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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung
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Diese
Anmeldung betrifft im Allgemeinen die Verwendung von nicht menschlichen
transgenen Tieren zur Herstellung therapeutisch nützlicher
Mengen von klinisch wichtigen Proteinen. Insbesondere betrifft diese Anmeldung
die Herstellung von klinisch nützlichen
Mengen des Blutgerinnungsproteins Fibrinogen („FIB") in transgenen Tieren.
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Beschreibung des Standes der Technik
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Der
entscheidende Vorgang in der Blutgerinnungskaskade ist die durch
Thrombin katalysierte Umwandlung von FIB (Mr = 340.000) zu Fibrin
(Mr = 329.000), wobei letzteres den Fibrinklumpen bildet. Mangel an
FIB wird im Allgemeinen als ein autosomal rezessives Merkmal übertragen
und kann sich als eine vollständige
oder teilweise Abwesenheit von FIB im Blutplasma manifestieren.
Klinisch ähnelt
die Krankheit gemäßigter oder
milder Hämophilie.
Angeborene Fibrinogenanomalie kann auf die vererbte Synthese von
strukturell oder funktionell anomalen Molekülen zurückgehen, wie in den Vlissingen-,
Ijmuiden- und Nijmegen-Fibrinogenen. Ein erworbener Mangel dieses
Proteins kann als das Resultat von beeinträchtigter hepatischer Synthese des
Proteins auftreten, wie zum Beispiel bei Hepatitis oder hepatischer
Nekrose, oder auf beschleunigte Zerstörung des Proteins, verursacht
zum Beispiel durch erhöhte
proteolytische Aktivität
im Blut.
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Eine
Kontrolle von Blutungen bei solchen Patienten wird derzeit durch
Transfusion von FIB, das in frisch eingefrorenem menschlichem Plasma
oder in aus Spenderblut isolierten Konzentraten des Proteins enthalten
ist, erreicht. Während
diese Ersatztherapien im Allgemeinen effektiv sind, setzen sie Patienten
dem Risiko von durch Viren übertragbaren
Krankheiten, wie Hepatitis oder AIDS, aus. Obgleich dieses Risiko
durch das Inaktivieren solcher Viren durch Hitze oder organische
Lösungsmittel
stark verringert worden ist, haben solche Präparate die Kosten der Behandlung
stark erhöht
und sie sind nicht frei von Risiken. Es gibt folglich einen ernsthaften
Bedarf für
eine zu menschlichem Plasma alternative Quelle dieses Proteins.
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Ein
wichtiger Fortschritt bei der Erschließung einer alternativen klinischen
Quelle von FIB ist die Klonierung von cDNAs, welche die drei unterschiedlichen
Fibrinogenketten kodieren, und die Veröffentlichung von cDNA Sequenzen
gewesen. Rixon et al., Biochemistry 22: 3237 (1983); Chung et al.,
ibid. 3244; Chung et al., ibid. 3250. Die Struktur des FIB-Moleküls ist außerordentlich
komplex. Jedes Molekül
FIB besteht aus zwei Sätzen
von drei unterschiedlichen Polypeptidketten, bezeichnet als Aα, Bβ und Gγ, mit molekularen
Massen von jeweils 66 kDa, 52 kDa bzw. 46,5 kDa. Die zwei Halbmoleküle, die
jeden Satz von Ketten enthalten, sind durch drei Disulfidbindungen
miteinander verbunden. Zusätzlich
ist ein komplexer Satz von Disulfidbindungen innerhalb der Ketten
und zwischen den Ketten (es gibt insgesamt 29 Disulfidbindungen
ohne freie Sulfhydrylgruppen) an der Erhaltung der korrekten funktionellen
Struktur beteiligt. Außerdem
ist FIB ein Glycoprotein mit in hohem Maße spezifischen Glycosylierungen.
Das Molekül
enthält
vier Kohlenhydratketten, jeweils eine auf den B, β, G und γ Ketten;
die α und
die A Ketten enthalten kein Kohlenhydrat. Etwa 11 kDa der gesamten
molekularen Masse von FIB (340 kDa) können diesem Kohlenhydrat zugeschrieben
werden, das dem Molekül nach
der Translation hinzugefügt
wird. Zusätzlich
sind Isoformen der Glycoproteine bekannt, die Unterschieden der
Sialinsäuren
auf den Kohlenhydratketten entsprechen. Eine ordnungsgemäße Kohlenhydrat-Modifizierung
ist für
die funktionelle Aktivität
von FIB erforderlich.
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Diese
in hohem Grade komplizierten Eigenschaften des funktionellen FIB-Moleküls haben
die Expression, den Zusammenbau und die Sekretion von vollständig gebildeten
und funktionierenden rekombinanten Molekülen unvorhersagbar und schwierig
gemacht. Obgleich die cDNA, welche die menschliche FIB Aα Kette kodiert,
in Bakterien exprimiert worden ist (Lord, DNA 4: 33 (1985)), ist
dies von begrenztem Nutzen, da die anderen Fibrinogenketten, die
Kohlenhydrate tragen, nicht in Prokaryonten produziert werden können.
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Einzelne
FIB-Ketten sind in COS1 Zellen (transformierte Fibroblasten aus
Affennieren) exprimiert worden. Danishevsky et al., Biochim. Biophys.
Acta 1048: 202 (1990). Zusätzlich
wird berichtet, dass die Transfektion von COS1 Zellen mit einer
Kombination der cDNAs, welche die einzelnen Ketten der Untereinheiten von
menschlichem Fibrinogen kodieren, das Holoprotein produziert, aber
die produzierten Mengen waren klein, und wesentlich kleiner als
die Produktionsmengen, die in den transgenen Tiersystemen, die unten
beschrieben werden sollen, erreicht wurden. Roy et al., J. Biol.
Chem., 266: 4758 (1991). Von der Sekretion von teilweise zusammengebauten
oder gar nicht zusammengebauten und getrennten menschlichen FIB
(„hFIB") oder rekombinanten
menschlichen FIB („rhFIB") Ketten in nativen
oder genetisch modifizierten Geweben ist noch nicht berichtet worden.
Chung et al. (1983), Danishevsky et al. (1990). Zusätzlich gibt
es gravierende Nachteile bei der Verwendung von Säuge tierzellen-Gewebekultursystemen
für die
Produktion von FIB. Diese schließen die hohen Kosten der Wachstumsmedien,
die arbeitsintensive Natur solcher Systeme und die begrenzte Produktionskapazität ein.
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Es
besteht weiterhin ein bedeutender Bedarf für leistungsfähige und
verhältnismäßig billige
Mittel zur Herstellung von klinisch nützlichen Mengen von rhFIB Protein,
das frei ist von infektiösen
Teilchen. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis. Es
ist überraschend
gefunden worden, dass transgene Tiere genetisch modifiziert werden
können,
um therapeutisch nützliche
Mengen von rhFIB zu produzieren und in leicht zugängliche
Körperflüssigkeiten
abzusondern. Zusätzlich
zu therapeutischen Verwendungen, die Ersatz- oder Zusatz-Therapie
mit einbeziehen, findet das erfindungsgemäße FIB in einer Vielzahl von
Anwendungen Verwendung, wie beispielsweise einem „Klebstoff" in chirurgischen
Verfahren, als Zuführungssystem
für Medikamente,
wie beispielsweise Antibiotika oder antiparasitische Mittel zu Wunden,
als Lebensmittel-Ersatzstoff und zur Veränderung der Zusammensetzung
von Milch. Diese transgenen Systeme werden im Folgenden beschrieben.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Erfindungsgemäß wird ein
nicht menschliches Säugetier
zur Verfügung
gestellt, das in seinem Genom heterologe, d. h. exogen abgeleitete,
Polynucleotide stabil integriert hat, die die Aα, Bβ und Gγ Polypeptidketten von menschlichem
FIB kodieren, und die die Expression von biologisch aktivem rhFIB
in den Brustdrüsenzellen
mittels Regulations- und Signal-Sequenzen steuern, so dass frisch
synthetisiertes Fibrinogen in Flüssigkeitsräume, insbesondere
Milch, des Tiers ausgeschieden wird. Indem man weniger als alle
der drei heterologen Polynucleotide integriert, können einzelne
Ketten des Fibrinogens produziert werden und können ausgeschieden werden.
Indem man heterologe Polynucleotide integriert, die vor der Verabreichung
an das Wirtstier modifiziert worden sind, können modifiziertes FIB und
Produkte davon hergestellt werden.
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Es
ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, transgene Tiere
zur Verfügung
zu stellen, die in der Lage sind, rhFIB, Ketten der Polypeptid-Untereinheiten
von FIB, und von FIB abgeleitete Proteine und Proteinprodukte zu
produzieren.
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Es
ist auch ein Gegenstand der Erfindung, ein Mittel zur Herstellung
von rhFIB, Polypeptiduntereinheiten davon und von FIB abgeleiteten
Proteinen und Proteinprodukten in transgenen Tieren zur Verfügung zu stellen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung, produzieren Milch gebende transgene
Tiere das rhFIB, FIB Untereinheiten und von FIB abgeleitete Proteine
in ihren Brustdrüsen
und sondern diese Erzeugnisse in ihre Milch ab.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
sondern transgene Tiere das produzierte rhFIB, FIB Untereinheiten
und von FIB abgeleitete Proteine in ihr Blut und/oder in ihren Urin
ab.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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1 ist
eine Skizze des WAP Gens der Maus.
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2 ist
eine Skizze des Plasmid-Kassettenvektors pUC-WAP4, der ~2,6 kbp WAP 5' Promotorregion,
~1,3 kbp WAP 3' UTR
und angrenzende 3' Region
enthält.
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3 ist
eine Skizze des Plasmid-Kassettenvektors pUC-WAP5, der das WAP Fragment von pUCWAP4
mit hinzugefügten
NotI Linkern enthält.
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4 ist
eine Skizze des Plasmids pUCWAP5, das ein Polynucleotid enthält, welches
die FIB Aα 1 Kette
kodiert.
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5 ist
eine Skizze des Plasmids pUCWAP5, das ein Polynucleotid enthält, welches
die FIB Bβ 1 Kette
kodiert.
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6 ist
eine Skizze des Plasmids pUCWAP5, das ein Polynucleotid enthält, welches
die FIB Gγ 1 Kette
kodiert.
