WO1999009816A1 - Verfahren zur gewinnung von insulin precursorproteinen - Google Patents

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WO1999009816A1
WO1999009816A1 PCT/EP1998/005095 EP9805095W WO9909816A1 WO 1999009816 A1 WO1999009816 A1 WO 1999009816A1 EP 9805095 W EP9805095 W EP 9805095W WO 9909816 A1 WO9909816 A1 WO 9909816A1
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Erhard Kopetzki
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Roche Diagnostics Gmbh
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins

Definitions

  • the invention relates to a method for obtaining insulin precursor proteins from milk from transgenic animals and their use for the production of therapeutically applicable insulin and insulin analogs
  • Insulin is a polypeptide hormone. which is essential for the control of the glucose metabolism and is required for the treatment of diabetes mellitus.
  • a number of oils are known, using a large number of different fusion proteins.
  • the constructs essentially consist of an N-terminal prosegment (signal sequence and / or car ⁇ er protein), an enzymatically or chemically cleavable linker, the Insuhn B chain, which comprises 30 amino acids, or one which may be truncated to amino acids 1-29 or C-terminal modified B chain.
  • linker peptide an optionally shortened C peptide (linker peptide), which connects the C-terminal end of the B chain with the N-terminal end of the A chain, and the A chain, which comprises 21 amino acids.
  • the A chain can also be deviated .
  • EP-A 0 195 691 describes a precursor form of human insulin in which the linker peptide consists of the basic amino acids lysine and / or arginine.
  • the expression vector used for the recombinant production of this miniproinsuhn is, however, only suitable for expression / secretion in yeast.
  • EP-A 0 055 945 describes the production of an insulin precursor form, part of the ⁇ -galactosidase or a fusion polypeptide from Trp-Leader being used as car ⁇ er protein with Trp E polypeptide is used As linker peptides between the B and A chain, peptides are used which are flanked by two basic amino acids (Lys or Arg) at the N and C terminals.
  • EP-A 0 367 161 describes a process for the selective cleavage of an amylase inhibitor-proinsulin fusion protein with a trypsin-like endoproteinase.
  • EP-A 0 600 372 describes a process for obtaining Promsulm with correctly connected cysteine bridges in the presence of mercaptan and chaotropic auxiliaries. Hanson describes in EP-B 0 195 691 insulin precursor forms which can be obtained by secretion in yeast strains.
  • Ammerer et al. in EP-B 0 163 529 and EP-B 0 427 296 describe DNA sequences for insulin precursors.
  • the B (I-29) -A (I-21) insulin precursor (Des B30 insulm) and derived derivatives thereof in yeast are obtained by expression / secretion from Hartman. JR et al will finally describe in WO 96/20724 a further process for the production of human insulin by naturalization of an SOD-mimpromsulin fusion prototype and subsequent processing with trypsin and carboxypeptidase B to insulin
  • EP-B 0 089 007 describes a process for the production of insulin from a precursor protein, which then consists of the precursor protein (Des B30-Insulm) being trypsin or a trypsin-like endopeptidase with an ester of natural amino acids (Thr ) that contain protective groups, reacted and then the ester group and the existing protective group are split off. As a result, a threonm is coupled to Lys-29 of the B chain, thereby producing the complete B chain (1-30)
  • homologous and heterologous hormones such as promsulm, insulin, erythropoietin, TNF, interleukins, CSFs, interferons and growth factors in transgenic animals usually leads to lethal reactions or has a negative impact on the health of the transgenic animals, in particular when the hormones ms get animal blood
  • the object of the invention is therefore to provide insulin precursor peptides which are extensively inactive in transgenic animals and which have essentially no negative impact on the health of the animals. It is also essential that these precursor peptides can easily be converted into insulin
  • the invention relates to an experience for the production of inactive insulin precursor proteins in transgenic animals, which is characterized in that one or more DNA sequences coding for this peptide, which are preferably free of bacterial foreign sequences, m the male pronucleus of a fertilized egg cell a mammal, the egg cell is implanted in the fallopian tube, the offspring are bred and the insulin precursor protein is obtained from their milk.
  • the DNA sequences are used in linear form
  • the insulin precursor protein shows practically no physiological effect in the transgenic animal, ie it is inactive. It has been shown that an insulin precursor protein with the general formula I
  • L left, part of a protein naturally secreted in animals, preferably a milk protein of up to 300 amino acids;
  • X lysine;
  • Such a precursor protein can be converted into active insulin in a simple manner, after secretion into the milk, by cleavage with a trypsin-like endoproteinase, preferably with lysyl endoproteinase, and subsequent coupling of Thr to Des-B30 insulin.
  • a lysyl endoproteinase produced recombinantly in prokaryotes is preferably used for the proteolytic cleavage.
  • Another object of the invention is the conversion of the insulin precursor protein obtained from the milk of transgenic animals to therapeutically active insulin.
  • the insulin precursor protein (general formula II: (LXB (I-29) -A (I-21)) obtained from the milk of transgenic animals differs from the precursor protein which is encoded by the nucleic acid which is fertilized in the male pronucleus of a Egg of a mammal has been introduced (Formula I) in that it no longer contains a signal peptide.
  • the signal peptide is split off when the body is removed from the body, preferably milk
  • transgenic animals are known to the person skilled in the art and is described, for example, in general form by R Janisch in Science 240 (1988) 1468-1473.
  • the preferred micro-projection is described by Hammer, RE in Nature 315 (1985) 680-683
  • the DNA can be injected into the male pronucleus of fertilized egg cells by micro-injection, the egg cells can then be implanted in the fallopian tube of the corresponding animals and offspring can be bred that expand the micro-injected genetic material.
  • Transgenic animals have also been found in mice Retrovirus infection of embryos or by transfer of genetically manipulated stem cells into blastocytes (Palmiter, RD et al. Ann Rev Genet 20 (1986) 465, B ⁇ nster, RL et al, Harvey Lectures Se ⁇ es 80 (Liss. New York, 1986, 1 - 38)
  • the genes to be expanded are subclomerized and propagated in a conventional manner, preferably in a prokaryotic vector, and suitable host cells. After cleavage of the vector, the genes in question are isolated with suitable residual nucleases, free of prokarvonian sequences, and injected into fertilized egg cells It is possible to use circularized or preferably neutralized DNA. It is further preferred to clomerize animal-specific promoters and enhancer sequences onto the expression vector before the DNA to be expanded
  • promoters which can be activated in the mammary gland, such as, for example, the promoters of milk proteins (caseine, ⁇ -lactalbumin and the acidic whey protein).
