JP2002525047A - 尿における組換え蛋白質の産生 - Google Patents

尿における組換え蛋白質の産生

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コスタス エヌ． カラタザス
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ネクシア バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、分泌されたポリペプチドの発現を誘導するために、ウロモジュリン遺伝子プロモーターを用いることによって、またはその産物が腎臓において特異的に発現されている遺伝子の他のプロモーターを用いることによって、尿中に分泌されるポリペプチドを産生する方法を提供する。同様に、その尿中に組換えポリペプチドを分泌するトランスジェニック動物と共に、動物が子宮内に存在するあいだにそのような動物を検出する方法も開示する。同様に、ウロモジュリン遺伝子プロモーター、または他の腎臓特異的遺伝子プロモーターに機能的に結合したポリペプチドコード核酸配列によって形質転換した培養腎細胞の馴化培地に分泌されるポリペプチドを産生する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は、その尿中に組換えポリペプチドを分泌することができるトランスジ
ェニック動物に関する。
【０００２】 動物をバイオリアクターとして利用して組換え蛋白質を産生することは、適切
に折り畳まれる可能性が高い組換え蛋白質を産生するという利点を有する。さら
に、動物は繁殖することができるため、それらは組換え蛋白質のほぼ無尽蔵の起
源となる。動物の体液に組換え蛋白質を産生させることは広く用いられている。
その例には、乳汁特異的プロモーターを用いた乳汁中への組換え蛋白質の分泌が
含まれる。
【０００３】 尿は、以下の理由から組換えポリペプチドの乳汁特異的発現に対してより利点
を有する：（1）尿からの組換えポリペプチド産生のプロセスは出生後直ちに始
まる（または出生前でも）；（2）授乳プロセスとは異なり、尿特異的組換えポ
リペプチド産生は、トランスジェニック動物のホルモンまたは生殖状態に依存し
ない；および（3）雄性動物も雌性動物も尿からの組換えポリペプチド産生のた
めに用いることができる。さらに、尿は乳汁と比較して含有する蛋白質量が本来
非常に少量であり、このために、トランスジェニック動物の尿からの組換えポリ
ペプチドの単離が容易である。
【０００４】 組換え蛋白質はウロプラキンII遺伝子の膀胱特異的プロモーターを用いて尿中
に分泌させることができることが最近報告された。詳しく述べると、ウロプラキ
ンIIプロモーターの影響下で組換え型ヒト成長ホルモン（rc hGH）の少量（150
μg/L）がトランスジェニックマウスの尿中に分泌された（ケールら（Kerr）、N
ature Biotechnology 16：75〜79、1998）。しかし、膀胱は分泌器官ではないた
め、ウロプラキンIIプロモーターを用いた組換え蛋白質の分泌は妨害される可能
性がある。
【０００５】発明の概要 本発明は、発現がウロモジュリン遺伝子プロモーターまたはその産物が腎臓に
おいて特異的に発現される遺伝子からの別のプロモーターによって促進され、そ
れによって腎臓からポリペプチドを発現させて尿中に分泌させ、そこからポリペ
プチドを単離することができる、所望のポリペプチドを含む導入遺伝子を提供す
る。
【０００６】 したがって、第一の局面において、本発明は、動物の腎組織によって尿中に細
胞外分泌された組換えポリペプチドを産生することができるヒト以外の尿分泌ト
ランスジェニック動物を提供する。動物は、哺乳動物であってもよく、かつ反芻
動物であってもよく、または反芻動物でなくともよい。本発明において有用であ
るヒト以外の尿分泌哺乳動物の代表的なものには、齧歯類、ウサギ、ブタ、ヤギ
、ヒツジ、ウマ、およびウシが含まれるがこれらに限定されることはない。
【０００７】 本発明の第一の局面の一つの態様において、組換えポリペプチドは尿中の望ま
しくない成分（例えば、アンモニア）を分解する、または分解反応を触媒するこ
とができる酵素である。
【０００８】 第二の局面において、本発明は、以下の段階を含む、トランスジェニック動物
の尿を得る方法を提供する：（a）発現される関心対象の核酸配列に機能的に結
合している腎特異的遺伝子の制御エレメント（5'末端プロモーター配列および3'
末端エレメントを含む）からなるトランスジェニック構築物を作製する段階；（
b）トランスジェニック動物を作製する前に構築物をスクリーニングする段階；
この構築物のスクリーニングは、腎上皮細胞において行うことができる；（c）
ヒト以外の動物のゲノムにトランスジェニック構築物を挿入する段階；（d）こ
のヒト以外の動物から尿を採取する段階；および（e）動物の尿から産物を単離
する段階。好ましくは、腎特異的遺伝子はウロモジュリン遺伝子である。
【０００９】 第三の局面において、本発明は、導入遺伝子が、（a）関心対象のトランスジ
ェニック動物の腎分泌細胞において機能的である腎特異的遺伝子からのプロモー
ターと、（b）該トランスジェニック種の腎分泌細胞において機能的であるリー
ダー配列と、（c）組換え型内因性または外因性産物をコードする核酸配列とを
含む、トランスジェニック動物を作製するために有用な導入遺伝子を特徴とする
。好ましくは、腎特異的遺伝子は、ウロモジュリン遺伝子である。好ましくは、
リーダー配列は、トランスジェニック動物の腎分泌細胞において分泌された組換
えポリペプチド（核酸配列によってコードされる）の発現を誘導することができ
る機能的導入遺伝子を形成するために、核酸配列に機能的に結合している。好ま
しくは、腎特異的遺伝子プロモーターはトランスジェニック動物と同じ種の動物
に由来する（例えば、ヤギウロモジュリン遺伝子からのプロモーターを、トラン
スジェニックヤギを作製するために用いる）。
【００１０】 本発明の第三の局面の一つの態様において、導入遺伝子はまた、5'または3'領
域に、インスレータエレメント（insulator element）配列またはマトリクス結
合領域の少なくとも１つのコピーを含む。好ましくは、導入遺伝子は４つの機能
的領域を含む：（i）インスレータエレメント配列；（ii）腎特異的発現調節部
位（例えば、ウロモジュリン遺伝子プロモーター）；（iii）リーダー配列；お
よび（iv）関心対象のポリペプチドをコードする核酸分子。関心対象のポリペプ
チドをコードする核酸配列は、cDNAもしくはゲノムDNAであってもよく、または
１つ以上のポリペプチド、または異なる２つの活性を含むドメインを有する異な
る２つの蛋白質のハイブリッド（例えば、インスリンと融合させた、免疫グロブ
リンのFc部位を含むハイブリッドポリペプチド）をコードしてもよい。
【００１１】 第四の局面において、本発明は、尿が内因性または外因性組換え型ポリペプチ
ドを含むことを特徴とし、かつトランスジェニック動物によって分泌される、ヒ
ト以外のトランスジェニック哺乳動物からの尿を提供する。トランスジェニック
動物は、核酸配列が腎特異的遺伝子（例えばウロモジュリン遺伝子）からの制御
エレメントに機能的に結合している、関心対象の組換えポリペプチドをコードす
る核酸配列を含む導入遺伝子をそのゲノムに導入することによって作製する。一
つの態様において、制御エレメントは遺伝子プロモーターである。
【００１２】 第五の局面において、本発明は、（i）ポリペプチドをコードする核酸配列と
、（ii）プロモーターが配列に機能的に結合し、かつプロモーターが核酸配列と
天然に会合していない、腎特異的遺伝子（例えば、ウロモジュリン遺伝子）から
のプロモーターと、（iii）尿産生細胞によって動物の尿中にポリペプチドを分
泌させるリーダー配列とを含む核酸分子を提供する。様々な態様において、腎特
異的遺伝子は、ウシ、ヒト、および齧歯類からなる群より選択され、動物は哺乳
動物であるか、または齧歯類および反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジ、もしくは
ヤギ）からなる群より選択される。ポリペプチドは、生物学的活性があってもよ
く、または可溶性であってもよい。
【００１３】 第六の局面において、本発明は、動物における尿産生に関与する細胞のゲノム
は、（i）ポリペプチドをコードする核酸配列と；（ii）プロモーターが配列に
機能的に結合し、プロモーターが核酸配列に天然に会合していない、腎特異的遺
伝子（例えば、ウロモジュリン遺伝子）からのプロモーターと；（iii）尿産生
細胞によって動物の尿中にポリペプチドを分泌させるリーダー配列とを含む核酸
分子を含む動物を提供する。様々な態様において、細胞は腎分泌細胞であり、動
物は齧歯類および反芻動物（ウシ、ヒツジ、またはヤギ）からなる群より選択さ
れ、かつ動物は哺乳動物である。
【００１４】 第七の局面において、本発明は、以下の段階を含む、動物の尿中に分泌される
ポリペプチドを産生する方法を特徴とする：（a）トランスフェクトした胚細胞
に由来する腎細胞からポリペプチドを発現させ、かつ分泌させ、プロモーターが
核酸配列と天然に会合していない、腎特異的遺伝子プロモーター（例えばウロモ
ジュリン遺伝子プロモーター）に機能的に結合したポリペプチドコード核酸分子
