DE3687796T2

DE3687796T2 - Verkuerzter phosphoglycerat-kinase-promotor.

Info

Publication number: DE3687796T2
Application number: DE8686907170T
Authority: DE
Inventors: Lindley Blair; Arnold Horwitz; Kanaka Koduri; Jar-How Lee
Original assignee: Xoma Corp
Current assignee: Xoma Corp
Priority date: 1985-11-13
Filing date: 1986-11-13
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2006-11-14
Also published as: DE3687796D1; JPS63501767A; WO1987003008A1; ATE85812T1; EP0245479A4; EP0245479A1; AU6622286A; AU621277B2; CA1312838C; EP0245479B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Querverweis auf verwandte Anmeldungen

Dies ist eine "Continuation in Part" - Anmeldung der US-Anmeldung mit der Serien-Nr. 797,477, eingereicht am 13. November 1985, die durch Verweis miteinbezogen wird.

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnologie. Die Erfindung bezieht sich auf einen verkürzten Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor und die Verbesserung, die dieser für die Expression von Polypeptiden unter seiner Kontrolle zur Verfügung gestellt. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung des verkürzten PGK-Pro-motors, der funktionell mit einem Sekretionssignal verknüpft ist, das eine Verbesserung der Sekretion der exprimierten Proteine in das Kulturmedium bereitstellt.

Hintergrund der Erfindung

Die Gene der glycolytischen Enzyme von Saccharomyces cerevisae kodieren für einige der am häufigsten auftretenden mRNA's für Proteinarten in der Zelle. Das Phosphoglyceratkinase (PGK)-Gen des Hefegenoms ist eingehend untersucht worden. Dobson et al. "Conservation of High Efficiency Promotor Sequences in Saccharomyces cerevisae", Nucleic Acids Research, 10: 2625-2637 (1982). Die 5'-Kontrollbereiche der Gene für die glycolytischen Hefeenzyme sind besonders attraktiv für den Einbau in Hefeexpressionsvektoren, da jedes Gen für 1-5% der gesamten Protein-mRNA kodiert. Weiter können die glycolytischen Gene leicht durch Glucose reguliert werden. Daher kann eine "high level"-Expression eines mit dem PGK-Promotor funktionell verknüpften Genes durch die einfache Kontrolle der Kohlenstoffquelle, Glucose, reguliert werden.
Forscher haben ungefähr 1.500 Nukleotide als den PGK 5'-flankierenden Bereich (den PGK-Promotor) identifiziert, abgeleitet aus einem 3 kbp HindIII-Fragment. sind. Bei Verwenden dieses PGK-Promotors voller Länge waren die Mengen des unter der Kontrolle des PGK- Promotors produzierten heterologen Proteins nicht so hoch, wie für diesen Promotor erwartet worden war. Tuite et al., "Regulated High Efficiency Expression of Human Inteferon-Alpha in Saccharomyces cerevisae", EMBO Journal, 1: 603-608 (1982). Von den Forschern wurde außerdem berichtet, daß bei Verwendung der vollständigen 5'-DNA-Kontrollbereiche von hoch exprimierten Hefegenen für glycolytische Enzyme die erzeugten Proteinspiegel weit niedriger als die des normalen homologen Genproduktes waren. Die Untersuchungen von Chen et al. "Homologous v. Heterologous Gene Expression in the Yeast, Saccharomyces cerevisae", Nucleic Acids Research, 12: 8951-8970 (1984) zeigten, daß die Expression heterologer Gene in Nachbarschaft zum PGK-Promotor auf einem Plasmidvektor mit hoher Kopienzahl in Hefe 15-50 mal niedriger war als die Expression des natürlichen homologen Genes auf dem gleichen Plasmid.
Die Anmelder haben hier entdeckt, daß die Verwendung eines PGK-Promotors mit verkürzter Länge von weniger als 500 Basenpaaren die Expression von Polypeptiden unter seiner Kontrolle verbessert. Es ist daher weniger Zeit erforderlich, bis Transformanten erscheinen, und die Polypeptidproduktion nimmt zu.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird ein verkürzter Promotor des PGK-Genes von Hefe bereitgestellt, der weniger als 500 Basenpaare des proximalen Endes des 5'-Bereiches des PGK-Genes umfaßt, wobei der Promotor bevorzugt eine Promotorsequenzlänge von ungefähr 165 bis ungefähr 404 Basenpaaren vom proximalen Ende des 5'-Bereiches des PGK-Genes umfaßt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein in einem gegebenen Wirt exprimierbares Polynukleotidmolekül zur Verfügung, das die Sequenz des verkürzten PGK-Promotors in funktioneller Verknüpfung mit einem Strukturgen, das homolog oder heterolog für den Wirt sein kann, umfaßt.
Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung des verkürzten PGK-Promotors in funktioneller Verknüpfung mit einem Sekretionssignal zur Verfügung, das daher die Expression und verbesserte Sekretion des exprimierten Polypeptides oder Proteins in das Kulturmedium reguliert.
Die Erfindung stellt außerdem zur Replikation und Expression fähige Vehikel zur Verfügung, die den verkürzten PGK-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit dem Strukturgen umfassen, und stellt weiterhin die mit dem Vehikel transformierten Wirte zur Verfügung.
In einer hier offenbarten und beanspruchten Ausführungsform der Erfindung wird der verkürzte PGK-Promotor in Verbindung mit einem Verfahren zum Regulieren der Hefeplasmidkopienzahl durch zwei selektierbare Marker verwendet. Die Regulation der Hefeplasmidkopienzahl beruht weitgehend auf der Stärke der Promotoren für die selektierbaren Markergene; ein starker Promotor für den ersten selektierbaren Marker selektiert nur auf eine niedrige Kopienzahl, während ein schwacher Promotor für den zweiten selektierbaren Marker für eine hohe Kopienzahl selektiert. Die high level-Expression des mit dem verkürzten PGK-Promotor verbundenen Strukturgens hängt von der Zunahme der Plasmidkopienzahl auf einen hohen Spiegel ab. Dieses Verfahren ist insbesondere nützlich, wenn die high level-Expression eines Genproduktes für die Wirtszellen lethal ist.

