JP2001525171A

JP2001525171A - トランスジェニック動物によって生成される尿を用いた有機材料の分解および解毒方法

Info

Publication number: JP2001525171A
Application number: JP2000523339A
Authority: JP
Inventors: ヘンリックリュボン; レカパレヤンダ; ウィリアムドロハン; ウィリアムヴェランダー
Original assignee: アメリカンナショナルレッドクロス
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2001-12-11
Also published as: WO1999028463A2; WO1999028463A3; AU1606499A; EP1036176A2; US20020184655A1

Abstract

(57)【要約】有機材料を分解または解毒する蛋白質を産生する方法を記述する。本方法は、その尿中にそのような蛋白質を生成し、および尿中に検出可能な蛋白質をコードする外因性遺伝子がそのゲノムに安定に組み込まれたヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法を含む。このように、その尿中にそのような蛋白質を産生するヒト以外のトランスジェニック動物、および有機材料を分解または解毒する方法について記述する。同様に、その尿中に有機材料を分解または解毒する蛋白質を生成するヒト以外のトランスジェニック動物を含む施設およびそのような動物を含む構造についても記述する。尿中に天然に認められる物質を変化させる方法を記述する。ヒト以外のトランスジェニック動物を作製するために用いられるDNA構築物についても記述する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景発明の分野本発明は、環境汚染物質となる可能性がある動物、植物、工業および農業関連
老廃物を処置するためにトランスジェニック動物の分野における技術的進歩を応
用する。

【０００２】動物の尿および老廃物動物はグアニン、クレアチン、クレアチニン、アミノ酸および酸化トリエチル
アミンのような多様な窒素老廃物を分泌するが、その大半をアンモニア、尿素お
よび尿酸が占める。動物老廃物からの硝酸塩および微生物は地下水を汚染する可
能性がある。豪雨による流出水は表面水に肥料を輸送しうる。表面水における高
いアンモニアレベルは魚およびその他の水性動物相に対して毒性を示し、過度の
硝酸塩および亜硝酸塩は動物に対して毒性となりうる。動物老廃物または化学発
酵器からの硝酸塩によって、硝酸塩誘発メトヘモグロビン血症による幼児の疾患
および死亡に至ることがありうる。病原性微生物によって水は家畜またはヒトに
よる消費に不適となりうる。健康リスクには、サルモネラ症、微生物における抗
生物質抵抗性、動物に投与された治療的または予防的薬剤からの残留毒物が含ま
れる。過剰な栄養分は富栄養化を促進し、上水道中の藻類または植物の増殖を増
加させる。植物が死亡すると、微生物によるそれらの分解によって水中の容存酸
素が枯渇し、その結果魚が死亡する（豚肉産業ハンドブック）。

【０００３】アメリカでは毎年、大量の食品加工、作物、林業、および動物の固形老廃物を
排出している。これらの老廃物の主成分は生体内分解性である。しかし、それら
は、制御されない条件下では水性生物、植物、動物またはヒトの生命に有害とな
りうる窒素、燐、ヒトおよび動物病原体、医薬品、試料添加剤、塩、酸化要求性
の有機化合物、ならびに特定の重金属のような成分も含んでいる。家禽および畜
産製造による肥料または尿および糞は、主な環境汚染源である。例えば、USDAに
基づくと、1989年のブロイラーおよび成熟ニワトリの国内生産数は56億頭、七面
鳥は2億4200万頭、アヒルは3100万頭、および鶏卵は69兆個であった。家禽の群による糞老廃物の年間排出量は、乾燥重量に基づいて8800万トンであり、これに
加えてブロイラーの孵化場老廃物が106,000メートル法トンであった。これに、3
700万羽の死鳥および廃棄鳥が加わる（ポープ（Pope, C. W.）、Poultry Sci.,
70：1123〜1125、1990）。

【０００４】動物試料中の窒素および燐の約80％、およびカリウムの90％は、ブタおよび家
禽のような単胃動物から排泄される。肥料中の燐は主に有機物の形で放出され、
家畜が大量生産される地域では環境問題を引き起こしつつあるが、カリウムは容
易に脱塩する無機塩であり、植物が利用できる。窒素および燐を固定するために
化学物質が肥料に加えられることがある。利用されない燐を放出するためにフィ
ターゼ酵素を加えることによって試料を変化させると、肥料の含有量は25〜40％
減少させることができる。フィターゼは、ヒスチジン酸フォスファターゼのファ
ミリーに属し、植物種子に関して燐酸の主な保存型であるフィチン酸塩の加水分
解を触媒して、無機燐酸塩、イノシトール、およびイノシトール一から五燐酸に
する。真菌アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）からのフィターゼをコードする遺伝子はA.ニガー（A. niger）において過剰発現された（
パサモンテス（Pasamontes）ら、Appl. Environ Microbiol. 63：1696〜1700、1
997）。phyA酵素の基質特異性は、A. ニガー（A. niger）T213、A. テレウス（A
. terreus）9A1、M. サーモフィラ（M. thermophila）およびアスペルギルス・フィキュウム（Aspergillus ficuum）のフィターゼに類似していた。酵素は、高
温に抵抗性であり、酵素活性は広いpH範囲で起こる。肥料の窒素含有量は、蛋白
質レベルを減少させ、特定のアミノ酸を置換することによって22から41％減少さ
せることができる。

【０００５】嫌気性菌は極端な環境条件で増殖し、その酵素は、バイオマス由来基質または
合成ガスに基づく化学および燃料生産システムと共に、有機老廃物処理システム
において応用されている。それらは、真核生物起源の酵素によって消化すること
ができない有機化合物の異化酵素を提供する。それらはコレステロール、胆汁酸
、およびステロイドホルモンの異化に必要である；それらはいくつかのフラボノ
イド配糖体を加水分解して、抗発癌物質にし、特定の発癌物質を解毒する。工業
的にはチーズの製造、デンプンの甘味料への変換、ならびにおがくず、チップお
よび紙ゴミを燃料に変換するために、嫌気性酵素が用いられている（ボッケンホ
イザー（Bokkenheuser）、Clin. Infect. Dis. 16：S427〜434、1993）。病原性
の土壌微生物からの特定の酵素は、尿素、クレアチニン、尿酸、グアニジン誘導
体およびその他の非蛋白質窒素化合物（NPN）を変換することができる。酵素はアンモニア、カリウム、燐、およびその他の危険となりうる因子を利用する。例
えば、好気性菌および嫌気性菌はいずれも老廃物から燐酸塩を蓄積することがで
きる。A. ジョンソニイ（A. Johnsonii ）210Aのようなアシネトバクター（Acin
etobacter）属に属する細菌は、多様な活性汚泥において発生し、その中では生物学的燐酸塩の除去の増強が認められる（コルツティ（Kortstee）ら、FEBS Mic
robiol. Rev. 15：137〜153、1994）。その他のポリ燐酸塩蓄積微生物もまた、燐の除去に関係する可能性がある。燐酸塩を蓄積し、同様に脱窒素化する細菌は
、汚水処理において密接な関係があるであろう。

【０００６】市内のゴミの50％以上が紙である。まぐさおよび糞の老廃物におけるセルロー
ス材料は、約65℃の堆肥化温度で活性である、サーモモノスポラ・クルバタ（Th
ermomonospora curvata）のような好熱性菌からのセルラーゼのような細胞不含酵素、およびトリコデルマ（Trichoderma）属のセルロース分解真菌によって分解される可能性がある。セルロースゴミを酸処理すると、アビセラーゼのような
フザリウム・アクミナーツム（Fusarium acuminatum）酵素、カルボキリメチルセルラーゼ、β-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼに対する感受性を改善することができる。クロストリウジウム・セルロリチクム（Clostr
idium cellulolyticum）celA、celB、celF遺伝子、C.サッカロリティクム（C. s
accharolyticum）F. スクシノゲネス（F. succinogenes）、R. フラベファシエンス（R. flavefaciens）およびストレプトミセス（Streptomyces）属からのようなその他のセルラーゼ遺伝子、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei
）からのβ-グルカナーゼ遺伝子およびセルマトガ・ネオポリタナ（Thermatoga
neaopolitana）からのアビセラーゼ遺伝子が単離されている。ストレプトミセス
・ビリドスポルス（Streptomyces viridosporus）T7Aは、植物残査のセルロース
およびヘミセルロース成分を分解するために、リグニンを酸化的に脱重合化する
。反応によって、改変された水溶性の酸沈殿性重合リグニン（APPL）が主な分解
産物として生成される。4 kb断片にコードされるリグニンペルオキシダーゼALip
-P3酵素は、S. ビリドスポルス（S. viridosporus）によって分泌される４つのペルオキシダーゼ活性化蛋白質の一つである（ワン（Wang）ら、J. Biotechnol.
13：131〜144、1990）。ALip-P3は、フェノールリグニンおよび非フェノールリ
グニンの側鎖のC-C結合の切断を触媒し、重合リグニンを酸化する。これは広い基質特異性を有するヘム蛋白質であり、2,4-ジクロロフェノールのような塩素化
芳香族化合物を含む多くの基質を酸化する。S. ビリドスポルス（S. viridospor
us）のリグニン脱重合化酵素系には、細胞外芳香族酸エステラーゼ、芳香族アル
デヒドオキシダーゼ、およびおそらくセルラーゼも含まれる。ファネロカエテ・
クソスポリウム（Phanerochaete chysosporium）からのリグニンペルオキシダー
ゼに対する遺伝子であるlpoは、バキュロウイルス系において発現された。フレビア・ラディアータ（Phlebia radiata）からの遺伝子、lgp、トラメト・ベルシ
コロル（Trameto versicolor）およびブジャカンデラ・アダスタ（Bjerkandera
adusta）からの遺伝子もまた同定されている。サーモモノスポラ・メソフィリア
（Thermomonospora mesophilia）は、リグノセルロースを分解してAPPLを産生す
る。もう一つのリグニン可溶化およびAPPL-産生放線菌（Actinomycete）であるストレプトミセス・シアネウス（Streptomyces cyaneus）は、ボールミルで処置
したわらの上で増殖し、リグニン可溶化に関係する誘導型の細胞外蛋白質を排出
する。ストレプトミセス・バディウス（Streptomyces badius）252は、S. ビリドスポルス（S. viridosporus）と類似の４つの細胞外ペルオキシダーゼを排泄し、少なくとも部分的にリグノセルロースを分解する細胞外オキシダーゼ１つ以
上を生成する。

【０００７】土壌および地下水に及ぼす化学物質の影響農業において用いられる除草剤もまた、地下水および流出水の汚染に至り、こ
れらは監視する必要がある。s-トリアジン環は、除草剤、色素およびポリマーの
構成成分として認められる。シマジン、テルブチラジン、およびアトラジン[2- クロロ-4-(エチルアミノ)-6-(イソプロピルアミノ)-1,3,5-トリアジン]を含むs-
トリアジン系除草剤は、トウモロコシ、モロコシ、およびサトウキビのような主
な作物における葉の広い雑草および草の多い雑草の制御に用いられて、環境中に
多く存在する。アトラジンの残留物は土、表面、排水および飲料水に認められ、
季節によっては安全濃度を超えている。アトラジンが脱塩素化してヒドロキシア
トラジンを生じることは、トウモロコシのような植物および動物において認めら
れている。ヒドロキシアトラジンは、除草剤ではなく、毒性はないと考えられ、
アトラジンほど容易に土壌から浸出しない。このように、加水分解的な脱塩素化
は、環境を回復するという目標を持ってアトラジンを代謝するためには理想的で
ある。シュードモナス（Pseudomonas）属の株ADPは、中間体ヒドロキシアトラジ
ンを通じて、アトラジンを二酸化炭素およびアンモニアに代謝した。株ADPからの1.9 kb avaI DNA断片は、アトラジン変換活性、TrzAと最高のアミノ酸配列同一性を有する予想分子量52,421のアミノ酸473個の蛋白質、R. コラリヌス（R. c
orallinus）NRRL B-15444Rからの脱塩素化酵素をコードする1,419ヌクレオチドのaztA遺伝子を含む。AtzAは、土壌および地下水におけるアトラジン、シマジン
、およびデスエチルアトラジンの脱塩素化を触媒するクロロヒドラーゼである。
AtzAは、大腸菌DH5αにアトラジン脱塩素化能を付与する（デソウザ（De Souza ）ら、J. Bacteriol. 178：4894〜4900、1996）。