をトランスフェクトさせた胚細胞を提供する段階；（b）胚細胞を増殖させて、
ポリペプチドを発現および分泌する細胞を含む動物を作製する段階；ならびに（
c）ポリペプチドを発現および分泌する動物細胞から蛋白質を単離する段階。好
ましくは、動物は哺乳動物である。
【００１５】 第八の局面において、本発明は、以下の段階を含む、ポリペプチドを産生する
方法を特徴とする：（a）細胞が、（i）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
（ii）プロモーターが核酸配列に天然に会合していない、細胞においてポリペプ
チドの発現を誘導する腎特異的遺伝子プロモーター（例えば、ウロモジュリン遺
伝子プロモーター）と、（iii）細胞によるポリペプチドの分泌を引き起こすリ
ーダー配列とを含む核酸分子にトランスフェクトしている、動物細胞を提供する
段階；（b）トランスフェクト細胞を培養する段階；および（c）培養トランスフ
ェクト細胞の培養液からポリペプチドを単離する段階。様々な態様において、細
胞は腎分泌細胞または不死化細胞である。好ましくは、動物は哺乳動物である。
【００１６】 第九の局面において、本発明は、脊椎動物の尿中に、ジスルフィド結合によっ
て互いに結合している二つまたはそれ以上のサブユニットを含む組換え蛋白質を
産生する方法を特徴とする；方法は以下の段階を含む：（a）組換え蛋白質の尿
特異的産生を示すトランスジェニック脊椎動物を提供する段階；（b）脊椎動物
から尿を採取する段階；および（c）尿から蛋白質を単離する段階。本発明の関
連する局面は、この方法において用いられる脊椎動物である。方法はウロプラキ
ンI、ウロプラキンII、またはウロモジュリンプロモーターを用いることができ
る。方法の好ましい態様において、蛋白質は、動物の尿中に排泄されると、それ
が生物学的に活性となるように折り畳まれる（すなわち、蛋白質の本来の型の生
物活性の少なくとも幾つかを示す）。または、活性蛋白質のおそらく有害な作用
から動物を保護するために、分泌時には蛋白質を部分的または完全に不活性にし
て、動物の尿を採取後に単純な手段によって活性化することができるように、蛋
白質を意図的に遺伝子操作することができる。そのような方法は既知であり、本
出願と同一出願人による、米国特許出願第08/775,842号に記載されている。
【００１７】 本発明の第九の局面に従って産生される多量体蛋白質の例は、任意のアイソタ
イプのモノクローナル抗体、およびヘテロダイマー生殖ホルモンである。この分
類における主なホルモンは、卵胞刺激ホルモン（FSH）、黄体形成ホルモン（LH
）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）である。これらのホルモンのそれ
ぞれはαサブユニットおよびβサブユニットを含む糖蛋白質である；３つのホル
モン全てのαサブユニットは同一であるが、βサブユニットはそれぞれのホルモ
ンに関して異なり、生物機能に特異性を与えている。FSHおよびLHはヒト尿から
精製されている重要な製品である。これらのホルモンは現在、培養哺乳動物細胞
において組換え型として製造されている。これらのホルモンの全ての配列は既知
である。例えば、国際公開公報第90/02757号は、LHとFSHの配列を示している。
【００１８】 本発明の第九の局面におけるプロセスはまた、もう一つの重要な市販のホルモ
ン製品、すなわちαサブユニットおよびβサブユニットを含むヘテロダイマー糖
蛋白質である妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）を産生するために用いることがで
きる。本方法はまた、性腺において産生されるヘテロ二量体糖蛋白質であるイン
ヒビンおよびアクチビン（activin）を製造するためにも用いることができる。
成熟インヒビンは、βA-またはβB-サブユニットのいずれかを有するαC-サブユ
ニットからなる。このファミリーの二量体のメンバーには、インヒビンA、イン
ヒビンB、アクチビンA、アクチビンAB、およびアクチビンB（ホモダイマーであ
り、本発明において同様に含まれる多量体蛋白質のクラスである）が含まれる。
【００１９】 本発明の第九の局面のプロセスはまた、ホモ三量体およびへテロ三量体型を含
む、任意のコラーゲンの多数の型を製造するために用いることができる：コラー
ゲン鎖の配列は既知であり、例えば、国際公開公報第96/03051号に開示されてい
る。本発明の第九の局面の方法はまた、フィブリノーゲンを産生するために用い
ることができ、これはその配列が既知であり、例えば国際公開公報第95/22249号
に記載されているヘテロ三量体蛋白質である。
【００２０】 本発明はまた、様々なポリペプチド、または同じポリペプチドの改変したもの
（例えば、保存的アミノ酸置換、またはポリペプチドの安定性を増強するアミノ
酸置換を含むポリペプチド）をコードする多数の導入遺伝子を提供する。これら
の多数の導入遺伝子は同時に、または連続的に同時インジェクション（すなわち
同時マイクロインジェクション）してもよい。このように、２つまたはそれ以上
のポリペプチドがトランスジェニック動物の尿中に分泌される。
【００２１】 「蛋白質」または「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後改変（例えば、グ
リコシル化または燐酸化）にかかわらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。
【００２２】 「天然に会合している」とは、二つの配列（例えば、プロモーターとポリペプ
チドコード配列）が、二つの配列が由来する生物の天然に存在するゲノムにおい
て機能的に結合していることを意味する。例えば、ウシウロモジュリン遺伝子プ
ロモーターは、ウシウロモジュリンコード配列と天然に会合している。
【００２３】 「天然に会合していない」とは、二つの配列（例えば、プロモーターとポリペ
プチドコード配列）が、二つの配列の一つまたは双方が由来する生物の天然に存
在するゲノムにおいて機能的に結合していないことを意味する。例えば、ヤギウ
ロモジュリン遺伝子プロモーターは、ウシウロモジュリンコード配列に天然に会
合していない。さらに、ヤギウロモジュリン遺伝子プロモーターは、ヒトtPAコ
ード配列に天然に会合していない。
【００２４】 「腎特異的遺伝子」とは、その産物が腎細胞に限って発現される遺伝子を意味
する。腎特異的遺伝子の一つの好ましい例は、ウロモジュリン遺伝子である。こ
の定義から特に除外されるのは、ウロプラキン遺伝子であり、それらの産物は膀
胱において発現されるためである。
【００２５】 「インスレータエレメント（insulator element）配列」とは、導入遺伝子上
で関心対象の核酸分子の発現を誘導する調節エレメント（例えばプロモーター）
に機能的に結合すると、導入遺伝子が組み入れられているゲノムの位置によらず
、核酸分子を発現させる核酸配列を意味する。典型的に、インスレータ配列は、
プロモーター配列の5'に隣接して存在する。
【００２６】 「リーダー配列」または「シグナル配列」とは、関心対象の核酸分子に機能的
に結合すると、核酸分子の産物を分泌させる核酸配列を意味する。リーダー配列
は、好ましくは核酸分子の5'に存在する。好ましくは、リーダー配列は、核酸分
子の転写を誘導するために用いられるプロモーターと同じ遺伝子から、または関
心対象の核酸分子が由来する遺伝子のいずれかから得る。
【００２７】 「トランスフェクト細胞」または「形質転換細胞」とは、中に（またはその祖
先の中に）組換え分子生物学技術によって、本発明のポリペプチドをコードする
核酸分子が導入されている細胞を意味する。好ましくは、細胞は多細胞動物（例
えば、哺乳動物）からの真核細胞である。
【００２８】 「胚細胞」とは、生物の全ての体細胞および生殖系列細胞に対して祖先となる
ことができる細胞である。例としての胚細胞は、胚肝細胞（ES細胞）および受精
卵である。好ましくは、本発明の胚細胞は哺乳動物の胚細胞である。
【００２９】 「生殖系列細胞」とは、減数分裂の産物である、真核細胞、前駆細胞、または
その子孫を意味する。
【００３０】 「機能的に結合する」とは、核酸配列と、一つまたは複数の調節配列（例えば
、プロモーター）とが、適当な分子（例えば、転写活性化蛋白質）が調節配列に
結合すると、核酸配列によってコードされる産物（即ち、ポリペプチド）が発現
および／または分泌されるように結合していることを意味する。
【００３１】 本明細書において遺伝子またはポリペプチドに関して用いられる「内因性」と
は、通常、動物に存在する遺伝子またはポリペプチドを意味する。
【００３２】 本明細書において遺伝子またはポリペプチドに関して用いられる「外因性」と
は、通常、動物に存在しない遺伝子またはポリペプチドを意味する。例えば、ヒ
ト成長ホルモンはトランスジェニックヤギに対して外因性である。
【００３３】 「導入遺伝子」とは、細胞またはその祖先に人工的に挿入されて、その細胞か
ら発達した動物のゲノムの一部となる核酸の任意の部分を意味する。そのような
導入遺伝子は、トランスジェニック動物に対して部分的もしくは完全に外因性（
即ち、外来性）である遺伝子を含んでもよく、または動物の内因性遺伝子に対し
て同一性を有する遺伝子を示してもよい。
