DE69833108T2

DE69833108T2 - Tiere, die ein transferiertes gen der 25-hydroxy-vitamin d3-24 hydroxylase enthalten

Info

Publication number: DE69833108T2
Application number: DE69833108T
Authority: DE
Inventors: Hisao Toyonaka-shi KASUGA; Masami Konohana-ku ISAKA; Kunio Suita-shi MATSUOKA
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: WO1998048616A1; EP0992189A1; AU7081698A; US6316689B1; CA2287979A1; ATE314805T1; DE69833108D1; EP0992189A4; EP0992189B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich auf transgene 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-Hydroxylase-Ratten.
STAND DER TECHNIK
Das transgene Tier trägt ein Gen, das in seine eigene Keimzellinie oder die seiner Nachkommen in einem frühen Entwicklungsstadium eingeführt wurde (üblicherweise Einzelzellen).
Wagner et al. (1981, ProNAS, USA, 78, 50169) und Stewart et al. (1982, Science, 217, 1046) beschreiben transgene Mäuse, die das humane Globin-Gen tragen. Constantini et al. (1981, Nature, 294, 92) und Lacy et al. (1983, Cell, 34, 343) beschreiben transgene Mäuse, die das Kaninchen-Globin-Gen tragen. McKnight et al. (1983, Cell, 34, 335) beschreiben Mäuse, die ein fremdes Transferrin-Gen tragen. Brinstar et al. (1983, Nature, 306, 332) beschreiben Mäuse, die ein funktionell eingeführtes Immunglobulin-Gen tragen.
Bezüglich transgener Mäuse, die ein mit Knochenerkrankungen in Beziehung stehendes Fremdgen tragen, gibt es den folgenden Bericht. Lewis, D. B. et al. (1993, ProNAS, USA, 90, 11618) beschreiben Mäuse, die das eingeführte Maus-Ick-IL4-Gen tragen und berichten, daß der Osteocalcinspiegel bei diesen Mäusen signifikant niedrig war, wobei die Tiere osteoporoseähnliche Symptome zeigten.
Inzwischen stehen zu Mäusen, die ein mit Nierenkrankheiten in Beziehung stehendes Fremdgen tragen, die folgenden Berichte zur Verfügung. Doi, T. et al. (1988, Am. J. Pathol., 131, 398) beschreiben Mäuse, die das eingeführte Rinderwachstumshormongen tragen und berichten, daß diese Mäuse im Alter von 7 Wochen eine diffuse mesangiale Hyalinisierung und von 30 Wochen oder später eine fortgeschrittene Glomerulosklerose zeigten und nachfolgend an Urämie starben.
Dressler, G. R. et al. (1993, Nature, 362, 65) beschreiben Mäuse, die das einge führte Pax-2-Gen tragen und berichten, daß in ihren Nieren die Expression des Gens bestätigt werden konnte und solche Symptome wie etwa glomeruläre Atrophie und Proteinurie beobachtet wurden. Lowden, D. A. et al. (1993, J. Lab. Clin. Med., 124, 386) beschreiben Mäuse, die ein eingeführtes TGF-α-Fremdgen tragen und berichten, daß die Expression des Gens in den Nieren bestätigt werden konnte und solche Symptome wie eine Zystenbildung und glomeruläre Hypertrophie beobachtet wurden.
Es ist jedoch keine Ratte bekannt, die ein eingeführtes Fremdgen trägt, die als Modell einer Knochenkrankheit oder Nierenkrankheit dienen kann.
Es ist bekannt, daß Vitamin D im Naturreich als zwei natürliche Formen, D₂ und D₃, existiert und daß während D₂ eine Doppelbindung in der 22-Stellung und eine Methylgruppe in der 24-Stellung seiner Seitenkette aufweist und in Pflanzen auftritt, D₃ in Tieren auftritt. Wenn das in der menschlichen Haut produzierte 7-Hydroxycholesterin (Provitamin D₃) ultraviolettem Licht von 290 bis 320 nm ausgesetzt wird, erleidet es einen Photoabbau, der die Spaltung des Rings B in der 9,10-Stellung unter Ergeben von Provitamin D₃ umfaßt. Dieses wiederum wird bei Körpertemperatur unter Ergeben von Vitamin D₃ isomerisiert. Die Struktur des Vitamins D₃ enthält 3 Doppelbindungen, die sich aus der Spaltung des Rings B in allen anderen Stellungen ergeben. Vitamin D₃ wird mit einem Vitamin-D-bindenden Protein gekuppelt und das Paar wird zur Leber transportiert, wo die 25-Stellung seiner Seitenkette durch das in den Leberzellenmitochondrien vorhandene Enzym 25-Hydroxylase unter Ergeben von 25-Hydroxyvitamin D₃ hydroxyliert wird. Diese Substanz wird darauf zu den Nieren transportiert und in Abhängigkeit von den den Calciumstoffwechsel regulierenden Hormonen im Blutstrom wie etwa PTH und der Blutcalciumkonzentration wird sie in der 1α-, 23-, 24- und 26-Stellung in den proximalen Nierenkanälchen unter Ergeben von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, 23,25-Dihydroxyvitamin D₃, 24,25-Dihydroxyvitamin D₃ beziehungsweise 26,25-Dihydroxyvitamin D₃ weiterhydroxyliert. Unter diesen ist der Metabolit mit einer hohen biologischen Aktivität 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, das den Blutcalcium- und Phosphorspiegel erhöht und knochenmetabolisierende Funktionen freisetzt, und zwar unterstützt es die Expression von Osteopontin und Osteocalcin durch Osteoblasten, hemmt die Produktion von Proteoglycan und verstärkt umgekehrt die Produktion aus der Zellmembran stammender Phospholipide, um dadurch die Kalzifizierung der Osteoblasten zu beschleunigen. Bezüglich der Funktion von 24,25-Dihydroxyvitamin D₃ ist von dieser Substanz bekannt, daß sie die Bildung von Osteoklasten hemmt, die Expression des Osteocalcin-Gens fördert und weiter angeblich die Kalzifizierung bei Vitamin-D-armen Ratten beschleunigt, diese Wirkung aber von der 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase (auch Vitamin-D₃-24-hydroxylase oder 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-hydroxylase genannt), die in den proximalen Nierenkanälchen vorhanden ist, abhängig ist. Weiterhin haben kürzliche Untersuchungen gezeigt, daß dieses Enzym nicht nur die 24-Stellung, sondern auch die 26-Stellung hydroxyliert.
Unter wichtigen bekannten Störungen des Vitamin-D-Stoffwechsels befinden sich die Vitamin-D-abhängige Krankheit Typ II, Rachitis, Osteomalazie und so weiter. Diese Krankheiten zeigen eine Dysosteogenese und Deformität des Knochens, die sich aus einer Störung der Kalzifizierung ergibt und das Auftreten dieser Störung vor dem Verschließen der Epiphysen führt zu Rachitis, während das Auftreten der Störung zu einem späteren Zeitpunkt zu Osteomalazie führt. Abgesehen von den vorstehenden Krankheiten bestehen Risiken für Nierenkrankheiten einschließlich Niereninsuffizienz, sekundären Hyperparathyroidismus und Hyperkalzämie, die entweder als Komplikationen der besagten Krankheiten oder unabhängig auftreten.
Ohyama et al. (1989, FEBS Lett., 255, 405) waren bei der Reinigung von Vitamin-D₃-24-hydroxylase aus Rattennierenmitochondrien, die nach der Verabfolgung von Vitamin D₃ extrahiert wurde, erfolgreich. Nachfolgend isolierten Ohyama et al. (1991, FEBS Lett., 278, 195) eine cDNA durch das Durchmustern von Klonen mittels eines Anti-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Antikörpers. Es ist bekannt, daß diese Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA eine vollständige Länge von 3,2 K Basen aufweist und einen Leserahmen (allgemein offener Leserahmen genannt) von 1542 bp zur Translation von 514 Aminosäuren enthält und ein Protein mit einem Molekulargewicht von 59000 produziert. Es ist gezeigt worden, daß wenn 35 Aminosäuren vom N-Terminus des vorstehenden Proteins abgespalten werden, ein aus 479 Aminosäureresten bestehendes reifes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 55000 produziert wird. Weiterhin zeigt der Befund, daß ihre 462. Aminosäure Cystein an die 5-Stellung des Häms gebunden ist, daß dieses Protein den des mitochondrialen Proteins P-450 ähnliche Eigenschaften auf weist und ein Expressionsversuch in COS-Zellen ergab den Nachweis der Expression als ein Protein. Inzwischen ist humane Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA durch Chen et al. (1993, ProNAS, USA, 90, 4543), das Maus-Gegenstück durch Itoh et al. (1995, Biochemica et Biophysica Acta, 1264, 26) und das Meerschweinchen-Gegenstück durch Ohyama et al. (1996, Journal of Japan Society of Bone Metabolism, 14, 112) isoliert worden. Es ist gezeigt worden, daß die Aminosäuresequenzen der vorstehenden Ratten-, humanen, Maus- und Meerschweinchenversionen des Enzyms etwa 80 bis 95% Homologie aufweisen.
Die Funktionen des Enzyms in vivo sind ebenfalls analysiert worden und Shinki et al. (1992, J. Biol. Chem., 267, 13757) zeigten durch Northern-Analyse, daß Vitamin-D₃-24-hydroxylase durch 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ induziert wird. Es wurde ferner gezeigt, daß die Reaktion von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ im Dünndarm schneller und höher im Ausmaß als in den Nieren ist. Weiterhin legte bei der Analyse der relativen Reaktivität von 25-Dihydroxyvitamin D₃ und 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ der Unterschied beim Km-Wert nahe, daß 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ in der Substratspezifität von Vitamin-D₃-24-hydroxylase höher ist. Bechen, M. J. et al. (1996, Biochemistry, 35, 8465) untersuchten den Stoffwechsel von 25-Hydroxyvitamin D₃ experimentell in Spodoptera-frugiperda-(Sf21)-Zellen und behaupteten, daß das Enzym eine 23-/24-bikatalytische Aktivität aufweist. Weiterhin wurde Vitamin-D₃-25-hydroxylase aus Rattenlebermitochondrien durch Masumoto et al. (1988, J. Biol. Chem., 263, 14256) isoliert und es wurde auch über die entsprechende Genfunktion ein gewisser Aufschluß gegeben. Jedoch waren weder die Isolierung und Reinigung noch das Klonieren des Vitamin-D₃-1α-hydroxylase-Gens bis heute erfolgreich.
Die Expression des Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens wird durch das Kuppeln des Heterodimers, das aus dem Vitamin-D₃-Rezeptor- (allgemein als VDR abgekürzt) 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-Komplex und dem Retinoid-X-Rezeptor (allgemein als RXR abgekürzt) besteht, mit dem Vitamin-D₃-Antwortelement (allgemein als VDRE abgekürzt) VDRE₁, das sich in der Region –150 bis –136 5'-stromaufwärts befindet, reguliert. Dieses Vitamin-D₃-Antwortelement weist eine sich wiederholende Struktur eines Motivs auf, das aus den 6 Basen AGGTCA mit einer Lücke von 3 Basen (allgemein Tandemwiederholung genannt) besteht und auf seine Ähnlichkeit mit dem Thyroidhormonantwortelement (allgemein als TRE bezeich net) und Retinsäureantwortelement (allgemein als RARE abgekürzt) ist hingewiesen worden. Weiterhin behaupteten Kerry, D. M. et al. (1996, J. Biol. Chem., 271, 29715), daß unter den drei 5'-stromaufwärts dieses Gens bestehenden Vitamin-D₃-Antwortelementen, VDRE-1, das sich in der Region –150 bis –136 befindet, empfindlicher gegenüber 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ als VDRE-2 ist, das sich in der Region –249 bis –232 befindet und daß diese beiden Elemente unter Verstärken der Aktivität und Modulieren der Antwort auf 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ zusammenarbeiten.
Die wichtigen Gene, die unter Hochregulierung der Expression durch 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ stehen, schließen alkalische Phosphatase, Aldolaseuntereinheit B, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hitzeschockprotein-70, Calbindin-D_28K und -_9K, Osteocalcin, Osteopontin, Osteonectin, Fibronectin, Interleukin I-6, Matrix-gla-protein, Metallothionein, NADH-DH-Untereinheit III und IV, Integrin αVβ3, den transformierenden Wachstumsfaktor β, Nervenwachstumsfaktor, c-FMS, c-fos, c-Ki-ras, Vitamin-D₃-Rezeptor, 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase, Proteinkinase C, Prolactin, Plasmamembrancalciumpumpe, EGF-Rezeptor, Tumornekrosefaktor α, 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-Rezeptor usw. ein. Die wichtigen Gene unter Herabregulierung der Expression schließen NADH-DH-Untereinheit I, Calcitonin, Kollagen Typ I, γ-Interferon, koloniestimulierenden Faktor, c-myb, 25-Hydroxyvitamin-D₃-1α-hydroxylase, fettsäurebindende Proteine, Interleukin II und III, CD-23, Transferrinrezeptor, Cytochrom B, Ferredoxin, Parathyroidhormon (allgemein als PTH abgekürzt), Prepro-PTH, PTH-verwandte Proteine, Proteinkinaseinhibitoren usw. Es ist bekannt, daß die Vitamin-D₃-24-hydroxylase-, Osteocalcin- beziehungsweise Osteopontinregulierungsregionen Vitamin-D₃-Antwortelemente aufweisen und daß die Expression dieser Proteine durch 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ geregelt wird, es bis jetzt aber unbekannt ist, ob alle vorstehend aufgezählten Gene unter der Regulierung durch die Vitamin-D₃-Antwortelemente stehen.
Als 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ einer Ratte mit Vitamin-D₃-Armut verabfolgt wurde, wurde Vitamin-D₃-24-hydroxylase induziert, aber ihre Konzentration und Reaktionszeit schwankten zwischen der Niere und dem Dünndarm, wobei beim Dünndarm eine höhere Reaktivität gefunden wurde. Es wurde gezeigt, daß die gleichzeitige Verabfolgung von Parathyroidhormon und 1α,25-hydroxyliertem Vi tamin-D₃ die Induktion von Vitamin-D₃-24-hydroxylase hemmte. Es wurde ferner gezeigt, daß dieses Enzym in den Nieren im proximalen Kanal exprimiert wird. Roy et al. (1996, Endocrinology, 137, 2938) zeigte, daß im Dünndarm dieses 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-induzierte Enzym im Zylinderepithel einer sackförmigen Drüse und Darmzotten exprimiert wird.
