DE69933216T2

DE69933216T2 - Erythropoietin-analog-menschliches serum-albumin fusionsprotein

Info

Publication number: DE69933216T2
Application number: DE69933216T
Authority: DE
Inventors: W. Michael Weston YOUNG; M. Harry Newton MEADE; M. Ian Westborough KRANE
Original assignee: GTC Biotherapeutics Inc
Current assignee: rEVO Biologics Inc
Priority date: 1998-06-15
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2019-06-16
Also published as: JP2002518018A; DE69933216D1; EP1088084A2; ES2273497T3; WO1999066054A2; HK1036475A1; AU775422B2; JP4087563B2; US20020155998A1; WO1999066054A3; CA2330527A1; US20050158832A1; AU4566899A; EP1088084B1; US6548653B1; US20040143857A1; US7101971B2; DK1088084T3; ATE339507T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Fusionsproteine aus Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA), Nukleinsäuren, die die EPOa-hSA Fusionsproteine codieren und Methoden zur Herstellung und Verwendung von EPOa-hSA Fusionsproteinen und Nukleinsäuren.
Korhonen et al, Eur. J Biochem (1997) 245:482-489 beschreiben die Produktion von EPO fusiert mit β-Laktoglobulin in Milch. Es wird nicht angedeutet, dass ein Fusionsprotein aus EPO und Humanalbumin hergestellt oder exprimiert werden kann, um EPO in Milch zu erzeugen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Allgemein zeichnet sich die Erfindung durch ein EPOa-hSA Fusionsprotein aus, in dem mindestens ein Aminosäurerest der EPOa-Gruppe des Fusionsproteins so verändert wird, dass ein Stelle, die im Erythropoietin (EPO) als Glykosylierungsstelle dient, im EPOa nicht als Stelle zur Glykosylisierung dient, wobei der besagte Aminosäurerest das EPOa-Äquivalent eines EPO-Rests ist, der aus der Gruppe gewählt wurde, die aus den Aminosäureresten Asn24, Asn38, Asn83 and Ser126 besteht, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, in dem wenigstens ein Aminosäurerest, der als Glykosylisierungsstelle in Erythropoietin dienen kann, verändert ist, z. B. durch Substitution oder Deletion, so dass er nicht als Glykosylisierungsstelle dient.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat das EPOa-hSA Fusionsprotein die Formel: R1-L-R2; R2-L-R1 oder R1-L-R2-L-R1, wobei R1 eine EPOa-Aminosäuresequenz, L ein Peptidlinker und R2 eine Humanalbumin-Aminosäuresequenz ist. R1 und R2 sind bevorzugt über den Peptidlinker kovalent verbunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform: Ein Aminosäurerest von EPO, der als Bindungspunkt für die Glykosylierung dient, wurde deletiert; ein Aminosäurerest von EPO, der als Glykosylierungsstelle dient, wurde durch einen Aminosäurerest substituiert, der nicht als Glykosylierungsstelle dient; die Glykosylierungsstelle bei Aminosäurerest Ser126 und mindestens eine zusätzliche Stelle zur N-Glykosylierung, die aus der Gruppe aus Asn24, Asn38 und Asn83 gewählt wurde, wurden verändert; eine Glykosylierungsstelle, die die N-Glykosylierung ermöglicht, wird durch die Substitution eines Asn-Rests mit einen anderen Aminosäurerest verändert, z. B. Gln; eine Glykosylierungsstelle, die die O-Glykosylierung ermöglicht, wird durch die Substitution eines Ser-Rests mit einem anderen Aminosäurerest verändert, z. B. Ala.
In bevorzugten Ausführungsformen wurde das EPOa-hSA Fusionsprotein in der Milchdrüse eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers hergestellt, z. B. eines Wiederkäuers, z. B. einer Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wurde das EPOa-hSA Fusionsprotein in die Milch eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers ausgeschieden, z. B. eines Wiederkäuers, z. B. einer Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in einem transgenen nichtmenschlichen Tier unter der Kontrolle eines für die Milchdrüse spezifischen Promotors hergestellt, z. B, eines milchspezifischen Promotors, z. B. eines Milchserumprotein- oder Kasein-Promotors. Der milchspezifische Promotor kann ein Kasein-Promotor, ein beta-Lactuglobulin-Promotor, ein Whey-Acid-Promotor oder ein Lactalbumin-Promotor sein. Der Promotor ist bevorzugt ein ∃-Kasein-Promotor aus der Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das EPOa-hSA Fusionsprotein in einem transgenen nichtmenschlichen Tier und wird in die Milch eines transgenen nichtmenschlichen Tiers in Konzentrationen von mindestens 0,2 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml oder darüber ausgeschieden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde der Aminosäurerest Asn24 verändert z. B. substituiert oder deletiert. Der Aminosäurerest Asn24 wurde bevorzugt mit Gln substituiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde der Aminosäurerest Asn38 verändert z. B. substituiert oder deletiert. Der Aminosäurerest Asn38 wurde bevorzugt mit Gln substituiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde der Aminosäurerest Asn83 verändert z. B. substituiert oder deletiert. Der Aminosäurerest Asn83 wurde bevorzugt mit Gln substituiert.
In einer weiteren Ausführungsform wurde der Aminosäurerest Ser126 verändert z. B. substituiert oder deletiert. Der Aminosäurerest Ser126 wurde bevorzugt mit Ala substituiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform: Jeder der Aminosäurereste Asn24, Asn38, Asn83 and Ser126 wurden verändert, z. B. substituiert oder deletiert, so dass keiner von ihnen als Glykosylierungstellen dienen kann; jeder der Aminosäurereste Asn24, Asn38, Asn83 and Ser126 wurden jeweils durch Gln, Gln, Gln und Ala ersetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform gehört zu dem Fusionsprotein ein Peptidlinker und der Peptidlinker hat mindestens eine der folgenden Eigenschaften: a) Er ermöglicht die Rotation der Erythropoietin-Analog Aminosäuresequenz und der Humanalbumin Aminosäuresequenz zueinander; b) Er ist gegen die Verdauung durch Proteasen resistent und c) Er interagiert nicht mit dem Erythropoietin-Analog oder dem Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform: Das Fusionsprotein enthält einen Peptidlinker und der Peptidlinker ist 5 bis 60, stärker bevorzugt 10 bis 30 Aminosäuren lang; der Peptidlinker ist 20 Amnosäuren lang; der Peptidlinker ist 17 Aminosäuren lang; alle Aminosäuren im Peptidlinker werden aus der Gruppe gewählt, die aus Gly, Ser, Asn, Thr und Ala besteht; der Peptidlinker enthält ein Gly-Ser-Element.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Fusionsprotein einen Peptidlinker und der Peptidlinker enthält eine Sequenz mit der Formel (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y, wobei y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, oder 8 ist. Der Peptidlinker enthält bevorzugt eine Sequenz mit der Formel (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3. Der Peptidlinker enthält bevorzugt eine Sequenz mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro).
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Fusionsprotein einen Peptidlinker und der Peptidlinker enthält eine Sequenz mit der Formel (Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)y, wobei y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, oder 8 ist. Der Peptidlinker enthält bevorzugt eine Sequenz mit der Formel ((Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3-Ser-Pro).
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein EPOa-hSA Fusionsprotein aus, in dem das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO (d. h. nur Aminosäuren 24, 38, 83 und 126 unterscheiden sich vom Wildtyp).
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein EPOa-hSA Fusionsprotein aus, das von links nach rechts ein EPOa enthält, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein EPOa-hSA Fusionsprotein aus, das von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa enthält, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine isolierte Nukleinsäure aus, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein hierin beschriebenes EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein in dem mindestens ein Aminosäurerest so verändert wurde, dass eine Stelle, die in EPO als Glykosylierungsstelle dient, in EPOa nicht als Glykosylierungsstelle dient, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, in dem mindestens ein Aminosäurerest des kodierten EPOa-hSA, das in Erythropoietin als Glykosylierungsstelle dienen kann, verändert wurde, z. B. durch Substitution oder Deletion, so dass er nicht als Glykosylierungsstelle dienen kann.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Nukleinsäure aus, die für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, wobei das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Nukleinsäure aus, die für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, das von links nach rechts ein EPOa enthält, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Nukleinsäure aus, die für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, das von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa enthält, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich der Erfindung durch einen Expressionsvektor oder ein Konstrukt aus, der (das) eine Nukleinsäure der Erfindung enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten der Vektor oder das Konstrukt auch: einen Promotor, einen Selektionsmarker, einen Startpunkt der Replikation oder eine DNA, die homolog zu einer nichtmenschlichen Spezies ist, z. B. DNA einer Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promotor ein milchspezifischer Promotor, z. B. ein Milchserumprotein- oder Kasein-Promotor. Der milchspezifische Promotor ist ein Kasein-Promotor, ein beta-Lactuglobulin-Promotor, ein Whey-Acid-Promotor oder ein Lactalbumin-Promotor.
Der Promotor ist bevorzugt ein ∃-Kasein-Promotor aus der Ziege.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich der Erfindung durch eine Zelle aus, die einen Vektor oder eine Nukleinsäure der Erfindung enthält.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Methode aus, eine EPOa-hSA Fusion in einem Nukleinsäurekonstrukt oder einem Vektor durchzuführen. Die Methode beinhaltet das Bilden einer Sequenz im Konstrukt oder im Vektor, in der eine Nukleinsäure, die für ein Erythropoietin-Analog kodiert, in-frame mit einer Nukleinsäure verbunden wird, die für Humanalbumin kodiert.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Methode aus, ein EPOa-hSA Fusionsprotein herzustellen, z. B. von einer kultivierten Zelle. Die Methode beinhaltet das Bereitstellen einer Zelle, die eine Nukleinsäure enthält, welche für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, und die Expression des EPOa-hSA Fusionsprotein von der Nukleinsäure, wobei ein EPOa-hSA Fusionsprotein hergestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine Säugetier-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Bakterienzelle. Zu den geeigneten Säugetierzellen gehören CHO-Zellen oder andere ähnliche Expressionssysteme.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine mikrobielle Zelle, eine kultivierte Zelle oder eine Zelle aus einer Zellenlinie.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in Kulturmedium freigesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in Kulturmedium freigesetzt und zur Methode gehören außerdem das Reinigen des EPOa-hSA Fusionsprotein vom Kulturmedium.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
Die Erfindung beinhaltet auch eine kultivierte Zelle, die eine Nukleinsäure enthält, die für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben wird. Die Erfindung beinhaltet auch Methoden zur Herstellung solcher Zellen, z. B. durch das Einbringen einer Nukleinsäure in die Zelle oder das Formen einer Nukleinsäure in der Zelle, welche für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschreiben wird.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Methode aus, ein EPOa-hSA Fusionsprotein herzustellen, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben wird. Die Methode beinhaltet das Bereitstellen eines transgenen nichtmenschlichen Organismus, der ein Transgen enthält, das die Expression des EPOa-hSA Fusionsproteins steuert, die Expression des Transgens ermöglicht und bevorzugt die Gewinnung eines auf transgenischem Weg hergestellten EPOa-hSA Fusionsproteins, z. B. aus dem nichtmenschlichen Organismus oder aus einem vom nichtmenschlichen Organismus erzeugten Produkts.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der nichtmenschliche transgene Organismus ein transgenes nichtmenschliches Tier, z. B: ein nichtmenschliches transgenes Säugetier, z. B. ein nichtmenschliches transgenes Milchtier, z. B. eine transgene Ziege oder eine transgene Kuh.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in eine Körperflüssigkeit ausgeschieden und die Methode beinhaltet weiterhin das Reinigen des EPOa-hSA Fusionsproteins von der Körperflüssigkeit.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das auf transgenischem Weg hergestellte EPOa-hSA Fusionsprotein in einer Milchdrüse eines nichtmenschlichen transgenen Säugetiers erzeugt, bevorzugt unter der Kontrolle eines milchspezifischen Promotors, z. B. eines Milchserumprotein- oder Kasein-Promotors. Der milchspezifische Promotor kann ein Kasein-Promotor, ein beta-Lactuglobulin-Promotor, ein Whey-Acid-Promotor oder ein Lactalbumin-Promotor sein. Bevorzugt ist der Promotor ein ∃-Kasein-Promotor aus der Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in der Milchdrüse des transgenen nichtmenschlichen Säugetiers erzeugt, z. B. eines Wiedekäuers, z. B. eines Milchtiers, z. B. einer Ziege oder einer Kuh.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in die Milch eines nichtmenschlichen transgenen Säugetiers in Konzentrationen von mindestens ca. 0,2 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml oder darüber ausgeschieden. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Methode außerdem die Gewinnung von EPOa-hSA Fusionsprotein aus dem nichtmenschlichen Organismus oder aus einem von dem nichtmenschlichen Organismus erzeugten Produkt, z. B. aus Milch, Samen, Haaren, Blut, Eiern oder Urin.