  • milk proteins caseine, ⁇ -lactalbumin and the acidic whey protein.
  • signal sequence from a homologous or heterologous milk protein Signal sequences are in USP 4,873,316.
  • EP-A 0 279 582 and WO 88/101 18 describe The main advantage of the forms of insulin precursors according to the invention is that they can only be cleaved by lysyl-endoproteinase or protemases, which show the same specificity, namely cleavage after lysine.
  • a linker which is part of a naturally secreted protein, is preferably an N-terminal amino acid sequence of a milk protein (e.g. caseine, ⁇ -lactalbumin and the acidic whey protein), which immediately follows the signal sequence
  • FIG. 1 shows the DNA and the amino acid sequence derived therefrom of the chemically synthesized INSLYS-BC'A human proinsulm structural variant gene.
  • the LysArg to ArgLys mutation in the C peptide is marked (double underline).
  • the corresponding DNA sequence is listed in SEQ ID NO: 3
  • FIG. 2 shows the DNA sequence and the amino acid sequence derived therefrom of the INSLYS-DesB30A Humanproinsu n structural variant gene.
  • the corresponding DNA sequence is listed in SEQ ID NO 4
  • SEQ ID NO 4 A sequence of the INSLYS-DesB30A human prou
  • the INSLYS-BC'A promsulm structure ariantengen encodes a human proinsulinva ⁇ ante, in which the order of the two C-terminal amino acids LysArg of the C-peptide at position 64 and 65 (ammosaurus sequence numbering according to the publication by Sures, I et al Science 208 ( 1980) 57-59) was switched to ArgLys
  • the INSLYS-BC'A promsulm structural variant gene is based on the sequence published by Sures, I et al (Science 208 (1980) 57-59) for human proinsuhn from amino acid position 1-86.
  • the INSLYS-BC'A proinsulm variant gene additionally codes for em N-termmal prosegment (linker) with the amino acid sequence AlaSerLys
  • the prosegment contains a lysyl endoproteinase cleavage site (Lys) at the C-terminal in direct fusion with the proinsulin polypeptide chain coding region and introduced at the ends of the INSLYS-BC'A gene with a view to the construction of further Proinsulmva ⁇ antengenen and the recloning of the Promsulm coding DNA segment
  • the INSLYS-BC'A gene was produced by Genosys (Genosys Biotechnologies, Inc. Camb ⁇ dge, England) by chemical synthesis from ohgonucleotides.
  • the double-stranded INSLYS-BC'A gene was assembled by "annealmg” and ligation of the ohgonucleotides and then into the EcoRI and Hindill interface of the E coh standard vector pBluesc ⁇ ptSK (-) from Stratagene (Stratagene GmbH, Heidelberg, Germany).
  • the predetermined DNA sequence of the cloned INSLYS-BC'A gene was confirmed by DNA sequencing.
  • the nucleotide and the derived amino acid sequence of the chemically synthesized INSLYS-BC'A promsuhnva ⁇ anten gene is shown in FIG. 1.
  • the DNA segment coding for the C-terminal amino acid Thr at position 30 of the B chain and the C'-peptide in the INSLYS-BC'A gene was removed.
  • the INSLYS-DesB30A proinsulin variant gene codes for a Promsulm peptide chain. in which the amino acid sequence of the B chain at position Lys29 is fused with the A chain at position Glyl.
  • the INSLYS-DesB30A proinsuhnva ⁇ anten gene was produced from the INSLYS-BC'A gene using a DNA adapter
  • the plasmid pINSLYS-BC'A (example 1) was digested with the singularly cutting residual endonucleases StuI and Ndel and the approximately 3.06 kBp long Stul / Ndel-pINSLYS-BC'A vector fragment after isolation by means of agarose gel electrophoresis with the DesB30A adapter ligated.
  • the DesB30A adapter (FIG.
  • the desired plasmid pINSLYS-DesB30A was identified by restriction mapping (truncated 177 bp Nhel / HindIII fragment) and the DNA sequence of the adapter region was checked by DNA sequencing.
  • the nucleotide and deduced .amino acid sequence of the INSLYS-DesB30A proinsulin variant gene is shown in FIG. 2.
  • transgenic mammals includes the preparation of injectable DNA solutions, the extraction of fertilized eggs and embryos, the microinjection of the DNA solution into pronuclei or nuclei, the transfer of the injected oocytes to synchronized recipient animals and the examination of the born animals for integration.
  • the individual mammal species such as mouse. Sheep or goat, some species-related differences in the preparation of the donor and recipient tiers. the extraction and transfer of the embryos and the microinjection.
  • this is familiar to the person skilled in the art, but will be explained using the example of the mouse.
  • the DNA solution is diluted with Tris buffer so that up to 1000 copies of the gene construct are contained per pico liter of solution. All for making the DNA Solutions used in the micro-projection solution must be free of particulate contaminants, so that blockage of the injection pipette is avoided
  • the donor animals are usually superovulled
  • mice Female mice, who are at least six weeks old, are injected with 5 - 10 IU PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) to induce superovulation. 48 hours later they receive 5 - 10 IU HCG (Human Chonginonadotropin) and are paired with fertile goats the next morning the plaque positive mice are killed and after opening the abdominal cavity the fallopian tubes are removed. By tearing open the ampoules with fine tweezers and by winding the fallopian tubes, the embryos are obtained and transferred to embryo culture medium to which the hyaluroma dose has been added. The egg cells are washed after removal of the cumulus cells and cultivated up to micro-projection
  • An inverse microscope e.g. Zeiss ICM 405
  • two Leitz micromampulators and an injection device Eppendorf
  • One manipulator carries the holding pipette with which the embryo can be fixed by negative pressure.
  • the second micromanipulator is used to hold the pipette Injection pipette filled with DNA solution fixed in a nanostepper and connected to the injection device.