【００３４】 「トランスジェニック」とは、細胞またはその祖先に人工的に挿入されて、そ
の細胞から発生した動物のゲノムの一部となる核酸配列を含む任意の細胞を意味
する。好ましくは、トランスジェニック動物は、トランスジェニック哺乳動物（
例えば、齧歯類または反芻動物）である。好ましくは核酸（導入遺伝子）は、人
工的に核ゲノムに挿入される。
【００３５】 「レポーター遺伝子」とは、発現が検出可能である産物をコードする任意の遺
伝子または核酸分子を意味する。レポーター遺伝子産物は以下の属性の一つを有
してもよいがこれらに限定されることはない：蛍光（例えば、緑色蛍光蛋白質）
、酵素活性（例えば、ルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ）、毒性（例えば、リシン）、試薬に対する耐性（例えば、neo
遺伝子によるネオマイシンに対する耐性、もしくはメタロチオネインコード遺伝
子による銅に対する耐性）の付与能、試薬に対する感受性の付与能（例えば、単
純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼコード遺伝子によるガンシクロビルに対す
る感受性）、またはビオチン、もしくは検出可能に標識した抗体のような、第二
の分子との特異的結合能（例えば、アビジンコード遺伝子によるビオチンとの結
合、または細胞表面に発現されたエピトープコード遺伝子による抗体（例えば、
検出可能に標識された）との結合）。
【００３６】詳細な説明 本発明は、ヒト以外の動物の尿中に組換え蛋白質を排泄するためのプロセスに
関する。このプロセスは、腎臓において組換え蛋白質を発現させて、それらを尿
中に分泌させるために、ウロモジュリンの調節エレメント（タム・ホースフォー
ルムコ蛋白（THS）／ウロムコイドとも呼ばれる）に基づくプロモーター配列、
または他の腎特異的遺伝子からのプロモーター配列を含む発現ベクターを利用す
る。
【００３７】 ウロモジュリンは、腎臓によって合成され、初期遠位尿細管および腎上行枝に
存在する。ウロモジュリンはヒト（30〜45 mg/24時間）およびラット尿（0.5〜2
.9 mg/24時間）において最も量の多い蛋白質である（ゴクヘールら（Gokhale）
、Urol. Res. 25：347〜354、1997）。ウロモジュリン蛋白質は、腎臓以外の正
常組織には検出されていない（ハウイら（Howie, A.J.）、J. Pathol. 153：399
〜404、1987）が、ウロモジュリンに対する抗体に交叉反応する蛋白質は、ヒト
およびラット血清において低レベルで同定されている（リン＆マーシャル（Lynn
and Marshall）、Biochem. J. 194：561〜568、1981；ワードナム＆ミルナー（
Wirdnam and Milner）、Nephron 40：362〜367、1985）。ウロモジュリンに対す
る抗体は、哺乳動物の腎臓においてヘンレ係締、特に幾つかの両生類および魚類
の皮膚の表層部、魚類の口腔粘膜およびえらの表層部、および両生類腎臓の遠位
尿細管と交叉反応する。鳥類および爬虫類では交叉反応は認められない（ハウイ
（Howie）ら、Cell Tissue Res. 274：15〜19、1993）。
【００３８】 ウロモジュリンは、インビトロ免疫抑制特性を有する616アミノ酸の85 kDa糖
蛋白質である。部分的ウシおよび齧歯類ウロモジュリンプロモーターがクローニ
ングされて、遠位プロモーターに典型的な制御転写エレメントを含むことが示さ
れている（ユら（Yu）、Gene Expr. 4：63〜75、1994）。ウロモジュリンレベル
は尿量を増加させることによって増大させることができることから、このように
、その発現がウロモジュリン遺伝子プロモーターによって誘導される、組換え産
物の総産生量を増加させる手段が提供されるため、ウロモジュリンプロモーター
を用いることは、尿分泌蛋白質を産生するために有用である。さらに、ウロモジ
ュリンは胎児の尿に分泌され、羊水を採取すると、その発現がウロモジュリン遺
伝子プロモーターによって誘導される組換え型（rc）ポリペプチドを発現するト
ランスジェニック胎児の早期検出が可能となり得る（フィミスター＆マーシャル
（Phimister and Marshall）、Clin. Chim. Acta. 128：261〜269、1983の方法
を参照のこと）。
【００３９】トランスジェニック構築物 腎分泌細胞から組換えポリペプチドの分泌を可能にするトランスジェニック構
築物の作製に関しては、如何なる適当な骨格を用いてもよい。関心対象の組換え
ポリペプチドをコードする核酸配列がゲノムDNAである場合、骨格となるプラス
ミドはコスミド（例えば、いずれもストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア
州から販売されているSuperCosまたはpWE15）に由来するものであってもよい。
【００４０】 好ましくは、骨格は、形質転換した細菌において容易な増殖および増幅を行う
ために、原核生物複製起点と共に、原核生物に関して用いられる選択マーカーを
コードする遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、およびクロラム
フェニコール）を有する。マイクロインジェクションを行う前に、完全なトラン
スジェニック構築物を、全ての細菌配列（すなわち、細菌の複製起点および細菌
の選択マーカー遺伝子）を除去することによって直鎖状にしてもよい。
【００４１】 さらに、骨格となるプラスミドは選択マーカー遺伝子を有しなければならない
が、これは真核細胞において選択するために用いてもよい（例えば、ハイグロマ
イシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、およびゼオマイシン）。そのような
マーカー遺伝子はその内因性プロモーター（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝
子の発現を誘導するピューロマイシン耐性遺伝子プロモーター）の発現下であっ
てもよい。または、比較的弱いプロモーター（例えば、SV40初期プロモーター）
を用いて、選択マーカー遺伝子産物の発現を誘導してもよい。
【００４２】 尿中で発現されて、分泌される核酸配列によってコードされる代表的なポリペ
プチドには、例えば、エリスロポエチン（EPO）、ヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子（htPA）、インスリン、抗体（例えば、モノクローナル抗体またはヒト
化抗体）、およびホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）が含まれるがこれらに
限定しない。
【００４３】 意図している基本的なトランスジェニック構築物は、以下のエレメントを含む
：プラスミド骨格；リーダー配列および関心対象のポリペプチドをコードする核
酸に機能的に結合した腎特異的遺伝子プロモーター（例えば、ウロモジュリン遺
伝子プロモーター）；ならびに核酸配列の停止コドンの3'に存在するポリアデニ
ル化シグナル。リーダー配列は、プロモーターが用いられる遺伝子、核酸配列、
または分泌されたもう一つの蛋白質のコード配列（例えば、Igκ遺伝子）に由来
してもよい。同様に、ポリアデニル化シグナルを含む3' UTRは、プロモーターが
由来する遺伝子、関心対象の核酸配列、または別の起源（例えば、SV40ウイルス
）に由来してもよい。5' UTRは、プロモーター配列とリーダー配列のあいだに存
在してもよく、そのプロモーターが用いられる遺伝子、関心対象の核酸配列、ま
たは別の起源に由来してもよい。例えば、都合のよい制限酵素認識配列が、関心
対象の核酸の5' UTR、リーダー配列、核酸配列（すなわちコード配列）、および
3' UTR（ポリアデニル化部位を含む）のあいだに存在しない場合、トランスジェ
ニック構築物は、直鎖状骨格プラスミド、腎特異的遺伝子プロモーター配列（適
当なリンカーに隣接する）、ならびに同様に適当なリンカーに隣接する以下の断
片：5' UTR、リーダー配列、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列、お
よび3' UTRの３つの部分をライゲーションすることによって作製してもよい。
【００４４】ウロモジュリン遺伝子プロモーター、例としての腎特異的遺伝子プロモーター ヒト、ウシ、およびラットウロモジュリン遺伝子プロモーターの部分配列は記
述されている（図１〜３、ユ（Yu）ら、上記）。さらに、GenBank配列データベ
ースによって、ヒトを含む（アクセッション番号、M15881およびM17778）多様な
哺乳動物からの多くのウロモジュリン配列が提供される。標準的な分子生物学技
術を用いて、特定の動物（例えば、ヤギ）からのウロモジュリンプロモーターの
配列を、標準的なライブラリースクリーニング技術を用いて、その動物からのゲ
ノムDNAから単離してもよい（例えば、アウスユベール（Ausubel）ら、上記に記
載の技術を参照のこと）。
【００４５】 さらに、解明されているのはプロモーター配列のごく一部であるため、プロモ
ーターの残りは、標準的なプライマー伸長プロトコール、またはPCRに基づく「
遺伝子歩行」技術を用いて誘導してもよい（例えば、クロンテックラボラトリー
