DE69735242T2

DE69735242T2 - N-terminal verlängerte proteine exprimiert in hefe

Info

Publication number: DE69735242T2
Application number: DE69735242T
Authority: DE
Inventors: B rglum Thomas KJELDSEN; Svend Havelund; Frost Annette PETTERSSON; Per Balschmidt
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: ES2258797T3; JP2001507574A; JP4187796B2; EP0946735A1; DE69735242D1; EP0946735B1; ATE317443T1; AU7873798A; WO1998028429A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft in Hefe hergestellte Polypeptide, ein DNA-Konstrukt, das eine derartige Polypeptide kodierende DNA-Sequenz umfasst, derartige DNA-Fragmente tragende Vektoren und mit diesen Vektoren transformierte Hefezellen sowie ein Verfahren zur Herstellung heterologer Proteine in Hefe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Hefeorganismen stellen etliche intrazellulär synthetisierte Proteine her, die jedoch eine Funktion außerhalb der Zelle haben. Derartige extrazelluläre Proteine werden als sezernierte Proteine bezeichnet. Diese sezernierten Proteine werden zunächst innerhalb der Zelle in einer Vorläufer- oder Vorform exprimiert, die eine Präpeptidsequenz enthält, welche eine wirksame Führung des exprimierten Produkts über die Membran des Endoplasmatischen Reticulums (ER) gewährleistet. Das normalerweise als Signalpeptid bezeichnete Präpeptid wird im Allgemeinen von dem gewünschten Produkt während der Translokation abgespalten. Sobald das Protein in den sekretorischen Weg eingetreten ist, wird es zum Golgi-Apparat transportiert. Vom Golgi-Apparat kann das Protein verschiedenen Routen folgen, die zu Kompartimenten wie z.B. der Zellvakuole oder der Zellmembran führen, oder es kann aus der Zelle geleitet werden, um ins externe Medium sezerniert zu werden (Pfeffer, S. R. und Rothman, J. E. Ann. Rev. Biochem. 56 (1987), 829–852.
Mehrere Vorgehensweisen wurden für die Expression und Sekretion von für die Hefe heterologen Proteinen in Hefe nahe gelegt. Die Europäische Veröffentlichung Nr. 0088632A beschreibt ein Verfahren, durch das für die Hefe heterologe Proteine durch das Transformieren eines Hefeorganismus mit einem Expressions vektor, der eine das gewünschte Protein und ein Signalpeptid kodierende DNA trägt, das Herstellen einer Kultur des transformierten Organismus, das Züchten der Kultur und Gewinnen des Proteins aus dem Kulturmedium, exprimiert, verarbeitet und sezerniert werden. Bei dem Signalpeptid kann es sich um das eigene Signalpeptid des gewünschten Proteins, d.h. ein heterologes Signalpeptid, oder ein Hybrid eines homologen und eines heterologen Signalpeptids handeln.
Ein bei der Verwendung der für Hefe heterologen Signalpeptide anzutreffendes Problem könnte sein, dass das heterologe Signalpeptid keine wirksame Translokation und/oder Spaltung nach dem Signalpeptid gewährleistet.
Der MFα1 (α-Faktor) von Saccharomyces cerevisiae wird als eine Präproform von 165 Aminosäuren synthetisiert, die eine 19 Aminosäuren langes Signal- oder Präpeptid umfasst, gefolgt von einem 64 Aminosäuren langen „Leader" oder Propeptid, der/das drei N-verknüpfte Glykosylierungsstellen umfasst, gefolgt von (LysArg(Asp/Glu, Ala)_2-3α-Faktor)₄ (Kurjan, J. und Herskowitz, I. Cell 30 (1982), 933–943). Der Signal-Leader-Teil des Präpro-MFα1 wurde weitgehend verwendet, um die Synthese und Sekretion heterologer Proteine in S. cerevisiae zu erzielen.
Die Verwendung von für die Hefe homologen Signal-/Leaderpeptiden ist unter anderem von dem US-Patent Nr. 4,546,082, den Europäischen Veröffentlichungen Nr. 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163529A, 0123289A, dem Europäischen Patent Nr. 0100561B und der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/02059 bekannt.
In EP 0123289A ist die Verwendung des α-Faktor-Vorläufers von S. cerevisiae beschrieben, während EP 0100561 die Verwendung des PHO5-Signals von Saccharomyces cerevisiae und WO 95/02059 die Verwendung des YAP3-Signalpeptids zur Sekretion fremder Proteine beschreibt.
Das US-Patent Nr. 4,546,082 und die Europäischen Veröffentlichungen Nr. 0016201A, 0123294A, 0123544A und 0163529A beschreiben Verfahren, durch welche der Signal-Leader des α-Faktors von Saccharomyces cerevisiae (MFα1 oder MFα2) in dem Sekretionsverfahren der exprimierten heterologen Proteine in Hefe verwendet wird. Die Sekretion und Verarbeitung des gewünschten Proteins wurde durch Fusionieren einer DNA-Sequenz, die das Signal-/Leaderpeptid des MFα1 von S. cerevisiae kodiert, am 5'-Ende des Gens des gewünschten Proteins demonstriert.