  • the tip of the injection pipette has a diameter of 1 - 2 ⁇ m.
  • the pipette tip is pushed through the zona pellucida, the cell membrane and the core membrane into the core lumen and approx. 1 - 2 pl DNA solution is deposited there.
  • the increase in volume of the pre-nucleus signals a successful micromjection.
  • the nuclei of embryos in the two-cell stage are also micro-injected and cores are pretreated (Zent ⁇ fuga tion at 15000 G for 3 - 5 mm)
  • the microinjection takes place in a medium drop on a cover glass or in a so-called injection chamber.
  • the eggs or embryos are cultivated until transfer 3.4 Transfer of the micro-injected egg cells
  • Recipient mice are paired with vasectomized goats overnight to trigger an apparent pregnancy. Plaque positive mice are selected and anesthetized for transfer. The upstream bursa ovarica is opened with fine tweezers and the embryos drawn up in a transfer pipette (10-15 per side) are transferred to both fallopian tubes. The boys are born 20 - 21 days after the transfer.
  • tissue samples tail tissue, blood or biopsy
  • High molecular weight genomic DNA is isolated from these tissue samples.
  • slot blot Dot blot or Southern blot analyzes performed.
  • Positive animals are raised and mated to non-transgenic mating partners after the breeding ripe has been calibrated. The offspring resulting from these matings are examined to see whether they have inherited the transgene from their transgenic parent. By mating hemizygotically transgenic animals homozygous transgenic F2 progeny are then bred.
  • the amount of insulin precursor protein in milk is determined after cleavage of the precursor protein with lysyl endoproteinase, followed by analytical RP-HPLC with Des B30 insulin as standard.
  • the transgenic milk (whey) containing the insulin precursor is titrated to pH 4.0 with acetic acid and the protein precipitate is sedimented by centrifugation.
  • the supernatant 1 mol / 1 Tris-HCl is added (final concentration 25 mmol / 1) and the pH is adjusted to pH 9.0 using HC1.
  • the time course of the enzymatic cleavage (cleavage kinetics) of the fusion protein is monitored by means of the release of DesB30 insulin by analytical RP HPLC.
  • the bound material is eluted by a gradient of 0-300 mmol / 1 NaCl in 25 mmol / 1 Tris-HCl, pH 9.0 and 30% (v / v) isopropanol (2 SV / hour).
  • the DesB30-insulin-containing fractions are combined and the DesB30-insulin is precipitated by adding acetone (final concentration 80-90 ° o (v / v)).
  • the precipitate is sedimented by centrifugation and then dried in vacuo.
  • DesB30 insulin is equivalent to that of Morihara. K. et al. published method with the lysyl endoproteinase LysC (Boehringer Mannheim GmbH. Mannheim. Germany. Cat. No. 1420429) instead of Achromobacter protease I as catalyst in human insulin (Biochem. J. 240 (1986) 803-810; TIBTECH 5 ( 1987) 164-170; EPS 17938).
  • the generated human insulin is purified by preparative RP HPLC on Kromasil C-8 (Akzo Nobel AB, Sweden) using methods known from the literature.

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Abstract

Ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin Precursorproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere für dieses Protein codierende Nukleinsäuren in den männlichen Pronucleus einer befruchteten Eizelle eines Säugetiers einbringt, die Eizellen in den Eileiter des Säugetiers implantiert, die Nachkommen züchtet und aus ihrer Milch das Insulin Precursorprotein gewinnt, ist zur Insulinherstellung besonders geeignet, da das Insulin-Vorläuferprotein praktisch keine physiologische Wirkung im transgenen Tier zeigt und auf einfache Weise in Insulin umgewandelt werden kann.

Description

Verfahren zur Gewinnung von Insulin Precursorproteinen
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin Precursorproteinen aus Milch von transgenen Tieren und deren Verwendung zur Herstellung von therapeutisch apphzierbarem Insulin und Insuhnanaloga
Insulin ist ein Polypeptidhormon. welches wesentlich für die Kontrolle des Glucosemetabo- hsmus ist und für die Behandlung des Diabetes mellitus benotigt wird Zur rekombinanten Herstellung von Insulin sind eine \ lelzahl von \ erfahren, unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Fusionsproteinen, bekannt. Die Konstrukte bestehen im Wesentlichen aus einem N-terminalen Prosegment (Signalsequenz und/oder Carπerprotein), einem enzymatisch oder chemisch spaltbaren Linker, aus der Insuhn-B-Kette, welche 30 Aminosäuren umfaßt, oder einer gegebenenfalls auf die Aminosäuren 1 - 29 verkürzten oder C-terminal modifizierten B-Kette. einem gegebenenfalls verkürzten C-Peptid (Linkerpeptid), welche das C-terminale Ende der B-Kette mit dem N-terminalen Ende der A-Kette verbindet, sowie der A-Kette, welche 21 Aminosäuren umfaßt Auch die A-Kette kann deπvatisiert sein. In der EP-A 0 195 691 ist eine Vorlauferform von humanem Insulin beschrieben, bei der das Linkerpeptid aus den basischen Aminosäuren Lysin und/oder Arginm besteht. Der zur rekombinanten Herstellung dieses Miniproinsuhns verwendete Expressionsvektor ist jedoch nur für die Expression/Sekretion in Hefe geeignet In der EP-A 0 055 945 wird die Herstellung einer Insulinvorläuferform beschrieben, wobei als Carπerprotein ein Teil der ß-Galactosidase oder ein Fusionspolypeptid aus Trp-Leader mit Trp E-Polypeptid verwendet wird Als Linkerpeptide zwischen B- und A-Kette werden Peptide verwendet, die N- und C-terminal von zwei basischen Aminosäuren (Lys oder Arg) flankiert werden.
