DE3886408T2 - Synthetische hefe-signalpeptide. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Hefe-Leader- Peptide, DNA-Sequenzen, die solche Leader-Peptide kodieren, Vektoren und transformierte Hefestämme.
- Hefeorganismen produzieren eine Anzahl von Proteinen, die intrazellulär synthetisiert werden, aber eine Funktion außerhalb der Zelle besitzen. Solche extrazellulären Proteine werden als sekretierte Proteine bezeichnet. Diese sekretierten Proteine werden anfänglich innerhalb der Zelle in einer Vorläufer- oder einer Präprotein-Form exprimiert, die eine Präsequenz enthält, die eine effektive Lenkung des exprimierten Produktes durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) hindurch sicherstellt. Die Präsequenz, normalerweise als ein Signalpeptid bezeichnet, wird im allgemeinen von dem gewünschten Produkt während der Translokation abgespalten. Wenn es erst einmal in den sekretorischen Weg eingetreten ist, wird das Protein durch den Golgi-Apparat transportiert. Aus dem Golgi kann das Protein verschiedenen Wegen folgen, die zu Abteilungen, wie der Zell-Vakuole oder der Zellmembran, führen oder es kann aus der Zelle herausgeleitet werden, um in das externe Medium sekretiert zu werden (Pfeffer, S.R. und Rothman, J.E. Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 829-852).
- Mehrere Ansätze sind für die Expression und Sekretion in Hefe von zu Hefe heterologen Proteinen vorgeschlagen worden. Die europäische veröffentlichte Patentanmeldung Nr. 0088632A beschreibt ein Verfahren, mit dem zu Hefe heterologe Proteine exprimiert, verarbeitet und sekretiert werden, indem ein Hefeorganismus mit einem Expressionsvehikel, das DNA enthält, die das gewünschte Protein und ein Signalpeptid kodiert, transformiert, eine Kultur des transformierten Organismus hergestellt, die Kultur gezüchtet und das Protein aus dem Kulturmedium gewonnen wird. Das Signalpeptid kann das eigene Signalpeptid des gewünschten Proteins sein, ein heterologes Signalpeptid oder ein Hybrid aus nativem und heterologen Signalpeptid.
- Ein Problem, auf das man bei der Verwendung von zu Hefe heterologen Signalpeptiden trifft, könnte sein, daß das heterologe Signalpeptid keine effiziente Translokation und/oder Spaltung nach dem Signalpeptid sicherstellt.
- Der S. cerevisiae-MFα (α-Faktor) wird als eine Präpro-Form aus 165 Aminosäuren synthetisiert, die ein 19 Aminosäuren langes Signal- oder Präpeptid umfaßt, gefolgt von einem 64 Aminosäuren langem "Leader-" oder Propeptid, das drei N- verknüpfte Glykosylierungsstellen umfaßt, gefolgt von (LysArg(Asp/Glu,Ala)&sub2;&submin;&sub3;α-Faktor)&sub4; (Kurjan, J. und Herskowitz, I. Cell 30 (1982) 933-943). Der Signal-Leader-Teil des PräproMFα ist in breitem Umfang angewendet worden, um Synthese und Sekretion von heterologen Proteinen in S. cerevisiae zu erreichen.
- Verwendung von zu Hefe homologen Signal/Leader-Peptiden ist aus u.a. der US-Patentschrift No. 4,546,082, den europäischen veröffentlichten Patentanmeldungen Nrn. 0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163592A und 0123289A und den DK-Patentschriften Nrn. 2484/84 und 3614/83 bekannt.
- In EP 0123289A wird die Verwendung des S. cerevisiae-α- Faktor-Vorläufers beschrieben, wohingegen DK 2484/84 die Verwendung des Saccharomyces cerevisiae-Invertase- Signalpeptids beschreibt und DK 3614/83 die Verwendung des Saccharomyces cerevisiae-pH 0,5 Signalpeptids zur Sekretion fremder Proteine.
- US-Patentschrift No. 4,546,082, EP 0016201A, 0123294A, 0123544A und 0163529A beschreibt Verfahren, durch die der α- Faktor-Signal-Leader aus Saccharomyces cerevisiae (MFαl oder MFα2) im Sekretionsprozeß von exprimierten heterologen Proteinen in Hefe verwendet wird. Durch Verschmelzen einer DNA-Sequenz, die die S cerevisiae-MFα-Signal/Leader-Sequenz kodiert, mit dem 5'-Ende des Gens für das gewünschte Protein wurde Sekretion und Verarbeitung des gewünschten Proteins nachgewiesen.
