DE60037513T2

DE60037513T2 - Transgene hergestellte antithrombin iii und deren mutanten

Info

Publication number: DE60037513T2
Application number: DE60037513T
Authority: DE
Inventors: Harry Newton MEADE; Paul R. Bourdon
Original assignee: GTC Biotherapeutics Inc
Current assignee: rEVO Biologics Inc
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: AU5008300A; ES2299425T3; EP1194033B1; CA2368608A1; ATE381260T1; EP1194033A1; EP1194033A4; WO2000069256A1; AU782069B2; DE60037513D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es werden für therapeutische und diagnostische Anwendungen eine wachsende Zahl von rekombinanten Proteinen entwickelt, wobei jedoch viele von diesen Proteinen schwer oder aufwändig in den erforderlichen Mengen in einer funktionellen Form unter Anwendung konventioneller Methoden herzustellen sind. Konventionelle Methoden umfassen das Insertieren des für die Erzeugung eines speziellen Proteins verantwortlichen Gens in die Wirtszellen, wie beispielsweise Bakterien-, Hefe- oder Säugerzellen, und das anschließende Aufziehen der Zellen im Kulturmedium. Die kultivierten Zellen stellen anschließend das gewünschte Protein synthetisch dar. Traditionelle Bakterien- oder Hefesysteme sind wohl unfähig, viele komplexe Proteine in einer funktionellen Form zu erzeugen. Obgleich Zellen von Säugern komplexe Proteine reproduzieren können, sind sie in der Regel schwierig und aufwändig aufzuziehen und erzeugen lediglich mg/l-Mengen an Protein.
Die Anwendung der Transgen-Technologie auf die kommerzielle Erzeugung von rekombinanten Proteinen in der Milch von transgenen Tieren bietet bedeutende Vorteile gegenüber den traditionellen Methoden der Proteinherstellung. Diese Vorteile schließen eine Verringerung der Gesamthöhe der erforderlichen Investitionskosten ein, die Eliminierung des erforderlichen Kapitalaufwandes zum Bau von Anlagen in der ersten Produktentwicklung/Lebensdauer und geringere Produktionskosten pro Einheit bei komplexen Proteinen. Von entscheidender Bedeutung ist die Wahrscheinlichkeit, dass bei bestimmten komplexen Proteinen die transgene Herstellung die wohl einzige technologisch und wirtschaftlich ausführbare Methode für eine kommerzielle Produktion darstellt.
In seinem aktiven Zustand ist das Antithrombin III (ATIII) ein Serinprotease-Hemmer, das Thrombin und die aktiven Formen der Faktoren X, VII, IX, XI und XII hemmt. Es befindet sich normalerweise im Serum in Mengen von 14 bis 20 mg/l. Verringerte Mengen an ATIII können im Serum von Individuen angetroffen werden, bei denen entweder ein erblich bedingter Mangel an ATIII besteht oder ein erworbener Mangel besteht, der aus einer Reihe von pathologischen Umständen resultieren kann. Die konventionelle Behandlung auf erblich bedingten ATIII-Mangel ist eine Protein-Ersatztherapie, die auch bei der Behandlung einiger erworbener Mangelzustände wirksam sein kann.
Die gegenwärtigen Methoden zum Erhalten von ATIII, umfassen die Isolierung des Proteasehemmers aus Blutplasma. Allerdings bietet die Verwendung von plasmabasierendem ATIII zahlreiche Probleme, die auf zahlreiche Komponenten im Plasma zurückzuführen sind, einschließend: Variation zwischen den Chargen; Probleme der Immunogenität und Risiken einer biologischen Gefährdung infolge einer viralen Kontamination.
Die WO 96/26268 beschreibt die Erzeugung von Human-Antithrombin III vom Wildtyp in der Milch von transgenen Tieren. Bei Edmund T et al., Blood, Bd. 91, Nr. 12, S. 4561 bis 4571 wird die strukturelle und fraktionelle Analyse von transgen erzeugtem Human-Antithrombin beschrieben.
Es werden in der Literatur zahlreiche Formen von mutantem Antithrombin III beschrieben, einschließlich: Beauchamp N J et al., Blood, Bd. 92, Nr. 8, S. 2696 bis 2708, worin eine T85M/K-Mutation beschrieben wird; Perry J et al., Blood, Coagulation and Fibrinolysis, Bd. 6, Nr. 1, 1995, S. 51 bis 54, worin Asn187Asp- oder Asn187Lys-Mutationen beschrieben werden; Bruce D et al., Journal of Clinical Investigation, Bd. 94, Nr. 6, S. 2265–2274, worin die Konsequenzen der Asn187Asp-Mutation beschrieben werden, und Sakuragawa N et al., Japanese Journal of Clinical Pathology, Bd. 41, Nr. 5, S. 492 bis 505, worin C-terminale Deletionsmutanten von Antithrombin III beschrieben werden. Allerdings werden in diesen Publikationen natürlich auftretende Mutationen beschrieben, und es gibt keinen Vorschlag dafür, dass Mutanten als Medikamente verwendbar sein können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, dass mutante Formen von Antithrombin III (ATIII) transgen erzeugt werden können. In seinem aktiven Zustand ist ATIII ein Serinprotease-Hemmer, der Thrombin sowie andere Serinproteasen der Kaskade hemmt. Nach Änderung seiner Konformation von dem gestressten oder aktiven Zustand zu einem latenten oder gespaltenen Zustand kann ATIII auch Angiogenese hemmen. Es wurde entdeckt, dass zahlreiche Mutanten, welche die Aktivität von ATIII als Antikoagulans und/oder die antiangiogene Wirksamkeit erleichtern, transgen erzeugt werden können. Die Erfindung betrifft damit allgemein transgen erzeugtes Human-Antithrombin III (tgATIII).
Speziell betrifft die Erfindung transgen erzeugtes, mutiertes Human-Antithrombin III (tgATIII_mut), das über eine antiangiogene Wirksamkeit verfügt, wobei die reaktive Schleife von ATIII zur Verwendung als ein Medikament reaktionsunfähig ist. Andere Ausführungsformen betreffen Verfahren zum Herstellen von derartigen transgenen ATIII in der Milch eines transgenen Tieres. Das mutante Antithrombin III hat eine reaktionsunfähige, reaktive Schleife, wobei beispielsweise die reaktive Schleife gefaltet ist (z. B. ist die reaktive Schleife zu einem beta-Blatt gefaltet), oder die reaktive Schleife ist teilweise oder vollständig entfernt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das ATIII durch Veränderung mindestens einer alpha-Helix, die unter dem beta-Blatt liegt, z. B. durch Insertion, Deletion oder Substitution von mindestens einem Nucleotid der Sequenz, die eine alpha-Helix von ATIII codiert, z. B. Human-ATIII, mutiert. Die alpha-Helix kann beispielsweise durch ein oder mehrere der Folgenden mutiert werden: Änderung des Threonins in Position 85 zu Methionin; Änderung von Threonin in Position 85 zu Lysin und Änderung von Asparagin in Position 187 zu einer Asparaginsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform verändert die Mutation die reaktive Schleife beispielsweise durch Destabilisieren des beta-Blattes, indem dem beta-Strang der reaktiven Schleife eine Abwärtsfaltung zwischen den dritten/vierten und fünften/sechsten Strängen des beta-Blatts ermöglicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet eine veränderte alpha-Helix tgATIII_mut die latente Form von ATIII leichter als der Wildtyp-ATIII, z. B. durch spontane Umwandlung und/oder bei niedrigeren Temperaturen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ATIII durch Entfernen eines Abschnittes oder des gesamten C-Terminus von ATIII mutiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der C-Terminus bei etwa 70, 60, 50 Aminosäuren oder weniger vom C-Terminus entfernt. Vorzugsweise ist der C-Terminus entfernt bei: der Elastasestelle (z. B. etwa 43 Aminosäuren vom C-Terminus entfernt); oder der Thrombin-Spaltungsstelle (z. B. etwa 39 Aminosäuren von dem C-Terminus entfernt). In einer bevorzugten Ausführungsform verändert das C-Terminus-mutierte ATIII die reaktive Schleife, z. B. indem dem beta-Strang der reaktiven Schleife die Faltung zu dem beta-Blatt ermöglicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das C-Terminus-mutierte ATIII aus einem transgenen Tier in einer aktiven Form ausgeschieden.
ATIII kann durch Entfernen von mindestens einer, zwei, drei, vier Glykosylierungsstellen mutiert werden. Der Begriff "deglykosyliert", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen ATIII-Mutanten, in welchem mindestens eine, einige oder alle Glykosylierungsstellen entfernt sind. Der glykosylierte ATIII-Mutant kann ein Asparagin an Position 135 aufweisen, wonach an der dritten Position ein Serin folgt. In einer anderen Ausführungsform wird das Asparagin an Position 135 zu einem Glutamin verändert. In einer Ausführungsform können zwei, drei, vier der Glykosylierungsstellen entfernt werden, z. B. wird das Asparagin durch ein Glutamin ersetzt. In einer der Ausführungsformen verfügt der deglykosylierte ATIII-Mutant über eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten: er befindet sich in Wechselwirkung, z. B. bindet er Heparin fester als ATIII vom Wildtyp; er befindet sich in Wechselwirkung, indem er beispielsweise Heparinsulfate an der Endothelzelloberfläche bindet; er hemmt oder vermindert die Aktivität als Prokoagulans; er erhöht die Halbwertszeit des mutierten ATIII, beispielsweise im Vergleich zu dem Wildtyp von ATIII.
In einer der Ausführungsformen wird ATIII durch Verringern des Bindens von Heparin mutiert, indem beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuren außerhalb der Pentasaccharid-bindenden Domäne mutiert werden, z. B. durch Insertion, Deletion oder Substitution. In einer der Ausführungsformen wird ATIII substituiert, indem eine oder mehrere Aminosäuren außerhalb der Pentasaccharid-bindenden Domäne mutiert werden, beispielsweise durch Veränderung des Lysins an Position 114 zu einem Glutamin. In einer der Ausführungsformen reduziert die Heparin-bindende mutierte Form von ATIII das Binden von Heparin wesentlich. In einer der Ausführungsformen hat der Heparin-bindende Mutant von ATIII eine inhibitorische Wirkung, die mit der inhibitorischen Wirkung des ATIII vom Wildtyp vergleichbar ist, die jedoch in Gegenwart von Heparin nicht beschleunigt wird.