Von Laslo. V. et al. wird in der EP-A 0 367 161 ein Verfahren zur selektiven Spaltung eines Amylasemhibitor-Proinsulin-Fusionsproteins mit einer Trypsin-ähnlichen Endoproteinase beschrieben. In der EP-A 0 600 372 wird ein Verfahren zur Gewinnung von Promsulm mit korrekt verbundenen Cysteinbrucken in Anwesenheit von Mercaptan und chaotropen Hilfsstoffen beschrieben. Hanson beschreibt in der EP-B 0 195 691 Insulinvorläuferformen, welche durch Sekretion in Hefestammen erhalten werden können. Ammerer et al. beschreiben in der EP-B 0 163 529 und EP-B 0 427 296 DNA-Sequenzen für Insulmvorläuferpepüde. welche korrekt positionierte Disulfidbrucken haben und gegen proteolytische Degradation stabil sind. Durch Expression/Sekretion wird dabei der B(l - 29)-A(l - 21) Insulmprecursor (Des B30-Insulm) und davon abgeleitete Dεπvate in Hefe erhalten Von Hartman. J R et al wird schließlich in der WO 96/20724 ein weiteres Verfahren zur Herstellung von humanem Insulin durch Natuπerung eines SOD-Mimpromsulin-Fusionsprotems und anschließender Prozessierung mit Trypsin und Carboxypeptidase B zu Insulin beschπeben
In der EP-B 0 089 007 wird ein Verfahren zur Herstellung von Insulin aus einem Vorlauferprotein beschπeben, welches dann besteht, daß das Vorlauferprotein (Des B30-Insulm) mit Hilfe von Trypsin oder einer Trypsin-ahnhchen Endopeptidase mit einem Ester naturlicher Aminosäuren (Thr), die Schutzgruppen enthalten, umgesetzt und danach die Estergruppe und die vorhandene Schutzgruppe abgespalten wird Dadurch wird ein Threonm an Lys-29 der B-Kette gekoppelt und dadurch die \ ollstandige B-Kette (1 - 30) hergestellt
Die Uberexpression von homologen und heterologen Hormonen, wie z B Promsulm, Insulin, Erythropoietin, TNF, Interleukine, CSFs, Interferonen und Wachstumsfaktoren in transgenen Tieren, führt in der Regel zu lethalen Reaktionen bzw hat einen negativen Einfluß auf die Gesundheit der transgenen Tiere, insbesondere wenn die Hormone ms Blut der Tiere gelangen
Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ιnaktι\ e Insulin- Vorlauferpeptide zur V erfugung zu stellen, die in transgenen Tieren in w eitestgehend inaktiver Form expπmierbar sind und im Wesentlichen keinen negativen Einfluß auf die Gesundheit der Tiere haben Zudem ist es wesentlich, daß diese Vorlauferpeptide in einfacher Weise m Insulin umgewandelt werden können
Gegenstand der Erfindung ist ein erfahren zur Gew innung von inaktiven Insulin Precursorproteinen in transgenen Tieren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine oder mehrere für dieses Peptid codierende DNA-Sequenzen, die vorzugsweise frei von bakteπellen Fremdsequenzen sind, m den männlichen Pronukleus einer befruchteten Eizelle eines Saugetiers embπngt, die Eizelle in den Eileiter des Saugetiers implantiert, die Nachkommen züchtet und aus ihrer Milch das Insulin Precursorprotein gewinnt In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform werden die DNA-Sequenzen in linearer Form verwendet
Zur rekombinanten Herstellung von Insulin in transgenen Tieren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, inaktive Vorlauferproteme (Precursorproteme) von Insulin zu expπmieren, im Besonderen nicht prozessiertes Des-B30 Insulin, das gegebenenfalls am N-Terminus noch einen abspaltbaren Fusionsanteil aufweisen kann und welche in die Milch sekretiert werden können. Zur Herstellung des therapeutisch verwendbaren Insulins, müssen anschließend noch eine Spaltung, Transpeptidierung oder Kopplung von Thr und eine Reinigung durchgeführt werden.
Wesentlich für die Erfindung ist, daß das Insulin Vorläuferprotein praktisch keine physiologische Wirkung im transgenen Tier zeigt, also inaktiv ist. Es hat sich gezeigt, daß ein Insulin Precursorprotein mit der allgemeinen Formel I
SS-L-X-B( 1 - 29)-A( 1 - 21 ) (Formel I)
in der bedeuten
SS: Signalpeptid;
L: Linker, Teil eines natürlicherweise im Tier sezer- nierten Proteins, vorzugsweise ein Milchprotein bis zu 300 Aminosäuren; X: Lysin;
B(l-29): die ersten 29 Aminosäuren der B-Kette von Insulin;
A (l-21 ): A-Kette von Insulin,
im transgenen Tier im wesentlichen inaktiv ist. Ein solches Precursorprotein kann in einfacher Weise, nach Sekretion in die Milch, durch Spaltung mit einer Trypsin-ähnlichen Endoproteinase, vorzugsweise mit Lysyl-Endoproteinase, und anschließender Kopplung von Thr an Des-B30 Insulin in aktives Insulin umgewandelt werden. Vorzugsweise wird zur pro- teolytischen Spaltung eine rekombinant in Prokaryonten hergestellte Lysyl-Endoproteinase verwendet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Umwandlung des aus der Milch transgener Tiere erhaltenen Insulin Precursorproteins zu therapeutisch aktivem Insulin. Das aus der Milch transgener Tiere erhaltene Insulin-Precursorprotein (allgemeine Formel II: (L-X-B(l-29)-A(l-21)) unterscheidet sich von dem Precursorprotein, welches durch die Nukleinsäure codiert wird, die in dem männlichen Pronukleus einer befruchteten Eizelle eines Säugetiers eingebracht wurde (Formel I), dadurch, daß es kein Signalpeptid mehr enthält. Das Signalpeptid wird bei der Ausschleusung aus der Zelle m die Korperflussigkeit, vorzugsweise Milch, abgespalten
Die Herstellung von transgenen Tieren ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise in allgemeiner Form von R Janisch in Science 240 (1988) 1468 - 1473 beschπeben. Die v orzugsweise verwendete Mikromjektion ist v on Hammer, R E in Nature 315 (1985) 680 - 683 beschπeben
Zur Expression fremder DNA-Sequenzen in Tieren kann man die DNA in den mannlichen Pronukleus von befruchteten Eizellen durch Mikromjektion injizieren, die Eizellen dann in den Eileiter von entsprechenden Tieren implantieren und Nachkommen züchten, die das mikroinjizierte genetische Mateπal expπmieren Bei Mausen wurden transgene Tiere auch durch Retrovirus-Infektion von Embryonen oder durch Transfer von genetisch manipulierten Stammzellen in Blastozyten erzeugt (Palmiter, R D et al . Ann Rev Genet 20 (1986) 465, Bπnster, R L et al , Harvey Lectures Seπes 80 (Liss. New York, 1986, 1 - 38)