In einer weiteren Ausführungsform wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in einer transgenen Pflanze erzeugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Erythropoietin-Analog die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Methode aus, ein transgenes EPOa-hSA Fusionsprotein herzustellen, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist. Die Methode beinhaltet das Bereitstellen eines nichtmenschlichen transgenen Säugetiers, z. B: einer Ziege oder einer Kuh, das ein Transgen enthält, das die Expression des EPOa-hSA Fusionsproteins möglich macht, indem das Transgens exprimiert werden kann und bevorzugt die Gewinnung von EPOa-hSA Fusionsprotein aus der Milch des transgenen nichtmenschlichen Tiers.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in der Milchdrüse des transgenen nichtmenschlichen Säugetiers erzeugt, z. B. eines Wiederkäuers, z. B. eines Milchtiers, z. B. einer Ziege oder einer Kuh.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in die Milch des transgenen nichtmenschlichen Säugetiers ausgeschieden, z. B. eines Wiederkäuers, z. B. eines Milchtiers, z. B. einer Ziege oder einer Kuh.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein unter der Kontrolle eines für die Milchdrüse spezifischen Promotors hergestellt, z. B. eines milchspezifischen Promotors, z. B. eines Milchserumprotein- oder Kasein-Promotors. Der milchspezifische Promotor ist ein Kasein-Promotor, ein beta-Lactuglobulin-Promotor, ein Whey-Acid-Promotor oder ein Lactalbumin-Promotor sein. Der Promotor ist bevorzugt ein ∃-Kasein-Promotor aus der Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in die Milch eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers in Konzentrationen von mindestens ca. 0,2 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml oder darüber ausgeschieden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Methode aus, eine transgene Zubereitung bereitzustellen, die ein EPOa-hSA Fusionsprotein, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist, in der Milch eines nichtmenschlichen transgenen Säugetiers enthält. Die Methode beinhaltet: Das Bereitstellen eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers, das eine für EPOa-hSA Fusionsprotein kodierende Sequenz hat, die operativ mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, die die Expression der für das Protein kodierenden Sequenz in den Epithelzellen der Milchdrüse bewirkt und die Expression des Fusionsproteins ermöglicht und die Gewinnung von Milch von dem nichtmenschlichen Säugetier, wodurch die transgene Zubereitung bereitgestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die für das EPOa-hSA Fusionsprotein kodierende Sequenz, die operativ mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, in die Keimbahn des transgenen nichtmenschlichen Säugetiers eingebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Erythropoietin-Analog die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Methode aus, mit der eine transgene Zubereitung bereitgestellt wird, die ein EPOa-hSA Fusionsprotein, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist, in der Milch einer transgenen Ziege oder einer transgenen Kuh enthält. Die Methode beinhaltet das Bereitstellen einer transgenen Ziege oder einer transgenen Kuh mit einer für das EPOa-hSA Fusionsprotein kodierenden Sequenz, die operativ mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, die die Expression der für das Protein kodierenden Sequenz in den Epithelzellen der Milchdrüse bewirkt und die Expression des Fusionsproteins ermöglicht und die Gewinnung von Milch von der Ziege oder der Kuh, wodurch die transgene Zubereitung bereitgestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Erythropoietin-Analog die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA-Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch einen nichtmenschlichen transgenen Organismus aus, der ein Transgen enthält, das für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der transgene nichtmenschliche Organismus eine transgene Pflanze oder ein nichtmenschliches Tier. Zu den bevorzugten transgenen nichtmenschlichen Tieren gehören: Säugetiere, Vögel, Reptilien, Beuteltiere und Amphibien. zu den geeigneten nichtmenschlichen Säugetieren gehören: Wiederkäuer, Huftiere, Haussäugetiere und Milchtiere. Zu den besonders bevorzugten nichtmenschlichen Tieren gehören: Mäuse, Ziegen, Schafe, Kamele, Kaninchen, Kühe, Schweine, Pferde, Rinder und Lamas. Zu den geeigneten Vögeln gehören Hühner, Gänse und Truthähne. Wenn das transgene Protein in die Milch eines transgenen nichtmenschlichen Tiers ausgeschieden wird, sollte das Tier in der Lage sein, mindestens 1 Liter oder mehr, und stärker bevorzugt mindestens 10 oder 100 Liter Milch pro Jahr zu produzieren.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein von einem für die Milchdrüse spezifischen Promotor kontrolliert, z. B, einem milchspezifischen Promotor, z. B. einem Milchserumprotein- oder Kasein-Promotors. Der milchspezifische Promotor kann ein Kasein-Promotor, ein beta-Lactuglobulin-Promotor, ein Whey-Acid-Promotor oder ein Lactalbumin-Promotor sein. Der Promotor ist bevorzugt ein ∃-Kasein-Promotor aus der Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in Konzentrationen von mindestens 0,2 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml oder darüber in die Milch ausgeschieden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. eine Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA-Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine transgene Kuh, eine transgene Ziege oder ein transgenes Schaf aus, die ein Transgen enthalten, das für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein von einem für die Milchdrüse spezifischen Promotor kontrolliert, z. B, einem milchspezifischen Promotor, z. B. einem Milchserumprotein- oder Kasein-Promotor. Der milchspezifische Promotor kann ein Kasein-Promotor, ein beta-Lactuglobulin-Promotor, ein Whey-Acid-Promotor oder ein Lactalbumin-Promotor sein. Der Promotor ist bevorzugt ein ∃-Kasein-Promotor aus der Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in die Milch in Konzentrationen von mindestens 0,2 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml oder darüber ausgeschieden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine Herde transgener nichtmenschlicher Tiere aus, die aus mindestens einem weiblichen und einem männlichen transgenen nichtmenschlichen Tier besteht, wobei jedes nichtmenschliche Tier ein Transgen für das EPOa-hSA Fusionsprotein, z. B. ein Transgen, das für ein hierin beschriebenes EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein transgenes nichtmenschliches Tier der Herde ein nichtmenschliches Säugetier, ein Vogel, ein Reptil, ein Beuteltier oder eine Amphibie. Zu den geeigneten nichtmenschlichen Säugetieren gehören: Wiederkäuer, Huftiere, Haussäugetiere und Milchtiere. Zu den besonders bevorzugten Tieren gehören: Mäuse, Ziegen, Schafe, Kamele, Kaninchen, Kühe, Schweine, Pferde, Rinder und Lamas. Zu den geeigneten Vögeln gehören Hühner, Gänse und Truthähne. Wenn das transgene Protein in die Milch eines transgenen nichtmenschlichen Tiers ausgeschieden wird, sollte das Tier in der Lage sein, mindestens 1 Liter oder mehr und stärker bevorzugt mindestens 10 oder 100 Liter Milch pro Jahr zu produzieren.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein von einem für die Milchdrüse spezifischen Promotor kontrolliert, z. B, einem milchspezifischen Promotor, z. B. einem Milchserumprotein- oder Kasein-Promotor. Der milchspezifische Promotor ist ein Kasein-Promotor, ein beta-Lactuglobulin-Promotor, ein Whey-Acid-Promotor oder ein Lactalbumin-Promotor.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein in Konzentrationen von mindestens 0,2 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml oder darüber in die Milch ausgeschieden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine pharmazeutische Zusammensetzung aus, die eine therapeutisch wirksame Menge von EPOa-hSA Fusionsprotein, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform gehört zu der Zusammensetzung Milch.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
Wir bieten eine Ausstattung an, die ein EPOa-hSA Fusionsprotein enthält, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist, das mit Anweisungen zur Behandlung einer Testperson verpackt ist, die Erythropoietin benötigt In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Testperson ein Patient, der an Anämie im Zusammenhang mit Nierenversagen, chronischen Erkrankungen, HIV-Infektion, Blutverlust oder Krebs leidet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Testperson ein Patient vor einem chirurgischen Eingriff In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Erythropoietin-Analog die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
Wir bieten eine gereinigte Zubereitung eines EPOa-hSA Fusionsproteins, z. B. ein EPOa-hSA Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Zubereitung mindestens 1, 10, 100 oder 1000 Mikrogramm EPOa-hSA Fusionsprotein. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Zubereitung mindestens 1, 10, 100 oder 1000 Milligramm EPOa-hSA Fusionsprotein.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein EPOa-hSA Fusionsprotein oder eine gereinigte Zubereitung dessen aus, in dem das Erythropoietin-Analog die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Zubereitung mindestens 1, 10, 100 oder 1000 Mikrogramm EPOa-hSA Fusionsprotein. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Zubereitung mindestens 1, 10, 100 oder 1000 Milligramm EPOa-hSA Fusionsprotein.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein EPOa-hSA Fusionsprotein oder eine gereinigte Zubereitung dessen aus, das von links nach rechts ein EPOa enthält, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Zubereitung mindestens 1, 10, 100 oder 1000 Mikrogramm EPOa-hSA Fusionsprotein. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Zubereitung mindestens 1, 10, 100 oder 1000 Milligramm EPOa-hSA Fusionsprotein.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein EPOa-hSA Fusionsprotein oder eine gereinigte Zubereitung dessen aus, das von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa enthält, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Zubereitung mindestens 1, 10, 100 oder 1000 Milligramm EPOa-hSA Fusionsprotein. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Zubereitung mindestens 1, 10, 100 oder 1,10 Milligramm EPOa-hSA Fusionsprotein.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch den Einsatz einer therapeutisch wirksamen Menge eines EPOa-hSA Fusionsprotein, z. B. eines EPOa-hSA Fusionsproteins, das hierin beschrieben ist, in einer Zubereitung eines Medikaments aus, mit dem Testpersonen behandelt werden, die an Anämie, Nierenversagen, chronischer Krankheit, HIV-Infektionen, Blutverlust oder Krebs leiden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Subjekt eine Testperson vor einem chirurgischen Eingriff.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA wiederholt verabreicht, z. B. mindestens zwei, drei, fünf oder zehn Mal.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Erythropoietin-Analog die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
Wir bieten eine Methode zur Behandlung einer Testperson, die Erythropoietin benötigt. Die Methode beinhaltet die Lieferung oder das Bereitstellen einer Nukleinsäure an die Testperson, welche für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, z. B. ein Fusionsprotein, das hierin beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure an die Zielzelle des Subjekts geliefert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure in einen biologisch wirksamen Träger geliefert oder dort bereitgestellt, z. B. einem Expressionsvektor.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure in eine Zelle geliefert oder dort bereitgestellt, z. B. eine autologe, allogene oder xenogene Zelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das ein EPOa Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
Wir bieten eine Methode, mit der ein transgenen nichtmenschlichen Organismus hergestellt wird, der ein EPOa-hSA Transgen enthält. Zu der Methode gehört das Bereitstellen oder Formen eines EPOa-hSA Transgens in einer Zelle eines nichtmenschlichen Organismus, z. B. eines Transgens, das für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, das hierin beschrieben ist, und der Zelle oder einem Nachkommen der Zelle ermöglicht, einen transgenen nichtmenschlichen Organismus entstehen zu lassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der transgene nichtmenschlihce Organismus eine transgene Pflanze oder ein transgenes Tier. Zu den bevorzugten transgenen Tieren gehören: Säugetiere, Vögel, Reptilien, Beuteltiere und Amphibien. Zu den geeigneten nichtmenschlichen Säugetieren gehören: Wiederkäuer, Huftiere, Haussäugetiere und Milchtiere. Zu den besonders bevorzugten nichtmenschlichen Tieren gehören: Mäuse, Ziegen, Schafe, Kamele, Kaninchen, Kühe, Schweine, Pferde, Rinder und Lamas. Zu den geeigneten Vögeln gehören Hühner, Gänse und Truthähne. Wenn das transgene Protein in die Milch eines transgenen nichtmenschlichen Tiers ausgeschieden wird, sollte das nichtmenschliche Tier in der Lage sein, mindestens 1 Liter oder mehr Liter, und stärker bevorzugt mindestens 10 oder 100 Liter Milch pro Jahr zu produzieren.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das EPOa-hSA Fusionsprotein von einem für die Milchdrüse spezifischen Promotor kontrolliert, z. B, einem milchspezifischen Promotor, z. B. einem Milchserumprotein- oder Kasein-Promotors. Der milchspezifische Promotor kann ein Kasein-Promotor, ein beta-Lactuglobulin-Promotor, ein Whey-Acid-Promotor oder ein Lactalbumin-Promotor sein. Der Promotor ist bevorzugt ein ∃-Kasein-Promotor aus der Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der nichtmenschliche Organismus ein nichtmenschliches Säugetier und das EPOa-hSA Fusionsprotein wird in die Milch des transgenen nichtmenschlichen Tiers in Konzentrationen von mindestens 0,2 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml oder darüber ausgeschieden..
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker, z. B. einen Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein EPOa, das die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
Wir bieten ein Erythropoietin-Analog (EPOa) Protein oder eine gereinigte Zubereitung dessen, z. B. die EPOa-Gruppe eines EPOa-hSA Fusionsproteins, das hierin beschrieben ist, wobei mindestens ein Aminosäurerest so verändert wird, so dass eine Stelle, die in EPO als Glykosylierungsstelle dient, im EPOa nicht als Glykosylierungsstelle dient, z. B. ein EPOa, in dem mindestens ein Aminosäurerest, der als Glykosylierungsstelle in Erythropoietin dienen kann, verändert wird, z. B. durch Substituiton oder Deletion, so dass er nicht als Glykosylierungsstelle dienen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Erythropoietin-Analog die Aminosäurereste Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das EPOa ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch eine isolierte Nukleinsäure aus, die über die Nukleotidsequenz verfügt, die für ein hierin beschriebenes EPOa kodiert.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich der Erfindung durch einen Expressionsvektor oder ein Konstrukt aus, der (das) eine EPOa-Nukleinsäure enthält, die hierin beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten der Vektor oder das Konstrukt auch: einen Promotor, einen Selektionsmarker, ein Startpunkt der Replikation oder eine DNA, die homolog zu einer nichtmenschlichen Spezies ist, z. B. DNA einer Ziege.
In einem weiteren Aspekt zeichnet sich der Erfindung durch eine Zelle aus, die einen Vektor oder ein Konstrukt enthält, der (das) eine EPOa-Nukleinsäure enthält, die hierin beschrieben ist.
Eine gereinigte Zubereitung, im Wesentlichen reine Zubereitung eines Polypeptids oder eines isolierten Polypeptids, bedeutet im vorliegenden Dokument ein Polypeptid, das von mindestens einem anderen Protein, einem Lipid oder einer Nukleinsäure getrennt wurde, mit denen es in der Zelle oder dem nichtmenschlichen Organismus auftritt, der es exprimiert, z. B. von einem Portein, einem Lipid oder einer Nukleinsäure in einem nichtmenschlichen transgenen Tier oder in einer Flüssigkeit, z. B. der Milch oder einer anderen Substanz, z. B. einem Ei, die von einem nichtmenschlichen transgenen Tier erzeugt wird. Das Poypeptid wird bevorzugt von Substanzen getrennt, z. B. Antikörper oder Gelmatrix, z. B. Polyacrylamide, die zu dessen Reinigung verwendet werden. Das Polypeptid besteht bevorzugt aus mindestens 10, 20, 50 70, 80 oder 95 % Trockengewicht der gereinigten Zubereitung. Die Zubereitung enthält bevorzugt: ausreichend Polypeptide, um die Proteinsequenzierung zu ermöglichen, mindestens 1, 10 oder 100 μg des Polapeptids; mindestens 1, 10 oder 100 mg des Polypeptids.
Im vorliegenden Dokument bezieht sich „Humanalbumin" oder „hSA" auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in Minghetti et al. J. Biol. Chem. 261:6747-6757, 1986; Lawn et al. Nucl. Acids Res. 9:6103, 1981 beschrieben ist In bevorzugten Ausführungsformen sind Sequenzvariationen einbezogen, wobei eine oder bis zu zwei, fünf 10 oder 20 Aminosäurereste substituiert, eingefügt oder deletiert wurden. Varianten haben im Wesentlichen die gleiche Immunogenizität in z. B. Mäusen, Ratten, Kaninchen, Primaten, Pavianen oder Menschen; das Gleiche gilt für hSA. Varianten, die in ein Fusionsprotein inkorporiert werden, das EPOa enthält, führen zu einer EPOa-hSA Fusion, die in z. B. Mäusen, Kaninchen oder Menschen eine ähnliche Halbwertzeit und Aktivität wie ein Fusionsprotein hat, die EPOa und hSA enthalten.
In diesem Dokoment bezieht sich „Erythropoietin" oder „EPO" auf ein Glykoproteinhormon, das an der Reifung von Erythroid-Vorläuferzellen zu Erythrozyten beteiligt ist. Die Sequenz von EPO kann in Powell, J.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6465-6469 (1986) gefunden werden Eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die entweder bzw. sowohl: nicht unmittelbar benachbart zu einer oder beiden Sequenzen ist, z. B. Kodiersequenzen, mit denen es im natürlich auftretenden Genom des Organismus, von dem die Nukleinsäure abgeleitet wird, unmittelbar benachbart ist (d. h. eine am 5'-Ende, die andere am 3'-Ende) oder im Wesentlichen frei von einer Nukleinsäurefrequenz ist, in der sie in dem Organismus auftritt, von dem die Nukleinsäure abgeleitet wurde. Der Begriff schließt z. B. eine rekombinante DNA ein, die in einen Vektor inkorporiert wurde, z. B. in ein autonom replizierendes Plasmid oder ein autonom replizierendes Virus oder in die genome DNA eines Prokaryots oder nichtmenschlichen Eukaryots oder die als getrenntes Molekül (z. B. eine cDNA oder ein genomes DNA-Fragment, das durch PCR oder Restriktionsendonukleasebehandlung) unabhängig von anderen DNA-Sequenzen existiert. Im Wesentlichen reine DNA beinhaltet auch eine rekombinante DNA, die Teil eines Hybridgens ist, das für zusätzliche EPOa-hSA Fusionsproteinsequenzen kodiert.
Homologie oder Sequenzidentität, bezieht sich in diesem Dokument auf die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidmolekülen oder zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz von dem gleichen Aminosäurerest oder Nukleotid besetzt wird, wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. in diesem Dokument ist Aminosäure- oder Nukleinsäure-„Homologie" äquivalent zu Aminosäure- oder Nukleinsäure-„Identität"). Der Prozentsatz der Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der identischen Positionen, die die Sequenzen gemeinsam haben (d. h. % der Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtpositionen × 100). Wenn z. B. 6 von 10 der Positionen in zwei Sequenzen zusammenpassen oder homolog sind, dann sind die beiden Sequenzen 60 % homolog oder haben eine Sequenzidentität von 60 %. Zum Beispiel haben die beiden DNA-Sequenzen ATTGCC und TATGGC 50 % Homologie oder Sequenzidentität gemeinsam. Im Allgemeinen wird ein Vergleich angestellt, wenn zwei Sequenzen ausgerichtet werden, um eine maximale Homologie oder Sequenzidentität zu liefern.