FIGURENBESCHREIBUNG

Fig. 1 zeigt die Konstruktion des Plasmides pING52, das den verkürzten PGK-Promotor trägt.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion des Plasmides pING56a, das den vollständigen (full length) PGK-Promotor in wirksamer Verknüpfung mit dem Teil A des Thaumatingenes trägt.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion des Plasmides pING57, das den vollständigen PGK-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit dem vollständigen Thaumatingen auf einem BamHI-XhoI-Fragment trägt.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion des Plasmides pING59 aus den Plasmiden pING52 und pING58. Plasmid pING59 enthält den verkürzten PGK-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit dem vollständigen Thaumatingen und enthält außerdem den leu2-d-Selektionsmarker.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion des Plasmides pING60 aus den Plasmiden pING57 und pING58. Plasmid pING60 enthält den vollständigen PGK-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit dem vollständigen Thaumatingen und enthält weiter den leu2-d-Selektionsmarker.
Fig. 6 zeigt die Konstruktion des Plasmides pING58, das den PGK-Terminator enthält.
Fig. 7 zeigt die Konstruktion des Plasmides pING86, das den 291 bp PGK-Promotor 5' vom Thaumatingen enthält.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion von Hefeexpressionsplasmiden, die folgendes enthalten: eine 218 bp PGK-Promotor- Thaumatinfusion (pING59T), eine 291 bp PGK-Promotor- Thaumatinfusion (pING86T), eine 536 bp PGK-Promotor- Thaumatinfusion (pING89T), und eine 1,5 kp PGK-Promotor- Thaumatinfusion (pING60T).
Fig. 9 zeigt die Konstruktion des Plasmides pING406T, das den verkürzten PGK-Promotor in funktioneller Verknüpfung mit dem vollständigen Thaumatingen enthält und das außerdem die leu2-d- und TRP1-Selektionsmarker enthält.
Fig. 10 zeigt die Konstruktion einer Fusion aus verkürztem PGK-Promotor (218 bp) - Invertase Signalsequenz - Thaumatin YT406 auf einem Hefe-Escherichia coli Schaukelvektor mit hoher Kopienzahl, pING156.
Fig. 11 zeigt die Konstruktion der Plasmide pING94 und pING95, die die Fusionen des 218 bp bzw. des 536 bp (vollständigen) PGK-Promotors mit der Invertase-Signalsequenz und Thaumatin YT406 enthalten, kloniert in einen Hefe-E. coli Schaukelvektor mit mittlerer Kopienzahl.
Fig. 12 zeigt die Konstruktion einer Fusion aus verkürztem (218 bp) PGK-Promotor - Prä-Thaumatin-Signalsequenz - Thaumatin YT406-Fusion auf einem Hefe-E. coli Schaukelvektor mit mittlerer Kopienzahl, pING139CVS.

DEFINITIONEN

In der folgenden Beschreibung werden eine Anzahl von in der rekombinanten DNA-Technologie verwendeten Ausdrücken häufig benutzt. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche bereitzustellen, einschließlich des Umfangs, der solchen Ausdrücken gegeben werden soll, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.

Promotor

Eine DNA-Sequenz, im allgemeinen beschrieben als der 5'-Bereich eines Genes und proximal zum Startcodon angeordnet. Im Promotorbereich werden die Transkription oder Expression eines oder mehrerer benachbarter Gene initiiert.

Polynukleotidmolekül

Eine lineare Sequenz aus miteinander durch ein Rückgrat verbundenen Nukleotiden, das aus einer alternierenden Serie von Zucker- und Phosphatresten besteht und so, wie es hier verwendet wird, DNA- und RNA-Polymere umfassen kann.

Gen

Eine DNA-Sequenz, die Information für die Konstruktion eines Polypeptides oder Proteins enthält, und so, wie der Ausdruck hier verwendet wird, die 5'- und 3'-Enden umfaßt.

Strukturgen

Eine DNA-Sequenz, die in Messenger-RNA transkribiert wird und dann in eine Aminosäuresequenz translatiert wird, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch ist. Typischerweise wird das erste Nukleotid des ersten translatierten Codons mit +1 numeriert, und die Nukleotide werden fortlaufend mit positiven ganzen Zahlen durch den translatierten Bereich des Strukturgenes und im 3'-untranslatierten Bereich numeriert. Die Numerierung von Nukleotiden im Promotor- und regulatorischen Bereich 5' vom translatierten Bereich wird fortlaufend mit negativen ganzen Zahlen vorgenommen, wobei das dem ersten translatierten Nukleotid nächste 5'-Nukleotid mit -1 numeriert wird.

Heterologes Gen

Ein Strukturgen, das fremd ist, d. h., aus einem von dem Wirt verschiedenen Donor stammt oder ein chemisch synthetisiertes Gen ist, und wobei der Donor einer von dem Wirt verschiedenen Art angehören kann. Das Gen kodiert für ein Polypeptid, das normalerweise von dem für eine Transformation mit dem Expressionsvehikel empfänglichen Wirt nicht erzeugt wird.

Funktionelle Verknüpfung

So wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck, daß der Promotor die Initiation der Expression des Polypeptides, für das das Strukturgen kodiert, steuert.

Expression

Expression ist der Prozeß, mit dem ein Strukturgen ein Polypeptid erzeugt. Er umfaßt die Transkription des Genes in Messenger-RNA (mRNA) und die Translation solcher mRNA in ein oder mehrere Polypeptide.

Klonierungsvehikel

Eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu replizieren, und die durch eine oder eine begrenzte Anzahl von Endonuklease-Erkennungsstellen charakterisiert ist, an denen die DNA-Sequenzen in einer vorhersehbaren Weise ohne Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA geschnitten werden können, wobei die DNA- Sequenz einen phänotypischen Selektionsmarker enthält, der für die Verwendung zur Identifizierung von transformierten Zellen geeignet ist. Marker sind beispielsweise Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Für Klonierungsvehikel wird manchmal das Wort "Vektor" verwendet.

Expressionsvehikel

Ein einem Klonierungsvehikel ähnliches Vehikel, das jedoch zur Expression eines gegebenen Strukturgenes in einem Wirt, normalerweise unter Kontrolle von bestimmten regulatorischen Sequenzen, fähig ist.

Wirt

Jeder Organismus, der der Empfänger eines replizierbaren Expressionsvehikels ist, einschließlich von Bakterien und Hefe.