Die Einführung von fremder genetischer Information, in die Keimbahn von Tieren, ist für eine Reihe von Tierarten, darunter auch Schafen (Clark, A J et al , Bio/Technology 7 (1989) 487, Simons. J et al , Bio/Technology 6 (1988) 179 Rexroad, C E et al , Mol Reprod De\ (1989) 164). Ziegen und Mausen beschπeben orden
Bei dem erfmdungsgemaßen \ erfahren werden die zu expnmierenden Gene auf übliche Weise, vorzugsweise m einem prokaryontischen Vektor, subklomert und geeigneten Wirtszellen vermehrt Die entsprechenden Gene w erden nach Spaltung des Vektors mit jeweils geeigneten Restπktionsnukleasen, frei von prokarvonüschen Sequenzen, isoliert und in befruchtete Eizellen injiziert Dabei kann man zirkulaπsierte oder bevorzugt neaπsierte DNA verwenden Es ist weiter bevorzugt, tierspezifisch Promotoren und Enhancersequenzen auf den Expressionsvektor vor die zu expπmierende DNA zu klomeren
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von spezifischen in der Milchdrüse akti ierbaren Promotoren, wie z B die Promotoren von Milchproteinen (Caseine, α-Lactalbumin und das saure Molke-Protein) Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung der Signalsequenz von einem homologen oder heterologen Milchprotein Derartige Promotoren und Signalsequenzen sind in der USP 4,873,316. EP-A 0 279 582 und WO 88/101 18 beschπeben Der wesentliche Vorteil der erfmdungsgemaßen Insulinvorläuferformen ist, daß sie ausschließlich durch Lysyl-Endoproteinase oder Protemasen, welche die gleiche Spezifität, namhch Spaltung nach Lysin, zeigen, spaltbar sind. Nach der Spaltung ist es lediglich erforderlich, mit Endoproteinase Lys-C (z B. durch Transpeptidierung oder durch eine andere Kopplungsreaktion) Threomn an den C-Terrmnus der B-Kette anzufügen. Die Transpeptidierung und die Kopplung von Aminosäuren sind Verfahren, welche dem Fachmann geläufig sind und beispielsweise von Moπhara, K. et al. in Biochem. J. 240 (1986) 803 - 810, TIBTECH 5 (1987) 164 - 170, EP-B-0 089 007 und EP-B 0 017 938 beschπeben sind. Es gelingt damit, unter Verwendung der erfmdungsgemaßen Konstrukte, die Herstellung von therapeutisch verwendbarem Insulin aus Vorlauferpeptiden durch die Anwendung eines einzigen Enzyms, welches spezifisch nach Lysin spaltet und in der Lage ist eine Transpepti- dierung/Kopplung zu eπeichen, durchzufuhren
Die Herstellung der vollständigen Insuhn-B-Kette aus Des-B30-Insuhn durch enzymatische Transpeptidierung/Kopplung ist dem Fachmann bekannt und wird als enzymatische Transpeptidierung/Kopplung bezeichnet Dieses Verfahren ist ausführlich von Moπhara et al. in Biochem. J. 240 (1986) 803 - 810, TIBTECH 5 (1987) 164 - 170 und im europäischen Patent EP-B 0 017 983 beschrieben
Unter einem Linker, welcher ein Teil eines natürlicherweise sezermerten Proteins darstellt, v ersteht man vorzugsweise eine N-terminale Aminosauresequenz eines Milchproteins (z.B. Caseine. α-Lactalbumin und das saure Molke-Protein), die sich unmittelbar an die Signalsequenz anschließt
Die folgenden Beispiele, Publikationen, das Sequenzprotokoll und die Abbildungen erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschπebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.
Fig 1 zeigt die DNA- und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des chemisch synthetisierten INSLYS-BC'A Humanproinsulm Strukturvaπantengens. Die LysArg zu ArgLys Mutation im C-Peptid ist gekennzeichnet (doppelt unterstπchen). In SEQ ID NO:3 ist die entsprechende DNA-Sequenz aufgeführt Fig 2 zeigt die DNA- und die davon abgeleitete Aminosauresequenz des INSLYS-DesB30A Humanproinsu n Strukturvariantengens In SEQ ID NO 4 ist die entsprechende DNA- Sequenz aufgeführt
Fig 3 zeigt den DesB30A-Adaptor gern Beispiel 2
SEQ ID NO 1 - 2 Ohgonukleotide ON1 - ON2
SEQ ID NO 3 DNA-Sequenz des chemisch synthetisierten INSLYS-BC'A
Humanproinsuhn Strukturvaπantengens
SEQ ID NO 4 DN A-Sequenz des INSLYS-DesB30A Humanproinsuhn
Strukturvariantengens
Rekombinante DNA-Technik
Zur Manipulation von DNA w urdεn Standardmethoden benutzt, wie sie bei Sambrook, J et al. (1989) In Molecular clomng A laboratory manual Cold Spπng Harbor Laboratory Press, Cold Spπng Harbor, New York, beschπeben sind Die verwendeten molekularbiologischen Reagenzien wurden nach den Angaben des Herstellεrs eingesetzt
Beispiel 1
Gensynthese des Humanproinsulin Strukturgens INSLYS-BC'A mit verändertem C- Peptid (Plasmid: pINSLYS-BC'A)
Das INSLYS-BC'A Promsulm Struktur ariantengen kodiert für eine Humanproinsulinvaπante, bei der die Reihenfolge der beiden C-termmalen Aminosäuren LysArg des C-Peptides an Position 64 und 65 (Ammosauresequenz-Numeπerung entsprechend der Publikation von Sures, I et al Science 208 (1980) 57-59) zu ArgLys vertauscht wurde
Das INSLYS-BC'A Promsulm Strukturvariantengen basiert auf der von Sures, I et al (Science 208 (1980) 57-59) publizierten Sequenz für Humanproinsuhn von Ammosaureposition 1-86 Das INSLYS-BC'A Proinsulmvaπantengen kodiert zusätzlich für em N-termmales Prosegment (Linker) mit der Aminosauresequenz AlaSerLys Das Prosegment enthält C-terminal eine Lysyl-Endoproteinase Spaltstelle (Lys) in direkter Fusion mit der Proinsulin Polypeptidkette Beim "Gendesign" des INSLYS-BC'A Proinsulmvaπantengens wurden geeignete singulare Restπktionsendonukleaseschnittstellen innerhalb der kodierenden Region und an den Enden des INSLYS-BC'A Gens eingeführt im Hinblick auf die Konstruktion von weiteren Proinsulmvaπantengenen und die Umklonierung des Promsulm kodierenden DNA Segments
Das INSLYS-BC'A Gen wurde von der Firma Genosys (Genosys Biotechnologies, Inc. Cambπdge, England) durch chemische Synthese aus Ohgonukleotiden hergestellt Durch "Annealmg" und Ligation der Ohgonukleotide wurde das doppelstrangige INSLYS-BC'A Gen zusammengesetzt und danach in die EcoRI und Hindill Schnittstelle des E coh Standardvektors pBluescπptSK(-) der Firma Stratagene (Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland) klomert. Die vorgegebene DNA Sequenz des klomerten INSLYS-BC'A Gens wurde durch DNA Sequenzierung bestätigt Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosauresequenz des chemisch synthetisierten INSLYS-BC'A Promsuhnvaπantengens ist in der Fig. 1 dargestellt.
