JPWO2019045049A1 - 腎尿細管細胞特異的発現ベクター - Google Patents
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Abstract
Description
[1]腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターからなる、腎尿細管細胞特異的に前記遺伝子を発現させるためのベクター。
[2]前記プロモーターが、sodium−dependent phosphate transporter type 2a(NPT2a)、sodium−potassium−2−chloride cotransporter(NKCC2)、aquaporin2(AQP2)、sodium−chloride cotransporter(NCC)、epithelial sodium−channel(ENaC)等からなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、[1]に記載のベクター。
[3]前記遺伝子が、NPT2a、NKCC2、AQP2、NCC、及びENaCからなる群より選択される遺伝子である、[1]又は[2]に記載のベクター。
[4]血流を遮断した腎臓の腎動脈へのボーラス注入により投与される、[1]〜[3]のいずれかに記載のベクター。
[5]遺伝性尿細管疾患の遺伝子治療用である、[1]〜[4]のいずれかに記載のベクター。
1実施形態において、本発明は、腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターからなる、腎尿細管細胞特異的に前記遺伝子を発現させるためのベクターを提供する。
1実施形態において、本発明は、腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む遺伝性尿細管疾患の治療方法を提供する。
ウイスターラットのゲノムDNAから、Npt2a遺伝子、Nkcc2遺伝子及びAqp2遺伝子のプロモーターをクローニングして使用した。クローニングするプロモーター領域としては、ヒト、マウス、ラットの塩基配列データを比較し、相同性の高い領域を選択した。
ウイスターラットの血液からラットゲノムDNAを抽出し、PCRによりNpt2a遺伝子のプロモーターをクローニングした。クローニングするプロモーター領域ができるだけ長くなるように、翻訳開始コドンにできるだけ近接した領域を含む領域を取得した。クローニングしたプロモーターは−3379〜+630の領域であった。ここで、−1がNpt2a遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)の直前の塩基に対応し、以下同様である。
下記表1に記載の各プロモーターを使用した。表1中、pNKCC2DIプロモーター及びpNKCC2pvuプロモーターはテキサス大学南西医療センターのピーター・イガラシ博士より分与された。pNKCC2プロモーターはラットゲノムDNAのPCRにより調製した。
ウイスターラットの血液からラットゲノムDNAを抽出し、PCRによりAqp2遺伝子のプロモーターをクローニングした。クローニングしたプロモーターは−5338〜+930の領域であった。
実験例1でクローニングした各プロモーターは、緑色蛍光タンパク質発現ベクターであるpEGFPN1(クロンテック社)にサブクローニングし、各プロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子を連結した。続いて、各プロモーター及びその下流に連結されたEGFP遺伝子をアデノウイルスベクターであるpAxCwit(理化学研究所バイオリソースセンター)にそれぞれサブクローニングした。下記表2に、調製したアデノウイルスベクター名及びその内容を記載した。
アデノウイルスベクターを静脈投与により生体に投与した場合、95%以上が肝臓にトラップされてしまう。そこで、アデノウイルスベクターを腎臓に特異的に感染させるための投与ルートの検討を行った。具体的には、8〜10週齢のラットを用いて、以下の投与ルートによりアデノウイルスベクターを投与し検討した。実験は、動物実験委員会の承認を得て行い、43匹のラットを本実験に使用した。
まず、ラットの腹部大動脈と左腎動脈の間をクリップでクランプして血流を遮断した。続いて、1mLの生理食塩水を2分間かけて左腎動脈に注入した。これにより、腎臓内の血液が洗い流された。続いて、1mLのアデノウイルスベクター液を2分間かけて左腎動脈に注入した。続いて、腎静脈をクリップでクランプして血流を遮断し10分間維持した。これにより、アデノウイルスベクターが腎臓内に留まり、腎細胞に効率よく感染した。その後、クリップをはずし、血流を再開させた。
ラットの腎動脈にアデノウイルスベクター液1mLを16時間かけて緩徐に注入した。
ラットの膀胱にアデノウイルスベクター液1mLを注入した。その結果、アデノウイルスベクターは尿管を逆流して腎細胞に感染することが期待された。
ラットの腎臓にアデノウイルスベクター液1mLを直接注射した。注射は10回に分けて行い、あらゆる方向に向けて注射した。