Bezüglich Vitamin D sind Reaktionen aufgrund einer Genaktivierung (allgemein die genomische Wirkung von Vitamin D genannt) und andere Reaktionen (allgemein die nicht-genomische Wirkung von Vitamin D genannt) bekannt und es wurde behauptet, daß sie mit unterschiedlichen physiologischen Aktivitäten verbunden sind. Was die nicht-genomische Wirkung von Vitamin D betrifft, werden solche Phänomene wie die Förderung der Calciumaufnahme im Darm und das Auslösen einer Erhöhung des intrazellulären Calciums innerhalb weniger Minuten angeführt.
Die Metaboliten von Vitamin D im Humanplasma schwanken mit den Testbedingungen, aber unter Annahme von Vitamin D₃ als Beispiel ist sein normaler Bereich im Plasma angeblich 1 bis 5 ng/ml bei einer Ausscheidungshalbwertszeit von 1 Tag; im Fall von 25-Hydroxyvitamin D₃ ist sein normaler Bereich 10 bis 40 ng/ml bei einer Ausscheidungshalbwertszeit von 10 bis 20 Tagen; im Fall von 24-Hydroxyvitamin D₃ ist sein normaler Bereich 1 bis 4 ng/ml bei einer Ausscheidungshalbwertszeit von 14 bis 21 Tagen und in dem Fall von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃ ist sein normaler Bereich 20 bis 70 pg/ml bei einer Ausscheidungshalbwertszeit von mehreren Stunden. 25-Hydroxyvitamin D₃ wird in der Leber produziert und diese Substanz unterliegt kaum der Stoffwechselregulierung, ist aber von der Vitamin-D-Aufnahme und Photobiosynthese abhängig und kann daher ein Ernährungsmarker bei Vitamin-D-Mangel sein. Zum anderen wird 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ durch die Blutcalciumkonzentration und den Parathyroidhormonspiegel reguliert und in den Nieren verstoffwechselt, so daß es bei einer konstanten Konzentration gehalten wird. Niedrige Plasmaspiegel dieser Substanz finden sich bei bestimmten Krankheiten wie etwa Vitamin-D-abhängiger Krankheit Typ II, Rachitits, Osteomalazie, chronischer Niereninsuffizienz, Hypoparathyroidismus, Hyperthyroidismus und Osteoporose, während hohe Plasmawerte bei solchen Krankheiten wie sekundärem Parathyroidismus und Hyperkalzämie und bei Schwangerschaft gefunden werden. Es ist somit bekannt, daß diese Substanz ein diagnostischer Marker dieser Krankheiten sein kann.
Ernährungsmäßig gesehen ist die Einnahme Vitamin D₂ und Vitamin D₃ enthaltender Lebensmittel oder Zubereitungen bei Vitamin-D-Mangel wirkungsvoll, aber die Verabreichung einer aktivierten Vitamin-D-Zubereitung wird bei Vitamin-D-resistenter Rachitis, Osteomalazie, Osteoporose, renaler Dystrophie, Psoriasis und durch einen antineoplastischen Wirkstoff ausgelöster Rachitis notwendig.
Die Synthese aktivierter Vitamin-D-Derivate geht mit Eifer weiter und eine große Zahl von Derivaten ist synthetisiert worden. Im Einklang mit dieser Entwicklung wurden Fortschritte bei der Untersuchung der biologischen Aktivität in Zellen als auch klinischen Wirkungen dieser Derivate mit dem Ergebnis gemacht, daß verschiedene Vitamin-D-Zubereitungen als therapeutische Wirkstoffe für diese Krankheiten und sogar eine größere Anzahl Kandidaten von Derivaten für derartige therapeutische Wirkstoffe bereits bekannt ist. Insbesondere sind wie durch den Bericht von Bouillon et al. (1995, Endocrine Reviews, 16, 200) kurz dargestellt wurde, bereits viele Untersuchungen zur Struktur-Aktivitätsbeziehung unternommen worden. Untersuchungen zu den biologischen Wirkungen in Zellen und klinischen Wirkungen dieser Substanzen haben ebenfalls raschen Fortschritt gemacht und als Ergebnis werden viele Vitamin-D-Zubereitungen in der Therapie der vorstehend angeführten Krankheiten verwendet und eine große Zahl von Derivaten ist derzeit als Kandidat für therapeutische Wirkstoffe vorgesehen.
Unter diesen ist 24-fluoriertes Vitamin D₃ besonders genau untersucht worden und es wurde aufgeklärt, daß die biologische Aktivität von 24,24-Difluor-25-hydroxyvitamin D₃ von der von 24,25-Dihydroxyvitamin D₃ nicht verschieden ist. Die Funktion von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase muß eingehender erforscht werden. Beckman et al. (1996, Biochemistry, 35, 8465) zeigten die multikatalytische Aktivität dieses Enzyms in einem In-vitro-Stoffwechselversuch. So wurde 25-Hydroxyvitamin D₃ zu 25-Hydroxy-24-oxovitamin D₃, zu 24-Oxo-23,25-hydroxyvitamin D₃ und weiter zu 23-Hydroxy-24,25,26,27-tetranorvitamin D₃ verstoffwechselt, was zeigt, daß die Aktivität dieses Enzyms nicht auf die 24-Hydroxylierung beschränkt ist, sondern multikatalytisch ist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Aufklärung des Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens, insbesondere das Entschlüsseln des Vitamin-D₃-Metabolismus und seiner Wirkungen bei Knochenkrankheiten ist ein therapeutisch wichtiger Untersuchungsgegenstand bei der Behandlung von Knochenkrankheiten (z. B. primäre und sekundäre Osteoporose, Rachitis, Osteomalazie, Hypokalzämie usw.) und Nierenkrankheiten (z. B. Glomerulonephritis, IgA-Nephropathie, membranöse Nephropathie, Glomerulosklerose, Nephrose, Niereninsuffizienz usw.). Weiterhin ist es ein wichtiges Forschungsunterfangen, den Prozeß der Pathogenese einer Nierenkrankheit, Knochenkrankheit, Gelenkkrankheit, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergischen Krankheit, endokrinen Krankheit, Demenz und Krebs durch die größenmäßige Bestimmung der Besserung dieser Krankheiten aufzuklären.
Die transgene Ratte stellt gemäß einem Aspekt dieser Erfindung das optimale Modell für Untersuchungen zur Funktion von Vitamin-D₃-24-hydroxylase, Untersuchungen zum Vitamin-D₃-Stoffwechsel, Untersuchungen zum Aufstellen prophylaktischer und therapeutischer Modalitäten für Knochenkrankheiten, Bereitstellung stark genexprimierender Zellen, Ligandenbindungsuntersuchung des Vitamin-D-Rezeptors und Aufklärung des Zielgenregulierungsmechanismus nukleärer Rezeptoren einschließlich des Vitamin-D-Rezeptors bereit. Die transgene Ratte gemäß dieser Erfindung, bei der die Überexpression der Vitamin-D₃-24-hydroxylase das Ungleichgewicht des Vitamin-D₃-Stoffwechsels hauptsächlich in den Nieren und die Inaktivierung oder Unterdrückung der aktivierten Vitamin-D₃-regulierenden Gene fördert, dient als Tiermodell, das die größenmäßige Bestimmung der den Krankheitszustand verbessernden Wirksamkeit bei einer Nierenkrankheit, Knochenkrankheit, Gelenkkrankheit, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergischen Krankheit, endokrinen Krankheit, Demenz oder Krebs ermöglicht und dadurch Aufschluß über den Mechanismus dieser Krankheiten und ihre Komplikationen gibt.
Es war jedoch kein transgenes Tier (insbesondere eine transgene Ratte) bekannt, das ein gut geeignetes Modell für eine Knochenkrankheit oder Nierenkrankheit sein könnte und daher für die vorstehend angeführten Zwecke brauchbar ist.
Es wurde daher angenommen, daß falls man beim Aufbauen einer transgenen Ratte erfolgreich ist, die eine DNA trägt, in die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen inseriert ist, die als ein derartiges Krankheitsmodell verwendet werden kann, es möglich sein sollte, die Funktionen des Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens, insbesondere unter dem Aspekt des Vitamin-D₃-Stoffwechsels und seiner Auswirkungen auf Knochenerkrankungen aufzuklären und Untersuchungen zum Aufstellen prophylaktischer und therapeutischer Modalitäten für Knochenkrankheiten, die Bereitstellung stark genexprimierender Zellen, die Ligandenbindungsuntersuchung des Vitamin-D-Rezeptors und sogar Untersuchungen über den Regulierungsmechanismus des Zielgens der durch den Vitamin-D-Rezeptor dargestellten nukleären Rezeptoren zu gestatten.
Beim ernsthaften Erforschen von Möglichkeiten für Lösungen der vorstehenden Probleme waren die Erfinder dieser Erfindung zum ersten Mal beim Aufbauen einer transgenen Ratte erfolgreich, die eine DNA trägt, die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen beherbergt und fanden zu Jedermanns Überraschung, daß diese transgene Ratte eine Nierenkrankheit entwickelt und daß die Überexpression von Vitamin-D₃-24-hydroxylase das Ungleichgewicht des Vitamin-D₃-Stoffwechsels hauptsächlich in den Nieren fördert und durch die Inaktivierung oder Unterdrückung der Funktionen der aktivierten Vitamin-D₃-regulierenden Gene eine Nierenkrankheit, Knochenkrankheit, Gelenkkrankheit, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergische Krankheit, endokrine Krankheit, Demenz oder Krebs einschließlich ihrer Komplikationen auslöst und dadurch eine Bestimmung der den Krankheitszustand verbessernden Wirkung therapeutischer Mittel bei einer Nierenkrankheit, Knochenkrankheit, Gelenkkrankheit, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergischen Krankheit, endokrinen Krankheit, Demenz oder Krebs ermöglicht.
Diese Erfindung bezieht sich daher auf:

1. Eine transgene Ratte umfassend ein Ratten-25-Hydroxyvitamin-D₃-24- hydroxylase-Transgen, die das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxy-Transgen überexprimiert.
2. Eine transgene Ratte gemäß vorstehend 1, wobei die Überexpression der Vitamin-D₃-24-hydroxylase das Ungleichgewicht des Vitamin-D₃-Stoffwechsels hauptsächlich in den Nieren fördert.
3. Eine transgene Ratte gemäß vorstehend 1 oder 2, wobei die Überexpression der Vitamin-D₃-24-hydroxylase die Funktionen der aktivierten, Vitamin-D₃-regulierenden Gene inaktiviert oder unterdrückt.
4. Eine transgene Ratte gemäß einem aus vorstehend 1 bis 3, wobei die Überexpression der Vitamin-D₃-24-hydroxylase eine Nierenerkrankung, Knochenerkrankung, Gelenkerkrankung, Lungenerkrankung, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzerkrankung, Diabetes, Fettsucht, Erkrankung eines Verdauungsorgans oder Infektionskrankheit auslöst.
5. Eine aus einer transgenen Ratte gemäß einem aus vorstehend 1 bis 4 isolierte Zelle, Gewebe oder Organ, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ ein Transgen umfaßt, das eine für 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase kodierende DNA-Sequenz umfaßt.
6. Eine isolierte Zelle, Gewebe oder Organ gemäß vorstehend 5, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ eine Nierenzelle, -gewebe oder -organ ist und wobei das Transgen in den Nieren in nachweisbaren Mengen exprimiert wird.
7. Eine isolierte Zelle, Gewebe oder Organ gemäß vorstehend 5, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ aus dem Oberschenkelknochen stammt und wobei das Transgen im Oberschenkelknochen in nachweisbaren Mengen exprimiert wird.
8. Eine isolierte Zelle, Gewebe oder Organ aus vorstehend 5, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ eine Leberzelle, -gewebe oder -organ ist und wobei das Transgen in der Leber in nachweisbaren Mengen exprimiert wird.
9. Eine isolierte Zelle, Gewebe oder Organ aus vorstehend 5, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ eine Lungenzelle, -gewebe oder -organ ist und wobei das Transgen in der Lunge in nachweisbaren Mengen exprimiert wird.
10. Ein Verfahren zum Screenen auf eine Substanz, die zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Nierenerkrankung, Knochenerkrankung, Gelenkerkrankung, Lungenerkrankung, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzerkrankung, Diabetes, Fettsucht, Erkrankung eines Verdauungsorgans oder Infektionskrankheit Anwendung findet, die aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels entsteht, das das Bestimmen der sich daraus ergebenden Wirksamkeit der Untersuchungssubstanzen zum Verbessern des Krankheitszustands bei der aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels entstehenden Krankheit an einer transgenen Ratte gemäß einem aus vorstehend 1 bis 4, die mit der Untersuchungssubstanz behandelt wurde oder an einer daraus stammenden Zelle umfaßt.
11. Ein Screeningverfahren aus vorstehend 10, wobei die aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels entstehende Krankheit eine Nierenerkrankung oder eine Knochenerkrankung ist.
12. Verwendung einer transgenen Ratte gemäß einem aus vorstehend 1 bis 4 oder einer daraus stammenden Zelle zum Screenen auf eine Substanz, die zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Nierenerkrankung, Knochenerkrankung, Gelenkerkrankung, Lungenerkrankung, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzerkrankung, Diabetes, Fettsucht, Erkrankung eines Verdauungsorgans oder Infektionskrankheit Anwendung findet, die aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels entsteht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein schematisches Diagramm, das den Aufbau des Plasmids pMLV-LTR-Vitamin-D₃-24-hydroxylase zeigt.