EP 0206783 offenbart ein System zur Sekretion von Polypeptiden von S. cerevisiae, wobei die Signal-/Leadersequenz des α-Faktors zur Beseitigung der in der natürlichen Sequenz vorliegenden vier α-Faktor-Peptide verkürzt wurde, um das Signal-/Leaderpeptid selbst, das mit einem heterologen Polypeptid über die Verarbeitungsstelle Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala des α-Faktors fusioniert ist, zu hinterlassen. Es ist beschrieben, dass diese Konstruktion zu einem wirksamen Verfahren zur Herstellung kleinerer Peptide (weniger als 50 Aminosäuren) führt. Zur Sekretion und Verarbeitung größerer Polypeptide wurde die Leadersequenz des natürlichen α-Faktors verkürzt, um ein oder zwei α-Faktor-Peptide zwischen dem Leaderpeptid und dem Polypeptid zu hinterlassen.
Etliche sezernierte Proteine werden gesteuert, so dass der Vorläufer einem proteolytischen Verarbeitungssystem, das die Peptidbindung am Carboxyende von zwei aufeinander folgenden basischen Aminosäuren spalten kann, ausgesetzt ist. Diese enzymatische Aktivität ist in S. cerevisiae durch das Gen KEX 2 kodiert (Julius, D. A. et al., Cell 37 (1984b), 1075). Die Verarbeitung des Produkts durch die Protease KEX 2 ist zur Sekretion des aktiven Paarungsfaktors α1 (MFα1 oder α-Faktor) von S. cerevisiae erforderlich, ist jedoch nicht an der Sekretion des aktiven Paarungsfaktors a von S. cerevisiae beteiligt.
Die Sekretion und korrekte Verarbeitung eines zur Sekretion bestimmten Polypeptids wird in manchen Fällen erzielt, wenn ein Hefeorganismus, der mit einem Vektor transformiert ist, der wie in den vorstehend aufgeführten Dokumenten angegeben konstruiert wurde, kultiviert wird. In vielen Fällen ist jedoch der Wert der Sekretion sehr gering oder die Sekretion unterbleibt oder die proteolytische Verarbeitung kann fehlerhaft oder unvollständig sein. Wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/10075 beschrieben wird vermutet, dass dies zum Teil einem unzureichenden Aussetzen der Verarbeitungsstelle, die zwischen dem C-terminalen Ende des Leaderpeptids und dem N-terminalen Ende des heterologen Proteins vorliegt, zuzuschreiben ist, um sie der proteolytischen Spaltung, unter anderem der Spaltung durch die Protease KEX 2 unzugänglich oder weniger zugänglich zu machen.
WO 90/10075 beschreibt ein Hefeexpressionssystem mit verbesserter Verarbeitung eines heterologen Polypeptids, die durch die Bereitstellung bestimmter Modifikatiopen nahe der Verarbeitungsstelle am C-terminalen Ende des Leaderpeptids und/oder des N-terminalen Endes eines mit dem Leaderpeptid fusionierten heterologen Polypeptids erzielt wird. Somit ist es möglich, eine höhere Ausbeute an korrekt verarbeitetem Protein zu erhalten, als es mit nicht modifizierten Konstruktionen aus Leaderpeptid und heterologem Polypeptid erhältlich ist.
Des Weiteren beschreibt WO 95/35384 DNA-Konstrukte, die Polypeptide mit Modifikationen des N-terminalen Endes des heterologen Polypeptids kodieren, die als Verlängerungen entworfen sind, die durch Hefeproteasen vor der Reinigung aus den Kulturmedien oder durch Proteolyse in vitro während oder im Anschluss an die Reinigung des Produkts aus dem Kulturmedium abgespalten werden können. Die Polypeptide weisen die Formel Signalpeptid-Leaderpeptid-X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-heterologes Protein auf, wobei X¹-X² eine zweibasige Verarbeitungsstelle der Hefeprotease, wie z.B. Lys-Arg, definiert und wobei die Sequenz X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷ nicht EEGEPK umfasst.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Verbesserung von Modifikationen des N-terminalen Endes des heterologen Polypeptids, die als Verlängerungen entworfen sind, welche durch Proteolyse in vitro während oder im Anschluss an die Reinigung des Produkts aus dem Kulturmedium abgespalten werden können, was zu höheren Ausbeuten eines homogenen heterologen Proteinprodukts führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Konstrukt, das eine Polypeptidsequenz mit der folgenden Struktur
SP-LP-EEGEPK-*Polypeptid*
kodiert, wobei SP eine DNA-Sequenz ist, die ein Signalpeptid kodiert,
LP eine DNA-Sequenz ist, die ein Leaderpeptid kodiert und
EEGEPK eine Aminosäuresequenz ist, die als eine N-terminale Verlängerung des folgenden *Polypeptids*, bei dem es sich um ein herzustellendes Protein oder anderes Polypeptid handelt, lokalisiert ist.
...führt zu einer verbesserten Ausbeute an heterologem Protein, was möglicherweise eine verbesserte Translokation und/oder Sekretion widerspiegelt, da Glycin mit nur einem Wasserstoffatom als Seitenkette eine viel größere Vielfalt an Konformationen als andere Aminosäurereste annehmen kann, was somit ungewöhnliche Hauptkettenkonformationen und möglicherweise einen instabileres/n Vorläufer-Polypeptid und Sekretionsverlauf ermöglicht.
