen nicht malignen Phänotyp. Andererseits weisen die reduzierte Lebensspanne, die aggressive expandierende Invasion in alle Magenschichten und das Anheften an die umgebenden Organe auf einen eher malignen Phänotyp hin. Die intestinale Metaplasie war in den CA-AhR-Tumoren weit verbreitet und ist mit als präkarzinomatöse Läsion betrachtet (17). Darüber hinaus ist kürzlich eine Untergruppe des menschlichen, gastrischen Karzinoms des intestinalen Typs beschrieben worden, in der die Krebszellen ebenfalls hochgradig differenziert sind (18). Angesichts des auffälligen, gastrischen, onkogenen Phänotyps der CA-AhR-Mäuse ist es interessant festzustellen, dass die meisten physiologischen Anwärter von Rezeptorliganden Indolderivate sind, ganz besonders Indol[3,2-b]carbazol, die in der sauren Umgebung des Magens aus Nahrungsmittelvorstufen, z.B. Indol-3-carbinol erzeugt werden (19). Darüber hinaus bilden bestimmte im Nahrungsmittel enthaltende heterozyklische Amine, die während des Kochverfahrens der Lebensmittel erzeugt werden, ebenfalls AhR-Liganden (20). Daher stellt die Korrelation zwischen der Anwesenheit von vermeintlichen Nahrungsmittel-Rezeptorliganden und einer möglichen Rolle des AhRs in der homöostatischen Kontrolle von Zellen aus der Magenschleimhaut ein faszinierendes biologisches Szenario dar, dass es noch im näheren molekularen Detail zu überprüfen gilt.
Magenkrebs ist der am zweithäufigsten verbreitete bösartige Tumor in der Welt (21). Die Rolle (falls irgendeine) des AhRs bei der Entwicklung dieser Krebsart ist nicht bekannt. Interessanterweise wird der Magenkrebs üblicherweise mehr beim Mann als bei der Frau gefunden (21, 22), ein Geschlechterunterschied, der von den CA-AhR-Mäusen wiedergegeben wird. Einige epidemiologische Studien zeigen ein erhöhtes Auftreten von Magenkrebs in menschlichen Populationen, die Herbiziden (23) oder fetthaltigen Fischen (24), die mit TCDD oder anderen Dioxinen kontaminiert sind, ausgesetzt worden. Noch geläufiger diskutierte Risikofaktoren für Magenkrebs sind die Nahrung, die mutagene nitrosierende Verbindungen enthält, als auch die Infektion mit Helicobactor pylori (22). Jedoch erhielten die CA-AhR-Tiere in dieser Studie herkömmliches Nagetierfutter und es wurde keine Infektion mit Helicobactor bei selektiver Kultur von Gewebehomogenaten (Daten nicht dargestellt) detektiert. Angesichts der Abwesenheit irgendeines bekannten Karzinogens ist es unwahrscheinlich, dass die Induktion von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen und die darauf folgende Bioaktivierung von Mutagenen die onkogene Wirkung des AhRs erklären kann. Eine faszinierendere Hypothese ist, dass ein Netzwerk von entscheidenden Wachstumskontrollgenen durch das CA-AhR fehlreguliert wird.
In der Magenschleimhaut werden hohe Niveaus an endogener AhR-mRNA am Schwangerschaftstag 15,5 der sich entwickelnden Maus nachgewiesen (25). Die Erfinder haben die Expression des CA-AhRs im Magen von neugeborenen Mäusen nachgewiesen (Daten nicht dargestellt). Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass das vorliegende Mausmodell eine Situation einer frühen in utero Einwirkung des AhR-Liganden widerspiegelt, die sich nach der Geburt fortsetzt. Auffallenderweise gibt es einen Mangel an Daten im Bezug auf die Langzeitwirkungen, die der in utero Einwirkung von Dioxinen und anderen Umweltschadstoffen, die AhR-Liganden bilden, folgt. Zusätzlich zu Dioxinen schließen xenobiotische AhR-Liganden halogenierte Biphenyle und eine große Anzahl von nicht halogenierten, polyzyklischen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, z.B. Benzo[a]pyren, 9,10-Dimethylbenz[a]anthrazen und 3-Methylcholanthren ein. In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, dass vor kurzem vorgeschlagen wurde, dass AhR verschiedene Zielgene abhängig von der chemischen Natur des Rezeptorliganden unterschiedlich reguliert (26). Es wurde berichtet, dass AhR die Bax-Gentranskription aktiviert, wenn es 9,10-Dimethylbenz[a]anthrazen ausgesetzt wird, jedoch nicht wenn es mit TCDD als Liganden (26) besetzt ist. Offensichtlich muss dieses Modell weiter substantiiert werden. Auffallenderweise könnte das vorliegende Modellsystem ein experimentelles Werkzeug zum Lösen dieses Problems bereitstellen. Besonders die möglichen biologischen Wirkungen, die durch den aktivierten Rezeptor per se (d.h. erzeugt durch das CA-AhR) vermittelt werden, können mit den Wirkungen verglichen werden, die durch die verschiedenen ligandenstimulierten Rezeptorformen erzeugt werden. Jedoch muss dieses Szenario unter der Berücksichtigung, dass alle Klassen von Rezeptorliganden jetzt noch nicht identifiziert sein könnten, weiter experimentell aufgeklärt werden.