2 zeigt Southern-Blots (jede Probe: 10 μg; Alkaliblotten) einer transgenen Ratte unter Verwenden Digoxigenin-markierter Riboprobe mit 600 bp. In 2 stellt Bahn 1 den Marker (λ/HindIII+ϕx174/HaeIII) dar, Bahn 2 stellt eine nega tive Kontrolle dar, Bahn 3 stellt R12123-6(+) dar, Bahn 4 stellt R12121-7(+) dar, Bahn 5 stellt R10175-9(?) dar, Bahn 6 stellt R11293-5(+) dar und Bahn 7 stellt R11293-9(+) dar.
3 zeigt die Southern-Blots der transgenen Ratte unter Verwenden einer zufallsverteilten Primer-markierten XbaI-KpnI-Fragmentsonde mit 940 bp. In 3 stellt Bahn 1 den Marker (MLV-24-Hydroxylase/ClaI) dar und Bahn 2 stellt R9121-7/ClaI dar.
4 zeigt ein schematisches Diagramm, das die Konstruktion des Plasmids pOsteocalcin-Vitamin-D₃-24-hydroxylase darstellt.
5 zeigt ein Dendrogramm der transgenen Ratte R12121-7.
6 zeigt ein abnormales Einzeltier (15 Tage alte Ratte) unter den Ratten, die das eingeführte MLV-LTR-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen tragen.
7 ist ein Diagramm, das den zeitlichen Verlauf des Körpergewichts einer transgenen Ratte, R12121-7F₂ (Homozygote) zeigt.
8 ist ein Diagramm, das den zeitlichen Verlauf des Körpergewichts einer transgenen Ratte, R12121-7F₂ (Heterozygote) zeigt.
9 zeigt das Ergebnis einer Genexpressionsanalyse (RT-PCR; Elektrophorese) der Nachkommen der transgenen Ratte F₂, R12121-7-1.
BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE DER ERFINDUNG
Die transgene Ratte dieser Erfindung kann durch Einführen eines fremden 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens in Zielzellen, zum Beispiel Keimzellen wie etwa unbefruchtete Eizellen, befruchtete Eizellen, Sperma und ihre ursprünglichen Zellen vorzugsweise während des Embryogenesezeitraums bei der Entwicklung einer Ratte (bevorzugter im Stadium einer Einzelzelle oder befruchteten Eizelle und im allgemeinen bis zum Stadium des 8-Zellen-Embryos) durch eine Geneinführungstechnik wie etwa dem Calciumphosphatverfahren, Elektropulsverfahren, Lipofektionsverfahren, Aggregationsverfahren, Mikroinjektionsverfahren, Teilchenkanonenverfahren, DEAE-Dextranverfahren und so weiter hergestellt werden. Weiterhin kann durch eine derartige Geneinführungstechnik das Gen auch in somatische Zellen oder Organ- oder Gewebezellen zur Kultur der Zellen oder Gewebe eingeführt werden. Weiterhin können transgene Ratten dadurch aufgebaut werden, daß diese Zellen dazu veranlaßt werden, durch die an sich bekannte Zellfusionstechnologie mit den besagten Keimzellen fusioniert zu werden.
Weiterhin können Teile der so aufgebauten transgenen Ratte (zum Beispiel Zellen, Gewebe oder Organe, die eine DNA tragen, in die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen inseriert wurde oder Kulturen davon stammender Zellen oder Gewebe und nötigenfalls Subkulturen davon) jeweils ebenfalls „als Teile einer Ratte, die eine DNA trägt, in die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen inseriert wurde" gemäß dieser Erfindung für dieselben Zwecke wie die „Ratte, die eine DNA trägt, in die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen inseriert wurde" gemäß dieser Verwendung verwendet werden.
Diese Erfindung kann auf eine Ratte angewendet werden. Insbesondere Ratten (Wistar-Stamm, SD-Stamm usw.), insbesondere Ratten des Wistar-Stamms, sind die zum Aufbauen der Krankheitsmodelle bevorzugtesten.
Das in die Wirtsratte einzuführende fremde 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen schließt die folgenden ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Das Ratten-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen wurde zuerst durch Ohyama et al. (1989, ProNAS, USA, 86, 8977) isoliert. Als ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 55000 ist dieses Enzym ein Mitochondriencytochrom-P450-Protein und Ohyama et al. waren schließlich beim Isolieren einer komplementären DNA (als cDNA abgekürzt) mit 3,2 kbp durch den Test unter Verwenden eines Anti-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Antikörpers erfolgreich.
Bezüglich der Struktur und Funktion dieses Gens ist bekannt, daß die aminoterminale (allgemein als N-Terminus abgekürzt) Propeptidstruktureinheit des 35-Rests nach der Translation unter Ergeben eines reifen 479-Restproteins ab gespalten wird. Im Hinblick auf die Tatsache, daß das Cystein 462 dieses Proteins mit der 5. Bindungsstelle von Häm koordiniert ist, ist auch gezeigt worden, daß dieses Protein Eigenschaften des P450-Proteins aufweist. Wenn die erhaltene cDNA in COS-Zellen exprimiert wird, wird Vitamin-D₃-24-hydroxylase produziert, wodurch bestätigt wird, daß sie auch funktionell eine cDNA der Vitamin-D₃-24-hydroxylase ist.
Außer der Ratten-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA sind die DNA-Sequenzen humaner Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA (Chen et al., 1993, ProNAS, USA, 90, 4543), Maus-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA (Itoh et al., 1995, Biochemica et Biophysica Acta, 1264, 26), Meerschweichen-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA (Ohyama et al., 1996, J. of Japanese Society of Bone Metabolism, 14, 112) usw. bereits bekannt und die Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA jeder Tierart kann als das besagte, in die Wirtsratte einzuführende, fremde 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen verwendet werden.
Das bevorzugte Fremdgen umfaßt die Substitution, Addition oder Deletion von 1 bis 5 (vorzugsweise 1 oder 2) Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz der 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase als Ergebnis der besagten Basenaddition, -deletion oder -substitution und kann jede Art Mutation sein, vorausgesetzt, daß die Funktion der Ausgangs-25-hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase erhalten bleibt.
Das fremde 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen kann in dieser Erfindung das Gen sein, das von einem Säuger stammt, der zu der Wirtsratte, in die das Gen zur Expression eingeführt wird, allogenetisch oder heterogenetisch ist. Beim Einführen des Gens in die Ratte ist es allgemein bevorzugt, es in Form eines Genkonstrukts (z. B. ein Vektor) zu verwenden, das durch Ligieren des Gens stromabwärts eines Promotors, der die Expression des Gens in Zellen der Ratte bewirken kann, hergestellt werden kann. Genauer kann, wenn das humane 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen eingeführt werden soll, eine angestrebte Ratte, die zur hohen Expression des humanen 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens befähigt ist, durch Mikroinjizieren eines Vektors, der das Gen stromabwärts eines Promotors ligiert umfaßt, der dazu befähigt ist, die Expression des humanen 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens, das von einer ein 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen mit hoher Homologie zu dem huma nen 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen tragenden Ratte stammt, in befruchtete Eier der Wirtsratte (z. B. befruchtete Ratteneier) aufgebaut werden.
Als 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen-Expressionsvektor, der verwendet werden kann, können aus E. coli stammende Plasmide, von B. subtilis stammende Plasmide, von Hefe stammende Plasmide, Bakteriophagen wie etwa λ-Phage, Tierviren wie etwa Retroviren, z. B. Moloney-Leukämievirus, Vacciniaviren und Vaculoviren sein. Darunter sind aus E. coli stammende Plasmide, aus B. subtilis stammende Plasmide und aus Hefe stammende Plasmide bevorzugt und aus E. coli stammende Plasmide sind besonders bevorzugt.
Als Promotor zum Regulieren der Expression des 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens können die aus Viren (Cytomegalovirus, Moloney-Leukämievirus, JC-Virus, Papillomavirus usw.) stammenden Genpromotoren und aus verschiedenen Säugern (Mensch, Kaninchen, Hund, Katze, Meerschweinchen, Hamster, Ratte, Maus usw.) und Vogelarten (Hühner usw.) stammenden Genpromotoren (z. B. Albumin, Endothelin, Osteocalcin, Muskelkreatininkinase, Kollagen Typ I und Typ II, von cyclischem AMP abhängige Proteinkinase-βI-Untereinheit, atrialer natriuretischer Faktor, Dopamin-β-hydroxylase, Neurofilament-leichte-Kette, Metallothionein I und IIA, Gewebeinhibitor von Metalloprotease 1, Glattmuskel-α-Aktin, Polypeptidkettenverlängerungsfaktor 1α (EF-1α), β-Actin, α- und β-Myosin-schwere-Kette, Myosin-leichte-Kette 1 und 2, Myelinbasisches-Protein, Serumamyloid-P-Komponente, Renin usw.) verwendet werden. Vorzugsweise können der Moloney-Leukämieviruspromotor und humane und Hühner-β-Actinpromotor, die systematisch hohe Expressionen sicherstellen, verwendet werden. Zu knochenspezifischen Expressionen bei Menschen, Ratten oder Mäusen sind Promotoren des Osteocalcingens und Östrogenrezeptorgens, von denen bekannt ist, daß sie im Knochen exprimiert werden, wirkungsvoll.
Der vorstehende Vektor enthält vorzugsweise eine Sequenz, die die Transkription der angestrebten Messenger-RNA (polyA, allgemein Terminator genannt) in der transgenen Ratte beendet und die Genexpression kann mittels der Sequenz des aus einer Virus-, einer Säuger- oder einer Vogelart stammenden Gens manipuliert werden. Vorzugsweise kann der SV40-Terminator aus Affenvirus eingesetzt werden. Weiter kann zu einer noch höheren Expression des Zielgens das Spleiß- Signal, die Verstärkerregion und ein Teil des eukaryotischen Introns des Gens in Abhängigkeit von der Zielsetzung stromaufwärts des 5'-Endes der Promotorregion, zwischen der Promotorregion und der Translationsregion oder stromabwärts des 3'-Endes der Translationsregion ligiert werden.
Die Translationsregion für Vitamin-D₃-24-hydroxylase kann durch Verwenden der ganzen oder eines Teils der aus Leber-, Nieren-, Fibroblasten- oder anderen Zellen verschiedener Säuger (Kaninchen, Hund, Katze, Meerschweinchen, Hamster, Ratte, Maus usw.) stammenden DNA oder der ganzen oder eines Teils der aus verschiedenen, im Handel befindlichen genomischen DNA-Bibliotheken stammenden genomischen DNA als Ausgangsmaterial oder durch Verwenden der aus der RNA, die aus den Leber-, Nieren- oder Fibroblastenzellen stammt, durch ein bekanntes Verfahren hergestellten komplementären DNA erhalten werden. Was das fremde 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen betrifft, kann die aus der RNA von Fibroblastenzellen eines Patienten durch ein bekanntes Verfahren hergestellte komplementäre DNA ebenfalls als Ausgangsmaterial verwendet werden. Weiterhin kann durch Verwenden der Translationsregion einer aus den besagten Zellen oder Geweben erhaltenen Vitamin-D₃-24-hydroxylase auch eine mutierte Translationsregion durch zum Beispiel die Punktmutationstechnik aufgebaut werden. Jedes dieser Materialien kann zur Herstellung transgener Tiere verwendet werden.
Jede vorstehende Translationsregion kann in Form eines Genkonstrukts (z. B. Vektor) ligiert werden, das in einem Wirtstier durch herkömmliche Gentechnik exprimiert werden kann, die sein Ligieren stromabwärts des Promotors (vorzugsweise stromaufwärts der Transkriptionsstopstelle) unter Liefern einer DNA umfaßt, in die das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen inseriert ist.
Die Einführung des 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens auf der Stufe befruchteter Eizellen stellt sicher, daß das Gen in allen Keimzellen und somatischen Zellen des Wirtstiers verteilt wird. Das Vorhandensein des 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens in den Keimzellen der transgenen Ratte bedeutet, daß das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen in allen Keimzellen und somatischen Zellen der gesamten Nachkommenschaft des transgenen Tiers vorhanden ist. Die Nachkommen derartiger Ratten, auf die das Gen weitergege ben wurde, enthalten das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen in allen ihren Keimzellen und somatischen Zellen.
Durch den Erhalt von Homozygoten, die das in beide homologe Chromosomen eingeführte Gen tragen, das Paaren männlicher und weiblicher Einzeltiere und Bestätigen, daß die gesamte Nachkommenschaft das Gen stabil erhält und dasselbe Gen im Überschuß beherbergt, können die Ratten von Generation zu Generation in der üblichen Zuchtumgebung gezüchtet werden.
Das befruchtete Ei zur Verwendung bei der Einführung eines fremden 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens, eines von einem endogenen Gen einer Wirtsratte verschiedenen Gens (vorzugsweise ein Gen ohne ein Intron), in das befruchtete Ei der Wirtsratte, vorzugsweise einer Wistar-Ratte oder ihres Vorgängers kann durch Paaren einer männlichen Ratte, vorzugsweise einer männlichen Wistar-Ratte mit einer weiblichen Ratte, vorzugsweise einer weiblichen Wistar-Ratte erhalten werden.
Das befruchtete Ei kann aus einer natürlichen Kreuzung erhalten werden, wird aber vorzugsweise durch ein Verfahren erhalten, das das künstliche Einstellen des Sexualzyklus einer weiblichen Ratte, vorzugsweise einer weiblichen Wistar-Ratte und ihr Paaren mit einer männlichen Ratte, vorzugsweise einer männlichen Wistar-Ratte umfaßt. Das bevorzugte Verfahren zum künstlichen Modifizieren des Sexualzyklus einer weiblichen Ratte umfaßt die Gabe eines follikelstimulierenden Hormons (Serumgonadotropin trächtiger Stuten, allgemein als PMSG abgekürzt) und anschließend eines Luteinisierungshormons (humanes Choriongonadotropin, allgemein hCG abgekürzt) zum Beispiel durch intraperitoneale Injektion. Die bevorzugte Hormondosis und der Dosierungsabstand schwanken mit unterschiedlichen Arten von Ratten. Wenn eine Wistar-Ratte verwendet wird, ist ein 8 Wochen altes oder älteres Tier bevorzugt, das etwa 1 Woche bei einem Lichtzyklus von etwa 12 Stunden (z. B. AN von 7:00 bis 19:00) gehalten wurde. Bei einer weiblichen Ratte (vorzugsweise einer weiblichen Wistar-Ratte) umfaßt das bevorzugte Verfahren zum Ernten befruchteter Eier im allgemeinen zuerst die Gabe eines follikelstimulierenden Hormons und nach etwa 48 Stunden eines Luteinisierungshormons und Paaren der Ratte mit einer männlichen Ratte. Die Dosis des follikelstimulierenden Hormons kann etwa 20 bis etwa 50 IE/Tier, vorzugsweise etwa 30 IE/Tier sein und die Dosierung des Luteinisierungshormons kann etwa 0 bis etwa 10 IE/Tier, vorzugsweise etwa 5 IE/Tier sein.