Das transgen erzeugte tgATIII_mut lässt sich in einem transgenen Organismus erzeugen, d. h. eine transgene Pflanze oder ein solches Tier. Bevorzugte transgene Tiere schließen ein: Säuger; Vögel; Reptilien und Amphibien. Geeignete Sauger schließen ein: Wiederkäuer; Huftiere; domestizierte Sauger sowie Milchtiere. Besonders bevorzugte Tiere schließen ein: Ziegen, Schaf, Kamele, Kühe, Schweine, Pferde, Ochsen, Kaninchen und Lamas. Geeignete Vögel schließen Hühner ein, Gänse und Truthähne. Wo das transgene Protein in die Milch eines transgenen Tieres abgegeben wird, sollte das Tier in der Lage sein, mindestens eins und mehr bevorzugt mindestens 10 oder 100 Liter Milch pro Jahr zu erzeugen.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut in einer Brustdrüse des transgenen Saugers erzeugt, z. B. einem Wiederkäuer, beispielsweise einer Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut in die Milch des transgenen Tieres abgeschieden, z. B. eines Wiederkäuers, beispielsweise eine Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut unter der Kontrolle eines für mammmärspezifischen Promotors erzeugt, z. B. eines milchspezifischen Promotors, z. B. ein Milchserumprotein- oder Casein-Promotor. Der milchspezifische Promotor kann ein Casein-Promotor sein, beta-Lactoglobulin-Promotor, Molkesäureprotein-Promotor oder Lactalbumin-Promotor.
In einigen Ausführungsformen wird das tgATIII_mut unter der Kontrolle einer Harnblase oder ovumspezifischen Promotors erzeugt und das tgATIII_mut in den Urin oder in ein Ovum abgeschieden.
Das tgATIII_mut ist eine Mutation der Nucleotid- und/oder Aminosäuresequenz vom Human-ATIII.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt die Herstellung mindestens 0,1, 1, 10 oder 100 mg tgATIII_mut ein. In bevorzugten Ausführungsformen schließt die Herstellung mindestens 0,1, 1, 10 oder 100 mg tgATIII_mut ein.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt die Herstellung mindestens 1, 10, 100 oder 500 Milligramm pro Milliliter tgATIII_mut ein.
Ebenfalls wird von uns ein isoliertes Nucleinsäuremolekül beschrieben, in das eine tgATIII_mut-Protein-codierende Sequenz einbezogen ist, die operativ verknüpft ist mit einem gewebespezifischen Promotor, z. B. eine für die mammmärspezifische Promotorsequenz, die zur Abscheidung des Proteins in der Milch des transgenen Säugers führt. Die tgATIII_mut kann beispielsweise eine tgATIII_mut entsprechend der Beschreibung hierin sein.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promotor ein milchspezifischer Promotor, z. B. ein Milchserumprotein- oder Casein-Promotor. Der milchspezifische Promotor kann ein Casein-Promotor sein, kann ein beta-Lactoglobulin-Promotor sein, Molkesäureprotein-Promotor oder Lactalbumin-Promotor sein.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promotor eine Harnblase oder ein ovumspezifischer Promotor, und das tgATIII_mut wird in den Urin oder in ein Ovum abgeschieden.
Ebenfalls werden von uns ein Verfahren zum Erzeugen von transgenem tgATIII_mut oder eines Präparats von transgenem tgATIII_mut entsprechend der Beschreibung hierin beschrieben. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellen eines transgenen Organismus, d. h. eines transgenen Tieres oder einer solchen Pflanze, die ein Transgen einschließt, welches die Expression von tgATIII_mut dirigiert;
das Transgen exprimieren lassen und das transgen erzeugte tgATIII_mut gewinnen oder ein Präparat von transgen erzeugtem tgATIII_mut aus dem Organismus oder von einem Produkt, das durch den Organismus erzeugt wird, z. B. Milch, Sahne, Haar, Blut, Eier oder Urin.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Verfahren ferner ein:
Insertieren einer Nucleinsäure, welche die Expression von tgATIII_mut dirigiert, und zwar in eine Zelle, und die Zelle zu einem transgenen Organismus werden lassen;
das tgATIII_mut kann z. B. jedes beliebige tgATIII_mut sein, das hierin beschrieben wird.
Bevorzugte transgene Tiere schließen ein: Sauger; Vögel, Reptilien und Amphibien. Geeignete Säuger schließen ein: Wiederkäuer; Huftiere; domestizierte Tiere und Milchtiere. Besonders bevorzugte Tiere schließen ein: Ziegen, Schaf, Kamele, Kühe, Schweine, Pferde, Ochsen, Kaninchen und Lamas. Geeignete Vögel schließen Hühner ein, Gänse und Truthähne. Wo das transgene Protein in die Milch eines transgenen Tieres abgeschieden wird, sollte das Tier zur Erzeugung von mindestens 1 und mehr bevorzugt mindestens 10 oder 100 Liter Milch pro Jahr in der Lage sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut in einer Brustdrüse des transgenen Tieres hergestellt, z. B. eines Wiederkäuers, z. B. eine Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut in die Milch des transgenen Säugers, z. B: ein Wiederkäuer, z. B. eine Ziege, abgeschieden.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut unter der Kontrolle eines mammmärspezifischen Promotors erzeugt, z. B. eines milchspezifischen Promotors, z. B: eines Milchserumprotein- oder Casein-Promotors. Der milchspezifische Promotor kann ein Casein-Promotor sein, kann ein beta-Lactoglobulin-Promotor sein, Molkesäureprotein-Promotor oder Lactalbumin-Promotor.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das tgATIII_mut unter der Kontrolle einer Harnblase oder eines ovumspezifischen Promotors erzeugt und das tgATIII_mut in den Urin oder in ein Ovum abgeschieden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das tgATIII_mut eine Mutation der Nucleotid- und/oder Aminosäuresequenz eines Säugers oder Primaten und bevorzugt Human-ATIII.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt die Herstellung mindestens 1, 10 oder 100 Milligramm tgATIII_mut ein. In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Präparat mindestens 1, 10 oder 100 Gramm des tgATIII_mut ein.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Präparat mindestens 1, 10, 100 oder 500 Milligramm pro Milliliter des tgATIII_mut ein.
Ebenfalls wird von uns ein Verfahren zum Bereitstellen eines transgenen Präparats beschrieben, in welchem tgATIII_mut in der Milch eines transgenen Säugers einbezogen ist, welches Verfahren umfasst:
Erhalten von Milch von einem transgenen Säuger, in dessen Keimbahn eine tgATIII_mut-Protein-codierende Sequenz operativ verknüpft mit einer Promotorsequenz eingeführt wurde, die zur Expression der Protein-codierenden Sequenz in Brustdrüsen-Epithelzellen führt, wodurch das tgATIII_mut in die Milch des Säugers abgeschieden wird und das Präparat geschaffen wird.
Das tgATIII_mut kann beispielsweise jedes beliebige tgATIII_mut sein, das hierin beschrieben wurde.
Geeignete Säuger schließen ein: Wiederkäuer; Huftiere; domestizierte Säuger; sowie Milchtiere. Besonders bevorzugte Säuger schließen ein: Ziegen, Schaf, Kamele, Kühe, Schweine, Pferde, Ochsen und Lamas. Der transgene Säuger sollte zur Erzeugung von mindestens 0,1, 1 oder mehr bevorzugt mindestens 10 oder 100 Liter Milch pro Jahr in der Lage sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut in einer Brustdrüse des transgenen Säugen erzeugt, z. B. ein Wiederkäuer, z. B. eine Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut in die Milch des transgenen Saugers abgeschieden, z. B. ein Wiederkäuer, z. B. eine Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut unter der Kontrolle eines mammmärspezifischen Promotors erzeugt, z. B: ein milchspezifischer Promotor, z. B. ein Milchserumprotein- oder Casein-Promotor. Der milchspezifische Promotor kann ein Casein-Promotor sein, beta-Lactoglobulin-Promotor, Molkesäureprotein-Promotor oder Lactalbumin-Promotor.
In bevorzugten Ausführungsformen sind in die Milch mindestens 1, 10, 100, 500, 1.000 oder 2.000 Milligramm pro Milliliter des tgATIII_mut einbezogen.
Ebenfalls wird von uns ein transgener Organismus beschrieben, der ein transgenes tgATIII_mut und bevorzugt tgATIII_mut, deriviert von Human-ATIII exprimiert und von dem ein transgenes Präparat des tgATIII_mut erhalten werden kann.
Das tgATIII_mut kann beispielsweise jedes beliebige tgATIII_mut sein, das hierin beschrieben wird.
Der transgene Organismus ist eine transgene Pflanze oder ein solches Tier davon. Bevorzugte transgene Tiere schließen ein: Säuger; Vögel; Reptilien und Amphibien. Geeignete Säuger schließen ein: Wiederkäuer; Huftiere; domestizierte Tiere und Milchtiere. Besonders bevorzugte Tiere schließen ein: Ziegen, Schaf, Kamele, Kühe, Schweine, Pferde, Ochsen, Kaninchen und Lamas. Geeignete Vögel schließen Hühner ein, Gänse und Truthähne. Wo das transgene Protein in die Milch eines transgenen Tieres abgeschieden wird, sollte das Tier zur Erzeugung von mindestens 0,1, 1 und mehr bevorzugt mindestens 10 oder 100 Liter Milch pro Jahr in der Lage sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut in einer Brustdrüse des transgenen Tieres, z. B. ein Wiederkäuer, z. B. eine Ziege, erzeugt.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut in die Milch des transgenen Tieres abgeschieden, z. B. ein Wiederkäuer, z. B. eine Ziege.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das transgen erzeugte tgATIII_mut unter der Kontrolle eines mammmärspezifischen Promotors erzeugt, z. B. eines milchspezifischen Promotors, z. B. Milchserumprotein- oder Casein-Promotors. Der milchspezifische Promotor kann ein Casein-Promotor sein, beta-Lactoglobulin-Promotor, Molkesäureprotein-Promotor oder Lactalbumin-Promotor.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das tgATIII_mut unter der Kontrolle einer Harnblase oder ovumspezifischen Promotor erzeugt und das tgATIII in den Urin oder in ein Ovum abgeschieden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das tgATIII_mut eine mutierte Nucleotid- oder Aminosäuresequenz von Säugern oder Primaten und bevorzugt ein Human-ATIII.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Präparat mindestens 1, 10 oder 100 Milligramm tgATIII_mut ein. In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Präparat mindestens 1, 10 oder 100 Gramm des tgATIII_mut ein.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Präparat mindestens 1, 10, 100 oder 500 Milligramm pro Milliliter tgATIII_mut ein.