- Eine Anzahl sekretierter Proteine wird so geleitet, daß sie einem proteolytischen Verarbeitungssystem ausgesetzt werden, das die Peptidbindung am Carboxy-Ende zweier aufeinanderfolgender basischer Aminosäuren spalten kann. Diese enzymatische Aktivität ist in S. cerevisiae durch das KEX-2- Gen kodiert (Julius, D.A. et al., Cell 31 (1984b), 1075). Verarbeitung des Produkts durch das KEX-2-Genprodukt ist für die Sekretion von aktivem S. cerevisiae-Reifungsfaktor α (MFα oder α-Faktor) erforderlich, aber ist nicht bei der Sekretion von aktivem S. cerevisiae-Reifungsfaktor a beteiligt.
- Die zunehmende Offensichtlichkeit, daß Sekretion ein mangelhafter Weg bei der Lokalisierung von Proteinen in Eukaryonten ist, wo die Konformation des zu sekretierenden Proteins oder seines Vorläufers der wesentliche Parameter für die Effizienz des Prozesses ist (Pfeffer, S.R. und Rothman, J.E., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 829-852), löste eine Suche nach effizienteren Leadern als dem MFα-Leader für Sekretion in S. cerevisiae aus.
- Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung effizientere Leader als den α-Faktor-Leader für die Sekretion in Hefe von kleinen Proteinen zur Verfügung zu stellen.
- In Konkurrenzexperimenten der Art, die von M. Egel-Mitani et al., GENE (1988) (in Druck) mit Insulinvorläufern der Art beschrieben ist, die in der EP-Patentanmeldung Nr. 163 529 beschrieben sind, haben wir einen beschränkenden Faktor bei Expression und Sekretion der Insulinvorläufer gefunden, die vom N-Terminus des Vorläufers bewirkt wird, am wahrscheinlichsten wegen ineffizienter Verarbeitung der Lysin-Arginin-Sequenz, die den Signal-Leader vom Insulinvorläufer trennt.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Sekretionssystem für heterologe Proteine in Hefe zur Verfügung zu stellen, das eine hocheffiziente Verarbeitung des reifen Proteins mit Hilfe einer KEX-2-kodierten Endopeptidase an einer zweibasigen Sequenz sicherstellt, um die Ausbeute des reifen Produktes zu verbessern,
- Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neuartiges synthetisches Leader-Peptid mit der folgenden Formel (I) zur Verfügung gestellt
- wobei X&sub1; Ala oder Gln ist;
- X&sub2; Ile, eine Peptidkette mit bis zu 10 Aminosäureresten oder eine Peptidbindung ist;
- X&sub3; eine Peptidkette mit bis zu 5 Aminosäureresten oder eine Peptidbindung ist;
- X&sub4; und X&sub5; Lys oder Arg sind.
- Beispiele für Leader-Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind die folgenden
- Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden DNA-Sequenzen zur Verfügung gestellt, die Leader-Peptide mit der obigen Formel (I) kodieren.
- Beispiele für solche DNA-Sequenzen sind in den Figs. 9, 10, 12 und 13 dargestellt.
- Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein replizierbarer Hefevektor zur Verfügung gestellt, der eine DNA-Sequenz, die ein Leader-Peptid mit der obigen Formel (I) kodiert, angeordnet flußaufwärts zu einer DNA- Sequenz, die das gewünschte Produkt kodiert, und operabel verknüpft mit geeigneten Promotor- und Signalsequenzen.
- Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die Transkriptionsaktivität in Hefe zeigt und kann abgeleitet sein von Genen, die zu Hefe entweder homologe oder heterologe Proteine kodieren. Der Promotor ist vorzugsweise abgeleitet von einem Gen, das ein zu Hefe homologes Protein kodiert. Beispiele für einen geeigneten Promotor ist der Saccharomyces cerevisiae-MFα1-Promotor. Andere geeignete Promotoren sind S. cerevisiae-TPI-, -ADH- oder -PGK-Promotoren.