ズインク、パロアルト、カリフォルニア州から販売されているゲノムウォーカー
（Genome Walker）（登録商標）キットを用いる）。
【００４６】 ウロモジュリン遺伝子プロモーターが同定されれば、ルシフェラーゼをコード
する配列のようなレポーター配列に機能的に結合させることができる。このレポ
ーター構築物を用いて、クローニングしたプロモーターの、形質転換細胞からの
ルシフェラーゼ発現および分泌能を調べてもよい。例えば、腎細胞（例えば、CO
S細胞）を、ルシフェラーゼコード配列に機能的に結合したウロモジュリン遺伝
子プロモーター構築物によって形質転換させた後、細胞の培養液をルシフェラー
ゼの有無に関して速やかにアッセイしてもよい（例えば、プロメガコーポレーシ
ョン、マディソン、ウィスコンシン州から販売されているルシフェラーゼ検出ア
ッセイキットを用いる）。
【００４７】ポリペプチドの精製 組換え蛋白質が尿中に発現されると、これは、アフィニティクロマトグラフィ
ーのような標準的な蛋白質精製技術を用いて精製することができる（例えば、ア
ウスユベール（Ausubel）の「分子生物学の現行プロトコール（Current Protoco
ls in Molecular Biology）」、ジョンウィリー＆サンズ、ニューヨーク、ニュ
ーヨーク州、1994を参照のこと）。組換え蛋白質がヒト上皮細胞増殖因子（EGF
）である例では、抗ヒトEGF抗体（例えば、アップステートバイオテックインク
、レークプラシッド、ニューヨーク州から販売されている）を固定したアフィニ
ティカラムに尿を加えてもよい。単離した後、組換え蛋白質は、望ましい場合に
は、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC：例えば、フィッシャー（Fisher
）、「生化学および分子生物学における実験技術（Laboratory Techniques in B
iochemistry and Molecular Biology）」、ワーク＆バードン（Work and Burdon
）編、エルゼビア、1980を参照のこと）によってさらに精製することができる。
【００４８】トランスジェニック動物の作製 トランスジェニック構築物は通常、マイクロインジェクションによって細胞内
に導入される（オガタ（Ogata）ら、米国特許第4,873,292号）。次に、マイクロ
インジェクションした受精体を適当な雌性動物に移入すると、導入遺伝子を組み
入れた受精体の発達段階に応じて、トランスジェニック動物またはキメラ動物が
誕生する。キメラ動物を交配させて、真の生殖系列トランスジェニック動物を得
ることができる。
【００４９】 トランスジェニック動物発生に関する幾つかの方法においては、導入遺伝子を
受精卵の前核に導入する。マウスのような幾つかの動物では、受精はインビボで
行い、受精卵を外科的に摘出する。他の動物では、生きている動物、または死ん
だばかりの動物（例えば、屠殺場で）から卵子を摘出して、インビトロで受精さ
せることができる。
【００５０】 または、導入遺伝子は胚幹細胞（ES細胞）に導入することができる。導入遺伝
子はエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または当業者に既知
である細胞のトランスフェクションに関して用いられるその他の技術によって、
そのような細胞に導入することができる。形質転換細胞をそれらが由来する動物
からの胚盤胞と混合する。細胞は胚に定着し、幾つかの胚では、これらの細胞は
生殖系列を形成して、その結果キメラ動物が得られる（ジャニッシュ（Jaenisch
, R.）、Science 240：1468〜1474、1988）。または、ES細胞を、除核した受精
卵に移植するための核の起源として用いて、このようにして、トランスジェニッ
ク動物を得ることができる。
【００５１】多数の導入遺伝子 トランスジェニック動物の尿中における組換え蛋白質の産生に従って、蛋白質
が互いに非共有結合している２つの異なるサブユニットで構成されている場合、
同じトランスジェニック動物から双方のサブユニットを生成することが望ましい
と考えられる。そのような場合、それぞれが２つのサブユニットをコードする２
つの異なるトランスジェニック構築物を、同時または連続的に同じ受精体に同時
マイクロインジェクションして、双方のサブユニットを発現するトランスジェニ
ック動物を作製してもよい。
【００５２】 または、２つのサブユニットのそれぞれをコードする核酸配列を、介在リボソ
ーム流入部位（IRES）を挿入することによって同じ発現カセットにクローニング
することができる（ジャン（Jang）ら、J. Virol. 62：2636〜2643、1988；グル
ツ（Gurtu）ら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 229：295〜298、1996）。双方
の核酸配列を同じ発現カセットにクローニングする利点は、トランスジェニック
動物を作製するために必要な構築物が１個でよい点である。
【００５３】 上記の技法は、完全長の無関係な二つの蛋白質（例えば、組換え型インスリン
ポリペプチドと組換え型ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子ポリペプチド）を
分泌するトランスジェニック動物を作製するためにも用いてもよいと理解される
。
【００５４】インジェクション前のスクリーニング 所望のポリペプチドをコードするトランスジェニック構築物をマイクロインジ
ェクションする前に、構築物は、インビトロ培養腎細胞において、トランスフェ
クトした培養細胞によって発現および分泌されるポリペプチドをコードするか否
かをスクリーニングしてもよい。COS細胞またはMDCK細胞（いずれもアメリカン
タイプカルチャーコレクション（ATCC、ロックビル、メリーランド州）から販売
されている）のような培養腎上皮細胞は、標準的な形質転換プロトコールを用い
てトランスジェニック構築物によって形質転換してもよい（例えば、CaPO4沈殿
、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション；例えば、アウスユベール（Aus
ubel）ら、上記を参照のこと）。腎特異的遺伝子プロモーター（例えば、ウロモ
ジュリンプロモーター）は、これらの細胞において活性であるため、トランスジ
ェニック構築物が機能的であれば、トランスジェニック構築物によってコードさ
れる所望のポリペプチドが形質転換細胞によって発現および分泌されると考えら
れる。形質転換細胞の馴化培養液を、分泌された組換えポリペプチドの有無に関
してアッセイしてもよい。
【００５５】子宮内スクリーニング より小さい哺乳動物（例えば、齧歯類）は妊娠期間が適度に短く、このように
トランスジェニック動物が本当にトランスジェニックであるか否か、その尿中に
組換え蛋白質を産生することができるか否かを迅速に決定することができる。し
かし、より大きい動物（例えば、ウシ）では、胎児が実際にトランスジェニック
であるか否か、およびその尿中に組換え蛋白質を産生することができるか否かを
出生前に決定することが望ましいと思われる。
【００５６】 胎児腎機能は、妊娠期間の早期に始まり、羊水中にウロモジュリンが検出され
るが、このことは、当然、ウロモジュリンプロモーターが活性であることを意味
している。従って、胎児はその胎盤の羊水中に尿を分泌することから、羊水を採
取して、発現がウロモジュリンプロモーターによって誘導される組換えポリペプ
チドの有無を調べてもよい。そのような試験は任意の標準的な免疫学的アッセイ
法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット分析）によって行ってもよく、または
特異的抗体が利用できない場合、組換えポリペプチドの精製およびN末端シーク
エンシングによって行ってもよい。
【００５７】 以下の実施例は、本発明を説明するためであって、本発明をいかなる場合にお
いても制限することを意味していない。さらに、以下の実施例は、ヤギからのウ
ロモジュリン遺伝子プロモーターを説明しているが、別の種からのウロモジュリ
ン遺伝子プロモーターも同様に、本発明に含まれると理解される。さらに、その
他の腎特異的遺伝子プロモーターも、それらが細胞内または分泌蛋白質の発現を
誘導するにせよ、本発明の範囲内である。非分泌蛋白質の発現を誘導する腎特異
的遺伝子プロモーターを用いる場合、リーダー配列はウロモジュリン遺伝子、所
望のポリペプチドをコードする核酸配列、または如何なる他の分泌ポリペプチド
から得てもよい。
【００５８】実施例I ウロモジュリンプロモーター配列を標準的な技術（例えば、非ストリンジェン
トな条件下でのハイブリダイゼーション）を用いてクローニングして、既知の部
分的ウロモジュリンプロモーター配列（すなわち、ラット、ヒト、またはウシ配
列）の１つをプローブとして用いて、ウロモジュリンプロモーター配列を単離し
てもよい。当然、既知の部分配列のいずれをプローブとして用いるかということ
は、トランスジェニックにすることが望まれる動物によって影響を受けると考え
られる。例えば、トランスジェニックヤギが望ましい場合、ウシウロモジュリン
プロモーター（図２に示す；ユ（Yu）ら、上記）の部分配列を放射標識して、こ