Ebenfalls wird von uns eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, in die eine therapeutisch wirksame Menge des transgenen tgATIII_mut oder ein transgenes Präparat von tgATIII_mut einbezogen ist, z. B. ein tgATIII_mut, wie es hierin beschrieben wird, sowie ein pharmazeutisch duldbarer Träger.
Das transgene tgATIII_mut oder tgATIII_mut-Präparat kann mit Hilfe jeder beliebigen Methode oder eines Organismus hergestellt werden, wie hierin beschrieben wird.
Ein "Präparat", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Mehrzahl von Molekülen, die durch ein oder mehrere transgene Tiere erzeugt werden. In einem der Aspekte kann dieses Moleküle differierender Glykosylierung einschließen oder kann in dieser Hinsicht homogen sein.
Ein "gereinigtes Präparat", "weitgehend reines Präparat" eines Polypeptids oder eines isolierten Polypeptids, wie sie hierin verwendet werden, bedeutet im Fall eines transgen erzeugten Polypeptids ein Polypeptid, das von mindestens einem anderen Protein, Lipid oder Nucleinsäure separiert worden ist, mit denen es in dem transgenen Tier oder in einem Fluid, z. B. Milch, oder einer anderen Substanz, z. B. einem Ei, die von dem transgenen Tier erzeugt werden, vorkommt. Das Polypeptid wird bevorzugt von Substanzen separiert, z. B. Antikörpern oder Gelmatrix, z. B. Polyacrylamid, die zu dessen Reinigung verwendet werden. Das Polypeptid besteht bevorzugt aus mindestens 10, 20, 50, 70, 80 oder 95% Trockenmasse des gereinigten Präparats. Vorzugsweise enthält das Präparat: ausreichend Polypeptid, um eine Proteinsequenzierung zu ermöglichen; mindestens 1, 10 oder 100 Mikrogramm des Polypeptids; mindestens 1, 10 oder 100 Milligram des Polypeptids.
Eine weitgehend reine Nucleinsäure ist eine Nucleinsäure, die eines oder beides der Folgenden ist: nicht unmittelbar zusammenhängend mit einem oder beiden der Sequenzen, z. B. codierende Sequenzen, mit denen sie unmittelbar zusammenhängend ist (d. h. eine am 5'-Ende und eine am 3'-Ende) in dem natürlich auftretenden Genom des Organismus, von dem die Nucleinsäure abgeleitet ist; oder das weitgehend frei ist von einer Nucleinsäuresequenz, mit der es in dem Organismus auftritt, von dem die Nucleinsäure deriviert ist. In den Begriff einbezogen sind beispielsweise eine rekombinante DNA, die in einem Vektor eingebaut ist, z. B. in einem autonom replizierenden Plasmid oder Virus oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten, oder die als ein separates Molekül existiert (z. B. eine cDNA oder ein genomisches DNA-Fragment, das durch PCR erzeugt wurde oder durch eine Behandlung der Restriktionsendonuclease) unabhängig von anderen DNA-Sequenzen. Weitgehend reine DNA schließt außerdem eine rekombinante DNA ein, die Bestandteil eines Hybridgens ist, welches zusätzlich eine tgATIII_mut-Sequenz codiert.
Die Begriffe Peptide, Proteine und Polypeptide werden hierin austauschbar verwendet.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "transgene Sequenz" auf eine Nucleinsäuresequenz (z. B. die ein oder mehrere Humanproteine codiert), die durch eine künstliche Maßnahme in eine Zelle insertiert ist. Die transgene Sequenz, die hierin auch als ein Transgen bezeichnet wird, kann Bestandteil des Genoms eines Tieres werden, das sich im Ganzen entwickelt, oder Teil einer solchen Zelle sein. In Ausführungsformen der Erfindung ist die transgene Sequenz in das chromosomale Genom integriert. Wenn die transgene Sequenz in das Genom integriert ist, ergibt sich durch ihre bloße Insertion eine Änderung in der Nucleinsäuresequenz des Genoms, in das sie insertiert ist. Eine transgene Sequenz kann teilweise oder vollständig Species-heterolog sein, d. h. die transgene Sequenz oder ein Abschnitt davon kann von einer Species sein, die von der Zelle verschieden ist, in die sie eingeführt wurde. Eine transgene Sequenz kann teilweise oder vollständig Species-homolog sein, d. h. die transgene Sequenz oder ein Abschnitt davon kann von der gleichen Species wie die Zelle sein, in die sie eingeführt wurde. Wenn eine transgene Sequenz (im Sinne der Sequenz oder in dem Species-homologen Sinn) zu einem endogenen Gen der Zelle, in die sie eingeführt wurde, homolog ist, dann hat die transgene Sequenz bevorzugt ein oder mehrere der folgenden Merkmale: sie ist für die Insertion konzipiert oder in das Genom der Zelle in einer solchen Weise insertiert, dass es die Sequenz des Genoms der Zelle, in die es insertiert wurde, verändert (z. B. ist sie an einer Stelle insertiert, die sich von derjenigen des endogenen Gens oder endogenen Gens unterscheidet oder ihre Insertion führt zu einer Änderung in der Sequenz des endogenen Gens); es schließt eine Mutation ein, z. B. eine Mutation, die zu einer Fehlexpression der transgenen Sequenz führt; auf Grund ihrer Insertion kann sie zu einer Fehlexpression des Gens führen, in die es insertiert wurde, z. B. kann die Insertion zu einem "Knock-out" des Gens führen, in das sie insertiert wurde. Eine transgene Sequenz kann eine oder mehrere transkriptionelle regulatorische Sequenzen einschließen sowie jede andere beliebige Nucleinsäuresequenz, wie beispielsweise Intronen, die für ein gewünschtes Maß oder Muster der Expression einer ausgewählten Nucleinsäure erforderlich sein kann, wobei alle funktionsfähig mit der ausgewählten Nucleinsäure verknüpft sind. In die transgene Sequenz kann eine Enhancer-Sequenz einbezogen sein und/oder Sequenzen, die eine Abscheidung ermöglichen.
Der hierin verwendete Begriff "heterologer Promotor" bezieht sich auf einen Promotor, der normalerweise in Verbindung steht mit dem Gen, das er kontrolliert oder das heterolog zu dem Säuger ist, in das er eingeführt ist.
Säuger sind hierin als alle Tiere mit Ausnahme der Menschen festgelegt, die über Brustdrüsen verfügen und Milch erzeugen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Milchtier" auf ein milcherzeugendes Tier. In bevorzugten Ausführungsformen erzeugt das Milchtier große Volumina an Milch und hat lange Lactationsperioden, z. B. Kühe oder Ziegen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Pflanze" entweder auf eine ganze Pflanze, ein Teil einer Pflanze, auf eine Pflanzenzelle oder eine Gruppe von Pflanzenzellen. Die Klasse der Pflanzen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung gelangen können, ist im Allgemeinen so umfangreich wie die Klasse höherer Pflanzen, die Transformationsmethoden zugänglich sind, einschließlich sowohl einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen. Darin einbezogen sind Pflanzen einer Varietät von Ploidie-Werten einschließlich polyploid, diploid und haploid.
Der Begriff "pharmazeutisch duldbare Zusammensetzung" bezeichnet Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge von tgATIII_mut aufweisen und gemeinsam mit einem oder mehreren pharmazeutisch duldbaren Trägem formuliert sind.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung sowie anhand der Ansprüche offensichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Human-ATIII-cDNA und Aminosäuresequenzen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, das mutierte Formen von ATIII die Aktivität von ATIII als Antikoagulans und/oder die antiangiogene Aktivität erleichtern können. Derartige mutierte Formen von ATIII lassen sich transgen erzeugen und werden in die Milch eines transgenen Tieres abgeschieden.
TRANSGENE SÄUGER
Methoden zur Erzeugung von nichthumanen transgenen Säugern, die als Quelle für somatische Zellen in der Erfindung verwendet werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Diese Methoden können das Einführen von DNA-Konstrukten in die Keimbahn eines Säugers umfassen, um einen transgenen Sauger zu erzeugen. Beispielsweise können ein oder mehrere Kopien des Konstruktes in das Genom eines Säugerembryos mit Hilfe von transgenen Standardmethoden eingebaut werden. Darüberhinaus lassen sich nichthumane transgene Säuger unter Verwendung einer Somazelle als Spenderzelle erzeugen. Das Genom der Somazelle kann dann in ein Oozyt insertiert werden und das Oozyt fusioniert und aktiviert werden, um einen rekonstruierte Embryo zu erzeugen. Beispielsweise werden Methoden zur Erzeugung transgener Tiere unter Verwendung einer Somazelle in der PCT-Veröffentlichung WO 97/07669 beschrieben.
Obgleich Ziegen eine bevorzugte Quelle für genetisch bearbeitete Somazellen sind, können auch andere Säuger außer Mensch verwendet werden. Bevorzugte Säuger außer Mensch sind Wiederkäuer, z. B. Kühe, Schaf, Kamele oder Ziegen. Ziegen, schwarzer Herkunft, z. B. Ziegen der Aufzucht der Alpen, Saanen und Toggenburg, sind in den hierin beschriebenen Methoden verwendbar. Zusätzliche Beispiele für bevorzugte Tiere außer Mensch schließen Ochsen ein, Pferde, Lamas und Schweine. Die als Quelle für die genetisch bearbeiteten Zellen verwendeten Säuger hängen von dem transgenen Säuger ab, der mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden soll, beispielsweise mit Hilfe eines Ziegengenoms, das in ein funktionell kernlos gemachtes Oozyt einer Ziege eingeführt werden soll.