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7 zeigt
den Familienstammbaum von transgenen Mäusen, in deren Genom FIB-Gene
kodierende DNAs eingebaut sind.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der
Anmelder hat ein Mittel zur Erzeugung nicht menschlicher transgener
Säugetiere
entdeckt, die genetisch modifiziert sind, um in leicht zugängliche
Körperflüssigkeiten,
wie Milch, Blut und Urin, rekombinantes menschliches FIB („rhFIB"), einzelne Polypeptide
von Ketten der Untereinheiten und Ketten von modifizierten FIB-Untereinheiten
in Mengen und in Formen auszuscheiden, die für die Behandlung von Menschen
mit genetisch bedingtem oder erworbenem Mangel an normalem Protein
verwendbar sind.
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Die
Bezeichnung „Tier" bezeichnet hier
alle Säugetiere
mit Ausnahme von Menschen. Es schließt auch ein einzelnes Tier
in allen Stadien der Entwicklung, einschließlich der embryonalen und fötalen Stadien mit
ein. Ein „transgenes" Tier ist jedes Tier,
das Zellen enthält,
die genetische Informationen tragen, die direkt oder indirekt durch
gezielte genetische Manipulation auf subzellularem Niveau empfangen
wurden, wie beispielsweise durch Mikroinjektion oder Infektion mit
rekombinanten Viren.
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„Transgen" umfasst im vorliegenden
Kontext nicht eine klassische Kreuzung oder in vitro Fertilisation, sondern
bezeichnet vielmehr Tiere, in denen eine oder mehrere Zellen ein
rekombinantes DNA Molekül
empfangen. Obgleich es in hohem Maße bevorzugt ist, dass dieses
Molekül
in die Chromosomen des Tiers eingebaut wird, zieht die Erfindung
auch die Verwendung von DNA Sequenzen in Betracht, die sich außerhalb
der Chromosomen vermehren, wie beispielsweise solche, die in künstliche
Hefechromosomen eingebaut werden könnten.
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Die
Bezeichnung „Keimbahn-transgenes
Tier" bezieht sich
auf ein transgenes Tier, in dem die genetische Information in eine
Keimbahnzelle aufgenommen und eingebaut worden ist und ihr dadurch
die Fähigkeit verleiht,
die Information an Abkömmlinge
weiterzugeben. Wenn solche Abkömmlinge
tatsächlich
einen Teil oder die Gesamtheit der Informationen besitzen, dann
sind sie ebenfalls transgene Tiere.
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Die
Information, die in das Tier eingeführt werden soll, ist vorzugsweise
der Tierart fremd, der der Empfänger
angehört
(d. h. „heterolog"), aber die Information
kann auch nur dem bestimmten einzelnen Empfänger fremd sein oder genetische
Information sein, die der Empfänger
bereits besitzt. Im letztgenannten Fall kann das eingeführte Gen
anders als das native Gen exprimiert werden.
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Die
erfindungsgemäßen transgenen
Tiere können
jegliche vom Menschen verschiedene sein, die Milch, Blutserum und
Urin produzieren. Nutztiere (Schweine, Ziegen, Schafe, Kühe, Pferde,
Kaninchen und dergleichen), Nagetiere (wie bei spielsweise Mäuse), und
Haustiere (zum Beispiel Katzen und Hunde) sind im Umfang dieser
Erfindung eingeschlossen.
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Es
ist in hohem Maße
bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen transgenen Tiere erzeugt
werden, indem man in einzellige Embryonen geeignete Polynucleotide,
die menschliches FIB, oder Polypeptide von Ketten der Untereinheiten
oder modifizierte Produkte davon kodieren, in einer Weise einbringt,
dass diese Polynucleotide stabil in die DNA der Keimbahnzellen des
reifen Tiers integriert werden und auf normale Mendelsche Art und
Weise geerbt werden.
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Fortschritte
in den Methoden zur Mikromanipulation von Embryonen ermöglichen
heute die Einführung heterologer
DNA in befruchtete nicht menschliche Säugetiereizellen. Zum Beispiel
können
totipotente oder pluripotente Stammzellen durch Mikroinjektion,
durch Calciumphosphat vermittelte Fällung, Liposomenverschmelzung,
retrovirale Infektion oder andere Mittel transformiert werden, die
transformierten Zellen werden dann in den Embryo eingeführt, und
der Embryo entwickelt sich dann zu einem transgenen Tier. In einem
bevorzugten Verfahren werden sich entwickelnde Embryonen mit einem
Retrovirus infiziert, welches die gewünschte DNA enthält, und
transgene Tiere werden aus dem infizierten Embryo erzeugt. In einem
ganz besonders bevorzugten Verfahren jedoch werden die geeigneten
DNAs in den Pronucleus oder in das Zytoplasma von Embryonen coinjiziert,
vorzugsweise im einzelligen Stadium, und man lässt die Embryonen sich zu reifen
transgenen Tieren entwickeln. Diese Techniken sind wohlbekannt.
Zum Beispiel schließen
Berichte über Standard-Laborverfahren für die Mikroinjektion
von heterologer DNA in befruchtete Säugetiereizellen ein: Hogan
et al., Manipulation von Mäuseembryonen
(„Manipulating
the Mouse Embryo"),
Cold Spring Harbor Press, 1986; Krimpenfort et al., Bio-/Technology
9: (1991); Palmiter et al., Cell, 41: 343 (1985); Kraemer et al.,
Genetische manipulation des frühen
Säugetierembryos
(„Genetic
Manipulation of the Early Mammalian Embryo"), Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1985; Hammer et al., Nature, 315: 680 (1985); Wagner et al.,
US-A 5 175 385 ; Krimpenfort
et al.,
US-A 5 175 384 ,
die alle durch Bezugnahme Teil dieser Beschreibung werden sollen.
Die menschlichen Gene für
FIB oder FIB-Untereinheiten können
erhalten werden, indem man sie aus einer geeigneten Genomquelle
(d. h. menschlicher Leber, die das natürliche Organ für die Produktion
dieses Proteins ist) durch verschiedene Verfahren, die die Herstellung
von cDNAs aus isolierten mRNA Templaten, die direkte Synthese oder
irgendeine Kombination davon einschließen, isoliert. Die einzelne
FIB Ketten kodierenden cDNAs können
im passenden Lesen-Rahmen mit geeigneten Regulationssignalen verschmolzen
werden, wie im Folgenden detailliert beschrieben wird, um ein genetisches
Konstrukt herzustellen, das dann amplifiziert wird, zum Beispiel
durch Aufbereitung in einem bakteriellem Vektor nach herkömmlichen
Verfahren (siehe Sambrooket al., Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch
(„Molecular
Cloning: A Laboratory Manual"),
Cold Spring Harbor Press, 1989, das durch Bezugnahme Bestandteil
dieser Beschreibung werden soll). Das amplifizierte Konstrukt wird
danach aus dem Vektor ausgeschnitten und für die Verwendung in der Erzeugung transgener
Tiere gereinigt. Die Reinigung kann erreicht werden durch einen
oder mehrere Zyklen anionischer HPLC; alternative Techniken schließen Ultrazentrifugation
durch einen Saccharose- oder NaCl-Gradienten, Gelelektrolyse gefolgt
von Agarosebehandlung und Fällung
mit Ethanol oder Niederdruck-Chromatographie mit ein. Reinigung
durch mehrere Zyklen HPLC ermöglicht
bemerkenswert hohe Transformationshäufigkeiten, in der Größenordnung
von 20% oder mehr, sowohl in Mäusen
wie auch in Schweinen.
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Obgleich
die vorliegende Erfindung vorzugsweise die Verwendung von DNA Konstrukten
mit sich bringt, die das gewünschte
oder native menschliche FIB an sich produzieren, kann das gewünschte Protein auch
als ein Fusionsprotein produziert werden, das ein anderes Protein
enthält.
Zum Beispiel kann das gewünschte
erfindungsgemäße rekombinante
Protein als Teil eines größeren rekombinanten
Proteins produziert werden, um das gewünschte Protein zu stabilisieren
oder seine Reinigung aus Milch schneller und einfacher zu machen.
Die Fusionspartner werden dann chemisch oder enzymatisch abgetrennt
und das gewünschte
FIB wird isoliert. Die Produktion eines Fusionsprodukts von FIB
mit β-Lactoglobulin
(BLG) wird im Folgenden detailliert beschrieben.
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Das
rhFIB kann ebenfalls mit einer zum nativen Molekül identischen Sequenz produziert
werden, oder es kann als ein Fragment oder Derivat produziert werden.
Eine Vielfalt von modifiziertem rhFIB oder von Untereinheiten davon
kann produziert werden, indem man eine geklonte DNA unter Verwendung
der weithin bekannten Techniken der in vitro Mutagenese, wie beispielsweise
der in den oben genannten Literaturstellen beschriebenen, verändert.
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Die
Erzeugung von transgenen Tieren, die das Gen für menschliches FIB enthalten,
ist verbunden mit der Verwendung von cDNA oder genomischer DNA,
die die α, β und γ Ketten von
hFIB kodiert, Rixon et al., 1983, siehe oben; Chung et al., 1983,
siehe oben. Die Basensequenz jeder Kette ist in voller Länge in diesen Literaturstellen
angegeben, die durch Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung
werden sollen.
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In
der vorliegenden Erfindung verwendbare DNA Konstrukte stellen eine
doppelsträngige
DNA Sequenz zur Verfügung,
die FIB kodiert, das in Funktionsbeziehung mit allen cis- wirkenden Signalen
verbunden ist, die für
die spezifische Expression dieses Proteins in den Brustdrüsen, die
posttranslationale Glycosylierung von zweien der drei Sätze von
Ketten von FIB (Bβ and
Gγ), die
Sekretion von FIB in Milch oder andere Körperflüssigkeiten und die Entfaltung
voller biologischer Aktivität
erforderlich sind. Wie oben dargelegt, können Polynucleotide, die Ketten
von FIB oder FIB-Untereinheiten kodieren, die erfindungsgemäß verwendbar
sind, durch Standardtechniken, ausgehend von den bekannten Polynucleotidsequenzen,
isoliert werden.
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Modifizierte
FIB DNA Sequenzen können
in dieser Erfindung ebenfalls eingesetzt werden. Nützliche Modifikationen
schließen
in diesem Kontext, ohne darauf beschränkt zu sein, solche ein, die
posttranslationale Modifikationen, die Größe oder das aktive Zentrum
von FIB verändern
oder die dieses Protein oder Teile davon mit einem anderen Protein
verschmelzen. Solche Modifikationen können durch dem Fachmann wohlbekannte Verfahren
in das Protein eingeführt
werden, wie beispielsweise durch Synthese modifizierter Gene durch
Ligation von überlappendem
Oligonucleotid oder durch Einführung
von Mutationen in die geklonten Gene, beispielsweise durch Oligonucleotid-vermittelte
Mutagenese.
