KR100453571B1 - 소변으로 조혈촉진제를 생산하는 형질전환 돼지 및 그제조방법 - Google Patents
소변으로 조혈촉진제를 생산하는 형질전환 돼지 및 그제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고분자 연쇄 중합반응(Polymerase chain reaction: PCR)에 의해 쥐의 방광으로부터 생쥐 U Ⅱ프로모터 3.603kb 를 증폭하고 클로닝하여 인간 게놈 DNA로부터 분리한 인간 EPO 게놈 DNA 단편 2.1kb와 SV 40 Poly A 유전자 2.6kb로 구성된 발현벡터를 구축한 후 이를 돼지의 수정란에 주입하고 즉시 대리모 돼지에 이식하여 대리모로부터 태어난 돼지의 꼬리조직으로부터 인간 EPO DNA를 코드하는 DNA가 전이된 것을 확인하는 단계를 포함하여 구성되는, 소변으로부터 조혈촉진제를 생성하는 형질전환 돼지의 제조방법 및 그와 같이 형질 전환된 돼지에 관한 것으로, 이러한 형질전환 된 돼지의 소변으로부터 저렴하면서도 안정적으로 수득된 다량의 인간 조혈촉진제는 고가의 의약품에 유용하게 이용될 수 있는 잇점을 갖는다.
Description
본 발명은 의약에 효과적으로 사용될 수 있는 인간의 조혈촉진제(ERYTHROPOIETIN :EPO)를 생산할 수 있는 형질전환 돼지에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유전자 재조합 기술을 이용하여 인간의 조혈촉진제를 소변으로 안정적이면서 대량 생산할 수 있는 형질 전환 돼지 및 그러한 형질 전환 돼지를 생산하는 방법에 관한 것이다.
인간 조혈촉진제는 적혈구계의 세포에 특이적인 조혈 호르몬으로서, 골수 중의 적아구(erythroblast)계 전구세포의 분화와 증식을 조절하여 적혈구의 생성을 자극하는 순환 당 단백호르몬의 일종으로서 166개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량은 약 30Kd 이고, 24,38 및 83번 아미노산에 N-결합된 3개의 당쇄 첨가부위를 가지고 있으며, 126번 아미노산에 하나의 O-결합된 당쇄첨가결합 부위를 가지고 있으며(P.S.E.B.M.216,358-369(1997)),전체 당쇄는 이 당단백 호르몬 분자량의 40%에 해당한다.
인간 조혈촉진제는 1906년 적혈구 조혈(erythropoiesis)을 조절할 수 있는 체액성 인자의 존재 가능성이 보고되면서 처음으로 알려지기 시작하였고, 1957년에 에리스로포이에틴으로 명명된 적혈구 생성을 촉진하는 호르몬이 신장에서 생성된다는 것이 밝혀졌다(Jacobson 등 Nature,179,633.1957).
인간 조혈촉진제는 1977년 미야케 등이 재생불량성 빈혈환자의 소변으로부터 대량 분리 정제하는데 최초로 성공한 이후(Miyake 등, J. Biol. Chem., 252(15),5558,1977), 분자생물학과 당생물학에서 연이은 연구가 본격화되기 시작하여 야나가와 등에 의해 N-말단 30개의 아미노산 서열이 처음으로 보고되었고(Yanagawa 등 J. Biol. Chem., 295(5),2707,1984),2년 후에는 래이 등이 인간 소변 유래 조혈촉진제로부터 전제 아미노산 서열을 결정하여 보고하였다(Lai 등, J. Biol. Chem., 261,3116,1986).
적혈구 생성을 조절하는 호르몬인 천연형 조혈 촉진제는 태아의 간에서 분비되기 시작하여 임신 120 내지 140일 사이에 신장으로 이동하기 시작하여 분만 후40일에는 완전히 이동이 완료된다. 혈액내 인간 조혈 촉진제는 저산소 혈중 상태에서 증가하여 그 결과로 성숙한 산소전달 적혈구 세포의 생산을 조절하는데, 인간은 정상적인 조직의 기능을 위해 적정한 수준의 적혈구 수를 유지하고 있으므로 적혈구 수가 감소하면 조직의 기능 장애가 일어나 빈혈을 일으키게 된다.