Interessanterweise hat man von verschiedenen Spezies von Labortieren, die mit AhR-Liganden behandelt worden sind, berichtet, die Läsionen in der glandulären Magenschleimhaut entwickeln, was den Befunden in den CA-AhR Mäusen der vorliegenden Erfindung gleicht. Zum Beispiel wird ein Adenokarzinom nach der Injektion von 3-Methylcholantren in die Magenwand von verschiedenen Mäusestämmen beobachtet (27, 28). Ob dies durch reaktive 3-Methylcholantren-Metaboliten oder einen anderen Mechanismus verursacht wird, eine mögliche Rolle für das AhR im durch 3-Methylcholantren induzierten Magenkrebs wird durch die Beobachtung gestützt, dass der DBA Mäusestamm, der eine wenig affine AhR Variante exprimiert, bezüglich der Entwicklung von durch 3-Methylcholantren induzierten Magentumore resistent ist (27). Zusätzlich wurden eine Hyperplasie der Magenschleimhaut und der Zysten in der Submucosa von Rhesusaffen (29) und ein Adenokarzinom des glandulären Magens der Ratte (30) nach der Einwirkung von Nährstoffmischungen von polychlorinierten Biphenylen, die das Potential haben AhR zu aktivieren, beobachtet. Zusammengenommen weisen diese Beobachtungen auf eine wichtige Rolle des AhRs in der Magentumorgenese hin und daher auch auf die Kontrolle des Wachstums und der Proliferation von Magenepithelzellen.
Es existieren anscheinend gegenteilige Berichte über die Rolle des AhRs in der Zellzykluskontrolle. Vom TCDD wurde berichtet, dass es das Wachstum von menschlichen Keratinozyten (31) und veränderten Zellen, die kein oder wesentlich niedrigere Niveaus an AhR exprimieren, stimuliert, was erhöhte Wachstumsraten im Vergleich zu Wildtypzellen (32, 33) anzeigt. Andererseits ist vom TCDD berichtet worden, dass es die Expression des Cyklin/cdk-Inhibitors p27 (Kip 1) in bestimmten Zellen induziert (34). Interessanterweise entwickeln Mäuse Adenokarzinome im glandulären Magen nach der Expression von viralen Onkoproteinen, die an das Retinoblastomprotein Rb binden (35–38). Besonders vom AhR wurde vor kurzem berichtet, dass es mit Rb (39,40) über einen bisher unklaren Mechanismus physikalisch interagiert, und es bleibt zu ermitteln, ob diese Wirkung irgendeine Relevanz für den Phänotyp der CA-AhR exprimierenden Mäuse hat.
Interessanterweise zeigen Mäuse, die TGFα oder EGF-ähnliche virale Wachstumsfaktoren überexprimieren zystische Hyperplasie, intestinale Metaplasie und Dysplasie im Magen (41, 42). Darüber hinaus sind TGFα-mRNA-Expressionsniveaus dafür bekannt, dass sie durch TODD-Behandlung von, z.B., Keratinozyten induziert werden (43). Jedoch gelang es den Erfindern nicht, irgendeine Zunahme in den TGFα-mRNA-Niveaus im glandulären Magen der CA-AhR Mäuse festzustellen (Daten nicht dargestellt). Demnach wird es jetzt von Bedeutung sein, das Netzwerk von Genen zu identifizieren, das nach der Expression des CA-AhRs fehlreguliert wird und dadurch eine mögliche physiologische Rolle des AhRs in der gastrischen Homöostase zu verstehen.