- Der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung wird normalerweise eine Signalpeptidsequenz enthalten, angeordnet flußaufwärts zur DNA-Sequenz, die das obige Leader-Peptid (I) kodiert. Das Signalpeptid kann jedes Signalpeptid sein, das effektive Leitung des exprimierten Produktes in den sekretorischen Weg der Zelle sicherstellt. Das Signalpeptid kann ein natürlich auftretendes Signalpeptid oder funktionelle Teile desselben oder ein synthetisches Peptid sein. Als geeignete Signalpeptide haben sich das α-Faktor- Signalpeptid, das Signalpeptid aus Mäusespeichel-Amylase oder ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signal erwiesen. Die Mäusespeichel-Amylase-Signalsequenz ist von O. Hagenbüchle et al., Nature (1981) 289, 643-646 beschrieben. Das Carboxypeptidase-Signal ist von L.A. Valls et al., Cell 48 (1987) 887-897 beschrieben.
- Gene, die das gewünschte Produkt kodieren, und die Signal/Leader-Sequenz sind kombiniert mit Fragmenten, die für einen Promotor, z.B. den TPI-Promotor (PTPI), und einen Terminator, z.B. den TPI-Terminator (TTPI) kodieren (T. Alber und G. Kawasaki: Nucleotide Sequence of the Triose Phosphat Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae J. Mol. Applied Genet 1 (1982) 419-434).
- Die Expressionsplasmide werden außerdem die Hefe-2u- Replikationsgene REP1-3 und den Replikationsursprung und einen oder mehrere selektierbare Marker, z.B. das Saccharomyces pombe-TPI-Gen, wie beschrieben in der EP- Patentanmeldung Nr. 85303702.6, umfassen.
- Die Verfahren, die zur Ligation der DNA-Sequenzen, die das Signal- und/oder Leader-Peptid gemäß der Erfindung kodieren, der Promotor- und Terminatorsequenzen und Insertion in geeignete Hefeplasmide, die die notwendige Information für Hefereplikation enthalten, verwendet werden, sind alle gut bekannte Verfahren innerhalb dieses Gebietes der Technik.
- Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Hefestämme zur Verfügung gestellt, die mit einem Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transforniert sind.
- Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen in Hefe zur Verfügung gestellt, durch das ein Hefestamm, der mit einem Vektor transformiert ist, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein Leader-Peptid mit der obigen Formel (I), angeordnet flußaufwärts zu einer DNA-Sequenz, die das gewünschte Produkt kodiert, und operabel verknüpft mit geeigneten Promotor- und Signalsequenzen, in einem geeigneten Medium kultiviert wird, woraufhin das sekretierte Produkt aus dem Kulturmedium isoliert wird.
- Der Hefeorganismus, der im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jeder geeignete Hefeorganismus sein, der große Mengen des gewünschten Proteins produziert. Bevorzugte Hefeorganismen sind Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces kluyveri, obgleich andere Hefeorganismen verwendet werden können, z.B. Schizosaccharomyces pombe und Saccharomyces uvarum.
- Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Produktion vieler verschiedener Proteine oder Polypeptide in Hefe. Beispiele für solche Verbindungen sind Humaninsulin-Vorläufer, Insulinanalog-Vorläufer, wie beschrieben in EP-Patentanmeldung Nr. 163,529, 194,864 und 214,862, und Glucagon und Aprotinin.
- Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine DNA-Sequenz, die ein Leader-Peptid mit der obigen Formel (I) kodiert, direkt mit dem Gen für das gewünschte Produkt verknüpft. Während der Sekretion wird das Leader- Peptid vom exprimierten Produkt abgespalten werden, was die Isolierung des gewünschten Produktes (z.B. Glucagon oder Aprotinin) aus dem Kulturmedium ohne die Notwendigkeit für weitere in-vitro-Konversion ermöglicht.
- Um eine effektivere Verarbeitung des Leader-Peptids an den C-terminalen Lys-Arg-Resten während der Sekretion sicherzustellen, kann es bevorzugt sein, das gewünschte Produkt mit einer zusätzlichen N-terminalen Aminosäuresequenz zu exprimieren Diese zusätzliche Aminosäuresequenz muß dann später vom restlichen Teil des Moleküls durch in-vitro-Konversation abgespalten werden. Für den Zweck einer solchen in-vitro-Abspaltung kann die zusätzliche Peptidkette mit einer selektiven Schnittstelle versehen sein, die N-terminal zum gewünschten Produkt angeordnet ist. Wenn das gewünschte Produkt kein Methionin enthält, wäre Cyanbromid-Spaltung am Methionin benachbart zum gewünschten Protein wirksam. Auch in Erwägung gezogen wird Arginin- oder Lysin-Spaltung an einem Arginin oder Lysin benachbart zum gewünschten Protein mittels einer trypsinähnlichen Protease.