【０００８】類脂質溶解性が高く、生体内分解に抵抗性であるDDT、ジエルドリン、およびリンデンのような有機塩素系殺虫剤は、動物組織に蓄積し、長期毒性作用を生じ
うる。この結果、D-グルクロン酸およびL-アスコルビン酸の形成および排泄が増
強され、これがさらに毒性をさらに悪化させる（ストリート＆チャドウィック（
Street and Chadwick）、Ann. NY Acad. Sci. 258：132〜143、1975）。肝アルデヒドレダクターゼ（AR1）は、脂肪族および芳香族アルデヒドを還元するのに対し、カルボニルレダクターゼCR1およびCR2は、キノンと共に芳香族アルデヒド
およびケトンの還元を触媒する。毒性のある有機塩素系殺虫剤であるクロロデコ
ン（ケポン）は、ヒト肝臓において、生体異物代謝酵素のアルドケトレダクター
ゼファミリーに属するクロロデコンレダクターゼ（CDR）によってクロロデコンアルコールへと生体内還元される。CDRをコードする３つの類似のcDNAインサートがクローニングされ、この蛋白質は分子量37.4 kDであった（ウィンタース（W
inters）ら、Biochemistry 29：1080〜1087、1990）。アレチネズミの肝臓における誘導型のカルボニルレダクターゼは、クロロデコンの生体内還元を触媒する
。白腐れ病真菌からの酵素は、クレオソートおよびアロクロールのような汚染物
質の複雑な不溶性混合物を分解することができる。ペニシリウム（Penicillium ）属からの酵素は、農業において用いられる殺虫剤および枯れ葉剤からの有機ヒ
酸をメチル化することができる。

【０００９】ブルクホルデイア（Burkholdeia）属の株PS12は、1,2,4-トリクロロベンゼンおよび1,2,4,5-テトラクロロベンゼンを分解する。クロロベンゼンジオキシゲナ
ーゼ、フェロドキシンおよびレダクターゼをコードするtec遺伝子を含むP12から
の5.5 kb DNA配列を大腸菌において発現させた（ベイル（Beil）ら、1997、Eur.
J. Biochem. 247：190〜199）。これによって、塩化ベンゼンおよびトルエン、
ビフェニルおよびジベンゾ-p-ジオキシンのような芳香族化合物が攻撃される。

【００１０】殺虫剤、防カビ剤、および除草剤のような有機燐（OP）化合物は、食品および
水道水に蓄積しうる。シュードモナス・ディミヌタ（Pseudomonas diminuta）MG
およびフラボバクテリウム（Flavobacterium）属のATCC 27551のような微生物は
高レベルの有機燐ヒドロラーゼ酵素を有するが、これは広い基質特異性を有し、
メチルおよびエチルパラチオン、パラオキソン、ドゥルスバン、クマホス、シア
ノホスおよびジアジノンのようなOP殺虫剤のホスホトリエステル結合と共に、サ
リンおよびソマンのような化学兵器のホスホネート・フルライド結合の加水分解
を触媒する。OP殺虫剤を解毒するP.ディミヌタ（P. diminuta）からのホスホトリエステラーゼが単離され、遺伝子がクローニングされた（セーダー（Serdar）
ら、Bio/Technol. 7：1151〜1155、1989）。1.3 kb断片は975塩基のORFを含み、
65 kDのダイマーを形成する35.4 kDの酵素をコードする。OPHは、N-末端シグナル配列を有する膜関連蛋白質であり、組換え型OPHはsf9昆虫細胞、大腸菌におい
て産生されており、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）によって可溶型として分泌されている。rOPHは、アキヨトウムシおよびドロソフ
ィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）にパラオキソン抵抗性を付与した。これは大腸菌細胞壁の外表面に結合すると、活性を保持する。有機燐酸
塩パラオキソンは、幾つかの組織においてコリンエステラーゼおよびカルボキシ
エステラーゼのような酵素に結合することによってこれらの酵素を阻害する。カ
ルボキシエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼとの相互作用を防止する
ことによって薬剤、殺虫剤の解毒に重要である（カリステ・コルホネン（Kalist
e-Korhonen）ら、Hum. Exp. Toxicol. 15：972〜978、1996）。パラオキソン加水分解酵素（Pxアーゼ）は、種特異的に解毒することができる。このアリールエ
ステラーゼ／パラオキソナーゼはまた、殺虫剤クロルピリホスまたはドゥルスバ
ンも加水分解する。フラボバクテリウム（Flavobacterium）opd（OP分解）遺伝子によって特定されたパラチオンヒドロラーゼ遺伝子が単離されている（ミュル
ブリー（Mulbry）ら、J. Bacteriol. 171：6740〜6746、1989）。マウスopd遺伝
子mpr56-1の発現は最近、腎臓および肝臓において検出されている。

【００１１】ニトリルはベンゾニトリル系除草剤において、およびポリアクリロニトリルプ
ラスチック合成の前駆物質として工業的に用いられるるシアン化合物置換カルボ
ン酸である。それらはまた、多くの工業的作業において化学溶剤、抽出剤、およ
び再結晶剤としても用いられる。それらは工業廃水を通じて環境に放出され、自
動車はシアン化水素１μgおよびアセトニトリル100 μg/mlを含むガスを排出する。それらのほとんどは非常に毒性が強く、変異原性および発癌性である。シュ
ードモナス・マルギナリス（Pseudomonas marginalis）はアセトニトリルを代謝
してアンモニアおよび酢酸塩にすることができる（バブ（Babu）ら、Appl. Micr
obiol. Biotechnol. 43：739〜745、1995）。２段階酵素メカニズム−ニトリル・アミノヒドロラーゼはニトリルをそのそれぞれのアミドに変換し、アミドはア
ミダーゼによってそのカルボン酸およびアンモニアに分解される。ニトリル・ア
ミノヒドロラーゼの基質はアセトニトリル、フェニアセトニトリル、イソブチロ
ニトリル、メタクリロニトリル、ブチロニトリル、プロピオニトリルおよびスク
シノニトリルであるが、アミダーゼはアセトアミドの存在下で最大活性を示し、
これにプロピオンアミド、アジパミド、ベンズアミド、イソブチルアミドおよび
メタクリルアミドが続く。これらの酵素はニトリル化合物からカルボン酸を産生
することができるため、それらはそれぞれの有機酸を産生するために商業的に用
いられる可能性がある。

【００１２】工業的に生産されるハロゲン化芳香族化合物は、主なクラスの環境汚染物質と
なる。ハロ芳香族化合物の場合、主な分解経路は、対応するハロカテコールの変
換、芳香環のイントラジオール（オルト）切断、およびその後の反応の際のハロ
ゲン化物の消失を含む。細菌の遺伝子産物はハロ芳香族、トルエン、キシレン、
および関連する芳香族炭化水素の分解に有用である。シュードモナス（Pseudomo
nas）属の株B13のxylDおよびxylL遺伝子は、酵素、トルエート1,2-ジオキシゲナ
ーゼおよびジヒドロ、ジヒドロキシ安息香酸デヒドロゲナーゼをコードするが、
nahG遺伝子はサリチレートヒドロキシラーゼをコードする。異なる代謝経路から
これらの遺伝子が組み合わせて発現されると、4-クロロベンゾエート、3,5-ジク
ロロベンゾエート、サリチル酸塩、およびクロロサリチル酸塩が分解された（レ
ーバック（Lehrbach）ら、J. Bacteriol. 158：1025〜1032、1984）。このように遺伝子操作によって、異なる細菌種からの遺伝子の組合せが可能となり、本質
的なDNA断片を使用することによって非生産的な酵素の誘導が防止される。ニトロベンゼン、ニトロトルエン、ニトロフェノール、およびニトロベンゾエートの
ようなニトロ芳香族は工業的にかなり重要である。それらはしばしば殺虫剤、火
薬類、色素、ポリマー、医薬品として、またはこれらの化合物の製造に用いられ
、および溶媒またはアミノ芳香族誘導体の前駆物質として用いられる。数千トン
ものこれらの化合物（例えば、2,3,6-トリニトロトルエンおよびニトロベンゼン
）が年間生産されている。多くのニトロ芳香族は、多くの生命体にとって毒性ま
たは変異原性であることが示されている。2,4,6-トリニトロトルエン（TNT）、2
,3-ジニトロトルエン（2,4-DNT）、および1,3-ジニトロベンゼンは多くの細菌、
酵母、真菌、単細胞藻類、トーデプール（todepool）カイアシ類、および牡蛎の
幼生に対して毒性であり、それらはヒトにおいて肝炎および貧血を引き起こす。
多くの生物がニトロ芳香族を還元することができる（マルビン-シッケマ（Marvi
n and Sikkema）ら、Appl. Microbiol. Biotechnol. 42：499〜507、1994）。ニ
トロ芳香族化合物の分解は、インサイチュー、土壌、水および汚水中で起こる。
澱粉質の老廃物のようなニトロ芳香族分解細菌および栄養の密度の濃い集団を、
汚染した土壌に加える。これらの条件下ではニトロ芳香族除草剤ジノセブは、２
週間以内に酢酸のような非毒性産物に分解された。コマモナス・アシドボランス
（Comamonas acidovorans）NBS-10はまた、ニトロ芳香族から酸素不安定性のカテコールを生成することができる。

【００１３】ロドコッカス（Rhodococcus）属の細菌は、水素化炭化水素、多数の芳香族化合物を分解する多様な酵素を含む。このように、それらは石炭もしくは石油のよ
うな化合物を脱硫するために、またはセシウムを蓄積するために用いられる可能
性がある。燃焼性の含硫石油および石炭は環境悪化に寄与する。これらの燃料か
らの無機硫黄の除去は、物理的、化学的または生物学的手段によって行ってもよ
いが、有機的に結合した硫黄は除去が難しい。グラム陽性細菌であるロドコッカ
ス（Rhodococcus）属の株IGTS8は、チオフェン、スルファイド、メルカプタン、
スルホキシド、およびスルホンのような、多様な有機硫黄化合物、石油および可
溶性の石炭由来材料から、炭素-硫黄結合を切断することによって、硫黄を水溶性の無機型で放出することによって硫黄を抽出することができる。ロドコッカス
（Rhodococcus）属の株IGTS8は、炭素-炭素結合を切断することなく、ジベンゼンチオフェン（DBT）から共有結合した硫黄を除去することができる酵素経路を有する。これらの遺伝子の産物はsoxABC（硫黄酸化）と呼ばれ、オペロンとして
発現され、DBTを2-ヒドロキシビフェニルに脱硫するために必要であった（デノム（Denome）ら、J. Bacteriol. 176：6707〜6716、1994）。soxABC遺伝子はDBT
脱硫表現型をIGTS8の脱硫陰性変異体またはその他の種、ロドコッカス・ファシアンス（Rhodococcus fascians）に付与した。このように、適当な制御シグナル
があれば、酵素はロドコッカス（Rhodococcus）属以外の属においても活性となりうる。

【００１４】ロドコッカス（Rhodococcus）が触媒する他の生体内変換は、ステロイド修飾およびニトリルのアミドおよび酸への変換である。幾つかの株はフェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼおよびエンドグリコシダーゼのような酵素を産生する。非ヘ
ムハロペルオキシダーゼは、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus eryt
hropolis）NI86/21によるチオカルバメート系除草剤の生体内分解に関係しており、30 kDa蛋白質はthcF遺伝子によってコードされる（デシュリジバー（De Sch
rijver）ら、Appl. Environ. Microbiol. 63：1911〜1916、1997）。これはシュ
ードモナス・ピロシニア（Pseudomonas pyrrocinia）からのクロロペルオキシダ
ーゼの遺伝子と相同である。