Sekretionssignal

Eine kurze Peptidsequenz, die die Information zum Steuern der Sekretion von mit der Peptidsequenz fusionierten Proteinen enthält.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Der verkürzte PGK-Promotor stellt den Ausgangspunkt in der die vorliegende Erfindung umfassenden Entwicklung dar. Der verkürzte PGK-Promotor wurde aus einem 3 kb Hind III DNA-Fragment abgeleitet, das den PGK-Promotor und das PGK-Gen enthält. Die 5'-Sequenz des PGK-Genes ist in Hitzeman et al. "The Primary Structure of the Saccharomyces cerevisae Gene for 3-Phosphoglycerate Kinase", Nucleic Acid Research 10: 7791-7808 (1982) und in Dobson et al., Nucleic Acid Research, 10: 2625-2637 (1982) gezeigt. Beide Publikationen sind durch Verweis einbezogen.
So, wie er hier verwendet wird, ist mit dem Ausdruck "verkürzter PGK-Promotor" gemeint, daß weniger als ungefähr 1.500 Nukleotide des 5'-Bereiches des PGK-Genes, genauer weniger als 500 Basenpaare vom proximalen Ende des 5'-Bereiches des PGK-Genes umfaßt sind. Die Anmelder haben festgestellt, daß der ungefähr 536 bp PGK-Promotor (HaeIII-Stelle im PGK-Promotor), der in Dobson et al., Nucleic Acid Research, 10: 2625-2637 Fig. 1 (1982) und der Britischen Patentanmeldung 2150577A gezeigt ist, den gleichen Effekt wie der 1,5 kb PGK-Promotor hat, d. h., eine low level-Expression des heterologen Proteins. Die Anzahl der Basenpaare, die den verkürzten PGK-Promotor umfassen, ist optimal, aber nicht kritisch, und ist nicht so zu verstehen, als daß sie den Umfang dieser Erfindung beschränken sollte. Die Anzahl von Basenpaaren in einem erfindungsgemäßen verkürzten PGK-Promotor kann daher variieren, vorausgesetzt jedoch, daß die Basenpaarlänge des verkürzten PGK-Promotors die Anzahl von Basenpaaren umfaßt, die zu einem hohen Level von Expression des Strukturgenes unter der Kontrolle des verkürzten PGK-Promotors führt. In der bevorzugten Ausführungsform beträgt die Anzahl von Basenpaaren, die den verkürzten PGK-Promotor umfaßt, ungefähr 165 bis ungefähr 404 Nukleotide vom proximalen Ende des 5'-Bereiches des PGK-Genes. Auf der Grundlage der Entdeckung der Anmelder, daß die Verwendung eines verkürzten PGK-Promotors die Expression des Polypeptides unter seiner Kontrolle verbessert, kann der Fachmann Routineuntersuchungen durchführen, um andere verkürzte PGK-Promotorsequenzen für die Verwendung als Promotor im Zusammenhang mit gentechnischen Manipulationen zu finden.
Der verkürzte PGK-Promotor kann durch Isolieren des PGK-Genes aus S. cerevisae und anschließendes enzymatisches oder chemisches oder enzymatisches und chemisches Verkürzen des Promotorbereiches erhalten werden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Quelle für verkürzte PGK-Promotor beschränkt. Andere Quellen können die Phosphoglyceratkinase-Promotoren der Gattungen Kluyveromyces, Asperqillus, Saccharomyces, Pichia oder Candida umfassen. Der PGK-Promotor kann weiterhin de novo synthetisiert werden; z. B. anstelle eines Promotors mit natürlichem Ursprung durch Manipulation im Labor.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird der verkürzte PGK-Promotor funktionell mit einem Strukturgen verknüpft und die resultierende genetische Konstruktion wird in ein Expressionsvehikel eingeführt oder bildet einen Teil davon. Das Expressionsvehikel wird dann zur Transformation entsprechender Wirtszellen verwendet. Die Wirtszelle wird unter ausgewählten Kulturbedingungen wachsen gelassen, um ein optimales Wachstum zu erreichen. Obwohl die Expression eines Strukturgenes vom verkürzten PGK-Promotors bewirkt wird, wird diese Expression nicht notwendigerweise von der Glucosekonzentration im Medium moduliert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der verkürzte PGK-Promotor funktionell mit einem Sekretionssignal verknüpft, wobei beide zusammen im korrekten Leseraster funktionell mit einem Strukturgen verknüpft werden. Die resultierende genetische Konstruktion wird in ein Expressionsvehikel eingeführt und wird zu einem Teil eines Expressionsvehikels gemacht, das eine entsprechende Wirtszelle transformiert. Unter entsprechenden Kulturbedingungen wird das Strukturgen exprimiert, mit der zusätzlichen Verbesserung, daß das exprimierte Polypeptid oder Protein in das Kulturmedium sezerniert wird. Das sezernierte Polypeptid oder Protein kann mit bekannten Maßnahmen leicht isoliert und gereinigt werden. Erfindungsgemäß verwendbare Sekretionssignale umfassen das Invertase-Sekretionssignal und das Prä-Thaumatin-Sekretionssignal.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Sekretionssignal in einem Verfahren zum Erzeugen eines Polypeptides, bevorzugt Thaumatin, verwendet. Für dieses Verfahren wird eine genetische Konstruktion so hergestellt, daß das Sekretionssignal funktionell mit einem Promotor verknüpft wird, und beide zusammen funktionell im richtigen Leseraster mit einem Strukturgen verknüpft werden, das für ein Polypeptid, insbesondere Thaumatin, kodiert. Die für diese Ausführungsform verwendbaren Promotoren umfassen den verkürzten PGK-Promotor, Invertase-, Alpha-Faktor-, CYC-, Pyruvatkinase-, Enolase- und andere Promotoren, die in einem Hefewirt funktionsfähig sind. Bevorzugte Sekretionssignale sind das Invertase-Sekretionssignal und das Prä-Thaumatin-Sekretionssignal. Ein Expressionsvehikel, das die genetische Konstruktion enthält, transformiert die entsprechenden Hefewirtszellen. Die transformierte Hefewirtszelle wird unter ausgewählten Kulturbedingungen wachsen gelassen, um das Polypeptid zu erzeugen, das als Ergebnis der regulatorischen Kontrolle des Sekretionssignales in das Kulturmedium sezerniert wird.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der verkürzte PGK-Promotor funktionell mit einer genetischen Sequenz verknüpft, die für ein erstes Polypeptid kodiert, und diese genetische Sequenz wird funktionell mit einer zweiten genetischen Sequenz verknüpft, die für ein anderes Polypeptid kodiert. Die Expression führt zu einer Fusion oder einem Vorläuferprotein, das sowohl die Aminosäuresequenz des zweiten Polypeptids als auch die des gewünschten ersten Polypeptids enthält, und das zwischen beiden eine der erwünschten Aminosäuresequenz benachbarte Spaltstelle enthält.
Die Spaltstelle ist bevorzugt Methionin, obwohl die Stelle jede andere bevorzugte im Stand der Technik bekannte Stelle sein kann. Das gewünschte Polypeptid sollte bevorzugt keine inneren Spaltstellen enthalten, die der aktuell ausgewählten Spaltstelle entsprechen. Andere bekannte Spaltstellen umfassen Asn-Gly, Asp-Pro, Lys, Arg und Lys-Arg.
Die selektive Spaltung des Fusions- oder Vorläuferproteins wird typischerweise außerhalb der replikativen Umgebung des Expressionsvehikels durchgeführt. In diesem posttranslationalen Schritt wird das Fusions- oder Vorläuferprotein durch eine selektive Behandlung abgehackt. Wenn beispielsweise Methionin die Spaltstelle ist, wird das Fusions- oder Vorläuferprotein mit Bromcyan behandelt, um das gewünschte Polypeptid abzuhacken. Bei anderen bekannten Spaltstellen umfaßt die Abspaltbehandlung Hydroxylamin, Säure, Trypsin und Lys-Arg spaltende Enzyme.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gewünschte Strukturgensequenz dem PGK-Promotor heterolog. In anderen Worten, die Struktursequenz tritt natürlicherweise nicht in der Nähe des PGK-Promotors auf. In einer weiteren Ausführungsform ist die Struktursequenz heterolog für den Wirt, d. h., wird natürlicherweise nicht vom Wirt produziert.
Verfahren zum Herstellen fusionierter, funktionell verknüpfter Gene und Expression derselben in Bakterien sind bekannt und beispielsweise im US-Patent 4,366,246 gezeigt.
Die genetischen Konstruktionen und Verfahren, die hierbei verwendet werden, können für die Expression der Polypeptide in eukaryontischen Wirten verwendet werden. Eukaryontische Wirte können Hefe oder filamentöse Pilze umfassen.
Im allgemeinen werden in Verbindung mit diesen Wirten Plasmide oder virale (Bakteriophagen-)Vektoren verwendet, die ein Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer mit der Wirtszelle kompatiblen Art abgeleitet sind. Der Vektor trägt im allgemeinen eine Replikationsstelle sowie spezifische Gene, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu ermöglichen, normalerweise Resistenz gegen Antibiotika oder die Fähigkeit, biosynthetische Enzyme zu synthetisieren.
Der verkürzte PGK-Promotor kann funktionell mit einer genetischen Sequenz verknüpft werden, die für irgendein Polypeptid oder Protein kodiert. Beispiele solcher Polypeptide oder Proteine umfassen Enzyme, Hormone, Hämoglobin, Antikörper, Strukturproteine, Alpha-, Beta- und Gamma- Interferone, Interleukine, Insulin und Gewebeplasminogen- Aktivatoren, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Die transformierten Wirte können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren fermentiert und kultiviert werden, um ein optimales Zellwachstum zu erhalten. Die Expression des Strukturgenproduktes wird erreicht, wenn die transformierten Wirtszellen auf einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle wachsen gelassen werden, beispielsweise Glucose. Die metabolische Regulation des verkürzten PGK-Promotors ist jedoch für das erfindungsgemäße Verfahren nicht notwendig.