Die Sequenz EEGEPK bildet eine Verlängerung am N-Terminus des heterologen Polypeptids. Diese Verlängerung erhöht nicht nur die Fermentationsausbeute, sondern ist gegen die Verarbeitung durch die Dipeptidyl-Aminopeptidase (DPAP A) geschützt, was zu einem homogenen N-Terminus des Polypeptids führt. Die Verlängerung ist derart konstruiert, dass sie gegen proteolytische Spaltung während der Fermentation resistent ist, so dass das N-terminal verlängerte heterologe Proteinprodukt aus dem Kulturmedium zur anschließenden proteolytischen Rei fung in vitro, z.B. durch eine für basische Aminosäuren spezifische Protease, wie z.B. Trypsin oder die Protease I von Achromobacter lyticus, gereinigt werden kann. Die gewünschte Entfernung der N-terminalen Verlängerung EEGEPK in vitro wird entweder durch Trypsin oder Protease I von Achromobacter lyticus einfach bewerkstelligt, vermutlich aufgrund der Flexibilität des N-terminalen Verlängerungspeptids, was zu einer verbesserten Ausbeute an gereiftem heterologen Protein führt.
Im vorliegenden Zusammenhang ist es selbstverständlich, dass der Begriff „Signalpeptid" ein Präpeptid bedeutet, das als eine N-terminale Sequenz der Vorläuferform eines in Hefe exprimierten, extrazellulären Proteins vorliegt. Die Funktion des Signalpeptids besteht darin, dem zu sezernierenden heterologen Protein es zu ermöglichen, in das Endoplasmatische Reticulum einzudringen. Das Signalpeptid wird normalerweise im Laufe dieses Vorgangs abgespalten. Das Signalpeptid kann zu dem das Protein herstellenden Hefeorganismus heterolog oder homolog sein. Ein bevorzugtes Signalpeptid in dieser Erfindung ist das Signalpeptid der Aspartat-Protease 3 von Hefe (YAP3). YAP3 wurde von Egel-Mitani, M. et al., YEAST 6, S. 127–137, 1990, kloniert und charakterisiert.
Der Ausdruck „Leaderpeptid" wird als eine Bezeichnung einer Polypeptidsequenz verstanden, deren Funktion darin besteht, dem zu sezernierenden heterologen Protein es zu ermöglichen, vom Endoplasmatischen Reticulum zum Golgi-Apparat und weiter zu einem sekretorischen Vesikel zur Sekretion ins Medium (d.h. zum Export des exprimierten Proteins oder Polypeptids über die Zellwand oder mindestens durch die zelluläre Membran in den periplasmatischen Raum der Zelle) geleitet zu werden. Vorzugweise ist das in der vorliegenden Erfindung verwendete Leaderpeptid ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Leaderpeptiden

die als SEQ ID NR. 1 bis 28 bezeichnet sind, welche in WO 95/34666 offenbart sind, und alle C-terminal von einer Lys-Arg-Sequenz und einem beliebigen funktionellen Analogon davon gefolgt werden, und stärker bevorzugt weist das Leaderpeptid eine Aminosäuresequenz von 43 oder mehr Aminosäuren auf, wie z.B. das Leaderpeptid (LA 19):
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAlaLysArg, das als SEQ ID Nr. 67 in WO 95/34666 bezeichnet wird und das die C-terminale LysArg-Verarbeitungsstelle einschließt. In dem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung enthält das Leaderpeptid vorzugsweise eine Endoprotease-Verarbeitungsstelle am C-terminalen Ende, wie z.B. eine Lys-Arg-Sequenz.
Noch stärker bevorzugte, durch die DNA-Konstrukte der Erfindung kodierte Leaderpeptide sind
Der Ausdruck „heterologes Protein" ist dafür bestimmt, ein Protein oder Polypeptid zu bezeichnen, das durch den Wirishefeorganismus in der Natur nicht hergestellt wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins in Hefe, das das Züchten des transformierten Hefestams in einem geeigneten Medium umfasst, um die Expression und Sekretion des heterologen Proteins zu erzielen, danach wird das Protein aus dem Medium isoliert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem durch das Verfahren der Erfindung hergestellte, N-terminal verlängerte heterologe, Protein kann es sich um ein beliebiges Protein handeln, das vorteilhaft in Hefe hergestellt werden kann. Beispiele derartiger Proteine sind Aprotinin, Gewebefaktorweghemmer oder andere Proteasehemmer und Insulin oder Insulinvorläufer, Insulinanaloga, insulinartige Wachstumsfaktoren, wie z.B. IGF I und IGF II, Human- oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, Gewebeplasminogenaktivator, Glucagon, glucagonartiges Peptid 1 (GLP 1), glucagonartiges Peptid 2 (GLP 2), GRPP, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor XIII, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor, Enzyme, wie z.B. Lipasen. Bei den bevorzugten Proteinen handelt es sich um Vorläufer von Insulin oder insulinartigen Wachstumsfaktoren und Peptiden der Proglucagon-Familie, wie z.B. Glucagon, GLP 1, GLP 2 und GRPP, einschließlich verkürzter Formen, wie z.B. GLP-1(1-45), GLP-1(1-39), GLP-(1-38), GLP-1(1-37), GLP-1(1-36), GLP-1(1-35), GLP-1(1-34), GLP-1(7-45), GLP-1(7-39), GLP-1(7-38), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36), GLP-1(7-35) und GLP-1(7-34).