【００１５】 2-ヒドロキシビフェニルは1937年以来、様々な果実の防かび剤として用いられ
てきた。2-ヒドロキシおよび2,2'-ジヒドロキシビフェニルはまた、化石燃料の主な硫黄含有成分であるジベンゾチオフェンの細菌による脱硫の最終産物でもあ
る。ラットでは、2-ヒドロキシビフェニルは腎毒性を示し、膀胱の腫瘍を引き起
こす。2-ヒドロキシビフェニル3-モノオキシゲナーゼは、シュードモナス・アゼ
ライカ（Pseudomonas azelaica）HBP1のhbpA遺伝子によってコードされる芳香族
ヒドロキシラーゼであり、その2,3-ジヒドロキシビフェニルへの変換を触媒する
（ススケ（Suske）ら、J. Biol. Chem. 272：24257〜24265、1997）。これはR.
ユートロファ（R. eutropha）からの2,4-ジクロロフェノール6-ヒドロキシラーゼおよびシュードモナス（Pseudomonas）属の株EST 1001からのフェノール2-ヒドロキシラーゼと配列相同性を有する。

【００１６】スチレンは化学産業で大量に用いられ、環境中に放出される毒性化合物である
。スチレン汚染は工業廃水、ポリスチレンの蒸発および熱分解によって起こりう
る。シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）STの4,377
bpの染色体領域は、スチレンをエポキシスチレンに変換するスチレンモノオキシゲナーゼをコードするstyAおよびstyB遺伝子、ならびにエポキシスチレンをフ
ェニルアセトアルデヒドに変換するエポキシスチレンイソメラーゼをコードする
styCを含み、これはその後styDによってコードされるフェニルアセトアルデヒド
デヒドロゲナーゼによってフェニル酢酸に酸化される（ベルトラメッティ（Belt
rametti）ら、Appl. Environ. Microbiol. 63：2232〜2239、1997）。

【００１７】尿路の構造および機能ヒト腎臓は、ベスト＆テイラー（Best and Taylor）の「医療の生理学的基礎（Physiological Basis of Medical Practice）」、第11版、ウェスト（J. B. W
est）；「生理学（Physiology）」、第２版、ベルネ＆レヴィ（Berne and Levy ）、CVモスビー社、1988に記述のように、ネフロン約1,000,000個を含む。図１および２を参照のこと。

【００１８】腎臓は、腎血管を通じて流れる血漿の組成を選択的に調節し、細胞が正常に機
能するために比較的一定の環境を提供することによって、細胞外液の組成を調節
する。腎臓はまた、これら全てが血圧の調節に関係しているアンジオテンシンII
、プロスタグランジン、およびキニンのようなホルモンの産生に何らかの役割を
果たしている。腎臓はまた組織への酸素輸送が適切であるか否かをモニターし、
腎低酸素状態に反応して骨髄における前駆細胞から赤血球産生を調節する糖蛋白
質ホルモンであるエリスロポエチンを合成する。

【００１９】尿の形成は３つのプロセスを含む：濾過、再吸収および分泌である。保存すべ
き材料は血漿中に保持され、老廃産物が抽出されて排泄される。肝代謝の最終産
物は、しばしば有機陰イオンの形で尿中に現れる。例えば、プリン代謝の最終産
物である尿酸は、腎臓によってのみ排泄される。下記の表Iは、腎臓の近位尿細管によって分泌される有機材料を記載する。

【表I】

（A）近位尿細管によって分泌される有機酸 (B)近位尿細管によって分泌される有機塩基

【００２０】蛋白質代謝の主な最終産物である尿素は腎臓によってのみ排泄される。さらに
、近位尿細管細胞はアンモニアを合成する。

【００２１】哺乳類の腎臓は、両生類および爬虫類の腎臓とは２つの主な点で形態学的に異
なる。第一に、ネフロンはその近位および遠位渦巻き部分の間にヘンレ係締が介
在し、第二にヘンレ係締および集合管は、平行した列に構築されている。鳥類は
これらの特徴をある程度共有する。魚類では腎臓器は両生類で認められるものと
類似である。鳥類および爬虫類ではいずれも、尿管腎盂は排泄腔につながってい
る。主な窒素含有最終産物は動物の特定のグループでは異なる可能性があり、窒
素化合物の最終代謝産物を変化させるために遺伝子を様々な種に加えてもよい。
（「動物の生理学（Animal Physiology）」、ヒル＆ワイズ（Hill HL and Wyse
GA）編、1989；「脊椎動物比較解剖学（Comparative Vertebrate Anatomy）」、
ハイマン（Hyman HL）編、1978；「魚の生理学（The Physiology of Fishes）」
、エバンス（Evans DH）、1997；ライト（Wright）ら、J. Exp. Biol. 198：273
〜281（1995））。

【００２２】このように、腎臓は複雑な臓器であり、尿は水、イオンおよび蛋白質の混合物
であり、その幾つかは環境中に大量に存在すると汚染源となる可能性がある。

【００２３】発明の概要このように、農業および家畜学に関連した有機老廃物を制御する必要性がある
。同様に、その毒性作用を減少させるために尿を変化させる方法の必要性も存在
する。本発明は、トランスジェニック動物技術を用いてこれらの要求を満足させ
ることができる発見に基づいている。詳しく述べると、本発明の一つの態様は、
有機材料を分解または解毒する蛋白質を産生する方法に関する。本方法は、尿中
に検出可能であって、有機材料を分解または解毒する蛋白質をコードする外因性
遺伝子をそのゲノムに安定的に組み入れられたヒト以外のトランスジェニック動
物を提供することを含む。用いられる動物は、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、齧歯
類、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコからなる群より選択される哺乳類であるが、鳥類
、魚類、または爬虫類のようなヒト以外の哺乳類を含むことができる。コードさ
れるタンパク質は、酵素、図７に記載する酵素のような酵素となりうる。分解ま
たは解毒すべき有機材料は、糞、グアノ、尿、微生物、化学汚染物質、およびそ
の副産物または食品およびその副産物である。特に化学汚染物質は除草剤、防虫
剤または肥料を含む殺虫剤となりうる。

【００２４】もう一つの態様において、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック動物が、
尿中に検出可能な蛋白質をコードする外因性遺伝子をそのゲノムに安定的に組み
入れられる、その尿中に有機材料を分解または解毒する蛋白質を生成するヒト以
外のトランスジェニック動物を提供する段階を含む、有機材料を分解または解毒
する方法に関する。方法は以下の段階を含む：（a）尿中に検出可能であって、有機材料を分解または解毒する蛋白質をコードする外因性遺伝子をそのゲノムに
安定的に組み入れられたヒト以外のトランスジェニック動物を提供する段階；お
よび（b）有機材料を尿と接触させ、それによって有機材料を分解および解毒する段階。接触は尿を有機材料と混合する段階、またはヒト以外のトランスジェニ
ック動物を有機老廃物に排尿させる段階を含んでもよい。

【００２５】さらにもう一つの態様において、本発明は動物を含む施設に関する。本施設は
、尿中に検出可能であって、有機材料を分解または解毒する蛋白質をコードする
外因性遺伝子をそのゲノムに安定的に組み入れられたヒト以外のトランスジェニ
ック動物少なくとも１匹；および施設内に動物を含むための構造、を含む。施設
はまた、トランスジェニック動物の種と同じまたは異なる種の非トランスジェニ
ック動物少なくとも１匹を含む。トランスジェニック動物は上記の通りである。
トランスジェニック動物および非トランスジェニック動物はいずれも哺乳類であ
ってもよく、またはもう一つの態様において、非トランスジェニック動物は鳥類
もしくは爬虫類であってもよい。さらにもう一つの態様において、トランスジェ
ニック動物はニワトリ、七面鳥、ガチョウまたはアヒルのような鳥類であっても
よい。施設は農場、放牧場、屠殺場、研究施設または動物園であってもよい。構
造は建物、ケージ、フェンス、または動物を含むために典型的なその他の囲いと
なりうる。

【００２６】もう一つの態様において、本発明は尿の天然成分を変化させる方法に関する。
より詳しく述べると、本発明は、尿中の物質を変化させるインビボ法であって、
トランスジェニック動物の尿中の第二の物質を変化させる第一の物質をコードす
る外因性遺伝子をそのゲノムに安定的に組み入れられたヒト以外のトランスジェ
ニック動物を作製する段階を含む方法に関する。第一の物質は第二の物質を分解
してもよい。第一の物質は蛋白質であってもよく、好ましくは図７に記述する酵
素である。

【００２７】さらにもう一つの態様において、本発明はトランスジェニック動物において用
いられる遺伝子構築物に関する。この構築物は、a、b、およびcが尿管細胞におけるペプチドまたは蛋白質の生成および動物の尿中への分泌を得るために遺伝子
構築物と機能的に結合している、（a）尿管特異的プロモーターおよびエンハンサー配列を含む5'発現調節配列；（b）酵素活性を有する複雑なペプチドおよび蛋白質をコードするcDNAまたはゲノムDNA配列、および該ペプチドまたは蛋白質をトランスジェニック動物の尿中に分泌させるために有効なシグナル配列；およ
び（c）尿管細胞において該DNA配列の発現が起こるポリアデニル化配列を含む3'
調節配列、を含む。

【００２８】さらなる態様において、本発明は、尿中で生成される複雑な蛋白質またはペプ
チドをコードするポリヌクレオチドをその中で発現されるように組み入れられた
細胞を含む、ヒト以外の雄性または雌性トランスジェニック動物を提供する。こ
れは組換え型蛋白質の生成部位として尿管を利用する独自の機会となる。トラン
スジェニック動物は、尿の組成が変化している、または尿の成分が変化している
、複雑な異種蛋白質、酵素またはペプチドをその尿中に生成する。

【００２９】さらに、複雑な蛋白質、酵素またはペプチドは動物の尿中に生成され、動物の
尿中に存在する。尿管の領域は腎臓、尿管腎盂、膀胱および尿道を含む。腎臓お
よび膀胱の細胞は上皮細胞であり、発現に好ましい領域は腎臓または膀胱の遠位
尿細管である。

【００３０】関係する蛋白質をコードするcDNAまたはゲノム配列を、全遺伝子座またはオペ
ロンと同様に、分泌のシグナル配列と共に用いてもよい。同種または異種イント
ロンを含むミニ遺伝子を用いてもよい。

【００３１】詳細な説明一つの態様において、本発明は有機材料を分解または解毒する蛋白質を産生す
る方法に関する。もう一つの態様において、本発明は有機材料を分解する方法に
関する。いずれの態様も有機材料を分解または解毒する蛋白質をその尿中に生成
するヒト以外のトランスジェニック動物を必要とする。ヒト以外のトランスジェ
ニック動物は、尿中に検出可能な蛋白質をコードする外因性遺伝子をそのゲノム
に安定的に組み入れられている。蛋白質は免疫学的または酵素学的アッセイ、ウ
ェスタンブロット、およびその他の既知の方法のような当業者に周知の蛋白質検
出法を用いて検出される。尿中に蛋白質を生成することは、尿管の細胞に外因性
の遺伝子が発現され、この結果最終的に蛋白質が尿において検出されることを意
味する。好ましい態様において、動物はブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、齧歯類、ウ
サギ、ウマ、イヌおよびネコのような哺乳類である。最も好ましい態様において
蛋白質は酵素である。もう一つの好ましい態様において、動物はニワトリ、雌鶏
、アヒル、ガチョウ、もしくは七面鳥のような鳥類または魚類もしくは爬虫類で
ある。そのような酵素によって分解または解毒される有機材料には、糞、グアノ
、および尿中の有機材料と共に肥料、除草剤（防かび剤を含む）、殺虫剤、防虫
剤のような化学汚染物質またはその副産物、微生物、食品およびセルロースのよ
うな食品副産物が含まれる。