Hefeplasmidsystem zum Regulieren der Kopienzahl

Die erfindungsgemäß bevorzugten Plasmidkonstruktionen enthalten zwei selektierbare Marker, d. h., (a) leu2-d und (b) einen zweiten selektierbaren Marker, beispielsweise TRP1, URA3 oder HIS3. Diese Promotoren können durch einen besonderen Metaboliten unter Inhibition der Expression ihres Genproduktes reprimiert werden. Leucin wird die Expression des leu2-d-Markers inhibieren. Das Plasmid enthält außerdem das zu erzeugende gewünschte Polypeptid, normalerweise unter Kontrolle eines anderen Promotors, bevorzugt unter Kontrolle des verkürzten PGK-Promotors.
Erfindungsgemäß wird daher die transformierte Hefe in einem Medium wachsen gelassen, das eine vorbestimmte Menge von Leucin und eine unzureichende Menge eines zweiten Metaboliten, z. B. entweder Tryptophan, Uracil oder Histidin, enthält. Mit diesem Verfahren werden die Plasmide mit hoher Effizienz, aber niedriger Kopienzahl, in die Hefe transformiert, bis das Leucin erschöpft ist. Nach Verbrauch des Leucins beginnt der leu2-d-Promotor- Operator, sein Genprodukt zu produzieren.
Das leu2-d ist insofern defekt, als es nur geringe Mengen seines Genproduktes, beta-Isopropylmalatdehydrogenase (beta-IPMDH) produziert. Um hier ausreichende Mengen von beta-IPMDH zu erzeugen, nimmt die Plasmidkopienzahl in einem Wachstumsmedium mit Leucin Mangel zu, mit der daraus folgenden Zunahme der Expression des gewünschten Polypeptids (Erhart und Hollenberg, "The Presence of a Defective LEU2 Gene on 2-Micron DNA Recombinant Plasmids of Saccharomyces cerevisae Is Responsible for Curing and High Copy Number", J. Bacteriol. 156: 625-635 (1983)).
Wenn TRP1 oder URA3 oder irgendein genetischer Marker, der nicht direkt in die Biosynthese von Aminosäuren außer von Tryptophan involviert ist, als zweiter selektierbarer Marker verwendet wird, kann Säure-hydrolysiertes Kasein als Kohlenstoffquelle und Aminosäuresupplement verwendet werden. Säure-hydrolysiertes Kasein enthält kein Tryptophan und Uracil, so daß das Medium, das das Säure-hydrolysierte Kasein enthält, noch die Selektion für TRP1, URA3 oder andere Nicht-Aminosäure-Marker, z. B. für die Vitamin- oder Fettsäuresynthese, aufrecht erhält. Andere Aminosäurebiosynthesegene können als selektierbare Marker in besser definierten Medien verwendet werden, in denen bestimmte Aminosäuren fehlen.
Wenn Leucin erschöpft ist, wird die Selektion für die leu2-d-Expression auferlegt. Nach der Expressionsphase wird das gewünschte Polypeptid aus den Zellen und/oder den Kulturmedien nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gewonnen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Materialien und Methoden, die zur Durchführung der Erfindung verwendet werden. Es ist nicht beabsichtigt, mit den Beispielen die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.