Der Vergleich von Sequenzen und das Feststellen des Prozentsatz der Homologie zwischen zwei Sequenzen kann mithilfe eines mathematischen Algorithmus bewerkstelligt werden. Ein bevorzugtes, nicht-limitierendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, geändert gemäß Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Ein derartiger Algorithmus ist in die NBLAST und XBLAST Programme (Version 2.0) von Altschul, et al.(1990) J. Mol Biol 215:403-10 inkorporiert. BLAST Nucleotide Searches können mit dem NBLAST Programm durchgeführt werden (Score = 100, Wortlänge = 12), um Nukleotidsequenzen aufzufinden, die homolog zu den ITALY Nukleinsäuremolekülen der Erfindung sind. Um gapped Alignments zu Vergleichzwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 beschrieben. Wen BLAST und Gapped BLAST Programme eingesetzt werden, können die voreingestellten Parameter der jeweiligen Programme verwendet werden. (z. B. XBLAST und NBLAST). Siehe http:\\www.ncbi.nhn.nih.gov. Ein weiteres bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller, CABIOS (1989). Ein derartiger Algorithmus ist in das ALIGN Programm (Version 2.0) inkorporiert, das Teil des GCG Sequence Alignment Softwarepakets ist. Wenn das ALIGN Programm zum Vergleich von Aminosäurefrequenzen verwendet wird, können eine PAM120 Weight Residue Tabelle, eine Gap Length Penalty von 12 und eine Gap Length Penalty von 4 verwendet werden.
Die Begriffe Peptide, Proteine und Polypeptide werden in diesem Dokument austauschbar eingesetzt.
In diesem Dokument bedeutet der Begriff „Transgen" eine Nukleinsäuresequenz (die z. B. für mindestens ein EPOa-hSA Fusionsproteinpolypeptid kodiert), die in das Genom eines nichtmenschlichen transgenen Organismus eingebracht wird. Ein Transgen kann mindestens eine transkriptionelle regulatorische Sequenz und andere Nukleinsäuren enthalten, wie Introns, die zur optimalen Expression und Sekretion einer Nukleinsäure notwendig sein kann, die für das Fusionsprotein kodiert. Ein Transgen kann eine Enhancer-Sequenz enthalten. Eine EPOa-hSA Fusionsproteinsequenz kann operativ mit einem gewebespezifischen Promotor verknüpft werden, z. B. einer milchdrüsenspezifischen Promotorsequenz, die die Ausscheidung des Proteins in die Milch eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers bewirkt, ein winspezifischer Promotor oder ein eierspezifische Promotor.
Der Begriff „transgene Zelle" bezieht sich in diesem Dokument auf eine Zelle, die ein Transgen enthält.
Ein nichtmenschlicher transgener Organismus bezieht sich in diesem Dokument auf ein nichtmenschlicher transgenes Tier oder eine transgene Pflanze.
In diesem Dokument ist ein „nichtmenschliches transgenes Tier" ein nichtmenschliches Tier, in dem mindestens eine und bevorzugt im Wesentlichen alle Zellen des nichtmenschlichen Tiers ein Transgen enthalten, das durch einen menschlichen Eingriff in die Zelle eingebracht wurde, wie durch transgene Methoden, die im Fach bekannt sind.
Das Transgen kann direkt oder indirekt durch das Einbringen in einen Vorläufer der Zelle in die Zelle eingebracht werden, durch absichtliche genetische Manipulation, wie durch Mikroinjektion oder Infektion mit einem rekombinanten Virus.
Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen hervor.
Detaillierte Beschreibung
Die Zeichnungen werden zuerst beschrieben.
1 ist ein schematisches Diagramm von EPOa-hSA Fusionskonstrukten. Sternchen bezeichnen Glykosylierungsstellen des nativen menschlichen Erythropoietins.
2 ist eine Fotografie, die die Western-Blot-Analyse von COS7-Zellen zeigt, die mit EPOa-hSA cDNA Konstrukten transient transfiziert wurden.
Glykosylierung
EPO ist ein Glykoproteinhormon, das die Reifung von Erythroid-Vorläuferzellen zu Erythrozyten vermittelt. Es spielt einen wichtige Rolle in der Regulierung des Erythrozytengehalts im Blutkreislauf. Natürlich vorkommendes EPO wird vom Fötus in der Leber und bei Erwachsenen in der Niere erzeugt, zirkuliert im Blut und stimuliert die Produktion roter Blutkörperchen im Knochenmark.
Viele Zelloberflächen und sekretorische Proteine, die von eukaryontischen Zellen produziert werden, werden durch das Anbinden einer oder mehrerer Oligosaccharidgruppen verändert. Die Veränderung, die als Glykosylierung bezeichnet wird, kann die physikalischen Eigenschaften von Proteinen dramatisch verändern und kann für die Stabilität, Ausscheidung und Lokalisation des Proteins wichtig sein.
Glykosylierung findet an bestimmten Stellen entlang des Polypeptidrückgrats statt. Es gibt gewöhnlich zwei Haupttypen der Glykosylierung: Glykosylierung durch O-gebundene Oligosaccharide, die an Serin- oder Threoninreste gebunden werden, und Glykosylierung durch N-gebundene Oligosaccharide die an Asparginreste in einer Asn-X-Ser/Thr-Sequenz gebunden werden, wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann. N-Acetylneuraminsäure (im Folgenden als Salinsäure bezeichnet) ist gewöhnlich der Terminalrest von sowohl N-gebundenen als auch O-gebundenen Oligosacchariden.
Aus menschlichem Urin abgeleitetes EPO enthält drei N-gebundene und eine O-gebundene Oligosaccharidkette. N-Glykosylierung tritt an Asparginresten auf, die sich an den Positionen 24, 38 und 83 befinden, während o-Glykosylierung an eineM Serinrest stattfindet, der sich an Position 126 befindet (Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al, Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988).
Wie hierin beschrieben wurden die EPO-Analoge der Erfindung verändert, so dass Glykosylierung an einer, zwei, drei oder allen diesen Stellen ausgeschaltet wurde, z. B. durch Substitution oder Deletion eines Aminosäurerests.
EPO-Glykosylierungsanaloge
Ein EPO-Analog kann sich von einem natürlich auftretenden oder rekombinanten EOP an mindestens einer der folgenden Aminosäuren unterscheiden: Asn24, Asn38, Asn83 oder Ser126. In einem EPOa kann die Primärsequenz verändert werden, so dass mindestens einer diese Reste die Glykosylierung nicht mehr unterstützt.
Bevorzugte Analoge werden unten angeführt, wobei Xaa eine Aminosäure ist, die eine Anbindung eines Zuckerrests nicht unterstützt, z. B. Gln oder Ala
Ein EPOa kann sich von EPO nur an einer, mehreren oder allen der Stellen 24, 38, 83 und 126 unterscheiden oder kann zusätzliche Aminosäuresubstitutionen und/oder -deletionen haben, wie unten ausgeführt.
Kodiersequenzen von EPOa-hSA Fusionsprotein
Die bevorzugte EPOa-hSA Fusion hat eine EPOa-Verbindung an ein hSA-Molekül, andere Konformationen sind jedoch in der Erfindung inbegriffen. Z. B. können EPOa-hSA Fusionsproteine jede der folgenden Formeln haben: R₁-L-R₂; R₂-L-R₁; R₁-L-R₂-L-R₁ oder R₂-L-R₁-L-R₂; R₁-R₂; R₂-R₁; R₁-R₂-R₁ oder R₂-R₁-R₂; wobei R₁ ein EPO-Analog, R₂ hSA und L eine Peptidlinkersequenz ist.
EPOa- und hSA-Domänen sind bevorzugt über eine Linkersequenz miteinander verbunden. Die Linkersequenz muss die EPOa- und hSA-Domänen mit genügend Abstand voneinander trennen, dass gewährleistet ist, dass sich jede Domäne richtig zu seiner Sekundär- und Tertiärstruktur falten kann. Bevorzugte Linkersequenzen (1) müssen eine flexible ausgedehnte Konformation annehmen, (2) dürfen keine Neigung zur Entwicklung einer geordneten Sekundärstruktur haben, die mit den funktionellen EPOa- und hSA-Domänen interagieren könnte und (3) müssen einen minimal hydrophobischen oder geladenen Charakter haben, der zur Interaktion mit den funktionellen Domänen führen könnte. Zu den typischen Oberflächenaminosäuren in flexiblen Proteinregionen gehören Gly, Asn und Ser. Permutationen von Aminosäuresequenzen, die Gly, Asn und Ser enthalten, würden gemäß Erwartung die oben genannten Kriterien für eine Linkersequenz erfüllen. Andere nahezu neutrale Aminosäuren wie Thr und Ala können ebenfalls in der Linkersequenz verwendet werden.
Eine Linkersequenz mit einer Länge von 20 Aminosäuren kann verwendet werden, um eine geeignete Trennung der funktionellen Proteindomänen zu gewährleisten, obwohl auch längere oder kürzere Sequenzen verwendet werden können. Die Länge der Linkersequenz, mit der das EPOa und das hSA voneinander getrennt werden, kann von 5 bis 500 Aminosäuren betragen oder stärker bevorzugt 5 bis 100 Aminosäuren. Bevorzugt ist die Linkersequenz ungefähr 5 bis 30 Aminosäuren lang. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Linkersequenz ungefähr 5 bis 20 Aminosäuren lang und enthält zweckmäßigerweise ungefähr 10 bis 20 Aminosäuren. Zu den Aminosäuresequenzen, die sich als Linker von EPOa und hSA eignen, gehören unter anderem (SerGly4)y, wobei y größer oder gleich 8 ist, oder Gly4SerGly5Ser. Eine bevorzugte Linkersequenz hat die Formel (SerGly4)4. Ein weiterer bevorzugter Linker hat die Sequenz ((Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3-Ser-Pro).
Die EPOa- und hAS-Proteine können direkt ohne Linkersequenz fusiert werden. Linkersequenzen sind nicht notwendig, wenn die fusierten Proteine nichtessentielle N- oder C-terminale Aminosäureregionen haben, die zur Trennung der funktionellen Domänen verwendet werden können und eine räumliche Behinderung verhindern. In bevorzugten Ausführungsformen kann der C-Terminus von EPOa direkt an den N-Terminus von hSA gebunden werden oder der C-Terminus von hSA kann direkt an den N-Terminus von EPOa gebunden werden.
Rekombinante Produktion
Ein EPOa-hSA Fusionsprotein kann mit standardmäßigen rekombinanten DNA-Methoden hergestellt werden, wobei ein Nukleinsäuremolekül dazu verwendet wird, für das Fusionsprotein zu kodieren. Eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein kodiert, kann durch standardgemäße DNA-Synthesemethoden geschaffen werden.
Eine Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein kodiert, kann in eine Wirtzelle eingebracht werden, z. B. eine Zelle einer Primärzelllinie oder einer immortalisierten Zelllinie. Die rekombinanten Zellen können zur Herstellung eines Fusionsprotein verwendet werden. Eine Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein kodiert, kann in eine Wirtzelle eingebracht werden, z. B. durch homologe Rekombination. In den meisten Fällen wird eine Nukleinsäure, die für das EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert, in einen rekombinanten Expressionsvektor inkorporiert.
Die Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein kodiert, kann operativ mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen verknüpft werden, deren Wahl aufgrund der Wirtzellen erfolgt, die zur Expression genutzt werden. Der Begriff „operativ verknüpft" bedeutet, dass die Sequenzen, die für die Fusionsproteinverbindung kodieren, so an die regulatorischen Sequenzen) gebunden sind, dass die Expression des Fusionsproteins möglich ist. Der Begriff „regulatorische Sequenz" bezieht sich auf Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente für die Expression (z. B. Polyadenylierungssignale). Solche regulatorischen Sequenzen werden z. B. in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben, dessen Inhalt hierin durch Referenz einbezogen ist. Zu den regulatorischen Sequenzen gehören die, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtzellen steuern (z. B. gewebespezifische regulatorische Sequenzen) und die, die die Expression auf regulierbare Art steuern (z. B. nur bei Vorhandensein einesAuslösers). Fachkräfte in dem Bereich werden anerkennen, dass das Design des Expressionsvektors von Faktoren wie der Wahl des Wirtzelle, die transformiert werden soll, des gewünschten Gehalts der Expression für das Fusionsprotein und ähnlichen Faktoren abhängt. Die Expressionsvektoren für das Fusionsprotein können in die Wirtzelle eingebracht werden, so dass Fusionsproteine erzeugt werden, die von Nukleinsäuren kodiert werden.
Rekombinante Expressionsvektoren können für die Expression von Fusionsproteinen in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen geschaffen werden. Zum Beispiel können Fusionsproteine in Bakterienzellen wie E.coli, Insektenzellen (z. B. im Baculovirus-Expressionssystem), Hefezellen oder Zellen von Säugetieren exprimiert werden. Einige geeignete Wirtzellen werden in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enrymology 185 Academic Press, San Diego, CA (1990) näher beschrieben. Zu den Beispielen für Vektoren zur Expression in Hefe S. cerevisiae gehören pYepSecl (Baldari et al., (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Zu den für die Expression von Fusionsproteinen in kultivierten Insektenzellen verfügbaren Baculovirus-Vektoren (z. B. Sf 9 Zellen) gehören die pAc-Serie (Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) und die pVL-Serie (Lucklow, V.A., and Summers, M.D., (1989) Virology 170:31-39).
Zu den Beispielen für Säugetier-Expressionsvektoren gehören pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kauffman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Häufig verwendete Promotoren werden z. B. oft von Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalovirus und Simian Virus abgeleitet.
Zusätzlich zu den oben erwähnten regulatorischen Kontrollsequenzen kann der rekombinante Expressionsvektor zusätzliche Nukleotidsequenzen enthlten. Zum Beispiel kann der rekombinante Expressionsvektor für ein Selektionsmarkergen kodieren, um Wirtzellen zu kennzeichnen, die den Vektor inkorporiert haben. Darüber hinaus kann zur Erleichterung der Ausscheidung des Fusionsproteins von einer Wirtzelle, besonders von Säugetierzellen, der rekombinante Expressionsvektor für eine Signalsequenz kodieren, die operativ mit Sequenzen verknüpft ist, die so für den Amino-Terminus des Fusionsproteins kodieren, dass das Fusionsprotein bei der Expression mit der Signalsequenz synthetisiert wird, die an seinen Amion-Terminus gebunden ist. Diese Signalsequenz richtet das Fusionsprotein in den sekretorischen Pfad der Zelle und wird dann gespalten, so dass die Ausscheidung des reifen Fusionsproteins (d. h. des Fusionsprotein ohne Signalsequenz) von der Wirttzelle möglich ist. Der Einsatz einer Signalsequenz zur Erleichterung der Ausscheidung von Proteinen oder Peptiden von Säugetierwirtzellen ist im Fach bekannt.
Vektor-DNA kann in prokaryotische und eukaryotische Zellen über konventionelle Transformations- oder Transfektionsmethoden eingebracht werden. In diesem Dokument beziehen sich die Begriffe „Transformation" und „Transfektion" auf eine Reihe von im Fach anerkannter Methoden zum Einbringen fremder Nukleinsäuren (z. B. DNA) in eine Wirtzelle, einschließlich Calciumphosphat oder Calciumchlorid Coprezipitation, DEAF-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, Elektroporation, Mikroinjektion and viral-vermittelte Transfektion. Geeignete Methoden zur Transformation oder Transfektion von Wirtzellen können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) und anderen Laborhandbüchern gefunden werden.
Oft integriert nur ein kleiner Anteil der Säugetierzellen die fremde DNA in ihr Genom. Um diese Integranten feststellen und selektieren zu können, kann zusammen mit dem Gen, das für das Fusionsprotein kodiert, eine Gen in die Wirtzelle eingebracht werden, das für einen Selektionsmarker kodiert (z. B. Resistenz auf Antibiotika). Zu den bevorzugten Selektionsmarkern gehören die, die Resistenz auf Medikamente verleihen, wie G418, Hygromycin und Methotrexate. Nukleinsäuren, die für einen Selektionsmarker kodieren, können mit dem gleichen Vektor in eine Wirtzelle eingebracht werden, der für das Fusionsprotein kodiert. Sie können auch auf einem getrennten Vektor eingebracht werden. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert wurden, können durch Medikamentenselektion festgestellt werden (z. B. überleben Zellen, die den Selektionsmarker inkorporiert haben, andere Zellen sterben).
