DE3650664T2

DE3650664T2 - Verwendung von promotoren von filamentösen pilzen

Info

Publication number: DE3650664T2
Application number: DE3650664T
Authority: DE
Inventors: Francis Paul 727 Indian Road Ontario Buxton; Roger Wayne R. R. 1 Ontario Davies; David Ivor 34 Monterrey Avenue Ontario Gwynne; Mark Hudson Ontario Pickett; Claudio 6 Parc De Bures F-91440 Bures Sur Yvette Scazzocchio
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1985-04-15
Filing date: 1986-04-14
Publication date: 1998-04-16
Anticipated expiration: 2006-04-15
Also published as: DE3650783T2; JP2868179B2; EP0284603A1; EP0284603B1; JPH07163389A; DE3650664D1; ATE161881T1; ATE253119T1; WO1986006097A1; DE3650783D1; AU5698686A; AU606033B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression und die Expression, an die sich eine Sekretion anschließt, von Proteinen aus filamentäsen Pilzen.

Hintergrund der Erfindung

Ein Ziel der rekombinanten DNA-Technologie ist die Insertion von DNA- Segmenten, die für kommerziell oder wissenschaftlich wertvolle Proteine kodieren, in eine Wirtszelle, die ohne weiteres und in wirtschaftlicher Weise verfügbar ist. Gene, die für die Insertion gewählt werden, sind normalerweise die, die Proteine kodieren, die nur in begrenzten Mengen von ihren natürlichen Wirten gebildet werden, oder Proteine, die zu Wirten gehören, die zu teuer zu halten sind. Die übertragung der genetischen Information in einer gesteuerten Weise auf einen Wirt, der imstande ist, das Protein mit einer größeren Ausbeute oder in wirtschaftlicherer Weise in einer ähnlichen Ausbeute zu bilden, stellt einen günstigeren Weg für die Proteinherstellung dar.
Gene, die Proteine kodieren, enthalten Promotorregionen von DNA, die im wesentlichen mit dem 5'-Terminus der das Protein kodierenden Region verknüpft sind. Die Promotorregionen enthalten die Bindungsstelle für RNA-Polymerase II. RNA-Polymerase II katalysiert in wirksamer Weise den Zusammenbau der Messenger-RNA, die komplementär zu dem entsprechenden DNA-Strang der kodierenden Region ist. In den meisten Promotorregionen ist eine Nucleotidbasensequenz, die mit einer Sequenz verwandt ist, die allgemein als "TATA-Box" bekannt ist, vorhanden, und sie ist in einem gewissen Abstand stromaufwärts vom Start der kodierenden Region angeordnet und ist für die genaue Initiation der Transkription erforderlich. Weitere Merkmale, die wichtig oder essentiell für die richtige Funktion und Steuerung der kodierenden Region sind, sind ebenfalls in der Promotorregion stromaufwärts vom Start der kodierenden Region enthalten.
Filamentöse Pilze, insbesondere die filamentösen Ascomyceten, wie Aspergillus, z. B. Aspergillus niger, stellen eine Klasse von Mikroorganismen dar, die sich als Empfänger von Fremdgenen, die für wertvolle Proteine kodieren, eignen. Aspergillus niger und verwandte Spezies werden gegenwärtig vielfach bei der großtechnischen Herstellung von Enzymen, z. B. für die Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie, verwendet. Ihre Verwendung basiert auf den sekretorischen Fähigkeiten des Mikroorganismus. Da sie gut charakterisiert sind und aufgrund ihrer weiten Verwendung und Akzeptanz gibt es sowohl einen großtechnischen als auch einen wissenschaftlichen Anreiz, genetisch modifizierte und verstärkte Zellen von A. niger und verwandten Spezies unter Einschluß von A. nidulans bereitzustellen, um nützliche Proteine zu erhalten.