BEISPIEL 1

Einen verkürzten PGK-Promotor verwendender Hefeprotein- Expressionsvektor

A. Die Konstruktion von Thaumatin-Expressionsvektoren

Der PGK-Promotor aus S. cerevisae wurde verwendet, um das Thaumatingen in Hefe zu exprimieren. Das PGK-Gen wurde aus einer Hefegenombank unter Verwendung von Koloniehybridisierung mit einer synthetischen Sonde (17mer), die der publizierten PGK-Promotorsequenz komplementär war, isoliert. (Dobson et al. Nucleic Acids Research, 10: 2626-2637 (1982)). Ein 3 kb HindIII-Fragment, das das PGK-Gen enthielt, wurde in pBR322 subkloniert. Dieses Plasmid wurde mit pPGK-p bezeichnet. Ein 218 bp MboII-Fragment, das das proximale Ende des PGK-Promotors (TATA box, aber keine UAS Sequenz) von pPGK-p enthielt, wurde mit T4 DNA-Polymerase stumpfendig gemacht und mit BclI-verdautem und mit T4 DNA-Polymerase aufgefülltem p1NG250, das das 5'-Ende des Thaumatingenes enthält (Fig. 1), ligiert. Das resultierende Plasmid pING51 enthielt am 5'-Ende des PGK-Promotors eine wiedererzeugte MboII-Stelle, jedoch nicht am 3'-Ende. Dieses Plasmid wurde erneut mit MboII verdaut und durch Behandlung mit T4 DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Nach Anheften von BamHI Linkern an die stumpfendige MboII-Stelle wurde EcoRI verwendet, um das PGK-Thaumatin (Teil A) aus pING51 zu entfernen, und Teil A wurde dann mit BamHI und EcoRI verdautem pING301 verbunden, der ein vollständiges Thaumatingen enthält. Das resultierende Plasmid, pING52, enthielt die vollständige Thaumatinsequenz 3' von einem 218 bp PGK-Promotor (Fig. 1).
Eine Fusion aus vollständigem (full length) PGK-Promotor mit Thaumatingen wurde mittels in vivo Rekombinationstechnik konstruiert (Fig. 2), wie im folgenden beschrieben: Das Plasmid pING52 wurde mit BamHI verdaut, mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt, dann mit EcoRI verdaut, um ein PGK-Promotor- Thaumatin (Teil A)-Fragment zu erzeugen, das an der 5'-Position ein stumpfes Ende und am 3'-Ende ein überstehendes EcoRI-Ende enthielt. Dieses Fragment wurde dann mit XbaI verdautem pPGK-p verbunden, mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um die Enden aufzufüllen, und mit EcoRI verdaut, um pING55a zu bilden. Da die XbaI-Stelle im PGK-Strukturgen lag und die EcoRI-Stelle weiter stromabwärts im PGK-Gen, wurde der verbundene 218 bp PGK-Promotor eine Tandemduplikation der gleichen 218 bp-Sequenz des stromaufwärts liegenden intakten PGK-Promotors. Eine zwischen diesen beiden tandemartig duplizierten Bereichen durch in vivo Rekombination in E. coli erzeugte Deletion ordnete den intakten PGK-Promotor unmittelbar stromaufwärts vom 5'-Ende des Thaumatingenes an. Ein repräsentativer Klon wurde pING56a genannt. Weil nur der Teil A des Thaumatingenes in pING56a war, wurde das PGK-Thaumatin (Teil A) aus pING56a durch einen BamHI-EcoRI Doppelverdau entfernt und mit den gleichen Restriktionsstellen in pING52 verbunden (Fig. 3). Das resultierende Plasmid, pING57, enthielt den vollständigen PGK-Promotor und das Thaumatingen auf einem BamHI-Xhol-Fragment. Dieses BamHI-XhoI-Fragment aus entweder pING52 oder pING57 wurde dann mit den gleichen Restriktionsstellen in pING58, einem E. coli-Hefe-Schaukelvektor, ligiert, was dazu führte, daß der PGK-Terminator stromabwärts vom Thaumatingen angeordnet war. Die Endprodukte, pING59 und pING60, enthalten den 218 bp- bzw. vollständigen PGK-Promotor-Thaumatin-PGK-Terminatorkomplex (Fig. 4 und 5).
Plasmid pING58 wurde wie folgt konstruiert (Fig. 6): Das Plasmid pPGK-p wurde mit BglII und EcoRV verdaut und durch Behandlung mit T4 DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Es wurden XhoI-Linker angeheftet und das Plasmid wurde religiert und in MC1061 (Casadaban und Cohen, "Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia coli, J. Mol. Biol.", 138: 179-207 (1980)) transformiert, um pING53 zu erzeugen. In pING53 war der PGK-Terminator zwischen den XhoI- und HindIII-Stellen angeordnet. Ein BamHI-HindIII-Fragment, das den PGK-Terminator und 190 bp der pBR322 DNA enthielt, wurde dann an den BamHI- und HindIII-Stellen mit dem Hefe-E. coli-Schaukelvektor pJDB209 verbunden (Beggs, J., "Multicopy Yeast Plasmid Vectors" in Molecular Genetics in Yeast, von Wettstein, et al., eds. (Copenhagen 1981)), um pING58 zu erzeugen.

B. Expression des Thaumatingenes in Hefe mit pING59 oder pING60

Das Plasmid pING59 oder pING60 wurde in den Hefestamm AH22 transformiert und Leu+-Transformanten auf SD-leu Agar selektioniert. Die Eigenschaften von pING59/AH22 und pING60/AH22 wurden, wie in der folgenden Tabelle gezeigt, verglichen: Tabelle I Zum Erscheinen der Transformanten erforderliche Zeit 4 Tage 10 Tage Thaumatinproduktion (% des Gesamtproteines): weniger als 20 ml Kultur mehr als 100 ml
Der Vergleich zeigt eindeutig, daß ein verkürzter PGK- Promotor in pING59 ein sehr viel besserer Thaumatin- Expressionsvektor ist als pING60, der den PGK-Promotor voller Länge enthält.

BEISPIEL 2

Vergleich der Thaumatin-Expression in Hefe-Expressions- Vektoren mit verschiedenen Längen des PGK-Promotors

A. Konstruktion eines Plasmides. das eine 291 bp PGK- Promotor-Thaumatin-Fusion enthält (Fig. 7)

Plasmid pING57, das eine Fusion aus vollständigem PGK-Promotor mit Thaumatin enthält, wurde mit PvuI verdaut, das bei Position -291 des PGK-Promotors spaltet, und durch Behandlung mit T4 DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Nach Anheften von BamHI-Linkern an die stumpfendigen Pvul-Stellen wurden BamHI und XhoI verwendet, um das PGK (291 bp)-Thaumatinfragment aus pING57 zu entfernen, und dieses BamHI-XhoI-Fragment wurde dann mit BamHI- und Xhol gespaltenem pING58 unter Bildung von pING86 verbunden. Plasmid pING86 enthält einen 291 bp-PGK-Promotor 5' vom Thaumatingen.

B. Konstruktion eines Hefe-Expressionsvektors, der eine 536 bp PGK-Promotor-Thaumatinfusion (Fig. 8) enthält

Plasmid pING57 wurde mit HaeIII verdaut, das bei Position -536 des PGK-Promotors spaltet, und BamHI-Linker wurden angefügt. (Dieser 536 bp PGK-Promotor entspricht dem PGK-Promotor, der in der Britischen Patentanmeldung 2150577A gezeigt wird). Anschließend wurden BamHI und Xhol verwendet, um das PGK (536 bp)-Thaumatinfragment aus pING57 zu entfernen, und dieses BamHI-Xhol-Fragment wurde dann mit BamHI- und Xhol-verdautem pING58T verbunden, um pING89T zu bilden.

C. Konstruktion eines Hefe-Expressionsvektors mit entweder einer 218 bp-, 291 bp- oder 1500 bp-PGK-Promotor-Thaumatinfusion (Fig. 8)

Die Plasmide pING52, pING57 und pING86 wurden mit BamHI und Xhol verdaut. Jedes BamHI-Xhol-Fragment, das eine PGK-Promotor-Thaumatinfusion enthält, wurde in pING58T kloniert, das mit BamHI und XhoI verdaut worden war. Die resultierenden Plasmide pING59T, pING60T und pING86T enthalten 218 bp-, 1500 bp- bzw. 291 bp-PGK-Promotoren.