Ein rekombinanter Expressionsvektor kann in vitro transkribiert und translatiert werden, z. B. unter Verwendung von regulatorischen Sequenzen des T7 Promotors und T7 Polymerase.
Transgene Säugetiere
Hierin werden Methoden beschrieben, mit denen nichtmenschliche transgene Tiere erzeugt werden können. DNA-Konstrukte können in die Keimbahn eines nichtmenschlichen transgenen Säugetiers eingebracht werden, um ein transgenes nichtmenschliches Säugetier zu erzeugen. Zum Beispiel können mit transgenen Standardtechniken eine oder mehrere Kopien des Konstrukts in das Genom eines nichtmenschlichen Säugetierembryos eingebracht werden Es ist oft wünschenswert, das transgene Protein in der Milch eines nichtmenschlichen transgenen Säugetiers zu exprimieren. Nichtmenschliche Säugetiere, die hohe Milchmengen produzieren und lange Laktationsperioden haben sind bevorzugt. Bevorzugte nichtmenschliche Säugetiere sind Wiederkäuer, z. B. Kühe, Schafe, Kamele oder Ziegen, z. B. Ziegen schweizerischer Herkunft, z. B. Ziegen der Rassen Alpenziege, Saanenziege und Toggenburger Ziege. Zu weiteren bevorzugten Tieren gehören Rinder, Kaninchen und Schweine.
In einer beispielhaften Ausführung wird ein transgenes nichtmenschliches Tier durch das Einbringen eines Transgens und die Keimbahn des nichtmenschlichen Tiers erzeugt. Transgene können in verschiedenen Entwicklungsstadien in die nichtmenschlichen embyonalen Zielzellen eingebracht werden. Abhängig vom Entwicklungsstadium der nichtmenschlichen embryonalen Zielzelle werden verschiedene Methoden verwendet. Die spezielle(n) Linie(n) aller verwendeten nichtmenschlichen Tiere sollte(n) nach Möglichkeit auf der Grundlage von allgemeiner Gesundheit, guten Embryoerträgen, guter pronuklearer Sichtbarkeit im Embryo und guter reproduktiver Leistung ausgewählt werden.
Das Einbringen des EPOa-hSA Fusionsproteintransgens in den nichtmenschlichen Embryo kann auf verschiedene Weisen erfolgen, die im Fach als Mikroinjektion, Elektroporation und Lipofektion bekannt sind. Zum Beispiel kann ein EPOa-hSA Fusionsproteintransgen in ein nichtmenschliches Säugetier durch Mikroinjektion des Konstrukts in die Pronuklei des befruchteten Eis des Säugetiers eingebracht werden, so dass eine oder mehrere Kopien des Konstrukts in den Zellen des sich entwickelnden nichtmenschlichen Säugetiers zurückbehalten werden. Nach dem Einbringen des Transgenskonstrukts in das befruchtete Ei, kann das Ei für unterschiedlich lange Zeiträume in vitro inkubiert oder in ein nichtmenschliches Muttertier eingepflanzt werden, oder beides. Eine häufige Methode ist das Inkubieren der nichtmenschlichen Embryos in vitro für 1 bis 7 Tage, abhängig von der Art. Danach wird er in ein nichtmenschliches Muttertier eingepflanzt.
Die Nachkommenschaft der transgen manipulierten nichtmenschlichen Embryos kann mit der Southern-Blot-Analyse eines Gewebesegments auf das Vorhandensein des Konstrukts getestet werden. Ein nichtmenschlicher Embryo, der mindestens eine Kopie des exogen geklonten Konstrukts stabil in das Genom integriert hat, kann zur Schaffung einer permanent transgenen Säugetierlinie verwendet werden, die das transgen hinzugefügte Konstrukt trägt.
Würfe von transgen veränderten nichtmenschlichen Säugetieren können nach der Geburt auf die Inkorporation des Konstrukts in das Genom der Nachkommen getestet werden. Dies kann durch die Hybridisierung einer Probe, die der für das Fusionsprotein kodierende DNA-Sequenz entspricht, oder eines Segments davon gegen das Chromosomenmaterial der Nachkommenschaft geschehen. Die nichtmenschlichen Säugetiernachkommen, die mindestens eine Kopie des Konstrukts in ihrem Genom enthalten werden bis zur Reife herangezogen. Die nichtmenschlichen weiblichen Exemplare dieser Nachkommenschaft erzeugen das gewünschte Protein in oder mit der Milch. Die transgenen nichtmenschlichen Säugetiere können gezüchtet werden, um weitere transgene nichtmenschliche Nachkommen zu erzeugen, die zur Herstellung der gewünschten Proteine in der Milch nützlich sind.
Transgene Weibchen können mit einer im Fach bekannten Probentechnik, z. B. Western-Blot oder enzymatische Assays, auf die Proteinausscheidung in die Milch getestet werden.
Produktion von transgenem Protein in der Milch eines transgenen Tiers Milchspezifische Promotoren
Nützliche Transkriptionspromotoren sind die Promotoren, die bevorzugt in den Epithelzellen der Milchdrüse aktiviert werden, einschließlich Promotoren, die die Gene kontrollieren, die Milchproteine kodierenden, wie Kasein, beta-Lactuglobulin (Clark et al., (1989) Bio/Technology 7: 487-492), Whey-Acid-Protein (Gorton et al. (1987) Bio/Technology 5: 1183-1187), und Lactalbumin (Soulier et al., (1992) FEBSLetts.: 297: 13). Der alpha-, beta-, gamma- oder kappa-Kasein-Genpromotor aller Säugetierarten kann zur Expression in der Milchdrüse verwendet werden; ein bevorzugter Promotor ist der beta-Kasein-Genpromotor aus der Ziege (DiTullio, (1992) Bio/Technology 10:74-77). Milchspezifische Proteinpromotoren oder die Promotoren, die speziell im Milchdrüsengewebe aktiviert werden, können aus der cDNA oder genomischen Sequenzen isoliert werden. Sie sind bevorzugt von genomischem Ursprung.
Informationen über DNA-Sequenzen für die oben erwähnten milchdrüsenspezifischen Gene in mindestens einem, oft in mehreren Organismen stehen zur Verfügung. Siehe z. B. Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981) (∀-Lactalbumin aus der Ratte); Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984) (WAP aus der Ratte); Jones et al., J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985) (∃-Kasein aus der Ratte); Yu-Lee & Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) ((-Kasein aus der Ratte); Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987) (menschliches ∀-Lactalbumin); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (∀sl- und 6-Kasein cDNAs aus dem Rind); Gorodetsky et al., Gene 66, 87-96 (1988) (∃-Kasein aus dem Rind); Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (6-Kasein aus dem Rind); Brignon et al., FEBS Lett. 188, 48-55 (1977) (∀S2-Kasein aus dem Rind); Jamieson et al., Gene 61, 85-90 (1987), Ivanov et at., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander ct at., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (∃-Lactoglobulin aus dem Rind); Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620 (1987) (∀-Lactalbumin aus dem Rind).
Die Struktur und Funktion der verschiedenen Milchproteingene wurde von Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993) untersucht (durch Referenz in seiner Gesamtheit für alle Zwecke einbezogen.). Wenn zur Optimierung der Expression zusätzliche flankierende Sequenzen nützlich sind, können diese Sequenzen unter Verwendung der vorhandenen Sequenzen als Sonden geklont werden. Milchdrüsenspezifische regulatorische Sequenzen verschiedener Organismen können aus Screeening Libraries solcher Organismen erhalten werden, die bekannte verwandte Nukleotidsequenzen oder Antikörper zu verwandten Proteinen als Sonde verwenden.
Signalsequenzen
Nützliche Signalsequenzen sind milchspezifische Signalsequenzen oder andere Signalsequenzen, die die Ausscheidung eukaryotischer oder prokaryotischer Proteine bewirken. Die Signalfrequenz wird bevorzugt aus milchspezifischen Signalsequenzen gewählt, d. h. sie kommt von einem Gen, das für ein Produkt kodiert, das in die Milch ausgeschieden wird. Am stärksten bevorzugt ist die milchspezifische Signalsequenz mit dem milchspezifischen Promotor verwandt, der im Expressionssystem dieser Erfindung verwendet wird. Die Größe der Signalsequenz ist für diese Erfindung nicht ausschlaggebend. Die Sequenz muss nur von ausreichender Größe sein, um die Ausscheidung des gewünschten rekombinanten Proteins zu beeinflussen, z. B. im Milchdrüsengewebe. Zum Beispiel sind Signalsequenzen von Genen die für Kaseine, z. B. alpha-, beta-, gamma- oder kappa-Kaseine, beta-Lactoglobulin, Whey-Acid-Protein und Lactalbumin kodieren, in der vorliegenden Erfindung nützlich. Eine bevorzugte Signalsequenz ist die Signalsequenz von ∃-Kasein aus der Ziege.
Signalsequenzen von anderen ausgeschiedenen Proteinen, z. B. Proteinen, die von Leberzellen, Nierenzellen oder Bauchspeicheldrüsenzellen ausgeschieden werden, können ebenfalls verwendet werden.
DNA-Konstrukte
Ein EPOa-hSA Fusionsprotein kann von einem Konstrukt exprimiert werden, das einen für die Epithelzellen der Milchdrüse spezifischen Promotor, z. B. einen Kasein-Promotor, z. B. einen beta-Kasein-Promotor aus der Ziege, eine milchspezifische Signalsequenz z. B. eine Kasein-Signalsequenz, z. B. eine ∃-Kasein-Signalsequenz und eine DNA enthält, die für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert.
Ein Konstrukt kann auch eine 3' nicht translatierte Region downstream von der DNA-Sequenz enthalten, die für das nicht ausgeschiedene Protein kodiert. Solche Regionen können das RNA-Transkript des Expressionssystem stabilisieren und daher den Ertrag des gewünschten Proteins aus dem Expressionssystem vergrößern. Zu den 3' nicht translatierten Regionen, die in den Konstrukten dieser Erfindung nützlich sind, gehören Sequenzen, die das Poly-A-Signal bereitstellen. Solche Sequenzen können z. B. aus dem SV40 kleinen T-Antigen, der 3' nicht translatierten Region von Kasein oder anderen 3' nicht translatierten Sequenzen abgeleitet werden, die im Fach gut bekannt sind. Bevorzugt wird die 3' nicht translatierte Region von einem milchspezifischen Protein abgeleitet. Die Länge der 3' nicht translatierten Region ist nicht ausschlaggebend, die stabilisierende Wirkung seines Poly-A-Transkripts scheint jedoch wichtig bei der Stabilisierung der RNA der Expressionssequenz zu sein.
Ein Konstrukt kann eine 5' nicht translatierte Region zwischen dem Promotor und der DNA-Sequenz enthalten, die für die Signalsequenz kodiert. Solche nicht translatierten Regionen können von der gleichen Kontrollregion kommen, von der der Promotor genommen wurde oder kann von einem anderen Gen sein, z. B. können sie von anderen synthetischen, semisynthetischen oder natürlichen Quellen abgeleitet werden. Auch hier ist die spezifische Länge nicht ausschlaggebend, sie scheinen jedoch nützlich in der Verbesserung des Expressionsgehalts zu sein.
Ein Konstrukt kann auch ungefähr 10 %, 20 %, 30 % oder mehr der N-terminalen kodierenden Region eines Gens enthalten, das bevorzugt in den Epithelzellen der Milchdrüse exprimiert wird. Zum Beispiel kann die N-terminale kodierende Region dem verwendeten Promotor entsprechen, z. B. eine N-terminale kodierende Region von ∃-Kasein aus der Ziege.
Frühere im Fach übliche Methoden können das Herstellen eines Konstrukts und das Testen auf die Fähigkeit zur Erzeugung eines Produkts in kultivierten Zellen beinhalten, bevor das Konstrukt in ein transgenes nichtmenschliches Tier gesetzt wird. Überraschenderweise stellten die Erfinder fest, dass ein solches Protokoll nicht unbedingt einen Prognosewert hat, wenn festgestellt werden soll, ob ein normalerweise nicht ausgeschiedenes Protein ausgeschieden werden kann, z. B. in der Milch eines transgenen nichtmenschlichen Tiers. Daher kann es wünschenswert sein, Konstrukte direkt in den transgenen nichtmenschlichen Tieren zu testen, z. B. transgener Mäuse, da manche Konstrukte, die nicht in CHO-Zellen ausgeschieden werden, in die Milch transgener nichtmenschlicher Tiere ausgeschieden werden.
Aufreinigen von Milch
Das transgene Protein kann in Milch in relativ hohen Konzentrationen und in großen Mengen erzeugt werden, so dass eine kontinuierlicher hohe Abgabe von normal prozessiertem Peptid bereitgestellt wird, das leicht aus einer nachhaltigen Quelle geerntet werden kann. Im Fach sind mehrere verschiedenen Methoden zur Isolierung von Proteinen aus der Milch bekannt.
Milchproteine werden normalerweise in einer Kombination von Verfahren isoliert. Rohmilch wird zunächst fraktioniert, um Fette z. B. durch Abschäumen, Zentrifugation oder Sedimentation (H.E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982), Säurefällung (U.S. Patent Nr. 4,644,056) oder enzymatische Koagulation mit Rennin oder Chymotrypsin (Swaisgood, ibid.) zu entfernen. Danach können die wichtigsten Milchproteine entweder in eine klare Lösung oder eine Gesamtfällung fraktioniert werden, von denen das spezielle Protein von Interesse leicht gereinigt werden kann.
USSN 08/648,235 gibt eine Methode zur Isolierung einer löslichen Milchkomponente, wie eines Peptids, in seiner biologisch aktiven Form aus Vollmilch oder aus einer Milchfraktion durch Tangential-Flow-Filtration bekannt. Im Gegensatz zu früheren Isolierungsmethoden ist hierbei eine erste Fraktionierung der Vollmilch nicht erforderlich, um Fett und Kaseinmizellen zu entfernen, wodurch das Verfahren vereinfacht wird und Verluste in der Gewinnung und Bioaktivität vermieden werden können. Diese Methode kann in Kombination mit zusätzlichen Reinigungsschritten eingesetzt werden, um weitere Verunreinigungen zu entfernen und die Komponente von Interesse zu reinigen.
Produktion transgenen Proteins in den Eiern eines transgenen nichtmenschlichen Tiers
Ein EPOa-hSA Fusionsprotein kann in Geweben, Sekretionen und anderen Produkten erzeugt werden, z. B. einem Ei eines transgenen nichtmenschlichen Tiers. EPOa-hSA kann und den Eiern von transgenen nichtmenschlichen Tieren erzeugt werden, bevorzugt einer transgenen Truthenne, einer transgenen Ente, einer transgenen Gans, eines transgenen Vogel Strauß, eines transgenen Perlhuhns, eines transgenen Pfaus, eines transgenen Rebhuhns, eines transgenen Fasans, einer transgenen Taube und stärker bevorzugt eines transgenen Huhns, wobei im Fach bekannte Methoden eingesetzt werden (Sang et al., Trends Biotechnology, 12:415-20, 1994). Gene die für Proteine kodieren, die speziell im Ei exprimiert werden, wie Eigelbprotein- und Albuminprotein- Gene, können zur direkten Expression von EPOa-hSA verändert werden.
Eierspezifische Promotoren
Nützliche Transkriptionspromotoren sind die Promotoren, die bevorzugt im Ei aktiviert werden, einschließlich Promotoren, die die Gene kontrollieren, die für Eiproteine kodieren, z. B. Ovalbumin, Lysozym und Avidin. Promotoren von Ovalbumin, Lysozym- oder Avidin-Genen aus dem Huhn werden bevorzugt. Eierspezifische Proteinpromotoren oder Promotoren, die speziell im Eiergewebe aktiviert werden, können aus der cDNA oder genomischen Sequenzen sein. Die eierspezifischen Promoter haben bevorzugt genomischen Ursprung.