- Schließlich kann die zusätzliche Peptidkette in vitro durch andere geeignete proteolytische Enzyme abgespalten werden, vorausgesetzt, daß sie eine Schnittstelle für solche Enzyme bildet.
- Wie hierin verwendet, meint der Ausdruck "zu Hefe heterologe Proteine" Proteine, die nicht vom Hefeorganisnus produziert werden. "Sekretion" meint Herausführen eines exprimierten Produktes durch die Zellwand in das Medium oder wenigstens durch die Zellmemoran. "Verarbeitung" meint zelluläre Abspaltung des Signal/Leader-Peptids vom reifen Protein, um das heterologe Protein ohne Begleitung irgendeines Teils des Signal/Leader-Peptids herzustellen. "Signal/Leader-Peptid" meint eine Präproregion, die die Leitung des exprimierten Produktes in den sekretorischen Weg der Zelle sicherstellt und aus einer N-terminalen Signalsequenz hydrophober Zusammensetzung, gefolgt von einer hydrophilen Leader- Region, besteht. "Reifes Protein" meint das Protein, das durch die DNA-Sequenz kodiert ist, die in das Expressionvehikel inseriert ist. Das reife Protein kann ein aktives Protein oder Polypeptid oder ein Vorläufer desselben sein, das durch in-vitro-Konversion weiter in das aktive Endprodukt umgewandelt wird.
- Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht, in denen:
- Fig. 1 das pMT743-Plasmid und die Konstruktion von Plasmid pT7αMI3 zeigt,
- Fig. 2 die Konstruktion der Plasmide pT7-178 und pLaC178 veranschaulicht,
- Fig. 3 die Konstruktion der Plasmide pT7-193, pT7-194 und pT7-195 veranschaulicht,
- Fig. 4 die Konstruktion der Plasmide pT7-200 und pLaC200 veranschaulicht,
- Fig. 5 die Konstruktion von Plasmid pT7-196 veranschaulicht,
- Fig. 6 die Konstruktion von Plasmid pLaC212spx3 veranschaulicht,
- Fig. 7 die DNA-Sequenz des EcoRI-Xba-Fragments von pT7aMI3 und das entsprechende Protein in Ein- Buchstaben-Nomenklatur darunter zeigt,
- Fig. 8 die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7- 178 und das entsprechende Protein in Ein- Buchstaben-Nomenklatur darunter zeigt,
- Fig. 9 die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7- 193 und das entsprechende Protein in Ein- Buchstaben-Nomenklatur darunter zeigt,
- Fig. 10 die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7- 194 und das entsprechende Protein in Ein- Buchstaben-Nomenklatur darunter zeigt
- Fig. 11 die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7- 195 und das entsprechende Protein in Ein- Buchstaben-Nomenklatur darunter zeigt,
- Fig. 12 die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7- 200 und das entsprechende Protein in Ein- Buchstaben-Nomenklatur darunter zeigt,
- Fig. 13 die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pLaC212spx3 und das entsprechende Protein in Ein- Buchstaben-Nomenklatur darunter zeigt,
- Fig. 14 die Konstruktion der Plasmide pKFN371, pT2712spx- 3017 und pT7α-0174 veranschaulicht und
- Fig. 15 die Konstruktion der Plasmide pLaC212spx3-0174 und pKFN216 veranschaulicht.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele beispielhaft belegt werden, die die Herstellung von bestimmten Insulinvorläufern zeigen.
- Alle Expressionsplasmide sind vom C-POT-Typ. Solche Plasmide sind beschrieben in der EP-Patentanmeldung Nr. 85303702.6 und sind so charakterisiert, daß sie das S. pompe- Triosephosphat-Isomerase-Gen (POT) zum Zweck der Plasmidstabilisierung enthalten. Ein Plasmid, das das POT- Gen enthält, ist aus einem hinterlegten E. coli-Stamm (ATCC 39685) erhältlich. Die Plasmide werden außerdem den S. cerevisiae-Triosephosphat-Isomerase-Promotor und -Terminator (PTPI und TTPI) enthalten. Sie sind identisch zu pMT743 (M. Egel-Mitani et al. GENE (1988) (in Druck)) (siehe Fig. 1) mit Ausnahme der durch die EcoRI-XbaI-Restriktionsstelle definierten Region, die eine Signal/Leader/Insulinvorläufer- Sequenz kodiert.