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Die
cis-wirkenden Regulationsregionen, die in der Erfindung nützlich sind,
schließen
den Promotor mit ein, der die Expression der Gene der Ketten von
FIB oder FIB-Untereinheiten bestimmt. Besonders bevorzugt sind Promotoren,
die spezifisch in Brustdrüsenzellen
aktiv sind und Milchproteine mit einbeziehen. Unter solchen Promotoren
sind besonders bevorzugt die Promotoren für das saure Molkeprotein („whey acidic
Protein", WAP),
kurzes und langes α-, β- und kappa-Kasein, α-Lactalbumin
und β-Lactoglobulin
(„BLG"). Promotoren können auf
der Grundlage der Proteinzusammensetzungen von verschiedenen Milchsorten
ausgewählt
werden.
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Zum
Beispiel sind die WAP- und BLG-Promotoren bei transgenen Nagetieren,
Schweinen und Schafen besonders nützlich. Die kurzen und langen
Promotoren von Nagetier-WAP sind verwendet worden, um das WAP Gen
der Ratte, das menschliche tPA Gen und das CD4 Gen zu exprimieren,
während
der Promotor für BLG
des Schafes benutzt worden ist, um das BLG Gen des Schafes, das
menschliche alpha-1-Antitrypsin Gen und das Gen für menschlichen
Faktor IX zu exprimieren. Für Übersichten
siehe Paleyanda et al., Rekombinante Technologie in Hämostase
und Thrombose („Recombinant
Technology in Hemostasis and Thrombosis"), Hoyer et al. (Hrsg.), Plenum Press,
NY 1991, Seite 197; Clark et al., TIBTECH, 5: 20 (1987), die durch
Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung werden sollen. Bevorzugt
unter den Promotoren für
die Ausführung der
vorliegenden Erfindung sind die Kasein- und WAP-Promotoren von Nagetieren
und die Kasein-, α-Lactalbumin- und
BLG-Promotoren von Schweineartigen, Rinderartigen, Pferdeartigen
und Schafartigen (Schweine, Schafe, Ziegen, Kühe, Pferde), Kaninchen, Nagetiere
und Haustiere (Hunde und Katzen). Die Gene für diese Promotoren sind isoliert
worden und ihre Charakterisierungen sind veröffentlicht worden; für Übersichten
siehe Clark et al. (1987), siehe oben und Henninghausen, Proteinexpression
und -reinigung („Protein
Expression and Purification"),
1: 3 (1990), die durch Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung
werden sollen.
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Der
Promotor kann isoliert werden, indem man herkömmliche Restriktionsendonuclease-
und Subklonierungs-Schritte durchführt. Ein WAP-Promotor der Maus,
isoliert als ein 2,6 kb EcoRI-KpnI Fragment unmittelbar 5' zu der WAP Signalsequenz
ist bevorzugt, obgleich der „lange" WAP Promotor (der
5' 4,2 kb Sau 3A-KpnI
Promotor des WAP Gens der Maus oder ein Fragment davon) auch für die Ausführung dieser
Erfindung verwendbar ist.
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Wichtig
für die
vorliegende Erfindung sind Regulationssequenzen, die die Sekretion
von Proteinen in Milch und/oder andere Körperflüssigkeiten des transgenen Tiers
lenken. In dieser Hinsicht sind sowohl homologe als auch heterologe
Regulationssequenzen in der Erfindung nützlich. Im Allgemeinen können die
Regulationssequenzen, die dafür
bekannt sind, die Sekretion von Milchproteinen zu lenken, wie beispielsweise
entweder Signalpeptide aus Milch oder das naszierende Zielpolypeptid,
verwendet werden, obgleich erfindungsgemäß ebenfalls Signalsequenzen
verwendet werden können,
die die Sekretion der exprimierten Proteine in andere Körperflüssigkeiten,
insbesondere Blut und Urin, lenken, wie beispielsweise Signalsequenzen
für Gerinnungsproteine
wie beispielsweise Protein C und Faktor VIII. Am meisten bevorzugt
für die
transgene Maus ist die Regulationssequenzen für das WAP Protein.
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Unter
den nützlichen
Sequenzen, die die Transkription regulieren, sind zusätzlich zu
den oben besprochenen Promotoren, Verstärker, Spleißsignale, Transkriptionsterminationssignale
und Polyadenylierungsstellen. In dieser Hinsicht besonders nützlich sind
diejenigen, die die Effizienz der Transkription der Gene für Fibrinogen
in den Brustdrüsenzellen
der oben aufgeführten
transgenen Tiere erhöhen.
Bevorzugt sind Transkriptionsregulationssequenzen für Proteine,
die in hohem Maße
in den Brustdrüsenzellen
exprimiert werden (siehe oben).
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Vorzugsweise
schließt
das erfindungsgemäße Expressionssystem
oder Konstrukt auch eine nicht translatierte 3' Region hinter der DNA Sequenz mit ein,
die das gewünschte
rekombinante Protein kodiert, oder das für die Regulation benutzte Milchprotein-Gen.
Diese Region stabilisiert anscheinend das RNA-Transkript des Expressionssystems
und erhöht
so die Ausbeute an gewünschtem
Protein. Unter den nicht translatierten 3' Regionen, die in dieser Hinsicht nützlich sind,
sind Sequenzen, die ein poly-A Signal liefern. Solche Sequenzen
können
z. B. abgeleitet sein von dem SV 40 kleinen t Antigen, der nicht
translatierten 3' Region
von Kasein oder von anderen nicht translatierten 3' Sequenzen, die dem
Fachmann wohlbekannt sind. Vorzugsweise ist die nicht translatierte
3' Region von einem
für Milch
spezifischen Protein abgeleitet. Der stabilisierende Effekt des
poly-A Iranskripts dieser Region ist für die Stabilisierung der mRNA
der Expressionssequenz wichtig. Auch wichtig für die Erhöhung der Effizienz der Expression
von FIB sind Ribosom-Bindungsstellen.
Ebenso sind Sequenzen, die die posttranslationale Modifikation der
FIB-Untereinheiten regulieren, in der Erfindung nützlich.
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Daher
wird erfindungsgemäß eine doppelsträngige chimäre DNA,
die Gene enthält,
die die Ketten von Untereinheiten von FIB kodieren, die in Funktionsbeziehung
verbunden sind mit cis-wirkenden Regulationssequenzen, die eine
effiziente Expression der vorgenannten in Milch und/oder anderen
Körperflüssigkeiten
fördern,
in einen Embryo eingeführt,
in dem sie in das embryonale Genom integriert werden und Teil der
erblichen genetischen Ausstattung aller Tierzellen, einschließlich der
Keimbahnzellen, des Erwachsenen werden, der aus dem Embryo reift.
Das so exprimierte und in die Milch ausgeschiedene FIB ist immunologisch
reaktionsfähig,
wie durch eine ELISA Untersuchung gemessen wurde wie unten beschrieben.
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Wo
die Synthese einer Kette einer FIB-Untereinheit bei der Produktion
des Holoproteins limitierend sein mag, kann die Expression dieser
Kette erhöht
werden, indem man das Gen an einen anderen Ort des Genoms bringt.
Dieser andere Ort kann eine DNA Sequenz unter derselben oder einer
anderen Regulationssequenz enthalten wie die anderen beiden FIB
Sequenzen.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
bestehen die Transgene der Erfindung im Allgemeinen aus aufwärts und
abwärts
gerichteten und flankierenden Sequenzen von Milchprotein in Kombination,
jeweils separat, mit jedem der drei translatierten Teile der cDNA
Sequenzen, welche die Ketten der drei FIB-Untereinheiten darstellen.
Eine native 5'-WAP
Regulationssequenz, die in einer zugänglichen Restriktionsstelle direkt
vor bzw. an dem ATG Codon endet, kann mit jeder der jeweiligen Restriktionsstellen
ligiert werden, die am ATG von translatierbaren Sequenzen ohne Linkersequenzen
auftreten, die von den Ketten des menschlichen FIB abgeleitet sind.
Eine Restriktionsstelle kann erzeugt werden durch ortsspezifische
Mutagenese von drei Basen, die sich in jeder der 3' nicht translatierbaren
Sequenzen der drei FIB cDNAs befinden. Dies bewahrt die Stopsequenz
während
eine Restriktionsstelle unmittelbar nach jeder der translatierbaren
Sequenzen der FIB cDNAs hinzugefügt
wird. Jede der kombinierten 5'-Regulations-
und der FIB-translatierbaren Sequenzen, die in einer bestimmten
Restriktionsstelle enden, können
dann mit einer korrespondierenden Restriktionsstelle ligiert werden,
die am Anfang der 3' nicht
translatierten Region von WAP und der angrenzenden WAP 3'-flankierenden Region auftritt. Dieses
Konstruktionsprinzip ermöglicht
es, dass native 5'-Regulations-
und 3'-UTR der Milchprotein-Gene
ohne intervenierende Sequenzen unmittelbar nebeneinander angeordnet
werden können
(siehe aber das oben in Bezug auf die Insertion des Bβ Gens an
einem anderen Ort gesagte). Bestimmte Restriktionsstellen an den
Enden aller Konstrukte können
ausgewählt
werden, um die Hintereinanderschaltung von Aα, Bβ und Gγ Konstrukten in einem einzigen
Bereich innerhalb des tierischen Genoms zu erleichtern.
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Obgleich
die obenstehenden allgemeinen Beschreibungen der erfindungsgemäßen DNA
Konstrukte in Zusammenhang mit dem WAP Promotor gegeben worden sind,
wird hervorgehoben, dass andere geeignete Promotoren (siehe oben
für die
Diskussion) in ähnlicher
Weise an die Fibrinogen kodierenden Polynucleotide ligiert werden
können.
Zur Verdeutlichung beschreibt die folgende Diskussion die Verwendung
des Rinderlactoglobulin („bovine
lactoglobulin", „BLG") Promotors zur Erhöhung der
Effizienz der Expression von FIB und FIB-BLG-Fusionsproteinen in Brustdrüsen.