Beispiel 2
Konstruktion des Humanproinsulin Variantengens INSLYS-DesB30A (Plasmid: pINSLYS-DesB30A)
Im INSLYS-DesB30A Promsuhn aπantensen wurde das DNA Segment, das für die C- termmale Aminosäure Thr an Position 30 der B-Kette und das C'-Peptid im INSLYS-BC'A Gen kodiert entfernt. Das INSLYS-DesB30A Proinsulinvaπantengen kodiert für eine Promsulm Peptidkette. bei der die Aminosauresequenz der B-Kette an Position Lys29 mit der A-Kette an Position Glyl fusioniert ist Das INSLYS-DesB30A Proinsuhnvaπantengen wurde aus dem INSLYS-BC'A Gen mittels eines DNA-Adaptors hergestellt
Dazu wurde das Plasmid pINSLYS-BC'A (Beispiel 1 ) mit den Singular schneidenden Restπktionsendonukleasen StuI und Ndel verdaut und das ca. 3,06 kBp lange Stul/Ndel- pINSLYS-BC'A Vektorfragment nach Isolierung mittels Agarosegelelektrophorese mit dem DesB30A-Adaptor ligiert. Der DesB30A-Adaptor (Fig 3) wurde durch Hybπdisierung aus den komplementären Ohgonukleotiden (ON) 1 (SEQ ID NO: 1) und 2 (SEQ ID NO: 2) (Reaktionspuffer: 12,5 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,0 und 12,5 mmol/1 MgCl, ; ON Konzentration: jeweils 1 pmol / 60 μl) hergestellt.
DesB30A-Adaptor:
ON1: (SEQ ID NO: 1)
5' -CctTaTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGaTTCTTCTACACACCCAAGGGCATTGTGGAACAATGC
TGTACCAGCA-3'
ON2: (SEQ ID NO:2)
5'-TATGCTGGTACAGCATTGTTCCACAATGCCCTTGGGTGTGTAGAAGAAtCCTCGTTCCCCGCACA
CTAGGTAtAagG-3'
Das gewünschte Plasmid pINSLYS-DesB30A wurde durch Restriktionskartierung identifiziert (verkürztes 177 Bp langes Nhel/Hindlll-Fragment) und die DNA-Sequenz des Adaptorbereichs durch DNA Sequenzierung überprüft. Die Nukleotid- und die abgeleitete .Aminosäuresequenz des INSLYS-DesB30A Proinsulinvariantengens ist in der Fig. 2 dargestellt.
Beispiel 3 Transgene Säugetiere
Die Erstellung transgener Säugetiere umfaßt die Herstellung injizierbarer DNA-Lösungen, die Gewinnung befruchteter Eizellen und Embryonen, die Mikroinjektion der DNA-Lösung in Vorkerne oder Kerne, den Transfer der injizierten Oozyten auf synchronisierte Empfängertiere und die Untersuchung der geborenen Tiere auf Integration. Dabei sind für die einzelnen Säugerspecies, wie Maus. Schaf oder Ziege, einige speciesbedingte Unterschiede in der Vorbereitung der Spender- und Empfängertiεre. der Gewinnung und den Transfer der Embryonen sowie der Mikroinjektion zu beachten. Dies ist jεdoch dem Fachmann geläufig, soll aber am Beispiel der Maus erläutert werden.