- Der Zusammenbau der Signal/Leader/Insulinvorläuferkodierenden Fragmente, die in diesem Zusammenhang beschrieben sind, hat aus praktischen Gründen in einem E. coli-Plasmid pT7αxMI3 stattgefunden. Dieses Plasmid (siehe Fig. 1) ist ein pBR322-Derivat, in dem die EcoRI-Stelle eliminiert worden ist durch Religieren des EcoRI-Schnitts, mit Klenow-Polymerase und mit dNTP stumpfendig gemachtem Plasmid, und in dem das BamHI-SphI-Fragment durch das 2,2 kb SphI-BamHI-Fragment aus dem obigen pMT743 ersetzt worden ist. Dieses letztere Fragment enthält eine Sequenz, die einen Insulinvorläufer B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) kodiert, verknüpft mit dem MFα-Leader und -Signal und den S. cerevisiae-Triosephosphat-Isomerase-Promotor und -Terminator-Sequenzen (siehe Fig. 1). In diesem SphI-BamHI- Fragment ist die Sequenz, die den Signal/Leader/Insulinvorläufer kodiert, im 0,5 kb EcoRI-XbaI-Fragment enthalten. Das allgemeine Prinzip der Konstruktionsarbeit, die in den folgenden Beispielen beschrieben ist, ist, die MFα-Leader- Sequenz durch eine Leader-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung zu ersetzen. Die Signal-Sequenz sowie die Sequenz für das gewünschte Produkt können ebenfalls ausgetauscht werden. Die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7αMI3 ist in Fig. 7 dargestellt.
- Mehrere der Konstrukte verkörpern weiter Fragmente aus den S. kluyveri-α-Reifungspheromon-Gen (M. Egel-Mitani und M. Trier Hansen (1987) Nucl. Acid Res. 15, 6306).
- Schließlich ist eine Anzahl von synthetischen DNA-Fragmenten angewendet worden.
- Die synthetischen DNA-Fragmente wurden synthetisiert auf einem automatischen DNA-Synthesizer (Applied Biosystems Model 380A) unter Verwendung der Phosphoramidit-Chemie und konmerziell erhältlicher Reagenzien (S.L. Beaucage und M.H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1869). Die Oligonukleotide wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen gereinigt.
- Vor der Anelierung wurden die komplementären DNA- Einzelstränge mit T4-Polynukleotid-Kinase und ATP kinasiert.
- Die aus dieser Vorgehensweise resultierenden Fragmente sind die folgenden:
- Alle anderen verwendeten Methoden und Materialien sind allgemeiner Stand des Wissens (T. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press).
- Die folgenden Beispiele 1-4 veranschaulichen die Expression und Sekretion von Insulinvorläufern von Typ B(1-29)-Ala-Ala- Lys-A (1-21) mittels verschiedener Signal-Leader-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung und Beispiel 5 veranschaulicht die Expression und Sekretion eines Insulinvorläufers des vorgenannten Typs, aber in dem der Aminosäurerest in Position B(27) durch Arg ersetzt worden ist und der Aminosäurerest in Position A(21) durch Gly ersetzt worden ist. Wie im folgenden Text verwendet, meint B(1-29) eine verkürzte B-Kette von Humaninsulin von B(1)Phe bis B(29)Lys, und A(1-21) meint die A-Kette von Humaninsulin.
- Das 4,5 kb SalI-XbaI-Fragment, das 1317 bp SalI-HincII- Fragment und das 333 bp EcoRI*-XbaI-Fragment von pT7αMI13 wurden mit dem synthetischen Fragment NOR243/244:
- verknüpft, was zu pT7-172 führte.
- Das 5,6 kb EcoRI-XbaI-, das 172 bp EcoRI-PvuII- und das 278 bp HinfI-XbaI-Fragment von pT7-172 wurde mit dem synthetischen Fragment NOR 245/246:
- verknüpft, was zu pT7-178 führte.
- Ersetzen des SphI-BamHI-Fragments von pMT743 durch das 2,2 kb SphI-BamHI-Fragment von pT7-178 führte zu pLaC178. Die Konstruktion von pLaC178 ist in Fig. 2 veranschaulicht.
- Die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7-178 ist in Fig. 8 dargestellt.
- Das 5,6 kb EcoRI-XbaI- und das 203 bp PvuII-XbaI-Fragment von pT7αMI3 wurden mit dem synthetischen Fragment NOR308/309:
- AATTGATATCG
- CTATAGC
- verknüpft.