Durch Einführen eines fremden 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens in die geernteten befruchteten Eier gemäß dem vorstehenden Verfahren und anschließendes künstliches Transplantieren und Implantieren des befruchteten Eis in eine weibliche Ratte, wird eine Ratte erhalten, die eine DNA trägt, in die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen inseriert wurde.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren umfaßt die Gabe eines Luteinisierungshormon-freisetzenden Hormons (allgemein als LHRH abgekürzt) oder eines Analogons davon an eine weibliche Ratte, ihr Paaren mit einer männlichen Ratte und das künstliche Implantieren der geernteten befruchteten Eier in die sich daraus ergebende, scheinträchtige weibliche Ratte, bei der Fertilität induziert wurde.
Die Dosierung von LHRH oder einem Analogon davon und der Zeitpunkt, an dem die so mit dem Hormon behandelte weibliche Ratte mit einem männlichen Partner gepaart wird, schwanken mit unterschiedlichen Arten von Ratten. Bei einer weiblichen Ratte (vorzugsweise weiblichen Wistar-Ratte) ist es im allgemeinen vorteilhaft, die Ratte mit einem männlichen Partner an Tag 4 oder so ungefähr auf die Verabfolgung von LHRH oder einem Analogon davon (z. B. [3,5-Dil-Tyr₅]-LH-RH, [Gln₈]-LH-RH, [D-Ala₆]-LH-RH, [des-Gly₁₀]-LH-RH, [D-His(Bzl)₆]-LH-RH und ihre Ethylamide usw.) folgend zu paaren. Die Dosis von LHRH oder einem Analogon davon ist im allgemeinen etwa 10 bis 60 μg/Tier, vorzugsweise etwa 40 μ/Tier.
Es ist ferner bevorzugt, das vorstehende Verfahren zu verwenden, das das künstliche Regulieren des Sexualzyklus einer weiblichen Ratte und Ernten befruchteter Eier in Kombination mit dem vorstehenden Verfahren umfaßt, das das künstliche Implantieren der geernteten, befruchteten Eier in eine scheinträchtige weibliche Ratte mit induzierter Fertilität umfaßt.
Die Ratte dieser Erfindung, in die das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen inseriert ist, zeigt eine hohe Expression des 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens und da die Funktion des intrinsischen 25-Hydroxyvitamin-D₃- 24-hydroxylase-Gens erhöht ist, ist das Tier für das Entwickeln von Hyperkalzämie, Hyperparathyroidismus, Knochenkrankheiten wie etwa Rachitis, Osteomalazie, Osteoporose, Dysostonie usw., Nierenkrankheiten wie etwa Glomerulonephritis, chronische Nephritis, Niereninsuffizienz usw., Geradgelenkerkrankungen, Lungenkrankheiten, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergische Krankheit, endokrine Krankheit, Demenz und/oder Krebs anfällig und kann als Tiermodell für diese Krankheiten verwendet werden. Es ist zum Beispiel durch Verwenden der Ratte dieser Erfindung möglich, den Mechanismus der Pathogenese bei Hyperkalzämie, Hyperparathyroidismus, Knochenkrankheiten wie etwa Rachitis, Osteomalazie, Osteoporose, Dysostonie usw., Nierenkrankheiten wie etwa Glomerulonephritis, chronische Nephritis, Niereninsuffizienz usw., Geradgelenkerkrankung, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergischer Krankheit, endokriner Krankheit, Demenz und Krebs zu entschlüsseln, Prophylaxe- und/oder Behandlungsmodalitäten für diese Krankheiten zu erforschen und Durchmusterungen auf Kandidatenverbindungen zur Verwendung bei der Entwicklung von Wirkstoffen zur Prophylaxe und Behandlung dieser Krankheiten auszuführen.
Die transgene Ratte dieser Erfindung stellt ein Modell bereit, das beim Durchmustern nach Wirkstoffen zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Nierenkrankheit, einer Knochenkrankheit, einer Gelenkkrankheit, einer Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, einer Krankheit eines Verdauungsorgans, einer Infektionskrankheit, einer allergischen Krankheit, einer endokrinen Krankheit, Demenz oder Krebs verwendet werden kann. Da die transgene Ratte dieser Erfindung insbesondere eine Störung der Nierenfunktion aufweist, kann sie als Modell für Durchmusterungen nach Wirkstoffen zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen der Nieren verwendet werden. Da die transgene Ratte dieser Erfindung weiterhin Symptome eines Knochenmasseverlusts zeigt, kann sie als Modell zum Durchmustern nach Wirkstoffen, die Osteoporose verhindern und/oder behandeln, wie etwa Vitamin-D₃-Zubereitungen verwendet werden.
Die herkömmlichen Modelle für Knochenkrankheiten (Ratten, Mäuse usw.) wei sen die folgenden Nachteile bezüglich des Artenunterschieds auf. Die transgene Ratte dieser Erfindung ist frei von diesen Nachteilen und ist, wenn doch nur unter diesem Gesichtspunkt, ein brauchbares Tier.

(1) Die altersabhängige Änderung der Knochenmasse von Ratten weist einen Höchstwert auf, geradeso wie es beim Menschen der Fall ist.
(2) Bei Ratten ist die altersabhängige Änderung der Knochenzusammensetzung gut untersucht worden.
(3) Bei alkalischer Phosphatase und weinsäureresistenter saurer Phosphatase (allgemein als TRAP abgekürzt), die biochemische Marker der Osteogenese und Knochenresorption sind, werden bedeutsame Unterschiede häufiger bei Ratten als bei Mäusen beobachtet. Weiterhin kann die Knochenmorphologie wie etwa Osteometrik leichter bei Ratten als bei Mäusen beobachtet werden.
(4) Bei der Grundlagenforschung zu Knochenkrankheiten und dem Durchmustern zur Entwicklung therapeutischer Wirkstoffe wurden in der Mehrheit der Fälle eher Ratten als Mäuse verwendet.

Weiterhin ist die transgene Ratte dieser Erfindung unter den folgenden Gesichtspunkten ein überlegenes Modell für eine Nierenkrankheit.

(1) Nephrektomierte Mäuse und Ratten werden häufig als Modelle einer beeinträchtigten Nierenfunktion verwendet, da aber diese Modelle den Nierenkrankheitszustand keinesfalls zuverlässig widerspiegeln, finden sie nur beim Durchmustern zur Entwicklung und Bewertung eingeschränkter Arten therapeutischer Wirkstoffe Verwendung. Im Gegensatz dazu durchläuft die transgene Ratte dieser Erfindung einen zeitlichen Verlauf der Morbidität, der dem eines Menschen mit einer Nierenerkrankung ähnlich ist.
(2) Bei der transgenen Ratte dieser Erfindung wird Proteinurie in der Jugend festgestellt und der Proteinspiegel neigt dazu, mit dem Altern zuzunehmen. Er spiegelt den Krankheitszustand bei Nierenstörungen und auch die Beziehung zu biochemischen Markern wider.
(3) Die transgene Ratte dieser Erfindung ist der normalen Ratte im Muster der Körpergewichtszunahme und bei der Fertilität ähnlich und ist leicht zu verwenden.
(4) Es gibt kein Modell für Glomerulonephritis oder IgA-Nephropathie, aber das pathologische Bild der transgenen Ratte dieser Erfindung ähnelt dem Krankheitszustand derartiger Störungen.
(5) Die herkömmliche hyperlipidämsche Modellratte der SHC-Linie und die Obesitasmodellratte der Wistar-Fatty-Linie zeigen ebenfalls eine schwere Proteinurie und sterben im Alter von etwa 25 bis 30 Wochen. Die transgene Ratte dieser Erfindung kann jedoch als Model einer schweren Nierenerkrankung verwendet werden und kann bis ins Alter überleben.
(6) Die transgene Ratte dieser Erfindung entwickelt in der Jugend Nierenstörungen und zeigt ein Fortschreiten des Krankheitszustands mit Osteoporoseähnlichen Symptomen. Sie ist daher als Modell für einen Patienten mit einer Erkrankung sowohl der Nieren als auch Knochen äußerst nützlich.

Die Ratte dieser Erfindung oder ein Teil davon, der DNA trägt, in die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen inseriert ist, ist auch als Versuchsmodell zum Durchmustern auf Substanzen (Wirkstoffe) nützlich, die zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten verwendet werden können, die sich aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels ergeben, das das Anwenden einer Untersuchungssubstanz (Wirkstoff) darauf und Bestimmen der sich daraus ergebenden, den Krankheitszustand verbessernden Wirksamkeit des Wirkstoffs bei der Erkrankung, die sich aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels ergibt, umfaßt. Die vorstehend angeführte „Erkrankung, die sich aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels ergibt" schließt zum Beispiel eine Nierenkrankheit, eine Knochenkrankheit, eine Gelenkkrankheit, eine Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, eine Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, eine Krankheit eines Verdauungsorgans, eine Infektionskrankheit, eine allergische Krankheit, eine endokrine Krankheit, Demenz und Krebs (vorzugsweise Nierenkrankheit und Knochenkrankheit) ein.
Die vorstehend angeführte Untersuchungssubstanz schließt sowohl bekannte synthetische Verbindungen, Peptide und Proteine, als auch Gewebeextrakte, Zellkulturüberstände oder dergleichen aus warmblütigen Säugern (z. B. Maus, Ratte, Schwein, Rind, Schaf, Affe und Mensch) ein. Zum Beispiel kann durch Verabfolgen aus den Gewebeextrakten, Zellkulturüberständen und Reinigungsprodukten davon an die transgene Ratte dieser Erfindung oder Zufügen oder deren auf andere Weise In-Kontakt-bringen mit einem Teil der Ratte (z. B. Zellen, ein Gewebe oder ein Organ) und Bestimmen der zustandsverbessernden Wirksamkeit bei einer Krankheit wie etwa Nierenkrankheit, Knochenkrankheit, Gelenkkrankheit, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergische Krankheit, endokrine Krankheit, Demenz oder Krebs ein Durchmustern von Kandidaten (z. B. Peptide, Proteine, Nicht-Peptid-Verbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte usw.) nach Wirkstoffen zur Prophylaxe und/oder Behandlung durchgeführt werden. Weiterhin findet jede durch das Durchmusterungsverfahren dieser Erfindung als bei einer Nierenkrankheit, Knochenkrankheit, Gelenkkrankheit, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergischen Krankheit, endokrinen Krankheit, Demenz oder Krebs als wirksam bestimmte Substanz (z. B. ein 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Inhibitor) zur Prophylaxe und Behandlung einer Nierenkrankheit, Knochenkrankheit, Gelenkkrankheit, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit der Verdauungsorgane, Infektionskrankheit, allergischen Krankheit, endokrinen Krankheit, Demenz oder Krebs Anwendung. So können durch Verarbeiten der Substanz gemäß eingeführten pharmazeutischen Verfahren medizinische Zubereitungen zur Prophylaxe und Behandlung einer Nierenkrankheit, Knochenkrankheit, Gelenkkrankheit, Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit der Verdauungsorgane, Infektionskrankheit, allergischen Krankheit, endokrinen Krankheit, Demenz oder Krebs bereitgestellt werden.
Wo überall in dieser Beschreibung Basen und Aminosäuren durch Abkürzungen wiedergegeben werden, werden die von der IUPAC-Kommission für biochemische Nomenklatur festgesetzten oder in der Technik in allgemeinem Gebrauch befindlichen verwendet. Das Folgende ist eine teilweise Liste derartiger Abkürzungen.

DNA:: Desoxyribonukleinsäure
RNA:: Ribonukleinsäure
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin

Die SEQ ID Nr. gemäß der Sequenzliste in dieser Beschreibung bezeichnen die folgenden Sequenzen.
SEQ ID Nr. 1 bezeichnet die Nukleotidsequenz eines der für die in Beispiel 2 ausgeführte PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendeten Primer.
SEQ ID Nr. 2 bezeichnet die Nukleotidsequenz des anderen für die in Beispiel 2 ausgeführte PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendeten Primers.
SEQ ID Nr. 3 bezeichnet die Nukleotidsequenz eines der für die in Beispiel 3 ausgeführte PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendeten Primer.
SEQ ID Nr. 4 bezeichnet die Nukleotidsequenz des anderen für die in Beispiel 3 ausgeführte PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendeten Primers.
SEQ ID Nr. 5 bezeichnet die Nukleotidsequenz eines der für die in Beispiel 4 ausgeführte PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendeten Primer.
SEQ ID Nr. 6 bezeichnet die Nukleotidsequenz des anderen für die in Beispiel 4 ausgeführte PCR (Polymerasekettenreaktion) verwendeten Primers.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen diese Erfindung bloß genauer und sollten keinesfalls als den Umfang der Erfindung definierend aufgefaßt werden.
Beispiel 1
1) Konstruktion des Plasmids pMLV-LTR-Vitamin-D₃-24-hydroxylase, das ein 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen stromabwärts der Genregulationsregion des Moloney-Leukämievirus trägt.