Zusammenfassend haben die Erfinder dargestellt, das CA-AhR die Entwicklung von hochgradig invasiven Magentumoren in Abwesenheit der Einwirkung irgendeines bekannten Karzinogens auslöst. Diese Studie stellt zum ersten Mal Beweise für das direkte onkogene Potential des AhRs zur Verfügung und schlägt eine mögliche physiologische Rolle des AhRs in der homöostatischen Kontrolle von Zellen der Magenschleimhaut vor.
Infolgedessen stellt die vorliegende Erfindung einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) und insbesondere ein verändertes Konstrukt bereit.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung fehlt dem Konstrukt ein Abschnitt der ligandenbindenden Domäne. Gemäß einer bestimmten Ausführungsform, die derzeit von den Erfindern bevorzugt wird, umfasst das Konstrukt eine Mäuse-AhR-Sequenz, in der die Aminosäuren 288–421 fehlen.
Die Erfindung stellt weiterhin ein transgenes nicht-menschliches Tier bereit, das CA-AhR in einem oder mehreren Geweben exprimiert oder ein transgenes nicht-menschliches Tier, das ein Expressionskonstrukt, wie weiter oben definiert, funktionell enthält.
Das transgene nicht-menschliche Tier gemäß der Erfindung wird bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Mäusen, Ratten, Affen, Schafen und Hasen besteht.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine isolierte Zelle des erfindungsgemäßen transgenen nicht-menschlichen Tieres, wie weiter oben definiert. Die Erfindung umfasst auch eine isolierte Zelllinie, die von dem transgenen Tier, wie weiter oben definiert, abstammt. Gemäß einer Ausführungsform wird die Zelle oder werden die Zellen aus einer Keimzelle oder einer Körperzelle ausgewählt.
Die vorliegenden Erfindung stellt ein Tiermodell zum Studium von Krebs bereit, das ein transgenes nicht-menschliches Tier, das ein Expressionskonstrukt für einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) in wenigstens einer seiner Zellen aufweist, umfasst. Das transgene Tier gemäß der Erfindung wird bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Mäusen, Ratten, Affen, Schafen und Hasen besteht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein in vitro-Modell zum Studium von Krebs bereit, das eine Zelle umfasst, die ein Expressionskonstrukt für einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR), der funktionell enthalten ist, aufweist. Die Erfindung stellt weiterhin ein in vitro-Modell zum Studium von Krebs bereit, das eine Zelllinie umfasst, wobei dessen Zellen ein Expressionskonstrukt für einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR), der funktionell enthalten ist, umfassen.
Eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern von Arzneimittel-Anwärtern, wobei die anti-karzinogene Wirkung der Arzneimittel-Anwärter in einem nicht-menschlichen transgenen Tier oder einer Zelle oder Zelllinie davon, die einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) exprimiert, geprüft wird.
Eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Durchmustern von Arzneimittel-Anwärtern, wobei die anti-karzinogene Wirkung der Arzneimittel-Anwärter in einem Tiermodell oder in einem in vitro-Modell, wie weiter oben definiert, geprüft wird.
Eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Untersuchen der molekularen Mechanismen des Krebses, wobei ein Tiermodell oder in vitro-Modell, wie weiter oben definiert, verwendet wird.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Untersuchen der Mechanismen von hochgradig differenzierten Adenokarzinomen im Magen bereit, wobei ein Tiermodell oder in vitro-Modell, wie weiter oben definiert, verwendet wird.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Auslösen von Magenkrebs in einem nicht-menschlichen Tier für Forschungszwecke bereit, wobei das Tier mit einem Konstrukt transformiert wird, das einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) exprimiert. Mit dem Konstrukt transformiert bedeutet in diesem Kontext, dass das Konstrukt funktionell inseriert wird, d.h. im korrekten Leserahmen und Orientierung, so wie es vom Fachmann allgemein verstanden wird. Verschiedenartige Expressionsvektoren oder Systeme sind gut bekannt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Konstrukt in eine befruchtete Eizelle des nicht-menschlichen Tieres injiziert, und man lässt sich das Ei zu einem Tier entwickeln, das das Konstrukt in seinem Genom trägt.