Expression und Sekretion von Fremdproteinen aus filamentösen Pilzen sind bis jetzt nicht erzielt worden. Es war in keiner Weise klar, daß die Strategien, die bei Hefe erfolgreich waren, auch bei filamentösen Pilzen, wie Aspergillus, erfolgreich sein würden. Es gibt Belege, daß Hefe ein ungeeignetes System für die Expression von filamentösen Pilzgenen ist (Pentilla et al., Molec. Gen. Genet., Bd. 194 (1984), S. 494-499) und daß Hefegene in filamentösen Pilzen nicht exprimiert werden. Es sind erst kürzlich gentechnische Verfahren für Aspergillus nidulans und Aspergillus niger entwickelt worden. Diese Techniken beinhalten die Einverleibung von exogen zugeführten Genen in das Aspergillus-Genom in einer Form, in der sie exprimiert werden können.
Bis jetzt sind keine Fremdgene in filamentösen Pilzen unter Anwendung dieser Techniken exprimiert und daraus sekretiert worden. Dies hat seine Ursache im Fehlen geeigneter Expressionsvektoren und der sie aufbauenden Komponenten. Diese Komponenten umfassen Aspergillus-Promotorsequenzen, die vorstehend beschrieben wurden, die Region, die das gewünschte Produkt kodiert, und die damit assoziierten Sequenzen, die zugefügt werden können, um das gewünschte Produkt in das extrazelluläre Medium zu leiten.
Wie angegeben, erfordert die Expression des Fremdgens durch die Wirtszelle das Vorhandensein einer Promotorregion, die sich stromaufwärts von der Region, die für das Protein kodiert, befindet. Diese Promotorregion ist aktiv bei der Steuerung der Transkription der kodierenden Region, mit der sie assoziiert ist, zu Messenger-RNA, die schließlich einer Translation in das gewünschte Proteinprodukt unterliegt. Auf diese Weise hergestellte Proteine können in zwei Klassen auf der Basis ihrer Bestimmung im Hinblick auf den Wirt eingeteilt werden.
Eine erste Klasse von Proteinen wird intrazellulär zurückgehalten. Die Extraktion des gewünschten Proteins, wenn es intrazellulär vorliegt, erfordert es, daß der gentechnisch veränderte Wirt aufgebrochen oder lysiert wird, um das Produkt für die schließliche Reinigung freizusetzen. Die intrazelluläre Herstellung hat mehrere Vorteile. Das Protein kann mit der Zellmasse konzentriert, d. h. pelletiert werden, und wenn das Produkt unter extrazellulären Bedingungen labil ist oder strukturell nicht sekretiert werden kann, dann ist dies ein günstiges Verfahren für Herstellung und Reinigung.
Eine zweite Klasse von Proteinen sind die, die aus der Zelle sekretiert werden. In diesem Fall wird die Reinigung mit dem extrazellulären Medium anstelle der Zelle selbst durchgeführt. Das Produkt kann unter Anwendung von Verfahren, wie Affinitätschromatographie, extrahiert werden, und eine kontinuierliche Durchflußfermentation ist möglich. Außerdem sind bestimmte Produkte extrazellulär stabiler und profitieren von der extrazellulären Reinigung. Experimentelle Belege zeigen, daß die Sekretion von Proteinen in Eukaryonten fast immer von einem Sekretionssignalpeptid (nachstehend als Signalpeptid bezeichnet) bestimmt wird, das sich üblicherweise am Aminoterminus des Proteins befindet. Signalpeptide weisen charakteristische Verteilungen auf, wie es von G. Von Heijne in Eur. J. Biochem., S. 17- 21 (1983) beschrieben wurde und sind für den Fachmann erkennbar. Das Signalpeptid führt, wenn es von der Zelle erkannt wird, das Protein in den sekretorischen Stoffwechselweg der Zelle ein. Während der Sekretion wird das Signalpeptid abgespalten, wobei das Protein für die Gewinnung in seiner reifen Form aus dem extrazellulären Medium verfügbar wird.