【００３２】幾つかの場合において、本発明の蛋白質によって分解または解毒される有機材
料はヒト以外のトランスジェニック動物そのものによって生成される。別の場合
では、有機材料はトランスジェニック動物と同じ種または異なる種の非トランス
ジェニック動物によって生成される。例えば、家禽農場または動物園の場合では
、トランスジェニック動物はブタのような哺乳類であり、有機材料は鳥類または
爬虫類、またはその他の野生動物によって生成されてもよい。さらにその他の場
合では、有機材料は農業または動物の飼育に関連した食品または食品副産物であ
る。そのようなため、本発明の方法は、農場、屠殺場、放牧場、動物園、研究施
設または動物を飼育し、もしくは植物を栽培する他のタイプの施設において用い
ることができる。ヒト以外のトランスジェニック動物によって生成された尿は、
そのような施設において自身によって産生されたおよび／またはその他の動物に
よって生成された尿または糞を分解および解毒する。トランスジェニック動物に
よって生成された尿は単独で、または糞およびその他の老廃物と共に混合して有
機材料に分配またはこれと混合する目的で回収してもよく、またはトランスジェ
ニック動物に有機材料の上に直接排尿させることによって有機材料と接触させて
もよい。

【００３３】「分解する」とは、蛋白質またはその他の有機化合物の天然構造を完全または
部分的に切断することを意味する。「解毒」とは、蛋白質またはその他の有機化
合物を非毒性にすることを意味する。解毒は蛋白質またはその機能における完全
な分解または改変によって起こってもよい。

【００３４】「蛋白質」とは、ペプチドおよび蛋白質の断片と共に蛋白質の変異体および変
種を意味する。本発明の特定の蛋白質は動物老廃物の組成に影響を及ぼす細菌、
真菌または植物起源の酵素的に活性な蛋白質またはペプチドの全てを含む。非常
に有用なものは、非常に高温または非常に低温で活性がある酵素である。特に有
用な蛋白質は老廃物を変換するように予め適合させた微生物からの酵素である。
例えば、排泄物中のペニシリン抗生物質を分解して、環境中への抗生物質抵抗性
細菌の形成およびその繁殖を減少させる酵素が存在する。一例は土壌および／ま
たは表面および地下水の組成に影響を及ぼす生物学的に活性なペプチドまたは蛋
白質である。その他の酵素は土壌および水を汚染する殺虫剤を解毒する。そのよ
うな蛋白質を発現するさらなる蛋白質および遺伝子の同定は、周知の技術を用い
て当技術分野の範囲内である。細菌、ウイルス、真菌、植物および動物ゲノムか
ら既知の蛋白質および関連するDNAを操作する方法も同様に周知である。このように、本発明の蛋白質には、有機材料を分解または解毒する蛋白質の全ての既知
および考えられる変種または修飾を含む。本発明はまた、トランスジェニック動
物において発現され、異なる蛋白質によって翻訳後修飾されてもされなくてもよ
い蛋白質に関する。本発明の酵素の例は図７に述べる。

【００３５】もう一つの態様において、本発明は有機材料を分解または解毒する蛋白質をそ
の尿中に生成するトランスジェニック動物に関する。そのようなトランスジェニ
ック動物の作製は、当技術分野において周知で、しかも容認された技術を応用す
ることを必要とする。例えば、従来の組換えDNAクローニング法を応用することによって、トランスジェニック生物を作製するためのDNAを得ることができる。この点に関して適したDNAを作製する周知の技法に関する一般的な説明は、本明細書に関連する部分が参照として組み入れられる、マニアティス（Maniatis）ら
、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Ma
nual）」、コールドスプリングハーバー研究所、1982およびサムブルック（Samb
rook）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Labor
atory Manual）」、第２版、第１〜３巻、（コールドスプリングハーバー研究所
、1989）によって提供される。全身または組織特異的発現のためにトランスジェ
ニック動物に導入されたDNA構築物の例は、この点に関して関連する部分が本明細書に参照として組み入れられる、「動物の遺伝子操作（GENETIC ENGINEERING
OF AMINALS）」、プーラー（A. Puhler）編、VCH ベルラグスゲセルシャフト、バインハイム、ニューヨーク州（1993）に示される。

【００３６】所定の蛋白質をコードするDNAは、下記に詳細に説明するように、適切な読みとり枠において、適当な調節シグナルと共に融合して遺伝子構築物を作製するこ
とができ、次にこれを例えば細菌ベクターにおける増殖またはその後宿主生物に
導入するためには従来の方法に従ってPCRによって増幅してもよい。一般的に、遺伝子は生物において所望の方法で発現に必要なシス作用シグナルと機能的に結
合する。この点において特に好ましいのは、プロモーターおよび特定の細胞タイ
プにおいて効率的な発現を提供するその他のシス作用調節エレメントである。以
下の考察において、プロモーターという用語は広く用いられ、厳密な技術的意味
ではプロモーターと通常見なされないエンハンサーのようなシス作用エレメント
に及ぶ。

【００３７】本発明において有用なシス作用調節領域には、遺伝子の発現を誘導するために
用いられるプロモーターが含まれる。本発明において特に有用であるのは、所定
の細胞タイプにおいて特に活性があるプロモーターである。この点において、好
ましいプロモーターは尿のような体液に物質を分泌させる細胞において特異的に
活性である。したがって、特に、尿管細胞は特に有用である。最も有用であるの
は腎臓の尿細管上皮細胞および膀胱の上皮細胞である。この点において特に好ま
しいプロモーターは、腎臓または膀胱組織のような尿管組織において活性である
プロモーターである。「効率的」とは、プロモーターが尿中での蛋白質の妥当な
大量を合成することを支援することを意味する。

【００３８】尿管組織に関連した蛋白質からそのようなプロモーターおよびその他の調節配
列を単離することも当技術の範囲内である。例えば、ウロモジュリンまたはタム
-ホールフォール糖蛋白質（THP）はヒト尿中に大量、20〜200 mg/日または総蛋白質の15〜37％存在する。THP発現は腎臓に限って特異的であって、肝臓、心臓、肺、脳、胸腺、筋肉、脾臓、精巣、または胎盤では発現されない。単一のヒト
遺伝子はエキソン11個およびイントロン10個を含み、mRNAの大きさは約2.6 kbで
ある（ヘッション（Hession）ら、Science 237：1479〜1484、1987；ペニカ（Pe
nnica）ら、Science 236：83〜87、1987）。完全長のcDNAのヌクレオチドシーク
エンシングからアミノ酸640個の蛋白質が予想され、これはアミノ酸24個のリーダー配列およびシステイン残基48個を含むアミノ酸616個の成熟蛋白質を含む。リーダー配列から、THPの大部分は分泌型蛋白質であるが、ホスホリパーゼ、またはプロテアーゼの作用によって放出されて尿中で大きい集合体を形成するグリ
コシルホスファチジルイノシトール結合膜蛋白質であることが示唆される。マウ
スウロモジュリンcDNAは、アミノ酸642個の蛋白質を予想する。THPは当初抗原誘
導T細胞増殖を阻害する能力を有する蛋白質として妊娠女性の尿中から単離された。これは男性の尿中にも存在する。THPには考えられるグリコシル化部位が８個存在し、そのうち利用されているのは５個に過ぎない。ウロモジュリンの炭化
水素部分は、インターロイキン-1、インターロイキン-2および腫瘍壊死因子のよ
うなサイトカインの特異的リガンドである。大腸菌の１型線毛と結合することが
できることからおそらく、これによって尿管の細菌定着からの保護が得られた。
ヒトおよびヒツジTHPは高い親和性でヒトおよびヒツジIgGと相互作用する。THP の４つのドメインは上皮細胞増殖因子前駆体のシステインリッチ領域および低密
度リポ蛋白質受容体と類似性を示した。２つのアスパラギンが加水分解されてい
る。THPはまた、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、１型コラーゲン、およびトロンボスポンジンの場合のように、「RGD」配列を発現し、これは細胞表面受容体に結合する。これは同様にヘンレ係締における水分および塩分バランスの
維持に何らかの役割を果たしている可能性がある。

【００３９】 THPは妊娠16週では一貫して認められ、20週以降は羊水に検出可能で、出生時の中央値は1.3 mg/lまで上昇する。生後、THP分泌は着実に増加して、成年初期に最大に達する。これはヘンレ係締の上行枝および初期遠位尿細管の、先端およ
び基底外側表面の双方に局在する。THP分泌は腎臓移植直後では低く、２〜３週間後に正常値まで増加する。糖尿病のTHPは糖含有量が有意に異なり、コロイド安定性が変化しているが、アミノ酸に有意な差はない。シスプラチンは近位尿細
管に重度の損傷を引き起こすが、遠位尿細管細胞には損傷を引き起こさず、利尿
の増加によってTHP排泄が一過性に上昇し、近位尿細管液再吸収の減少により遠位尿細管の尿流が増加する。

【００４０】哺乳類の尿路上皮の管腔表面は、膀胱の膨張の際に尿路上皮表面を安定化させ
ることに関係する12 nm蛋白質粒子の半結晶６角配列を含む無数のプラークで覆われている。27 kDの尿路上皮プラークに関連した（ウロプラキンI）蛋白質は分
化の際に表層部アンブレラ細胞において発現される。15 kD尿路上皮特異的蛋白質ウロプラキンIIおよびIIIもまた同定された。uPA II cDNAはそのC-末端領域で
膜に結合し、N-末端ドメインは管腔に暴露されている蛋白質をコードする（リン
（Lin）ら、J. Biol. Chem. 269：1775〜1784、1994）。UPA遺伝子発現は膀胱特
異的であり、分化依存的である。uPA II遺伝子の3.6 kb 5'隣接配列は細菌のlac
Z遺伝子の発現を尿路上皮の分化した基底上部の細胞にターゲティングすることができる（リン（Lin）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：679〜683、1995）
。

【００４１】エリスロポエチン（EPO）は、赤血球前駆体の増殖および分化を促進する糖蛋白質である。EPOの主な生成部位は腎皮質および程度は少ないものの外部髄質であるが、肝臓が主な腎臓外部位である。急性の低酸素症に反応したEPO生成は、デノボ合成を表し、EPO mRNAにおける変化によって調節される。EPO mRNAは尿細
管分画に認められるが、糸球体組織には認められない。腎臓におけるEPO生成細胞は尿細管周囲の細胞であり、主に内皮細胞である（ラコーム（Lacombe）ら、J
. Clin. Invest. 81：620、1988）。

【００４２】可溶性のヒトトロンボモジュリン（TM）は健常被験者の血漿および尿中の双方
に存在する（ヤマモト（Yamamoto）ら、J. Biochem. 113：433〜440（1993））。尿トロンボモジュリンは、細胞のトロンボモジュリンをエラスターゼまたはエ
ラスターゼ様酵素によって切断することによって生成される可能性があるが、血
漿中での可溶性TMの分子量は28〜105 kDaであることから、血漿TMが糸球体膜を通過して尿中に生理的に濾過されることはあり得ない。それらは腎臓細胞によっ
て生成される可能性がある。尿中に存在するトロンボモジュリンの２つの主な分
子型は、カラムクロマトグラフィーの４連続段階によってヒト尿から単離された
。UTMは無傷の細胞トロンボモジュリンのカルボキシ末端配列のアミノ酸29個を欠損し、II型はI型よりガラクトサミンが少なかった。尿のトロンボモジュリンは、トロンビン結合およびプロテインC活性化にとって必須であるN-末端EGF様ド
メインを含み、推定のO-グリコシル化リッチドメインの最初の６残基を含んだ。
O-グリコシル化リッチドメインにおける可能性がある３つのO-グリコシル化部位
は失われている。