인간 조혈 촉진제는 신부전증의 치료 동안 또는 이로부터 기인한 호르몬의 결핍 또는 생산 감소가 원인인 만성빈혈의 치료에 놀라운 잠재능을 나타냈다(Winearles 등 Lancet, 22,1175,1986). 특히 말기 신부전증 환자들은 생존을 위해 신장이식이나 정기적인 신장투석이 요구되는데, 만성 신부전증 환자가 신장성 빈혈을 일으키는 가장 주된 원인은 조혈촉진제 생성의 결핍임이 이미 입증되었다(Eschbach 등, N. Engl. J. Med., 321,158,1989). 따라서 인간 조혈 촉진제는 빈혈, 신장성 빈혈 등의 임상적 치료에 유용하게 이용되고 있으며, 이러한 치료제인 인간 조혈촉진제를 대량으로 제조하기 위해서 유전자 재조합 기술이 매우 유용한데, 지금까지는 동물세포에서 생산한 재조합 조혈촉진제를 사용하고 있으나, 분비량이 너무 적을 뿐만 아니라 생리활성도 천연형과는 동일하지 않은 문제점이 있었다.
도 1은 본 발명에 의한 형질전환 돼지의 제조방법을 도시한 개략도이고,
도 2는 본 발명에 의한 형질전환 발현 벡터이고,
도 3은 돼지의 게놈 DNA로 주입되는 인간 조혈촉진제 cDNA의 염기서열이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 거듭 실험을 계속한 결과 생쥐의 방광으로부터 DNA 단편을 증폭하고 클로닝 한 U Ⅱ프로모터를 인간의 조혈촉진제(hEPO)에 결합시킨 형질전환 벡터를 구축하였고, 이러한 재조합 발현 벡터를돼지의 웅성전핵에 주입한 후 즉시 돼지의 대리모에 이식함으로써 소변으로 안정적으로 다량의 인간 조혈촉진제를 생산할 수 있는 형질전환 돼지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 소변으로 다량의 안정적인 인간 조혈촉진제를 생성할 수 있는 형질전환 돼지의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 소변으로 안정적으로 인간 조혈촉진제를 생성할 수 있는 형질전환 돼지의 제조방법은,
고분자 연쇄 중합반응(Polymerase chain reaction: PCR)에 의해 쥐의 방광으로부터 DNA를 채취한 생쥐 U Ⅱ프로모터를 증폭하고 클로닝하는 단계와; 인간 게놈 DNA로부터 분리한 인간 에리트로포이에틴(EPO) 게놈 DNA 단편과 SV 40 Poly A 유전자를 포함하여 구성되는 발현벡터를 구축하는 단계와; 과배란 유도제 호르몬인 임마 혈청성 성선자극호르몬(eCG) 및 임산부 유래 성선자극호르몬(hCG)을 돼지의 근육내 주사하여 과배란을 유기시키는 단계와; 발정을 확인하고 자연종부를 시키는 단계와; 돼지로부터 one cell 수정란을 회수하는 단계와; 회수된 수정란에 발현벡터를 주입한 후 즉시 대리모 돼지에 이식하는 단계와; 대리모로부터 돼지를 태어나게 하는 단계와; 태어난 돼지의 꼬리조직으로부터 인간 에리트로포이에틴(EPO) DNA를 코드하는 DNA가 전이된 것을 확인하는 단계를 포함하여 구성된다.
이하, 본 발명을 도면을 참조하여 상세히 설명하면 아래와 같다.
EPO 발현 벡터의 구축
도 2에 도시한 본 발명의 인간 에리트로포이에틴(이하 EPO이라 칭함) 발현 벡터는 아래와 같이 제조될 수 있다.
먼저, 생쥐의 방광으로부터 3.6kb의 U(Uroplakin) Ⅱ 프로모터를 고분자 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭 및 클로닝 한 후 인간 게놈 DNA로부터 분리한 인간 EPO 게놈 DNA(hEPO)와 SV40 poly A 유전자를 준비하여 인간 조혈촉진제 DNA를 제공할 수 있는, 도 2에 도시한 발현벡터(transfer vector)를 구축하였고, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
| DNA | 생쥐 U Ⅱ 프로모터 | hEPO 게놈 | SV40 poly A |
| 크기 | 3.603kb | 2.1kb | 2.6kb |
생쥐 U Ⅱ 프로모터의 구축을 위해 생쥐의 방광조직으로부터 DNA를 분리하여 이를 템플레이트 DNA로 사용하여 종래 알려져 있는 UⅡDNA 염기배열(Nature Biotechnology; 16;75-79,1998)을 기초로 하여 합성된 표 2와 같은 프라이머를 유전자 증폭장치를 이용하여 증폭시킨 후 염기배열 확인결과 종래에 알려진 UⅡ프로모터와 동일하였다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| UⅡ-F | 5'-gAA TTC CTC gAg gAT CTC CCT CTT TCT gCA-3' |
| UⅡ-R | 5'-ggT ACC ACT gCg CTg ggA CTg gAT CCT ggA ACA-3' |
인간의 EPO 게놈(hEPO)는 인간의 태반게놈으로부터 유전자 증폭장치를 이용하여 하기 표 3과 같은 프라이머를 증폭하였다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| gEPO-F | 5'-CTC TCg CCA Tgg ggg Tgc ACg gTg Ag-3' |
| gEPO-R | 5'-gAg TCg ACT CAT CTg TCC CCT gTC CTg CA-3' |
SV40 poly A 는 본 출원인에 의해 2000.2.14.자로 출원된 특허출원 제2000-6888호에서 사용한 것과 동일하여 상세한 설명은 생략한다.