Beide Klassen von Proteinen, intrazelluläre wie extrazelluläre, werden von Genen kodiert, die eine Promotorregion enthalten, die mit einer kodierenden Region gekoppelt ist. Gene, die extrazellulär gerichtete Proteine kodieren, unterscheiden sich von denen, die intrazelluläre Proteine kodieren, darin, daß bei Genen, die extrazelluläre Proteine kodieren, der Abschnitt der kodierenden Region, der dem Promotor am nächsten ist (wobei es sich um den ersten Teil handelt, der von der RNA-Polymerase transkribiert werden soll), ein Signalpeptid kodiert. Die Nucleotidsequenz, die das Signalpeptid kodiert und die nachstehend als die Signalpeptid-kodierende Region oder die Signalsequenz bezeichnet wird, ist ein funktioneller Teil der kodierenden Region als solcher.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Es ist nun ein System entwickelt worden, durch das filamentse Pilze zur Expression eines gewünschten Proteins transformiert werden können. Mit diesem System kann die Transformation zu einem filamentösen Pilz führen, der nicht nur zur Expression des Proteins, sondern auch zur Sekretion des Proteins imstande ist, und zwar unabhängig davon, ob es sich bei dem Protein um ein natürlicherweise sekretiertes Protein handelt oder nicht. Darüber hinaus kann der Grad, in dem das Protein exprimiert wird, entsprechend bestimmter Aspekte der Erfindung gesteuert werden. Der Fachmann erkennt, daß das bereitgestellte System es ermöglicht, daß filamentöse Pilze als wertvolle Quelle für Proteine dienen, und eine Alternative bereitstellt, die bei vielen Anwendungen bakteriellen und Hefesystemen überlegen ist.
Gemäß einem allgemeinen Aspekt stellt die Erfindung also ein filamentöses Pilztransformationssystem bereit, durch das die genetische Konstitution dieser Pilzzellen modifiziert werden kann, so daß die Beschaffenheit oder die Menge der von diesen Zellen exprimierten Proteine geändert wird. Speziellere Aspekte der Erfindung sind nachstehend definiert.
Erfindungsgemäß wird ein rekombinantes DNA-Konstrukt bereitgestellt, das eine regulierbare Promotorregion eines filamentösen Pilzgens, die operativ mit einem für das Polypeptid kodierenden DNA-Fragment verknüpft ist, umfaßt, wobei:
(a) das DNA-Fragment für die Promotorregion fremd ist; und
(b) die regulierbare Promotorregion durch Ethanol induzierbar ist, wobei die Ethanol-Induzierbarkeit durch das alcR-Genprodukt vermittelt wird.
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereitgestellt, das folgendes umfaßt:
(i) das Züchten eines filamentösen Pilzes, der durch ein rekombinantes DNA-Konstrukt transformiert ist, wobei in dem Konstrukt eine regulierbare Promotorregion eines filamentösen Pilzgens funktionell mit einem für das Polypeptid kodierenden DNA-Fragment verknüpft ist, wobei
(a) das DNA-Fragment für die Promotorregion fremd ist; und
(b) die regulierbare Promotorregion durch Ethanol induzierbar ist, wobei die Ethanol-Induzierbarkeit durch das alcR-Genprodukt vermittelt wird;
(ii) unter Bedingungen, bei denen die regulierte Expression des Polypeptids erfolgt; und
(iii) das Gewinnen des Polypeptids.
Ferner wird ein filamentöser Pilz bereitgestellt, der mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Konstrukt transformiert ist.