アデノウイルスベクターの投与から4日後に各ラットから腎臓を摘出し、4%パラホルムアルデヒドで2日間固定した。続いて、各腎臓標本をパラフィン包埋して薄切切片を作製した。
発明者らは、実験例2で調製した、NKCC2DI−EGFP、NKCC2pvu−EGFP及びNKCC2−EGFPの3種類のアデノウイルスベクターを腎動脈へのボーラス投与によりラットに投与した。続いて、アデノウイルスベクターの投与から4日後に各ラットから腎臓を摘出し、実験例3と同様にして組織切片を作製した。
続いて、作製した各組織切片を免疫組織化学解析により解析した。図1(a)及び(b)は、NKCC2DI−EGFPアデノウイルスベクターを導入した結果を示す写真である。図1(a)は抗EGFP抗体で染色した結果を示す写真であり、図1(b)は、図1(a)の組織切片に隣接する別の組織切片を抗NKCC2抗体で染色し、内在性のNKCC2タンパク質を検出した結果を示す写真である。スケールバーは、いずれも1cmを示す。
続いて、共焦点レーザー顕微鏡を使用して、NKCC2DI−EGFPアデノウイルスベクターを導入した場合のEGFP及び内在性のNKCC2タンパク質の発現を、より高解像度で検討した。組織切片の免疫染色には、実験例3で用いたものと同じ抗体を使用し、EGFP及び内在性のNKCC2タンパク質を二重染色した。また、ヘキスト33342を用いて核を染色した。
発明者らは、実験例2で調製した、NPT2a−EGFPアデノウイルスベクターを腎動脈へのボーラス投与によりラットに投与した。続いて、アデノウイルスベクターの投与から4日後に各ラットから腎臓を摘出し、実験例3と同様にして組織切片を作製した。
続いて、作製した各組織切片を免疫組織化学解析により解析した。図3(a)及び(b)は、NPT2a−EGFPアデノウイルスベクターを導入した結果を示す写真である。図3(a)は抗EGFP抗体で染色した結果を示す写真であり、図3(b)は、図3(a)の組織切片に隣接する別の組織切片を抗NHE3抗体で染色し、内在性のNHE3タンパク質を検出した結果を示す写真である。上述したように、抗NHE3抗体は、抗NPT2a抗体が入手できなかったため、抗NPT2a抗体の代わりに使用した。スケールバーは、いずれも1cmを示す。
続いて、共焦点レーザー顕微鏡を使用して、EGFP及び内在性のNKCC2タンパク質の発現を、より高解像度で検討した。組織切片の免疫染色には、実験例3で用いたものと同じ抗体を使用し、EGFP及び内在性のNHE3タンパク質を二重染色した。また、ヘキスト33342を用いて核を染色した。スケールバーは、いずれも50μmを示す。
発明者らは、実験例2で調製した、AQP2−EGFPアデノウイルスベクターを腎動脈へのボーラス投与によりラットに投与した。続いて、アデノウイルスベクターの投与から4日後に各ラットから腎臓を摘出し、実験例3と同様にして組織切片を作製した。
続いて、作製した各組織切片を免疫組織化学解析により解析した。図5(a)及び(b)は、AQP2−EGFPアデノウイルスベクターを導入した結果を示す写真である。図5(a)は抗EGFP抗体で染色した結果を示す写真であり、図5(b)は、図3(a)の組織切片に隣接する別の組織切片を抗AQP2抗体で染色し、内在性のAQP2タンパク質を検出した結果を示す写真である。スケールバーは、いずれも1cmを示す。
続いて、共焦点レーザー顕微鏡を使用して、EGFP及び内在性のAQP2タンパク質の発現を、より高解像度で検討した。組織切片の免疫染色には、実験例3で用いたものと同じ抗体を使用し、EGFP及び内在性のAQP2タンパク質を二重染色した。また、ヘキスト33342を用いて核を染色した。
Claims (5)
- 腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターからなる、腎尿細管細胞特異的に前記遺伝子を発現させるためのベクター。
- 前記プロモーターが、sodium−dependent phosphate transporter type 2a(NPT2a)、sodium−potassium−2−chloride cotransporter(NKCC2)、aquaporin2(AQP2)、sodium−chloride cotransporter(NCC)及びepithelial sodium−channel(ENaC)からなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、請求項1に記載のベクター。
- 前記遺伝子が、NPT2a、NKCC2、AQP2、NCC及びENaCからなる群より選択される遺伝子である、請求項1又は2に記載のベクター。
- 血流を遮断した腎臓の腎動脈へのボーラス注入により投与される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のベクター。
- 遺伝性尿細管疾患の遺伝子治療用である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のベクター。
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