3.1 Herstellung einer injizierbaren DNA-Lösung
Nach der DNA-Fragmentisolierung und der Bestimmung des DNA-Gehalts, wird die DNA-Lösung mit Trispuffer so vεrdünnt, daß pro pico Liter Lösung bis zu 1000 Kopien des Genkonstruktes enthalten sind. Alle für die Herstellung der DNA- Mikromjektionslosung verwendeten Losungen müssen frei von partikularen Verunreinigungen sein, damit ein Verstopfεn dεr Injεktionspφetten vermieden wird
3.2 Gewinnung der Embryonen
Um die Ausbeute an Embryonen zu erhohen, werden die Spendertiere in aller Regel superovuhert
Weiblichen Mausen, die mindestens sechs Wochen alt sind, werden zur Induktion der Superovulation 5 - 10 IE PMSG (pregnant mare sεrum gonadotropin) injiziert 48 Stunden spater erhalten sie 5 - 10 IE HCG (Human Choπongonadotropin) und werden mit fertilen Bocken angepaart Am nächsten Morgen werden die Plaque positiven Mause getötet und nach Öffnung der Bauchhohle werdεn die Eileiter herausgenommen Durch Aufreißen der Ampullε mit feinen Pinzetten und durch Spulen der Eileiter werden die Embryonen gewonnen und in Embryokulturmedmm, dem Hyaluromdase zugesetzt wurde, überfuhrt Die Eizellen werden nach Entfernung der Kumuluszellen gewaschen und bis zur Mikromjektion kultiviert
3.3 Mikroinjektion der DNA-Losung
Für die Mikroinjektion werden ein Inversmikroskop (z B Zeiss ICM 405), zw ei Leitz- Mikromampulatoren und ein Injektionsgerat (Eppendorf) verwendet Der eine Manipulator tragt die Haltepipette, mit w elcher der Embryo durch Unterdruck fixiert werden kann Auf dem zweiten Mikromanipulator werden die mit DNA-Losung gefüllte Injektionspipette m einem Nanostepper fixiert und mit dem Injektionsgerat verbunden Die Spitze der Injektionspipette hat einen Durchmesser von 1 - 2 um Zur Mikromjektion wird die Pipettenspitze durch die Zona Pellucida, die Zellmembran und die Kernmembran in das Kernlumen vorgeschoben und ca 1 - 2 pl DNA-Losung werden dort abgesetzt Die Volumenzunahme des Vorkerns signalisiert eine erfolgreiche Mikromjektion Zum Teil erfolgt auch eine Mikromjektion der Kerne von Embryonen im Zweizellstadium Im Gegensatz zur Maus, müssen bei dεn meisten Nutztierspecies (Schaf. Ziege) die Eizellen und Embryonen zur Sichtbarmachung der Vorkerne und Kerne vorbehandelt werden (Zentπfugation bei 15000 G für 3 - 5 mm) Die Mikroinjektion erfolgt in einem Mediumtropfen auf einem Deckglas oder in einer sogenannten Injektionskammer Nach der Mikromjektion werden die Eizellen odei Embrvonen bis zum Transfer kultiviert 3.4 Transfer der mikroin jizierten Eizellen
Empfängermäuse werden zur Auslösung einer Scheingravidität mit vasektomierten Böcken über Nacht angepaart. Plaque positive Mäuse werden herausgesucht und für den Transfer narkotisiert. Die vorgelagerte Bursa Ovarica wird mit feinen Pinzetten geöffnet und die in einεr Transferpipette aufgezogenen Embryonen (10 - 15 pro Seite) werden in beide Eileiter übertragεn. Die Geburt der Jungen erfolgt 20 - 21 Tage nach dem Transfer.
3.5 Untersuchung auf Integration
Zur Untersuchung auf Integration der injizierten DNA, müssen von den geborenen Tieren Gewebeprobεn (Schwanzgewebe, Blut oder Biopsie) entnommen werden. Aus diesen Gewebeproben wird hochmolekulare genomische DNA isoliert. Zum Integrationsnachweis w erden Slot Blot-. Dot Blot- oder Southern-Blot- Analysen durchgeführt.
Positive Tiere (Tiere mit Integration des Genkonstruktes) werden aufgezogen und nach Eπeichen der Zuchtreifε an nicht-transgene Paarungspartner angepaart. Die aus diesen Anpaarungen entstehenden Nachkommen wεrdεn darauf untersucht, ob sie das Transgen von ihrem transgenen Elternteil geεrbt habεn. Durch Verpaarung hemizygot transgener Tierε werden dann homozygot transgene F2-Nachkommen gezüchtet.
Zur Untersuchung der Expression wird von transgenen Tieren Milch gewonnen.
Die Menge an Insulin-Precursorprotein in dεr Milch wird nach Spaltung des Precursorproteins mit Lysyl-Endoproteinasε, gεfolgt von analytischer RP-HPLC mit Des B30-Insulin als Standard, bestimmt.
Beispiel 4
Spaltung der Precursor-Insulinproteine mit Lysyl-Endoproteinase
Die den Insulinprecursor enthaltende transgene Milch (Molke) wird mit Essigsäure auf pH 4.0 titriert und das Proteinpräzipitat durch Zentrifugation sedimentiert. Der Überstand wird mit 1 mol/1 Tris-HCl versetzt (Endkonzentration 25 mmol/1) und der pH- Wert auf pH 9.0 mit HC1 eingestellt. Danach wird das Insulinprecursorprotein mit Lysyl- Endoproteinase (LysC) der Firma Boehriner Mannheim (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland, Kat.-Nr. 1420429) in einer Konzentration von 0,5 bis 2.0 mg/ml Precursor Fusionsprotein und einem Proteinase / Substrat Verhältnis von 1 :100 bis 1 : 1000 bei 20-30°C für 5-24 Std. vollständig verdaut. Der zeitliche Verlauf der enzymatischen Spaltung (Spaltungskinetik) des Fusionsproteins wird anhand der Freisetzung von DesB30-Insulin durch analytische RP HPLC verfolgt.
Beispiel 5
Anreicherung von DesB30-Insulin durch Ionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose ff
Der Spaltungsansatz wird auf eine gegen 25 mmol/1 Tris-HCl, pH 9,0 äquilibrierte Q-Sepharose-ff-Säule (1,5 x 1 1 cm, V = 20 ml; Bεladungskapazität: 10 mg Protein ml Gel) der Firma Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) aufgetragen (2 Säulenvolumen/Stunde. 2 SV/Std.) und so lange mit dem Äquilibrierungspuffεr gεwaschεn, bis diε Absorption des Eluats bei 280 nm den Leerwert des Puffers erreicht. Die Elution des gebundenen Materials erfolgt durch einen Gradienten von 0-300 mmol/1 NaCl in 25 mmol/1 Tris-HCl, pH 9.0 und 30% (v/v) Isopropanol (2 SV/Std.). Die DesB30-Insulin-haltigen Fraktionεn werden vereinigt und das DesB30-Insulin durch Zugabe von Aceton (Endkonzentration 80-90° o (v/v)) präzipitiert. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation sedimentiert und anschließend im Vakuum getrocknet.