In der vorliegenden Erfindung wird gemäß einem Aspekt eine Promotor- DNA-Region, die mit einer kodierenden Region in filamentösen Pilzen, wie A. niger, A. nidulans oder einer verwandten Spezies, assoziiert ist, identifiziert und isoliert, entsprechend in einer funktionellen Beziehung mit einer zweiten, verschiedenen kodierenden DNA-Region außerhalb der Zelle verknüpft und dann wieder in einen filamentösen Pilzwirt unter Verwendung eines geeigneten Vektors eingeführt. Transformierte Wirtszellen exprimieren das Protein der zweiten kodierenden Region unter der Steuerung der eingeführten Promotorregion. Bei der zweiten kodierenden Region kann es sich um eine Region handeln, die für die Wirtspezies fremd ist, wobei der Wirt in diesem Fall ein Protein exprimiert und in einigen Fällen sekretiert, das von dem gegebenen Wirt nicht natürlicherweise exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, fremde kodierende Regionen in filamentöse Pilze zusammen mit Promotoren einzuführen, um dafür zu sorgen, daß der Wirtspilz verschiedene Proteine exprimiert. Sie ermöglicht es auch, die Transkription der einzelnen Gene, die in natürlicher Weise darin auftreten, oder der Fremdgene, die eingeführt sind, über die Promotorregion, die in den Wirt zusammen mit dem Gen eingeführt worden ist, zu regulieren. Zum Beispiel sind die Promotorregionen, die natürlicherweise mit dem Alkoholdehydrogenase I (alc)A-Gen und dem Aldehyddehydrogenase (aldA)- Gen von A. nidulans assoziiert sind, mittels Ethanol, Threonin oder anderen induzierenden Substanzen im extrazellulären Medium regulierbar. Dieser Effekt hängt von der Integrität eines Gens ab, das als alcR bekannt ist. Wenn die alcA- oder aldA-Promotorregion mit einer ein Fremdprotein kodierenden Region in Aspergillus oder dergl. erfindungsgemäß assoziiert ist, dann kann eine ähnliche Regulation der Expression der verschiedenen Gene mittels Ethanol oder anderer Induktoren erzielt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen genetischen Vektor bereit, der imstande ist, das Segment, das die vorstehend erwähnte regulierbare Promotor- und Signalpeptid-kodierende Region mit der integralen Protein-kodierenden Region trägt, in das Genom eines filamentösen Pilzwirtes einzuführen. Die Protein-kodierende Region kann entweder nativ oder fremd für den filamentösen Pilzwirt sein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein neues Konstrukt bereit, das eine als die vorstehend erwähnte Promotorregion in Zellen von filamentösen Pilzen aktive DNA-Sequenz und eine kodierende Region, die chemisch an die DNA-Sequenz in funktioneller Verknüpfung damit gebunden ist, umfaßt, wobei die kodierende Region zur Expression in einem filamentösen Pilzwirt unter dem Einfluß der DNA-Sequenz imstande ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur genetischen Modifikation einer filamentösen Pilzwirtszelle bereit, das die Einführung einer kodierenden Region, die zur Expression in der transformierten Aspergillus-Wirtszelle imstande ist, und einer Promotorregion, wie sie vorstehend beschrieben wurde, die in der transformierten Aspergillus-Wirtszelle aktiv ist, wobei die kodierende Region, die für die Promotorregion fremd ist, und der Promotor chemisch aneinander und in funktioneller Verknüpfung miteinander gebunden sind, in die Wirtszelle mittels eines geeigneten Vektors umfaßt.
Dieses Verfahren beinhaltet auch die Einführung von mehrfachen Kopien des gewählten Konstrukts in den Wirt, um erhöhte Grade der Genexpression bereitzustellen. Falls erforderlich oder wünschenswert, ist die Einführung von mehrfachen Konstruktkopien von der Einführung von mehrfachen Kopien von Genen begleitet, die Produkte mit einer regulatorischen Wirkung auf das Konstrukt kodieren.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch filamentöse Pilzzellen, die mit den erfindungsgemäßen Konstrukten transformiert sind.

Darstellung der bevorzugten Ausführungsformen

Erfindungsgemäß bevorzugte Wirte sind filamentöse Pilze der Ascomyceten-Klasse, insbesondere Aspergillus sp. unter Einschluß von A. niger, A. nidulans und dergl.
Gemäß der bevorzugten Form der Erfindung wird die Promotorregion, die mit dem Aspergillus niger-Glucoamylasegen assoziiert ist, oder die Promotorregion, die mit dem Alkoholdehydrogenase 1-Gen oder den Aldehyddehydrogenasegenen von Aspergillus nidulans assoziiert ist, zur Herstellung eines geeigneten Vektorplasmids verwendet.