D. Expression von PGK-Promotor-Thaumatinfusionen verschiedener Längen

Für die Expression von PGK-Promotor-Thaumatinfusionen von verschiedener Länge wurden die Hefeplasmide pING59T, pING60T, pING86T und pING89T in den Hefestamm BB29-lC (MATa, leu2-3, 2-112, trp1) transformiert, wie im Beispiel 2 Abschnitt C beschrieben. Eine Transformante aus jeder Transformation wurde in flüssigem SD+1% CAA-Medium inokuliert. Jede Starterkultur (200 Klett, Rotfilter) wurde verwendet, um in einer 1/100-Verdünnung 225 ml SD-leu Medium zu inokulieren. Nach 48 h Inkubation bei 30ºC wurden die Zellen geerntet und die Expression von Thaumatin ein den die verschiedenen Plasmide enthaltenden Hefezellen verglichen. Hefezellen, die pING59T und pING86T enthielten, produzierten annähernd die gleiche Menge von Thaumatin, während Hefezellen, die pING60T und pING89T enthielten, viel weniger Thaumatin produzierten. Der Vergleich zeigt, daß die 291 bp- und 218 bp-Promotoren den gleichen hohen Level von Thaumatinexpression haben, und daß der 536 bp PGK-Promotor die gleiche Wirkung wie ein PGK-Promotor vollständiger Länge hat.

E. Expression von Thaumatin mit PGK-Promotoren von 536 bp, 404 bp, 291 bp, 218 bp, 195 bp oder 165 bp Länge

Um die Länge des PGK-Promotors zu bestimmen, der einen hohen Level der Thaumatinexpression aufrechterhalten wird, wurden verschiedene Längen von PGK-Promotoren zur Expression des Thaumatingenes in Hefe verwendet. Im PGK-Promotor gibt es mehrere Restriktionsstellen (Britische Patentanmeldung 2150577A). Bei Verwendung von A im Translationsinitiations-ATG als +1, ist eine HaeIII-Stelle an Position -536, 5' von der UAS-Sequenz angeordnet, und eine PssI-Stelle ist bei Position -404 innerhalb der UAS-Sequenz angeordnet. Eine PvuI-Stelle bei Position -291, eine MboII-Stelle bei Position -218, eine BstXI-Stelle bei Position -195 und eine MnlI-Stelle bei Position -165 sind alle zwischen der UAS-Sequenz und der TATA-Box angeordnet. Der Verdau mit diesen 6 Restriktionsenzymen erzeugte PGK-Promotoren mit 536 bp, 404 bp, 291 bp, 218 bp, 195 bp bzw. 165 bp. Die DNA-Fragmente, die die verschiedenen Längen des PGK-Promotors an das Thaumatingen (YP406) fusioniert enthielten, wurden in einen Hefe-E. coli-Schaukelvektor, pING58, kloniert. Die erhaltenen Plasmide wurden jeweils verwendet, um den Hefestamm BB25-1d (MATa, leu2-3, 2-112) zu transformieren, und Leu&spplus;-Transformanten wurden auf SD-leu-Platten selektioniert. Die Transformanten erschienen nach 4 Tagen Inkubation bei 30ºC mit allen verwendeten Plasmiden mit Ausnahme des Plasmides, das den 536 bp PGK-Promotor enthielt, das 10 Tage brauchte. Leu&spplus;-Transformanten mit jedem der Plasmide wurden in YPD-Flüssigmedium inokuliert. Jede YPD-Starterkultur (von 200 Klett, Rotfilter) wurde verwendet, um 200 ml eines SD-leu-Mediums mit einer 1/100-Verdünnung zu inokulieren. Nach 48 h Inkubation unter Schütteln (250 rpm) bei 30ºC wurden die Zellen geerntet und mit Glasperlen aufgebrochen. Die wasserunlösliche Fraktion wurde mit kochendem 1%igen SDS extrahiert. Die Mengen von in den Hefezellen durch die verschiedenen Mengen des PGK-Promotors exprimierten Thaumatins wurden durch Laufenlassen dieser Extrakte auf SDS-PAGE verglichen. Die PGK-Promotoren mit Längen von 404 bp, 291 bp, 218 bp, 195 bp oder 165 bp steuerten die Expression von Thaumatin in Hefe auf ungefähr dem gleichen Niveau (ungefähr 10-20% des gesamten zellulären Proteins) während der 536 bp PGK-Promotor Thaumatin in einem sehr geringen Ausmaß (weniger als 1% des gesamten zellulären Proteins) exprimierte.

BEISPIEL 3

Hefeplasmidsystem mit regulierter Kopienzahl

A. Konstruktion von pING58T

Das Vorläuferplasmid von pING58T war pING58, dessen Konstruktion in Beispiel 1 beschrieben ist. Um es zusammenzufassen, pING58 ist ein E. coli-S. cerevisae-Schaukelvektor, der einen Großteil der Sequenzen des bakteriellen Vektors pAT153 einschließlich des beta-Lactamasegenes (bla) für Ampicillinresistenz und des bakteriellen Origins für die Replikation (oriB) aus pBR322 zur Selektion und Amplifikation in Bakterien enthält. Für die Replikation in Hefe enthält pING58 den Replikationsorigin (oriY) und eine weitere cis-wirkende Sequenz (REP3) aus den Hefe-endogenen 2u-Plasmid. Zusätzlich enthält es leu2-d, eine Version des Hefe-LEU2-Genes, dem das meiste des Promotorbereiches fehlt, was zu einem niedrigen Transkriptionsniveau führt. Das niedrige Transkriptionsniveau jeder Kopie selektiert eine hohe Kopienzahl pro Zelle bei Wachstum ohne Leucin. pING58 enthält weiterhin den Hefe-PGK-Terminator, der verwendet wird, die Transkription von Genen, die an seiner 5'-Seite insertiert sind, zu terminieren.
pING58 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII verdaut, und die resultierenden einzelsträngigen überstehenden 5'-Enden wurden mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt, um doppelsträngige stumpfe Enden zu bilden. Diese stumpfen Enden wurden anschließend mit Phosphatase aus Kälberdarm (calf intestinal phosphatase) behandelt, um die 5'-terminalen Phosphate zu entfernen. Dies verhindert die Selbstligation des Vorläuferplasmides, wenn es kein anderes Fragment einbaut.
Das Fragment, das in pING58 eingebaut werden sollte, war ein 850 bp-Fragment, das das TRP1-Gen aus S. cerevisae (Tschumper, G. und J. Carbon, Sequence of a yeast DNA fragment containing a chromosomal replicator and the TRP1 gene", Gene, 10: 157-166 (1980)) enthielt. Dieses Fragment wurde durch Verdauen von pING63 mit den Restriktionsenzymen BglII und EcoRI hergestellt. pING63 ist ein E. coli-Vektor, der das Hefe-TRP1-Gen als ein BglII-EcoRI-Restriktionsfragment mit einem BglII-Linker- Fragment enthält, das das BamHI-EcoRI-Restriktionsfragment in pBR322 ersetzt. Die beiden Fragmente, die aus einer Spaltung mit pING63 herrühren, wurden ebenfalls mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen. Um die Häufigkeit zu erniedrigen, mit der zurückbleibende intakte pING63-Moleküle in einem nachfolgenden Schritt Bakterien transformieren, wurden die pING63-Fragmente mit dem Restriktionsenzym PvuI behandelt.
Die pING58- und pING63-Fragmente wurden miteinander in einem Gewicht/Gewichtsverhältnis von annähernd 1:3 pING58:pING63 gemischt. Die DNA-Endkonzentration betrug ungefähr 20 ug/ml. Nach ungefähr 48 h Ligieren mit T4 DNA-Ligase bei 12ºC wurde die Mischung verwendet, um den E. coli-Stamm MC1061 auf Ampicillinresistenz zu transformieren. Von 11 Transformanten trug einer zwei XbaI-Restriktionsfragmente. Das kleinere 1,2 kb Fragment legte nahe, daß das mutmaßliche TRP1-Insert mit dem 3'-Ende von TRP1 in Nachbarschaft zu den 2u-Sequenzen und das 5'-Ende dem PGK-Terminator von pING58 benachbart orientiert ist.
Dieses Plasmid, genannt pING58T (Fig. 9), konnte unseren Hefestamm BB28-ld (MATa, his4-519, leu2-3, 2-112, trp1) zu einem Trp&spplus;-Phänotyp transformieren, und diese Trp&spplus;-Transformanten waren weiterhin auch Leu&spplus;. Dies weist darauf hin, daß pING58T zusätzlich zu dem insertierten TRP1-Gen auch das funktionelle leu2-d-Gen aus pING58 enthält.