れをプローブとして用いてヤギ組織から調製したゲノムDNA（ヤギ細胞からの標
準的な技術に従って作製）を調べてもよい。このように単離されたヤギウロモジ
ュリンプロモーターが完全長のプロモーターより短いことが判明した場合、プラ
イマー伸長法を用いて、単離された断片を伸長させることによって完全長のプロ
モーターを単離してもよい。または、完全長のプロモーターは、クロンテック社
から販売されているゲノムウォーカー（登録商標）キットを用いて得てもよい。
【００５９】 ヤギウロモジュリンプロモーター配列をクローニングした後、市販のリンカー
（例えば、ニューイングランドバイオラブズ、ビバリー、マサチューセッツ州か
ら販売されている）をプロモーター配列の末端に結合させて、ベクター形質転換
大腸菌においてプロモーターを迅速に増幅させるために、細菌複製起点を含む細
菌プラスミド（例えば、puc19ベクター）にライゲーションしてもよい。このよ
うに増幅した後、リンカー配列を特異的に切断する制限エンドヌクレアーゼによ
る消化によって、プロモーターをpuc19ベクターから切り出して、トランスジェ
ニック構築物にサブクローニングしてもよい。
【００６０】 または、消化した断片を、リーダー配列に対応する消化した断片および所望の
ポリペプチド（例えば、tPA）をコードする核酸と組みあわせて、EcoRI/SpeI直
鎖状真核細胞発現ベクター、関心対象の核酸配列を含む断片、ならびに5' UTRお
よびリーダー配列を含む断片との４つの部分のライゲーションに用いることがで
きる（図４参照）。図４のシナリオでは、４つの部分のライゲーションは、5' U
TRおよびリーダー配列がウロモジュリン遺伝子またはヒトtPA遺伝子に由来しな
い場合に限って用いる必要がある。図４における骨格プラスミドは、3' UTR、お
よび挿入されたヒトtPAコード核酸配列の停止コドンの3'に存在するポリアデニ
ル化シグナルを既に含んでいることに注意すること。
【００６１】実施例II ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）を生成するためにトランスジェ
ニックヤギが望ましい場合、tPA遺伝子のコード配列は既知のヒトtPA cDNA配列
（GenBankアクセッション番号E02027）を用いて作製してもよい。図５に示すよ
うに、Bam HI制限酵素認識部位をその5'末端に含むフォワードプライマー、およ
びSpeI制限酵素認識部位をその5'末端に含むリバースプライマーを用いて、ヒト
tPAコードcDNA配列をヒトcDNAライブラリー（例えば、クロンテック社、パロア
ルト、カリフォルニア州から販売されている）からPCR増幅してもよい。増幅後
、PCR産物をBamHIおよびSpeIによって消化してもよく、上記のように、ウロモジ
ュリンプロモーターに対応する断片、ならびにEcoRIおよびSpeI直鎖状ベクター
を有するリーダー配列にライゲーションしてもよい（図４参照）。
【００６２】実施例III 図４に示すトランスジェニック構築物をヤギ受精体にインジェクションする前
に、構築物が構築物によってコードされるポリペプチドを形質転換細胞に発現お
よび分泌させるか否かをまず、形質転換培養腎上皮細胞を用いて決定してもよい
。本実施例では、ミドリザル腎細胞（COS細胞）をCaPO4形質転換法を用いて構築
物によって形質転換する。望ましい場合には、細菌複製起点または原核細胞選択
マーカー遺伝子内に存在する独自の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて、
構築物をまず直鎖状にしてもよい。
【００６３】 形質転換の24時間後、細胞が消費した馴化培地を新鮮な培地と交換して、細胞
を培養に戻す。翌日（すなわち、トランスフェクションの48 時間後）、細胞の
馴化培地を取り出して、ヒトtPA特異的抗体をプローブとして用いるウェスタン
ブロット分析を用いて、ヒトtPAの有無に関してアッセイする。所望の量のpTAが
形質転換細胞によって産生されれば、構築物をそのまま用いてヤギ受精体にマイ
クロインジェクションしてもよい。tPAが形質転換細胞によって産生されるが、
量が所望の量より少ないもう一つの場合では、構築物を改変して、COS細胞にお
いて再試験を行ってもよい。
【００６４】実施例IV COS細胞において繰り返しスクリーニングを行った後、図６に略図で示すよう
なトランスジェニック構築物を作製してもよい。示した構築物は、ヤギウロモジ
ュリンプロモーター配列の上流に存在するインスレータエレメント配列を有し、
これによって組み込み部位によらず、構築物を発現させることができる。さらに
、図４のSV40 3' UTR（SV40 ポリAシグナルを含む）を、ヤギウロモジュリン遺
伝子の3' UTRに置換する。望ましければXhoIおよびXbaIによって構築物を消化す
ることによって、構築物を直鎖状にして、アンピシリン耐性遺伝子およびColE1
複製起点を除去してもよい（すなわち、ColE1複製起点およびアンピシリン耐性
遺伝子を含む消化断片を廃棄する）。次に、残った断片（すなわち、導入遺伝子
）を用いて、ヤギ受精体にマイクロインジェクションする。
【００６５】 図４〜６の略図において、特定の制限エンドヌクレアーゼは一例であることが
理解されると思われる；任意の適した制限エンドヌクレアーゼを用いてもよい。
特に、制限エンドヌクレアーゼが独自のものであることが望ましい場合（例えば
、ヤギウロモジュリンプロモーターのクローニングおよびサブクローニングを容
易にするため）、配列を隣接させるために用いられるリンカーは、まれな切断酵
素（例えば、SseIまたはNotI）の認識部位であってもよい。
【００６６】実施例V 図６に示す構築物は、尿中にヒトtPAを分泌することができるトランスジェニ
ックマウスを作製するために用いることができる。トランスジェニックマウスと
比較してトランスジェニックヤギを作製するためにはより多くの時間（即ち、よ
り多くの妊娠期間）を必要とするのみならず、動物の維持および収容により費用
がかかることから、トランスジェニックヤギを作製する前にトランスジェニック
マウスを作製することが好ましい。
【００６７】 したがって、成熟した雌性マウスの排卵誘発を行って、雄性マウスと交配させ
て受精卵を得た。前核マイクロインジェクションのために卵子を採取する。例え
ば、マイクロインジェクションのために、レイツマイクロマニピュレーターおよ
びニコン倒立顕微鏡を用いてもよい。仮親の雌性マウスに、マイクロインジェク
ションした２細胞期胚を移植する。仔が生まれた後、その尿中のヒトtPAの有無
をスクリーニングする。
【００６８】実施例VI モノクローナル抗体K20の発現は、真核細胞発現ベクター、pcDNA4/HisMaxにお
いてマウスウロプラキンII遺伝子プロモーターの制御下で行うことができる。
【００６９】 K20は、ヒトCD29上の特定のエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体
（「mAb」）である。K20の可溶性型は、抗CD3抗体によって誘導される末梢のT細
胞活性化および増殖を阻害することが示された。この負の作用は、cAMPレベルの
増加、またはジアシルグリセロールおよびPA形成の阻害によって媒介される可能
性がある。K20はインビトロで機能的作用を示すことから、K20は治療的免疫抑制
にとって良好な候補物となる。免疫原性が潜在的に減少して、マウスmAn K20と
同一の機能的特性を有するヒト化したK20 mAb（Hu-K20）が産生されている（ポ
ール（Paul, M.A.）ら、Mol. Immunol. 32：101〜116、1995）。
【００７０】 膀胱尿路上皮の先端表面に産生される、ウロプラキンとして知られる一群の膜
蛋白質は、尿路上皮の先端表面の80％以上に及ぶ二次元結晶（「尿路プラーク」
）を形成する厚みのある蛋白質粒子を形成しうる（ユ（Yu, J.）ら、J. Cell Bi
ol. 125：171〜182、1994；サン（Sun, T.T.）ら、Mol. Bio. Rep. 23：3〜11、
1996）。それらは尿路上皮特異的マーカーであり、哺乳動物の進化の過程で保存
されている（ウ（Wu, x. R.）ら、J. Biol. Chem. 269：13716〜13724、1994）
。最近、ウロプラキンII遺伝子プロモーター（米国特許第5,824,543号）を用い
て、その膀胱尿路上皮にヒト成長ホルモン（hGH）を発現するトランスジェニッ
クマウスが作製され、その結果、尿中に組換え型hGHが100〜500 mg/Lで分泌され
た（ケール（Kerr, D.E.）ら、Nat. Biotechnol. 16：75〜79、1998）。
【００７１】 下記に、真核生物発現ベクターpcDNA4/HisMax（インビトロゲン社）を用いたH
u-K20発現カセットの構築を示す。プラスミドの精製、制限酵素消化、DNAライゲ
ーション、およびDNA断片の単離には標準的な方法を用いた。
【００７２】 図７のHu-K20軽鎖発現カセットの構築を参照して、鋳型として483 wkmM16発現
ベクターのDNA（ゾウ（Zhou）博士、ネキシア）を用いて、MunI部位（下線）を
含む5'センスプライマー（5'GCGCAGCAATTGGCGGCCGCTCTAGACTCG3'）と、XhoI部位