Eine oder alle dieser Promotorregionen sind in der Wirtszelle durch Zugabe einer geeigneten Induktorsubstanz regulierbar. Bei alcA und aldA wird diese Induktion durch das Proteinprodukt eines dritten Gens, nämlich alcR, vermittelt, das über den Promotor gesteuert wird. Es gibt Belege dafür, daß die Verfügbarkeit des alcR-Produkts die Promotorfunktion der alcA- und aldA-Promotoren begrenzen kann, wenn mehrfache Kopien eines Konstrukts, das den alcA-Promotor oder den aldA-Promotor enthält, in eine Wirtszelle ohne die entsprechende Einführung von mehrfachen Kopien des alcR-Gens eingeführt werden. In einem derartigen Fall kann die Menge des alcR-Produkts, die der Wirt herstellen kann, unzureichend sein, um die Anforderungen von mehreren Promotoren, die eine Induktion durch das alcR-Produkt erfordern, zu erfüllen. Daher wird die Transformation von filamentösen Puzwirten mit mehrfachen Kopien von Konstrukten, die den alcA- oder aldA-Promotor enthalten, von der Einführung von mehrfachen Kopien des alcR-Gens entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung begleitet. In anderen Fällen kann die Transkription z. B. durch Verwendung hoher Glucosespiegel (und Spiegel einiger anderer Kohlenstoffquellen) im Medium, das für die Züchtung des Wirts verwendet wird, reprimiert werden. Die Expression des von der kodierenden Region kodierten Produkts, die durch den Promotor gesteuert wird, wird dann bis nach dem Ende der Zellwachstumsphase verzögert, wenn die Gesamtmenge der Glucose verbraucht ist und das Gen dereprimiert wird. Der Induktor kann zu diesem Zeitpunkt zugegeben werden, um die Aktivität des Promotors zu verstärken.
Das Ziel des Proteinprodukts der kodierenden Region, die gewählt wurde, so daß sie unter der Steuerung des vorstehend beschriebenen Promotors exprimiert wird, wird von der Nucleotidsequenz der kodierenden Region bestimmt. Wie vorstehend erwähnt wurde, enthält sie, wenn das Proteinprodukt natürlicherweise in die extrazelluläre Umgebung geführt wird, inhärent eine ein sekretionssignalpeptid kodierende Region. Proteinprodukten, die normalerweise intrazellulär vorliegen, fehlt dieses Signalpeptid.
Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung ist also darauf hinzuweisen, daß eine "kodierende Region" ein Protein kodiert, das entweder intrazellulär zurückgehalten oder sekretiert wird. (Diese "kodierende Region" wird auf diesem Gebiet gelegentlich als Strukturgen, d. h. der Anteil eines Gens, der ein Protein kodiert, bezeichnet.) Wenn das Protein innerhalb der Zelle, die es bildet, zurückgehalten wird, dann fehlt der kodierenden Region üblicherweise eine Signalpeptid-kodierende Region. Die Sekretion des Proteins, das innerhalb der kodierenden Region kodiert wird, kann eine natürliche Folge des Zellmetabolismus sein, wobei in diesem Fall die kodierende Region inhärent eine Signalpeptid-kodierende Region, die natürlicherweise im Translationsleserahmen mit dem Segment der kodierenden Region, das das sekretierte Protein kodiert, verknüpft ist. In diesem Fall ist die Insertion einer ein Signalpeptid kodierenden Region nicht erforderlich. Alternativ dazu kann die kodierende Region manipuliert werden, um eine Signalpeptid-kodierende Region einzuführen, die fremd für den Abschnitt der kodierenden Region ist, der das sekretierte Protein kodiert. Diese fremde Signalpeptid-kodierende Region kann erforderlich sein, wenn die kodierende Region nicht natürlicherweise eine Signalpeptid-kodierende Region enthält, oder sie kann einfach die natürliche Signalpeptid-kodierende Region ersetzen, um eine verstärkte Sekretion des gewünschten Proteins, mit dem das natürliche Signalpeptid normalerweise assoziiert ist, zu erzielen.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung wird daher eine Signalpeptid-kodierende Region bereitgestellt, falls dies erforderlich ist, d. h. wenn die kodierende Region, die gewählt wurde, um unter der Steuerung des vorstehend beschriebenen Promotors exprimiert zu werden, nicht selbst eine Signalpeptid-kodierende Region enthält. Die verwendete Signalpeptidkodierende Region ist vorzugsweise eine Region, die mit dem Aspergillus niger-Glucoamylasegen assoziiert ist, oder eine synthetische Signalpeptid-kodierende Region, die in vitro hergestellt wird und bei der Herstellung eines geeigneten Vektorplasmids verwendet wird. Es ist besonders bevorzugt, wenn diese Signalpeptid-kodierenden Regionen an einem oder beiden Enden modifiziert werden, um eine Ligation mit anderen Komponenten eines Vektors zu ermöglichen. Diese Ligation wird in einer solchen Weise durchgeführt, daß die Signalpeptid-kodierende Region sich zwischen der Promotorregion und dem Protein-kodierenden Segment der kodierenden Region befindet, so daß die Signalpeptid-kodierende Region sich im Rahmen mit dem Segment der kodierenden Region befindet, das das reife funktionelle Protein kodiert.