In dem vorliegenden Zusammenhang ist der Begriff „funktionelles Analogon" dafür bestimmt, ein Polypeptid mit einer ähnlichen Funktion wie das natürliche Protein zu bezeichnen (dies ist eher in Bezug auf die Natur als den Wert der biologischen Aktivität des natürlichen Proteins zu verstehen). Das Polypeptid kann dem natürlichen Protein strukturell ähnlich sein und von dem natürlichen Protein durch Anhängen eines oder mehrerer Aminosäuren entweder am C- oder N-terminalen oder sowohl am C- als auch am N-terminalen Ende des natürlichen Proteins, durch Substitution eines oder mehrerer Aminosäuren an einer oder etlichen verschiedenen Stellen in der natürlichen Aminosäuresequenz, durch Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren an einem oder beiden Enden des natürlichen Proteins oder an einer oder einigen Stellen in der Aminosäuresequenz, oder durch Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der natürlichen Aminosäuresequenz abgeleitet sein. Derartige Modifikationen sind für einige der vorstehend erwähnten Proteine bekannt.
Die Vorläufer von Insulin, einschließlich des Proinsulins sowie die Vorläufer mit verkürztem und/oder modifiziertem C-Peptid oder gänzlich fehlendem C-Peptid, die Vorläufer von Insulinanaloga, und insulinverwandte Peptide, wie z.B. insulinartige Wachstumsfaktoren, können menschlichen Ursprungs sein oder von anderen Tieren und rekombinanten oder halbsynthetischen Quellen stammen. Die cDNA(s), die zur Expression der Vorläufer von Insulin, der Vorläufer von Insulinanaloga oder insulinverwandter Peptide in dem Verfahren der Erfindung verwendet wurden, schließen Formen mit optimierten Codons zur Expression in Hefe ein.
Unter „einem Vorläufer von Insulin" oder „einem Vorläufer eines Insulinanalogons" ist ein einzelkettiges Polypeptid zu verstehen, das durch ein oder mehrere aufeinander folgende chemische und/oder enzymatische Verfahren in ein zweikettiges Molekül des Insulins oder Insulinanalogons mit korrekter Etablierung der drei Disulfidbrücken, wie sie in dem natürlichen Humaninsulin vorkommen, umgewandelt werden kann. Bei den bevorzugten Insulinvorläufern handelt es sich um B(1-29)-A(1-21), bezeichnet als MI1; B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), bezeichnet als MI3 (wie z.B. in EP 163 529 beschrieben); B(1-27-Asp-Lys)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), bezeichnet als X14 (wie z.B. in der PCT-Veröffentlichung Nr. 95/00550 beschrieben); B(1-27-Asp-Lys)-A(1-21); B(1-27-Asp-Lys)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21); B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21) (wie z.B. in der PCT-Veröffentlichung Nr. 95/07931 beschrieben); B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21), bezeichnet als MI5; und B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21); und stärker bevorzugt B(1-29)-A(1-21), bezeichnet als MI1; B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), das als MI3 bezeichnet wird; und B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21), bezeichnet als MI5.
Beispiele von Insulinen und Insulinanaloga, die auf diese Weise hergestellt werden können, sind das Humaninsulin, vorzugsweise Des(B30)-Humaninsulin, Schweineinsulin und Insulinanaloga, wobei mindestens ein Lys oder Arg vorliegt, vorzugsweise Insulinanaloga, wobei Phe⁸¹ entfernt wurde, Insulinanaloga, wobei die A-Kette und/oder die B-Kette eine N-terminale Verlängerung aufweisen, und Insulinanaloga, wobei die A-Kette und/oder die B-Kette eine C-terminale Verlängerung aufweisen. Bei den anderen bevorzugten Insulinanaloga handelt es sich um derartige, worin ein oder mehrere der Aminosäurereste, vorzugsweise ein, zwei oder drei davon durch einen anderen kodierbaren Aminosäurerest ersetzt wurden. Somit kann an Position A21 ein Ausgangsinsulin statt Asn einen Aminosäurerest aufweisen, der ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr oder Val, insbesondere einen Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Gly, Ala, Ser und Thr. Die Insulinanaloga können auch durch eine Kombination von den vorstehend er läuterten Änderungen modifiziert werden. Desgleichen kann an Position B28 ein Ausgangsinsulin statt Pro einen Aminosäurerest aufweisen, der ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Asp und Lys, vorzugsweise Asp, und an Position B29 ein Ausgangsinsulin statt Lys die Aminosäure Pro aufweisen. Der Ausdruck „ein kodierbarer Aminosäurerest" wie hierin verwendet bezeichnet einen Aminosäurerest, der durch den genetischen Code, d.h. ein Triplett („Codon") von Nukleotiden kodiert werden kann.