（下線）を含む3'アンチセンスプライマー（5'GCGCAGCTCGAGGTCGACGCCCCATCCTCA
C3'）によってPCRを実施した。インスレータとして用いるニワトリのβグロビン
遺伝子の上流からの2.4 kb増幅断片をMunIおよびXhoIによって消化して、UPIIの
ゲノム配列（サン（T.T. Sun）博士、カプラン総合癌センター、ニューヨーク大
学医学部、ニューヨーク州）を含むpGIから放出されたUPII遺伝子プロモーター
の長さ3.6 kbのXhoI-BamIII断片に、XhoI部位でライゲーションした。pcDNA4/Hi
sMax発現ベクター（インビトロゲン社）をMunIおよびBamHIによって消化して、C
MV-プロモーターを含まないベクターを、BamHI部位を含む5'センスプライマー（
5'GCGTATGGATCCAGCGCAGAGGCTTG3'）およびBswiI部位を含む3'アンチセンスプラ
イマー（5'GCGTATTGCATTCGGTTTCGGAGGCCGTCCG3'）による鋳型としてのpcDNA4/Hi
sMaxからのMunI-BamHI断片にライゲーションした。翻訳エンハンサーとして作用
する増幅したSP163断片（ゴーマン（Gorman, C.M.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 79：6777〜6781、1982）をBamHIおよびBswIによって消化する。mAb Hu-K2
0軽鎖モジュールの可変領域の320 bp断片は、BswI部位（下線）、コザック配列
（斜体）、および開始コドン（太字）の後に部分的マウスV47 Ig重鎖シグナル配
列を含む5'センスプライマー 、ならびにHpI部位（下線）を含む3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATGTTAACA
CTTACGTTTGATCTCCAG3'）による、pSVhyg-Hu VKK20-HuCKプラスミドDNA（ポール
（Paul, M.A.）ら、Mol. Immunol. 32：101〜116、1995）のPCR増幅によって得
られる。増幅された産物をBswiIおよびHpaIによって消化する。もう一つのPCRは
、pSVhyg-HuVKK20-HuCKにおいて、HpaI部位（下線）、軽鎖可変領域の3'末端の
スプライシングドナーシグナル（太字）、およびヒトゲノムIgκ定常領域の5'配
列を含む5'センスプライマー 、ならびにPmeI部位（下線）、およびヒトゲノムIgκ定常領域の部分配列を含む
3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATGTTTAAACGAGTAGTTGGTAAACAACAG3'）によっ
て実施する。PCR産物をHpaIおよびPmeIによって消化する。増幅されたPCR産物は
それぞれ、BswiIおよびHpaI部位にライゲーションする。pcDNA4/HisMax/インス
レータ/UPIIをBamHIおよびPmeIによって消化して、ライゲーションしたPCR産物
を5'でBamHI部位、および3'でPmeI部位の突出部とライゲーションして、pcDNA4/
Max/UPII-K20Lを形成する（図７）。
【００７３】 発現カセットpcDNA4/Mas/UPIIK20Lは、重鎖および軽鎖からなる免疫グロブリ
ンのクローニングおよび発現のための用途の広いシステムとして用いることがで
きる。このシステムの利点は、選択したIg遺伝子に存在する制限酵素部位が低頻
度であれば、V-遺伝子およびC-遺伝子をいずれもベクター内でカセットとして交
換してもよい点である。さらに、V-遺伝子は、無傷のままにしておくことができ
、抗体の一過性および安定な発現は、２つの異なるベクターのいずれかから、ま
たは１つの直列ベクターから行うことができる（ノルデルハーグ（Norderhaug,
L.）ら、J. Immunol. Methods 204：77〜87、1997）。
【００７４】 Hu-K20重鎖発現カセットを構築するために図８を参照して、Hu-K20重鎖モジュ
ールの可変領域の360 bp断片を、BswiI部位（下線）、コザック配列（斜体）、
および開始コドン（太字）の後に部分的マウスV47 Ig重鎖シグナル配列を含む5'
センスプライマー 、ならびにClaI部位（下線）を含む3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATATCGAT
CTGAGGAGACGGTGACCGTG3'）によるpSVgpt-VHK20-HuCyI DNA（ポール（Paul, M.A.
）ら、Mol. Immunol. 32：101〜116、1995）のPCR増幅によって得る。増幅され
た産物をBswiIおよびClaIによって消化する。もう一つのPCRはpSVgpt-VHK20-HuC
yIにおいて、ClaI部位（下線）、重鎖可変領域の3'末端のスプライシングドナー
シグナル（太字）、およびヒトゲノムIgγ-1定常領域の5'部分配列を含む5'セン
スプライマー 、ならびにPmeI部位（下線）およびヒトゲノムIgγ-1定常領域の3'部分配列を含
む3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATGTTTAAACGACCCGCTCTGCCTCCCTC3'）によ
って実施する。PCR産物はClaIおよびPmeIによって消化する。増幅された２つのP
CR産物をClaI部位を通じて結合する。pcDNA4/Max/UPII-K20LベクターをBswiIお
よびPmeI部位で消化して、ライゲーションしたPCR産物を、5'でBswiI部位の突出
部と、および3'でPmeI部位とライゲーションして、pcDNA4/Max/UPII-K20Hを形成
する（図９）。
【００７５】 軽鎖と重鎖モジュールの双方を含む同時発現ベクターは以下のように作製する
。pcDNA4/Max/UPII-K20HをXhoIおよびPmeIによって消化する。消化したXhoI-Pme
I断片をゲル精製して、XhoI付着末端をクレノウによって塞ぎ、平滑末端を、既
にPmeIによって消化したpcDNA4/Max/UpH-K20Lにライゲーションして、pcDNA4/Ma
x/UPII-K20LHを形成する。pcDNA4/Max/UPII-K20LHの方向性は、HpaIおよびClaI
によるベクターの消化によって確認する。
【００７６】 ヒト尿路上皮細胞株（hu609）（ステーシー（Stacey, S.D.）ら、Mol. Carcin
og 3：216〜225、1990）を用いて、確立された発現カセットを評価する。L鎖お
よびH鎖構築物のDNAはマキシ調製（SPO#008）によって精製して、標準的なトラ
ンスフェクション技術によってHu609細胞株に等モル濃度で同時に導入する。培
養上清を沈殿させて、抗ヒトIgG（H鎖特異的）アガロースカラム（シグマ社）に
適用する。溶出した分画の蛋白質濃度は、ブラッドフォードマイクロアッセイ法
（バイオラド社）によって測定し、蛋白質を含む分画を10％SDS-PAGE上で確認す
る。発現された蛋白質はまた、抗IgG（H鎖）抗体（シグマ社）によるウェスタン
ブロットによって検出する。
【００７７】 この構築物を発現するトランスジェニック動物は以下のように作製する。発現
ベクターpcDNA4/Max-UPII-K20LおよびPCDNA4/Max-UPII-K20HをMunI-PmeIによっ
て消化するとそれぞれ、マイクロインジェクションのためのL鎖およびH鎖断片を
放出する。Hu-K20トランスジェニックマウスは、1）L鎖とH鎖断片とを１：１の
モル比で同時インジェクションすることによって、または2）同時発現ベクターp
cDNA4/Max-UPII-K20LHのMunI-PmeI断片をインジェクションすることによって作
製される。標準的な技術によってDNAを精製してインジェクションする。Hu-K20
トランスジェニックヤギは同じ導入遺伝子をインジェクションすることによって
作製されると考えられる。
【００７８】実施例VII 真核細胞発現ベクターpcDNA4/HisMaxにおけるヤギウロモジュリン遺伝子プロ
モーターの制御下でのモノクローナル抗体K20の発現。
【００７９】 ヤギウロモジュリン遺伝子プロモーターをクローニングするために、ヤギゲノ
ムDNAを鋳型として、ヒトおよびウシUM遺伝子プロモーターの保存領域から指定
した２組のプライマーによってPCTを実施した。600 bp断片を得てシークエンシ
ングした。これはウシおよびヒトUM遺伝子プロモーターの既知の配列とそれぞれ
、94％および67％の同一性を共有した。幾つかの特異的ゲノムライブラリーをユ
ニバーサルゲノムウォーカーキット（Universal Genome Walker kit）（クロン
テック社）によって構築して、ヤギUM遺伝子プロモーターの600 bp断片から指定
した幾つかの特異的プライマーおよび特異的アダプタープライマーによって、ラ
イブラリーを鋳型として用いてPCRを実施した。600 bp片を含む1.5 kb断片をラ
イブラリーの一つおよびヤギゲノムDNAの双方から得た。この1.5 kb断片をプロ
モーターを含まないpEGFPにサブクローニングして、pGUEGFP3を形成して、その
全体をシークエンシングした（図10）。
【００８０】 もう一つの戦略において、プロモーターおよび3'エレメントを含むゲノムウロ