【００４３】尿はまた、シュウ酸カルシウム一水和物結晶成長阻害因子であるネフロカルシ
ン（NC）を含む。マウスの近位尿細管を初代細胞培養するとNCを産生する。精製
すると、全てのNCが炭化水素10〜20重量％を有する糖蛋白質であることが示され
た。それらは酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸およびグルタミン酸）の含有量
が高いが、芳香族および塩基性アミノ酸残基は少なかった。全てのNCはフコース
、ガラクトース、グルコース、マンノース、ガラクトサミン、グルコサミン、お
よび微量のN-アセチルノイラミン酸を含む。腎細胞癌患者における尿中NCの上昇
は一般的で、正常な腎細胞における生化学的変化というよりはむしろ腫瘍増殖が
原因である。転移性疾患を有する患者ではNCの尿中レベルは疾患の進行と一致し
た。オステオカルシン関連遺伝子がマウスにおいてネフロカルシン遺伝子として
同定されており（デスボイス（Desbois）ら、J. Biol. Chem. 269：1183〜1190 、1994）、これは骨ではなくて腎臓でのみ転写される。

【００４４】ヘンレ係締の下行枝の細胞、およびそこで尿が結石の鉱質構成成分の中で非常
に濃縮される腎杯円蓋での乳頭表面上皮に検出される尿結石阻害剤蛋白質は、オ
ステオポンチン（OPN）と同一であることが判明した。OPN mRNAは腎臓では高レベルで認められ、蛋白質が合成されて、ヘンレ係締の太い上行枝および遠位の渦
巻き状の尿細管における上皮によって尿細管液の中に分泌される。雌性の妊娠お
よび授乳中のマウスは雄性マウスより多くのOPNを発現した。動物の加齢に従って、発現はより近位部分で認められる。ウシ腎ライブラリからのオステオポンチ
ン-kのcDNAの特徴付けから、これがアミノ酸約261個および分子量29.6 kDaの腎細胞接着分子であることが示された（クリベロ（Crivello）ら、J. Bone. Miner
. Res. 7：693〜699、1992）。

【００４５】ラット腎臓の集合管の先端膜水分チャンネル（AQP-CD）は濃縮された尿の形成
にとって重要であり、そのRNAは腎臓に限って検出される。集合管のヒトアクアポリン（hAQP-CDまたはAQO2）のcDNAは、ラットAQP-CDと91％同一であるアミノ酸271個の蛋白質をコードする。hAQP-CDのmRNA発現は、皮質より腎髄質に多く認
められ、hAQP-CDの免疫組織化学染色は、集合管細胞の先端ドメインに限って認められた。rAQP-CDは腎集合管のバソプレッシン調節水分チャンネルである。これはhAQP-CDにおいて保存されるC-末端において蛋白質キナーゼAによる燐酸化の
コンセンサス配列を含む。HAQPは29 kDaおよび〜40 kDaの２つの分子量型を含む
可能性がある。健常被験者の尿中に29 kDaの無傷のhAQPが存在することは、hAQP
-CDが膜から剥離して尿中に排泄されることを示している。アクアポリン3（AQP3
）はラット髄質集合管の上皮細胞に存在するもう一つの水分チャンネルであり、
1.9 kbのcDNAによってコードされる。

【００４６】腎髄質における尿素の蓄積に関係する、ラットおよびウサギのバソプレッシン
調節腎尿素輸送物質のcDNAがクローニングされた。RUT2は内髄質集合管の先端お
よび先端下部分ならびに下行性の細い枝の末端部分において認められた。ラット
UT1発現は内髄質において認められ、rUT2とは異なった。

【００４７】尿の蛋白質組成において性に関連した差が認められ、正常なヒト男性の尿は思
春期以降の非妊娠女性の尿よりはるかに多くの蛋白質1（P1）を含む。UP1のレベ
ルはラテックスイムノアッセイまたはELISAによって測定されている。しかし、血清中のUP1レベルに性差はなかった。これは腎臓および生殖組織から濾過後の膀胱に保存された血漿P1が分泌されるためである。トランスフォーミング増殖因
子β、レチノイドX受容体、エリスロポエチン受容体およびドーパミン1A受容体に類似の他の遺伝子が腎臓に発現されている。様々な尿プロテナーゼが正常な尿
および患者の尿の双方から単離されている（チャウラ（Chawla）ら、J. Cell Bi
ochem. 50：227〜236（1992））。

【００４８】幾つかの血清蛋白質が様々な疾患の患者の尿中に認められる。末期腎疾患にお
ける尿のβ2-ミクログロブリンは、血漿β2-MのpI型を５個中２個含む。尿蛋白質１のような低分子量蛋白質は、慢性腎不全患者の尿から単離されており（イト
ウ（Itoh）ら、J. Clin. Lab. Anal., 7：394〜400、1993）、糖尿病およびカド
ミウム腎症では非常に上昇している。腎不全患者は通常、アルブミン、α₁m、β ₂ m、およびレチノール結合蛋白質（RBP）を含む幾つかの血漿由来尿蛋白質を大量に排泄する。そのような尿にはまた、大量のP1が含まれた。腸のアルカリフォ
スファターゼ（IAP）、直部（S3部分）および絨毛のマーカー、ブラッシュ・ボーダー損失を示す近位尿細管に限局した細胞骨格蛋白質、のような蛋白質が尿中
に存在することは、近位尿細管細胞損傷の細胞マーカーとして用いることができ
る。

【００４９】

【表II】

尿における幾つかの蛋白質の濃度尿の総蛋白質含有量＝7.4×10⁴ OD単位/Lまたは74 g/L〜10.8 g/L

【００５０】ヒトおよび様々な種の動物の尿から幾つかの蛋白質の精製が報告されている。
限外濾過装置を用いれば、低分子量の尿蛋白質が濃縮された形でミリグラム量で
迅速に回収される。十分な透析によって、より純粋なα₂-マクログロブリンの調
製物が得られる（マーシャル（Marshall）ら、Biochem. Soc. Trans. 20：1885 （1992））。ウロモジュリンは塩沈殿（タム＆ホースフォール（Tamm and Horsf
all）、J. Exp. Med. 95：71〜、1952）およびレクチン接着性（ヘッション（He
ssion）ら、Science 237：1479〜1484、1987）によって単離された。プロテイン
１は硫酸アンモニウム沈殿、イムノアフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過
およびイオン交換rp-HPLCによって単離された。ウロペプシノーゲンは、ラット尿カリクレイン（ミナミウラ（Minamiura）ら、J. Biochem. 96：1061〜1069、1
984）、ならびに尿の酸抵抗性トリプシン阻害剤ならびにヒトおよび動物の尿からの可溶型の血清CD58（LFA-3）のように、本来の形で排泄される血清蛋白質と同様に高度に精製されている。蛋白質によっては尿中で他の蛋白質より安定なも
のもあり、例えばP1は少なくとも４日間非常に安定であるが、β2-Mは37℃で24 時間を超えると不安定である。ペプチドマッピングによって、アンジオテンシン
、ウロディラチン、プソリアシンおよびグラニュリンが尿から同定された。

【００５１】腎臓への遺伝子移入および発現は幾つかの方法によって行うことができる。胚
腎組織を、生後の期間にマウス腎実質に移植すると、発達して分化することがで
き、これによって新規遺伝子を哺乳類の腎臓にインビボで移入することができる
（ウールフ（Woolf）ら、Exp. Nephrol. 1：41〜48、1993）。インプラントは発
達して、開いた管腔を有する分化した腎尿細管に結合した、血管形成を伴う濾過
糸球体を形成する。エクスビボで複製欠損ウイルスに感染させた組織は、βガラ
クトシダーゼ遺伝子を形質導入すると、糸球体上皮細胞において多く遺伝子が発
現されるが、間質細胞および血管構造にも発現が認められる。陽性の尿細管細胞
は認められなかった。ラットでは、後腎形質導入後に尿細管発現が起こる。これ
は種差またはラット後腎が形質導入された発達段階が早すぎたためであるかも知
れない。非濾過性のネフロンですら、これらの蛋白質が拡散するために腎臓に遺
伝子産物を輸送する可能性がある。対照的に、哺乳類の成人腎臓は細胞の代謝回
転が遅く、分裂指数は細胞10⁵個あたり15個未満であり、レトロウイルスによる感染の標的としては不適である。成体ラット腎臓へのインビボ遺伝子形質導入は
、化学的腎毒性物質によって、または新規遺伝子の細胞ベクターとして胚腎組織
を迅速に分割することによって、尿細管細胞複製を誘導すれば成功する可能性が
ある。

【００５２】トランスジェニック動物は、腎臓または膀胱特異的遺伝子のプロモーターおよ
びその他の調節配列を用いて、またはヒトアポリポ蛋白質（apo）E遺伝子のよう
な他の遺伝子に存在する尿管特異的調節エレメントを用いて作製してもよい。5'
-隣接DNAの30または５ kbおよび3'-隣接DNAの1.5 kbによる構築物を用いて、トランスジェニックマウスを作製すると、ヒトapoE mRNAの高レベルが腎臓において生成された（シモネット（Simonet）ら、J. Biol. Chem. 265：10809〜10812 、1990）。トランスジェニック腎臓におけるヒトapoE源は,近位尿細管およびボーマン嚢に沿った内皮細胞であった。しかし、下流の調節配列23 kbを用いると、腎臓での発現は抑制された。腎臓におけるラットapoE合成はまた、近位曲尿細
管の上皮に限定された。マウスEPO遺伝子の5'隣接配列の6.5 kbは、1.2 kbの3' 隣接配列と共に、lacZ遺伝子の低レベル発現を特に腎近位曲尿細管細胞にターゲ
ティングすることができ、これは低酸素状態の誘導によって増加した。トランス
ジェニックマウスの腎臓におけるhEPOの誘導に必要な調節配列は、ヒトEPO遺伝子の5'の9.5 kb以上に存在する。乳蛋白質遺伝子のような他の遺伝子における配
列、WAPもまた、雌性の処女マウスおよび授乳期の腎臓では低レベルで通常発現されるが（ウェン（Wen）ら、Mol. Reprod. Dev. 41：399〜406、1995）、WAP蛋
白質が存在することは証明されていない。

【００５３】このように、腎臓は遺伝子移入のための生存臓器であり、本発明に従ってトラ
ンスジェニック動物の調製に用いるために適したプロモーターには、上記蛋白質
に関連したプロモーター、特にウロモジュリンおよびウロプラキンプロモーター
が含まれる。本発明において適したその他のプロモーターを単離することは当技
術分野の技術範囲内である。さらに、腎特異的発現を得るためにその他の遺伝子
の調節配列を改変してもよい。好ましいのは、ヒトアポリポ蛋白質E遺伝子または腎臓において高レベルで発現されるマウスレニンのRen-2遺伝子の5'および3' 調節配列に認められる尿管特異的調節エレメントである。プロモーターおよび調
節配列は、研究室において発現の特異性を改善し、および組織における特定の細
胞タイプの発現をターゲティングするために改変することができる。

【００５４】上記のプロモーター配列に加えて、本発明の転写を調節する配列はイントロン
であり、特に、エンハンサー、スプライスシグナル、転写終了シグナル、および
ポリアデニル化シグナルを含む3'調節配列である。特に有用な調節配列はトラン
スジェニック動物において蛋白質の尿管特異的発現効率を増加させる。この点に
おいて特に有用であるのは、ウロモジュリン遺伝子のような、尿管細胞において
高レベルで発現される遺伝子のその他の転写調節配列である。好ましい調節配列
源は齧歯類（マウスおよびラット）、ウサギ、家禽、魚類、ブタ、ヒツジ、ヤギ
、ウシ、ウマ、およびヒトである。

【００５５】上記のシグナル配列のほかに、翻訳を調節する配列は、RNAの安定性を増強するリボソーム結合部位および配列である。特に有用であるのは、尿路細胞におい
て高レベルで発現される遺伝子の翻訳調節配列である。例えば、ウロモジュリン
、ウロプラキン、レニン、エリスロポエチン、ウロポンチン、ネフロカルシン、
アクアポリン遺伝子の尿路特異的調節配列が好ましく、特に齧歯類（マウスおよ
びラット）、ウサギ、家禽、魚類、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、およびヒ
トからの配列が好ましい。特に好ましいのは、ヒトウロモジュリンおよびラット
ウロプラキン遺伝子の調節配列である。