Des Weiteren stellt die Erfindung ein Verfahren zum Induzieren von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen, die normalerweise durch den Ah-Rezeptor in Gegenwart eines Liganden reguliert werden, zum Studium des Arzneimittel-Metabolismus durch irgendein Mitglied (irgendwelche Mitglieder) der Enzyme, bereit, wobei ein nicht-menschliches Tier mit einem Konstrukt transfiziert wird, das einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) exprimiert.
Gemäß einer Ausführungsform des obigen Verfahrens wird ein in vitro-Verfahren zum Induzieren von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen, die normalerweise durch den Ah-Rezeptor in Gegenwart eines Liganden reguliert werden, zum Studium des Arzneimittel-Metabolismus durch irgendein Mitglied (irgendwelche Mitglieder) dieser Enzyme, durch das Transfizieren von kultivierten Zellen mit einem Konstrukt, das einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) exprimiert, aufgebaut.
Die vorliegende Erfindung betrifft, durch das Bereitstellen der obigen praktischen und leistungsfähigen Forschungs- und Durchmusterungswerkzeuge, auch Arzneimittel-Anwärter, Arzneimittelvorstufen und Behandlungskuren, die durch einen Prozess einschließlich eines Verfahrens identifiziert werden, ein Tierverfahren oder ein in vitro-Verfahren, das Tiere oder Zellen einschließt, die ein Konstrukt enthalten, das einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) exprimiert.
Im Kontext von Arzneimittelentwicklungen und dem Verständnis der molekularen Mechanismen von Krebs sind andere nicht-menschliche Tiere außer Mäusen ebenfalls von Interesse, besonders andere Säugetiere. Nagetiere werden zum Beispiel weiterhin verwendet, besonders Ratten und Mäuse. Da das erfindungsgemäße Konstrukt auch in anderen Tieren transformiert und der CA-AhR-Rezeptor auch in anderen Tieren exprimiert werden kann, umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des Konstruktes in diesen anderen Tieren, Tiermodellen und Verfahren, die darauf basieren.
Beispiele
Materialien und Methoden
Zellkultur, Reportergen und Immunoblot-Assays:
CHO-Zellen wurden mit einem XRE-enthaltenden Luziferase Reportergenkonstrukt, PTXDIR, und CMV Expressionsplasmiden, die für Arnt und entweder das Wildtypmäuse AhR (8) oder ein Mäuse AhR, dem ein Abschnitt der ligandenbindenden Domäne (Aminosäuren 288–421) fehlt, CA-AhR (J. McGuire, K. Okamoto, M.L. Whitelaw, H. Tanaka, L. Poellinger, Studien durchgeführt, Manuskript in Vorbereitung) kodieren, transient transfiziert. Nach 48 h Inkubation entweder in Gegenwart von 10 nM TCDD (2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin) oder einem Trägerstoff (1 % DMSO) alleine, wurde die Luziferase-Aktivität geprüft. Gesamtzellextrakte wurden wie zuvor bereits beschrieben hergestellt (8), um die Expression von AhR zu überwachen. Die Extrakte (30 μg Protein) wurden durch eine 7,5 % SDS-PAGE getrennt, auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und die relativen Expressionsniveaus durch Immunodetektion mit anti-AhR-Antiserum (BioMol, PA) bestimmt.
Mäuse:
Das CA-AhR wurde zwischen dem Mäuse IgH Intron-Verstärker/SV40-Promotor und der SV40-Polyadenylierungsstelle von pEμSR (9) subkloniert. Transgene Mäuse wurden durch pronukleäre Injektion eines 5,5 kb KpnI-Fragmentes, das das EμSR-CA-AhR-Konstrukt umfasst, in befruchtete C57BL/6 × CBA Eier erzeugt, was zu fünf Gründertieren geführt hat, die das CA-AhR im Genom tragen. Drei Linien wurden für weitere Studien ausgewählt und nachfolgend in den C57BL/6-Stamm für zwei zusätzliche Generationen eingekreuzt. Transgene CA-AhR und Wildtypkontrolltiere weisen den gleichen gemischten genetischen Hintergrund auf. Die Homozygotie wurde durch Southern-Blot-Analysen genomischer DNA aus Schwanzbiopsien verifiziert. Die Tiere wurden in ventilierten Käfigen mit Oberfilter gehalten und erhielten herkömmliches Nagetierfutter (RM3, spezieller Ernährungsservice) und Wasser nach belieben und wurden einem 12-stündigem Licht/Dunkelzyklus ausgesetzt. In Studien zur TCDD Einwirkung wurden gleichaltrige Wildtyp- und weibliche CA-AhR-Mäuse mit Maisöl oder verschiedenen Dosen von TCDD, das in Maisöl gelöst war, behandelt und wurden drei Tage später getötet. Die Tiere wurden durch CO₂-Erstickung gefolgt von einer Halswirbeldislokation getötet. Alle tierischen Verfahren waren vom örtlichen Ethikkomitee genehmigt.