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Mit
den oben beschriebenen Techniken kann Fibrinogen kodierende cDNA
in ein BLG Gen des Schafes eingesetzt werden. Zum Beispiel kann,
um solch einen Aufbau zu produzieren, das 11,2 Kbp BLG Gen des Schafes
modifiziert werden, so dass es eine einzelne EcoRV Stelle stromaufwärts des
Initiator ATG Codons in dem Vektor pUCXSRV besitzt. Die Sequenz
um diese Region herum wird wie folgt geändert:
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Dies
erlaubt das Klonen von Fragmenten mit stumpfen Enden stromaufwärts des
BLG Gens. Das 1,5 kbp Fragment aus einem Plasmid (z. B. pWAP FIB),
das eine menschliches Fibrinogen kodierende cDNA enthält, wird
isoliert, mit T4 DNA Polymer werden stumpfe Enden erzeugt und das
Produkt wird mit durch EcoRV geschnittenem pUCXSRV ligiert. Nach
der Transformation von E. Coli mit diesem Plasmid können die
erzeugten Klo ne charakterisiert werden durch Restriktionsanalyse
von Plasmid DNA, die durch ein Mini-prep Verfahren hergestellt wurde
und durch Ermittlung der Nucleotidsequenz um die 5' und 3' Klonierungs-Verbindungsstellen
für die
DNA herum. Die gewünschte
Struktur aufweisende Klone können
verwendet werden, um transgene Nagetiere, Schweine, Schafe, Kühe, Pferde
und andere Nutztiere und Haustiere (Katzen und Hunde) zu erzeugen,
die ein FIB-BLG Fusionsprodukt in ihre biologischen Flüssigkeiten
absondern, wie unten beschrieben wird.
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Eine
genomische Sequenz für
menschliches Fibrinogen kann auch mit dem BLG Promotor des Schafes
verschmolzen werden, der in der folgenden Diskussion veranschaulicht
wird. Die DNA Sequenzen, die im Plasmid pUCXSRV BLG des Schafes
kodieren, werden gelöscht,
um einen Vektor (pUCSV) zu erzeugen, der nur BLG Promotorsequenzen
des Schafes enthält.
Wie bei pUCSRV können
Fragmente mit stumpfen Enden durch Ligation mit einer einzelnen
EcoRV Stelle mit dieser Promotorregion verschmolzen werden. Die
Sequenzen 5' zu
dieser Stelle sind in beiden Plasmiden identisch.
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Genomische
FIB-Sequenzen von mehr als ungefähr
15 kbp können
trotz ihrer Länge
in transgene Tiere eingeführt
werden durch die Verwendung von Cosmiden mit überlappenden FIB-Sequenzen, woraufhin
der notwendige Zusammenbau eines gesamten genomischen Polynucleotids,
das hFIB kodiert, durch homologe Rekombination in vivo nach Mikroinjektion
in eine Embryozelle erzielt wird. In Konstrukten, die im vorangehenden
Beispiel eingesetzt werden können,
wird ein Plasmid, in dem die FIB Genomsequenzen mit BLG 3' flankierenden Sequenzen
des Schafes direkt nach dem Terminationscodon der Translation von
Fibrinogen verschmolzen werden, um korrekte Transkription, Termination
und Polyadenylierung sicherzustellen. Das hFIB Gen, das mit BLG
3' flankierenden
Sequen zen des Schafes verschmolzen wurde, wird aus dem Plasmid ausgeschnitten,
die 3' überhängenden
Enden werden mit Klenow Enzym repariert, und das Produkt wird mit
durch EcoRV geschnittenem pUCSR ligiert. Nach der Transformation
von E. Coli werden die resultierenden Klone charakterisiert durch
Restriktions-DNA-Analyse und durch Ermittlung der Nucleotidsequenzen
um die 5' und 3' Klonierungs-Verbindungsstellen
herum. Die gewünschte
Struktur aufweisende Klone können
zur Erzeugung von transgenen Tieren in befruchtete tierische Einzellen
eingebracht werden.
-
Es
kann eine Vielzahl von Vektoren, die auf dem BLG Gen basieren, konstruiert
werden. In auf diesem Ansatz basierenden Konstrukten werden die
Sequenzen, die das BLG Protein des Schafes kodieren, entfernt, aber
die 5' Promotorsequenzen
bleiben erhalten. Jede kann ein anderes Komplement von Intronen
aus dem Gen des Schafes und eine einzelne EcoRV Stelle besitzen,
was das Klonen von Fragmenten mit stumpfen Enden zwischen der Promotor-
und der 3' flankierenden
Region des Gens erlaubt. Jedoch enthält jede den BLG Promotor, die
EcoRV Stelle und die BLG 3' flankierende
Sequenz. Für
jede Rekombinante wird das 1,5 kbp KpnI Fragment aus pWAP FIB isoliert,
stumpfe Enden werden wie oben beschrieben erzeugt, und das Produkt wird
mit durch EcoRV geschnittenen Vektorsequenzen ligiert. Diejenigen
Konstrukte mit den korrekten Strukturen (wie oben beschrieben ermittelt)
können
benutzt werden, um Fibrinogen in den biologischen Flüssigkeiten
von transgenen Tieren zu exprimieren.
-
Wir
haben beobachtet, dass erzeugte doppelt transgene Mäuse, die
native BLG Genomsequenzen aufweisen, die als separate Konstrukte
injiziert werden, um in vivo als zusätzliche flankierende Sequenzen
mit dem BLG cDNA Zielkonstrukt (wie beispielsweise BLG Promotor-Intron
I-EcoRV-Intron VI-BLG
3' Flanke plus BLG)
verkettet zu werden, häufiger
höhe re
Expression ergeben, als es bei Verwendung von Konstrukten des BLG
Promotor-FIB cDNA-BLG Gens oder BLG Promotor-FIB genomisch (± BLG 3' Ende) beobachtet wird. Intakte oder
native BLG Genomsequenzen, die mit dem BLG-cDNA Target vorligiert
sind, können
den gleichen Vorteil ergeben. Die gleiche Grundregel kann auf WAP
Genomsequenzen erweitert werden.
-
Die
erfindungsgemäße Gewinnung
von Milch von einem transgenen Tier wird mit herkömmlichen
Mitteln durchgeführt.
Siehe z. B. McBurney et al., J. Lab. Clin. Med. 64: 485 (1964);
Velander et al., Proc Natl. Acad. Sci., USA 89: 12003 (1992), die
durch Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung werden sollen.
Fibrinogen oder Ketten von Untereinheiten oder Proteinprodukte davon
können
mit herkömmlichen
Mitteln aus Milch oder Urin isoliert und gereinigt werden, ohne
ihre Aktivität
nachteilig zu beeinflussen. Ein in hohem Grade bevorzugtes Verfahren
besteht aus einer Kombination von Anionenaustausch- und Immunochromatographien, Kryopräzipitationen,
durch Zinkionen verursachte Fällung
von Proteinen entweder der Vollmilch oder der Milchmolke (entfettete
Milch). Für
diese Techniken siehe Bringe et al., J. Dairy Res. 56: 543 (1989),
das durch Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung werden soll.
-
Milch
ist dafür
bekannt, eine Anzahl von Proteasen zu enthalten, die das Potential
haben, fremde Proteine abzubauen. Diese schließen in der Hauptsache eine
alkalische Protease mit tryptischer und chymotryptischer Aktivität, eine
Serin-Protease,
ein Chymotrypsin-artiges Enzym, eine Aminopeptidase und eine saure Protease
mit ein. Clark et al. (1987), siehe oben. Es kann daher wünschenswert
sein, frisch ausgeschiedenes FIB oder Ketten von Untereinheiten
davon gegen proteolytischen Abbau zu schützen. Solche Vorkehrungen schließen eine
schnelle Verarbeitung der Milch nach der Sammlung und die Zugabe
von weithin bekannten Proteolyseinhibitoren zur Milch ein, wie derjenigen,
die im Katalog der Sigma Chemical Co., Ausgabe 1993, Seite 850 verzeichnet
sind, die durch Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung werden
sollen.
-
Wir
haben zwei Sandwich ELISA Ausführungen
verwendet, um FIB in der Milchmolke zu ermitteln und quantitativ
zu bestimmen. Eine Technik ist ein System aus Einfangen durch polyklonale
Antikörper/FIB/Nachweis
monoklonaler Antikörper
(„P/M") und die andere
ein System, das polyklonale Antikörper sowohl für das Einfangen
wie auch für
den Nachweis verwendet („P/P"). Beide Verfahren
werden im Folgenden beschrieben. Das P/M System profitiert von der
größeren Spezifität für hFIB,
da es nur ein Epitop von etwa 6 bis 20 Aminosäuren Länge erkennt, das spezifisch
für hFIB
ist. Jedoch ist, da das P/M System nur ein einzelnes Epitop erkennt,
die Nachweisempfindlichkeit verringert. Demgegenüber liefert das P/P System
weniger Spezifität,
da es viele Epitope erkennt, aber gleichzeitig stellt es eine größere Nachweisempfindlichkeit
zur Verfügung.
Da diese mehreren Epitope Epitope einschließen, die bei Mäuse-FIB
und menschlichem FIB gleich sind, wird das „FIB" Hintergrundsignal erhöht, wenn
man rhFIB in Mäusemilch
mit dem P/P System misst. Ausführliche
Sandwich ELISA Verfahren sind im nachfolgenden BEISPIEL 7 angegeben.
-
Die
vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden
illustrativen Beispiele beschrieben.
-
BEISPIEL 1
-
WAP-Fibrinogen cDNA Konstrukte für die Expression
von Fibrinogen in transgenen Tieren
-
Aufbau von Kassetten-Vektoren
-
DNAs
für Ketten
von Fibrinogen-Untereinheiten, gewebespezifische Promotoren und
Sekretionssignale wurden aus den oben beschriebenen Quellen erhalten.
cDNAs für
Ketten von Fibrinogen-Untereinheiten wurden in einen modifizierten
pUC 18 Vektor geklont und in E. Coli JM109 aufgezogen.