생쥐방광유래의 UII 프로모터는 양쪽에 EcoRI과 KpnI 사이트를 가지고 있으며, SV 40 Poly A는 SalI과 EcoRV사이트를 가지고 있다. 따라서 KpnI과 SalI사이에 EPO유전자를 붙여 발현 벡터(pCR2.1 hEPO)를 구축하였다.여기서, 상기 발현 벡터 pCR2.1 hEPO의 제조 방법을 다시 한번 구체적으로 밝히면 다음과 같다.시판되고 있는 유전자 크로닝 발현벡터 pCR2.1-TOPO(3.9kb, Invitogen사)를 이용, 1) 생쥐 UPⅡ 프로모터(promoter) 3.6kb 단편(EcoRI-KpnI 제한효소부위)을 크로닝하여, 2) KpnI 제한효소부위를 제거하기 위해 HindⅢ 와 SacI으로 처리하여 말단을 평활화시킨후, NotI 연결체(linker)를 첨가하여 NotI 제한효소로 처리하고 자가합성연결(self ligation)방법으로 크로닝한다. 3) 이렇게 연결된 벡터에 KpnI 과 EcoRV제한효소부위를 가지는 hEPO 게놈DNA와 SV40poly(A)를 KpnI 과 EcoRV 제한효소 부위에 연결하여 전체 발현벡터 크로닝을 완성한다.
이를 pCR 2.1에 크로닝하여, 대장균(Ecoli: TOPO 10F: invitrogen사)을 이용하여 형질전환 시켜, 이 벡터가 들어있는 콜로니로부터 대량의 플라스미드를 추출한 후, EcoRI과 EcoRV 제한효소로 절단한 UII + EPO+ SV40 유전자를 돼지 one cell 수정란의 미세주입에 사용하였다.
돼지 수정란의 준비
과배란 유도제 호르몬인 임마 혈청성 성선자극호르몬(eCG) 및 임산부 유래 성선자극호르몬(hCG)을 근육내 주사하여 과배란을 유도시키고 발정 확인한 후 자연종부를 시킨다. 이후 one cell 수정란을 회수하여 표 1로 나타낸 DNA를 메니퓰레이터를 이용하여 웅성전핵에 주입한 후 즉시 대리모에 이식시킨다.
분만돼지의 PCR 검정
태어난 돼지 새끼 중 2두(이를, 새새롬 Ⅰ 및 Ⅱ라 한다)의 꼬리조직으로부터 PCR 결과 인간의 EPO DNA를 코드하는 DNA가 전이된 것을 확인하였고 이를 하기 표 4에 나타내었으며, EPO 유전자의 염기서열은 아래와 같다.
| 프라이머 | 5'-말단 염기서열 | 크기 |
| hEPO-304 | F 5'-CGA GAA TAT CAC GGT AGA ACC -3'R 5'-CTC ATT CAA GCT GCA GTG TTC -3' | 304bp |
| hEPO-567 | F 5'-AAG TGG TGC ATG GTG GTA GTC -3'R 5'-TTA CAG AAA GGG CAA GCA GAA -3' | 567bp |
염기서열목록
[서열목록 Ⅰ.EPO cDNA 유전자 염기배열]
서열번호 : 1
서열의 길이 :582
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 :cDNA
기원
생물명 : 인간의 간 DNA로부터 분리된 EPO cDNA
서열의 특징
특징을 나타내는 기호 :signal peptide
존재위치 :1-81
특징을 나타내는 기호 : mat protein
존재위치 : 82-579
특징을 나타내는 기호 : terminator
존재위치 : 580-582
형질전환 자돈의 소변내 EPO 분비량
형질전환 된 돼지의 소변으로부터 회수한 분석은 미국 DSL(Diagnostic System Laboratory)사의 에리스로포이에틴 분석 시약을 사용하여 분석하였고, 표 5에 나타난 바와 같이 분석 결과에 따르면 일령 증가에 따라 EPO 분비량이 지속적으로 증가됨을 알 수 있다.