Das DNA-Konstrukt der Erfindung, das das Polypeptid der Erfindung kodiert, kann durch etablierte Standardverfahren, z.B. das Phosphoramidit-Verfahren, das von S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, S. 1859– 1869, beschrieben ist, oder das Verfahren, das von Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, S. 801–805, beschrieben ist, synthetisch hergestellt werden. Gemäß dem Phosphoramidit-Verfahren werden die Oligonukleotide synthetisiert, z.B. in einem automatischen DNA-Synthesizer, gereinigt, verdoppelt und ligiert, um das synthetische DNA-Konstrukt zu bilden. Ein derzeit bevorzugter Weg zur Herstellung des DNA-Konstrukts ist durch die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Bei dem DNA-Konstrukt der Erfindung kann es sich ebenso um einen genomischen oder cDNA-Ursprung handeln und zum Beispiel durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Genbank und Durchmustern der DNA-Sequenzen, die alle oder einen Teil der Polypeptide der Erfindung kodieren, durch Hybridisierung unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden gemäß den Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989) erhalten werden. In diesem Fall kann die genomische oder cDNA-Sequenz, die ein Signal- und Leaderpeptid kodiert, mit einer das heterologe Protein kodierenden genomischen oder cDNA-Sequenz verbunden werden, danach kann die DNA-Sequenz an einer Stelle, die der Aminosäuresequenz EEGEPK des Polypeptids entspricht, durch Einfügen synthetischer Oligonukleo tide, die die gewünschte Aminosäuresequenz zur homologen Rekombination gemäß der bekannten Verfahren kodieren, oder vorzugsweise durch Erzeugen der gewünschten Sequenz durch PCR unter Verwendung geeigneter Oligonukleotide modifiziert werden.
Schließlich kann es sich bei dem DNA-Konstrukt um einen gemischten synthetischen und genomischen, gemischten synthetischen und cDNA-, oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprung handeln, das durch Hybridisieren von Fragmenten mit synthetischem, genomischem oder cDNA-Ursprung (dementsprechend), wobei die Fragmente den verschiedenen Teilen des gesamten DNA-Konstrukts entsprechen, gemäß den Standardverfahren hergestellt wird. Somit ist es vorstellbar, dass die das heterologe Protein kodierende DNA-Sequenz einen genomischen oder cDNA-Ursprung haben kann, während die das Signal- und Leaderpeptid kodierende Sequenz sowie die Sequenz, die die N-terminale Verlängerung EEGEPK kodiert, synthetisch hergestellt werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor, der in Hefe replizieren kann und der ein DNA-Konstrukt trägt, das das vorstehend definierte Polypeptid kodiert. Bei dem rekombinanten Expressionsvektor kann es sich um einen beliebigen Vektor handeln, der in Hefeorganismen replizieren kann. In dem Vektor sollte die das Polypeptid der Erfindung kodierende DNA-Sequenz funktionsfähig mit einer geeigneten Promotersequenz verbunden sein. Bei dem Promoter kann es sich um eine beliebige DNA-Sequenz handeln, die in Hefe eine Transkriptionsaktivität zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die zur Hefe entweder homologe oder heterologe Proteine kodieren. Der Promoter ist vorzugsweise von einem Gen abgeleitet, das ein zur Hefe homologes Protein kodiert. Beispiele von geeigneten Promotoren sind die Mα1-, TPI-, ADH- oder PGK-Promotoren von Saccharomyces cerevisiae.
Die das Polypeptid der Erfindung kodierende DNA-Sequenz kann ebenso mit einem geeigneten Terminator, z.B. dem TPI-Terminator (vgl. T. Alber und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, S. 419–434), funktionell verbunden sein.
Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung umfasst eine DNA-Sequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in Hefe zu replizieren. Beispiele derartiger Sequenzen sind die Replikationsgene REP 1–3 und der Replikationsursprungspunkt des Hefeplasmids 2μ. Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker, z.B. das TPI-Gen von Schizosaccharomyces pombe umfassen, wie von P. R. Russell, Gene 40, 1985, S. 125–130, beschrieben wurde.
Die Verfahren, die verwendet wurden, um die DNA-Sequenzen, welche die Polypeptide der Erfindung kodieren, den Promoter und den Terminator jeweils zu ligieren und sie in einen geeigneten Hefevektor einzufügen, der die zur Hefereplikation erforderlichen Informationen enthält, sind dem Fachmann bekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., angegebenes Werk). Es wird selbstverständlich sein, dass der Vektor entweder zunächst durch Herstellen eines DNA-Konstrukts, das die gesamte, das Polypeptid der Erfindung kodierende DNA-Sequenz enthält, und anschließendes Einfügen dieses Fragments in einen geeigneten Expressionsvektor, oder durch aufeinander folgendes Einfügen von DNA-Fragmenten, die die genetische Information für die einzelnen Elemente (wie z.B. das Signal, den Leader oder das heterologe Protein) enthalten, gefolgt durch Ligation konstruiert werden kann.
Bei dem Hefeorganismus, der in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann es sich um einen beliebigen Hefeorganismus handeln, der nach Züchtung große Mengen des fraglichen heterologen Proteins oder Polypeptids herstellt. Beispiele geeigneter Hefeorganismen können Stämme sein, die aus den folgenden Hefestämmen ausgewählt sind: Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. und Geotrichum fermentans. Ein Fachmann wird es als nahe liegend ansehen, eine beliebige andere Pilzzelle, wie z.B. Zellen der Gattung Aspergillus, als Wirtsorganismus auszuwählen.
Die Transformation der Hefezellen kann zum Beispiel durch Protoplastenbildung, gefolgt von der Transformation in einer an sich bekannten Art und Weise bewerkstelligt werden. Bei dem zum Züchten der Zellen verwendeten Medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium handeln, das für das Wachstum von Hefeorganismen geeignet ist. Das sezernierte heterologe Protein, von dem ein wesentlicher Teil im Medium in einer korrekt verarbeiteten Form vorliegen wird, kann aus dem Medium durch herkömmliche Verfahren gewonnen werden, die das Abtrennen der Hefezellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, das Fällen proteinöser Komponenten des Überstands oder Filtrats mit Hilfe von einem Salz, z.B. Ammoniumsulfat, gefolgt von der Reinigung durch eine Vielfalt chromatographischer Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, einschließen.