モジュリン遺伝子を、標準的な技術によってクローニングして、関心対象の遺伝
子を、ウロモジュリンのシグナルペプチドの直前に融合する、またはウロモジュ
リンのシグナル配列を用いる。さらに、イントロンを含むウロモジュリン構造遺
伝子の3'末端エレメントを関心対象の遺伝子の3'末端に融合することができる。
【００８１】 ヤギUM遺伝子プロモーターをHu-K20軽鎖および重鎖発現の構築に用いた。PCR
は、頭部から尾の方向にニワトリβグロビンインスレータ配列のコピー２個を有
する（チュン（Chung, J.H.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：575〜580、
1997）483 wkmM16発現ベクターDNA（ゾウ（Zhou）博士、ネキシア・バイオテク
ノロジーズ・インクの好意による）を鋳型として用いて、MunI部位（下線）を含
む5'センスプライマー（5'GCGCAGCAATTGGCGGCCGCTCTAGACTCG3'）、およびXhoI部
位（下線）を含む3'アンチセンスプライマー（5'GCGCAGCTCGAGGTCGACGCCCCATCCT
CAC3'）によって実施した（チュン（Chung, J.H.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94：575〜580、1997）。ニワトリのβグロビン遺伝子の増幅された2.4 kb
インスレータ断片を、MunIおよびXhoIによって消化して、PGUEGFP3から放出され
たヤギUM遺伝子プロモーターの長さ1.5 kbのXhoI-BamHI断片と、XhoI部位でライ
ゲーションした。pcDNA4/HisMax発現ベクター（インビトロゲン社）をMunIおよ
びBamHIによって消化して、このCMVプロモーターを含まないベクターを、インス
レータとヤギUMプロモーターのMunI-BamHI混合断片にライゲーションした。PCR
は、pcDNA4/HisMaxからのSP163配列を含む、切除したMunI-BamHI断片を鋳型とし
て用いて、BamHI部位を含む5'センスプライマー（5'GCGTATGGATCCAGCGCAGAGGCTT
G3'）およびBswiI部位を含む3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATTGCATTCGGTTT
CGGAGGCCGTCCG3'）によって実施した。PCR産物をBamHIおよびBawiIで消化した。
増幅されたSP163断片は、血管内皮増殖因子（VEGF）遺伝子の5'非翻訳領域（UTR
）に由来し、これは発現レベルをプロモーターについて認められるレベルの２〜
５倍高いレベルに増加させることが示されている（ゴーマン（Gorman, C.M.）ら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：6777〜6781、1982）。mAb Hu-K20軽鎖モジ
ュールの可変領域の320 bp断片は、BswiI部位（下線）、コザック配列（斜体）
、および開始コドン（太字）の後に部分的マウスV47 Ig重鎖シグナル配列を含む
5'センスプライマー 、ならびにHpaI部位（下線）を含む3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATGTTAAC ACTTACGTTTGATCTCCAG3'）による、pSVhyg-HuVKK20-HuCKプラスミドDNAのPCR増幅
によって得た（ポールら（Paul, M.A.）、Mol. Immunol. 32：101〜116、1995）
。増幅した産物をBswiIおよびHpaIによって消化した。もう一つのPCRは、pSVhyg
-HuVKK20-HuCKLにおいて、HpaI部位（下線）、軽鎖可変領域の3'末端のスプライ
シングドナーシグナル（太字）、およびヒトゲノムIgκ定常領域の5'部分配列を
含む、5'センスプライマー 、ならびにPmeI部位（下線）およびヒトゲノムIgκ定常領域の3'部分配列を含む
3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATGTTTAAACGAGTAGTTGGTAAACAACAG3'）によっ
て実施した。PCR産物をHpaIおよびPmeIによって消化した。増幅された３つのPCR
産物を、BswI部位およびHpaI部位によって、BamHIおよびPmeI末端を有する得ら
れた断片とライゲーションした。5'でBamHI部位、および3'でPmeI部位の突出部
を有するこの結合したPCR産物を、BamHIおよびPmeIによって消化したpcDNA4/His
Ma/インスレータ-UM にライゲーションすると、pcDNA4/Max/UM-K20Lが生成され
た（図８）。
【００８２】 Hu-K20重鎖発現カセットを構築するために、Hu-K20重鎖モジュールの可変領域
の360 bp断片は、BswI部位（下線）、コザック配列（斜体）、および開始コドン
（太字）の後に部分的マウスV47 Ig重鎖シグナル配列を含む5'センスプライマー
、およびClaI部位（下線）を含む3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATATCGATCT
GAGGAGACGGTGACCGTG3'）による、PSVgpt-VHK20-HuCγ1 DNAのPCR増幅によって得
ることができる（ポール（Paul, M.A.）ら、Mol. Immunol. 32：101〜116、1995
）。増幅された産物をBswiIおよびHpaIによって消化する。もう一つのPCRはpSVg
pt-VHK20-HuCγIにおいて、ClaI部位（下線）、軽鎖可変領域の3'末端のスプラ
イシングドナーシグナル（太字）、およびヒトゲノムIgκ定常領域の5'部分配列
を含む、5'センスプライマー 、ならびにPmeI部位（下線）およびヒトゲノムIgγ定常領域の3'部分配列を含む
3'アンチセンスプライマー（5'GCGTATGTTTAAACGACCCGCTCTGCCTCCCTC3'）によっ
て実施した。PCR産物をClaIおよびPmeIによって消化した。増幅した２つのPCR産
物をClaI部位によって結合した。5'でBswI部位、および3'でPmeI部位の突出部を
有するこの結合したPCR産物を、BswiIおよびPmeIによって消化したpcDNA4/Max/U
M-K20Lにライゲーションすると、PCDNA4/Max/UM-K20Hが生成される（図８）。
【００８３】 同時発現のために軽鎖と重鎖モジュールの双方を含む単一のベクターを、XhoI
-PmeI消化5'末端平滑末端UMプロモータープラスpcDNA4/Max/Um-K20HのH鎖モジュ
ールをPmeI消化pcDNa4/Max/UM-K20Lに挿入して、pcDNA4/Max/UM-K20LHを形成す
ることによって作製することができる（図９参照）。または、二シストロン性発
現ベクターを構築することができる。この場合、単一のヤギUMプロモーターは、
軽鎖と重鎖の双方の発現を促進する。この目的に関して、pcDNA4/Max/UM-K20LH
における第二のUMプロモーター断片を内部リボソーム流入部位（IRES）配列の断
片に置換することができる（スタール（Staal, F.J.）ら、Cancer Gene Ther. 3
45〜351、1996）。
【００８４】 腎上皮細胞株における構築物の試験 トランスジェニック構築物を用いてトランスジェニック動物を作製する前に、
それらの機能性を腎上皮細胞におけるトランスフェクション、および抗体の有無
に関する培地の試験の際に決定することができる。例えば、ウサギ腎細胞株であ
るPAP-HT25（グリーンら（Green, N.）、Am J. Physiol. 249：C97〜104、1985
）、およびイヌ腎細胞株MDCK（ATCC#CCL-34）を用いて、確立された発現カセッ
トの機能性を調べることができる。細胞は、標準的なトランスフェクション技術
によって、L鎖およびH鎖構築物の等モル濃度によって同時にトランスフェクトす
ることができる。同時発現ベクターもまた、同じ細胞株にトランスフェクトする
ことができる。トランスフェクションの24時間後、細胞の馴化培地を新鮮な培地
に交換して、細胞を培養に戻すことができる。翌日、細胞の馴化培地を取り出し
て、抗体を精製するために抗ヒトIgG（H鎖特異的）アガロースカラム（シグマ社
）に適用するか、またはウェスタンブロット分析によって抗体の有無を直接試験
することができる。溶出した分画の蛋白質濃度はブラッドフォードマイクロアッ
セイ（バイオラド社）によってアッセイし、蛋白質を含む分画は10％SDS-PAGE上
でチェックすることができる。組換え型mAb Hu-K20の他の機能的アッセイ法、例
えば結合の測定、T細胞増殖、ホスファチジン酸合成の測定、補体依存的細胞障
害アッセイ、よびC1q結合測定も同様に実施することができる。
【００８５】 ヤギUM遺伝子プロモーターの制御下におけるHu-K20導入遺伝子を有するトランス
ジェニック動物の作製 トランスジェニック動物の作製は、前核マイクロインジェクション（ライト（
Wright, G.）ら、Bio/Technology 9：830〜83、1991；パーセル（Pursel, V.G.