Als Moloney-Leukämieviruspromotor (MLV-LTR) wurde das aus dem Plasmid pYJ1 abgeleitete Plasmid pIRA01 verwendet, das von Goff et al. (1980, Cell, 22, 777) beschrieben wird. Als Terminator (SV40) wurde die in dem besagten, von dem Plasmid pIRA01 abgeleiteten Plasmid pcVD1 enthaltene, durch Okayama et al. (1983, Mol. Cell. Biol., 3, 280) und Okayama et al. (1982, Mol. Cell. Biol., 2, 161) beschriebene Terminatorsequenz verwendet. Der Vektor zur Expression der Ratten-25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA wurde wie folgt aufgebaut. Die durch Ohyama et al. (1991, FEBS Lett., 278, 195) beschriebene pUC19-24-Hydroxylase (von Professor Tatsuo Suda, zahnmedizinische Fakultät der Universität Showa, und Privatdozent Yoshihiko Ohyama, physikalische Fakultät der Universität Hiroshima bereitgestellt) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und ScaI unter Ergeben eines Fragments mit 3,2 kbp, das eine Ratten-25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA enthielt, verdaut. Dieses Fragment wurde mit PmacI weiter gespalten und 100 ng dieses von pUC19-24-Hydrolyse abgeleiteten EcoRI-PmacI-Fragments (2,1 kbp) wurden zum Dephosphorylieren des 5'-Endes mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo) aus Kälberdünndarm behandelt. Anschließend wurde die in LacZ des handelüblichen pBluescript II KS(+) inserierte Multiklonierungsstelle mit den Restriktionsenzymen SmaI und EcoRI unter Ergeben eines von pBluescript II KS(+) abgeleiteten SmaI-EcoRI-Fragments (2,9 kbp) verdaut. Das von pUC19-24-Hydroxylase abgeleitete EcoRI-PmacI-Fragment (2,1 kbp) und das auf diese Weise von pBluescript II KS(+) abgeleitete SmaI-EcoRI-Fragments (2,9 kbp) wurden mittels des Takara Ligation Kits (Takara Shuzo) 60 Minuten bei 16°C ligiert und unter Verwenden dieses Reaktionsgemisches wurde Escherichia coli JM109 (Nippon Gene) unter Ergeben eines ampicillinresistenten Stamms transformiert. Aus dieser Transformanten (Escherichia coli JM109/pBluescript II KS(+)-24-Hydroxylase) wurde die Plasmid-DNA isoliert und mit Restriktionsenzymen verdaut, um zu bestätigen, daß das EcoRI-PmacI-Fragment aus pUC19-24-Hydroxylase in Sense-Richtung innerhalb des von pBluescript II KS(+) abgeleiteten SmaI-EcoRI-Fragments ligiert worden war. Auf diese Weise wurde ein Plasmid, pBluescript II KS(+)-24-Hydroxylase (5,0 kbp), erhalten. Als dieses Genkonstrukt durch Mehrfachverdauung mit Restriktionsenzymen analysiert wurde, enthielt es keine nachweisbare Transposition.
Anschließend wurde pBluescript II KS(+)-24-Hydroxylase mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI unter Ergeben eines EcoRI-BamHI-Fragments verdaut, das die Ratten-25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA enthielt. Zum anderen wurde der MLV-LTR enthaltende Vektor pIRA01 mit EcoRI und BglII unter Ergeben eines MLV-LTR enthaltenden EcoRI-BglII-Fragments verdaut. Anschließend wurde das vorstehende, die (von pUC19-24-Hydroxylase abgeleitete) Ratten-25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA enthaltende EcoRI-BamHI-Fragment mit dem vorstehenden MLV-LTR enthaltenden EcoRI-BglII-Fragment mittels des Takara Ligation Kits (Takara Shuzo) 60 Minuten bei 16°C ligiert und unter Verwenden dieses Reaktionsgemisches wurde Escherichia coli JM109 (Nippon Gene) unter Ergeben eines ampicillinresistenten Stamms transformiert. Aus dieser Transformanten (Escherichia coli JM109/pMLV-LTR-Vitamin-D₃-24-hydroxylase) wurde die Plasmid-DNA isoliert und mit Restriktionsenzymen verdaut, um zu bestätigen, daß das EcoRI-BamHI-Fragment aus pBluescript II KS(+)-24-Hydroxylase in der Sense-Richtung innerhalb des EcoRI-BglII-Fragments von pI-RA01 ligiert worden war. Auf diese Weise wurde ein Plasmid pMLV-LTR-Vitamin-D₃-24-hydroxylase (6,2 kbp) erhalten. Als dieses Genkonstrukt durch Mehrfachverdauung mit Restriktionsenzymen analysiert wurde, enthielt es keine nachweisbare Transposition. Ein dieses Plasmid zeigendes schematisches Diagramm wird in 1 dargestellt.
2) Aufbau einer transgenen Ratte, die ein Fusionsgenprodukt trägt, das das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen stromabwärts der Genregulationsregion des Moloney-Leukämievirus trägt.
Weibliche Ratten zur Sammlung von Eiern wurden mit einem Alter von 8 Wochen erworben und eine Woche unter Anwenden eines 12-Stunden-Lichtzyklus von 7:00 bis 19:00 akklimatisiert. Als die Ratten ein Alter von 9 Wochen erreicht hatten, wurde follikelstimulierendes Hormon (Serumgonadotropin aus trächtigen Stuten) (30 IE/Tier) intraperitoneal an Tag 1 um 11:00 verabreicht und die behandelten Tiere wurden weiter unter denselben Bedingungen wie vorstehend gehalten. An Tag 3 wurde um 17:00 Luteinisierungshormon (humanes Choriogonadotropin) (5 IE/Tier) intraperitoneal verabfolgt und die Tiere wurden der Kohabitation mit 10 Wochen alten oder älteren männlichen Wistar-Ratten zur Paarung auf 1:1-Grundlage unterzogen. An Tag 4 wurden die weiblichen Ratten um 9:00 auf einen Vaginaverschluß untersucht und beginnend um 13:30 wurden die Tiere, bei denen ein Vaginaverschluß bestätigt worden war, getötet und die Eier wurden geerntet. Als befruchtete Eier wurden Eier des pronukleären Stadiums selektiv verwendet. Um 14:30 wurde das vorstehend angeführte Plasmid pMLV-LTR-Vitamin-D₃-24-hydroxylase mit ClaI gespalten und auf eine Konzentration von 10 μg bis 100 μg/ml eingestellt und ein Teil von 1 bis 2 μl wurde in den männlichen Pronukleus des Wistar-Ratteneis im Einzellenstadium unter Mikro skopüberwachung mikroinjiziert. Die Eier wurden in HER-Medium kultiviert und die 2-Zellenembryos wurden an Tag 5 um 13:30 bestätigt. Anschließend wurden die Embryonen gemäß der von Wagner et al. (1981, ProNAS, USA, 78, 5016) beschriebenen Vorschrift in den Eileiter scheinträchtiger weiblicher Wistar-Ratten zur Implantation transplantiert.
Die scheinträchtigen weiblichen Wistar-Ratten (11 Wochen alte und ältere Ratten) wurde subkutan mit Luteinisierungshormon-freisetzendes Hormon oder einem Analogon davon (40 μg/Tier) an Tag 0 um 13:00 behandelt und sie wurden mit vasoligierten, 12 Wochen alten oder älteren männlichen Ratten des Zuckerlean- oder Wistar-Stamms auf 1:1-Grundlage an Tag 4 um 17:00 gepaart. An Tag 5 um 9:00 wurde von den weiblichen Ratten bestätigt, daß sie einen Vaginaverschluß aufwiesen und sie wurden für den vorstehenden Zweck verwendet.
Beispiel 2
Genanalyse transgener 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-Hydroxylase-Ratten Die Genanalyse wurde durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren unter Verwenden aus dem Schwanz der 3 Wochen alten Jungratte geernteter DNA ausgeführt. Auf diese Weise wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwenden des Primers 1 (5'-AGGCTGTGCTGCTAATGTCAA-3' : SEQ ID Nr. 1), der ein in der Ratten-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA enthaltenes 21mer ist und Primer 2 (5'-AAGAGTGGGGGTCAGAGTTCG-3' : SEQ ID Nr. 2), der ein 21mer in der Ratten-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA ist, durchgeführt. Unter Verwenden von 1 μl der 50fach mit sterilem Wasser verdünnten Schwanz-DNA-Zubereitung als Substrat wurde eine PCR in 1 Zyklus von 94°C, 3 min und 25 Zyklen von 94°C über 30 sec, 65°C über 1 min und 72°C über 1 min durchgeführt und das Reaktionsprodukt wurde durch 1,0% GTG Agarosegel (FMC BioProducts) der Elektrophorese unterzogen und die Ratten, die eine 783-bp-DNA-Bande ergaben, wurden ausgewählt. Die Analyse von insgesamt 141 jungen Ratten zeigte sechs PCR-positive Einzeltiere, wovon eines ein totes Tier war.
Bei den 5 PCR-positiven Tieren wurde weiter eine Southern-Hybridisierungsanalyse unter Verwenden der Schwanz-DNA-Zubereitungen mit (1) einer Digoxigenin-markierten DNA-Sonde mit 600 bp, die die Ratten-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gensequenz (durch das Riboprobe-Verfahren markiert) oder (2) der durch Markieren des XbaI/KpnI-Fragments mit 940 by der Ratten-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA mit ³²P-dCTP durch das Random-Primerverfahren hergestellten Sonde durchgeführt. In jedem Fall wurde die Schwanz-DNA mit PstI/BamHI verdaut und das sich daraus ergebende Fragment wurde mit ³²P markiert und als Sonde verwendet. Die DNA zur Analyse wurde aus einem etwa 1 cm langen Schwanzstreifen gemäß dem durch Horgan et al. (1986, Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory)) beschriebenen Verfahren extrahiert. Das erhaltene Nukleinsäurepellet wurde einmal in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 200 μl 10 mM Tris (pH 8,0)-1 mM EDTA erneut suspendiert. Weiterhin wurden jeweils 10 μl der DNA aus den 5 PCR-positiven und falsch-positiven Tieren gründlich mit den Restriktionsenzymen XhoI und ClaI verdaut, der Elektrophorese durch 1,0% GTG Agarosegel unterzogen und durch das durch Southern (1975, Journal of Molecular Biology, 98, 503) beschriebene Verfahren auf ein Nylonfilter verbracht. Als Riboprobe verwendet wurde, wurde eine Hybridisierung über Nacht durch Verwenden dieses Filters als Sonde durchgeführt und das Reaktionsprodukt wurde zweimal mit 2 × SSC-0,1% SDS bei Raumtemperatur und anschließend zweimal mit 0,1 SSC-0,1% SDS bei 68°C gewaschen. Als Ergebnis der Southern-Hybridisierung ergaben 4 der 5 getesteten Proben ein Signal bei 1,8 kbp, was anzeigt, daß die entsprechenden vier Ratten das eingeführte Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen trugen.
Als andererseits die durch das Random-Primerverfahren markierte Sonde verwendet wurde, wurden jeweils 10 μg der aus dem Schwanz hergestellten DNA mit dem Restriktionsenzym NsiI oder ClaI gründlich verdaut, der Elektrophorese durch 1,0% GTG Agarosegel unterzogen und auf dieselbe Weise wie vorstehend auf ein Nylonfilter aufgebracht. Das Filter wurde mit einer Vorhybridisierungslösung, die mit 4 × SSC-50% Formamid-5x Denhart-Lösung-50 μg/ml Lachssperma-DNA und 0,2% SDS ergänzt war, 2 Stunden bei 65°C behandelt und anschließend mit derselben, mit der Sonde ergänzten Lösung über Nacht hybridisiert. Das hybridisierte Filter wurde mit 1 × SSC-0,1% SDS-Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur insgesamt 4 Mal gewaschen und anschließend mit 0,1 × SSC-0,1% SDS-Lösung insgesamt 4 Mal 15 Minuten bei 68°C gewaschen. Als Ergebnis dieser Southern-Hybridisierung zeigte eine der 5 getesteten Proben ein Signal bei 3,0 kbp, was anzeigt, daß eine der Ratten das eingeführte Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen trug.
Als Ergebnis der vorstehenden Southern-Analyse wurde bei insgesamt 5 Tieren gefunden, daß sie das eingeführte 25 Hydroxy-Vitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen trugen. Die Tiernummern dieser 5 transgenen Tiere waren R9121-7 (männlich), R12123-6 (weiblich), R12121-7 (weiblich), R11293-5 (weiblich) und R11293-9 (weiblich). Bei R10175-9 (männlich) wurde die Einführung des Gens nur durch PCR bestätigt (Tabelle 1 und 2 und 3).
Beispiel 3
1) Klonieren des Ratten-Osteocalcingenpromotors
Als Ratten-Chromosomengenregulationssystem wurde der Ratten-Osteocalcingenpromotor durch das PCR-Verfahren mittels des Primers 3 (5'-TGAGGACATTACTGACCGCTCCTT-3' : SEQ ID Nr. 3), der ein 24mer in der genomischen Ratten-Osteocalcin-DNA ist und Primers 4 (5'-AGTTGCTGTGTGGGACTTGTCTGT-3' : SEQ ID Nr. 4), der ein 24mer in der genomischen Ratten-Osteocalcin-DNA ist, unter Bezug auf die durch Lian et al. (1989, ProNAS, USA, 86, 1143) mitgeteilten Nukleotidsequenzdaten hergestellt. Das so erhaltene Fragment wurde mittels des TA-Cloning Kits kloniert. Die Nukleotidsequenz wurde auf Routineweise mittels ABIs DNA-Sequenziergerät bestätigt.
2) Konstruktion von pOsteocalcin-Vitamin-D₃-24-hydroxylase, wobei das Plasmid das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen stromabwärts der Ratten-Chromosomengenregulationsregion aufwies.
Als Terminator (SV40) wurde die Terminatorsequenz verwendet, die in dem durch Okayama et al. (Mol. Cell. Biol., 3, 280) und Okayama et al. (1982, Mol. Cell. Biol. 2, 161) beschriebenen, von Plasmid pcVD1 abgeleiteten pIRA01 enthalten war.