-
Ein
pUC18 Vektor (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) wurde mit HindIII + EcoRI
Restriktionsendonucleasen verdaut, mit DNA T4 Polymerase wurden
in Anwesenheit von 100 mM dNTPs stumpfe Enden erzeugt und ein Not
I Linker wurde in die vormalige HindIII-EcoRI Mehrfach-Klonierungsstelle
ligiert. Dieses modifizierte pUC Fragment wurde zusätzlich mit
NotI+ Enzym verdaut, um die bei der Ligation entstehenden zusätzlichen
(mehrfache Kopien) NotI Linkersequenzen zu entfernen, und dann erneut
ligiert und in E. Coli JM 109 aufgezogen. Dieses Verfahren modifizierte
den Vektor pUC18 durch Entfernung der gesamten Mehrfach-Klonierungsregion
von pUC18 (einschließlich
der KpnI Stelle) und deren Ersatz durch eine NotI Restriktionsstelle. Der
neue Vektor wurde als pUCNot1+ bezeichnet.
-
Ein
pUC Vektor enthaltend ~2,6 kbp WAP 5' Promotorregion, ~1,3 kbp WAP 3' UTR und flankierende 3', aber keine WAP
Kodierungs- oder Intron-Regionen, wurde konstruiert (bezeichnet
als Kassettenvektor pUCWAP4, 2; siehe
WAP Gen, 1 und Kassettenvektor pUCWAP5, 3).
Das gesamte WAP Gen der Maus einschließlich 2,6 kb der nicht translatierten
5' Sequenz und der
nicht translatierten 3' Region
kann erhalten werden von Dr. I. Hennighausen, National Institutes
of Health, Bethesda, Maryland. Siehe Camp bell et al., Nucleic Acids
Res., 12: 8685 (1984). Das in dem WAP4 Vektor enthaltene WAP Fragment
enthält
eine ~2,6 kbp WAP Promotor 5' Region,
die bei EcoRI#1 anfängt
und an der translationalen Startstelle von WAP endet, die sich unmittelbar
hinter der einzelnen KpnI Endonuclease-Restriktionsstelle befindet
(siehe 1). Mit dieser KpnI Stelle wurde ein Fragment
von ~1,3 kbp WAP UTR und flankierender 3' Sequenz ligiert. Diese WAP 3' DNA schloss die
Region von unmittelbar hinter dem WAP Stopcodon bis hinunter zur
EcoRI#2 Stelle ein. Das in WAP4 enthaltene WAP Fragment wurde unter
Verwendung von EcoRI aus dem pUC Vektor ausgeschnitten und dann
mit stumpfen Enden versehen und NotI Linker wurden hinzugefügt, weiter
gestutzt durch NotI Verdauung und in das pUCNotI+ Plasmid ligiert,
das mit NotI Restriktionsendonuclease linearisiert worden war. Das
resultierende Plasmid wurde als pUCWAP5 bezeichnet (siehe 3).
-
Amplifikation von cDNAs für Ketten
von Fibrinogen-Untereinheiten durch PCR
-
Jede
der cDNAs für
Aα, Bβ und Gγ Ketten für menschliches
Fibrinogen wurden einzeln modifiziert und durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) amplifiziert, um KpnI Endonuclease-Restriktionsstellen an ihren 5' und 3' Enden zu erzeugen.
Die 5' KpnI Stelle
wurde durch PCR erzeugt unter Verwendung der Primer [die die 6 Basen
umfassende Sequenz (GGTACC, unterstrichen gezeigt in
1)
enthalten] die unmittelbar an das ATG Startcodon in den cDNAs der
Aα, Bβ und Gγ Ketten für hFIB angrenzt.
Nach Amplifikation wurden die Enden der PCR Produkte verwendenden
Verlängerung
durch T4 Polymerase mit stumpfen Enden versehen (in Anwesenheit
von Desoxynucleosidtriphosphaten, um prozessuale Exonucleaseaktivität zu inhibieren.
Auf eine ähnliche
Art und Weise wurde eine KpnI Stelle durch Ortsmodifizierung in
die 6 Basen umfassende Sequenz GGTACC eingebaut, die in
1 unterstrichen gezeigt
ist und unmittelbar an die Stopsequenz in der 3' UTR jeder cDNA für Aα, Bβ und Gγ Ketten für hFIB angrenzt. Das Komplement
der Stopsequenzen ist in den 3' Primern
in Tabelle 1 in Fettdruck gezeigt. Tabelle
1 Oligonucleotide
für die
Amplifikation von cDNA für
Ketten von FIB-Untereinheiten
- GGTACC
- = KpnI Stelle
- ATG
- = Startcodon
- CTA und TTA
- = Stopcodon
-
Aufbau von pUC Plasmiden, die cDNA für Ketten
von Fibrinogen-Untereinheiten enthalten
-
Die
mit stumpfen Enden versehenen PCR Produkte der cDNAs für die Bβ und Gγ Ketten von
menschlichem Fibrinogen wurden mit KpnI Restriktionsendonuclease
verdaut. Im Falle der Aα Kette
wurde das PCR Produkt mit stumpfen Enden in pUCNotI+ geklont (das
mit NotI verdaut worden war und mit T4 Polymerase mit stumpfen Enden
versehen worden war) vor teilweiser Verdauung mit KpnI. Diese eingeschobenen
Schritte der Klonierung und teilweisen Verdauung waren wegen der
Anwesenheit einer internen KpnI Stelle innerhalb der cDNA der Aα Kette notwendig,
um ein intaktes Kodierungsfragment zu erzeugen. Das intakte cDNA
Fragment der Aα Kette
wurde durch Gelelektrophorese selektiert und in die KpnI Stelle
geklont an der Kontaktstelle zwischen der WAP 5' Promotor- und den WAP 3' UTR/flankierenden
Sequenzen innerhalb des pUCWAP5 Plasmids. Die mit KpnI verdauten
PCR Produkte aus Bβ und
Gγ Ketten
für menschliches
Fibrinogen wurden jeweils direkt an der KpnI Stelle in ein pUCWAP5
Plasmid geklont. Separate Elektroporations-Transformationsreaktionen
wurden an E. Coli durchgeführt
unter Verwendung jeder der drei pUC-WAP5/Fibrinogen cDNA Präparate und
Kolonien wurden ausgewählt
und in TB Ampicillin-Medium aufgezogen. Plasmidpräparate aus
diesen Kolonien wurden durch Restriktionsenzym-Verdauung und Gelelektrophorese analysiert.
Die korrekte Größe und Orientierungen
wurden ausgewählt
und für
jedes WAP-Fibrinogen cDNA Konstrukt wurde ein Klon sequenziert an
den Verbindungsstellen von WAP Promotor 5':Fibrinogen cDNA und Fibrinogen cDNA:WAP
3' UTR und flankierende.
Diagramme, die den Aufbau der WAP-Aα (etwa 5,8 kbp), -Bβ (etwa 5,4
kbp) und -Gγ (etwa
5,2 kbp) cDNA Plasmide und linearisierten Transgene für menschliches
Fibrinogen zusammenfassen, sind jeweils in den 4, 5 bzw. 6 angegeben.
-
BEISPIEL 2
-
Herstellung von DNAs für die Mikroinjektion
-
Die
intakten und linearisierten Fragmente WAP 5' Promotor/Fibrinogen cDNA/WAP 3' UTR und flankierende
wurden aus jedem der pUCWAP5 Plasmide durch NotI Restriktionsendonuclease-Verdauung
ausgeschnitten und gereinigt durch Elektrophorese auf Agarose mit
niedrigem Schmelzpunkt. Das DNA:Agarose-Band wurde aus der Gelplatte
ausgeschnitten. Das Agaroseband wurde dann mit Agarase behandelt,
um Agaroseverunreinigungen abzubauen und zu entfernen.
-
Nach
der Verdauung wurde die die cDNA enthaltende Lösung auf 10 mM Mg2+,
20 mM EDTA und 0,1% SDS gebracht und dann mit Phenol/Chloroform
extrahiert. DNA wurde aus der wässrigen
Schicht mit 2,5 Volumina Ethanol in Anwesenheit von 0,3 M Natriumacetat
bei –20 °C über Nacht
ausgefällt.
Nach Zentrifugation wurde das Pellet mit 70%igem Ethanol gewaschen,
getrocknet, und jedes der Konstrukte wurde erneut suspendiert und
in Brinster Mikroinjektionspuffer aufgelöst um eine Gesamtkonzentration
(α, β, plus γ) von ungefähr 1,2 bis
5 μg/ml
zu ergeben. Brinster et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438
(1985), das durch Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung werden
soll.
-
BEISPIEL 3
-
Transgene Mäuse
-
Transgene
Mäuse wurden
im Wesentlichen erzeugt wie von Hogan et al., Manipulation des Mäuseembryos
(„Manipulating
the Mouse Embryo"),
Cold Spring Harbor Press, 1986, beschrieben, das durch Bezugnahme
Bestandteil dieser Beschreibung werden soll. Die eingesetzten Verfahren
werden unten kurz dargestellt.
-
Glasnadeln
für die
Mikroinjektion wurden hergestellt unter Verwendung einer Ziehvorrichtung
für Mikropipetten
und einer Mikroschmiede. Injektionen wurden unter Verwendung eines
Nikon Mikroskops durchgeführt,
das über
eine Hoffman Modulation Kontrastoptik verfügte, mit Narashigi Mikromanipulatoren
und einem mit N2 getriebenen Pikoinjektor
(Narashigi).
-
Befruchtete
Mäuseembryonen
wurden chirurgisch aus den Eileitern superovulierter weiblicher
CD-1 Mäuse
entfernt und in M2 Medium gesetzt. Cumuluszellen wurden mit Hyaluronidase
in einer Konzentration von 300 μg/ml
aus den Embryo nen entfernt. Die Embryonen wurden dann in neuem M2
Medium abgespült
und in M16 Medium überführt zur
Lagerung bei 37 °C
vor der Injektion.
-
Lagerlösungen,
die ungefähr
1,2 μg/ml
(enthaltend ungefähr
0,4 μg/ml
von jedem der linearisierten Konstrukte, die die cDNAs für die Aα, Bβ und Gγ Ketten für menschliches
Fibrinogen enthielten, oder ungefähr 60-70 Kopien/pl von jedem
Konstrukt) enthielten, wurden hergestellt und in die Pronuclei von
1-zelligen Mäuseembryonen
mikroinjiziert. Zusätzlich
wurden Lagerlösungen
hergestellt, die ungefähr
5 μg/ml
Gesamt-DNA (enthaltend ungefähr
1,7 μg/ml
linearisierte Konstrukte, die jede der cDNAs für die Aα, Bβ und Gγ Ketten für menschliches Fibrinogen enthielten,
oder ungefähr
200 Kopien/pl von jedem Konstrukt) enthielten, wurden hergestellt
und in die Pronuclei von 1-zelligen Mäuseembryonen mikroinjiziert.