【００５６】本発明のトランスジェニック動物のもう一つの局面において、誘導型のプロモ
ーターが好ましく、特に、食品成分のような環境的な変数によって誘導すること
ができるプロモーターが好ましい。この点において注目に値するのは、メタロチ
オネインプロモーターであり、これは適当な金属誘導物質を試料中に組み入れる
ことによって動物において誘導してもよい。メタロチオネインプロモーターは、
例えば、オステオグリシン、エピセリン、およびウシオンコスタチンMをトランスジェニック動物において発現するために用いられている。マリック（Malik）ら、Molec. Cell. Biol. 15：2349〜2358（1995）は、組織特異的もしくは誘導型発現のために、またはその両者のために用いることができるプロモーターに関
するレビューを提供しており、それらは本明細書にその全文が参照として組み入
れられる。

【００５７】蛋白質の高レベルを発現するトランスジェニック生物を産生するために役立つ
さらなる調節エレメントが存在する可能性があると認識されている。これらのシ
グナルの幾つかは転写調節物質、または細胞の外への輸送に関連したシグナルで
あってもよい。他のシグナルは有効な染色体組み込みまたは組み込まれたDNAの安定性に何らかの役割を果たしてもよい。

【００５８】本発明の一つの局面は有機材料を解毒または分解する蛋白質の発現に関するが
、本発明の方法に従って尿中に他の蛋白質を発現することができると理解される
。cDNA、幾つかのヒト、動物、細菌、真菌、または植物ペプチドおよび蛋白質を
コードする遺伝子を発現してもよい。特に、エクスサーモフィリック（exthermo
philic）または好熱性生物からの酵素を用いてもよい。オペロンのような配列お
よび代謝経路の関連する酵素をコードする遺伝子座を発現してもよい。特に、プ
ロトロンビン、第VII因子、第IX因子、プロテインC、プロテインS、第V因子、第
VIII因子、α1-アンチトリプシン、アンチトロンビンIII、フィブリノーゲン、アルブミン、または免疫グロブリンのような蛋白質のコード配列を発現してもよ
い。もう一つのグループの蛋白質には、成長ホルモン、エリスロポエチン、骨形
態形成蛋白質、トランスフォーミング増殖因子のような、ホルモンおよび増殖因
子またはサイトカインが含まれる。発現させるもう一つのクラスの蛋白質はプロ
テアーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、キナーゼ、γカル
ボキシラーゼのような酵素であり、この場合蛋白質は蛋白質溶解性のプロセシン
グ、グリコシル化、燐酸化、γカルボキシル化のような他の蛋白質の翻訳後修飾
を行う。酵素阻害剤およびイオンチャンネル蛋白質のような蛋白質もまた発現し
てもよい。上記蛋白質の全ての既知および考えられる変異体、変種または改変も
同様に発現してもよい。

【００５９】尿の改変に関係する酵素、尿の成分またはその物理化学的特性および抗微生物
ペプチドおよび静菌活性を有するペプチドも発現してもよい。

【００６０】細菌、真菌、または植物起源からの酵素的に活性なペプチドまたは蛋白質は、
動物の老廃物の組成に影響を及ぼす。排泄物中に存在する食品源からペニシリン
系抗生物質を分解することができる酵素は、抗生物質耐性菌の形成を減少させ、
汚泥を通じてそれらが環境中に広がることを減少させるであろう。尿中に生成さ
れた生物学的に活性なペプチドまたは蛋白質は、土壌および水を汚染する殺虫剤
を解毒するために用いることができる。既知の組換え法を応用すると、当業者は
、本発明において用いることができる他の蛋白質および遺伝子を同定することが
できるであろう。一例としての蛋白質および遺伝子に関しては図７を参照のこと
。さらに、記載の蛋白質の修飾型を発現してもよく、特に宿主動物において蛋白
質に翻訳後修飾を行うことができる遺伝子改変を行ってもよい。１つまたは幾つ
かのペプチド、蛋白質または酵素を生成してもよく、その尿中に幾つかの蛋白質
を生成する多遺伝子動物を作製して、このように尿の組成および老廃物、土壌、
または水の組成を変化させてもよい。トランスジェニック動物によって生成され
た大量の尿または肥料は、老廃物の処理および環境における様々な化学化合物の
分解に影響を及ぼすために用いてもよい。

【００６１】このように、さらにもう一つの態様において、本発明は尿中に天然に存在する
物質を変化させるインビボ法に関する。本方法は、尿中において「第二の」また
は「天然に存在する」物質に影響を及ぼす「第一の」物質をその尿中に生成する
ヒト以外のトランスジェニック動物を作製する段階を含む。「天然に存在する」
とは、同じ種のトランスジェニックおよび非トランスジェニック動物の双方にお
いて、その物質が存在し、したがって、トランスジェニック動物におけるクロー
ニングされた遺伝子によって発現されないことを意味する。このように、天然に
存在する物質を変化させる物質は、ヒト以外のトランスジェニック動物における
クローニングされた遺伝子によって発現される。一つの態様において、第一の物
質は蛋白質、好ましくは酵素であり、第二の物質はそのような酵素の基質である
。例えば、そのような基質はグアニン、クレアチン、クレアチニン、アンモニア
、尿素または尿酸のような窒素老廃物であってもよい。

【００６２】トランスジェニック生物を製造する一般的方法トランスジェニック生物を製造するために、標準的な周知の技法を用いて、本
発明に従って生物に遺伝子を導入してもよい。これらの技術は、例えば、本明細
書にその全文が参照として組み入れられる、「トランスジェニック技術（TRANSG
ENIC TECHNIQUES）」、マーフィー（Murphy）ら編、ヒューマンプレス、トトワ、ニュージャージー州（1993）、「動物の遺伝子操作（GENETIC ENGINEERING OF
ANIMALS）」、プーラー（A. Puhler）編、VCHベルラグスゲセルシャフト、バイ
ンハイム、ニューヨーク州（1993）、および「トランスジェニック動物技術（Tr
ansgenic Animal Technology）」、ピンカート（C. A. Pinkert）編、アカデミックプレスインク、サンジエゴ（1994）を含む多数の刊行物のテーマとなってい
る。

【００６３】例えば、DNAは、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染またはその他の手段によって全能性または多
能性幹細胞に導入することができる。電気的パルスによるブタの卵母細胞および
胚へのDNA輸送（ヤン（Yang）ら、Cell Res. 7：39〜49、1997）。異種DNAを含む細胞は細胞胚に導入することができ、それがその中に組み入れられて、トラン
スジェニック生物を形成する。トランスジェニックおよびキメラ胎児を作製する
ための胚幹細胞および胚細胞株は、マウスおよびブタにおいて用いられている（
ノタリアンニ（Notarianni）ら、Int. J. Dev. Biol. 41：537〜540、1997）。

【００６４】好ましい方法において、発達中の細胞または胚をレトロウイルスベクターに感
染させて、感染した胚からトランスジェニック動物を形成することができる。非
常に好ましい方法において、DNAを胚に、好ましくは単細胞期にマイクロインジェクションすると、胚は成熟したトランスジェニック動物に発達する。胚を宿主
動物に移入する前にインビボまたはインビトロでインキュベートする段階を加え
てもよい。酵母の人工染色体またはTAC技術を用いて、上流に25〜500 kb DNAを含むトランスジェニックのマウス（シェドル（Schedl）ら、Nucl. Acids. Res.
20：3073〜3077、1992）、ウサギ（ブレム（Brem）ら、Mol. Reprod. Dev. 44：
56〜62、1996）およびブタ（ラングフォード（Langford）ら、Transplant. Proc
. 28：862〜863、1996）を作製してもよい。ゲノム座全体または多シストロン性
のオペロンを、他の技術の中でも特に、前核インジェクション、ES細胞へのリポ
フェクション、または酵母のスフェロプラスト（spehroblast）融合を用いてこの方法によって導入してもよい。マウス接合体における重なり合うDNA断片の相同的組換えも同様に、大きい、機能的なトランスジーンを作製するために用いる
ことができる（ピーパー（Pieper）ら、Nucl. Acids. Res. 20：1259〜1264、19
92）。

【００６５】もう一つの非常に好ましい方法において、核を細胞から胚に移入して、トラン
スジェニック動物が胚から発達した。子孫はウシ（セイデル（Seidel, GE）、J.
Dairy Sci. 67：2786〜2796、1984；クリッシャー（Krisher）ら、J. Dairy Sc
i. 78：1282〜1288、1995；シムズ（Sims）ら、米国特許第5,453,366号、1995）
およびブタ（ニーマン（Niemann）ら、J. Reprod. Fertil. 48：75〜94、1993）
における胚移入、ならびにウシ胚における核移入（ロブル（Robl）ら、J. Anim.
Sci. 64：642〜647、1987；マアセイ（Maasey, J. M.）、米国特許第5,057,420
号、1991）、ならびにヒツジにおける胎児および成体細胞（ウィルムート（Wilm
ut）ら、Nature 385：810〜813、1997）に由来することができる。

【００６６】トランスジェニックのヤギ（エバート（Evert）ら、Bio/Technology 9：835 〜838、1991：アモア（Amoah）ら、J. Anim. Sci. 75：578〜585、1997）、ヒツ
ジ（クラーク（Clark）ら、Bio/Technology 7：487〜492、1989）、ウシ（バイエリ（Biery）ら、Theriogenology 29：224、1988；クリンペンフォート（Krimp
enfort）ら、Bio/Technology 9：844〜847、1991；ヒル（Hill）ら、Theriogeno
logy 37：222、1992；ボウェン（Bowen）ら、Theriogenology 39：194、1993；ヒッティネン（Hyttinen）ら、Bio/Technology 12：606〜6608、1994）、ブタ（
ベランダー（Velander）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89：12003〜12007、1992 ；ウィーラー（Wheeler, M. B.）、米国特許第5,523,226号、1996）、ウサギ（ビューラー（Buehler）ら、Bio/Technology 8：140〜143、1990）、ニワトリおよびウズラのような鳥類、サケおよびゼブラダニオのような魚類、アフリカツメ
ガエルのような両生類の下等脊椎動物、C.エレガンスのような無脊椎動物および
D. メラノガスター（D. melanogaster）のような昆虫、特にマウスおよびラット
を、上記技術を用いて作製してもよい（「トランスジェニック動物：作製と利用
（Transgenic Animals：Generation and Use）」、ハウデバイン（L.M. Houdebi
ne）編、ヘイウッドアカデミック・パブリッシャーズ、オランダ、1997）。

【００６７】上記の技術を用いて多細胞生物のゲノムDNAに２つ以上の異なるDNAを導入する
ことによって、二重およびその他の多重トランスジェニック動物を作製すること
ができる。DNAは同じ、または異なるプロモーターおよび他の発現調節配列を含んでもよい。蛋白質をコードするcDNAまたはゲノムDNAは、別々のまたは単一の構築物であってもよい。さらに、多重トランスジェニック生物はまた、交配して
作製することもできる。例えば、単トランスジェニック生物２匹を、適当な周知
の交配技術を用いて交配させ、両方の親のトランスジーンを有する二重トランス
ジェニック子孫を作製することができる。連続交配を用いて、さらなるトランス
ジェニック動物を同様に導入することができる。

【００６８】その中で蛋白質を生成してもよい生物本発明の実践に適したヒト以外の多細胞生物には植物および動物が含まれる。
動物には無脊椎動物、ならびに鳥類、爬虫類、昆虫、魚類および哺乳類のような
脊椎動物が含まれる。尿中に物質を生成するために特に好ましいのは、ヒト以外
の哺乳類である。好ましい哺乳類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモッ
ト、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびウマが含まれる。家
禽動物の中では、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびブタが好ましく、研究動物の中では
上記のほかにイヌ、ネコ、ハムスター、ウサギ、ラットおよびマウスが好ましい
。鳥類の中では、ニワトリ、アヒル、および七面鳥が好ましい。