Das in die Regulationsregion des Ratten-Osteocalcingens inserierte Plasmid pPCRII-Osteocalcinpromotor wurde mit HindIII und XbaI unter Ergeben eines Fragments mit 600 bp verdaut. Zum anderen wurde pUC118 mit HindIII und XbaI verdaut und diese Fragmente wurden mittels des Takara Ligation Kits (Takara Shuzo) 60 Minuten bei 16°C ligiert. Unter Verwenden dieses Reaktionsgemischs wurde Escherichia coli JM109 (Nippon Gene) unter Ergeben eines ampicillinresistenten Stamms transformiert. Aus dieser Transformanten (Escherichia coli M109/pUC118-Osteocalcinpromotor) wurde die Plasmid-DNA isoliert und der Restriktionsenzymspaltung unterzogen, um zu bestätigen, daß ein Fragment mit 600 bp mit pUC118 verknüpft worden war. Auf diese Weise wurde ein Plasmid pUC118-Osteocalcinpromotor (3,8 kbp) erhalten. Dieser Promotor wurde anschließend mit den Restriktionsenzymen ScaI und XhoI verdaut und das ScaI-XhoI-Fragment mit 2,0 kbp wurde isoliert.
Das in Beispiel 1 erhaltene Plasmid pMLV-LTR-Vitamin-D₃-24-hydroxylase (6,2 kbp) wurde mit ClaI gespalten und es wurde ein Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA enthaltendes Fragment mit 3,2 kbp isoliert. pUC119 wurde mit AccI gespalten und das sich daraus ergebende Fragment wurde mit dem vorstehenden Vitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA enthaltenden Fragment mit 3,2 kbp mittels de Takara Ligation Kits (Takara Shuzo) 60 Minuten bei 16°C ligiert. Unter Verwenden dieses Reaktionsgemisches wurde E. coli JM109 (Nippon Gene) unter Ergeben eines ampicillinresistenten Stamms transformiert. Aus dieser Transformanten (Escherichia coli JM109/pUC119-MLV-24-hydroxylase) wurde die Plasmid-DNA isoliert und der Restriktionsenzymspaltung unterzogen, um zu bestätigen, das ein Fragment mit 1500 bp mit pUC119 ligiert worden war. Auf diese Weise wurde ein Plasmid pUC119-MLV-24-hydroxylase (6,2 kbp) erhalten.
Dieses wurde mit ScaI und XhoI weiterverdaut und das auf diese Weise erhalten ScaI-XhoI-Fragment mit 3,8 kbp wurde mittels des Takara Ligation Kits (Takara Shuzo) 60 Minuten bei 16°C mit dem vorstehend angeführten ScaI-XhoI-Fragment mit 2,0 kbp ligiert. Unter Verwenden dieses Reaktionsgemisches wurde Escherichia coli JM109 (Nippon Gene) unter Ergeben eines ampicillinresistenten Stamms transformiert. Aus dieser Transformanten (Escherichia coli JM109/pUC-Osteocalcin-Vitamin-D₃-24-hydroxylase) wurde die Plasmid-DNA isoliert und der Restriktionsenzymspaltung unterzogen, um zu bestätigen, das ein Fragment mit 1500 bp in Sense-Richtung mit pUC119 ligiert worden war. Auf diese Weise wurde ein Plasmid pUC-Osteocalcin-Vitamin-D₃-24-hydroxylase (5,8 kbp) erhalten (4).
Beispiel 4
1) Aufbau transgener Ratten, die ein Fusionsgenprodukt mit dem 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen stromabwärts der Genregulationsregion des Rattenchromosoms tragen
Der das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen stromabwärts des Osteocalcinpromotors enthaltende Genexpressionsvektor wurde in 78 befruchtete Wistar/crj-Ratteneier mikroinjiziert, die anschließend in 5 scheinträchtige Ratten überführt wurden. Als Ergebnis wurden 17 Neugeborene erhalten, aber es gab kein Anzeichen einer Geneinführung.
Das vorstehende Plasmid pUC-Osteocalcin-Vitamin-D₃-24-hydroxylase wurde mit HindIII und ScaI verdaut und auf eine Konzentration von 10 μg bis 100 μg/ml eingestellt und ein Anteil von 1 bis 2 μl wurde in den männlichen Vorkern eines befruchteten Wistar-Ratteneis im Einzellenstadium mikroinjiziert. Die mikroinjizierten Eier wurden in den Eierstock einer scheinträchtigen weiblichen Wistar-Ratte zur Implantation gemäß dem durch Wagner et al. (1981, ProNAS, USA, 78 5016) mitgeteilten Verfahren überführt. Die Eier wurden durch Paaren von Wistar-Ratten erhalten. Die Wistar-Ratten wurden aus einer Handelsquelle (CLEA JAPAN) erworben und die Eier wurden in Ammenmutterratten bis zur Reife gezüchtet.
Die pseudoträchtigen weiblichen Wistar-Ratten (11 Wochen alt oder älter) wurden subkutan mit Luteinisierungshormon-freisetzendem Hormon (allgemein als LHRH abgekürzt) oder einem Analogon davon (40 μg/Tier) an Tag 0 um 13:00 behandelt. Um 17:00 an Tag 4 wurden diese weiblichen Tiere zusammen mit 12 Wochen alten oder älteren, vasoligierten männlichen Zucker-lean- oder Wistar-Ratten auf 1:1-Grundlage gehalten. Um 9:00 an Tag 5 wurden die Ratten, die kopuliert hatten, auf einen Vaginalverschluß überprüft und für den vorstehenden Zweck verwendet.
2) Analyse der Ratten, in die ein Fremdrattengen eingeführt war
Unter Verwenden der DNA, die aus dem Schwanz der jungen Ratte 3 Wochen nach der Geburt geerntet worden war, wurde die Genanalyse durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren durchgeführt. Auf diese Weise wurde die PCR unter Verwenden des Primers 5 (5'-CTGTCTTCTTTCAACCTGGAT-3' : SEQ ID Nr. 5), der ein 21mer in der Ratten-25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA ist und Primers 6 (5'-TTAGAGTTCTGTGGGGCATTC-3' : SEQ ID Nr. 6), der ein 21mer in der Ratten-25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-cDNA ist, durchgeführt. Unter Verwenden von 1 μl der 50fach mit sterilem Wasser verdünnten Schwanz-DNA-Zubereitung als Substrat wurde die PCR in 1 Zyklus von 94°C, 3 min, gefolgt vor 25 Zyklen von 94°C über 30 sec, 65°C über 1 min, 72°C über 1 min durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde in 1,0% GTG Agarosegel (FMC Bio-Product) der Elektrophorese unterzogen und die Ratten, die eine DNA-Bande mit 765 bp zeigten, wurden ausgewählt. Die Analyse von insgesamt 137 jungen Ratten zeig te, daß eine davon PCR-positiv war. Die DNA-Probe zur Analyse wurde durch Extrahieren der DNA aus einem etwa 1 cm langen Streifen des Schwanzes gemäß dem durch Horgan et al. [1986, Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory)] mitgeteilten Verfahren hergestellt. Das erhaltene Nukleinsäurepellet wurde einmal in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 200 μl 10 mM Tris (pH 8,0)-1 mM EDTA erneut suspendiert. Als Ergebnis dieser Analyse wurde von dem Tier R01163-1 gefunden, daß es transgen war. Die Information zur Mikroinjektion und Genanalyse wird in Tabelle 2 dargestellt.
3) Aufstellen einer transgenen 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-Hydroxylase-Rattenlinie
Die PCR-Analyse der F₁-Ratten der beiden Stämme, von denen gefunden wurde, daß sie transgen waren, zeigte einen ertolgreichen Gentransfer bei 7 von 17 Tieren eines Stamms. Zur Erzeugung von F₁-Nachkommen dieser Ratten, die das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen stromabwärts von MLV-LTR ligiert trugen, wurden sie mit männlichen oder weiblichen Wistar-Ratten auf 1:1-Grundlage gepaart.
Als Ergebnis lieferte die transgene Ratte R9121-7 12 F₁-Tiere, von denen durch PCR-Genanalyse gefunden wurde, daß 8 transgen waren. Nach der zweiten Paarung lieferten dieselbe Ratte 14 Nachkommen, von denen gefunden wurde, daß 6 transgen waren. Die transgene Ratte R11293-5 lieferte 14 Nachkommen, von denen durch PCR-Genanalyse gefunden wurde, daß 6 transgen waren. Das transgene Tier R12123-6 gebar 11 Nachkommen, von denen durch PCR-Genanalyse gefunden wurde, daß 4 transgen waren. Nach der zweiten Paarung lieferten dasselbe Tier 11 Nachkommen, von denen gefunden wurde, daß 3 transgen waren. Die transgene Ratte R10175-9 lieferte am 12. Februar 1995 12 Nachkommen, von denen durch PCR-Genanalyse gefunden wurde, daß eines transgen war. Die transgene Ratte R01163-1 lieferte 5 Nachkommen, von denen durch PCR-Genanalyse gefunden wurde, daß eines transgen war. Die transgene Ratte R02205-1 gebar 12 Nachkommen, aber keines davon war transgen. Somit lieferten alle transgenen Ratten außer R02205-1 transgene F₁-Ratten.
Unter den mehrfach kopierten transgenen Ratten fand sich ein abnormales, 5 Wochen nach der Geburt 39 g wiegendes Tier (R11293-9) mit verlängerten Schneidezähnen, starb aber durch Zufall.
Die transgene Ratte R12121-7 (weiblich) kopulierte mit einer männlichen Wistar-Ratte und gebar bei der ersten Niederkunft 12 Neugeborene. Dieselbe PCR-Genanalyse wie vorstehend zeigte, daß 5 dieser Nachkommen transgene Tiere waren. Bei der zweiten Niederkunft wurden 4 Nachkommen erhalten und dieselbe PCR-Genanalyse zeigte, daß 2 davon transgen waren.
Weiterhin wurde durch Geschwisterpaarung der F₁-Tiere. d. h. R12121-7-2 (weiblich) und R12121-7-4 (männlich), die bei der zweiten Niederkunft geboren waren, 15 Nachkommen erhalten.
Der Gentest durch PCR wurde durchgeführt und die DNA-Proben, von denen bestätigt wurde, daß das Gen eingeführt worden war, wurden durch Southern-Blotting auf dieselbe Weise wie vorstehend untersucht. Die Probe, die eine dunklere Bande als die Bande des F₁-Tiers ergab, wurde als Homozygote angesehen und die Probe, die eine Bande vergleichbarer Dichte ergab, wurde als Heterozygote angesehen. Weiter wurden die Homozygoten gekreuzt und die sich daraus ergebenden Nachkommen wurden demselben PCR-Gentest wie vorstehend unterzogen, um zu bestätigen, daß bei keinem Tier nicht das Gen nachgewiesen werden konnte und sie wurden auf der Grundlage der Ergebnisse der F₁-Tiere schließlich als Homozygoten beurteilt.
Als Ergebnis wurden 5 Homozygoten, 7 Heterozygoten und 3 nicht-transgene Tiere ermittelt.
Die so gefundenen Homozygoten waren R12121-7-2-1 (männlich), R12121-7-2-3 (weiblich), R12121-7-2-5 (weiblich), R12121-7-2-11 (weiblich) und R12121-7-2-12 (männlich). Das Dendrogramm ist in 5 dargestellt.
Beispiel 5
Kennzeichen transgener 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-Hydroxylase-Ratten
1) Mengenmäßige Bestimmung von Vitamin-D₃-metaboliten im Blut transgener Ratten
Die Vitamin-D₃-fraktionen einer transgenen Ratte wurden bestimmt und es wurde ein Versuch unternommen, zum Zweck des Untersuchens des Expressionsgrads des eingeführten Gens Ratten mit Vitamin-D-mangel aufzubauen. Zuerst wurde die transgene Ratte im Alter von 3 Wochen unmittelbar nach der Entwöhnung und ihre Wurfpartner mit reinem AIN-93G-Futter (Oriental Yeast Co.) gefüttert, aus dem Vitamin D entfernt worden war und Ca und P auf 0,5% beziehungsweise 0,6% eingestellt worden war, wobei entionisiertes Wasser in einem mit Acrylharzplatten vor Licht geschütztem Tierraum 1 Woche zur Verfügung gestellt wurde. Anschließend wurden die Tiere unter Verwenden reinen AIN-93G-Futters (Oriental Yeast Co.), aus dem Vitamin D entfernt worden war und Ca und P auf 0,03% beziehungsweise 0,15% eingestellt worden war und entionisierten Wassers 4 Wochen in derselben Umgebung gehalten. Am letzten Tag der 8. Woche nach der Geburt wurden 2 ml Blut für den Vitamin-D-test abgenommen und das Serum wurde auf Routineweise abgetrennt. Der Test wurde gemäß dem in der Literatur beschriebenen Verfahren, z. B. The Vitamin Society of Japan (herausgegeben und verfasst, 1989): Vitamin Handbook (3) (Kagaku Dojin), ausgeführt. Das Körpergewicht der jeweiligen Tiere wurde während des Zeitraums des Fütterns mit dem Vitamin-D-armen, calciumarmen Futter wöchentlich aufgezeichnet.
Als Ergebnis war das Körpergewicht der weiblichen transgenen F₁-Ratten R9121-7 im Alter von 8 Wochen bei vitaminarmer, calciumarmer Ernährung 135 bis 167 g, während das Körpergewicht der weiblichen, nicht-transgenen Ratten 139 bis 157 g war. Zum anderen war das Körpergewicht der weiblichen transgenen F₁-Ratten R9121-7 im Alter von 8 Wochen bei normaler Ernährung 206 bis 224 g, während das Körpergewicht der weiblichen, nicht-transgenen Ratten 196 g war.
Die mengenmäßige Bestimmung verschiedener Vitamin-D₃-metaboliten zeigte bei den Serumwerten von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, 24,25-Dihydroxyvitamin D₃ und 25-Hydroxyvitamin D₃ zwischen der transgenen Ratte und nicht-transgenen Ratte bei Vitamin-D-armer, calciumarmer Ernährung keine merklichen Unterschiede. Somit gab es keine dem Füttern mit Vitamin-D-armem, calciumarmem Futter zuschreibbare Wirkung.
Als die Ratten zum anderen mit normaler Nahrung gefüttert wurden, war der 24,25-Hydroxyvitamin-D₃-spiegel mindestens 10,0 ng/ml bei 3 der 4 transgenen Ratten, aber der Wert bei den nicht-transgenen Ratten war 7 bis 9 ng/ml. Bei dem 25-Hydroxyvitamin-D₃-spiegel waren die einzelnen Werte innerhalb des Bereichs von 19 bis 13 ng/ml und zeigten somit keinen Unterschied. Der 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-spiegel war 130 pg/ml bis 89 pg/ml bei den nicht-transgenen Ratten gegenüber 54 bis 11 ng/ml bei den transgenen Ratten (Tabelle 3).