Nach der Sekretion in das Kulturmedium kann das Protein verschiedenen Verfahren unterzogen werden, um die Sequenz EEGEPK zu entfernen.
Es ist festzustellen, dass die Verlängerung stabil an das heterologe Protein während der Fermentation angeknüpft ist, die den N-Terminus des heterologen Proteins gegen die proteolytische Aktivität der Hefeproteasen, wie z.B. DPAP, schützt. Die Anwesenheit der N-terminalen Verlängerung an dem heterologen Protein kann ebenso als ein Schutz der N-terminalen Aminogruppe des heterologen Proteins während der chemischen Verarbeitung des Proteins dienen, d.h. es kann als ein Ersatz für eine BOC (t-Butyloxycarbonyl)- oder ähnliche Schutzgruppe dienen. In derartigen Fällen kann die Aminosäuresequenz EEGEPK von dem gewonnenen heterologen Protein mit Hilfe eines proteolytischen Enzyms, das für eine basische Aminosäure (d.h. K (Lys)) spezifisch ist, entfernt werden, so dass die endständige Verlängerung an dem K abgespalten wird. Beispiele derartiger proteolytischer Enzyme sind das Trypsin oder die Protease I von Achromobacter lyticus.
Die vorliegende Erfindung ist in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben, die in keiner Weise dafür bestimmt sind, den beanspruchten Umfang der Erfindung zu begrenzen.
Die Erfindung ist unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, wobei
1 das Expressionsplasmid pAK773 zeigt, das Gene enthält, die die N-terminal verlängerten Polypeptide der Erfindung exprimieren. In 1 sind die folgenden Symbole verwendet:
TPI-PROMOTER: Bezeichnet die Promotersequenz des TPI-Gens von S. cerevisiae.
2: Bezeichnet die Region, die ein Signal-/Leaderpeptid kodiert (z.B. von dem YAP3-Signalpeptid und LA19-Leaderpeptid in Verbindung mit dem durch EEGEPK N-terminal verlängerten MI3-Insulinvorläufer).
TPI-TERMINATOR: Bezeichnet die Terminatorsequenz des TPI-Gens von S. cerevisiae.
TPI-POMBE: Bezeichnet das TPI-Gen von S. pombe.
Origin: Bezeichnet eine Sequenz des 2μ-Plasmids von S. cerevisiae, die seinen Ursprungspunkt der DNA-Replikation in S. cerevisiae einschließt.
AMP-R: Sequenz aus pBR322/pUC13, die das Ampicillin-Resistenzgen und einen Ursprungspunkt der DNA-Replikation in E. coli einschließt.
2 die DNA- und Aminosäuresequenzen in pAK773 zeigt, die das YAP3-Signalpeptid (Aminosäure Nr. 1 bis 21), das LA19-Leaderpeptid (Aminosäure Nr. 22 bis 64), die N-terminale Verlängerung EEGEPK (Aminosäure Nr. 65 bis 70), den MI3-Insulinvorläufer B_Kette(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_Kette(1-21) (Aminosäure Nr. 71 bis 123) kodiert.
3 das Expressionsplasmid pAK729 zeigt, das Gene enthält, die die N-terminal verlängerten Polypeptide der Erfindung exprimieren, und die folgenden Symbole verwendet sind:
TPI-PROMOTER: Bezeichnet die Promotersequenz des TPI-Gens von S. cerevisiae.
2: Bezeichnet die Region, die ein Signal-/Leaderpeptid kodiert (z.B. von dem YAP3-Signalpeptid und LA19-Leaderpeptid in Verbindung mit dem durch EEGEPK N-terminal verlängerten MI3-Insulinvorläufer).
TPI-TERMINATOR: Bezeichnet die Terminatorsequenz des TPI-Gens von S. cerevisiae.
TPI-POMBE: Bezeichnet das TPI-Gen von S. pombe.
Origin: Bezeichnet eine Sequenz des 2μ-Plasmids von S. cerevisiae, die seinen Ursprungspunkt der DNA-Replikation in S. cerevisiae einschließt.
AMP-R: Sequenz aus pBR322/pUC13, die das Ampicillin-Resistenzgen und einen Ursprungspunkt der DNA-Replikation in E. coli einschließt.
Beispiel
Konstruktion des den EEGEPK-MI3-Insulinvorläufer exprimierenden Hefestamms yAK773
Ein synthetisches Gen, das die N-terminale Verlängerung des N-terminal verlängerten Insulinvorläufers EEGEPK-MI3 kodiert, wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) konstruiert.
Es wurden die folgenden 2 Oligonukleotide synthetisiert:
#724 5'-GATCTCCATGGCTAAGAGAGAAGAAXYTGAACCAAAGTTCGTTAACC-3',
wobei X für A oder G und Y für T, A oder G steht, und
#2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3'
Die Oligonulcleotide wurden unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers (Applied Biosystems Modell 380A) unter Verwendung der Phosphoramidit-Chemie und der im Handel erhältlichen Reagenzien synthetisiert (Beaucage, S. L. und Caruthers, M. H. Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859–1869).