- Aus dem resultierenden Plasmid wurde das 210 bp EcoRV-XbaI- Fragment mit dem 138 bp EcoRI-MaeIII- und dem 5,6 kb EcoRI- XbaI-Fragment von pT7-178 und den unten angegebenen Fragmenten aus dem S. kluyveri-MFα-Gen verknüpft:
- 74 bp MaeIII-EcoRV, was zu pT7-193 führte
- 47 bp MaeIII-Sau3A, was zu pT7-194 führte
- 32 bp MaeIII-MspI, was zu pT7-195 führte.
- Die unterstrichenen Restriktionsenden wurden mit Klenow- Polymerase und dNTP eingefüllt. Die Konstruktion dieser Plasmide ist in Fig. 3 veranschaulicht.
- Des Ersetzen des SphI-BamHI-Fragments von pMT743 durch die Sphl-BamHI-Fragmente der Plasmide pT7-193 bis 195 führte zu den entsprechenden Plasmiden pLaC193 bis 195.
- Plasmid pLaC193 kodiert die folgende Leader-Sequenz:
- Die Signal-Sequenz ist eine codon-optimierte S. cerevisiae- Signalsequenz (siehe Michi Egel Mitani et al. (1988) aaO.). Die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7-193 ist in Fig. 9 dargestellt.
- Plasmid pLaC194 kodiert die folgende Leader-Sequenz:
- die Signal-Sequenz ist wie oben. Die DNA-Sequenz des EcoRI- XbaI-Fragments von pT7-194 ist Fig. 10 dargestellt.
- Plasmid pLaC19s kodiert die folgende Leader-Sequenz:
- Die Signal-Sequenz ist wie oben. Die DNA-Sequenz des EcoRI- XbaI-Fragments von pT7-195 ist in Fig. 11 dargestellt.
- Das 213 bp EcoRI-DdeI- und das 5,9 kb HpaI-EcoRI-Fragment von pT7-194 wurden mit den synthetischen Fragment NOR348/350:
- verknüpft, was zu pT7-200 führte. Das Ersetzen des SphI- BamHI-Fragments in pMT743 durch das 2,2 kb SphI-BamHI- Fragment von pT7-200 führte zu pLaC200. Die Konstruktion von pLaC200 ist in Fig. 4 dargestellt.
- Plasmid pLaC200 kodiert die folgende Leader-Sequenz:
- Die Signal-Sequenz ist dieselbe wie in Beispiel 1. Die DNA- Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pT7-200 ist in Fig. 12 dargestellt.
- Plasmid pT7-178 wurde in vitro mit der Doppelprimer-Methode unter Anwendung der synthetischen DNA NOR544.
- 3' CTTACTTTCAGAAGATAAAAATGACG 5'
- mutagenisiert, im wesentlichen wie von K. Norris et al. (1983) Nucl. Acid Res. 11 5103-5112 beschrieben (Fig. 5).
- Das resultierende Plasmid enthält nun eine XmnI- Schnittstelle, was die Isolierung eines 82 bp EcoRI-XmnI- Fragments ermöglicht, das zusammen mit dem 37 bp XmnI-ApaI- Fragment aus pMSA104 (O. Hagenbüchle et al. Nature (1981) 289, 643-646), das den Mäusespeichel-Amylase- Signalpeptidrest 3-15 kodiert, in einer Ligation verknüpft wurde, die außerdem das 251 bp MspI-Xba- und 5,6 kb EcoRI- Xba-Fragment von pT7-178 und das synthetische DNA-Fragment NOR217/218:
- einschloß, was zu dem Plasmid pT7-196 führte (Fig. 5), das ein modifiziertes Mäusespeichel-Signal enthält (Aminosäurereste 3-15).
- Ersetzen des SphI-BamHI-Fragmentes von pMT743 durch das 2,2 kb SphI-BamHI-Fragment von pT7-196 führte zu pLaC196.