Beispiel 6
Enzymatische Konversion von DesB30-Insulin zu Humaninsulin und Reinigung von Humaninsulin
DesB30-Insulin wird entsprechend der von Morihara. K. et al. publizierten Methode mit der Lysyl-Endoproteinase LysC (Boehringer Mannheim GmbH. Mannheim. Deutschland. Kat.- Nr. 1420429) anstelle von Achromobacter Protease I als Katalysator in Humaninsulin überführt (Biochem. J. 240 (1986) 803-810; TIBTECH 5 (1987) 164-170; EPS 17938). Das generierte Humaninsulin wird nach literaturbekannten Methoden durch präparative RP HPLC an Kromasil C-8 (Akzo Nobel AB, Schweden) gereinigt.
Referenzliste
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Clark, A.J. et al., Bio/Technology 7 (1989) 487
EP-A 0 055 945
EP-A 0 279 582
EP-A 0 367 161
EP-A 0 427 296
EP-A 0 600 372
EP-B 0 017 938
EP-B 0 017 983
EP-B 0 089 007
EP-B 0 163 529
EP-B 0 195 691
Hammer. R.E. Nature 315 (1985) 680 - 683
Jänisch. R. Science 240 (1988) 1468 - 1473
Moπhara, K. et al, Biochem. J. 240 (1986) 803 - 810
Morihara. K.: Using proteases in peptidε synthesis. TIBTECH 5 (1987) 164-170
Palmiter. R.D. et al. Ann. Rev. Genet. 20 (1986) 465
Rexroad. C.E. et al., Mol. Reprod. Dεv. (1989) 164
Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Manιatis,T.: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)
Simons. J. et al, Bio/Technology 6 (1988) 179
Sures, L; Goeddel, D.V.; Gray, A.; Ullrich, A.: Nucleotide sequence of human preproinsulin complementary DNA. Science 208 (1980) 57-59
USP 4.873,316 WO 88/10118 WO 96/20724 SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN: i) ANMELDER:
(A) NAME: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
(B) STRASSE: Sandhofer Str. 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: Germany
(F) POSTLEITZAHL: D-68305
(G) TELEFON: 03856/60-3446 (H) TELEFAX: C2356/60-3451
(ii) BEZEICHNUNG DΞ? ERFINDUNG: Verfahren zur Gewinnung von Insulin Precursorproteinen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRAGE?.: Floppy dis
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version *1.30B (EPA)
[ 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID N . . '
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 75 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D TOPOLOGIΞ: linear lii) ART DES MOLEKÜLS: other nucleic acid
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonukleotid ON1"
(xi) SΞQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID MO: 1: CCTTATACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGAT TCTTCTACAC ACCCAAGGGC ATTGTGGAAC 60 AATGCTGTAC CAGCA 75
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SΞQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 77 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: other nucleic acid
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonukleotid ON2" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: TATGCTGGTA CAGCATTGTT CCACAATGCC CTTGGGTGTG TAGAAGAATC CTCGTTCCCC 60 GCACACTAGG TATAAGG 77
(2, ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 297 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Emzelstrar.g
(D) TOPOLOGIE: linear n ART DES MOLEKÜLS: DNA
(Xi) SEQUENZBESCHPEI3UNC: SEQ ID NO: 3:
GAATTCGCTA GCGGGCCCAA GTTTGTTAAC CAACACCTGT GCGGATCCCA CCTGGTGGAG 60
GCCT ATACC TAGTGTGCGG GGAACGAGGA TTCTTCTACA CACCCAAGAC GCGTCGCGAG 120
GCAGAGGACC TGCAAGTGGG GCAGGTGGAG CTCGGCGGGG GACCTGGCGC CGGCAGCCTG 180
CAACCCTTGG CTCTAGAGGG GTCCCTGCAG CGTAAGGGCA TTGTGGAACA ATGCTGTACC 240
AGCATATGCT CCCTCTACCA GCTGGAGAAC TACTGCAACT AGTAACTCGA GAAGCTT 29" (2 ANGA3ΞN ZU SEQ ID NC : x
(X ΞEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 189 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Emzelstrar.σ
(D) TOPOLOGIE: linear n ART DES MOLEKÜLS: cDNA
ixi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GAATTCGCTA GCGGGCCCAA GTTTGTTAAC CAACACCTGT GCGGATCCCA CCTGGTGGAG 6C
GCCTTATACC TAGTGTGCGG GGAACGAGGA TTCTTCTACA CACCCAAGGG CATTGTGGAA 12C
CAATGCTGTA CCAGCATATG CTCCCTCTAC CAGCTGGAGA ACTA.CTGCAA CTAGTAACTC 180 GAGAAGCTT 189

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Gewinnung von Insulin Precursorproteinen aus transgenen Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere für dieses Protein codierende Nukleinsäuren in den männlichen Pronucleus einer befruchteten Eizelle eines Säugetiers einbringt, die Eizellen in den Eileiter des Säugetiers implantiert, die Nachkommen züchtet und aus ihrer Milch das Insulin Precursorprotein gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man die bei der Mikroinjektion verwendeten DNA-Sequεnzεn in linearer Form verwendet.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als codierende Nukleinsäure eine Nukleinsäure verwendet wird, die für ein Precursorprotein der allgemeinen Formel I codiert:
SS-L-X-B( 1 - 29)-A( 1 - 21) (Formel I)
in der bedeuten:
SS: Signalpeptid;
L: Linker, Teil eines natürlicherweise im Tier sezernierten Proteins;
X: Lys;
B(l-29): die ersten 29 Aminosäuren der B-Kette von Insulin;
A( 1 -21 ) : A-Kette von Insulin.
Verfahren zur Herstellung von Insulin aus einem Insulin Precursorprotein der allgemeinen Formel II:
L-X-B( 1 -29)-A( 1-21) (Formel II) in der bedeuten:
L: Linker, Teil eines natürlicherweise im Tier sezernierten Proteins;
X: Lys;
B(l-29): die ersten 29 Aminosäuren der B-Kette von Insulin;
A( 1 -21 ) : A-Kette von Insulin.
durch Spaltung des Precursorproteins mit einer spezifisch nach Lysin spaltenden Endo- proteinase und Umwandlung des so erhaltenen Des-B30-Insulins zu Insulin durch Anfügung von Thr an den C-Terminus der B-Kette von Des-B30-Insulin.
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