Die folgende PCR wurde unter Verwendung des Enzymgemischs „Expand High Fidelity" (Boehringer Mannheim GmbH, Sandhoefter Straße 116, Mannheim, Deutschland) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Das PCR-Gemisch wurde mit 100 μl Mineralöl (Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA) überschichtet.
PCR

5 μl Oligonukleotid #724 (gesamt 100 pMol)
5 μl Oligonukleotid #2371 (gesamt 100 pMol)
10 μl 10x PCR-Puffer
8 μl dNTP-Gemisch
0,75 μl Enzymgemisch „Expand High Fidelity"
0,5 μl pAK729-Plasmid als Matrize (0,2 μg DNA)
70,75 μl destilliertes Wasser

Insgesamt wurden 18 Zyklen durchgeführt, ein Zyklus war 94°C für eine Dauer von 45 Sek.; 37°C für eine Dauer von 1 min; 72°C für eine Dauer von 1,5 min. Das PCR-Gemisch wurde dann auf ein 2,5%iges Agarosegel aufgetragen und die Elektrophorese wurde unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook, J., Fritsch E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) durchgeführt. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und mit dem „Gene Clean Kit" (Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) gemäß den Herstellerangaben isoliert.
Das gereinigte PCR-DNA-Fragment wurde in 14 μl Wasser und Restriktionsendonuklease-Puffer gelöst und mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und XbaI gemäß den Standardver-fahren (Sambrook, J., Fritsch E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) gespalten. Das NcoI-XbaI-DNA-Fragment von 209 Nukleotidbasenpaaren wurde der Agarose-Elektrophorese unterzogen und unter Verwendung des „Gene Clean Kit" wie beschrieben gereinigt.
Das Plasmid pAK721 (siehe 3) wurde mit den Restriktionsendonukleasen BglII und XbaI gespalten und das Vektorfragment von 10849 Nukleotidbasenpaaren unter Verwendung des „Gene Clean Kit" wie beschrieben isoliert.
Das Plasmid pAK721 wurde mit den Restriktionsendonukleasen BglII und NcoI gespalten und das DNA-Fragment von 160 Nukleotidbasenpaaren unter Verwendung des „Gene Clean Kit" wie beschrieben isoliert.
Die drei DNA-Fragmente wurden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase und Standardverfahren (Sambrook, J., Fritsch E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) zusammenligiert. Das Ligationsgemisch wurde dann in einen kompetenten Stamm von E. coli (R–, M+) transformiert, gefolgt von der Selektion durch Ampicillin-Resistenz.
Das Plasmid des so erhaltenen E. coli wurde unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook, J., Fritsch E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) isoliert und bezüglich der Insertion mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen, d.h. BglII und NheI, geprüft. Durch DNA-Sequenzanalyse (Sequenzee, U.S. Biochemical Corp., USA) wurde gezeigt, dass das selektierte Plasmid die korrekte DNA-Sequenz der DNA des EEGEPK-MI3-Insulinvorläufers kodiert und dass es nach der DNA eingefügt ist, die die synthetische LA19-Leader-DNA kodiert.
Das Plasmid wurde als pAK773 bezeichnet.
Die DNA-Sequenz, die den YAP3-Signalpeptid-LA19-Leader-EEGEPK-MI3-Insulinvorläufer-Komplex kodiert, ist in 2 gezeigt.
Das Plasmid pAK773 wurde in den Stamm MT663 von S. cerevisiae wie in PCT/DK95/00250 beschrieben transformiert und der so erhaltene Stamm als yAK773 bezeichnet.
Das Hefe-Expressionsplasmid pAK773 ist vom C-POT-Typ (siehe 1) und ist jenen in WO EP 171 142 beschriebenen ähnlich, die das Triosephosphat-Isomerase-Gen von Schizosaccharomyces pombe (POT) zur Plasmidselektion und -stabilisierung in S. cerevisiae enthalten. pAK773 enthält ebenso den Triosephosphat-Isomerase-Promoter und -Terminator von S. cerevisiae. Der Promoter und Terminator sind jenen in dem Plasmid pKFN1003 (in WO 90/100075 beschrieben) wie alle Sequenzen im Plasmid ähnlich, mit Ausnahme der Sequenz zwischen dem EcoRI-XbaI-Fragment, das den YAP3-Signalpeptid-LA19-Leaderpeptid-EEGEPK-MI3-Insulinvorläufer kodiert.
SEQUENCE LISTING

Claims

DNA-Konstrukt, das eine Polypeptidsequenz mit der folgenden Struktur SP-LP-EEGEPK-*Polypeptid* kodiert, wobei SP eine ein Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz ist, LP eine ein Leaderpeptid kodierende DNA-Sequenz ist und EEGEPK eine Aminosäuresequenz ist, die als N-terminale Verlängerung des folgenden *Polypeptids*, bei welchem es sich um ein herzustellendes Protein oder ein anderes Polypeptid handelt, lokalisiert ist.
DNA-Konstrukt nach dem vorangehenden Anspruch, wobei SP eine DNA-Sequenz ist, die aus der Gruppe von DNA-Sequenzen ausgewählt ist, die das Signalpeptid des α-Faktors von S. cerevisiae, das Signalpeptid der Speichel-Amylase der Maus, das Signalpeptid der Carboxypeptidase der Hefe, das Signalpeptid der Aspartam-Protease 3 (YAP3) der Hefe oder das BAR1-Signalpeptid der Hefe kodieren.