Das Geschlechterverhältnis aller CA-AhR Tiere lag bei 216 Männchen und 209 Weibchen und bei den homozygoten CA-AhR Mäusen bei 125 Männchen und 107 Weibchen, im Vergleich zu 245 Männchen und 246 Weibchen bei den Wildtypmäusen.
Wildtyp- und homozygote CA-AhR-Tiere wurden einmal in der Woche während der ersten drei Lebensmonate gewogen. Auch wenn individuelle Würfe sich in der Gewichtszunahme unterschieden, wurde kein Unterschied bei irgendeinem Geschlecht beobachtet, wenn das Durchschnittsgewicht von fünf Würfen jedes Genotyps verglichen wurde (45 Wildtypen und 44 CA-AhR Tiere insgesamt).
RNA-Isolation und Northern-Blot-Assay:
Die Gesamt-RNA wurde durch Gewebehomogenisation in einem Guanidiniumthiocyanatpuffer gefolgt von einer CsCl₂-Gradientenzentrifugation aufbereitet (10). Poly-A RNA wurde aus der Gesamt-RNA mittels oligo-(dT)-gekoppelten magnetischen Kügelchen (Dynal AS, Oslo, Norwegen) isoliert. Die Northern-Blot-Analysen wurden mittels Standardverfahren durchgeführt (10). Die Prähybridisierung und Hybridisierung wurde bei 42°C in einem Formamid enthaltenden Puffer durchgeführt (10). Die Filter wurden über Nacht mit ³²P-markierten cDNA-Sonden, die für die angegebenen Gene spezifisch sind, hybridisiert (11). Die Filter wurden mit 2 × SSPE bei Raumtemperatur, 30 Minuten 2 × SSPE/2 % SDS bei 65 °C und 30 Minuten 0,1 × SSPE/0,1 % SDS bei 65 °C gewaschen und nachfolgend einem autoradiographischen Film bei –70 °C und einer PhosphorImager Analyse (FujiFilm Inc.) ausgesetzt. Die PhosphorImager-Ergebnisse wurden mittels der vom Hersteller zur Verfügung gestellten Software quantifiziert.
Histopathologische Analysen:
Die Gewebe wurden entfernt und in 4 % gepuffertem Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 4 μm dicke Schnitte geschnitten, die mit Hämatoxylin-Eosin, Alcian Blue pH 2,5 oder van Gieson Färbemittel gemäß den Standardverfahren gefärbt wurden.
Ergebnisse
In Analogie zu nukleären Hormonrezeptoren (12) vermittelt die ligandenbindende Domäne des AhRs sowohl die Aktivierung der Rezeptorfunktion in Gegenwart eines Liganden als auch die Hemmung der Rezeptorfunktion in Abwesenheit eines Liganden (8, 13). Die teilweise Deletion der minimalen ligandenbindenden Domäne des AhRs ergibt ein Protein, CA-AhR (1A), das keinen Liganden binden kann (Daten nicht dargestellt). Dieser veränderte Rezeptor war im Bezug auf die Reportergenaktivierung (1B) in transienten Transfektionsexperimenten bei CA-AhR Expressionsniveaus, die dem ligandenabhängigen Wildtyp AhR (1C) entsprechen, konstitutiv aktiv.