Bevorzugt werden die Somazellen zur Verwendung in der Erfindung von einer transgenen Ziege erhalten. Methoden zum Erzeugen transgener Ziegen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispielsweise kann ein Transgen in die Keimbahn einer Ziege durch Mikroinjektion eingeführt werden, wie beispielsweise in Ebert et al., (1994), Bio/Technology 12:699, beschrieben wurde, die hiermit als Fundstelle einbezogen ist.
Andere transgene Tiere außer Mensch, die als eine Quelle für genetisch verarbeitete Somazellen verwendet werden sollen, lassen sich durch Einführen eines Transgens in die Keimbahn des nonhumanen Tieres erzeugen. Zum Einführen von Transgenen können embryonale Targetzellen verschiedener Entwicklungsstadien verwendet werden. In Abhängigkeit von dem Entwicklungsstadium der embryonalen Targetzelle werden unterschiedliche Methoden angewendet. Die spezielle Linie/Linien irgendeines Tieres, das zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, wird/werden auf allgemeine gute Gesundheit ausgewählt, gute Embryoleistungen, gute pronucleäre Sichtbarkeit in dem Embryo und gute reproduktive Fitness. Darüber hinaus ist der Haplotyp ein bedeutender Faktor.
TRANSFIZIERTE ZELLLINIEN
Zur Erzeugung eines transgenen Tieres können genetisch bearbeitete Zelllinien verwendet werden. Ein genetisch bearbeitetes Konstrukt kann in eine Zelle über konventionelle Methoden der Transformation oder Transfektion eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sind in die Begriffe "Transfektion" und "Transformation" eine Vielzahl von Methoden zum Einführen einer transgenen Sequenz in eine Wirtszelle einbezogen, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-co-Ausfällung, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Wie nachstehend beschrieben wird, können darüber hinaus biologische Vektoren verwendet werden, z. B. virale Vektoren. Geeignete Methoden zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen finden bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) sowie in anderen geeigneten Laborhandbüchern.
Zwei anwendbare Vorgehensweisen sind die Elektroporation und die Lipofektion. Kurze Beispiele für die jeweilige Vorgehensweise werden nachfolgend beschrieben.
Das DNA-Konstrukt kann stabil in eine somatische Spenderzelllinie durch Elektroporation unter Anwendung des folgenden Protokolls eingeführt werden: Es werden Somazellen, z. B. Fibroblasten, z. B. embryonische Fibroblasten, in PBS bei etwa 4 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert. 50 Mikrogramm der linearisierten DNA werden zu 0,5 ml der Zellsuspension zugegeben und die Suspension in eine Küvette mit 0,4 cm Elektrodenabstand (Biorad) gegeben. Die Elektroporation wird unter Verwendung eines Elektroporators "Biorad Gene Pulser" mit 330 Volt Pulsspannung bei 25 mA, 1.000 μF und unendlichen Widerstand ausgeführt. Wenn das DNA-Konstrukt ein Neomycinresistenz-Gen für die Selektion enthält, werden Neomycin-resistente Klone nach der Inkubation mit 350 Mikrogramm/ml G418 (GibcoBRL) für 15 Tage ausgewählt.
Das DNA-Konstrukt lässt sich stabil in eine somatische Spenderzelllinie durch Lipofektion unter Anwendung eines Protokolls einführen, wie beispielsweise das Folgende: etwa 2 × 10⁵-Zellen werden auf eine 3,5 cm-Mulde aufgezogen und mit 2 Mikrogramm linearisierter DNA unter Verwendung von LipofectAMINE^TM (GibcoBRL) transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen 1:1.000 und 1:5.000 aufgeteilt und, wenn das DNA-Konstrukt ein Neomycinresistens-Gen für die Selektion enthält, G418 bis zu einer Endkonzentration von 0,35 mg/ml zugegeben. neomycinresistente Klone werden Isoliert und für die Kryopräservation sowie für den nuklearen Transfer erweitert.
GEWEBESPEZIFISCHE EXPRESSION VON PROTEINEN
Oftmals ist es wünschenswert, ein heterologes Protein zu exprimieren, z. B. eine mutierte Form von ATIII, und zwar in einem speziellen Gewebe oder Fluid, z. B. der Milch eines transgenen Tieres. Das heterologe Protein kann aus dem Gewebe oder dem Fluid gewonnen werden, in welchem es exprimiert wurde. Beispielsweise ist es oftmals wünschenswert, das heterologe Protein in Milch zu exprimieren. Methoden zum Erzeugen eines heterologen Proteins unter der Kontrolle eines milchspezifischen Promotors werden nachfolgend beschrieben. Zusätzlich werden andere gewebespezifische Promotoren sowie andere regulatorische Elemente, z. B. Signalsequenzen und eine Sequenz, die die Sekretion von nichtausgeschiedenen Proteinen verstärkt, beschrieben.
MILCHSPEZIFISCHE PROMOTOREN
Verwendbare transkriptionelle Promotoren sind solche Promotoren, die bevorzugt in Brust-Epithelzellen aktiviert sind, einschließlich Promotoren, die Gen-codierende Milchproteine kontrollieren, wie beispielsweise Casein, beta-Lactoglobulin (Clark et al., (1989) Bio/Technology 7: 487–492, Molkesäure-Proteine (Gordon et al., (1987) Bio/Technology 5: 1183–1187) und Lactalbumin (Soulier et al., (1992) FEBS Letts. 297:13). Casein-Promotoren lassen sich von den alpha-, beta-, gamma- oder kappa-Casein-Genen einer beliebigen Säugerspecies derivieren, wobei ein bevorzugter Promotor von dem beta-Casein-Gen der Ziege deriviert wird (DiTullio, (1992) Bio/Technology 10: 74–77). Ein milchspezifischer Protein-Promotor oder die Promotoren, die speziell in Brustgewebe aktiviert sind, lassen sich von cDNA- oder genomischen Sequenzen derivieren. Vorzugsweise sind sie genomischer Herkunft.
Die DNA-Sequenzinformation ist für die vorgenannten mammmärspezifischen Gene verfügbar in mindestens einem und oftmals in mehreren Organismen. Siehe hierzu Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526–532 (1981) (alpha-Lactalbumin-rat); Campbell et al., Nucleic Acid Res. 12, 8685–8697 (1984) (rat WAP); Jones et al., J. Biol. Chem. 260, 7042–7050 (1985) (rat beta-Casein); Yu-Lee & Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794–10804 (1983) (rat γ-casein); Hall, Biochem. J. 242, 735–742 (1987) (α-lactalbumin human); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (bovine αs) und κ casein Cdnas9; Gorodetsky et al., Gene 66, 87–96 (1988) (bovine β casein); Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178, 395–401 (1988) (bovine κ casein); Brigmon et al., FEBS Lett. 188, 48–55 (1977) (bovine αS2 casein); Jamieson et al., Gene 61, 85–90 (1987), Invanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425–429 (1988), Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (bovine β lactoglobulin); Vilotte et al., Biochimie 69, 609–620 (1987) (bovine α-lactalbumin). Die Struktur und Funktion der verschiedenen Milchproteingene finden sich in einer Übersichtsarbeit von Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079–3098 (1993) (hierin als Fundstelle in ihrer Gesamtheit für alle Aufgaben einbezogen). Wenn zusätzliche flankierende Sequenzen zum Optimieren der Expression des heterologen Proteins nützlich sind, lassen sich derartige Sequenzen unter Anwendung der bestehenden Sequenzen als Sonden klonieren. Milchdrüsen-spezifische regulatorische Sequenzen von verschiedenen Organismen können durch ein Screening von Banken von solchen Organismen unter Verwendung bekannter zugehöriger Nucleotidsequenzen oder Antikörper zu verwandten Proteinen als Sonden erhalten werden.
SIGNALSEQUENZEN
Brauchbare Signalsequenzen sind nichtspezifische Signalsequenzen oder andere Signalsequenzen, die aus der Abscheidung von eukaryotischen oder prokaryotischen Proteinen resultieren. Vorzugsweise werden die Signalsequenzen aus milchspezifischen Signalsequenzen ausgewählt, d. h. von einem Gen, das ein in die Milch abgeschiedenes Produkt codiert. Am Meisten bevorzugt steht die milchspezifische Signalsequenz in Bezug zu dem in dem Konstrukt zur Anwendung gelangenden milchspezifischen Promotor, wie nachfolgend beschrieben wird. Die Größe der Signalsequenz ist nicht entscheidend. Was insgesamt erforderlich ist, die Sequenz muss ausreichend groß sein, um eine Abscheidung des gewünschten rekombinanten Proteins herbeizuführen, z. B. in das Brustgewebe. Beispielsweise lassen sich Signalsequenzen von Genen verwenden, die auf Casein codieren, z. B. alpha-, beta-, gamma- oder kappa-Caseine, beta-Lactoglobulin, Molkesäureprotein und Lactalbumin. Eine bevorzugte Signalsequenz ist die Signalsequenz des Ziegen-beta-Caseins.
Signalsequenzen von anderen abgeschiedenen Proteinen, z. B. Proteine, die durch Nierenzellen, pankreatische Zellen oder Leberzellen abgeschieden werden, können ebenfalls zur Anwendung gelangen. Bevorzugt hat die Signalsequenz eine Abscheidung von Proteinen in beispielsweise Urin oder Blut zur Folge.
AMINO-TERMINALE REGIONEN ABGESCHIEDENER PROTEINE
Ein nichtabgeschiedenes Protein kann ebenfalls in einer solchen Weise modifiziert werden, dass es abgeschieden wird, wie beispielsweise durch Einschluss in das insgesamt oder einen Teil der codierenden Sequenz eines Protein abzuscheiden Protein, das normalerweise abgeschieden wird. Bevorzugt ist die gesamte Sequenz des Proteins, das normalerweise abgeschieden wird, nicht in die Sequenz des Proteins einbezogen, sondern lediglich ein ausreichender Abschnitt des Amino-terminalen Endes des Proteins, das normalerweise abgeschieden wird, um zu einer Abscheidung des Proteins zu führen. Beispielsweise wird ein Protein, das nicht normalerweise abgeschieden wird, mit einem Amino-terminalen Abschnitt eines Proteins, das normalerweise abgeschieden wird, fusioniert (gewöhnlich an seinem Amino-terminalen Ende).