Kurze Bezugnahme auf die Zeichnung

Fig. 1A ist eine Darstellung der Basensequenz der DNA, die die kodierende Region und die Promotorregion des Alkoholdehydrogenase I (alcA)-Gens von Aspergillus nidulans bildet.
Fig. 1B ist eine Darstellung der Basensequenz der DNA, die die kodierende Region und die Promotorregion des Aldehyddehydrogenase (aldA)-Gens von Aspergillus nidulans bildet.
Fig. 2 ist eine diagrammatische Darstellung eines Verfahrens zur Konstruktion des Plasmids pDG6, das sich für die Transformation einer filamentösen Pilzzelle eignet;
Fig. 3 ist eine lineare Darstellung eines Abschnitts des Plasmids pDG6 von Fig. 2;
Fig. 4 ist eine diagrammatische Darstellung der Plasmidkarten von pGL1 und pGL2;
Fig. 5 ist eine Darstellung einer Auswahl von synthetischen Linkersequenzen zur Insertion in das Plasmid pGL2;
Fig. 6 ist eine Darstellung der Nucleotidsequenz eines Fragments von pGL2;
Fig. 7 ist eine Darstellung der Plasmidkarte von pGL2B und pGL2BIFN;
Fig. 8 ist eine Darstellung der Nucleotidsequenz eines Fragments von pGL2BIFN;
Fig. 9 stellt das Plasmid pALCA1S und ein Verfahren zu dessen Herstellung dar;
Fig. 10 stellt die Plasmidkarte von pALCA1SIFN und ein Verfahren zu dessen Herstellung dar;
Fig. 11 stellt die Nucleotidsequenz eines Fragments von pALCA1SIFN dar;
Fig. 12 stellt eine Plasmidkarte von pGL2CENDO dar;
Fig. 13 stellt die Nucleotidsequenz eines Fragments von pGL2CENDO dar;
Fig. 14 stellt eine Plasmidkarte von pALCA1SENDO dar;
Fig. 15 stellt die Nucleotidsequenz eines Fragments von pALCA1SENDO dar;
Fig. 16 stellt das Plasmid pALCA1AMY und ein Verfahren zu dessen Herstellung dar; und
Fig. 17 stellt die Nucleotidsequenz eines Segments von pALCA1AMY, das in Fig. 16 gezeigt ist, dar.