-
Nachdem
man die DNA Lösung
in den männlichen
Pronucleus injiziert hatte, wurden Embryonen in mit Avertin anästhetisierte
CD-1 Empfängerweibchen
eingepflanzt, die durch Paarung mit vasektomierten Männchen scheinschwanger
gemacht worden waren. Ungefähr
25-30 mikroinjizierte Mäuseembryonen
pro Empfänger
wurden in scheinschwangere Weibchen überführt. Man ließ die Embryonen
austragen und die neugeborenen Mäuse
wurden mittels PCR unter Verwendung von Mäuse-WAP und eines FIB-spezifischen
Primers auf die Anwesenheit des Transgens untersucht, wie unten
beschrieben wird.
-
Tabelle
2 fasst die Daten der Embryonentransfers aus einem Experiment zusammen,
das transgene Fibrinogen produzierende Mäuse erzeugte. Für den Nachweis
von jeder der cDNAs für
Fibrinogen wurde eine separate PCR Analyse an DNA durchgeführt, die
aus biopsierten Geweben des Schwanzes durch das Verfahren, das im
untenstehenden Beispiel 4 gezeigt ist, gereinigt worden war. Die
Oligonucleotidprimer, die in Tabelle 3 gezeigt sind, wurden benutzt,
um jede der FIB cDNAs zu detektieren. Die Detektion einer jeden
Kette erforderte ein WAP Oligonucleotid (Nr. 1 in Tabelle 3) und
eines der anderen Oligonucleotide (Nr. 2, 3 oder 4).
-
Tabelle 2
-
Übertragungen
von Fibrinogen-Konstrukten
-
Dreißig Übertragungen
mit den FIB-Konstrukten wurden durchgeführt. Die Konstrukte mit drei
Ketten von Untereinheiten wurden coinjiziert bei DNA Gesamtkonzentrationen
von jeweils 1,2 μg/ml
bzw. 5 μg/ml
oder 200 Gesamtkopien/pl bzw. 800 Gesamtkopien/pl. Vierzehn Übertragungen
wurden mit mit 1,2 μg/ml
injizierten Embryonen und sechzehn mit mit 5 μg/ml injizierten Embryonen durchgeführt. Achtzehn
primär
transgene Tiere („Fo"), die mindestens
ein Konstrukt trugen, wurden erzeugt. Acht Fo Mäuse wurden mit Kontrollmäusen gepaart,
was fünf
das Transgen übertragende
Linien ergab. Aus den Linien 1, 23 und 85 sind Nachkommen der ersten
Generation („F1") gezüchtet und
Würfe erzeugt
worden.
| | 1,2 μg/ml | 5 μg/ml |
| Übertragungen: | 14 | 16 |
| lebende
Jungtiere: | 68 | 69 |
| injizierte
Embryonen: | 696 | 1098 |
| übertragene
Embryonen: | 480 | 675 |
| Embryonen
pro Übertragenen: | 34,2 | 42,1 |
| Jungtiere
pro Wurf: | 6,2 | 5,3 |
| Übertragene
schwanger: | 11 | 13 |
| Schwangerschaftrate: | 78% | 81% |
| Getestete
Mäuse: | 68 | 69 |
| Anzahl
transgen: | 7 | 11 |
| Prozent
transgen: | 10% | 15% |
| % positiv
für α, β, γ: | 85% | 72% |
| α, β, γ transgene
Weibchen: | 3 | 3 |
-
Tabelle 3
-
Für
die PCR Detektion von transgenen Mäusen mit menschlichem Fibrinogen
benutzte Oligonucleotid-Primer
-
- SEQ ID Nr. 9. Codierender (Sense) Strang. WAP-spezifisches
Oligonucleotid.
5'-CTGTGTGGCCAAGAAGGAAGTGTTG-3'
SEQ ID Nr.
10. Antisense Oligonucleotid. Detektion der Aα Kette.
5'-GATGTCTTTCCACAACCCTTGGGC-3'
SEQ ID Nr.
11. Antisense Oligonucleotid. Detektion der Bβ Kette.
5'-CCCGATAGCCACCTCCTCTGATG-3'
SEQ ID Nr.
12. Antisense Oligonucleotid. Detektion der Gγ Kette.
5'-CCTGGACTTCAAAGTAGCAGCGTC-3'
-
Eine
Zusammenfassung der Typen der Fibrinogen-transgenen Mäuse, die
in primär
transgenen Mäusen
und in Nachkommen der primär
transgenen Mäuse
ermittelt wurden, ist in Tabelle 4 wiedergegeben. Eine Auflistung
der auf das dreifache FIB-Konstrukt positiv getesteten primär transgenen
Tiere (Fo) und eine Auflistung der auf β-Ketten positiv getesteten transgenen
Mäuse sind
ebenfalls in Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle
4 Übertragung
von Fibrinogen Transgenen
| Maus
Nr. | Übertragungshäufigkeit | übertragene
Gene |
| 1 (α, β, γ) | 9/13
(69%) | α, β, γ |
| 23
(α, β, γ) | 6/12
(50%) | α, β, γ (3/6); |
| | | nur β 3/6) |
| 109
(α, β, γ) | 5/11
(45%) | α, β, γ |
| 112
(α, β, γ) | 5/8
(62%) | α, β, γ (4/6) |
| | | nur α (1/6) |
| | | nur α, γ (1/6) |
| 85
(α, β) | 1/6
(16%) | nur β |
| 113
(αβγ) | 0/8 | keine |
| 89
(α) | 0/6 | keine |
-
Auf das dreifache Fibrinogen-Konstrukt
positive Fl
-
- 1-2, 1-5, 1-6, 1-11, 1-12, 1-14, 1-16, 1-17, 1-20, 23-3,
23-4, 23-12, 109-3, 109-4, 109-5, 109-10, 109-11, 112-3, 112-6,
112-7, 112-8
-
Auf β-Ketten positive Mäuse
-
-
Allen
Embryonen wurden die drei FIB-Konstrukte in einer DNA Gesamtkonzentration
von 5 μg/ml
oder etwa 200-300 Kopien jedes Konstrukts pro pl injiziert.
-
Ein
Familienstammbaum der Weiterreichung der Transgene von FO zu F1
Weibchen ist in Tabelle 7 gezeigt. Männliche Tiere wurden nicht
festgehalten.
-
BEISPIEL 4
-
Transgene tierische DNA
-
DNA
kann aus Gewebe eines transgenen Tieres irgendeiner Spezies präpariert
werden durch das Verfahren, das unten für Mäuse beispielhaft beschrieben
wird. Marmur, J. Mol. Biol. 3: 208 (1961), das durch Bezugnahme
Bestandteil dieser Beschreibung werden soll.
-
Ein
5 mm langes Stück
des Mäuseschwanzes
wurde jungen, möglicherweise
transgenen Mäusen
im Entwöhnungsalter
(3 Wochen) entfernt und in flüssigem
Stickstoff eingefroren. Zu dem gefrorenen Gewebe wurde 840 μl Lyselösung hinzugefügt (8 mM
EDTA – 0,8%
SDS – 0,8%
2-Mercaptoethanol – 80 μg/ml Proteinase
K-1 M Natriumchlorat in 40 mM TRIS Puffer pH 8,0 und 120 mM NaCl,
und das Gemisch wurde bei 50 °C
inkubiert. Das Gemisch wurde dann 10-15 Sekunden lang mit 250 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1)
extrahiert, dann 10 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit
(ungefähr
830 μl)
wurde entfernt und in ein frisches Röhrchen gegeben und durch Vortexen
der Lösung
mit 0,6 Volumina Isopropanol wurde ein DNA Klumpen produziert. Die
Mutterlauge wurde abdekantiert und der DNA Klumpen wurde zweimal
mit 80%igem Ethanol abgespült.
Der DNA Klumpen wurde isoliert durch 5 min langes Zentrifugieren,
Aspiration der überstehenden
Flüssigkeit
und 10 min dauerndes Lufttrocknen des Klumpens mit einem Luftstrom.
-
Der
DNA Klumpen wurde in 250 μl
TE Puffer aufgelöst
(10 mM Tris-HCl, pH 7,0-1 mM EDTA, und die Lösung wurde 1 h lang bei 37 °C mit 10 μl einer RNAse
Mischung (1 mg/ml RNAse A und 4.000 Einheiten/ml RNAse T1) behandelt.
Dieses Gemisch wurde 5-10 Sekunden lang mit 50 μl einer 24:1 (Volumen/Volumen) Lösung von
Chloroform-Isoamylalkohol geschüttelt,
zentrifugiert und die überstehende
Flüssigkeit
wurde in ein frisches Röhrchen überführt.
-
Die
oben gewonnene überstehende
Flüssigkeit
wurde nacheinander mit 25 μl
3 M Natriumacetat und 0,5 ml 95%igem Ethanol gemischt. Die überstehende
Flüssigkeit
wurde von der ausgefällten
DNA abdekantiert und der Niederschlag wurde mit 80%igem Ethanol
gewaschen. Die gereinigte DNA wurde durch Zentrifugieren isoliert,
an der Luft getrocknet, dann in 150 μl TE aufgelöst.
-
Im
Wesentlichen die gleiche Methode wurde verwendet, um DNA aus Schweinen
zu präparieren,
und die gleichen oder ähnliche
Techniken können
verwendet werden, um DNA aus anderen Tieren zu präparieren.
-
PCR
Reaktionen an DNA Proben, die aus Gewebeproben der transgenen Tiere
isoliert wurden, wurden in herkömmlicher
Weise durchgeführt,
wie oben beschrieben wurde. Die Konzentrationen der DNA Isolate wurden
bestimmt, indem man das Absorptionsvermögen von 1:20 Verdünnungen
der oben beschriebenen TE Lösungen
bei 260 nm maß.