【００６９】発現のための細胞、組織、体液およびその他の部分一般に、生物の如何なる細胞または組織も、本発明に従って用いてもよい。こ
の点において好ましいのは、物質を体液中に分泌する細胞および組織である。こ
れらの細胞はトランスジェニック動物を作製する際の核移入のための核源として
用いてもよい。標準的な哺乳類組織培養法を用いて、単離細胞を培養中で増殖さ
せてもよい。この点において、ペプチドおよび蛋白質を尿中に分泌する細胞およ
び組織が非常に好ましい。中でも、蛋白質を尿中に分泌する近位尿細管および膀
胱の上皮細胞は特に好ましい。

【００７０】実例となる産物本発明は、細胞代謝および異化の蛋白質様産物と共に非蛋白質様産物の生成に
影響を及ぼすために、細胞において酵素活性を有するペプチドまたは蛋白質を生
成するために用いることができると認識される。異種蛋白質が腎臓または尿管の
その他の部位で標的化発現された結果、尿の組成が変化するが、これは異物蛋白
質が加えられたためであると同時に、尿の成分およびその作用に改変が加えられ
たためである。

【００７１】しかし、この詳細な説明を読むことによって、様々な変更および改変を行って
もそれらは本発明の範囲内であることは当業者に明らかとなるため、上記の詳し
い説明および以下の特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、
説明するために限って提供されると理解しなければならない。

【００７２】実施例以下の実施例は、トランスジェニック動物の尿中での複雑なヒト蛋白質、HPC の生成について説明する。

【００７３】実施例１（A）WAP/HPCトランスジーンの構築ならびにマウスおよびブタの作製マウス乳清酸性蛋白質プロモーターおよびヒトプロテインC（HPC）遺伝子を含
むトランスジーンを含むトランスジェニックマウスおよびブタを作製した。マウ
ス乳清酸性蛋白質遺伝子の中に導入されたHPC cDNAを含むトランスジーンを含む
トランスジェニックブタを作製した（ベランダー（Velander）ら、Proc. Natl.
Acad. Sci. 89：12003〜12007、1992）。プロモーターは周知であり、例えば、本明細書に参照としてその全文が組み入れられる、パレヤンダ（Paleyanda）ら、Transgenic Res. 3：355〜343（1994）に記述のように、トランスジェニック哺乳類の乳汁中にrHPCを直接発現および分泌させるために用いられている。DNA 構築物は、4.1 kbのマウス乳清酸性蛋白質（WAP）プロモーターおよび0.4 kbの3
'非翻訳配列を有する9 kbのHPC遺伝子を含んだ（図3A）。これは、本明細書にそ
のそれぞれの全文が参照として組み入れられる、ドロハン（Drohan）ら、Transg
enic Res. 3：355〜364（1994）およびホーガン（Hogan）ら、「MANIPULATING T
HE MOUSE EMBRYO（マウス胚の操作）」、コールドスプリングハーバー出版（198
6）に記述のように、周知の技法を用いて容易に利用可能なDNAから構築した。

【００７４】 HPCは62 kDaチモーゲンとして血漿中を循環し、活性化HPCは強力な抗凝固活性
を有する（図3B）。アミノ酸19個のシグナルペプチドは新生ポリペプチドの肝細
胞小胞体（ER）への転位を指示して、シグナルペプチダーゼによって切断される
。24残基のプロペプチドは、ビタミンK依存的（VKD）γグルタミルカルボキシラ
ーゼ、内在性ER膜蛋白質の結合を媒介する。カルボキシラーゼは、還元されたビ
タミンK、CO₂およびO₂を利用して、グリコシルコアを付加した後に、Glu残基９個をγカルボキシグルタミン酸（Gla）に変換する。Glaドメインはチモーゲンの
Ca⁺²媒介活性化、燐脂質、トロンビン-トロンボモジュリン、血小板因子４との結合、およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤の不活化にとって必須である。
ゴルジ体を通過する際に、複雑な炭化水素が４つのN-結合部位に付加され、プロ
ペプチドが除去されて、内部KRジペプチドが切断されて、ジスルフィド結合によ
って結合された軽鎖および重鎖を生じる。HPCは、これもまたCa⁺²に結合する、上皮細胞増殖因子様（EGF）ドメインにおけるAsn残基において、アスパルチルβ
ヒドロキシラーゼの作用によってβヒドロキシル化を受ける。分泌された後、活
性化ペプチドはトロンビンによって蛋白質分解的に切断され、活性化HPCを生成する。重鎖は、セリンプロテアーゼドメインを含み、単核球貪食反応、α₂-マク
ログロブリン結合、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤の不活化、および単球に
よるサイトカイン産生阻害のような多数の役割に関係することが示されている。

【００７５】（B）腎臓におけるトランスジーン発現の検出および尿中のrHPCの検出 F1またはF2世代のトランスジェニック雌性動物の組織から、および対照マウス
から、標準的な技術を用いて総RNAを調製した。酸グアニジニウムチオシアネートフェノールクロロホルム抽出を用いて（例えばRNAzolとして、モレキュラーリ
サーチセンターインクから販売されており、本明細書にその全文が参照として組
み入れられる、チョムクジンスキ（Chomczynski）ら、Anal. Biochem. 162：156
〜159（1987）に記述のように）、RNAを新鮮なまたは凍結した組織から一段階技
法を用いて単離した。

【００７６】トランスジェニック動物は、HPCトランスジーンを乳腺に発現して組換え型ヒトPC（rHPC）を乳汁中に分泌した。トランスジェニックマウスの腎臓の総RNAのノザンブロットによって検出されるように、トランスジーンは腎臓にも程度は低
いものの発現された（図４）。HPCに関してトランスジェニックであるマウスの組織からの総RNA（１、３、５、７）およびmRNA（２、４、６、８）のノザンブロット分析を実施した。ヒト肝臓（レーン１〜２）、WAP/HPCトランスジェニックマウス4.2.10.9（ドロハン（Drohan）ら、Transgenic Res. 3：355〜364（199
4））の乳腺（レーン３〜４）および腎臓（レーン５〜６）、ならびにヒト肝臓H
epG2細胞（レーン７〜８）からの転写物を分析した。シグナル強度が類似となる
ように、異なる量のRNAをレーン１〜８にローディングした；それぞれ、3.7、0.
11、0.004、0.0001、3.7、0.096、2.1および0.021μg。ブロットを（ドリューズ
（Drews）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 92：10462〜10466、1994）に記述のよう
に、HPC cDNAプローブと共にハイブリダイズさせた。矢印は成熟rHPC転写物を示
し、RNA標準物質を左側にキロベースで示す。

【００７７】このように、尿において検出される如何なるrHPC蛋白質もその合成は腎臓に由
来し、循環中の血漿に由来するのではない。この知見の結果として、これらのト
ランスジェニック動物の尿をrHPCの有無に関してELISAによってアッセイした。尿をトランスジェニックマウスから採取して透析した。サンドイッチELISAをWAP
/HPCトランスジェニックマウスの尿について実施したところ、rHPCが64〜76 ng/
ml検出された。このことは、rHPC発現レベルが高すぎてELISA、ウェスタンブロッティング、およびイムノアフィニティクロマトグラフィーによる単離による検
出ができなかったブタにおいて確認した。96ウェルマイクロタイタープレートに
ウサギ抗HPCポリクローナル抗体をコーティングすることによってELISAを実施し
た。HPCの1.3〜42.5 ng/mlの濃度を用いて標準曲線を構築した。透析した尿試料
は、検出レベルを上昇させるために10、20、40および80倍希釈した。ブタ110-3 からの尿はより多くのrHPCを含んだため、さらに希釈した。血漿由来HPC標準物質の希釈液はまた、摂氏37度で20分インキュベートした。プレートを洗浄するこ
とによって過剰量の未結合の抗原を除去して、それらをヤギの抗HPC抗体の1000 倍希釈液と共にインキュベートし、その後HRP標識抗ヤギIgGの1000倍希釈液と共
にインキュベートした。OPD基質を３分間加え、3 N硫酸によって反応を停止させ
、プレートを490 nmで読みとった。rHPCはマウスおよびブタの双方の尿に検出さ
れたことから、腎臓におけるトランスジーン発現は蛋白質合成に関連した（表II
I）。このように、家禽動物の尿は、大量のペプチドおよび蛋白質を生成するための体液として用いることができる。

【００７８】

【表III】

【００７９】（C）rHPCの活性の検出尿中に分泌されたrHPCに活性があるか否かを調べるために、rHPCをトランスジ
ェニック雌ブタの尿から濃縮して、活性アッセイを行った。トランスジェニック
ブタの尿を20 mMクエン酸ナトリウム、80 mM塩化ナトリウム、pH 6.5に対して透
析し、その後この緩衝液で50％に希釈した。HPCの重鎖に対する抗体、8861 MAb をアザラクトンとカップリングさせて用いて、トランスジェニック雌ブタ110-3 の尿からrHPCを濃縮した。rHPC約5.2±0.8 μg/mlを含む希釈した尿500 mlを１
cm/分でローディングした。カラムを20 mMクエン酸ナトリウム、80 mM塩化ナトリウム、pH 6.5で洗浄した。分画を100 mM炭酸ナトリウム、pH 10および２ Mチオシアン酸ナトリウムで溶出した。ローディングしたrHPCの約32％が２ Mチオシ
アン酸ナトリウム分画に回収された。

【００８０】濃縮した分画は、ドロハン（Drohan）ら、Transgenic Res. 3：355〜364（199
4）に記述のように、色素産生アッセイにおける活性を分析した。同じモノクローナル抗体を用いてイムノアフィニティ精製によってヒト血漿から単離されたHP
C標準物質をアッセイの参考物質として用いた。HPCの活性はアッセイにおいて10
0％であると見なした。結果を下記に示す。

【００８１】

【表IV】

このように、尿管細胞は内因性蛋白質のみならず、活性を保持する複雑な異物蛋
白質を生成することができる。

【００８２】（D）プロセシングしたHPCのウェスタンブロット尿のrHPCのサイズおよびプロセシングを分析した。HPCの重鎖に対する8861 MA
bを用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを用いて、６か月齢の雌ブタ1
10-3の尿からrHPCを濃縮した。カラムから２ Mチオシアン酸ナトリウムを用いて
溶出した蛋白質を分析した。対照およびトランスジェニックブタからの尿蛋白質
を還元条件下で10％SDS-PAGEによって解像し、ウェスタンブロッティングを行っ
た（図５）。ブロットをウサギ抗HPCポリクローナル抗体によってプロービングし、HRPに結合させたヤギ抗ウサギ抗体によって検出し、4-クロロナフトール基質によって現像した。尿中にrHPCが存在すると、その組成が変化するが、rHPCそ
のものは血漿HPCの場合と同様に、重鎖および軽鎖に翻訳後プロセシングされた。尿からのrHPCの分子量は類似であるように思われ、グリコシル化が腎細胞にお
いても起こっていることを示している。

【００８３】 HPCのような複雑なヒト蛋白質の遺伝子はマウスおよびブタの尿管において発現され、66 kDa蛋白質が尿中に生成されることは上記から明らかである。RHPCは
十分にプロセシングされて、44 kDaの重鎖および22 kDaの軽鎖の成熟型を形成し
た。濃縮した蛋白質は機能的活性を保持した。このように、動物の尿管細胞は活
性を保持している複雑な異物蛋白質を生成することができる。