Ausführliche Darstellung bevorzugter Ausführungsformen

In der vorliegenden Erfindung wird eine geeignete Promotorregion eines funktionierenden Gens in A. niger oder A. nidulans oder dergl. identifiziert. Die Verfahren zur Identifizierung der einzelnen Gene, die die gewünschten Promotorregionen enthalten, sind ähnlich, und aus diesem Grund wird hier die Lokalisierung und Identifizierung des alcA-Gens und des Promotors darin dargelegt. Zu diesem Zweck werden Zellen der gewählten Spezies induziert, um das gewählte Protein, z. B. alcA, zu exprimieren, und aus diesen Zellen wird die Messenger-RNA isoliert. Ein bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht identifizierter Abschnitt davon kodiert alcA. Komplementäre DNA für diese Fragmente wird aus den mRNA-Fragmenten hergestellt und in einen Vektor kloniert. Aus induziertem A. nidulans isolierte Messenger-RNA wird größenfraktioniert, um alcA-Sequenzen anzureichern, endmarkiert und an die cDNA-Klone hybridisiert, die aus dem alcA&spplus;-Stamm hergestellt wurden. Der Klon, der die cDNA enthält, die an alcA+-mRNA hybridisiert, enthält eine DNA-Kopie der alcA-mRNA. Dieses Stück wird an eine Gesamt-DNA-Genbibliothek aus der gewählten Aspergillus-Spezies hybridisiert, um die gewählte kodierende Region, z. B. alcA, und deren flankierende Regionen zu isolieren. Die aldA-kodierende Region wurde unter Anwendung analoger Verfahren isoliert.
Die kodierende Region beginnt an ihrem 5'-Ende mit einem ATG-Codon, das Methionin kodiert, in Übereinstimmung mit anderen kodierenden Regionen und Proteinen. Wenn die Aminosäuresequenz des exprimierten Proteins bekannt ist, dann ist die DNA-Sequenz der kodierenden Region ohne weiteres erkennbar. Unmittelbar "stromaufwärts" vom ATG-Codon befindet sich der Leiterabschnitt der Messenger-RNA, dem die Promotorregion vorausgeht.
Es wird auf Figg. 1A und 1B Bezug genommen. Diese Figuren zeigen Abschnitte der Gesamt-DNA-Sequenz von A. nidulans in herkömmlicher Basenbezeichnung. Der in Fig. 1A gezeigte Abschnitt enthält die Promotorregion und die kodierende Region des alcA-Gens, das das Enzym Alkoholdehydrogenase 1 kodiert. Der in Fig. 1B gezeigte Abschnitt enthält die Promotorregion und die Region, die das Enzym Aldehyddehydrogenase kodiert, d. h. aldA. (In beiden Fällen bezeichnet der Ausdruck "IVS" Zwischensequenzen.) Die Aminosäuresequenzen dieser beiden Enzyme sind in anderen Spezies bekannt. Daraus sind die Regionen 10 und 10' als kodierende Regionen erkennbar. Jede kodierende Region beginnt an ihrem 5'-Ende ("stromaufwärtigem" Ende) mit dem Methionin-Codon ATG bei 12. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die von den Protein-kodierenden Regionen kodiert werden, sind unterhalb der entsprechenden Zeilen in Figg. 1A und 1B in herkömmlichen Abkürzungen angegeben. Unmittelbar stromaufwärts vom Codon 12 befindet sich die Region, die die Messenger-RNA-Leitersequenz und die Promotorregion kodiert, deren erforderliche Länge, um alle essentiellen strukturellen Merkmale, die ihre Funktion als Promotor ermöglichen, zu enthalten, nun bestimmt oder zumindest abgeschätzt werden muß. Die Figg. 1A und 1B zeigen jeweils eine Sequenz von etwa 800 Basen in jedem Fall stromaufwärts vom ATG-Codon 12.
Aus der Analogie zu anderen bekannten Promotoren ist vorhersagbar, daß alle funktionell essentiellen Merkmale wahrscheinlich innerhalb einer Sequenz mit einer Länge von etwa 1000 Basen und wahrscheinlich innerhalb der dargestellten Sequenz von 800 Basen und mit größter Wahrscheinlichkeit innerhalb der Sequenz der ersten 200 bis 300 Basen, d. h. zurück bis etwa Position 14 in Figg. 1A und iB, enthalten sind. Eine essentielle Funktion einer Promotorregion besteht darin, eine Stelle für die genaue Initiation der Transkription bereitzustellen, die als eine TATA-Box-Sequenz bekannt ist. Eine derartige Sequenz findet sich bei 16 in der alcA-Promotorsequenz von Fig. 1A und bei 16' in der aldA-Promotorsequenz von Fig. 1B. Eine weitere Funktion einer Promotorregion besteht darin, eine geeignete DNA-Sequenz bereitzustellen, die aktiv hinsichtlich der Regulierung der Gentranskription ist, d. h. eine Bindungsstelle für ein regulatorisches Molekül, das die Gentranskription verstärkt, oder um das Gen aktiv oder inaktiv zu machen. Derartige Regulatorregionen befinden sich innerhalb der Promotorregion, die in den Figg. 1A und 1B für das alcA-Gen bzw. das alcA-Gen gezeigt ist.