In einem der Aspekte ist das Protein, das normalerweise abgeschieden wird, ein Protein, das normalerweise in Milch abgeschieden wird. In solche Proteine einbezogen sind Proteine, die durch Milchdrüsen-Epithelzellen, Milchproteine, wie beispielsweise Casein, beta-Lactoglobulin, Molkesäureprotein und Lactalbumin, abgeschieden werden. Ceseinproteine schließen alpha-, beta-, gamma- oder kappa-Casein-Gene beliebiger Species der Säuger ein. Ein bevorzugtes Protein ist beta-Casein, z. B: beta-Casein der Ziege. Die Sequenzen, die das abgeschiedene Protein codieren, können entweder von einer cDNA oder von genomischen Sequenzen deriviert werden. Bevorzugt sind sie von genomischem Ursprung und schließen ein oder mehrere Intronen ein.
ANDERE GEWEBESPEZIFISCHE PROMOTOREN
Zur Anwendung können auch andere gewebespezifische Promotoren gelangen, die eine Expression in ein spezielles Gewebe ermöglichen. Gewebespezifische Promotoren sind Promotoren, die in einem speziellen Gewebe starker exprimiert werden als in andere. Gewebespezifische Promotoren werden oftmals weitgehend ausschließlich in dem speziellen Gewebe exprimiert.
Gewebespezifische Promotoren, die zur Anwendung gelangen können, schließen ein: einen neuralspezifischen Promotor, z. B. Nestin, Wnt-1, Pax-1, Engrailed-1, Engrailed-2, unitraschallbehandelter Igel, ein leberspezifischer Promotor, z. B. Albumin, alpha-1-Antitrypsin; ein muskelspezifischer Promotor, z. B. Myogenin, Actin, MyoD, Myosin; ein oozytenspezifischer Promotor, z. B. ZP1, ZP2, ZP3; ein testikularspezifischer Promotor, z. B. Protamin, Fertilin, synaptisches Komplex-Protein-1; ein blutspezifischer Promotor, z. B. Globulin, GATA-1, Porphobilinogen, Deaminase; ein lungenspezifischer Promotor, z. B. Tensidprotein C; ein haut- oder wollespezifischer Promotor, z. B. Keratin, Elastin; Endothelspezifische Promotoren, z. B. Tie-1, Tie-2; und ein knochenspezifischer Promotor, z. B. BMP.
Darüber hinaus lassen sich zur Expression in mehreren Geweben allgemeine Promotoren verwenden. Beispiele für allgemeine Promotoren schließen beta-Actin ein, ROSA-21, PGK, FOS, c-Myc, Jun-A und Jun-B.
ISOLATORSEQUENZEN
In die Erzeugung eines transgenen Tieres verwendeten DNA-Konstrukte kann mindestens eine Isolatorsequenz einbezogen sein. Die Begriffe "Isolator", "Isolatorsequenz" und "Isolatorelement" werden hierin austauschbar verwendet. Ein Isolatorelement ist ein Kontrollelement, das die Transkription von Genen, die innerhalb des Wirkungsbereichs angeordnet sind, isoliert, das jedoch die Genexpression weder negativ noch positiv stört. Bevorzugt wird eine Isolatorsequenz auf beiden Seiten der zu transkribierenden DNA-Sequenz insertiert. Beispielsweise kann der Isolator etwa 200 bp bis etwa 1 kb, 5' von dem Promotor und mindestens etwa 1 kb bis 5 kb von dem Promotor am 3'-Ende des Gens angeordnet sein, das von Interesse ist. Der Abstand der Isolatorsequenz von dem Promotor und dem 3'-Ende des Gens, das von Interesse ist, lässt sich vom Fachmann auf dem Gebiet in Abhängigkeit von den relativen Größen des Gens, das von Interesse ist, des Promotors und des Enhancers, die zum Aufbau verwendet werden, bestimmen. Darüber hinaus lassen sich mehr als eine Isolatorsequenz 5' von dem Promotor oder an dem 3'-Ende des Transgens anordnen. Beispielsweise können zwei oder mehr Isolatorsequenzen 5' von dem Promotor angeordnet werden. Der Isolator oder die Isolatoren an dem 3'-Ende des Transgens können an dem 3'-Ende des Gens, das von Interesse ist, oder an dem 3'-Ende einer 3'-regulatorischen Sequenz angeordnet werden, z. B. an einer 3'-untranslatierten Region (UTR) oder einer 3'-flankierenden Sequenz.
Ein bevorzugter Isolator ist ein DNA-Segment, welches das 5'-Ende des β-Globulinlocus von Huhn umfasst und der 5'-constitutiven hypersensitiven Stelle entspricht, die in der PCT-Veröffentlichung 94/23046 beschrieben wird, deren Inhalt hierin als Fundstelle einbezogen ist.
DNA-KONSTRUKTE
Es kann eine Kassette, die ein heterologes Protein codiert, als ein Konstrukt zusammengesetzt werden, worin ein Promotor für ein spezifisches Gewebe einbezogen ist, z. B. für mammäre Epithelzellen, z. B. ein Casein-Promotor, z. B. ein beta-Casein-Promotor der Ziege, eine milchspezifische Signalsequenz, z. B. eine Casein-Signalsequenz, z. B. eine beta-Casein-Signalsequenz, sowie eine DNA, die das heterologe Protein codiert.
In das Konstrukt kann auch eine 3' untranslatierte Region hinter der DNA-Sequenz einbezogen sein, die auf das nichtabgeschiedene Protein codiert. Derartige Regionen können das RNA-Transkript des Expressionssystems stabilisieren und erhöhen damit die Ausbeute an gewünschtem Protein aus dem Expressionssystem. Unter den 3' untranslatierten Regionen, die in den Konstrukten zur Verwendung in der Erfindung brauchbar sind, sind Sequenzen, die ein Poly A-Signal bereitstellen. Derartige Sequenzen lassen sich z. B. von SV40 kleinen-t-Antigen derivieren, der Casein-3'-untranslatierten Region oder anderer 3'-untranslatierter Sequenzen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. In einem der Aspekte wird die 3' untranslatierte Region von einem milchspezifischen Protein deriviert. Die Länge der 3' untranslatierten Region ist nicht entscheidend, jedoch scheint die stabilisierende Wirkung ihres Poly A-Transkriptes beim Stabilisieren der RNA der Expressionssequenz von Bedeutung zu sein.
Wahlweise kann in das Konstrukt eine 5' untranslatierte Region zwischen dem Promotor und der DNA-Sequenz einbezogen sein, die die Signalsequenz codiert. Derartige untranslatierte Regionen können von der gleichen Kontrollregion kommen, von der der Promotor genommen wurde, oder können von einem anderen Gen kommen, z. B. können sie von anderen synthetischen, halbsynthetischen oder natürlichen Quellen deriviert sein. Wiederum ist ihre spezifische Länge nicht entscheidend, jedoch scheinen sie zur Verbesserung der Expressionsstärke nützlich zu sein.
In das Konstrukt können ebenfalls etwa 10%, 20%, 30% oder mehr der N-terminalen codierenden Region eines Gens einbezogen sein, das bevorzugt in mammären Epithelzellen exprimiert. Beispielsweise kann die N-terminale codierende Region dem verwendeten Promotor entsprechen, z. B. eine β-Casein-N-terminale codierende Region der Ziege.
Das Konstrukt kann unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden hergestellt werden. Das Konstrukt kann als Teil eines größeren Plasmids hergestellt werden. Eine solche Herstellung ermöglicht das Klonieren und die Selektion der korrekten Konstruktionen in wirksamer Weise. Das Konstrukt lässt sich zwischen leicht zugänglichen Restriktionsstellen auf dem Plasmid so anordnen, so dass es leicht von den verbleibenden Plasmidsequenzen zum Einbau in dem gewünschten Säuger isoliert werden kann.
OOZYTEN
Oozyten zur Verwendung in der Erfindung lassen sich zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlaufe des Reproduktionszyklus eines Tieres erhalten. Es können Oozyten in verschiedenen Stadien des Zellzyklus erhalten werden und anschließend in vitro zum Eintritt in ein spezielles Stadium der Reifeteilung induziert werden. Beispielsweise werden auf Serum-genüchtertem Medium aufgezogene Oozyten in der Metaphase arretiert. Darüber hinaus lassen sich arretierte Oozyten zum Eintritt in die Telophase durch Serumaktivierung induzieren.
Oozyten können in vitro zur Reife gebracht werden, bevor sie zur Erzeugung eines rekonstruierten Embryos verwendet werden. Dieser Prozess erfordert gewöhnlich die Aufnahme von unreifen Oozyten von Ovarien des Säugers, z. B. Ovarien der Ziege, und das Reifen des Oozyten in einem Medium vor der Kernentfernung, bis der Oozyt das gewünschte Meiosestadium erreicht hat, z. B. Metaphase oder Telophase. Darüber hinaus lassen Oozyten, die in vivo zur Reife gebracht worden sind, zur Erzeugung eines rekonstruierten Embryos verwenden.
Oozyten können von einem weiblichen Säuger während der Superovulation aufgenommen werden. Verkürzt gesagt, es können Oozyten, z. B. Oozyten der Ziege, operativ gewonnen werden, indem die Oozyten am dem Eileiter des weiblichen Spenders ausgespült werden. Es werden hierin Methoden zur Einleitung der Superovulation in Ziegen und der Aufnahme von Oozyten der Ziege beschrieben.
TRANSFER REKONSTRUIERTER EMBRYOS
Ein rekonstruiertes Embryo kann zu einem weiblichen Säugetier als Spender transferiert werden und kann sich zu einem klonierten oder transgenen Säuger entwickeln. Beispielsweise kann das rekonstruierte Embryo über die Fimbrien in das Eileiterlumen des jeweiligen weiblichen Spendersäugers transferiert werden. Außerdem sind Methoden zum Transferieren eines Embryos zu einem Spendersäuger auf dem Fachgebiet bekannt und wurden beispielsweise beschrieben von Ebert et al. (1994) Bio/Technology 12:699.