- Das modifizierte Mäusespeichel-Amylase-Signalpeptid wurde weiter mutagenisiert durch Ersetzen des XmnI-ApaI-Fragments von pLaC196 durch die synthetischen Adaptoren NOR520T oder 521T (siehe Fig. 6a), hergestellt aus
- in denen die Nukleotide in kleinen Buchstaben aus Pools eingebaut wurden, die aus 91% des angegebenen Nukleotids und 3% von jedem der anderen Nukleotide zusarniuengesetzt waren. NOR520 und 521 wurden auto-aneliert (unterstrichenes 3'- Ende), mit Klenow-Polymerase und dNTP erweitert, was zu doppelsträngigen DNA-Fragmenten mit 90 bzw. 72 bp führte. Diese Fragmente wurden mit ApaI geschnitten und die resultierenden Fragmente NOR521T mit 47 bp und NOR521T mit 38 bp wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.
- Plasmide, die aus dieser Vorgehensweise resultieren, wurden aus Transformanten eines E. coli-Stammes isoliert und einzeln in den S. cerevisiae-Stamm MT663 transformiert. Die resultierenden Hefe-Transformanten wurden auf Insulinvorläufer-Sekretion gescreent durch Kolonie- Immunblotting mit einem monoklonalen Mäuse-anti- Insulinvorläufer und ausgestattet mit Meerrettich- Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Mäuse-IgG. Die Transformanten, die die stärkste Reaktion ergaben, wurden weiter analysiert. Die besten von diesen enthielten das Plasmid pLaC196spx3, in dem das Signal-Peptid geändert war zu:
- MKAVFLVLSLIGFCWA
- Die exakte Nukleotidsequenz, bestimmt durch Maxam-Gilbert- Sequenzierung von der EcoRI-Stelle zu XbaI hin, ist in Fig. 13 angegeben.
- Das spx3-Signal-Peptid ist im obigen Zusammenhang ungefähr um einen Faktor zwei gegenüber dem ursprünglichen Signal- Peptid von pLaC196 überlegen, wie bewertet aus den erhaltenen sekretierten Insulinvorläufergehalten.
- Überraschenderweise ist spx3, das aus der NOR520T-Mutagenese stammt, zwei Codons kürzer als man erwarten würde, die einzige Erklärung hierfür muß Längen-Heterogenizität in den ursprünglichen Einzelsträngen von NOR520 sein oder durch einen Polymerasesprung in der Extensionsreaktion auf dem Weg zu NOR520T.
- Ersetzen des MaeIII-XbaI-Fragments, das den Leader- Insulinvorläufer-Teil von pLaC196spx3 kodiert, durch das analoge MaeIII-XbaI-Fragment von pLaC200 führte zu pLaC212spx3 (Fig. 6b).
- Plasmid pLaC212spx3 kodiert die folgende Leader-Sequenz:
- Die Signal-Sequenz ist das mutierte Mäusespeichel-Signal. Die DNA-Sequenz des EcoRI-XbaI-Fragments von pLaC212spx3 ist in Fig. 13 dargestellt.
- DNA, die einen Vorläufer eines Insulinanalogs mit Gln in Position B(12), Arg in Position B(27) bzw. Gly in Position A(21) kodiert, wurde aus Plasmid pKFN126 gewonnen (Markussen et al. (1987) Protein Engineering: 1, 215-223), durch Ersetzen des 90 bp StuI-XbaI-Fragments durch die folgende synthetische DNA:
- Aus dem resultierenden Plasmid pKFN371 wurde das 124 bp HindIII-XbaI-Fragment isoliert und verwendet, um das analoge HindIII-XbaI-Fragment von pT7212spx3 und pT7αMI3 zu ersetzen (siehe Fig. 14). Hierdurch wurde die DNA-Sequenz, die das obige Insulinanalog kodiert, in eine Sequenz geändert, die für ein Insulinanalog kodiert, in dem B(27) Arg ist und A(21) Gly ist. Durch Ersetzen des SphI-BamHI-Fragments von pMT743 durch das 2,2 kb SphI-BamHI-Fragment der Plasmide pT7212spx3-0174 und pT7α-0174, die aus diesen Konstruktionen, pLaC212spx3-0174 bzw. pKFN216, stammten, wurden konstruiert (siehe Fig. 15). In diesem Plasmiden vermittelt der 212spx3- bzw. der S. cerevisiae-MFα-Leader die Sekretion des Insulinanalogs.
- Plasmide, die hergestellt wurden, wie oben beschrieben, wurden in S. cerevisiae-Stämme transformiert, die Deletionen in TPI-Gen tragen, durch Selektieren auf Wachstum auf Glucose.