DNA-Sequenzen von eierspezifischen Genen sind im Fachkreisen bekannt (siehe z. B. Burley et al., "The Avian Egg", John Wiley and Sons, p. 472, 1989, dessen Inhalt hierin durch Bezug einbezogen wird.) Wenn zur Optimierung der Expression zusätzliche flankierende Sequenzen nützlich sind, können diese Sequenzen unter Verwendung der vorhandenen Sequenzen als Sonden geklont werden. Eierspezifische regulatorische Sequenzen verschiedener Organismen können aus Screeening Libraries solcher Organismen erhalten werden, die bekannte verwandte Nukleotidsequenzen oder Antikörper zu verwandten Proteinen als Sonde verwenden.
Transgene Pflanzen
Ein EPOa-hSA Fusionsprotein kann in einem transgenen nichtmenschlichen Organismus, z. B. einer transgenen Pflanze exprimiert werden, z. B. einer transgenen Pflanze, in der das DNA-Transgen in das Kerngenom oder Plastidengenom eingesetzt wird. Die Transformation von Pflanzen ist als Fachbereich bekannt. Siehe allgemein Methods in Enymology Bd. 153 ("Recombinant DNA Part D") 1987, Wu and Grossman Eds., Academic Press and European Patent Application EP 693554 .
Fremde Nukleinsäuren können in Pflanzenzellen oder Protoplasma mithilfe verschiedener Methoden eingebracht werden. Nukleinsäuren können z. B. mechanisch mithilfe von Mikropipetten durch Mikroinjektion direkt in die Pflanzenzelle übertragen werden. Fremde Nukleinsäuren können auch in eine Pflanzenzelle übertragen werden, indem Polyethylenglykol verwendet wird, das einen Fällungskomplex mit dem genetischen Material formt, der von der Zelle aufgenommen wird (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2712-22). Fremde Nukleinsäuren können durch Elektroporation in eine Pflanzenzelle eingebracht werden (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824). Bei dieser Methode werden Pflanzenprotoplasten unter Vorhandensein von Plasmiden oder Nukleinsäuren elektroporiert, die die relevanten genetischen Konstrukte enthalten. Elektrische Impulse mit hoher Feldstärke machen die Biomembranen reversibel permeabel, wodurch das Einbringen der Plasmide ermöglicht wird. Elektroporierte Pflanzenprotoplasten stellen die Zellwand wieder her, teilen sich und formen einen Pflanzenkallus. Die Wahl der transformierten Pflanzenzellen mit dem transformierten Gen kann mithilfe phänotypischer Marker erfolgen.
Das Kohlmosaikvirus (CaMV) kann als Vektor zum Einbringen fremder Aminosäuren in die Pflanzenzellen verwendet werden (Hohn et al. (1982) "Molecular Biology of Plant Tumors," Academic Press, New York, pp. 549-560; Howell, U.S. Pat. Nr. 4,407,956). Das CaMV virale DNA-Genom wird in ein bakterielles Elternplasmid eingebracht, wodurch ein rekombinantes DNA-Molekül geschaffen wird, das in Bakterien vermehrt werden kann. Das rekombinante Plasmid kann durch das Einbringen der gewünschten DNA-Sequenz weiter verändert werden. Der veränderte virale Teil des rekombinanten Plasmids wird dann aus dem bakteriellen Elternplasmid ausgeschnitten und zur Inokulation von Pflanzenzellen oder Pflanzen verwendet.
Ballistische Durchdringung mit kleinen Teilchen von hoher Geschwindigkeit kann zum Einbringen fremder Nukleinsäuren in Pflanzenzellen verwendet werden. Nukleinsäure wird in der Matrix kleiner Kügelchen oder Teilchen oder auf der Oberfläche aufgebracht (Klein et al. (1987) Nature 327:70-73). Obwohl allgemein nur ein einziges Einbringen eines neuen Aminosäuresegments erforderlich ist, kann diese Methode auch zum mehrfachen Einbringen verwendet werden.
Eine Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle durch die Infizierung einer Pflanzenzelle, eines Explantats eines Meristems oder eines Samens mit Agrobacterium tumefaciens eingebracht werden, der mit der Nukleinsäure transformiert wurde. Unter geeigneten Bedingungen wachsen die transformierten Pflanzenzellen, bilden Sprosse und Wurzeln und entwickeln sich weiterhin zu Pflanzen. Die Nukleinsäuren können in Pflanzenzellen z. B. mittels des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens eingebracht werden. Das Ti-Plasmid wird an Pflanzenzellen bei der Infizierung mit Agrobacterium tumefaciens übertragen und stabil in das Pflanzengenom integriert (Horsch et al. (1984) "Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants," Science 233:496-498; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803).
Pflanzen, aus denen Protoplasten isoliert und kultiviert werden können, um ganze regenerierte Pflanzen zu bilden, können so transformiert werden, dass ganze Pflanzen gewonnen werden, die das übertragene fremde Gen enthalten. Zu den geeigneten Pflanzen gehören zum Beispiel Arten der Gattungen Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciohorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antinhinum, Hemerocalis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, und Datura.
Die Pflanzenregeneration von kultivierten Protoplasten wird in Evans et al, "Protoplasts Isolation and Culture," Handbook of Plant Cell Cultures 1:124-176 (MacMillan Publishing Co. New York 1983); M.R. Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts," Protoplasts (1983)-Lecture Proceedings, pp 12-29, (Birkhauser, Basal 1983); P.J. Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops," Protoplasts (1983)-Lecture Proceedings, pp. 31-41, (Birkhauser, Basel 1983); and H. Binding, "Regeneration of Plants," Plant Protoplasts, pp. 21-73, (CRC Press, Boca Raton 1985) beschrieben.
Die Regeneration von Protoplasten ist von Pflanzenart zu Pflanzenart verschieden, im Allgemeinen wird jedoch erst eine Suspension transformierter Protoplasten erzeugt, die Kopien der exogenen Sequenz enthalten. Bei manchen Arten kann dann aus der Protoplastensuspension eine Embryobildung eingeleitet werden bis zum Stadium des Reifens und der Keimung als natürliche Embryos. Das Kulturmedium kann verschiedene Aminosäuren und Hormone enthalten, wie Auxin und Cytokinine. Es kann auch vorteilhaft sein, Zu dem Medium Glutaminsäure und Prolin hinzuzufügen, besonders bei Arten wie Mais und Alfalfa. Sprosse und Wurzeln bilden sich normalerweise gleichzeitig. Eine wirksame Regeneration hängt vom Medium, dem Genotyp und der Vorgeschichte der Kultur ab. Wenn diese Variablen kontrolliert werden, ist die Regeneration völlig reproduzierbar und wiederholbar.
Bei vegetativ vermehrten Kulturen kann die entwickelte transgene Pflanze durch das Schneiden von Stecklingen oder durch Gewebekulturmethoden vermehrt werden, um mehrere identische Pflanzen für Versuche zu erhalten, wie Tests auf Eigenschaften der Produktion. Einer gewünschte transgene Pflanze wird ausgewählt und hierdurch werden neue Sorten erzielt und vegetativ für den gewerblichen Handel vermehrt. Bei über Samen vermehrten Pflanzen kann die entwickelte transgene Pflanze mit sich selbst gekreuzt werden, um eine homozygote Inzuchtpflanze zu erzeugen. Die Inzuchtpflanze erzeugt Samen, die das Gen für das neu eingebrachte fremde Maß an Genaktivität enthalten. Mit diesen Samen können Pflanzen produziert werden, die den gewählten Phänotyp haben. Die Inzuchtpflanzen können gemäß dieser Erfindung dazu verwendet werden, neue Hybride zu entwickeln. Bei dieser Methode wird eine gewählte Inzuchtlinie mit einer anderen Inzuchtlinie gekreuzt, um den Hybrid zu erzeugen.
Teile, die von der transgenen Pflanze gewonnen werden können, wie Blüten, Samen, Blätter, Äste, Früchte usw. sind in die Entdeckung einbezogen, vorausgesetzt, dass diese Teile Zellen enthalten, die auf diese Weise transformiert wurden. Nachkommenschaft, Varianten und Mutanten der regenerierten Pflanzen sind ebenfalls in den Umfang dieser Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt, dass diese die eingebrachten DNA-Sequenzen enthalten. Nachkommenschaft, Varianten und Mutanten der regenerierten Pflanzen sind ebenfalls in den Umfang dieser Erfindung eingeschlossen.
Die Wahl transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen kann auf einem Sichttest basieren, wie zu beobachtende Farbänderungen (z. B. weiße Blüten, variable Pigmentproduktion und einheitliche Farbmuster an Blüten oder unregelmäßige Muster), sie kann aber auch biochemische Tests entweder der Enzymaktivität oder der Produktquantifizierung einbeziehen. Transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen werden zu Pflanzen herangezogen, die den Pflanzenteil von Interesse tragen und die Genaktivitäten werden überwacht, wie z. B. über das sichtbare Erscheinungsbild (für Flavonoid-Gene) oder biochemische Tests (Northern-Blots), Western-Blots, Enzymtests und Untersuchung der Flavonoidzusammensetzung, einschließlich Spektroskopie, siehe Harbome et al. (Eds.), (1975) The Flavonoids, Vols. 1 and 2, [Acad. Press)). Geeignete Pflanzen werden ausgewählt und weiter bewertet. Methoden zur gentechnologischen Erzeugung von Pflanzen werden ausführlicher in US-Patent Nr. 5,283,184, US Patent Nr. 5, 482,852, und dem europäischen Patentantrag EP 693 554 beschrieben.
Andere Erythropoietin-Analoge
Bevorzugt haben EPO-Analoge mindestens eine Veränderung in den folgenden Aminosäuren: Asn24, Asn38, Asn83 oder Ser126. EPO-Analoge können auch zusätzliche Veränderungen in Aminosäure haben, wie unten erläutert.
In einer bevorzugten Ausführungsform unterscheidet sich das EPO in der Aminosäuresequenz an bis zu 1, 2, 3, 5, oder 10 Resten von der Sequenz von natürlich vorkommendem EPO Protein. Diese Veränderungen können zusätzlich zu den Veränderungen an Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 auftreten. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen unterscheidet sich das EPO in der Aminosäuresequenz an bis zu 1, 2, 3, 5, oder 10 % der Reste von einer Sequenz natürlich vorkommenden EPO Proteins. Diese Veränderungen können zusätzlich zu den Veränderungen an Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 auftreten. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Veränderungen so, dass das Erythropoietin-Analog die biologische Aktivität eines Erythropoietin zeigt, wenn es mit hSA fusiert wird. In bevorzugten Ausführungsformen sind mindestens eine oder alle Unterschiede konservative Aminosäureveränderungen. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind mindestens eine oder alle Unterschiede andere als konservative Aminosäureveränderungen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das EPOa eine Fragment eines Erythropoietin der vollen Länge, z. B. ein Terminalfragment an einer Sequenz von der eine Intervall-Subsequenz deletiert wurde.
In bevorzugten Ausführungsformen: Das Fragment ist mindestens 50, 60, 80, 100 oder 150 Aminosäuren lang; das Fragment hat die biologische Aktivität eines natürlich vorkommenden Erythropoietins; das Fragment ist entweder ein Agonist oder ein Antagonist der biologischen Aktivität eines natürlich vorkommenden Erythropoietin; das Fragment kann die Bindung von Erythropoietin an einen Rezeptor verhindern, z. B. kompetitiv oder nicht kompetitiv verhindern.
In bevorzugten Ausführungsformen hat das Fragment mindestens 60 und stärker bevorzugt mindestens 70, 80, 90, 95, 99, oder 10 % Sequenzidentität mit der entsprechenden Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden Erythropoietin.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Fragment ein Fragment eines Wirbeltiers, z. B. eines Säugetiers, z. B. eines Primaten, z. B. ein menschliches Erythropoietin.
In einer bevorzugten Ausführungsform unterscheidet sich das Fragment in der Aminosäuresequenz an bis zu 1, 2, 3, 5, oder 10 Resten von den entsprechenden Resten des natürlich vorkommenden Erythropoietin. Diese Veränderungen können zusätzlich zu den Veränderungen an Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 auftreten. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen unterscheidet sich das Fragment in der Aminosäuresequenz an bis zu 1, 2, 3, 5, oder 10 % der Reste von den entsprechenden Resten des natürlich vorkommenden Erythropoietins. Diese Veränderungen können zusätzlich zu den Veränderungen an Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 auftreten. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Unterschiede so, dass das Fragment die biologische Aktivität eines Erythropoietins zeigt, wenn es mit hSA fusiert wird. In bevorzugten Ausführungsformen sind mindestens eine oder alle Unterschiede konservative Aminosäureveränderungen. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind mindestens eine oder alle Unterschiede andere als konservative Aminosäureveränderungen.
Zu den Polypeptiden der Erfindung gehören die, die als Ergebnis alternativer translationaler und pos-transionaler Ereignisse entstehen.
Im Fach sind viele Analoge von EPO bekannt. Die Primärstruktur und Aktivität dieser Varianten kann als Richtlinie für das Einbringen zusätzlicher Veränderungen in ein EPOa dienen (zusätzlich zu Änderungen, die Glykosylierung modifizieren). Änderungen, die die Aktivität rezuzieren oder Glykosylierungsstellen schaffen, müssen vermieden werden.
Einige der EPO-Analoge, die im Fach bekannt sind, sind in Tabelle 1 unten angeführt. TABELLE 1
Obwohl hSA der bevorzugte Fusionspartner ist, können andere Polypeptide verwendet werden. Dies sind bevorzugt Polypeptide, die die Glykosylierung nicht unterstützen. Der Satz „die Glykosylierung nicht unterstützen" bezieht sich in diesem Dokument auf Polypeptide, die natürlich die Glykosylierung nicht unterstützen und Polypeptide, die so verändert werden, dass sie die Glykosylierung nicht unterstützen. Zum Beispiel kann der Fusionspartner ein lösliches Fragment von Ig sein, bevorzugt ein lösliches Fragment von Ig, das so modifiziert ist, dass es die Glykosylierung nicht unterstützt.
In allen hierin beschriebenen Ausführungsformen kann die hSA-Gruppe einer Fusion durch ein anderes Protein ersetzt werden, bevorzugt ein Protein, z. B. ein Plasmaprotein oder ein Fragment davon, das die Halbwertzeit des EPO oder eines EPOa im Kreislauf verbessert. Das Fusionsprotein kann z. B. ein EPOa-Immunglobulin (Ig) Fusionsprotein sein, in dem die EPOa-Sequenz an eine Sequenz gebunden ist, die von der Superfamilie der Immunglobuline abgeleitet wird. Mehrere lösliche Fusionsproteinkonstrukte wurden bekannt gegeben, wobei die extrazelluläre Domäne eines Glykoproteins an der Zellenoberfläche mit der konstanten F(c) Region eines Immunglobulins fusiert wird. Zum Beispiel bieten Capon et al. (1989) Nature 337(9):525-531 Richtlinien zur Erzeugung eines dauerhafteren CD4-Analogs durch die Fusion eines CD4 an ein Immunglobulin (IgGl). Siehe auch, Capon et al., U.S. Patentnummern: 5,116,964 und 5,428,130 (CD4-IgG Fusionskonstrukte); Linsley et al., U.S, Patent Nummer 5,434,13 (CTLA4-IgGl and B7-IgGl Fusionskonstrukte); Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-569 (CTLA4-IgGl Fusionskonstrukte); und Linsley et al. (1991)J. Exp. Med 173:721-730 (CD28-IgGl and B7-IgGl Fusionskonstrukte). Derartige Fusionsproteine haben sich als hilfreich bei der Modulation von Interaktionen zwischen Rezeptorliganden und bei der Reduktion von Inflammationen in vivo erwiesen. Zum Beispiel wurden in vivo Fusionsproteine verwendet, in denen eine extrazelluläre Domäne des Zelloberflächenproteins Tumor Necrosis Faktor Receptor (TNFR) mit einer konstanten (Fc) Immunglobulin-Region fusiert wurde. Siehe zum Beispiel Moreland et al. (1997) N. Engl. J. Med. 337(3):141-147; und van der Poll et al. (1997) Blood 89(10):3727-3734).