2) Mengenmäßige Bestimmung von Vitamin-D₃-metaboliten im Blut mit normaler Nahrung gefütterter transgener Ratten
Die Vitamin-D₃-metaboliten im Blut wurden jeweils bei 5 weiblichen transgenen F₀-Ratten, die das eingeführte 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen trugen, und zwar R02205-1, R12123-6, R12121-7, R01163-1 und R11293-5 (F₀-Tiere, von 20 bis 40 Wochen alt), zwei transgenen F₁-Ratten R12121-7 und zwei nicht-transgenen Ratten bestimmt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Serumspiegel von 25-Hydroxyvitamin-D₃ bei den transgenen Ratten 28 bis 10 ng/ml waren. Während der 24,25-Dihydroxyvitamin-D₃-spiegel höher als 10,0 ng/ml bei den transgenen Ratten R12123-6, R01163-1 und R11293-5 war, zeigten die anderen beiden transgenen Ratten niedrigere Werte. Was die F₁-Tiere R12121-7 betrifft, ergaben zwei Weibchen Werte über 10,0 ng/ml, aber zwei Männchen zeigten niedrigere Werte. Der 1α,25-hydroxyvitamin-D₃-spiegel war höher als 100 pg/ml bei den transgenen Ratten R02205-1 und R12121-7 und dem männlichen, nicht-transgenen F₁-Tier R12121-7-3. Somit zeigten die hohe 24,25-Dihydroxyvitamin-D₃-spiegel zeigenden Tiere niedrige 1α,25-Dihydroxyvitamin-D₃-spiegel. Unter den transgenen Ratten wurden bei den Blutwerten von Vitamin-D₃-metaboliten große individuelle Unterschiede gefunden (Tabelle 4).
3) Erhalt einer abnormalen transgenen Ratte
Unter den transgenen F₁-Ratten 12121-7 war ein weibliches Tier (Tier Nr. 12121-7-3) ausgezehrt und wies im Gegensatz zu den anderen transgenen Ratten und ihren Wurfpartnern nach der Geburt Quadriplegie, Kniebeugenstörung und eine markante, abnormale Gangweise auf. Dieses Tier wog 12 g an Tag 15 nach der Geburt und war damit verglichen mit den anderen weiblichen transgenen Ratten, die 19 bis 21 g wogen oder ihren Wurfpartnern, die 17 bis 23 g wogen, beträchtlich untergewichtig (6). Ein Vergleich dieses Tiers mit seinen Wurfpartnern zeigte keine morphologischen Abnormalitäten bei den Knochen und Zähnen. Dieses Tier starb an Tag 17 nach der Geburt.
4) Veränderungen beim Köpergewicht transgener 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-Hydroxylase-Ratten
Das Körpergewicht von Heterozygoten und Homozygoten unter Tieren der F₂-Generation der transgenen Rattenlinie R12121-7 wurde bis Woche 18 nach der Geburt aufgezeichnet. Als Ergebnis zeigten auch die Homozygoten und Heterozygoten eine Tendenz zu einer Zunahme des Körpergewichts jede Woche. Von Woche 6 an wurde ein deutlicher Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Tieren bei jeder Zygotenart gefunden und das Körpergewicht der Homozygoten in Woche 18 war 400 bis 500 g bei Männchen gegenüber 300 bis 350 g bei Weibchen und das Körpergewicht der Heterozygoten war 450 bis 600 g bei Männchen gegenüber 250 bis 400 g bei Weibchen. Es fand sich keine Abnormalität bei den untersuchten Tieren (7 und 8).
5) Urinanalyse transgener 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-Hydroxylase-Ratten
Zur Bestimmung des Urinalbumin- und Urinkreatininspiegels wurde der 24-h-Urin jeder transgenen Ratte mittels eines Stoffwechselkäfigs gesammelt. Die Bestimmung des Urinalbumins wurde kolorimetrisch mittels des handelsüblichen Kits A/G, B-Test Wako (Wako Pure Chemical Ind.) auf Routineweise durchgeführt. Urinkreatinin wurde kolorimetrisch unter Verwenden des handelsüblichen Kits Creatinine HA-Test Wako HA7050 (Wako Pure Chemical Ind.) auf Routineweise bestimmt. Außerdem wurde das Urinalbumin/Urinkreatinin-Verhältnis aus den für jedes Tier gemessenen Werten berechnet.
Als Ergebnis zeigte unter den transgenen Ratten der F₀-Generation R12123-6 (weiblich) hohe Urinalbuminspiegel, d. h. 129 mg/Tag in Woche 41, 161 mg/Tag in Woche 44 und 214 mg/Tag in Woche 47 und jede Woche sogar noch höhere Werte. Die anderen transgenen Ratten zeigten von 7,5 bis 37 mg/Tag reichende Werte und keinen merklichen Unterschied bei irgendwelchen Einzeltieren zwischen den Wochen. Was das Urinkreatinin anbelangt, zeigten die transgenen Ratten von 9,3 bis 24,7 mg/Tag reichende Werte, die von einem Einzeltier zum anderen schwankten, es gab aber keinen Unterschied von Woche zu Woche innerhalb eines Einzeltiers. Bezüglich des Urinalbumin/Urinkreatinin-Verhältnisses jedes Tiers war das Verhältnis bei R12123-6 (weiblich) 13,6 in Woche 41, 16,4 in Woche 44 und 21,7 in Woche 47 und erhöhte sich danach jede Woche. Die anderen transgenen Ratten ergaben von 0,31 bis 2,47 reichende Werte (Tabelle 5).
Bezüglich der Urinalbuminkonzentration bei den transgenen Ratten der F₁-Generation ergab R12121-7-4 (männlich) hohe Werte, d. h. 372 mg/Tag 26 Wochen alt, 352 mg/Tag 29 Wochen alt und 311 mg/Tag 31 Wochen alt. Was die anderen transgenen Ratten der F₁-Generation anbelangt, ergaben R12123-6-3 (männlich) und R12123-6-9 (männlich) Werte von 19 bis 28,6 mg/Tag und der Wert bei R12123-6-5 (weiblich) war etwa 11 mg/Tag. Der Bereich der Urinkreatininkonzentration bei den transgenen Ratten der F₁-Generation war 7,8 bis 26,2 mg/Tag. Bezüglich des Urinalbumin/Urinkreatinin-Verhältnisses bei jedem Einzeltier zeigte R12121-7-4 (männlich) hohe Werte, d. h. 26,6 26 Wochen alt, 21,5 29 Wochen alt und 24,5 31 Wochen alt und die anderen transgenen Ratten der F₁-Generation ergaben Werte innerhalb des Bereichs von 0,45 bis 2,1 (Tabelle 6).
Bezüglich des Urinalbumins ergaben die transgene Ratte F₂-Homozygote R12121-7-12 (männlich) Werte über 110 mg/Tag in und nach Woche 11 und die F₂-Homozygote R12121-7-1 (männlich) zeigte Werte über 30 mg/Tag. Der Bereich bei den anderen 3 weiblichen Homozygoten war jedoch von 4 bis 10 mg/Tag. Was die Heterozygoten anbelangt, zeigte R12121-7-13 (männlich) Werte über 80 mg/Tag in und nach 11 Wochen alt und R12121-7-10 (weiblich) ergab Werte um 20 mg/Tag, aber der Bereich bei den anderen Heterozygoten war von 10 bis 19 mg/Tag bei 2 Männchen und von 5 bis 15 mg/Tag bei 3 Weibchen. Bei den Kontrollratten war das Mittel von 5 Männchen 12,3 mg/Tag und das Mittel von 5 Weibchen war 7,7 mg/Tag. Was das Urinkreatinin bei Homozygoten anbelangt, war der Konzentrationsbereich bei den beiden Männchen von 10 bis 15 mg/Tag und der bei 3 Weibchen war von 7 bis 11 mg/Tag. Unter den Heterozygoten ergaben 3 Männchen Werte innerhalb des Bereichs von 8 bis 16 mg/Tag und 4 Weibchen von 5 bis 10 mg/Tag. Bei den Kontrollratten war das Mittel von 5 Männchen 13,5 mg/Tag und das Mittel von 5 Weibchen war 9,2 mg/Tag. Was das Urinalbumin/Urinkreatinin-Verhältnis jedes Einzeltiers anbelangt, war das Verhältnis bei dem Homozygoten R12121-7-12 (männlich) über 8,0 und das bei R12121-7-1 (männlich) über 2,8. Der Bereich bei den anderen 3 weiblichen Homozygoten war jedoch 0,5 bis 1,3. Unter den Heterozygoten war das Verhältnis bei R12121-7-13 (männlich) über 9,0 und das bei R12121-7-10 (weiblich) war über 2,4. Die Werte bei den anderen Heterozygoten waren 0,9 bis 1,8 bei 2 Männchen und 0,8 bis 2,4 bei 3 Weibchen. Bei den Kontrollratten war das Mittel von 5 Männchen 0,9 und das Mittel von 5 Weibchen war 0,8 (Tabelle 7).
6) Blutbiochemie von Ratten, in die das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen eingeführt wurde
Zum Bestimmen der blutbiochemischen Marker wurde jeder transgenen Ratte auf Routineweise Blut entnommen. Die Bestimmung des Gesamtblutcholesterins (TCHO) wurde mittels eines handelsüblichen Kits (Fuji Fiol Co.) kolorimetrisch durchgeführt. Das Gesamtbluttriglycerid (TG) wurde ebenfalls kolorimetrisch mittels eines handelsüblichen Kits (Fuji Film Co.) bestimmt. Die Gesamtblutglucose (GLU) wurde kolorimetrisch mittels eines handelsüblichen Kits (Fuji Film Co.) bestimmt. Das Blutcalcium (Ca) wurde kolorimetrisch mittels des handelsüblichen Kits Calcium E-Test Wako (Wako Pure Chemical Ind.) bestimmt. Der Blutphosphor (P) wurde kolorimetrisch mittels des handelsüblichen Kits Phospholipid C-Test Wako (Wako Pure Chemical Ind.) bestimmt. Blutkreatinin (CREA) wurde kolorimetrisch mittels eines handelsüblichen Kits (Fuji Film Co.) bestimmt. Außerdem wurde die Kreatinin-Clearance (ml/min/100 g Körpergewicht) (Ccr) aus dem gemessenen Blutkreatinin- und Urinkreatininwerten für jedes Einzeltier mittels der Gleichung: Urinkreatininwert × 24-h-Urinvolumen/Blutkreatininwert/Körpergewicht × 100/1440 berechnet.
Bezüglich des Gesamtblutcholesterins bei transgenen F₀-Ratten zeigte R12123-6 (weiblich) den höchsten Wert von über 200 mg/dl. Die Werte bei den anderen transgenen Ratten waren 60 bis 150 mg/dl. Der höchste Bluttriglyceridspiegel von 2265 mg/dl wurde bei R12123-6 und R11293-5 festgestellt und R02205-1 zeigte ebenfalls hohe Werte. Der Blutglucosespiegel schwankte zwischen den transgenen Ratten nicht sehr. Der Blutcalciumspiegel schwankte zwischen den transgenen Ratten ebenfalls nicht sehr. Der Blutphosphorspiegel war bei R12123-6 752 mg/dl hoch. Der Kreatininclearancewert war bei R09121-7 niedrig mit weniger als 0,2 ml/min/100 g Körpergewicht.
Der Gesamtblutcholesterinspiegel war unter den Ratten der F₁-Generation bei R12121-7-4 (weiblich) mit 228 mg/dl am höchsten. Die Werte bei den anderen transgenen Ratten waren 64 bis 120 mg/ml. Der Bluttriglyceridspiegel war bei R12121-7-4 331 mg/dl hoch. Der Blutglucosespiegel schwankte zwischen den transgenen Ratten nicht sehr merklich. Der Blutcalciumspiegel schwankte zwischen den transgenen Ratten ebenfalls nicht sehr. Beim Blutphosphor lieferte R12121-7-4 den höchsten Wert von 375 mg/dl. Die Kreatininclearance schwankte zwischen den untersuchten Tieren nicht sehr (Tabelle 8).
Bezüglich des Blutgesamtcholesterins wurden zwischen den männlichen transgenen Ratten der F₂-Generation in Woche 24 bei R12121-7-12 und -13 hohe Werte um 200 mg/dl gefunden, wogegen der Mittelwert männlicher Kontrollratten 71 mg/dl war und das Mittel der weiblichen Kontrollratten 84 mg/dl war. Bezüglich des Bluttriglycerids zeigten R12121-7-12 und -13 Werte über 400 mg/dl, wogegen das Mittel der männlichen Kontrollratten 95,6 mg/dl war und das der weiblichen Kontrollratten 144 mg/dl war. Was die Blutglucose betrifft, war der Blutglucosespiegel bei den transgenen Ratten 86 bis 131 mg/dl, wogegen die Mittelwerte männlicher Kontrollratten und weiblicher Kontrollratten 122 mg/dl beziehungsweise 124 mg/dl waren und damit keinen merklichen Unterschied zu den Kontrollwerten zeigen. Bezüglich des Blutcalciums war die Konzentration bei den transgenen Ratten 8,8 bis 10,1 mg/dl, wogegen der Mittelwert männlicher Kontrollratten 9,2 mg/dl war und der weiblicher Kontrollratten 9,7 mg/dl war und damit keinen merklichen Unterschied zu den Kontrollwerten zeigt. Bezüglich des Blutphosphors waren die Werte bei R12121-7-12 und -13 mehr als 300 mg/dl hoch, wogegen die Mittelwerte männlicher Kontrollratten und weiblicher Kontrollratten 126 mg/dl beziehungsweise 174 mg/dl waren. Was die Kreatininclearance betrifft, lieferten R12121-7-4, -10, -1, -11, -12 und -13 kleinere Werte als 0,3, wogegen der Mittelwert männlicher Kontrollratten 0,376 ml/min/100 g Körpergewicht war und der weiblicher Kontrollratten 0,366 ml/min/100 g Körpergewicht war (Tabelle 9).