- Der transformierte Hefestamm wurde auf YPD-Medium gezüchtet (Sherman, F. et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981). Für jeden Stamm wurden 6 einzelne 5 ml-Kulturen bei 30ºC gerüttelt, bis sie ein OD&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 15 erreichten (ungefähr 48 Stunden). Nach Zentrifugation wurde der Überstand für HPLC-Analyse entfernt, wobei durch diese Methode die Konzentration von sekretiertem Insulinvorläufer mit einer Methode gemessen wurde, wie sie von Leo Snel et al. (1987) Chromotographia 24, 329-332 beschrieben worden ist.
- Die Expressionsniveaus von verschiedenen Insulinvorläufern sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt.
- In Tabelle 1 und 2 ist das Expressionsniveau der Insulinvorläufer durch Verwendung einer Leader-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in Prozentanteilen des Expressionsniveaus desselben Insulinvorläufers, exprimiert und sekretiert im selben Hefestamm, jedoch durch Verwendung der MFα-Signal/Leader-Sequenz, angegeben. Tabelle 1 Expressionsniveaus von Insulinvorläufer B(1-29)-Ala-Ala-Lys- A(1-21) in Hefetransformanten. Plasmid Expressionsniveau* * Die Expressionsniveaus sind angegeben in Prozentanteilen des Expressionsniveaus von pMT743, der willkürlich auf 100% gesetzt worden ist. Tabelle 2 Expressionsniveaus von Insulinvorläufern, in denen B(27) Arg ist und A(21) Gly ist. Plasmid Expressionsniveau* * ** Die Expressionsniveaus sind angegeben in Prozentanteilen des Expressionsniveaus von pKFN216, das willkürlich auf 100% gesetzt ist.
Claims (15)
1. Synthetisches Leader-Peptid für Sekretion in Hefe mit der
folgenden Formel (I)
wobei X&sub1; Ala oder Gln ist;
X&sub2; Ile, eine Peptidkette mit bis zu 10
Aminosäureresten oder eine Peptidbindung ist;
X&sub3; eine Peptidkette mit bis zu 5 Aminosäureresten
oder eine Peptidbindung ist;
X&sub4; und X&sub5; Lys oder Arg sind.
2. Leader-Peptid nach Anspruch 1, wobei X&sub2; Ile ist und X&sub1;, X&sub3;,
X&sub4; und X&sub5; definiert sind wie in Anspruch 1.
3. Leader-Peptid nach Anspruch 1, wobei X&sub2; die Peptidkette Gly-
Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Asp-Asp-Ile ist und X&sub1;, X&sub3;, X&sub4; und X&sub5;
definiert sind wie in Anspruch 1.
4. Leader-Peptid nach Anspruch 1 mit der folgenden
Peptidsequenz:
5. Leader-Peptid nach Anspruch 1 mit der folgenden
Peptidsequenz:
6. Leader-Peptid nach Anspruch 1 mit der folgenden
Peptidsequenz:
7. Leader-Peptid nach Anspruch 1 mit der folgenden
Peptidsequenz:
8. DNA-Sequenz, die ein Leader-Peptid mit Formel (I) kodiert,
wie beschrieben in Anspruch 1.
9. DNA-Sequenz nach Anspruch 8, mit der Nukleotidsequenz von
Nukleotid 133 bis 246 in Fig. 9.
10. DNA-Sequenz, die ein Leader-Peptid kodiert, nach Anspruch
8, mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 133 bis 218 in Fig.
10.
11. DNA-Sequenz, die ein Leader-Peptid kodiert, nach Anspruch
8, mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 133 bis 233 in Fig.
12.
12. DNA-Sequenz nach Anspruch 8 mit der Nukleotidsequenz von
Nukleotid 124 bis 216 in Fig. 13.
13. Replizierbarer Hefevektor, der eine DNA-Sequenz enthält,
die ein Leader-Peptid mit Formel (I) kodiert, wie beschrieben
in Anspruch 1, angeordnet flußaufwärts zu einer DNA-Sequenz,
die das gewünschte Produkt kodiert, und operabel verknüpft mit
Promotor- und Signalsequenzen.
14. Stamm von Saccharomyces cerevisiae, der mit einem Vektor
nach Anspruch 13 transformiert ist.
15. Verfahren zur Herstellung von Proteinen in Hefe, wobei ein
Stamm von Saccharomyces cerevisiae, der mit einem Vektor nach
Anspruch 13 transformiert ist, in einem geeigneten
Kulturmedium kultiviert wird und das gewünschte Proteinprodukt
aus dem Kulturmedium isoliert wird.
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