B. Konstruktion von PING406T

Um die Brauchbarkeit von pING58T als Plasmid für die Regulation der Expression eines Fremdgenes zu testen, wurde ein durch BamHI- und XhoI-Stellen begrenztes DNA-Fragment, das die verkürzte PGK-Promotorsequenz aus Hefe und eine synthetisierte Sequenz enthielt, die für das Süßprotein Thaumatin kodierte, in pING58T unter Ersetzen eines BamHI-Xhol-Fragmentes vor dem PGK-Terminator insertiert. Das resultierende Plasmid wurde pING406T (Fig. 7) genannt.

C. Die Thaumatinexpression von pING406T in Hefe ist reguliert

pING406T wurde verwendet, um den Hefestamm BB28-ld nach TRP&spplus; zu transformieren, indem für Wachstum auf SD Agar (2% Glucose, 0,67% Difco-Hefe-Stickstoffbase, 2% Agar), supplementiert mit 1% Säure-hydrolysierten Casamino acids (CAA) selektioniert wurde. Eine der transformierten Kolonien wurde in flüssiges SD + 1% CAA-Medium inokuliert. Diese Starterkultur wurde verwendet, um bei einer 1/30-Verdünnung drei 550 ml Kulturen mit verschiedenen Medien zu inokulieren: A) SD-leu; B) SD + 1% CAA; C) SD + 1% CAA + 300 mg Leucin/Liter. Nur die in SD-leu gewachsenen Zellen produzierten signifikante Mengen Thaumatin, während in den Medien B oder C gewachsene Zellen wenig, wenn überhaupt irgend etwas produzierten. Dies weist darauf hin, daß die Selektion für Wachstum ohne Tryptophan nicht zu einem hohen Level einer Thaumatinproduktion führt. Eine Selektion für Wachstum ohne Leucin führt jedoch zu einer high Level- Thaumatinproduktion.
Wachstum ohne Tryptophan selektioniert nur für eine bescheidene Anzahl von Plasmidkopien pro Zelle, nicht genug, um signifikant Thaumatin zu exprimieren. Wachstum ohne Leucin selektioniert jedoch für eine sehr viel höhere Kopienzahl, weil leu2-d irgendwie für die Transkription der LEU2-Message defekt ist. Diese zweite Selektion steigert die Plasmidkopienzahl, was die LEU2- Funktion erhöht. Dieser Kopienzahlanstieg führt auch zu einer signifikanten Thaumatinproduktion.

BEISPIEL 4

Sekretion von Thaumatin unter Steuerung durch den Hefe- PGK-Promotor und Invertase-Signalsequenz

Bei Fermentation in großem Maßstab ist die am weitesten verbreitete Kohlenstoffquelle Glucose. Da die Expression vom Hefe-Invertase-Promotor bei hohen Glucosekonzentrationen reprimiert ist, wurde der Hefe-PGK-Promotor, der ein starker, Glucose-induzierbarer Promotor ist, verwendet, um den Invertase-Promotor zu ersetzen. Die Konstruktion einer PGK(218bp)-Promotor-Invertasesignalsequenz- Thaumatin YT406-Fusion in einem Hefe-E. coli-Schaukelvektor mit hoher Kopienzahl (ca. 200 Kopien/Zelle) ist in Fig. 10 gezeigt. Das Endplasmid pING156 wurde in den Hefestamm BB33-lC (MATa, ura3, leu2) transformiert und Leu&spplus;-Transformanten selektioniert. Die Leu&spplus;-Transformanten begannen auf der SD-leu-Platte nach 2-3 Wochen Inkubation bei 30ºC zu erscheinen. Unter den Leu&spplus;-Transformanten sezernierte durchschnittlich eine von 8 Thaumatin in das Wachstumsmedium in einer Menge von 600 bis 1000 ug/l.
Die 218 bp- und die 536 bp(volle Länge)-PGK-Promotor- Invertasesignalsequenz-Thaumatin YT406-Fusionen wurden außerdem in einem Hefe-E. coli-Schaukelvektor mit mittlerer Kopienzahl (ca. 20 Kopien/Zelle) kloniert, um pING94 bzw. pING95 zu erzeugen (Fig. 11). Die Plasmide pING94 und pING95 wurden separat verwendet, um BB33-lC zu transformieren. Die Leu&spplus;-Transformanten erschienen nach 2 Tagen Inkubation bei 30ºC. Je 4 Transformanten von BB33-lC (pING94) oder BB33-lC (pING95) wurden gepickt und in SD-leu-Medium wachsen gelassen. Jede Transformante sezernierte YT406 mit in einer Menge von 200 bis 400 ug/l in das Wachstumsmedium.
Um die Sekretion von Einzelkopietransformanten zu untersuchen, wurden Integrationsvektoren konstruiert, indem die Hefe 2u-Sequenzen aus pING94 und pING95 deletiert wurden, um pKK106 bzw. pKK105 zu erzeugen. Ungefähr die Hälfte der Leu&spplus;-Transformanten von BB33-lc (die nach ungefähr 5-6 Tagen erschienen) mit entweder pKK105 oder pKK106 sezernierte ebenso YT406 in einer Menge von 200 bis 400 ug/l in das Wachstumsmedium. Von den nicht sezernierenden Transformanten wird angenommen, daß sie nur hinsichtlich des defekten leu2-Genes von BB33-lc korrigiert worden sind.