CA-AhR wurde in transgenen Mäusen unter der Kontrolle eines SV40-Promotors und dem immunoglobulinen schwere Kette (IgH) Intron-Verstärker exprimiert (9). Das Paaren von heterzygoten CA-AhR Tieren ergab Wildtyp, hetero- und homozygote Mäuse mit einer normalen Mendelschen 1:2:1 Frequenz, was auf keine pränatale Letalität von homozygoten Mutanten hinweist. Sowohl heterozygote als auch homozygote CA-AhR Mäuse waren fruchtbar und zeigten ein normales Geschlechterverhältnis. In Übereinstimmung mit anderen Studien, die IgH Intron-Verstärker getriebene Expressionskonstrukte verwenden (9, 14), wurden CA-AhR mRNA Expressionsniveaus im Thymus und in der Milz (1D), und in angereicherten B- und T-Zellen (Daten nicht dargestellt) als auch in einer Anzahl von nicht-lymphoiden Geweben (1D) detektiert. Das durch Liganden aktivierte AhR reguliert die Expression einer Reihe von Genen, die für xenobiotisch metabolisierende Enzyme, z.B. CYP1A1 und CYP1A2 kodieren (1). Mit Ausnahme der Lunge wurde die Expression von CYP1A1 mRNA in unbehandelten Wildtypmäusen (1D) nicht detektiert. Im Gegensatz dazu zeigten alle Gewebe, die eine CA-AhR transgene Expression zeigten, auch eine induzierte Expression bei verschiedenen Niveaus an CYP1A1 mRNA (1D). Jedoch korrelierte die Streuung bei der induzierten Expression dieser Zielgene nicht mit den Expressionsniveaus von CA-AhR, was darauf hinweist, dass weitere gewebespezifische Faktoren für die Regulation der CYP1A1 Expression wichtig sind. Zusätzlich wurde in der Leber die Expression der CYP1A2 mRNA auch durch das Transgen induziert. Zusammengenommen zeigt dies, dass CA-AhR transkriptionell aktiv ist und die Wirkung des durch Liganden aktivierten AhRs mimt.
Um das Niveau der funktionellen Aktivität von CA-AhR zu prüfen, wurde die Induktion der CYP1A1 mRNA Expression durch CA-AhR im Thymus mit der Induktionsreaktion, die in Wildtypmäusen infolge einer oralen Einwirkung von TCDD erzeugt wurde, verglichen. In homozygoten CA-AhR Mäusen waren die Niveaus an CYP1A1 mRNA vergleichbar mit denen, die in Wildtypmäusen, die mit einer einzelnen Dosis an TCDD mit 3 μg TCDD/kg Körpergewicht (2A) behandelt wurden, beobachtet wurden. Nach der Einwirkung dieser Dosis an TCDD wurden keine akuten toxischen Wirkungen (z.B. Letalität oder das Wasting-Syndrom) in Mäusenmodellen erkennbar (15). Es wurde keine Auswirkung auf die Körpergewichtszunahme sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen CA-AhR Mäusen (Daten nicht dargestellt) beobachtet. Diese Ergebnisse stimmen mit der Tatsache überein, dass ein Gewichtsverlust oder eine beeinträchtigte Gewichtszunahme nur nachgewiesen werden, wenn Mäusen Dosen an TCDD ausgesetzt werden, die beträchtlich höher als 3 μg/kg Körpergewicht (2, 15) sind. Demnach scheint die Aktivität des CA-AhRs mit einer chronischen, relativ geringen Einwirkdosis an TCDD oder anderen AhR-Liganden zu korrespondieren.
Eine gut charakterisierte nachteilige Wirkung von Dioxins ist die Rückbildung des Thymus (1). Das relative Thymusgewicht von CA-AhR-Tieren war bis zum sechsten Lebensmonat verringert (2B). Veränderte Populationsgrößen von einzelnen positiven CD8⁺ und CD4⁺ T-Zellen wurden zuvor bei Ratten beobachtet, die dem TCDD während der Trächtigkeit ausgesetzt waren (16). Die Wirkung wurde auch im Thymus von neugeborenen CA-AhR-Mäusen (Daten nicht dargestellt) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass in Abwesenheit von Dioxin CA-AhR die biologischen Wirkungen, die normalerweise durch die dioxinaktivierte Form des AhRs ausgelöst werden, mimt.
Die CA-AhR Mäuse zeigten eine wesentlich verringerte Lebensspanne in der nur sehr wenig homozygote Tiere über ein Alter von 12 Monaten hinaus überlebten. Etliche Mäuse wurden bereits ab einem Alter von 6 Monaten tot aufgefunden, häufig ohne irgendwelche vorhergehenden klinischen Symptome. Besonders war der auffallende Geschlechterunterschied, bei dem männliche Mäuse früher starben als weibliche. Zusätzlich wurde auch ein Unterschied im zeitlichen Verlauf zwischen zwei unabhängigen homozygoten Mäuselinien beobachtet (2C).