REINIGUNG VON PROTEINEN AUS MILCH
Das transgene Protein, z. B: eine mutierte Form von ATIII, kann in Milch mit relativ hohen Konzentrationen und großem Volumina erzeugt werden liefert eine kontinuierliche hohe Austragsmenge an normal bearbeitetem Peptid, das leicht am einer erneuerbaren Quelle geerntet werden kann. Es gibt mehrere verschiedene Methoden zur Isolierung von Proteinen aus Milch, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Milchproteine werden normalerweise mit Hilfe einer Kombination von Verfahren isoliert. Rohmilch wird zuerst zur Entfernung von Fetten, beispielsweise durch Entrahmen, Zentrifugation, Sedimentation (H. E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982), Säureausfällung ( US-P-4 644 056 ) oder enzymatische Koagulation mit Lab oder Chymotrypsin (Swaisgood, ibid.) zur Entfernung von Fetten fraktioniert. Anschließend können die wichtigsten Milchproteine entweder zu einer klaren Lösung oder zu einem Massepräzipitat aufgeteilt werden, am dem das spezielle Protein, das von Interesse ist, mühelos gereinigt werden kann.
In der FP-P-2 487 642 wird die Abtrennung von Milchproteinen aus Magermilch oder Molke mit Hilfe der Membranultrafiltration in Kombination mit der Ausschlusschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie beschrieben. Zuerst wird durch Entfernen des Caseins durch Ausfällung mit Lab oder Molkesäure Molke erzeugt. In der US-P-4 485 040 wird die Abtrennung eines an alpha-Lactoglobulin angereicherten Produkts in dem Filterrückstand aus Molke mit Hilfe zweier aufeinander folgender Schritte der Ultrafiltration beschrieben. Die US-P-4 644 056 gewährt ein Verfahren zum Reinigen von Immunglobulin aus Milch oder Colostrum mit Hilfe der Säureausfällung bei pH 4,0 bis 5,5 und aufeinander folgender Querstromfiltration zuerst auf einer Membran mit einer Porenweite von 0,1 bis 1,2 Mikrometer, um den Produktpool zu klären, und anschließend auf einer Membran mit einer Trenngrenze von 5 bis 80 kD, um dieses einzuengen.
In ähnlicher Weise lehrt die US-P-4 897 465 die Einengung und Anreicherung eines Proteins, wie beispielsweise Immunglobulin, aus Blutserum, Eigelb oder Molke, mit Hilfe einer sequentiellen Ultrafiltration auf Metalloxid-Membranen mit einer pH-Wert-Verschiebung. Die Filtration wird zuerst bei einem pH-Wert unterhalb des isoelektrischen Punktes (pI) des ausgewählten Proteins zur Entfernung der Masseverunreinigungen aus dem Protein-Filterrückstand ausgeführt und anschließend bei einem pH-Wert oberhalb des pI des ausgewählten Proteins, um Verunreinigungen zurückzuhalten und das ausgewählte Protein in das Permeat durchzulassen. Eine andere Methode der Anreicherung durch Filtration wird in der EP-P-467 482 B1 gelehrt, der entfettete Magermilch auf einen pH-Wert von 3 bis 4 unterhalb des pI der Milchproteine herabgesetzt wird, um sowohl Casein- als auch Molkeproteine zu solubilisieren. Sodann werden mit drei aufeinander folgenden Durchläufen der Ultrafiltration oder Diafiltration die Proteine unter Erzeugung eines Filterrückstandes eingeengt, der 15% bis 20% Feststoffe enthält, wovon 90% Protein sind. Alternativ offenbart die GB-A-2 179 947 die Abtrennung von Lactoferrin von Molke mit Hilfe der Ultrafiltration zur Einengung der Probe, gefolgt von einer schwachen Kationenaustauschchromatographie bei näherungsweise neutralem pH-Wert. Ein Maß für die Reinheit wird nicht angegeben. Nach der PCT-Veröffentlichung WO 95/22258 wird ein Protein, wie beispielsweise Lactoferrin, aus Milch gewonnen, die auf eine hohe Ionenstärke durch Zugabe von konzentriertem Salz und anschließender Kationenaustauschchromatographie eingestellt wurde.
In all diesen Verfahren wird Milch oder eine Fraktion davon zuerst zur Entfernung von Fetten, Lipiden und anderen Verunreinigungssubstanzen behandelt, die die Filtrationsmembranen oder Chromatographiemedien verstopfen würden. Die auf diese Weise erzeugten ersten Fraktionen können aus Casein bestehen, Molke oder Gesamtmilchprotein, woraus das Protein, das von Interesse ist, anschließend isoliert wird.
Die PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 94/19935 offenbart ein Verfahren zum Isolieren von biologisch aktivem Protein aus Vollmilch durch Stabilisieren der Löslichkeit der Gesamtmilchproteine mit einem positiv geladenen Mittel, wie beispielsweise Arginin, Imidazol oder Bis-Tris. Diese Behandlung erzeugt eine geklärte Lösung, aus der das Protein abgetrennt werden kann, z. B. durch Filtration durch Membranen, die ansonsten durch ausgefällte Proteine verstopft werden würden.
Die USSN 08/648 235 offenbart ein Verfahren zum Abtrennen einer löslichen Milchkomponente, wie beispielsweise ein Peptid, in ihrer biologisch aktiven Form aus Vollmilch oder ein Milchfraktion mit Hilfe einer Tangentialflussfiltration. Anders als bei früheren Trennmethoden wird hierbei die Notwendigkeit einer ersten Fraktionierung der Vollmilch zur Entfernung von Fett und Casein-Micellen eliminiert, wodurch der Prozess vereinfacht wird und Verluste bei der Gewinnung und in Bezug auf Bioaktivität vermieden werden. Diese Methode kann in Kombination mit zusätzlichen Reinigungsschritten angewendet werden, um weitere Verunreinigungen zu entfernen und das Produkt, z. B. das Protein, das von Interesse ist, zu reinigen.
HERSTELLUNG VON FRAGMENTEN UND ANALOGSUBSTANZEN
Ein Fachmann auf dem Gebiet kann die offenbarte Struktur von ATIII durch Erzeugung von Fragmenten oder Analogsubstanzen verändern und die neu erzeugten Strukturen auf Aktivität testen. Beispiele für Verfahren aus dem Stand der Technik, mit denen die Erzeugung und das Testen von Fragmenten und Analogsubstanzen möglich ist, werden nachfolgend diskutiert. Diese und andere Verfahren können zur Erzeugung und zum Screening von Fragmenten und Analogsubstanzen eines ATIII-Polypeptids angewendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist die ATIII-Struktur modifiziert ein Human-ATIII.
ERZEUGUNG VON FRAGMENTEN
Fragmente eines Proteins können auf mehreren Wegen erzeugt werden, z. B. rekombinant mit Hilfe einer proteolytischen Digerierung oder mit Hilfe einer chemischen Synthese. Innere und endständige Fragmente eines Polypeptids können erzeugt werden, indem ein oder mehrerer Nucleotide von dem einen Ende (bei einem terminalen Fragment) oder von beiden Ende (bei einem inneren Fragment) einer Nucleinsäure, die das Polypeptid codiert, entfernt werden. Die Expression der mutagenisierten DNA erzeugt Polypeptidfragmente. Die Digerierung mit "End-hängenden" Endonucleasen kann damit DNA's erzeugen, die ein Array von Fragmenten codieren. DNA's, die Fragmente eines Proteins codieren, können auch durch regelloses Shearing, Restriktionsdigerierung oder eine Kombination der vorstehend diskutierten Methoden erzeugt werden.
Fragmente können auch chemisch synthetisch unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden dargestellt werden, wie beispielsweise der Chemie der Merrifield-Festphasen-f-Moc oder t-Boc. Beispielsweise können Peptide der vorliegenden Erfindung willkürliche in Fragmente der gewünschten Länge ohne Überlappung der Fragmente unterteilt werden oder in überlappende Fragmente einer gewünschten Länge eingeteilt werden.
ERZEUGUNG VON ANALOGSUBSTANZEN: HERSTELLUNG VON VERÄNDERTEN DNA- UND PEPTIDSEQUENZEN MIT HILFE VON RANDOM-METHODEN
Varianten von Aminosäuresequenzen eines Proteins können mit Hilfe einer zufallsbestimmter Mutagenese von DNA hergestellt werden, die ein Protein oder eine spezielle Domäne oder Region eines Proteins codiert. Anwendbare Methoden schließen die PCR-Mutagenese und Sättigungsmutagene ein. Eine Bank von Random-Aminosäuresequenz-Varianten lassen sich auch mit Hilfe der Synthese einer Reihe degenerierter Oligonucleotidsequenzen erzeugen. (Methoden zum Screening von Proteinen in einer Bank und Varianten finden sich hierin an anderer Stelle).
PCR-MUTAGENESE
In der PCR-Mutagenese wird eine reduzierte Taq-Polymeraseübereinstimmung zur Einführung von zufallsbestimmten Mutationen in ein kloniertes Fragment einer DNA angewendet (Leung et al., 1989, Technique 1: 11–15). Hier bei handelt es sich um eine sehr leistungsstarke und relativ schnelle Methode zum Einführen von zufallsbestimmten Mutationen. Die DNA-Region, die mutagenisiert werden soll, wird unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Bedingungen amplifiziert, die die Übereinstimmung der DNA-Synthese durch Taq-DNA-Polymerase reduziert, z. B. unter Anwendung eines Verhältnisses von dGTP/dATP von fünf, und Zugabe von Mn²⁺ zu der PCR-Reaktion. Der Pool von amplifizierten DNA- Fragmenten wird in die geeigneten Klonierungsvektoren insertiert, um Banken von zufallsbestimmten Mutanten zu Schaffen.