DNA-Konstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei SP eine DNA-Sequenz ist, die das Signalpeptid der Aspartam-Protease 3 (YAP3) der Hefe kodiert.
DNA-Konstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei LP eine DNA-Sequenz ist, die ein synthetisches Leaderpeptid mit 43 Aminosäuren oder mehr kodiert.
DNA-Konstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei LP eine DNA-Sequenz ist, die ein synthetisches Leaderpeptid der Formel X1-PIDDTESNTTSVNLMADDTES-X2-FATNTT-X3-LDVV-X4-LISMAKR kodiert, wobei X1 mindestens eine Aminosäure ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V und Y; X2 eine Peptidbindung oder eine oder mehrere Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y; X3 1 bis 10 Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y; und X4 eine Peptidbindung oder eine oder zwei Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei X1 eine Aminosäure ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q und S.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei X2 eine Aminosäure ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R und A.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei X3 eine Sequenz aus zwei bis fünf Aminosäuren ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LA. LAGG, SVGG, NSGG, LADGG, LADD und LAGD.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei X4 eine Aminosäure ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N und G.
DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1–5, wobei LP eine DNA-Sequenz ist, die ein synthetisches Leaderpeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, wobei LP eine DNA-Sequenz ist, die das synthetische Leaderpeptid (LA19) kodiert: GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAlaLysArg.
DNA-Konstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das *Polypeptid* ein heterologes Protein ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 12, wobei das heterologe Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aprotinin, Gewebefaktorweghemmer oder anderen Proteasehemmern, insulinartigem Wachstumsfaktor I oder II, Human- oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, Gewebeplasminogenaktivator, Proglucagon und von Proglucagon abgeleiteten Polypeptiden, Glucagon, glucagonartigem Peptid 1, glucagonartigem Peptid 2, GRPP, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor XIII, von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor, Enzymen, Insulin oder einem Insulinvorläufer.
DNA-Konstrukt nach dem vorangehenden Anspruch, wobei die von Proglucagon abgeleiteten Polypeptide ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus GLP-1(1-45), GLP-1(1-39), GLP-1(1-38), GLP-1(1-37), GLP-1(1-36), GLP-1(1-35), GLP-1(1-34), GLP-1(7-45), GLP-1(7-39), GLP-1(7-38), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36), GLP-1(7-35) und GLP-1(7-34).
DNA-Konstrukt nach Anspruch 13, wobei das heterologe Protein Insulin oder ein Insulinvorläufer, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus B(1-29)-A(1-21); B(1-27-Asp-Lys)-Ala-Ala-Lys-A(1-21): B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21); und B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21) ist.
DNA-Konstrukt wie hier in 2 beschrieben.
Polypeptid mit der Sequenz EEGEPK-*Polypeptid*, wobei EEGEPK die N-terminale Verlängerung des folgenden *Polypeptids* ist, bei welchem es sich um ein Protein oder ein anderes herzustellendes Polypeptid handelt.
Polypeptid nach Anspruch 17, wobei das *Polypeptid* ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aprotinin, Gewebefaktorweghemmer oder anderen Proteasehemmern, insulinartigem Wachstumsfaktor I oder II, Human- oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, Gewebeplasminogenaktivator, Proglucagon und von Proglucagon abgeleiteten Polypeptiden, Glucagon, glucagonartigem Peptid 1, glucagonartigem Peptid 2, GRPP, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor XIII, von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor, Enzymen, Insulin oder einem Insulinvorläufer.
Polypeptid nach Anspruch 18, wobei die von Proglucagon abgeleiteten Polypeptide ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus GLP-1(1-45), GLP-1(1-39), GLP-1(1-38), GLP-1(1-37), GLP-1(1-36), GLP-1(1-35), GLP-1(1-34), GLP-1(7-45), GLP-1(7-39), GLP-1(7-38), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36), GLP-1(7-35) und GLP-1(7-34).
Polypeptid nach Anspruch 18, wobei das *Polypeptid* Insulin oder ein Insulinvorläufer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus B(1-29)-A(1-21); B(1-27-Asp-Lys)-Ala-Ala-Lys-A(1-21); B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21); und B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21) ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, der in Hefe replizieren kann und ein DNA-Konstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche 1–16 trägt, das funktionsfähig mit einer Promotersequenz, vorzugsweise die TPI-Promotersequenz, sowie mit einer Terminatorsequenz, vorzugsweise die TPI-Terminatorsequenz verbunden ist, die zur Expression in Hefe geeignet sind.
Hefezelle, die ein heterologes Protein exprimieren kann und mit einem Vektor nach Anspruch 21 transformiert wird.
Hefezelle nach Anspruch 22, die zu einer beliebigen der Spezies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizisaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha und Yarrowia lipolytica gehört.
Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins, umfassend das Züchten einer Hefezelle nach einem der Ansprüche 22 oder 23 in einem geeigneten Medium unter Erhalt der Expression und Sekretion des heterologen Proteins, wonach das Protein aus dem Kulturmedium isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Aminosäuresequenz EEGEPK von dem gewonnenen heterologen Protein durch ein Verfahren unter Beteiligung der Behandlung mit einem proteolytischen Enzym, das für eine basische Aminosäure spezifisch ist, entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das proteolytische Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Trypsin und Protease I von Achromobacter lyticus.