【００８４】実施例２ヒトウロモジュリン（THP）プロモーターの単離 P1バクテリオファージにおいて構築したヒトゲノムライブラリ（スターンバー
グ（Sternberg, N. L.）、Trends Genet. 8：11〜16、1992）を、ウロモジュリンcDNAの5'領域に存在する配列を用いてポリメラーゼ連鎖反応によって（ペニカ
（Pennica）ら、Science 236：83〜87、1987）スクリーニングした。cre+大腸菌
に存在するP1プラスミドは75〜100 kbのゲノムDNAインサートを含むことができる。スクリーニングに用いたオリゴヌクレオチドオリゴの配列は、下記の通りで
ある： # 4683（3'プライマー） CCC AGG CTC AGC GCA CTC ATC C # 4684（5'プライマー） GTC ACA GCA ATG CCA CCT GAC オリゴを合成して、PCRの前に沈殿させ、トリス-EDTA緩衝液に再浮遊させた。pB
luescriptプラスミドに5'隣接配列をサブクローニングするために３つのP1クローンを単離した。

【００８５】同様に、他の尿管特異的遺伝子のプロモーターは、特にヒトおよび動物のゲノ
ムシークエンシング配列プロジェクトの結果として単離してもよい。

【００８６】実施例３尿管における発現のための遺伝子構築物トランスジェニック動物の尿管における複雑なペプチドおよび蛋白質の発現の
ための一般的な構築物には、以下を含む：（A）尿管特異的プロモーターおよびエンハンサー配列を含む5'発現調節配列；（B）酵素活性を有する複雑なペプチドおよび蛋白質をコードするcDNAまたはゲノムDNA配列、およびトランスジェニック動物の尿中への該ペプチドまたは蛋白質の分泌を指示するために有効なシグナル配列；および（C）その結果尿管細胞において該DNA配列が発現される、ポリアデニル化配列を含む3'調節配列；ここで、A、BおよびCは、尿管細胞において該ペプチドまたは蛋白質の生成および動物の尿中への分泌を得るために該遺伝子構築物において機能的に結合してい
る。

【００８７】以下の遺伝子からの（A）および（C）の非制限的な例：ウロモジュリンウロプラキンレニンエリスロポエチンアポリポ蛋白質E アクアポリンネフロカルシンオステオポンチン-k／ウロポンチン尿カリクレイン尿トロンボモジュリン蛋白質のcDNAおよび遺伝子からの（B）の非制限的な例を図７に示す。

【００８８】上記で述べた雑誌、刊行物、特許および出願に対する全ての引用は、その関連
する一部または全文が参照として本明細書に組み入れられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】腎臓の縦方向切片の図を示す。

【図２】腎臓のネフロンの構造を示す。

【図3A】 WAP/HPC構築物を示す。

【図3B】ヒトプロテインCの構造および機能を表す。詳しく述べるとアミノ酸461個の前駆体をその切断部位と共に示す。矢印は蛋白質切断部位を示し、数値はアミノ酸残基を指す。Gla：γ-カルボキシグルタミン酸、EGF：上皮細胞増殖因子様ドメイン、OH：βヒドロキシアスパルテート、CHO-オリゴ多糖類、AP
：活性化ペプチド、Ser、His、Asp：触媒３構造の残基、PL：ホスホリピッド、T
/TM：トロンビン／トロンボモジュリン、PF4：血小板因子4、α₂-MAC：α₂-マク
ログロブリン、PAI：プラスミノーゲン活性化因子阻害剤。

【図４】 HPCに対してトランスジェニックであるマウスの組織からの総RNA
（１、３、５、７）およびmRNA（２、４、６、８）のノザンブロット分析を示す
。ヒト肝臓（レーン１〜２）、WAP/HPCトランスジェニックマウス4.2.10.9（ドロハン（Drohan）ら、Transgenic Res. 3：355〜364（1994））の乳腺（レーン３〜４）および腎臓（レーン５〜６）、ならびにヒト肝臓HepG2細胞（レーン７〜８）からの転写物を分析した。類似の強度のシグナルを得るために、異なる量
のRNAをレーン１〜８までローディングした；それぞれ3.7、0.11、0.004、0.000
1、3.7、0.096、2.1および0.021 μg。ブロットを、（ドロハン（Drohan）ら、1
994、上記）のようにHPC cDNAプローブとハイブリダイズさせた。矢印は成熟rHP
C転写物を示し、RNA標準物質をキロベースで左側に示す。

【図５】トランスジェニックブタの尿から、10％SDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動後の濃縮した蛋白質分画においてrHPCを検出するために実施したウ
ェスタンブロット分析を示す。（CON）：対照ブタからの透析した尿における尿中蛋白質、（TRG）：WAP/HPCトランスジェニックブタの尿からのクロマトグラフ
ィー後に溶出した尿中rHPC 、（HPC）：血漿由来HPC標準物質。HC：HPCの重鎖およびLC：軽鎖、kDa：キロダルトンでの分子量

【図６】尿管における発現のための一般的な遺伝子構築物を示す。

【図７】有機材料の分解または解毒化に用いるために適した酵素を記載す
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ドロハンウィリアムアメリカ合衆国ヴァージニア州スプリングフィールドオークフォードドライブ 8417 (72)発明者ヴェランダーウィリアムアメリカ合衆国ヴァージニア州ブラックスバーグランカスタードライブ 3014 Ｆターム(参考） 4B024 BA07 CA04 DA02 HA01 4D004 AA02 AA04 AA41 AB03 AB05 AB06 CA17 CA20 CC07 CC15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の段階を含む、有機材料を分解または解毒する蛋白質を
尿中に生成させる方法：（a）尿中に検出可能で、且つ有機材料を分解または解毒する蛋白質をコードする外因性の遺伝子をそのゲノムに安定的に組み入れられたヒト以外のトランスジ
ェニック動物を提供する段階。
【請求項２】トランスジェニック動物が哺乳類である、請求項１記載の方
法。
【請求項３】トランスジェニック動物がブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、齧歯
類、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類、および爬虫類からなる群より選択される
、請求項１記載の方法。
【請求項４】蛋白質が酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項５】酵素が図７における酵素のリストからなる群より選択される
、請求項４記載の方法。
【請求項６】有機材料が糞、尿、微生物、化学汚染物質またはその副産物
、および食品またはその副産物である、請求項１記載の方法。
【請求項７】化学汚染物質が、除草剤、殺虫剤および肥料からなる群より
選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】有機材料を分解または解毒する蛋白質をその尿中に生成する
ヒト以外のトランスジェニック動物であって、有機材料を分解または解毒し、且
つ尿中に検出される蛋白質をコードする外因性遺伝子をそのゲノムに安定的に組
み入れられたトランスジェニック動物。
【請求項９】哺乳類である、請求項８記載のトランスジェニック動物。
【請求項10】ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、齧歯類、ウサギ、ウマ、イヌ、
ネコ、鳥類、および爬虫類からなる群より選択される、請求項８記載のトランス
ジェニック動物。
【請求項11】有機材料が糞、尿、微生物、化学汚染物質またはその副産物
、および食品またはその副産物である、請求項８記載のトランスジェニック動物
。
【請求項12】有機材料がトランスジェニック動物、または異なる動物によ
って生成される、請求項８記載のトランスジェニック動物。
【請求項13】化学汚染物質が、除草剤、殺虫剤および肥料からなる群より
選択される、請求項11記載のトランスジェニック動物。
【請求項14】蛋白質が酵素である、請求項８記載のトランスジェニック動
物。
【請求項15】酵素が図７に記載の酵素の群より選択される、請求項14記載
のトランスジェニック動物。
【請求項16】下記の段階を含む、有機材料を分解または解毒する方法：（a）尿中に検出可能で、且つ有機材料を分解または解毒する蛋白質をコードする外因性の遺伝子をそのゲノムに安定的に組み入れられたヒト以外のトランスジ
ェニック動物を提供する段階；ならびに（b）該有機材料を該尿と接触させ、それによって該有機材料を分解または解毒する段階。
【請求項17】接触させる段階が有機材料と尿を混合する段階を含む、請求
項16記載の方法。
【請求項18】接触させる段階が、ヒト以外のトランスジェニック動物を有
機老廃物の上に排尿させる段階を含む、請求項16記載の方法。
【請求項19】トランスジェニック動物が哺乳類である、請求項16記載の方
法。
【請求項20】トランスジェニック動物がブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、齧歯
類、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類、および爬虫類からなる群より選択される
、請求項16記載の方法。
【請求項21】有機材料が糞、尿、微生物、化学汚染物質またはその副産物
、および食品またはその副産物からなる群より選択される、請求項16記載の方法
。
【請求項22】化学汚染物質が除草剤、殺虫剤および肥料からなる群より選
択される、請求項21記載の方法。
【請求項23】蛋白質が酵素である、請求項16記載の方法。
【請求項24】酵素が図７に記載の酵素からなる群より選択される、請求項
23記載の方法。
【請求項25】以下を含む、動物を収容するための施設：（a）尿中に検出可能であって、且つ有機材料を分解または解毒する蛋白質をコードする外因性遺伝子をそのゲノムに安定的に組み入れられた、少なくとも1匹のヒト以外のトランスジェニック動物；および（b）該動物をその施設内に収容する構造。
【請求項26】さらに以下を含む、請求項25記載の施設：（c）トランスジェニック動物の種と同じまたは異なる種の、少なくとも1匹の非
トランスジェニック動物。
【請求項27】トランスジェニック動物が哺乳類である、請求項25記載の施
設。
【請求項28】トランスジェニック動物がブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、齧歯
類、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類、および爬虫類からなる群より選択される
、請求項25記載の施設。
【請求項29】トランスジェニック動物が哺乳類であって、非トランスジェ
ニック動物もまた哺乳類である、請求項25記載の施設。
【請求項30】非トランスジェニック動物が鳥類または爬虫類である、請求
項27記載の施設。
【請求項31】農場、放牧場、屠殺場、研究施設および動物園からなる群よ
り選択される、請求項25記載の施設。
【請求項32】有機材料が糞、尿、微生物、化学汚染物質およびその副産物
、ならびに食品およびその副産物からなる群より選択される、請求項25記載の方
法。
【請求項33】化学汚染物質が除草剤、殺虫剤および肥料からなる群より選
択される、請求項32記載の方法。
【請求項34】下記の段階を含む、尿中の物質を変化させるインビボ法：（a）トランスジェニック動物の尿中において第二の物質を変化させる第一の物質をコードする外因性遺伝子をそのゲノムに安定的に組み入れられた、ヒト以外
のトランスジェニック動物を製造する段階。
【請求項35】動物が哺乳類である、請求項34記載の方法。
【請求項36】トランスジェニック動物がブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、齧歯
類、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類、および爬虫類からなる群より選択される
、請求項34記載の方法。
【請求項37】哺乳類がブタである、請求項36記載の方法。
【請求項38】第一の物質が第二の物質を分解する、請求項34記載の方法。
【請求項39】第一の物質が蛋白質である、請求項38記載の方法。
【請求項40】蛋白質が酵素である、請求項39記載の方法。
【請求項41】酵素が図７に記載の酵素からなる群より選択される、請求項
40記載の方法。
【請求項42】有機材料を分解または解毒する蛋白質をヒト以外のトランス
ジェニック動物の尿中に生成させるためのDNA構築物であって、（a）尿管特異的プロモーターおよびエンハンサー配列を含む5'発現調節配列と（b）該蛋白質をコードするcDNAまたはゲノムDNA配列、および該蛋白質をトラン
スジェニック動物の尿中に分泌させるために有効なシグナル配列と（c）その結果尿管細胞において該DNA配列の発現が起こる、ポリアデニル化配列
を含む3'調節配列とを含み、該動物の尿中に該蛋白質が生成されるように、該DNA構築物においてa、b、およびcが機能的に結合されている構築物。
【請求項43】（a）および／または（c）が、ウロモジュリン、ウロプラキ
ン、レニン、エリスロポエチン、アポリポ蛋白質E、アクアポリン、ネフロカルシン、オステオポンチン-k、ウロポンチン、および尿カリクレインからなる群よ
り選択される蛋白質をコードする遺伝子由来の配列である、請求項42記載のDNA 構築物。
【請求項44】（b）の蛋白質が図７に記載の酵素からなる群より選択される、請求項42記載のDNA。