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Ein EPOa-hSA Fusionsprotein oder eine Nukleinsäure können in eine pharmazeutische Zusammensetzung inkorporiert werden, die zur Behandlung, z. B. Hemmung, Milderung, Vorbeugung oder Verbesserung eines Befundes geeignet ist, die durch ein unzureichendes Maß an EPO-Aktivität charakterisiert sind, einschließlich Befunde, in denen das Maß der EPO-Aktivität normal (aber dennoch unzureichend) ist und solchen, bei denen es geringer als normal ist.
Die Zubereitung der Erfindung wird bevorzugt einer Testperson verabreicht, die an Nierenversagen, chronischer Erkrankung, HIV-Infektion, Blutverlust oder Krebs leidet oder einem Patienten vor einem chirurgischen Eingriff. Die Zusammensetzung sollte eine therapeutische oder prophylaktische Menge des rekombinant erzeugten EPOa-hSA Fusionsproteins in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder in der Milch des transgenen nichtmenschlichen Tiers enthalten.
Der pharmazeutische Träger kann eine beliebige kompatible, nichttoxische Substanz sein, die zur Darreichung der Polypeptide an den Patienten geeignet ist. Es können steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe als Träger verwendet werden. Pharmazeutisch akzeptierbare Zusätze, Puffersubstanzen, Dispergierungsmittel usw. können ebenfalls in die pharmazeutischen Zusammensetzungen inkorporiert werden. Der Träger kann mit dem EPO-hAS Fusionsprotein in jeder Form kombiniert werden, die sich zur Verabreichung durch Injektion (gewöhnlich intravenös oder subkutan) oder auf andere Art eignet. Zur intravenösen Verabrreichung gehören zu den geeigneten Trägen z. B. physiologische Kochsalzlösungen, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Die Konzentration des auf transgenischem Weg erzeugten Peptids oder anderer aktiver Substanzen in der pharmazeutischen Zusammensetzung kann sehr unterschiedlich sein, d. h. von weniger als 0,1 Gewichtsprozent über normalerweise mindestens ungefähr 1 Gewichtsprozent bis zu 20 Gewichtsprozent oder darüber.
Zur intravenösen Verabreichung des EPO-hSA Fusionsprotein muss die Zusammensetzung steril und zu einem Ausmaß flüssig sein, das die leichte Verabreichung mit einer Spritze ermöglicht. Sie muss unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und vor kontaminierenden Wirkungen durch Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen geschützt werden. Der Schutz vor der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antimykotische Substanzen erreicht werden, z. B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal o. Ä. In vielen Fällen ist zu bevorzugen, isotonische Mittel, z. B. Zucker, Polyalkohole wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid zur Zusammensetzung zuzusetzen. Eine Langzeitabsorption der injizierbaren Zusammensetzung kann bewirkt werden, indem zu der Zusammensetzung ein Mittel hinzugesetzt wird, das die Absorption verzögert, z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
Bei oraler Verabreichung kann der Wirkstoff in festen Darreichungsformen verabreicht werden, wie z. B. Kapseln, Tabletten und Pulver oder in flüssigen Darreichungsformen wie Elixieren, Sirupen und Suspensionen. Die aktiven Komponenten können in Gelatinekapseln zusammen mit inaktiven Substanzen und pulverförmigen Trägern eingeschlossen werden, wie Glukose, Laktose, Sukrose, Mannitol, Stärke, Zellulose oder Zellulosederivate, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Natriumsaccharin, Talkum, Magnesiumcarbonat o. Ä. Beispiele für zusätzliche inaktive Inhaltsstoffe, die hinzugefügt werden können, um die gewünschte Farbe, den gewünschten Geschmack, die gewünschte Stabilität, Pufferkapazität, Dispersion oder andere bekannte gewünschte Eigenschaften zu erzielen sind rotes Eisenoxid, Kieselgel, Sodium Lauryl Sulfat, Titaniumdioxid, essbarer weißer Farbstoff o. Ä. Ähnliche Verschnittmittel können zur Herstellung gepresster Tabletten verwendet werden. Sowohl Tabletten als auch Kapseln können als Produkte mit Retardwirkung hergestellt werden, die das Medikament über mehrere Stunden kontinuierlich freisetzen. Gepresste Tabletten können mit Zucker oder einem Überzug beschichtet werden, die einen unangenehmen Geschmack überdeckt und die Tablette vor der Atmosphäre schützt, oder zum selektiven Auflösen im Verdauungstrakt enterisch beschichtet werden. Flüssige Darreichungsformen zur oralen Verabreichung können Farb- oder Geschmacksstoffe enthalten, um die Akzeptanz vonseiten des Patienten zu verbessern.
Zu nasalen Verabreichung können die Peptide als Aerosole formuliert werden. Der Begriff Aerosol beinhaltet alle gasgetragenen suspendierten Phasen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die in die Bronchiolen oder Nasenwege inhaliert werden können. Aerosole beinhalten insbesondere eine gasgetragene Suspension von Tröpfchen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie sie in einem Dosier-Inhalator oder -vernebler erzeugt werden oder in einem Feinsprüher. Aerosol beinhaltet auch eine Trockenpulverzusammensetzung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, die in Luft oder anderen Trägergasen suspendiert ist, die z. B. durch Insufflation von einem Inhalator verabreicht werden kann. Siehe Ganderton & Jones, Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood (1987); Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313 und Raeburn et al. (1992) J. Pharmacol. Toxicol. Methods 27:143-159.
Die Dosierung des EPOa-hSA Fusionsproteins der Erfindung kann sich von Person zu Person leicht unterscheiden, abhängig von dem bestimmten Peptid und seiner spezifischen Aktivität in vitro, dem Verabreichungsweg, des medizinischen Befunds, des Alters und des Geschlechts des Patienten, der Empfindlichkeit des Patienten auf das EPOa-hSA Fusionsprotein oder Komponenten des Trägers und anderen Faktoren, die der behandelnde Arzt leicht berücksichtigen kann.
EPOa-hSA kann in einem sterilen Behälter bereitgestellt werden, der eine Dialyselösung enthält, oder in einem sterilen Behälter, z. B. einem Beutel mit Kochsalzlösung, Blut, Plasma, einem Blutersatz oder anderen Komponenten, die einem Patienten verabreicht werden sollen.
Nutrazeutika
Ein EPOa-hSA Fusionsprotein kann in ein Nutrazeutikum integriert werden. Es enthält bevorzugt Milch oder Milchprodukte, die von einem transgenen nichtmenschlichen Säugetier gewonnen wurden, das das Fusionsprotein exprimiert. Es kann Pflanzen oder Pflanzenprodukte enthalten, die aus einer transgenen Pflanze gewonnen wurden, die das Fusionsprotein exprimiert. Das Fusionsprotein kann in Pulver- oder Tablettenform, mit oder ohne andere bekannte Zusätze, Träger, Füllstoffe oder Verschnittstoffe bereitgestellt werden. Nutrazeutika werden in Scott Hegenhart, Food Product Design, Dec. 1993 beschrieben. Die Nutrazeutika können Babynahrung sein. Sie können Komponenten einer transgenen Pflanze enthalten, die ein EPOa-hSA Fusionsprotein produziert.
Gentherapie
EPOa-hSA Konstrukte können als Teil eines Gentherapieprotokolls verwendet werden, in dem Nukleinsäuren bereitgestellt werden, die für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodieren.
Ein bevorzugter Ansatz für das Einbringen einer Nukleinsäure in eine Zelle in vivo erfolgt unter Verwendung eines Virenvektors, der die Nukleinsäure enthält, die für ein EPO-hAS Fusionsprotein kodiert. Die Infektion von Zellen mit einem Virenvektor hat den Vorteil, dass ein großer Anteil der beabsichtigten Zellen, die Nukleinsäure empfangen kann. Zusätzlich werden Moleküle, die innerhalb der Virenvektors kodiert werden, z. B. von einer im Virenvektor enthaltenen cDNA, wirksam in den Zellen exprimiert, die die Nukleinsäure des Virenvektors aufgenommen haben.
Retrovirusvektoren und Adeno-assoziierte Virenvektoren können als rekombinantes Genlieferungsystem für die Übertragung von exogenen Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, die in vivo für EPO-hAS Fusionsprotein kodieren. Diese Vektoren bieten die wirksame Lieferung von Nukleinsäuren in Zellen und die übertragenen Nukleinsäuren werden stabil in die chromosonale DNA des Wirts integriert. Die Entwicklung spezialisierter Zelllinien (genannt „Packaging Cells"), die nur replikationsdefekte Retroviren erzeugen, hat die Eignung von Retroviren für Zwecke der Gentherapie erhöht und defekte Retroviren werden zum Gebrauch in der Genübertragung für Gentheraphiezwecke bestimmt (für einen Überblick siehe Miller, A.D. (1990) Blood 76:271). Ein replikationsdefektes Retrovirus kann in Virionen gepackt werden, die zur Infizierung von Zielzellen unter Verwendung eines Helfervirus mit normalen Methoden verwendet werden können. Protokolle zur Erzeugung rekombinanter Retroviren und zum Infizieren von Zellen in vitro oder in vivo mit solchen Viren kann in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Abschnitte 9.10-9.14 und anderen Standardhandbüchern der Laborpraxis gefunden werden.
Ein weiteres virales Gentransfersystem, das in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, verwendet vom Adenovirus abgeleitete Vektoren. Das Genom eines Adenovirus kann so manipuliert werden, dass es für ein Genprodukt von Interesse kodiert und dieses exprimiert, jedoch insofern inaktiviert ist, dass es nicht in der Lage ist einen normalen lytischen Virenzyklus zu replizieren. Siehe zum Bespiel, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434 und Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Geeignete adenovirale Vektoren, die vom Adenovirus-Stamm Ad Typ 5 d1324 oder anderen Stämmen von Adenovirus (z. B. Ad2, Ad3, Ad7 usw.) abgeleitet wurden, sind fachkundigen Personen bekannt. Rekombinante Adenoviren können unter bestimmten Umständen von Vorteil sein, da sie nicht in der Lage sind, sich nicht teilende Zellen zu infizieren und da sie zum Infizieren einer umfangreichen Auswahl von Zelltypen verwendet werden können, einschließlich von Epithelzellen (Rosenfeld et al. (1992) s. o.). Darüber hinaus ist das Viruspartikel relativ stabil und kann leicht gereinigt und konzentriert und wie oben verändert werden, um sich auf das Spektrum der Infektivität auszuwirken. Zusätzlich wird eingebrachte adenovirale DNA (und darin enthaltene fremde DNA) nicht in das Genom einer Wirtszelle integriert sondern bleibt episomal, wodurch potentielle Probleme vermieden werden, die als Folge von insertionaler Mutagenese auftreten können, wenn eingebrachte DNA in das Wirtsgenom integriert wird (z. B. retovirale DNA). Darüber hinaus ist die Trägerkapazität des adenoviralen Genoms für fremde DNA im Vergleich zu anderen Gentransfervektoren groß (bis zu 8 Kilobasen) (Berkner et al. s. o.; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57:267).
Ein weiteres Virenvektorsystem, das zum Transfer der betreffenden Nukleotidsequenz nützlich ist, die für das EOP-hSA Fusionsprotein kodiert, ist das Adeno-assoziierte Virus (AAV). Das Adeno-assoziierte Virus ist ein natürlich auftretendes defektes Virus, das zur wirksamen Replikation und für einen produktiven Lebenszyklus ein anderes Virus wie ein Adenovirus oder ein Herpesvirus als Helfervirus benötigt. (Für einen Überblick siehe Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro.and Immunol. (1992) 158:97-129). Er ist auch einer der wenigen Viren, die ihre DNA in sich nicht trennende Zellen integrieren kann und eine große Häufigkeit stabiler Integration zeigt (siehe z. B. Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mot. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; und McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Vektoren mit nur 300 Basispaaren von AAV können verpackt und integriert werden. Platz für exogene DNA ist auf ungefähr 4,5 kb beschränkt. Ein AAV-Vektor, wie der in Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 beschriebene, kann zum Einbringen von DNA in Zellen verwendet werden. Eine Reihe von Nukleinsäuren wurden unter Verwendung von AAV-Vektoren in verschiedene Zelltypen eingebracht (siehe z. B. Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081, Wondisford et al. (1988) Mol Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619 und Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790).
Zusätzlich zu viralen Transfermethoden, wie den oben gezeigten, können auch nicht virale Methoden verwendet werden, um die Expression von EPO-hSA Fusionsprotein im Gewebe nichtmenschlicher Tiere zu bewirken. Die meisten nicht viralen Methoden zum Gentransfer verlassen sich auf normale Mechanismen, die von Säugetierzellen zur Aufnahme und zum intrazellulären Transport von Makromolekülen verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen verlassen sich nicht virale Gentransfersysteme der vorliegenden Erfindung auf endozytische Wege zur Aufnahme des betreffenden Nukleotidmoleküls durch die beabsichtigte Zelle. Zu den beispielhaften Gentransfersystemen diesen Typs gehören von Liposomen abgeleitete Systeme, Polylysin-Konjugate und künstliche Virushüllen.
In einer repräsentativen Ausführungsform kann ein Nukleinsäuremolekül, das für EPO-hSA Fusionsprotein kodiert, in Liposomen festgehalten werden, die positive Ladungen an der Oberfläche haben (z. B. Lipofektine) und die (optional) mit Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene des Zielgewebes getaggt sind (Mizuno et O. (1992) No Shinkei Geka 20:547-551, PCT Veröffentlichung W091/06309, japanischer Patentantrag 1047381 und europäische Patentveröffentlichung EP-A-43075).
Gentransfersysteme für ein Gen, das für ein EPO-hSA Fusionsprotein kodiert können in einen Patienten mit Hilfe mehreren Methoden eingebracht werden. Zum Beispiel kann eine pharmazeutische Zubereitung des Gentransfersystems systematisch eingebracht werden, z. B. durch intravenöse Injektion und die spezifische Transduktion des Proteins in die Zielzellen geschieht überwiegend abhängig von der Spezifität der Transfektion, die vom Gentransferträger bereitgestellt wird, dem Zelltyp oder der Zelltypexpression aufgrund der transkriptionalen regulatorischen Sequenzen, die die Expression des Rezeptorgens kontrollieren oder einer Kombination dieser. In weiteren Ausführungsformen ist der erste Transfer des rekombinanten Gens begrenzter, wenn das Einbringen in das Tier sehr lokalisiert ist. Zum Beispiel kann der Gentransferträger mit Hilfe eines Katheter eingebracht werden (siehe U.S. Patent 5,328,470) oder durch stereotaktische Injektion (z. B. Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057).
Die pharmazeutische Zubereitung der Gentherapiekonstrukts kann im Wesentlichen aus dem Gentransfersystem und einem akzeptablen Verdünnungsmittel bestehen oder kann eine Matrix für Retardwirkung enthalten, in die der Gentransferträger eingebettet ist. Wenn das Fusionsprotein intakt aus rekombinanten Zellen erzeugt werden kann, z. B. retroviralen Vektoren, kann die pharmazeutische Zubereitung eine oder mehrere Zellen enthalten, die das Fusionsprotein produzieren.