SÄTTIGUNGSMUTAGENESE
Die Sättigungsmutagenese ermöglicht die schnelle Einführung einer großen Zahl von einzelnen Base-Substitutionen in die klonierten DNA-Fragmente (Mayers et al., 1985, Science 229:242). Diese Methode schließt die Erzeugung von Mutationen ein, z. B. durch chemische Behandlung oder Bestrahlung von einsträngiger DNA in vitro und Synthese eines komplementären DNA-Stranges. Die Mutationsfrequenz lässt sich modulieren, indem die Starke der Behandlung verändert wird, wobei im Wesentlichen alle möglichen Base-Substitutionen erhalten werden können. Da bei dieser Prozedur keine genetische Selektion auf mutanten Fragmenten beteiligt ist, werden beide neutrale Substitutionen sowie solche erhalten, die die Funktion verändern. Die Verteilung von Punktmutationen wird nicht in Richtung auf konservierte Sequenzelemente verschoben.
DEGENERIERTE OLIGONUCLEOTIDE
Eine Bank von Homologen lässt sich auch aus einer Reihe von degenerierten Oligonucleotidsequenzen erzeugen. Die chemische Synthese von degenerierten Sequenzen kann in einem automatischen DNA-Synthesegerät ausgeführt werden und die synthetischen Gene anschließend in einen entsprechenden Expressionsvektor legiert werden. Die Synthese von degenerierten Oligonucleotiden ist auf dem Fachgebiet bekannt (siehe beispielsweise Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier S. 273–289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Diese Methoden sind in der gerichteten Evolution anderer Proteine eingesetzt worden (siehe beispielsweise Scott et al. (1990) Science 249: 386–390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429–2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378–6382; sowie den US-P-5 223 409 , 5 198 346 und 5 096 815 ).
ERZEUGUNG VON ANALOGSUBSTANZEN: HERSTELLUNG VON VERÄNDERTEM DNA- UND PEPTID-SEQUENZEN DURCH ORTSGERICHTETE MUTAGENESE
Non-Random oder ortsgerichtete Mutagenese-Methoden können angewendet werden, um spezielle Sequenzen oder Mutationen in speziellen Regionen zu schaffen. Diese Methoden lassen sich zur Erzeugung von Varianten anwenden, in die z. B. Deletionen einbezogen sind, Insertionen oder Substitutionen von Resten der bekannten Aminsäuresequenz eines Proteins. Die Mutationsstellen lassen sich einzeln oder in Reihen modifizieren, beispielsweise indem (1) zuerst mit konservierten Aminosäuren substituiert wird und anschließend in Abhängigkeit von den erzielten Ergebnissen mit radikaleren Möglichkeiten gearbeitet wird, (2) der Target-Rest deletiert wird oder (3) die Reste der gleichen oder einer anderen Klasse angrenzend an der lokalisierten Stelle insertiert wird, oder Kombinationen der Möglichkeiten von 1 bis 3.
ALANIN-SCANNINGMUTAGENESE
Bei der Alanin-Scanningmutagenese handelt es sich um eine brauchbare Methode zur Identifikation bestimmter Reste oder Regionen des gewünschten Proteins, die bevorzugte Stellen oder Domänen für die Mutagenese ist (siehe hierzu beispielsweise Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085, 1989). Beim Alanin-Scanning wird ein Rest oder eine Gruppe von Target-Resten identifiziert (z. B. geladener Reste, wie beispielsweise Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch neutrale oder negativ geladene Aminosäure ersetzt (am Meisten bevorzugt Alanin oder Polyalanin). Der Austausch einer Aminosäure kann die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umgebung in oder außerhalb der Zelle beeinflussen. Solche Domänen, die eine funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen demonstrieren, werden sodann durch Einführen weiterer oder anderer Varianten an oder für die Substitutionsstellen verfeinert. Obgleich damit die Einführungsstelle einer Aminosäuresequenz-Variation vorbestimmt ist, muss die Beschaffenheit der Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Um die Ausführung einer Mutation an einer vorgegebenen Stelle zum Beispiel zu optimieren, kann ein Alanin-Scanning oder eine zufallsbestimmte Mutagenese an dem Target-Codon oder der Target-Region ausgeführt werden und die exprimierten gewünschten Varianten der Proteinuntereinheit einem Screening auf optimale Kombination der gewünschten Aktivität unterzogen werden.
OLIGONUCLEOTID-VERMITTELTE MUTAGENESE
Bei der Oligonucleotid-vermittelten Mutagenese handelt es sich um eine brauchbare Methode zum Herstellen von Substitutions- und Deletions- und Insertionsvarianten der DNA (siehe beispielsweise Adelman et al., (DANN 2:183, 1983). Verkürzt gesagt, wird die gewünschte DNA durch Hybridisieren eines Oligonucleotids, das eine Mutation codiert, zu einem DNA-Template verändert, wobei das Template eine einsträngige Form eines Plasmids oder eine Bakteriophage ist, die eine unveränderte oder native DNA-Sequenz des gewünchten Proteins enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase zur synthetischen Darstellung eines gesamten zweiten, komplementären Stranges des Templates verwendet, der auf diese Weise in den Olegonucleotid-Primer eingebaut wird und auf die ausgewählte Veränderung in der gewünschten Protein-DNA codiert. In der Regel werden Oligonucleotide einer Länge von mindestens 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid wird über 12 bis 15 Nucleotide verfingen, die zu dem Template auf beiden Seiten des/der Nucleotids/Nucleotide komplementär ist, die die Mutation codieren. Dieses gewährleistet, dass das Oligonucleotid zu dem einsträngigen DNA-Templatemolekül hybridisiert wird. Die Oligonucleotide werden mühelos unter Anwendung von Methoden synthetisch dargestellt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und beispielsweise beschrieben wurden von Crea et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978)).
KASSETTEN-MUTAGENESE
Eine andere Methode zum Herstellen von Varianten, die Kassetten-Mutagenese, beruht auf der von Wells et al. beschriebenen Methode (Gene, 34:315 (1985)). Das Ausgangsmaterial ist ein Plasmid (oder ein anderer Vektor), worin die DNA der Proteinuntereinheit, die mutiert werden soll, einbezogen ist. Das Codon/die Codone in der DNA der Proteinuntereinheit, die mutiert werden soll, werden identifiziert. Auf jeder Seite der zu identifizierenden Mutationsstelle(n) muss eine einzige Restriktionsendonuclease-Stelle vorhanden sein. Wenn es keine solchen Restriktionsstellen gibt, können sie unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-vermittelten Mutagenesemethode erzeugt werden, um sie an den entsprechenden Stellen in die DNA der gewünschten Proteinuntereinheit einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen aufgetrennt, um es zu linearisieren. Unter Anwendung von Standardprozeduren wird ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen codiert, jedoch die gewünschte Mutation(en) enthält, synthetisch dargestellt. Die zwei Stränge werden separat synthetisch dargestellt und anschließend miteinander unter Anwendung von Standardmethoden hybridisiert. Das doppelsträngige Oligonucleotid wird als die Kassette bezeichnet. Die Kassette ist so aufgebaut, dass sie 3'- und 5'-Enden verfügt, die mit den Enden des linearen Plasmids vergleichbar sind, so dass sie direkt an dem Plasmid legiert werden kann. Dieses Plasmid enthält jetzt die mutierte DNA-Sequenz der gewünschten Proteinuntereinheit.
KOMBINATORISCHE MUTAGENESE
Zur Erzeugung von Mutanten kann auch eine kombinatorische Mutagenese angewendet werden, z. B. werden die Aminosäuresequenzen für eine Gruppe von Homologen oder anderer verwandte Proteine ausgerichtet vorzugsweise, um die höchstmögliche Homologie zu unterstützen. Es können alle Aminosäuren, die an einer vorbestimmten Position der ausgerichteten Sequenzen auftreten, zur Erzeugung einer degenerierten Reihe von kombinatorischen Sequenzen gewählt werden. Die variegierte Bank von Varianten wird mit Hilfe der kombinatorischen Mutagenese auf der Höhe der Nucleinsäure erzeugt und durch eine variegierte Gen-Bank codiert. Beispielsweise kann eine Mischung von synthetischen Oligonucleotiden enzymatisch in die Gen-Sequenzen ligiert werden, so dass die degenerierte Reihe von potentiellen Sequenzen als individuelle Peptide exprimierbar ist, oder alternativ als eine Reihe großer Fusionsproteine, die die Reihe der degenerierten Sequenzen enthält.
BEISPIELE
Alle Mutanten wurden in einem pUC-Vektor durch Spaltmutagenese im Fall von T85M, T85K, N187D, N135Q und K114Q erzeugt. Es wurden Oligonucleotide synthetisch mit Änderungen an dem gewünschten Codon dargestellt (Operon), um dessen Aminosäure-Kennzeichnung zu verändern, und ebenfalls stumme Mutationen an benachbarten Codonen eingeführt, um die Differenz zwischen dem Wildtyp und dem Mutanten im Hybridisationsscreening zu verstärken. Es wurden die folgenden Oligonucleotide verwendet:
Die Spaltmutagenese wurde wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Verkürzt gesagt, wurde das Plasmid pAT-7 an den einzigen Restriktionsstellen SacII und Hpa1 digeriert und der Vektor einer Gelreinigung von den 600 bp Inserts unterzogen und aus der Agarose unter Verwendung von Gene Clean (Bio101) extrahiert. Diese Fragment wurde mit einer ähnlichen Menge von XmnI digerierter pAT-7 vereint und der phosphorylierte Mutant-Oligo anschließend in einem Wasserbad für 7 Minuten gesiedet. Die Fragmente ließ man sodann für 30 Minuten bei 37°C anwärmen. Der Spalt wurde gefüllt und mit Klenow und T4-Ligase in 1 × Ligierungspuffer ligiert. Nach der Umwandlung zu XL-1 Blue-superkompetenten Zellen und Aufziehen auf Nitrocellulosefiltern auf Lbamp-Plättchen wurden die Filter repliziert und durch Hybridisierung unter Einsatz des Kinase-behandelten Mutant-Oligo einem Screening unterzogen. Die Temperatur der Hybridisierung wurde auf 5°C unterhalb der Schmelztemperatur des Oligo eingestellt, um zwischen dem Mutanten und dem Wildtyp zu unterscheiden.