Ein Teil der Probe wurde dann in 100 μl TE auf eine Konzentration
von 30 ng/μl verdünnt. PCR
Reaktionsmischungen (20 μl
Volumen)
| Komponente | Volumen
(μl) | Konzentration |
| HOH | 13,25 | - |
| 10 × Taq Puffer | 2,5 | 1 |
| dNTPs | 2,0 | 0,2
mM |
| MgCl2 | 1,5 | 1,5
mM |
| Primer
1 | 0,3125 | 0,5 μM |
| Primer
2 | 0,3125 | 0,5 μM |
| Taq
Polymerase | 0,125 | 25 μU/μl |
| DNA
Templat | 1,0 | 1,2
ng/μl |
-
Verfahren
-
Embryonen-Lysepuffer
(5 μl, 0,9%
Nonidet P-40 und 0,9% Tween 20 in 20 mM TRIS Puffer) wurde zu jedem
PCR Röhrchen
hinzugegeben, zusammen mit 1 μl
der hergestellten DNA Lösung,
und das Gemisch wurde mit 25 μl
Mineralöl überschichtet.
Die Röhrchen
wurden in einen automatischen Temperaturcycler (wie beispielsweise
den von N. J. Research hergestellten) gebracht und 2 min lang auf
98 °C erhitzt;
die Temperatur wurde dann auf 85 °C
gesenkt.
-
PCR
Reaktionsmischung (20 μl)
wurde zu jedem Röhrchen
hinzugegeben und 40 Zyklen des folgenden Protokolls wurden durchgeführt:
20
Sekunden dauernde Denaturierung bei 96 °C
1 Minute langes Tempern
bei 55 °C
30
Sekunden dauernde Verlängerung
bei 75 °C
-
Die
Produkte der PCR Reaktion wurden analysiert, indem man 20% der Produkte
des Reaktionsgemischs auf Agarosegelen laufen ließ und die
Größe der Fragmente
durch Vergleich mit Fragmenten von Marker-DNA identifizierte.
-
7 zeigt,
dass eine Auswahl von primär
transgenen Tieren, die A+ und/oder B+ und/oder G+ Konstrukte aufweisen,
alle drei oder einige der A+, B+ und G+ Transgene übertragen
können.
Alle Tiere wurden aus Embryonen erzeugt, die Coinjektionen der gleichen
DNA Lösung
erhielten, die alle A+, B+ und G+ Konstrukte enthielt. Der Nachweis
von A+, B+ und G+ DNAs wurde mittels PCR durchgeführt, wie
oben beschrieben. Die primär
transgenen Tiere 1, 23, 109 und 112 wiesen alle drei Transgene auf.
Das primär
transgene Tier 85 wies nur A+ und B+ auf. Diese primär transgenen
Tiere wurden mit (nicht transgenen) Kontrollmäusen ausgekreuzt. Tier 1 und
109 gaben alle drei Transgene an jeweils 5 von 13 bzw. 5 von 11
Nachkommen weiter, was typisch ist für Mendelsche genomische Weitergabe
für ein
einzelnes Allel. Die primär
transgenen Tiere 23 und 112 gaben einige Transgene an jeweils 6
von 12 bzw. 7 von 8 Tieren weiter. Etliche Nachkommen von Tier 23
wiesen nur B+ auf, während
ein Nachkomme von Tier 112 nur A+ aufwies und andere A+ und G+ aufwiesen. Daher
sind die primär
transgenen Tiere 23 und 112 Beispiele von dreifach transgenen Tieren,
die ein bestätigtes
separates B+ Allel im Fall von Tier 23 aufweisen und ein separates
A+ und B+ Allel im Fall von Tier 112 aufweisen. Das primär transgene
Tier 85 ist auch ein Beispiel einer Maus mit einem ausschließlich B+
Allel. Daher kann eine Kreuzung von Tieren, die separate Allele
und damit Orte für
jedes Gen aufweisen, durchgeführt
werden, um die Expression zu erhöhen
(die Kontrolle über
eine in der Rate beschränkte
B+ Kette kann überwunden
werden, indem man ein B+ Allel mit einem stärker induzierbaren Ort einsetzt).
Außerdem
können doppelte
und dreifache Heterozygoten des gleichen Gens (entweder A+ und/oder
B+ und/oder G+) erhalten werden, um die Produktionsmengen zu erhöhen (d.
h. Erzeugen eines A+ B+ G+, B+ Tieres durch Kreuzung mit einem B+
Tier und weiteres Kreuzen dieses A+ B+ G+, B+ Tieres mit einer anderen
B+ Linie, um A+ B+ G+, B+ B+ zu erhalten).
-
BEISPIEL 5
-
Transgene Schweine
-
Embryonen
wurden aus dem Eileiter entnommen. Sie wurden in ein 1,5 ml Microfuge
Röhrchen
gebracht, das ungefähr
0,5 ml Embryonenübertragungsmedien
(phosphatgepufferte Salzlösung
+ 10% fötales Kälberserum,
Gibco BRL) enthielt. Diese wurden dann 12 Minuten lang bei 16.000 × g RCF
(13.450 U/min) in einer Mikrozentrifuge (Allied Instruments, Modell
235C) zentrifugiert. Embryonen wurden aus dem Microfuge Röhrchen mit
einer gezogenen und polierten Pasteur-Pipette entnommen und zur
Untersuchung in eine 35 mm Petrischale gelegt. Wenn das Zytoplasma
noch durch Lipid milchig war, so dass Pronuclei nicht sichtbar waren, wurden
die Embryonen nochmals 15 Minuten lang zentrifugiert. Die Embryonen
für die
Mikroinjektion wurden in einen Mikrotropfen der Medien (ungefähr 100 μl) in der
Mitte des Deckels einer 100 mm Petrischale eingebracht. Silikonöl wurde
benutzt, um den Mikrotropfen zu bedecken und den Deckel zu füllen, um
ein Verdampfen der Medien zu verhindern. Der die Embryonen enthaltende
Deckel der Petrischale wurde auf ein Umkehrmikroskop (Carl Zeiss)
gestellt, das ausgerüstet
war mit einem heizbaren Tisch und Hoffman Modulation Kontrastoptik
(200 × Endvergrößerung).
Eine fein gezogene (Kopf Vertikal-Pipettenzieher, Modell 720) und
polierte (Narishige Microforge, Modell MF-35) Mikropipette wurde
benutzt, um die Embryonen zu stabilisieren, während ungefähr 1-2 Pikoliter der durch
HPLC gereinigten DNA Lösung,
die ungefähr
200-500 Kopien des DNA Konstrukts enthielt, mit einer anderen fein
gezogenen Mi kropipette in den männlichen
Pronucleus eingebracht wurden. Die Embryonen, die das Mikroinjektionsverfahren überlebten,
was durch morphologische Beobachtung beurteilt wurde, wurden für die Übertragung
in das Empfängerschwein
in ein Polypropylen-Röhrchen
(2 mm Innendurchmesser) eingebracht. Sieben chirurgische Übertragungen
von Schweineembryonen wurden durchgeführt. Diesen Embryonen waren
die WAP-Fibrinogen
cDNA Konstrukte coinjiziert worden, die in den oben erwähnten Fibrinogen-transgenen
Mäusen
benutzt wurden. Nur bei einer dieser Emfängersauen konnte eine Schwangerschaft
durch Ultraschall bestätigt
werden. Die (anscheinend) nicht schwangeren Tiere wurden bis zum
abgeschätzten
Ende der Tragezeit gehalten, da ihre (potenziellen) Wurfgrößen zu klein
gewesen sein könnten,
um durch Ultraschallanalyse entdeckt zu werden (in der Vergangenheit
hatten wir 3 Würfe
von 4 Ferkeln oder weniger gehabt, die nicht durch Ultraschall entdeckt
worden waren. Einige dieser Würfe
produzierten transgene Tiere.) Tabelle
5 Daten
von Fibrinogen Schweineembryonen
| | Exp.
1 | Exp.
2 | | |
| | | | Gesamtzahlen | Übertragung |
| | | | 10/25/93 | ID |
| Zahl
der Spender: | 8 | 8 | Transfer
#1 | |
| | | | 50
Embryonen | #129 |
| Zahl
der Ovulationen: | 261 | 283 | Transfer
#2 | |
| | | | 47
Embryonen | #147 |
| gesammelte
Embryonen: | 250 | 296 | Transfer
#3 | |
| | | | 44
Embryonen | #108 |
| Zahlder
UFOs: | 99 | 77 | | |
| Sichteilende
UFOs: | 29 | 6 | | |
| injizierte
Anzahl: | 141 | 219 | 10/28 | |
| übertragene
Anzahl: | 141 | 200 | Transfer
#1 | |
| | | | 50
Embryonen | #114 |
| Übertragungen: | 3 | 4 | Transfer
#2 | |
| | | | 50
Embryonen | #139 |
| Embryonen/Übertragung: | 47 | 50 | Transfer
#3 | |
| | | | 50
Embryonen | #140 |
| Ovulationen/Schwein: | 32,6 | 35,3 | Transfer
#4 | |
| | | | 50
Embryonen | #131 |
| Embryonen/Schwein: | 31,2 | 37 | | |
-
Allen
Embryonen wurden die drei Fibrinogen-Konstrukte in einer DNA Gesamtkonzentration
von 5 μg/ml
oder etwa 200-300
Kopien jedes Konstrukts pro pl injiziert.
-
BEISPIEL 6
-
Praparation von Milch und Molke aus transgenen
Tieren
-
Milchgebende
Mäuse wurden
einmal etwa an Tag 12 der Laktation gemolken. Die Mäuse wurden
zuerst ungefähr
5 Stunden lang von ihren Jungen getrennt. Sie wurden dann mit 0,4
ml Avertin in einer Konzentration von 2,5 (i.m.) betäubt, und
0,2 ml Oxytocin wurde dann in einer Konzentration von 2,5 IU/ml
(i.p.) verabreicht, um die Freisetzung der Milch zu ermöglichen.
Eine Melkvorrichtung, die aus einer Vakuumpumpe (2,5 psi) und einer
Spritze mit einer Eppendorf-Spitze
bestand, wurde benutzt, um Milch in ein Eppendorf Röhrchen zu
leiten. Wie oben angemerkt, sollte Milch wegen der Kryopräzipitation
des Fibrinogens nicht auf Eis gelegt werden.
-
Um
Molke herzustellen, wurde Milch 1:1 mit IRIS Puffer (0,03 M Tris
pH 7,4; 0,06 M NaCl) verdünnt und
bei Zimmertemperatur in einem TLA-100 Rotor in einer Beckman TL-100
Tisch-Ultrazentrifuge 30 Minuten lang bei 51.000 U/min (89.000 × g) zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurde die Molke (unterstehende Flüssigkeit)
mit einer Kanüle
Nr. 18 gesammelt, wobei man das Kaseinpellet und die obere Rahmschicht
in dem Röhrchen
beließ.