BEISPIEL 5

Vom Hefe-PGK-Promotor (218 bp) und der Prä-Thaumatin- Sianalsequenz gesteuerte Sekretion von Thaumatin

Thaumatin ist ein sezerniertes Pflanzenprotein. Auf der Grundlage einer cDNA-abgeleiteten Thaumatin-Proteinsequenz gibt es eine Prä-Thaumatinsequenz von 22 Aminosäuren, die im reifen Thaumatin nicht vorhanden ist. Diese Sequenz von 22 Aminosäuren hat die grundlegenden Merkmale von Sekretionssignalsequenzen und steuert wahrscheinlich die Sekretion von Thaumatin. Um zu untersuchen, ob diese 22 Aminosäuren tatsächlich die Sekretion von Thaumatin in Hefe steuern können, wurde eine Hefe-PGK(218 bp)Promotor-PräThaumatinsignalsequenz-Thaumatin (YT406)-Fusion konstruiert.
Ein synthetisches DNA-Fragment, das für die 22 Aminosäuresignalsequenz kodierte, wurde unter Verwendung bevorzugter Hefecodons chemisch synthetisiert und zusammengesetzt:
Dieses synthetische Fragment hat 2 einzigartige Merkmale:
1) Zum Erleichtern der DNA-Klonierung wurden 4 zusätzliche Basenpaare (AGCT) zwischen den Codons 14 und 15 eingeführt, um eine SstI-Restriktionsstelle herzustellen. Nach Spalten mit SstI, Zurückschneiden mit T4 DNA-Polymerase und Religieren mit T4 Ligase können diese 4 Basenpaare deletiert werden, um die korrekte Prä-Thaumatinsequenz zurückzuerhalten.
2) Am 3'-Ende des Fragmentes wurde eine PstI-Stelle konstruiert, um das Thaumatingen oder andere heterologe Gene korrekt verbinden zu können. Die Plasmide pING124 und pING136 enthalten dieses DNA-Fragment an das 3'-Ende des vollständigen oder 218 bp PGK-Promotors fusioniert. Konstruktionen einer PGK(218 bp)-Promotor-Prä-Thaumatinsignalsequenz- Thaumatin YT406-Fusion in einem Hefe-E. coli-Schaukelvektor mit mittlerer Kopienzahl sind in Fig. 12 dargestellt. Bei Verwendung von pING139CVS zur Transformation von BB33-lc wurden Transformanten erhalten. BB33-lc(pING139CVS) sezernierte YT406 in einer Menge von 400 bis 500 ug/l in das Wachstumsmedium.
Obwohl die vorliegende Offenbarung alle wesentlichen Informationen in Verbindung mit der Erfindung of fenlegt, können die hier zitierten zahlreichen Publikationen für das Verständnis des Hintergrunds der Erfindung und des Standes der Technik hilfreich sein. Dementsprechend sind alle hier zitierten Publikationen durch Inbezugnahme in die Offenbarung des Patentes einbezogen. Außerdem ist die vorstehende Erfindung zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses in einigen Einzelheiten in den Figuren und Beispielen beschrieben worden. Es ist offensichtlich, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung durchgeführt werden können, und diese nur durch den Umfang der nachfolgenden Ansprüche beschränkt ist.

Claims

1. Verkürzter Promotor des Phosphoglyceratkinase (PGK)- Gens von Hefe, umfassend weniger als 500 Basenpaare des proximalen Endes der 5'-Region des PGK-Gens, wobei der Promotor verbesserte Expression von Polypeptiden unter seiner Kontrolle erlaubt, verglichen mit der durch den vollständigen PGK-Promotor ermöglichten Expression.

2. Verkürzter Promotor nach Anspruch 1, umfassend eine Länge von ungefähr 165 bis ungefähr 404 Basenpaare des proximalen Endes der 5'-Region des PGK-Gens.

3. Polynucleotidmolekül, das in einer gegebenen Wirtszelle exprimierbar ist, umfassend eine Sequenz des verkürzten PGK-Promotors nach Anspruch 1 oder 2, funktionell verknüpft mit einem Strukturgen.

4. Expressionsvehikel zum Verwenden in rekombinanter DNA, das genetische Information replizieren und exprimieren kann und den Promotor von Anspruch 2 enthält, wobei der Promotor die Expression eines strukturellen Polypeptids kontrolliert.

5. Expressionsvehikel zur Verwendung in rekombinanter DNA, das genetische Information replizieren und exprimieren kann und den Promotor von Anspruch 2, funktionell verknüpft mit einem Sekretionssignal, enthält, wobei der Promotor und das Sekretionssignal die Expression und Sekretion eines strukturellen Polypeptids kontrollieren.

6. Expressionsvehikel nach Anspruch 5, worin das Sekretionssignal ausgewählt wird aus dem Invertase-Sekretionssignal und dem Prä-Thaumatin-Sekretionssignal.

7. Wirtszelle, transformiert durch das Expressionsvehikel von Anspruch 4 oder 5.

8. Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Polypeptids, umfassend Kultivieren einer Wirtszelle, die durch das Expressionsvehikel von Anspruch 4 transformiert ist, unter Bedingungen, die so gewählt sind, daß das gewünschte Polypeptid hergestellt wird.

9. Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Polypeptids, umfassend Kultivieren einer Wirtszelle, die durch das Expressionsvehikel von Anspruch 5 transformiert ist, unter Bedingungen, die so ausgewählt sind, daß das Polypeptid hergestellt und in das Kulturmedium sezerniert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Polypeptid Thaumatin ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Sekretionssignal das Prä-Thaumatin-Sekretionssignal ist.

12. Verfahren zum Steigern der Expression eines heterologen Polypeptids in transformierter Hefe, umfassend Kultivieren von Hefe, transformiert mit einem Expressionsvehikel, das umfaßt:

(i) einen ersten selektierbaren Marker;

(ii) einen zweiten selektierbaren Marker, leu2-d; und

(iii) ein Gen, das ein heterologes Polypeptid codiert unter der Kontrolle eines dritten Promotors, der den Promotor von Anspruch 1 umfaßt, das von der transformierten Hefe exprimiert wird,

in einem Kulturmedium, enthaltend eine nicht ausreichende Menge des Metaboliten des ersten selektierbaren Markers und eine vorab bestimmte Menge von Leucin, um die Notwendigkeit der Expression des zweiten Markers, leu2-d, zu vermeiden, für eine ausreichende Zeit, um wirksame Transformation und Wachstum der transformierten Hefe zu erreichen, und bei Verarmung an Leucin selektiert die notwendige Expression von leu2-d auf gesteigerte Plasmidkopienzahl, was gleichzeitig zu gesteigerter Expression des heterologen Polypeptids führt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin der dritte Promotor den Promotor von Anspruch 2 umfaßt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, worin der erste selektierbare Marker TRP1, URA3, und HIS3 ist.