Weitere Ausführungsformen
Andere transgene nichtmenschliche Tiere
EPOa-hSA Fusionsprotein kann aus einer Anzahl transgener nichtmenschlicher Tiere exprimiert werden. Ein Protokoll für die Produktion eines transgenen Schweins kann in White and Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Foram in Immunology, pp. 88-94; US Patent Nr. 5,523,226; US Patent Nr. 5,573,933; PCT Antrag W093/25071 und PCT Antrag W095104744 gefunden werden. Ein Protokoll für die Produktion einer transgenen Maus kann in US Patent Nr. 5,530,177 gefunden werden. Ein Protokoll für die Produktion einer transgenen Ratte kann bei Bader and Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3:S81-S87, 1996 gefunden werden. Ein Protokoll für die Produktion einer transgenen Kuh kann in Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc gefunden werden. Ein Protokoll für die Produktion eines transgenen Schafs kann in Transgenic Animal Technology, A Handbook 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc gefunden werden. Ein Protokoll für ein transgenes Kaninchen kann in Hammer et al., Nature 315:680-683, 1985 und Taylor and Fan, Frontiers in Bioscience 2:d298-308, 1997 gefunden werden.
Ausführungsformen der Erfindung werden weiterhin durch die folgenden Beispiele illustriert, die nicht als begrenzend angesehen werden dürfen.
BEISPIELE
Beispiel 1: EPOa-hSA Fusionskonstrukte
Die cDNA, die für das menschliche Erythropoietin-Analog kodiert, das in den EPOa-hSA Fusionen verwendet wird, wurde entworfen und gefertigt, um die drei N-Glykosylierungstellen und die eine O-Glykosylierungstelle (Reste 24, 38, 83 und entsprechend 126) zu verändern. Weiterhin wurde die Codonnutzung geändert ohne die verbleibenden Aminosäurereste zu verändern, indem eine Codonnutzungstabelle für Proteine der Milchdrüse verwendet wurde, um die Proteinexpression in der Milch transgener Tiere zu maximieren. Eine schematische Darstellung der Fusionskonstrukts ist in 1 gezeigt. In den Fällen in denen das hSA die N-Terminalhälfte des Fusionsproteins ist, wurde das Signalpeptid des hSA intakt gelassen und das Signal des menschlichen Erythropoietin-Analogs wurde deletiert. Wenn das menschliche Erythropoietin-Analog der N-Terminalteil der Fusion ist, wurde seine Signalsequenz intakt gelassen und die des hSA Proteins wurde deletiert. Im ersten Fall wurde auch das hSA Stoppcodon des Wildtyps entfernt, sowie das der menschlichen Erythropoietin-Analog cDNA im zweiten Konstrukt. Außerdem wurde ein Linker-Protein (Ser-Gly₄)₄ oder Gelenk zwischen die beiden Fusionspartner gesetzt, um störende Behinderungen zu minimieren, die das hSA auf den EPO-Teil des Moleküls und damit auf seine Aktivität haben könnte.
Die cDNA Fusionskonstrukte wurden in die geeigneten Vektoren zur Expression in Gewebekulturen und in der Milchdrüse transgener Mäuse gebracht. Durch die transiente Expression dieser Konstrukte in Gewebekultur (COS7-Zellen), können eine Anzahl wichtiger Eigenschaften der Produkte dieser cDNA Fusionen untersucht werden, z. B. (1) werden die Proteine erzeugt und ausgeschieden? (2) sind diese Proteine authentisch und durch Antiseren gegen EPOa und hSA erkennbar? (3) sind diese Proteine in vitro und in vivo bioaktiv?
Beispiel 2: COS7 Zelltransfektionen/Western-Blot-Analyse
COS7-Zellen wurden transient mit Fusions-cDNA Konstrukten in Dreifachplatten oder einer einzelnen Platte mit nur dem Vektor (pcDNA3) transfiziert.24 Stunden nach der Transfektion wurden die Medien mit einem reduzierten Serummedium (Optimem) ersetzt. Nach fünf Tagen wurden alle Medien geerntet und kontaminierende Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt. Proben der konditionierten Medien wurden dann mit Hilfe von SDS-PAGE und Immunblotting analysiert (siehe 2).
Überstände von COS-Zellen, die nur mit HIP/pcDNA3-Konstrukten oder pcDA transfiziert wurden („Mock"), wurden durch Immunblotting mit einem polyklonalen Antikörper gegen Humanalbumin (∀-hSA) analysiert. Nach der Analyse mit dem hAS-Antikörper wurde der Blot „gestrippt" und mit einem monoklonalen Antikörper gegen menschliches Erythropoietin (∀-hEPO) erneut analysiert. Das Gel wurde folgendermaßen geladen: Spur 1, 10 ng hSA Standard; Spur 2, 10 μl „Mock" CM; Spur 3-5, 10 μl hSA-hEpo CM; Spur 6-8, 10 μl hEpo-hSA CM.
Die Ergebnisse der Western-Blotting-Versuche wiesen deutlich darauf hin, dass ein lösliches ausgeschiedenes Protein erzeugt wurde. Beide Fusionsproteine sind von der entsprechenden vorhergesagten Größe (~ 89 kDa). Das in den konditionierten Medienspuren erkennbare Band im hAS-Antibody-Blot stellt nicht hSA (~ 66 kDA) sondern bSA dar, da dieser Antikörper Kreuzreaktivität mit dem bSA aus dem verwendeten Gewebekulturmedium hat. Am wichtigsten ist jedoch die Fähigkeit der beiden Antikörper, beide Fusionsproteine zu erkennen. Dies weist darauf hin, dass eine richtige Translatation der gesamten mRNAs des Fusionskonstrukts erreicht wurde, wobei die geeigneten Epitope intakt und für die Antikörper zugänglich blieben.
Beispiel 3: Bioaktivität
Mit den gleichen ∀-hSA Antikörpern, die in der Western-Blot-Anslyse oben verwendet wurden, wurde eine ELISA durchgeführt, um die Konzentrationen der beiden Fusionsproteine im Gewebekulturüberstand zu bestimmen. Entsprechend der Ergebnisse aus der Western-Blot zeigte sich, dass der Gehalt des EPOa-Linker-hAS Fusionsproteins ungefähr 4 Mal höher war als der des hSA-Linker-EPOa Fusionsproteins (232 ng/ml im Vergleich zu 59 ng/ml). Diese Gehalte sollten genügend Produkt bereitstellen, um die Bioaktivität in vitro und möglicherweise in vivo zu bewerten. Wenn die EPOa-Fraktion der Fusionsproteine 20 % der Gesamtgröße des Moleküls beträgt stellen 232 ng/ml ungefähr 10 U/ml hEPO-hSA Fusionsprotein dar [(2,1 × 10⁵ U/mg) 2,32 × 10^-4 mg/ml) (0,2) = 9,7 U/ml]. In vitro wird EPOa-Aktivität mit Hilfe von EPO-responsiven Zellinien bewertet. Kurzgefasst werden Zellen 22-27 Stunden mit zunehmenden Mengen an rekombinantem EPOa-hSA Fusionsprotein inkubiert und das Zellwachstum wird anhand der [³H]-Thymidinaufnahme oder durch colorimetrische MTT-Versuche (Sigma) festgestellt.
EPOa-hSA Fusionsprotein kann unter Verwendung von Kationenaustauschchromatographie schnell bis fast zur Homogenität aufgereinigt werden, wobei gut ausgeprägte Bindungseigenschaften von hSA genutzt werden. Fusionsproteine können gegebenenfalls konzentriert und an Mäusen getestet werden. Mäuse können subkutan mit Fusionsproteinen injiziert werden (nach Möglichkeit mit 3 × 50 ng/Maus Gesamt-EPOa) und die Empfindlichkeit kann durch das Feststellen der Veränderungen in den Reticulozytenzahl oder des Hämatokritgehalts festgestellt werden. Direkte intramuskuläre Injektion in hohen Konzentrationen (>100 μg) der auf pcDNA3basierenden Plasmid-DNA und darauffolgende Beobachtung der Veränderungen im Reticulozyten- und Hämatokritgehalt kann als Versuch in vivo verwendet werden. Es zeigte sich, dass die Plasmidinjektion den Hämokritgehalt bei Mäusen deutlich ansteigen ließ, wenn die hEpo cDNA des Wildtyps verwendet wurde, die vom Cytomegalovirus-Promotor (CMV) exprimiert wird.
Beispiel 4: Erzeugung eines Fusionsproteinkonstrukts aus Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA)
cDNA die für das EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert wurde in den BC355 Vektor eingebracht, der die regularorischen Elemente des beta-Kaseingens aus der Ziege enthält, wodurch ein Transgen erzeugt wurde, das die Sequenz des EPOa-hSA Fusionsproteins unter der Kontrolle eines milchspezifischen Promotors hat. Dieses Konstrukt wurde dazu verwendet, die Expression des EPOa-hSA Fusionsproteins auf die laktierende Milchdrüse eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers zu richten.
Beispiel 5: Testen und Charakterisierung von Genkonstrukten in transgenen Mäusen
Transgenkonstrukte werden allgemein in einem Mausmodellsystem getestet, um ihre Fähigkeit zu testen, eine hohe Expression zu steuern und ihre Fähigkeit, auf gewebespezifische Weise zu exprimieren. Transgene Mäuse wurden mit der Expression von EPOa-hSA Fusionen erzeugt, die auf die Milchdrüse gerichtet waren.
Transgenen Mäuse wurden durch die Injektion in Mausembryos von DNA-Konstrukten erzeugt, die für Fusionsproteine kodieren. Western-Analyse der Milch des EPOa-hSA Fusionsproteins transgener Mäuse wurde mit Hilfe monoklonaler anti-EPO- oder Anti-hSA-Antikörper durchgeführt, um festzustellen, welche Tiere EPOa-hSA Fusionsprotein in der Milch exprimieren. Der Gehhalt des festgestellten EPOa-hSA Fusionsprotein reichte von ungefähr 0,2 mg/ml bis 4 mg/ml.
Beispiel 6: Bioaktivität von EPOa-hSA in transgenen Mäusen
Die Bioaktivität des EPOa-hSA Fusionsproteins wurde analysiert, indem die Veränderungen im Hämatokritgehalt transgener Mäuse festgestellt wurden, die das EPOa-hSA Fusionsprotein exprimieren. Siehe Tabelle 1. Die Hämatokritgehalte der transgenen Mäuse (655-1-8, 655-1-16, 655-1-43) wurden mit dem Gehalt in Kontrollmäusen verglichen (CD 1 Mäuse). Die normalen Hämatokritgehalte liegen bei ca. 50. TABELLE 1 TRANSGENE MÄUSE, DIE EPOA-HSA FUSIONSPROTEIN EXPRIMIEREN
Wie in Tabelle I gezeigt, ist erhöht die Expression des EPOa-hSA Fusionsproteins in transgenen Mäusen den Hämatokritgehalt in den Mäusen wesentlich.
Zusätzlich bietet Tabelle II die Hämatokritgehalte jungfräulicher Nachkommen der transgenen Founder-Mäuse und Hämatokritgehalte der Founder-Männchen (678-1-11 und 678-1-23), um die Expression von EPOa-hSA und die Bioaktivität von EPOa-hSA in diesen Mäusen zu zeigen.
Tabelle II Hämatokritgehalte in den jungfräulichen Nachkommen von transgenen Founder-Mäusen, die das EPOa-hSA Fusionsprotein exprimieren
Die Hämatokritgehalte der Nachkommen bieten Ausgangswerte der Expression von EPOa-hSA unter der Kontrolle eines Kaseinpromotors. Wie in Tabelle II gezeigt, haben selbst geringe Expressionswerte von EPOa-hSA Fusionsproteinen eine signifikante Wirkung in vivo.
Beispiel 7: Erzeugung und Charakterisierung transgener Ziegen.
Die unten dargelegten Abschnitte beschreiben kurz die wichtigsten Schritte zur Erzeugung von transgenen Ziegen.
Ziegenarten und -rassen:
Ziegen schweizer Ursprungs, z. B. Ziegen der Rassen Alpenziege, Saanenziege und Toggenburger Ziege werden bei der Erzeugung transgener Ziegen bevorzugt.
Superovulation bei der Ziege
Die Zeit des Östrus in den Spendern wird an Tag 0 durch 6 mg subkutane Norgestomet-Ohrenimplantate (Syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc., Overland Park, KS) synchronisiert. Prostaglandin wird nach den ersten sieben oder neun Tagen verabreicht, um die endogene Synthese von Progesteron zu stoppen. Ab Tag 13 nach dem Einsetzen des Implantats werden insgesamt 18 mg follikelstimulierendes Hormon (FSH – Schering Corp.,
Kenilworth, NJ) drei Tage lang durch Injektionen zwei Mal pro Tag intramuskulär verabreicht. Das Implatat wird am 14.Tag entnommen. Vierundzwanzig Stunden nach der Entnahme des Implantats werden die Spendertiere innerhalb eines Zeitraums von 2 Tagen mehrfach mit fruchtbaren Männchen gepaart. (Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205).
Ernte nichtmenschlicher Embryos
Der chirurgische Eingriff zur Ernte nichtmenschlicher Embryos findet am zweiten Tag nach der Paarung (oder 72 Stunden nach Entfernen des Implantats) statt. Superovulierte Weibchen bekommen ab 36 Stunden vor der Operation weder Futter noch Wasser. Den Weibchen wird 0,8 mg/kg Diazepam (Valium^®) IV und danach sofort 5,0 mg/kg Ketamine (Keteset), IV verabreicht. Halothan (2,5 %) wird während des Eingriffs in 2 l/min Sauerstoff über einen Endotrachealtubus verabreicht. Der Fortpflanzungstrakt wird durch einen laparotomischen Schnitt entlang der Mediallinie herausgenommen. Die Corpora lutea, nicht gesprungene Follikel mit einem Durchmesser von mehr als 6 mm und die Ovarialzysten werden gezählt, um die Ergebnisse der Superovulation zu bestimmen und die Anzahl der Embryonen voraussagen zu können, die durch eine Eileiterspülung geerntet werden sollten. In das Ostium des Eileiters wird eine Kanüle gelegt und mit einer einzelnen temporären Naht mit 3,0 Prolen befestigt. Eine Nadel der Stärke 20 wird in die Gebärmutter geführt, ungefähr 0,5 cm von der uterotubalen Verbindung. 10 bis 20 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wird durch den Eileiter mit der eingelegten Kanüle gespült und in einer Petrischale gesammelt. Dieses Verfahren wird auf der anderen Seite wiederholt, dann wird der Fortpflanzungstrakt wieder in die Bauchhöhle gelegt. Vor dem Schließen werden 10-20 ml steriler Glycerol-Kochsalzlösung in die Bauchhöhle gegossen, um ein Anhaften zu verhindern. Die Linea alba wird mit einfachen unterbrochenen Stichen mit 2,0 Polydioxanone oder Supramid geschlossen und die Haut wird mit sterilen Wundklammern geschlossen.
Befruchtete Ziegeneier werden von der PBS-Eileiterspülung auf ein Stereomikroskop gebracht und dann in Ham's F12 medium (Sigma, St. Louis, MO) mit 10 % Serum von Kälberföten (fetal bovine serum – FBS) gewaschen, das von Sigma bezogen wird. In Fällen, in denen Pronuklei sichtbar sind, wird der Embryo sofort mikroinjiziert. Wenn keine Pronuklei sichtbar sind, können die Embryos in Ham's F12 mit 10 % FBS gelegt und bei 37 C in eine feuchtigkeitsgesättigte Luftkammer mit 5 % CO2 in Luft kurzzeitig kultiviert werden, bis die Pronuklei sichtbar werden (Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205).
Mikroinjektionsverfahren:
Einzellige Ziegenembryos werden in einen Mikrotropfen von Medium unter Öl auf einen Hohlschliffobjektträger aufgebracht. Befruchtete Eier mit zwei sichtbaren Pronuklei werden in einer flammpolierten Mikropipette an einem aufrechten Zeiss-Mikroskop mit festem Tisch und Normarski-Optik immobilisiert. Ein Pronkleus wird mit dem DNA-Konstrukt von Interesse in Injektionspuffer (Tris-EDTA) unter Verwendung einer dünnen Mikronadel aus Glas mikroinjiziert z. B. einem BC355-Vektor, der das Fusionsproteingen für menschliches Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA) enthält, das operativ mit den regulatorischen Elementen des beta-Kaseingens aus der Ziege verknüpft ist. (Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205).