）ら、J. Anim. Sci. 71 Suppl 3：1〜9、1993；ウォール（Wall, R.J.）ら、Th
eriogenology 5：57〜968、1996）、または核移入（NT）方法論（キャンベル（C
ampbell, K.H.）ら、Nature 380：64〜66、1996；ウィルムート（Wilmut, I.）
ら、Nature 385：810〜813、1997；シベリ（Cibelli, J.B.）ら、Science 280
：1256〜1258、1998；ワカヤマ（Wakayama, T.）ら、Nature 394：369〜374、19
98）を含む標準的な技術を用いて実施することができる。発現ベクターpcDNA4/M
ax/UM-K20LおよびpcDNA4/Max/UM-K20HをMunI-PmeIによって消化するとそれぞれ
、ベクター骨格が除去され、マイクロインジェクションのためのインスレータ、
UMプロモーター、ならびにL鎖およびH鎖断片が生成される。トランスジェニック
動物はまた、L鎖とH鎖断片を１：１のモル比で同時インジェクションすることに
よって作製することができる。トランスジェニック動物はまた、同時発現ベクタ
ーpcDNA4/Max/UM-K20LHのMunI-PmeI断片をインジェクションすることによって作
製することができる。DNAは標準的な技術によって精製してインジェクションす
る。トランスジェニック動物と思われる動物のゲノムDNAを調製して、PCRおよび
サザンブロットによって分析する。胎児繊維芽細胞のようなNT由来子孫細胞株は
、インビトロで、例えばゼオシン選択マーカーを用いて選択したUM-K20HおよびU
M-K20L発現カセットにトランスフェクトすることができる（シベリ（Cibelli, J
.B.）ら、Science 280：1256〜1258、1998）。細胞株をNT実験に用いる前に、双
方のカセットのコピー数および組み込みに関して細胞株をスクリーニングする。
再構築されたNT胚を培養して、直ちにレシピエント動物に移入することができる
。
【００８６】 トランスジェニック動物の尿は、出生時から毎日採取して、その量と共に分泌
されたモノクローナル抗体の量を測定することができる。
【００８７】 本明細書において言及した全ての刊行物および特許出願は、それぞれの独立し
た刊行物または特許出願が、詳しく、個々に参照として組み入れられることを示
されるのと同じ程度に参照として本明細書に組み入れられる。
【００８８】 本発明は、その特定の態様に関連して説明したが、さらなる改変を行うことが
でき、本出願は、本発明の原則に一般的に従う本発明の如何なる変更、用途、ま
たは適合にも適用されること、および本開示からのそのような逸脱も含まれ、そ
れらは本発明が属する技術分野の既知または通常の実践の範囲内であり、これま
でに述べた本質的な特徴に当てはまると解釈されると理解すべきである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトウロモジュリン遺伝子プロモーター（GenBankアクセッショ
ン番号S75968；ユら（Yu）、Gene Expr. 4：63〜75、1994）の部分DNA配列を示
す。
【図２】 ウシウロモジュリン遺伝子プロモーター（GenBankアクセッショ
ン番号S75961；ユら（Yu）、上記）の部分DNA配列を示す。
【図３】 ラットウロモジュリン遺伝子プロモーター（GenBankアクセッシ
ョン番号S75965；ユら（Yu）、上記）の部分DNA配列を示す。
【図４】 ウロモジュリンプロモータートランスジェニック構築物を作製す
る方法の例を示す概略図である。この図における核酸配列（Bam HIおよびSpeI部
位に隣接する）は、ヒトtPA（図５参照）をコードしてもよく、またはルシフェ
ラーゼのようなレポーター遺伝子をコードしてもよい。
【図５】 5'末端においてBam HI認識部位に隣接し、3'末端においてSpeI認
識部位に隣接する、ヒトtPAコードcDNA断片を作製するPCR反応の概略図。
【図６】 ヒトtPAコード配列の発現を誘導するヤギウロモジュリン遺伝子
プロモーターを含むトランスジェニック構築物の概略図である。骨格となるプラ
スミドは真核細胞選択のためのハイグロマイシン耐性遺伝子、原核細胞選択のた
めのアンピシリン耐性遺伝子、および細菌において増幅するためのColE1複製起
点を有する。
【図７〜９】 本発明の発現ベクターの構築物の概略図である。
【図１０】 ヤギUMプロモーターの配列である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA15 BA41 BA80 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 GA12 HA01 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA11 4B065 AA90X AB01 BA01 CA24 CA44 CA60

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （i）ポリペプチドをコードする配列と、（ii）プロモータ
    ーが該配列に機能的に結合している、腎特異的遺伝子からのプロモーターと、（
    iii）尿産生細胞による該ポリペプチドを動物の尿に分泌させるリーダー配列と
    を含む核酸分子。
  2. 【請求項２】 腎特異的遺伝子からのプロモーターが、ヤギ、ヒツジ、ブタ
    、ウシ、ヒト、および齧歯類からなる群より選択される、請求項１記載の核酸分
    子。
  3. 【請求項３】 腎特異的遺伝子がウロモジュリン遺伝子である、請求項１記
    載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 動物が哺乳動物である、請求項１記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 ポリペプチドが生物活性を有する、請求項１記載の核酸分子
    。
  6. 【請求項６】 ポリペプチドが可溶性である、請求項１記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 動物における尿産生に関与する細胞のゲノムが、請求項１記
    載の核酸分子を含む動物。
  8. 【請求項８】 細胞が腎分泌細胞である、請求項６記載の動物。
  9. 【請求項９】 動物が齧歯類、反芻動物、ヒト、またはブタからなる群より
    選択される、請求項７記載の動物。
  10. 【請求項１０】 動物が哺乳動物である、請求項７記載の動物。
  11. 【請求項１１】 以下の段階を含む、ポリペプチドを製造する方法： （a）細胞が、（i）ポリペプチドをコードする核酸配列と、（ii）該細胞におい
    て該ポリペプチドの発現を誘導する腎特異的遺伝子プロモーターと、（iii）該
    細胞に該ポリペプチドを分泌させるリーダー配列とを含む核酸分子にトランスフ
    ェクトされている、動物細胞を提供する段階； （b）該トランスフェクト細胞を培養する段階；および （c）該培養トランスフェクト細胞の培養液から該ポリペプチドを単離する段階
    。
  12. 【請求項１２】 プロモーターがウロモジュリン遺伝子プロモーターである
    、請求項11記載の方法。
  13. 【請求項１３】 細胞が腎分泌細胞である、請求項12記載の方法。
  14. 【請求項１４】 動物が哺乳動物である、請求項11または12記載の方法。
  15. 【請求項１５】 腎特異的遺伝子プロモーターがウロモジュリン遺伝子プロ
    モーターである、請求項11または12記載の方法。
  16. 【請求項１６】 以下の段階を含む、ジスルフィド結合によって互いに結合
    している２つまたはそれ以上のサブユニットを含む組換え蛋白質を、脊椎動物の
    尿において製造する方法： （a）組換え蛋白質の尿特異的産生を示すトランスジェニック脊椎動物を提供す
    る段階； （b）該脊椎動物から尿を採取する段階；および （c）該尿から該蛋白質を単離する段階。
  17. 【請求項１７】 組換え蛋白質が抗体である、請求項16記載の方法。
  18. 【請求項１８】 蛋白質がヘテロダイマー生殖ホルモンである、請求項16記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】 蛋白質がコラーゲンまたはフィブリノーゲンである、請求
    項16記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ジスルフィド結合によって互いに結合している２つまたは
    それ以上のサブユニットを含む組換え蛋白質の尿特異的産生を示し、該蛋白質が
    生物学的に活性となるように折り畳まれている、ヒト以外のトランスジェニック
    脊椎動物。
  21. 【請求項２１】 蛋白質をコードするDNAが、ウロモジュリンまたはウロプ
    ラキンプロモーターに機能的に結合している、請求項20記載の動物。
  22. 【請求項２２】 蛋白質をコードするDNAが、動物の尿に蛋白質を分泌させ
    るリーダー配列に機能的に結合している、請求項21記載の動物。
  23. 【請求項２３】 ヤギウロモジュリン遺伝子プロモーターを含む、精製核酸
    分子。
  24. 【請求項２４】 哺乳動物がヤギである、請求項４記載の核酸分子。
  25. 【請求項２５】 蛋白質が生物学的活性となるように折り畳まれている、請
    求項16記載の方法。
  26. 【請求項２６】 蛋白質が、不活化または部分的不活化型で、動物の尿中に
    排泄され、該蛋白質が活性化可能である、請求項16記載の方法。
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