Um Feststoffe oder Rahm abzutrennen, die während der anfänglichen
Entnahme mit transferiert wurden, wurde die aus der ersten Zentrifugation
erhaltene Molke 30 min lang einer zweiten Drehbeschleunigung bei
12.000 U/min in einem TMA-4 Rotor in einer Tomy MTX-150 Zentrifuge
unterworfen. Nach der zweiten Drehbeschleunigung wurde die Molke
gewonnen wie zuvor.
-
BEISPIEL 7
-
Bestimmung von Fibrinogen in Milch durch
Sandwich ELISA
-
Eine
Sandwich ELISA wurde verwendet, um die Menge von FIB Protein, die
von primär
transgenen Tieren und transgenen Tieren aus deren Nachkommenschaft
produziert wird, in der verdünnten
entrahmten oder entfetteten Milch (hier als „Molke" bezeichnet) zu messen; der Molkewert
wird verwendet, um die Konzentration von FIB in Vollmilch abzuschätzen.
-
Im
Allgemeinen wird im ersten Schritt des P/M ELISA Systems eine Fibrinogen-
oder Fibrinogenketten-Analyt enthaltende Probe (z. B. Molke) mit
einem anti-Mensch Fibrinogen mAb von Mäusen (Klon Nr. 311, American
Diagnostics) inkubiert, der mit der alpha-Kette von Fibrinogen reagieren
kann, um einen ersten mAb-Fibrinogen (oder -ketten) Komplex zu bilden.
Dieser erste Komplex wird dann durch Inkubation mit polyklonalen
anti-Mensch Fibrinogen Antikörpern
von Kaninchen „eingefangen", die in den Vertiefungen
von Mikroliter-Platten
immobilisiert sind. Im Nachweisschritt wird das eingefangene Fibrinogen
(oder die alpha-Ketten) mit markiertem (Meerrettich-Peroxidase)
anti-Maus IgG in Kontakt gebracht, und die Menge des Markers wird
quantitativ be stimmt durch Reaktion mit o-Phenylendiamin und Messung
des Absorptionsvermögens
bei 490 nm; dies ist ein Maß für die vorhandene
Menge an Analyt. Standardkurven wurden erhalten, indem man die Molke
von (nicht transgenen) Kontrolltieren mit reinem menschlichem FIB
Referenzmaterial versetzte. Auf diese Weise wird die Anwesenheit
von Hintergrundmengen von FIB durch die Standardkurve normalisiert.
Diese Sandwich ELISA ergibt sehr niedrige Hintergrundwerte (ungefähr 0,06
Absorptionseinheiten bei 490 nm) für Mäusemolke allein, ohne menschliches
FIB. Beachten Sie, dass die typischen Signale, die in Tabelle 6
angegeben sind, ungefähr
0,25 oder mehr Absorptionseinheiten bei dieser Wellenlänge betragen.
-
Im
P/P System wurden Immulon II Mikroliter-Platten mit 96 Vertiefungen
24 h lang bei Kühlschranktemperaturen
mit 100 μl/Vertiefung
1:500 verdünntem
anti-Mensch FIB von Kaninchen (Celsus Kat. Nr. 60960) in 0,1 M NaHCO3 – 0,1
M NaCl, pH 9,6, beschichtet. Beschichtete Vertiefungen wurden dreimal
mit Wasch-Puffer (25 mM Tris-HCl – 50 mM NaCl – 0,5% Tween-20,
pH 7,0) gewaschen und 20 min lang bei Zimmertemperatur mit Verdünnungs-Puffer
(1 mg/ml PEG in 25 mM Tris-HCl – 50 mM
NaCl, pH 7,0) blockiert. 100 μl
Standard menschliches FIB (Bereich von 100 ng/ml bis 1,9 ng/ml)
und/oder 100 μl
verdünnte
Milchprobe wurden in jede Vertiefung gegeben und die Gemische wurden
45 min lang bei 37 °C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden gewaschen und wie oben beschrieben
10 min lang bei Zimmertemperatur blockiert. 100 μl 1:1000 verdünnte Meerrettichperoxid-konjugiertes
anti-Mensch FIB von Kaninchen wurden in jede Vertiefung gegeben
und die Gemische wurden 45 min lang bei 37 °C inkubiert. Nach Waschen der
Vertiefungen, wie oben beschrieben, wurden 100 μl o-Phenylendiamin-Lösung (1
Tablette/5 ml Verdünnungsmittel)
in jede Vertiefung hinzugefügt. Nachdem
man zur Farbentwicklung ungefähr
2-3 min gewartet hatte, wurden die Reaktionen durch die Zugabe von
100 μl 3
N H2SO4 (richtig:
H2SO4) zu jeder
Vertiefung abgestoppt. Die Platten wurden dann bei 490 nm gelesen.
-
Tabelle
6 stellt die Resultate der Analysen von rhFIB durch das das oben
beschriebene P/M ELISA System in der Molke der ersten Laktation
(und rechnerisch in der Vollmilch) von drei primär transgenen Mäusen (Fo),
deren Genom jede der cDNAs der Aα,
Bβ und Gγ Ketten für menschliches
Fibrinogen enthielt, dar. In diesem Experiment bezieht sich „Molke" auf Magermilch,
die 1,7× mit
EDTA verdünnt
worden war, um die Kaseine zu solubilisieren. Die Durchschnitte
von vier Verdünnungen
jeder Molkeprobe für
die drei Testtiere betrugen jeweils etwa 16,3, 3,86 bzw. 7,55 μg/ml. Die
entsprechenden Werte für
Vollmilch betrugen 27,6, 6,56 und 12,8. Die Produktion von rhFIB
in der zweiten Laktation war gleich bzw. ähnlich.
-
In
einem anderen Experiment mit denselben Tieren betrugen die Fibrinogenkonzentrationen
in der Molke der ersten Laktation im Durchschnitt etwa 22 ± 4 (Tier
1), 9 ± 2
(Tier 22) und 11 ± 3
(Tier 23) μg/ml.
Die zweite Laktation von Tier 1 produzierte 17 ± 3 μg/ml Molke.
-
Das
P/M ELISA System wurde benutzt, um rhFIB in der Milch der dritten
Laktation von Maus Nr. 1/Fo und der ersten Laktation von weiblichen
Abkömmlingen
(1-11/F1) der Maus Nr. 1 zu untersuchen. Wie in den Daten von Tabelle
7 gezeigt ist, hatte Maus Nr. 1/Fo ungefähr 71 μg/ml und ihr Abkömmling (Nr.
1-11/F1) hatte etwa 53 μg/ml
FIB Gesamtsignal. Somit wird die Menge von rFIB nach Subtraktion
des Hintergrunds zu jeweils ungefähr 50 μg/ml für Maus Nr. 1/Fo bzw. ungefähr 32 μg/ml für Abkömmling 1-11/F1 über dem
des auf Grund von Übertritt
aus dem Serum in die Milch vorhandenen endogenen FIB errechnet.
Der etwas niedrigere Wert (28 μg/ml)
aus der P/M Untersuchung der vorhergehenden Lak tation von Maus Nr.
1/Fo unterscheidet sich nicht signifikant von dem P/P Wert, wenn
die niedrigere Nachweisempfindlichkeit des ersteren Verfahrens in Betracht
gezogen wird. Es sei angemerkt, dass das Sammeln von Mäusemilch
inhärent
traumatisch ist und zu einem Übertritt
von endogenem mFIB aus dem Serum führt.
-
Zusammengefasst
produzierte Maus Nr. 1/Fo (primär
transgenes Tier) rFIB in Milch in einer Konzentration von ungefähr 30 μg/ml oder
mehr über
3 Laktationen, wie durch entweder das P/M oder das P/P ELISA Verfahren
ermittelt wurde, und hat dieses Merkmal an die F1 Generation weitergegeben,
die in Maus Nr. 1-11/F1 32 μg/ml
rFIB produzierte. TABELLE
7 Erblichkeit
des transgenen rhFIB Gens
| Maus
Nr. | μg rhFIB/ml
5× | μg rhFIB/ml
Milch |
| | verdünnte Molke | |
| 1/Fo | 14,0 ± 2,0 | 71,0 |
| 1-11/F1 | 10,4 ± 0,8 | 53,0 |
| Kontrollmolke | 4,0 ± 0,7 | 21,0 |
-
Diese
Produktionsmengen sind wesentlich größer als die 2 μg/ml, die
in dem COS1 System produziert wurden, das beschrieben wurde von
Roy et al., 1991, siehe oben.
-
Western
Analyse von Kontroll-Mäusemilch
unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen menschliches Fibrinogen
zeigte ungefähr
21 μg/ml
Fibrinogen-Hintergrundsignal (siehe Tabelle 7). Western Analyse,
welche den monoklonalen Antikörper
mit der Klonnummer 311 oder Y18 verwendet, hat eine untere Empfindlichkeitsgrenze
von ungefähr
1 μl Probe
von 100 μg/ml
Fibrinogen (Phastgel System) oder von 20 μl von 25 μg/ml in einem 3 Zoll mal 4 Zoll
SDS-PAGE Gel. TABELLE 6
| | A | B | C | D | E | Molke | Milch |
| 1 | Tier | Verdünnungen | AVG
ABS 490 nm | | FIB μ/ml | AVG
FIB μ/ml | AVG
FIB μ/ml |
| 2 | #1
Tag 6 | 100 | 0,623 | 0,132 | 13,2 | | |
| 3 | | 200 | 0,523 | 0,088 | 17,6 | 16,3 | 27,6 |
| 4 | | 400 | 0,434 | 0,049 | 19,4 | | |
| 5 | | 800 | 0,334 | 0,018 | 14,7 | | |
| 6 | | | | | | | |
| 7 | #22 | 100 | 0,374 | 0,022 | 2,16 | | |
| 8 | | 200 | 0,335 | 0,018 | 3,69 | 3,86 | 6,56 |
| 9 | | 400 | 0,273 | 0,014 | 5,73 | | |
| 10 | | 800 | 0,251 | 0,013 | 10,3 | | |
| 11 | | | | | | | |
| 12 | #23 | 100 | 0,477 | 0,067 | 6,75 | | |
| 13 | | 200 | 0,384 | 0,026 | 5,22 | 7,55 | 12,8 |
| 14 | | 400 | 0,338 | 0,019 | 7,44 | | |
| 15 | | 800 | 0,261 | 0,013 | 10,8 | | |
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