Entwicklung des nichtmenschlichen Embryos:
Nach der Mikroinjektion werden die überlebenden nichtmenschlichen Embryos in eine Kultur aus Ham's F12 mit 10 % FBS gelegt und dann in einer feuchtigkeitsgesättigten Luftkammer mit 5 % CO2 in Luft bei 37 °C inkubiert bis die nichtmenschlichen Empfängertiere auf den Embryotransfer vorbereitet sind (Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. p.115-1205).
Vorbereitung der Empfängertiere:
Die Östrussynchronisation in den Empfängertieren wird durch 6 mg Norgestomet-Ohrtransplantate (Syncromate-B) eingeleitet. Am 13. Tag nach dem Einpflanzen des Implatats wird den Tieren eine einzelne nicht superovulatorische Injektion (400 I.U.) vom Serum schwangerer Stuten Gonadotropin (PMSG) verabreicht, das von Sigma bezogen wird. Empfängerweibchen werden mit vasektomierten Männchen gepaart, um die Östrus-Synchronität sicherzustellen (Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205).
Transfer nichtmenschlicher Embryonen:
Alle nichtmenschlichen Embryos eines Spenderweibchens werden zusammengehalten und nach Möglichkeit in einen einzigen Empfänger übertragen. Das chirurgische Verfahren ist identisch mit dem oben für die Embryoernte beschriebenen, nur wird keine Kanüle in den Eileiter eingeführt und die nichtmenschlichen Embryonen werden über die Fimbrie mit einer Mikropipette aus Glas in einem minimalen Volumen von Ham's F12 mit 10 % FBS in das Eileiterlumen eingeführt. Nichtmenschliche Tiere mit mehr als sechs bis acht Ovulationspunkten an den Eierstöcken werden als ungeeignet für Empfänger angesehen. Der Wundverschluss und die Versorgung nach der Operation entspricht denen für die Spendertiere (siehe z. B. Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205).
Überwachung der Schwangerschaft und Geburt:
Die Schwangerschaft wird nach 45 Tagen nach dem ersten Tag des Duldungsöstrus durch Ultraschall festgestellt. Am 110. Tag wird eine zweite Ultraschalluntersuchung durchgeführt, um die Schwangerschaft zu bestätigen und Stress des Fötus festzustellen. Am 130. Tag wird die schwangere Empfängerziege mit Tetanus-Toxoid und Clostridium C&D geimpft. Selen und Vitamin E (Bo-Se) werden intramuskulär und Ivermectin wurde subkutan verabreicht. Die Weibchen werden am 145. Tag in einen sauberen Stall gebracht und können sich an diese Umgebung akklimatisieren bevor ungefähr am 147. Tag die Wehen eingeleitet werden. Die Geburt wird am 147. Tag mit 40 mg PGF2a (Lutalyse^®, Upjohn Company, Kalamazoo Michigan) eingeleitet. Diese Injektion wird intramuskulär in zwei Dosen gegeben; eine Dosis von 20 mg, gefolgt von einer weiteren Dosis von 20 mg nach vier Stunden. Das Weibchen wird am Tag und am Abend nach der ersten Injektion mit Lutalyse^® an Tag 147 in Abständen beobachtet. Die Beobachtung wird mit Beginn des Morgens des zweiten Tags auf alle 30 Minuten erhöht. Die Geburt erfolgte zwischen 30 und 40 Stunden nach der ersten Injektion. Nach der Geburt wird die Ziege gemolken, um das Colostrum zu sammeln und der Abgang der Plazenta wird bestätigt.
Bestätigung der transgenen Natur der F0 Tiere:
Zur Untersuchung auf transgene F0 Tier wird genomische DNA aus zwei verschiedenen Zelllinien isoliert, um keine Mosaik-Transgenik zu übersehen. Ein Mosaiktier wird als eine beliebige Ziege definiert, die nicht mindestens eine Kopie des Transgens in jeder Zelle hat. Daher wird eine Gewebeprobe aus den Ohr (Mesoderm) und eine Blutprobe von den zwei Tage alten F0-Tieren entnommen, um die genomische DNA isolieren zu können (Lacy, et al., A Laboratory Manual, 1986, Cold Springs Harbor, NY und Herrmann and Frischauf Methods Enzymology, 1987. 152: pp. 180-183). Die DNA-Proben werden durch die Polymerase-Kettenreaktion analysiert (Gould, et al. Proc. Natl. Acad. Sci, 1989. 86:pp. 1934-1938), wobei Primer verwendet werden, die für das Human-EPOa-hSA Fusionsproteingen spezifisch sind und durch Southern-Blot-Analyse (Thomas, Proc Natl. Acad. Sci., 1980. 77:5201-5205), wobei eine zufällig geprimte EPO- oder cDNA- Sonde verwendet wird (Feinberg and Vogelstein, Anal. Bioc., 1983. 132: pp. 6- 13). Die Versuchsempfindlichkeit wird auf die Feststellung einer Kopie des Transgens in 10 % der somatischen Zellen geschätzt.
Erzeugung und Wahl einer Produktionsherde
Die oben beschriebene Methode kann sowohl zur Produktion transgener primärer Ziegen (F0) als auch anderer transgener Ziegen verwendet werden. Die transgenen F0 Founder-Ziegen werden z. B. auf Milchproduktion gezüchtet, wenn sie weiblich sind, oder auf die Zeugung transgener weiblicher Nachkommen, wenn es sich um Founder-Ziegenböcke handelt. Dieser trangene FounderBock kann mit nicht transgenen Weibchen gepaart werden, um transgene weibliche Nachkommen zu erzeugen.
Übertragung von Transgenen und wichtige Eigenschaften
Die Übertragung des Transgens von Interesse wird in der Ziegenlinie im Ohrengewebe und im Blut durch PCR und Southern-Blot-Analyse analysiert. Zum Beispiel zeigt die Southern-Blot-Analyse des Founder-Männchens und der drei transgenen Nachkommen keine Neuanordnung oder Veränderung in der Anzahl der Kopien zwischen Generationen. Die Southern-Blots werden mit einer cDNAs Sonde menschlichen EPOa-hSA Fusionsproteins getestet. Die Blots werden auf einem Betascope 603 analysiert und die Kopienzahl wird durch den Vergleich des Transgens mit dem beta-Kasein endogenen Gens aus der Ziege verglichen.
Bestimmung des Expressionsanteils
Der Expressionsanteil des transgenen Proteins in der Milch eines nichtmenschlichen transgenen Tiers wird anhand enzymatischer Tests oder Western-Blots festgestellt.
Andere Ausführungsformen werden in den folgenden Ansprüchen erwähnt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Fusionsprotein aus menschlichem Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hAS), in dem mindestens ein Aminosäurerest der menschlichen Erythropoietin-Analog (EPOa) Gruppe so verändert wurde, dass eine Stelle, die im Wildtyp des menschlichen Erythropoietins (EPO) als Glykosylierungsstelle dient, im EPOa nicht als Glykosylierungsstelle dient, wobei der besagte Aminosäurerest das EPOa-Äquivalent eines EPO-Rests ist, der aus der Gruppe gewählt wurde, die aus den Aminosäuren Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 besteht.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei das besagte Fusionsprotein die folgende Formel hat: R1-L-R2; R2-L-R1 oder R1-L-R2-L-R1, wobei R1 eine Aminosäuresequenz des Erythropoietin-Analogs, L1 ein Peptidlinker und R2 eine Humanalbumin-Sequenz ist.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei der besagte Aminosäurerest deletiert wurde.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei der besagte Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest ersetzt wurde, der nicht als Glykosylierungsstelle dient.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei die besagte Glykosylierungsstelle am EPOa-Äquivalent des Aminosäurerest Ser126 des Wildtyp-EPO verändert ist und mindestens eine zusätzliche N-Glykosylierungsstelle, gewählt aus der Gruppe, die aus dem EPOa-Äquivalent des Wildtyp-EPO Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 besteht, verändert wurde.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei die besagte Glykosylierungsstelle N-Glykosylierung ermöglicht und durch das Ersetzten eines Aminosäurerest Ans durch Gln verändert wurde.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei die besagte Glykosylierungsstelle O-Glykosylierung ermöglicht und durch das Ersetzten eines Aminosäurerest Ser durch Gln verändert wurde.
Das EPOa has Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei mindestens ein EPOa-Äquivalent der Aminosäurereste 24, 38, oder 83 des EOP-Wildtyps verändert wurde.
Das EPOa-has Fusionsprotein aus Anspruch 8, wobei mindestens ein EPOa-Äquivalent der Aminosäurereste 24, 38, oder 83 des EOP-Wildtyps durch Gln ersetzt wurden.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei das EPOa-Äquivalent des Aminosäurerest 126 des EPO-Wildtyps verändert wurde.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 10, wobei das EPOa-Äquivalent des Aminosäurerest 126 des EPO-Wildtyps durch Ala ersetzt wurde.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei jedes EPOa-Äquivalent der Aminosäurereste 24, 38, 83 und 126 des EPO-Wildtyps so verändert wurde, dass es nicht als Glykosylierungsstelle dient.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 12, wobei jedes EPOa-Äquivalent der Aminosäurereste 24, 38, 83 und 126 des EPO-Wildtyps durch Gln, Gln, Gln bzw. Ala ersetzt wurde.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 2, wobei der besagte Peptidlinker 10 bis 30 Aminosäuren lang ist.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 14, wobei jede der besagten Aminosäuren in dem besagten Peptilinker aus der Gruppe gewählt wurde, die sich aus Gly, Ser, Asn, Thr und Ala zusammensetzt.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 2, wobei der besagte Peptidlinker eine Sequenz mit der Formel (Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)y enthält, wobei y gleich oder kleiner als 8 ist.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 2, wobei der besagte Peptidlinker eine Sequenz mit der Formel ((Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3-Ser-Pro) enthält.
Das EPOa-hSA-Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein von links nach rechts ein EPOa enthält, das die Aminosäurereste (Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126) der Aminosäurereste Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 des Wildtyp-EPOs, einen Peptidlinker und Humanalbumin enthält.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein von links nach rechts ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und Humanalbumin ist.
Das EPOa-hSA-Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei das EPOa-hSA Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, einen Peptidlinker und ein EPOa enthält, das die Aminosäurereste (Gln24, Gln38, Gln83 und Ala126) der Aminosäurereste Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 des Wildtyp-EPOs und enthält.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, 18 oder 20, wobei das EPO ein Gln24, Gln38, GLn83, Ala126 EPO ist.
Das EPOa-hSA Fusionsprotein aus Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein von links nach rechts Humanalbumin, ein Peptidlinker mit der Formel ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro) und ein Gln24, Gln38, Gln83, Ala126 EPO ist.
Eine isolierte Nukleinsäure, die aus einer Nukleotidsequenz besteht, die für ein Fusionsprotein aus einem menschliches Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA) kodiert, wobei mindestens ein Aminosäurerest der für EPOa-hSA kodiert, der als Glykosylierungsstelle in EPO dienen kann, verändert wird, so dass er im EPOa nicht als Glykosylierungsstelle dient, wobei der besagte Aminosäurerest das EPOa-Äquivalent eines Rests von einem Wildtyp-EPO ist, der aus der Gruppe gewählt wurde, die aus den Aminosäureresten Asn24, Asn38, Asn83 und Ser126 besteht.
Ein Expressionsvektor oder ein Konstrukt, das die Nukleinsäure aus Anspruch 23 enthält.
Eine isolierte Zelle, die den Vektor oder den Konstrukt aus Anspruch 24 enthält.
Eine Methode zur Herstellung eines Fusionsproteins aus menschlichem Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA) gemäß Anspruch 1 in einem Konstrukt oder einem Vektor, der die Bildung einer Sequenz in einem Konstrukt oder einem Vektor enthält, in der eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein EPOa kodiert, in-frame mit einer Nukleinsäure verknüpft wird, die eine Nukleinsequent enthält, die für Humanalbumin kodiert.
Eine Methode zur Herstellung eines Fusionsproteins aus menschlichem Erythropoietin und Humanalbumin (EPOa-hSA) gemäß Anspruch 1, die aus folgendem besteht: das Bereitstellen einer isolierten Zelle, die eine Nukleinsäure enthält, die für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert und die Expression des besagten EPOa-hSA Fusionsproteins aus der besagten Nukleinsäure, wodurch das besagte EPOa-hSA Fusionsprotein hergestellt wird.
Die Methode von Anspruch 27, wobei die besagte isolierte Zelle aus einer Gruppe gewählt wird, die aus Säugetier-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Bakterienzellen besteht.
Eine Methode zur Herstellung eines Fusionsproteins aus menschlichem Erythropoietin und Humanalbumin (EPOa-hSA) gemäß Anspruch 1 aus folgendem besteht: das Bereitstellen eines nichtmenschlichen transgenen Organismus, der ein Gen enthält, das die Expression von EPOa-hSA Fusionsproteinen steuert, das Ermöglichen der Expression des Transgens und die Gewinnung von EPOa-hSA Fusionsprotein.
Eine Methode zur Bereitstellung einer transgenen Zubereitung, zu der ein Fusionsprotein aus menschlichem Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA) in der Milch gemäß Anspruch 1 eines nichtmenschlichen transgenen Tiers gehört, die Folgendes umfasst: das Bereitstellen eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers mit einer für das EPOa-hSA Fusionsprotein kodierenden Sequenz, die operativ mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, die zur Expression der für das Protein kodierenden Sequenz in den Epithelzellen der Milchdrüse führt. das Ermöglichen der Expression des Fusionsproteins und der Gewinnung von Milch aus dem Säugetier, wodurch die transgene Zubereitung bereitgestellt wird.
Die Methode in Anspruch 29 oder 30, wobei der transgene nichtmenschliche Organismus ein transgenes nichtmenschliches Tier ist
Die Methode in Anspruch 29 oder 30, wobei der transgene nichtmenschliche Organismus ein transgenes Milchsäugetier ist.
Die Methode in Anspruch 29 oder 30, wobei das EPOa-hSA Fusionsprotein in einer Milchdrüse eines transgenen nichtmenschlichen Tiers unter Kontrolle eines spezifischen Milchpromotors hergestellt wird.
Die Methode in Anspruch 29 oder 30, wobei der besagte Promotor ein Milchserumprotein- oder Kasein-Promotor ist.
Die Methode in Anspruch 34, wobei das transgene nichtmenschliche Tier eine Ziege oder eine Kuh ist.
Ein nichtmenschlicher transgenenr Organismus, der ein Transgen enthält, das gemäß Anspruch 1 für ein Fusionsprotein aus menschlichem Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA) kodiert.
Ein transgenes Kaninchen, das ein Transgen enthält, das gemäß Anspruch 1 für ein Fusionsprotein aus menschlichem Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA) kodiert.
Ein Vogel, der ein Transgen enthält, das gemäß Anspruch 1 für ein Fusionsprotein aus menschlichem Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA) kodiert.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die gemäß Anspruch 1 eine therapeutisch wirksame Menge Fusionsprotein aus menschlichem Erythropoietin-Analog und Humanalbumin (EPOa-hSA) enthält.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Fusionsproteins aus menschlichem Erythropoietin und Humanalbumin (EPOa-hSA) gemäß Anspruch 1 in der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von Patienten, die unter Nierenversagen, chronischer Erkrankung, HIV, Infektionen, Blutverlust oder Krebs leiden.
Verwendung einer prophylaktischen Menge eines Fusionsproteins aus menschlichem Erythropoietin und Humanalbumin (EPOa-hSA), gemäß Anspruch 1 in der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von Patienten vor einem chirurgischen Eingriff
Eine Methode zur Herstellung eines Fusionsproteins aus menschlichem Erythropoietin und Humanalbumin (EPOa-hSA) gemäß Anspruch 1 in einer kultivierten Zelle, wobei eine kultivierte Zelle bereitgestellt wird, die eine Nukleinsäure enthält, die für ein EPOa-hSA Fusionsprotein kodiert und zur Expression des EPOa-hSA Fusionsproteins aus der Nukleinsäure, wodurch ein EPOa-hSA Fusionsprotein hergestellt wird.