Es wurden zwei trunkierte Mutanten erzeugt, indem entweder PCR im Fall der Trunkierung an der Elastase-Stelle verwendet wurde oder ein Oligo im Fall der Thrombin-Stelle. Der Elastase-trunkierte Mutant wurde unter Verwendung eines Oligos einer PCR-Behandlung unterzogen, der 5' von der Xho1-Stelle in pAT-7 war und eines Oligos, der zu der Sequenz 5' der Elastase-Stelle mit einem Stopcodon unter einer Sal1-Adaptersequenz homolog war. Die PCR wurde unter Anwendung von Pfu-Polymerase und des Puffers des Herstellers mit einer Wärmenachbehandlungstemperatur 4°C unterhalb der berechneten Schmelztemperatur ausgeführt. Das PCR-Produkt wurde einer Gelreinigung unterzogen und nach Digerierung mit Sal1 und Xho1 in einen modifizierten pUC19-Vektor ligiert. Der an der Thrombin-Stelle trunkierte ATIII-Vektor wurde durch Einsetzen eines doppelsträngigen Oligonucleotids (Operon, siehe nachfolgend) mit Nsi1- und Xho1-Enden und einer Bgl2-Stelle und einem Stopcodon am 3'-Ende in den Wildtyp eines cDNA-Klons erzeugt.
Die deglykosylierte Form wurde als ein Sac2-Hpa1-Restriktionsfragment synthetisch dargestellt, indem alle vier Asparagin der Glykosylierungsstelle in Glutamine umgewandelt und die Codon-Nutzung zur Säuger-Expression optimiert wurde und eine Destabilisierungssequenz durch Operon eliminiert und in den Sac2-Hpa1-restringierten Wildtyp ligiert wurde. Alle Mutanten mit Ausnahme des Thrombin trunkiert und N135Q wurden in den Säurer-Expressionsvektor pCEP-4 (Invitrogen) subkloniert und in einen Strang der 293-Zellen transfiziert, die auf das EBNA-1-nucleäre Protein positiv sind, indem Lipofect-Amine Plus (Life Technoligies) angewendet wurde. Dieses System liefert typischerweise einen Transfektionswirkungsgrad bezogen auf beta-Galactose-Anfärbung von 80 bis 90%. Nach 48 Stunden wurde konditioniertes Medium und Zell-Lysate auf einem 10–18% SDS-PAGE zum Durchlauf gebracht und mit Western-Blot analysiert. Der Blot wurde mit Sonde mit einem HRP-konjugierten Antihuman-ATIII (Biodesign International) versehen.
Um diese mutanten Insertionen zur Mikroinjektion in Maus-Oozyt zu subklonieren, wurden transgene Vektoren (BC800 und BC350), die beta-Casein-Promotor der Ziege, 3' UTR und Isolatorsequenzen enthielten, verwendet. Bis dahin wurden fünf Mutanten injiziert, die Thrombin-Stelle trunkiert (BC896), Elastase-Stelle trunkiert (BC898), non-glykosyliert (BC897), beta-Form (BC899) und Thrombin trungiert non-glykosyliert (BC929). Vier hatten Gründer, identifiziert unter Anwendung einer ATIII-spezifischen Primerreihe an Schwanz-DNA-Präparaten (Standardproteinase K-Protokoll). Es wurde ein geringer Prozentsatz von Transgenen mit etwa 5 bis 8% erzeugt und diese gepaart, um Milch und F1-Nachkommen zu erzeugen. Milch aus der Thrombinstelle trunkierten ATIII wurde mit Hilfe der Western-Blot-Analyse analysiert, und eine Maus produzierte einen Überschuss von 0,5 mg/ml und eine andere Maus einen Überschuss von 2 mg/ml. Obgleich ein großer Anteil davon aggregierte, gab es immer noch einen wesentlichen Anteil, der auf der Höhe des Monomers migrierte. Zusätzlich zu dieser Bestätigung, dass das Protein richtig faltete, wurde die Milch auch in einem ELISA-Format durchsucht, wo eine konstante Menge an ATIII entweder vom Wildtyp oder trunkiert durch Antihuman-ATIII-polyklonale Antikörper von Ziege eingefangen wurden und anschließend dagegen ein Peroxidase-konjugiertes Antihuman-ATIII von Schaf titriert wurde. Die Titrationskurven lagen sehr eng aneinander, was nahelegt, dass die meisten der Epitope verfügbar sind und richtig gefaltet sein müssen. Mit Hilfe der Western-Blot-Analyse wurde außerdem Milch in den non-glykosylierten Mutanten analysiert. Selbst unter reduzierenden Bedingungen blieb der größte Teil des Materials aggregiert. Eine nichtreduzierte Spur war fast vollständig aggregiert. Milch von weiblichen beta-ATIII-Gründern schied geringe Mengen an Protein in die Milch aus.

Die meisten der Konstrukte wurden auf Expression in Gewebekultur getestet, wobei jedoch auf Grund der Natur der Erzeugung einer transgenen Maus lediglich selektierte Formen mikroinjiziert wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle II zusammengestellt. In allen Gewebekulturexperimenten wurden große Mengen an den Proteinen in den Zellen exprimiert, wobei jedoch lediglich in zwei Beispielen, dem Wildtyp-ATIII und dem konservativ-mutanten Wibble (T85M) signifikante Mengen der Proteine aus den Zellen kamen. Der überwiegende Anteil des Materials in den Zellen schien nicht zu der reifen Form bearbeitet worden zu sein. Bisher sind fünf ATIII-Varianten in transgenen Mäusen erzeugt worden. Zwei trunkierte Formen, die eine an der Thrombin-Stelle (GTC896) und die andere an der Elastase-Spaltungsstelle (GTC898), die Thrombin-Spaltungsstelle-trunkierte Form non-glykosyliert (GTC928), eine non-glykosylierte Form selbst (GTC897) und die beta-Form (N135Q (GTC899). Es wurden mit Hilfe der PCR-Analyse von Maus-Schwanz-DNA Gründer identifiziert und zur Erzeugung von F1-Nachkommen und Milch zur Sekretionsanalyse aufgezogen. Mit Hilfe der Western-Blot-Analyse wurde festgestellt, dass alle fünf Varianten in die Milch dieser laktierenden Mäuse abgeschieden wurden. Unter nichtreduzierenden Bedingungen hat es den Anschein, dass alle Formen eine hohen Anteil an Aggregation und speziell die non-glykosylierte Form aufwiesen. TABELLE 1: LISTE VON KONSTRUKTEN

ATIII-Mutanten	PUC	PCEP4	PBC
Wildtyp-ATIII	pAT7	845	197
T85M Wibble	843	852	855
T85K Wobble	844	853	856
N187D Rouen VI	849	858
N135Q beta-Form	872		899
K114Q Non-Heparin-Binden	880	888
Deglykosyliert	879	887	897
Trunkiert a) Elastase-Stelle	881	889	898
Trunkiert b) Thrombin-Stelle	884	920	896
Trunkiert/non-glykosyliert	916	928	929
Trunkiert (Thrombin-Stelle):hSA-Fusion	925	932	933
Beta-Casein: PF4/47-70 Fusion	927		931
PF4/47-70	935
hSA:PF4/47-70 Fusion	936	956	943

TABELLE 2: EXPRESSION VON ATIII UND TGATII_MUT-KONSTRUKTEN

ATIII-Mutanten	Gewebekultur	Milch	Heparin-Binden
Wildtyp	1	2000	+
T85M Wibble	0,5
T85K Wobble	-
N187Q Rouen VI	-
N187Q beta-Form		500
K114Q Non-Heparin-Binden	-
non-glykosyliert	-	1000
Trunkiert a) Elastase-Stelle	-	1000	+
Trunkiert b) Thrombin-Stelle	-	2000
Trunkiert (Thrombin-Stelle/non-glykosyliert	-	500
Trunkiert (Thrombin-Stelle):hSA

Claims

Transgen hergestelltes mutiertes humanes Antithrombin III (tgATIII_mut) mit einer antiangiogenen Aktivität, wobei die reaktive Schleife von ATIII reaktionsunfähig ist, zur Verwendung als Medikament.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 1, wobei die reaktive Schleife gefaltet ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 1, wobei die reaktive Schleife teilweise oder vollständig entfernt ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 2, wobei das ATIII durch Ändern von mindestens einer alpha-Helix, zugrundeliegend dem beta-Blatt, mutiert ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 4, wobei die alpha-Helix durch Insertion, Deletion oder eine Substitution von mindestens einem Nucleotid der Sequenz, codierend eine alpha-Helix von ATIII, geändert ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 5, wobei ein Threonin an Position 85 von humanem ATIII zu einem Methionin verändert ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 5, wobei ein Threonin an Position 85 von humanem ATIII zu Lysin verändert ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 5, wobei ein Asparagin an Position 187 von humanem ATIII zu einer Asparaginsäure verändert ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 3, wobei ATIII durch Entfernen eines Teils oder des gesamten C-Terminus von ATIII mutiert ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 9, wobei etwa 50 Aminosäuren oder weniger von dem C-Terminus entfernt sind.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 10, wobei der C-Terminus an einer Elastasestelle von ATIII entfernt ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 10, wobei der C-Terminus an einer Thrombinspaltstelle von ATIII entfernt ist.
Mutiertes ATIII nach Anspruch 10, wobei die reaktive Schleife von ATIII geändert ist, indem dem beta-Strang der reaktiven Schleife erlaubt ist, in das beta-Blatt zu falten.
Verfahren zum Herstellen von transgenem tgATIII_mut, umfassend: Bereitstellen eines transgenen nichthumanen Säugers, welcher eine DNA-Sequenz, codierend ein tgATIII_mut mit einer antiangiogenen Aktivität, einschließt, wobei die reaktive Schleife von ATIII reaktionsunfähig ist, unter Kontrolle eines milchspezifischen Promotors, Erlauben, daß das tgATIII_mut exprimiert wird, dadurch Herstellen von tgATIII_mut.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Säuger aus der Gruppe, bestehend aus einer Ziege, einem Schaf, einer Kuh, einem Schwein, einem Kaninchen, einer Ratte und einer Maus, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der milchspezifische Promotor aus der Gruppe bestehend aus: einem Casein-Promotor, einem beta-Lactoglobulin-Promotor, einem Molke-Säure-Protein-Promotor und einen Lactalbumin-Promotor, ausgewählt ist.