Bei der Autopsie wurden drastische Magenläsionen in den CA-AhR-Mäusen beobachtet. Im Gegensatz zu Mägen von Wildtypmäusen (3A) zeigten CA-AhR Mäuse grobe, sichtbare Zysten im Alter von 3–4 Monaten in der kleinen Magenkurvatur (3B). Die Zysten wurden mit zunehmendem Alter zahlreicher (3C) und in den ernsteren Fällen (im Alter von 12 Monaten) hefteten die Wachsenden an umliegenden Organe, wie z.B. der Leber, der Bauchspeisedrüse und dem Bauchfett (3D) an. In vielen Fällen war die Magenwand überall im Mageneingang und im Korpusbereich des glandulären Magens verdickt. Die Grenzfalte, die die Grenze zwischen dem Vormagen und dem glandulären Teil des Nagetiermagens bildet (3E) war auch makroskopisch deutlich vergrößert (Daten nicht dargestellt).
Histopathologische Analysen offenbarten glanduläre Strukturen, die sich von der Mucosa in das Stroma der Grenzfalte ausbreiteten, was die Fettung erklärt, die bei der groben Inspektion beobachtet wurde (3F). Das expansive Wachstum der zystischen glandulären Strukturen in der Schleimhaut zeigte die Invasion von dysplastischen Krypta in die Submucosa, die Muskularis propria und letztendlich in die subserosale Region (3F, G). Trotz des aggressiven Verhaltens der eindringenden Tumorzellen behielten sie ein bemerkenswertes gut differenziertes Aussehen nach dem Hindurchtreten durch den Muskularis mucosa (3G). Die Tumorentwicklung schritt über die Zeit voran und führte zu einer bizarren deformierten Gewebearchitektur, die vor der Letalität beobachtet wurde (im Alter von 12 Monaten, 3H).
Die Erfinder wiesen auch Drüsen in der Subserosa nach, die durch Bindegewebe in Verbindung mit lymphatischen Geweben, Gefäßen, Fett und manchmal Nerven (3I) definiert waren, was auf eine ernste Störung des Differenzierungsstatuses dieser Gewebe hinweist. Diese Veränderungen sind charakteristisch für das Hamartom des menschlichen Magens. Die intestinale Metaplasie war in den meisten Zysten der Tumoren verbreitet, was durch das Färben des Schleims des intestinalen Typs, der normalerweise im Korpus des Magens nicht zu finden ist (4A–B), dargestellt wird. Darüber hinaus wurde auch eine Plattenepithelmetaplasie, die zur Bildung von Plattenepithelzysten führte, beobachtet (Daten nicht dargestellt). Eine nähere Analyse der expansiv wachsenden Epithelzellen, die die Muskularis mucosa-Schicht penetrieren, zeigte, dass diese Zellen nicht von Zellen der Muskularis mucosa-Schicht (4C–D) umgeben waren. Diese Beobachtung schließt die Herniation als Grund für die Penetration aus, was mit einem invasiven Wachstumsverhalten konsistent ist. Die Erfinder wiesen auch Plattenepithelzysten nach, die auf dem Blinddarmvokal angeordnet waren und gelegentlich auf dem Krummdarm in verschiedenen CA-AhR Mäusen im Alter von 6 Monaten oder mehr (4E–F). Obwohl das CA-AhR mit dem höchsten Niveau im glandulären Teil des Magens mit sich einer daraus ergebenden starken CYP1A1 Induktionsantwort exprimiert wurde, wurde das Transgen überall im ganzen Gastrointestinaltrakt (4G) exprimiert und funktionell aktiv. Trotz dieser Tatsache wurden keine weiteren größeren Läsionen als die beschriebenen im Gastrointestinaltrakt gefunden.
Die Magentumoren wurden in keinen Wildtypmäusen (n > 200) gefunden, jedoch in mehr als 200 transgenen Tieren. Darüber hinaus traten die Tumoren in drei unabhängigen Linien von CA-AhR-Mäusen auf, was darauf hinweist, dass die Neoplasie keine Wirkung aufgrund einer zufälligen Integration des Expressionskonstruktes in das Genom war. Heterozygote Mäuse zeigten weniger ernsthafte Magentumore als homozygote Mäuse, was auf eine Gen-Dosis-Wirkung hinweist (Daten nicht dargestellt). Darüber hinaus nahm die Schwere der Magentumore mit dem Alter zu und Männchen waren ernsthafter betroffen (Daten nicht dargestellt), was den Geschlechterunterschied bei der Empfindlichkeit gegenüber CA-AhR, die zuvor im Bezug auf die Sterblichkeit (2C) beobachtet wurde, illustriert.