| 구분 | 출생일 | 소변채취일 | ||||||||||
| 9/14 | 9/30 | 10/7 | 10/19 | 10/22 | 10/28 | 11/9 | 11/20 | 11/29 | 12/30 | 2000.1/25 | ||
| 대조구 | '99.9.148.21 | -- | -- | 11.414.0 | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| 3-5(새새롬Ⅰ) | '99.8.14. | 14.0 | 20.8 | 38.5 | 32.5 | 40.2 | 48.8 | 52.8 | 63.1 | 76.5 | 41.8 | 148.4 |
| 3-15(새새롬Ⅱ) | '99.8.21. | - | 12 | 15 | 17.3 | 14 | 18.7 | 31.36 | 20.4 | 30.2 | 10.3 | 13.4 |
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용하여 인간의 신장에 존재하는 조혈촉진제 유전자를 돼지의 수정란에 주입, 형질전환 시킴으로서 인간의 조혈 촉진제 유전자를 가지는 돼지를 생산하고 그 돼지의 소변을 통하여 분비하도록 함으로써 저렴하고 안정적인 조혈촉진제를 다량 수득할 수 있어 저렴한 비용으로 의약품에 용이하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> TRANSGENIC PORCINE CAPABLE OF PRODUCING HUMAN ERYTHROPOIETIN AND PREPARATION METHOD THEREOF <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 582 <212> DNA <213> EPO cDNA obtained from human liver DNA <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(81) <220> <221> mat_peptide <222> (82)..(579) <220> <221> terminator <222> (580)..(582) <400> 1 atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60 ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120 aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180 agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240 atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360 catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 420 gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480 actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540 aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582 <210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> EPO cDNA obtained from human liver DNA <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(27) <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(193) <400> 2 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Gly Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg
Claims (6)
- 양쪽에 EcoRI과 KpnI 사이트를 가지고 있는 생쥐 U Ⅱ 프로모터와 양쪽에 SalI과 EcoRV사이트를 가지고 있는 SV 40 Poly A의 KpnI과 SalI사이에 EPO유전자를 결합시켜 구축된 재조합 인간 조혈촉진제 발현 벡터.
- 제 1항에 있어서, 발현벡터 pCR2.1 hEPO.
- 제1항의 발현벡터에 의해 형질전환 된 돼지.
- 제3항에 있어서, 재조합 인간 조혈촉진제 cDNA의 염기서열이 서열목록에 서열번호 1로 도시된 염기서열인 것을 특징으로 하는, 형질전환 된 돼지.
- 고분자 연쇄 중합반응(Polymerase chain reaction: PCR)에 의해 쥐의 방광으로부터 3.603kb 생쥐 U Ⅱ프로모터를 증폭하고 클로닝하는 단계와;인간 게놈 DNA로부터 분리한 인간 에리트로포이에틴(EPO) 게놈 DNA 단편과 SV 40 Poly A 유전자를 포함하여 구성되는 발현벡터를 구축하는 단계와;과배란 유도제 호르몬인 임마 혈청성 성선자극호르몬(eCG) 및 임산부 유래 성선자극호르몬(hCG)을 돼지의 근육내 주사하여 과배란을 유기시키는 단계와;발정을 확인하고 자연종부를 시키는 단계와;돼지로부터 one cell 수정란을 회수하는 단계와;회수된 수정란에 발현벡터를 주입한 후 즉시 대리모 돼지에 이식하는 단계와;대리모로부터 돼지를 태어나게 하는 단계와;태어난 돼지의 꼬리조직으로부터 인간 에리트로포이에틴(EPO) DNA를 코드하는 DNA가 전이된 것을 확인하는 단계를 포함하여 구성되는, 소변으로 조혈촉진제를 생성하는 형질전환 돼지의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 발현벡터가 양쪽에 EcoRI과 KpnI 사이트를 가지고 있는 생쥐 U Ⅱ 프로모터와 양쪽에 SalI과 EcoRV사이트를 가지고 있는 SV 40 Poly A의 KpnI과 SalI사이에 EPO유전자를 결합시켜 구축되는, 소변으로 조혈촉진제를 생성하는 형질전환 돼지의 제조방법.
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2001
- 2001-07-24 KR KR10-2001-0044610A patent/KR100453571B1/ko active IP Right Grant
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Also Published As
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