Die biochemischen Marker bei denselben Tieren in Woche 27 nach der Geburt waren wie folgt. Was das Blutgesamtcholesterin betrifft, lieferten R12121-7-12 und -13 über 200 mg/dl hohe Werte, wogegen die Mittelwerte männlicher und weiblicher Kontrollratten 62,4 mg/dl bzw. 70,6 mg/dl waren. Bezüglich des Bluttriglycerids lieferten R12121-7-7, -1, -3, -12 und -13 Werte über 300 mg/dl, wogegen die Mittelwerte männlicher und weiblicher Kontrollratten 113 mg/dl beziehungsweise 166 mg/dl waren. Es gab keine merkliche Schwankung bei der Blutglucosekonzentration: die Konzentrationswerte bei den transgenen Ratten waren 113 bis 156 mg/dl, wogegen die Mittelwerte männlicher Kontrollratten und weiblicher Kontrollratten 149 mg/dl beziehungsweise 117 mg/dl waren. Was das Blutcalcium betrifft, waren die Konzentrationswerte bei den transgenen Ratten 8,2 bis 10,2 mg/dl, wogegen die mittleren Konzentrationswerte männlicher und weiblicher Kontrollratten 9,1 mg/dl beziehungsweise 9,5 mg/dl waren und damit keinen merklichen Unterschied zu der Kontrolle zeigten. Was den Blutphosphor betrifft, zeigten R12121-7-1, -12 und -13 über 300 mg/dl hohe Werte, wogegen die Mittelwerte männlicher Kontrollratten und weiblicher Kontrollratten 129 mg/dl beziehungsweise 172 mg/dl waren. Bezüglich der Kreatininclearance lieferten R12121-7-10, -1, -7, -15, -11, -5 und -12 kleinere Werte als 0,3, wogegen die Mittelwerte männlicher Kontrollratten und weiblicher Kontrollratten 0,365 ml/min/100 g Körpergewicht beziehungsweise 0,442 ml/min/100 g Körpergewicht waren. Somit schwankten die Werte verschiedener Marker von einer Woche zur anderen bei demselben Tier, aber abnormale Werte wurden im allgemeinen bei denselben Tieren gefunden (Tabelle 10).
7) Histopathologische Analyse von Ratten, in die das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen eingeführt wurde
R12121-7-1 (Homozygote, männlich, 28 Wochen alt), eine transgene Ratte der F₂-Generation und Kontrollratten wurden getötet und das Gehirn, Herz, Leber, Lunge, Nieren, Milz, Hoden und Oberschenkelknochen wurde aus jedem Kadaver auf Routineweise isoliert. Diese Organe und Gewebe wurden jeweils in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, mit einem Mikrotom geschnitten und unter Liefern von Proben auf Routineweise mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt. Der Oberschenkelknochen wurde 3 Tage mit 10% Ameisensäure auf Routineweise gespült, sagittal geschnitten und auf dieselbe Weise wie die anderen Organe, um Proben zu liefern, behandelt. Die Proben wurden unter dem Lichtmikroskop untersucht.
Im Ergebnis war das Cerebrum bei R12121-7-1 und den Kontrollratten unverändert. Das Cerebellum war bei R12121-7-1 und den Kontrollratten ebenfalls unverändert. Bei den Kontrollratten zeigte die Leber eine zelluläre Infiltration der Glisson-Kapsel. Bei R12121-7-1 wurde eine zelluläre Infiltration der Glisson-Kapsel, Vakuolisierung von Leberzellen und disseminierte klare Zellen beobachtet. Die Nieren waren bei den Kontrollratten unverändert. Im Gegensatz dazu zeigte R12121-7-1 eine Glomerulosklerose, Nephropathie, einfache Hyperplasie der Harnröhre, basophile Degeneration des Nierentubuliepithels, Ikteruszylinder, Dilatation von Nierentubuli und Infiltration mit kleinen Rundzellen. Die Lunge war bei den Kontrollratten unverändert. Bei R12121-7-1 wurde eine Verdickung der Tunicae media und externa der kleinen und mittleren Lungenarterien, alveoläre Histiozytose, Knochenbildung, Kalzifizierung von Lungenarterien und eine örtlich begrenzte Verdickung der Septa alveolaria beobachtet. Das Herz war bei R12121-7-1 und den Kontrollratten unverändert. Bei den Kontrollratten zeigte die Milz eine extramedulläre Hämopoese und Pigmentierung. Bei R12121-7-1 wurden eine extramedulläre Hämopoese und arterielle Hypertrophie beobachtet. Das Knochenmark war bei den Kontrollratten unverändert. Im Gegensatz dazu zeigte R12121-7-1 eine erhöhte Hämopoese. Die Hoden waren bei R12121-7-1 und den Kontrollratten unverändert.
8) Organgewichte der transgenen 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen-Ratten
Die transgene Ratte F₄ R12121-7-1 (Homozygote, männlich, 18 Wochen alt) und Kontrollratten wurden getötet und das Herz, Leber, Lunge, Niere und Milz wurden aus jedem Kadaver auf Routineweise isoliert und gewogen. Im Ergebnis war das Herz-, Leber-, Lungen- und Milzgewicht bedeutend größer als die entsprechenden Organgewichte der Kontrollratten. Das Nierengewicht neigte dazu, im Vergleich mit den Kontrollratten größer zu sein.
9) Knochenmineraldichten transgener 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Fremdgen-Ratten
Die F₃-Nachkommenschaft der transgenen Ratte R12121-7-1 (Homozygote, 16 Wochen alt) und von Kontrollratten wurde getötet und die Oberschenkelknochen und Schienbein wurden aus jedem Kadaver isoliert. Die Knochensalzdichte jedes Knochens wurde durch Dualenergieröntgenabsorptiometrie (allgemein als DXA abgekürzt) gemessen. Im Ergebnis war die Knochensalzdichte des 1/3 proximalen Epiphysienteils des Schienbeins der männlichen und weiblichen transgenen Ratten verglichen mit Kontrollratten des jeweiligen Geschlechts signifikant niedrig. Außerdem neigte die Knochenmineraldichte des 1/3 distalen Epiphysienteils der Oberschenkelknochen der männlichen transgenen Ratten dazu, niedriger als die der Kontrollratten zu sein.
10) Genexpressionsanalyse der transgenen 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen-Ratten
Die RNA zur Analyse wurde aus Teilen des Gehirns, Herzens, Leber, Lunge, Nieren, Milz, Hoden und Oberschenkelknochen der besagten transgenen F₂-Ratte R12121-7-1 (Homozygote, 28 Wochen alt) und Kontrollratten durch Gewebeaufschluß in Guanidin und nachfolgende Extraktion gemäß dem Routineverfahren geerntet. Jedes erhaltene Nukleinsäurepellet wurde in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser erneut suspendiert.
Die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (allgemein als RT-PCR abgekürzt) wurde unter Verwenden der hierin vorstehend beschriebenen Primer 5 und 6 durchgeführt. Unter Verwenden von 20 μg des RNA-Präparats als Substrat wurde es zuerst 30 Minuten bei 60°C und weiter 2 Minuten bei 94°C mit reverser Transkriptase behandelt. Anschließend wurde Taq-Polymerase zugefügt und der Reaktionszyklus 1 min bei 94°C und 1,5 min bei 60°C wurde 40 Mal wiederholt, gefolgt von 7 Minuten Inkubation bei 60°C. Das Reaktionsgemisch wurde der E lektrophorese in 1,0% GTG Agarosegel (FMC Bioproducts) unterzogen. Im Fall der Kontrollratten wurde bei keinem der analysierten Organe eine DNA-Bande beobachtet. Im Gegensatz dazu lieferten alle Organe aus R12121-7-1 eine DNA-Bande mit 400 bp (9).
Die Expression des 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens wurde im Gehirn, Herz, Leber, Lunge, Niere, Milz, Hoden und Oberschenkelknochen der transgenen F₂-Ratte R12121-7-1 (Homozygote, männlich, 28 Wochen alt) gefunden. Bei den Kontrollen war die Expression des intrinsischen 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gens ebenfalls unter der Nachweisgrenze.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Von der Ratte dieser Erfindung, in die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen eingeführt ist, kann erwartet werden, daß sie Hyperkalzämie, Hypokalzämie, Hyperparathyroidismus, eine Knochenkrankheit wie etwa Rachitis, Osteomalazie, Osteoporose und Knochenmassenverlust, eine Nierenkrankheit wie etwa Glomerulonephritis, Glomerulosklerose, chronische Nephritis und Niereninsuffizienz, Geradgelenkerkrankung; Lungenkrankheit, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Krankheit eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergische Erkrankung, endokrine Erkrankung, Demenz und/oder Krebs oder Komplikationen davon aufweist und daher als Tiermodell für derartige Krankheiten verwendet werden kann. Zum Beispiel kann die Ratte dieser Erfindung zum Aufklären des Mechanismus dieser Krankheiten, Erforschung der Entwicklung prophylaktischer und therapeutischer Modalitäten für die Krankheiten und das Durchmustern nach therapeutischen Wirkstoffkandidaten verwendet werden.
Die transgene Ratte dieser Erfindung kann als Krankheitsmodell zum Verfolgen des Krankheitszustands bei Knochenstörungen wie etwa Osteoporose, Osteomalazie usw., Störungen der Nieren wie etwa Nephritis, Niereninsuffizienz usw., als Modell zur Therapie dieser und anderer, aus Abnormalitäten des Vitamin-D₃-stoffwechsels entstehender Krankheiten, als Modell zum Durchmustern nach Kandidatenverbindungen zur Entwicklung neuer Wirkstoffe und als Quelle zu deren In-vitro-Bewertung verwendet werden.
Diese Erfindung hat Aufschluß gegeben über den Mechanismus des Ausbruchs einer Nierenerkrankung, Knochenerkrankung, Gelenkserkrankung, Lungenerkrankung, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzkrankheit, Diabetes, Obesitas, Erkrankung eines Verdauungsorgans, Infektionskrankheit, allergischen Krankheit, endokrinen Krankheit, Demenz oder Krebs oder eine Komplikation einer derartigen Krankheit durch die übermäßige Expression von 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase, die das Ungleichgewicht des Vitamin-D₃-stoffwechsels hauptsächlich in den Nieren und eine Inaktivierung oder Unterdrückung des Gens fördert, das die aktiven Formen von Vitamin D₃ reguliert. Insbesondere ist aufgeklärt worden, daß Niereninsuffizienz durch Abnormalitäten des Vitamin-D₃-stoffwechsels, insbesondere eine übermäßige Expression von Vitamin-D₃-24-hydroxylase verursacht wird. Dies ist ein neuer Befund.
Die Ratte dieser Erfindung, in die ein fremdes 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen eingeführt ist, kann zur Lieferung das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Gen stark exprimierender Zellen und dem Entschlüsseln des Zielgenregulationsmechanismus nukleärer Rezeptoren benützt werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Transgene Ratte umfassend ein Ratten-25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Transgen, die das 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase-Transgen überexprimiert.
Transgene Ratte gemäß Anspruch 1, wobei die Überexpression der Vitamin-D₃-24-hydroxylase das Ungleichgewicht des Vitamin-D₃-Stoffwechsels hauptsächlich in den Nieren fördert.
Transgene Ratte gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Überexpression der Vitamin-D₃-24-hydroxylase die Funktionen der aktivierten, Vitamin-D₃-regulierenden Gene inaktiviert oder unterdrückt.
Transgene Ratte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Überexpression der Vitamin-D₃-24-hydroxylase eine Nierenerkrankung, Knochenerkrankung, Gelenkerkrankung, Lungenerkrankung, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzerkrankung, Diabetes, Fettsucht, Erkrankung eines Verdauungsorgans oder Infektionskrankheit auslöst.
Aus einer transgenen Ratte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 isolierte Zelle, Gewebe oder Organ, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ ein Transgen umfaßt, das eine für 25-Hydroxyvitamin-D₃-24-hydroxylase kodierende DNA-Sequenz umfaßt.
Isolierte Zelle, Gewebe oder Organ gemäß Anspruch 5, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ eine Nierenzelle, -gewebe oder -organ ist und wobei das Transgen in den Nieren in nachweisbaren Mengen exprimiert wird.
Isolierte Zelle, Gewebe oder Organ gemäß Anspruch 5, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ aus dem Oberschenkelknochen stammt und wobei das Transgen im Oberschenkelknochen in nachweisbaren Mengen exprimiert wird.
Isolierte Zelle, Gewebe oder Organ des Anspruchs 5, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ eine Leberzelle, -gewebe oder -organ ist und wobei das Transgen in der Leber in nachweisbaren Mengen exprimiert wird.
Isolierte Zelle, Gewebe oder Organ des Anspruchs 5, wobei die Zelle, das Gewebe oder Organ eine Lungenzelle, -gewebe oder -organ ist und wobei das Transgen im Lungengewebe in nachweisbaren Mengen exprimiert wird.
Verfahren zum Screenen auf eine Substanz, die zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Nierenerkrankung, Knochenerkrankung, Gelenkerkrankung, Lungenerkrankung, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzerkrankung, Diabetes, Fettsucht, Erkrankung eines Verdauungsorgans oder Infektionskrankheit Anwendung findet, die aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels entsteht, das das Bestimmen der sich daraus ergebenden Wirksamkeit der Untersuchungssubstanzen zum Verbessern des Krankheitszustands bei der aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels entstehenden Krankheit an einer transgenen Ratte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, die mit der Untersuchungssubstanz behandelt wurde oder an einer daraus stammenden Zelle umfaßt.
Screeningverfahren des Anspruchs 10, wobei die aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels entstehende Krankheit eine Nierenerkrankung oder eine Knochenerkrankung ist.
Verwendung einer transgenen Ratte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einer daraus stammenden Zelle zum Screenen auf eine Substanz, die zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Nierenerkrankung, Knochenerkrankung, Gelenkerkrankung, Lungenerkrankung, Hyperlipidämie, Arteriosklerose, Herzerkrankung, Diabetes, Fettsucht, Erkrankung eines Verdauungsorgans oder Infektionskrankheit Anwendung findet, die aus einer Abnormalität des Vitamin-D₃-Stoffwechsels entsteht.