Auch wenn die Erfindung im Bezug auf ihre bevorzugten Ausführungsformen, die die beste den Erfindern derzeit bekannte Methode darstellt, beschrieben worden ist, sollte deutlich geworden sein, dass verschiedene Veränderungen und Modifikationen, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sind, durchgeführt werden können, ohne sich aus dem Schutzumfang der Erfindung, wie sie in den beigefügten Ansprüchen dargestellt wird, zu entfernen.
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Claims

Expressionskonstrukt für einen konstitutiv aktiven Dioxin/Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (CA-AhR), dadurch gekennzeichnet, dass das Konstrukt die Mäuse-AhR-Sequenz, in der die Aminosäuren 288–421 fehlen, ist.
Transgenes nicht-menschliches Tier, das ein Expressionskonstrukt gemäß Anspruch 1 funktionsfähig enthält.
Transgenes nicht-menschliches Tier nach Anspruch 2, bei dem das Tier ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Mäusen, Ratten, Affen, Schafen und Kaninchen besteht.
Isolierte Zelle des transgenen Tiers nach Anspruch 2.
Isolierte Zelllinie, die von dem transgenen Tier nach Anspruch 2 stammt.
Zelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle aus einer Keimzelle oder einer Körperzelle ausgewählt ist.
Nicht-menschliches Tiermodell zum Studium von Krebs, aufweisend ein transgenes Tier nach Anspruch 2.
Nicht-menschliches Tiermodell zum Studium von Krebs, aufweisend ein transgenes Tier nach Anspruch 3.
In vitro-Modell zum Studium von Krebs, aufweisend eine Zelle nach Anspruch 4.
In vitro-Modell zum Studium von Krebs, aufweisend eine Zelllinie nach Anspruch 5.
Verfahren zum Durchmustern von Arzneimittel-Anwärtern, dadurch gekennzeichnet, dass die anti-karzinogene Wirkung der Arzneimittel-Anwärter in einem nicht-menschlichen transgenen Tier nach Anspruch 2 oder 3 oder einer Zelle davon oder einer davon stammenden Zelllinie, das (die) einen konstitutiv aktiven Dioxin/Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (CA-AhR) exprimiert, geprüft wird.
Verfahren zum Durchmustern von Arzneimittel-Anwärtern, dadurch gekennzeichnet, dass die anti-karzinogene Wirkung der Arzneimittel-Anwärter in einem Modell gemäß einem der Ansprüche 7–10 geprüft wird.
Verfahren zum Untersuchen der molekularen Mechanismen von Krebs, dadurch gekennzeichnet, dass ein Modell gemäß einem der Ansprüche 7–10 verwendet wird.
Verfahren zum Untersuchen der Mechanismen hochgradig differenzierter Ardenokarzinome im Magen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Modell gemäß einem der Ansprüche 7–10 verwendet wird.
Verfahren zum Auslösen von Magenkrebs bei einem nicht-menschlichen Tier für Forschungszwecke, dadurch gekennzeichnet, dass das Tier mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 1 transfiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Konstrukt in ein befruchtetes Ei des nicht-menschlichen Tiers injiziert wird und dem Ei erlaubt wird, sich zu einem Tier zu entwickeln, das das Konstrukt in seinem Genom enthält.
Verfahren zum Erzeugen von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen, die normalerweise durch den Ah-Rezeptor in Anwesenheit eines Liganden reguliert werden, zum Studium des Arzneimittel-Metabolismus durch irgendein Mitglied (irgendwelche Mitglieder) der Enzyme, dadurch gekennzeichnet, dass ein nicht-menschliches Tier mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 1 transfiziert wird.
Verfahren zum Erzeugen von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen, die normalerweise durch den Ah-Rezeptor in Anwesenheit eines Liganden reguliert werden, zum Studium des Arzneimittel-Metabolismus durch irgendein Mitglied (irgendwelche Mitglieder) der Enzyme, dadurch gekennzeichnet, dass kultivierte Zellen mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 1 transfiziert werden.