Der genaue stromaufwärtige 5'-Terminus der hier als eine Promotorregion verwendeten DNA-Sequenz ist nicht kritisch, sofern die Sequenz die essentiellen funktionellen Sequenzen, wie sie hier beschrieben werden, enthält. Überschüssige DNA-Sequenzen stromaufwärts vom 5'-Terminus sind unnötig, es ist jedoch unwahrscheinlich, daß sie für die vorliegende Erfindung schädlich sind.
Wenn das Ausmaß der Sequenz, die alle essentiellen funktionellen Merkmale enthält, um eine Promotorregion des gegebenen Gens zu bilden, durch die hier beschriebenen Techniken bestimmt worden ist, besteht die nächste Stufe darin, die DNA-Kette an einer geeigneten Stelle stromabwärts vom Promotorregion-Terminus zu schneiden und die Protein-kodierende Region zu entfernen, wobei im wesentlichen eine Sequenz zurückbleibt, die die Promotorregion und gelegentlich einen Teil der Region, die für die Messenger- RNA-Leitersequenz kodiert, umfaßt. Zu diesem Zweck müssen geeignet angeordnete Restriktionsstellen lokalisiert werden, und anschließend muß die DNA mit den entsprechenden Restriktionsenzymen behandelt werden, um einen Schnitt zu bewirken. Restriktionsstellen sind aus der in Fig. 1A dargestellten alcA-Sequenz erkennbar. Für den stromaufwärtigen Schnitt wird eine Stelle gewählt, die ausreichend weit stromaufwärts liegt, so daß im beibehaltenen Abschnitt alle essentiellen funktionellen Stellen für die Promotorregion eingeschlossen sind. Im Hinblick auf den stromabwärtigen Schnitt gibt es keine Restriktionsstelle genau am ATG-Codon 12 im Fall von alcA. Die nächste stromabwärtige Restriktionsstelle dazu ist die Sequenz GGGCCC bei 13, an der die Kette mit dem Restriktionsenzym Apal geschnitten werden kann. Gegebenenfalls können nach einem derartigen Schnitt die restlichen Nucleotide von der Stelle 13 bis zur Stelle 12 stufenweise unter Verwendung einer Exonuclease entfernt werden. Bei Kenntnis der Anzahl derartiger Nucleotide, die entfernt werden sollen, kann die Exonucleaseeinwirkung in geeigneter Weise beendet werden, wenn der Ort 12 erreicht ist. Indem eine ähnliche Restriktionsstelle stromabwärts vom Methionincodon 12 der in Fig. 1B gezeigten aldA-kodierenden Region lokalisiert wird, wird diese Promotorregion in ähnlicher Weise für die anschließende Verwendung ausgeschnitten. In vielen Fällen sind restliche Nucleotide am 5'-Ende der Promotorregion nicht schädlich für die Funktion der Promotorregion und stören diese nicht in signifikanter Weise, solange der Leserahmen der Basentripletts erhalten bleibt.
Fig. 2 der beigefügten Zeichnung erläutert diagrammatisch die Stufen in einem Verfahren zur Herstellung von Plasmid pDG6, das zur Erzeugung von erfindungsgemäßen Aspergillus-Transformanten verwendet werden kann. In Fig. 2 bezeichnet 18 ein rekombinantes Plasmid, das die Endoglucanase (cellulase)-kodierende Region 30 aus dem Bakterium cellulomonas fimi, nämlich ein Barnhi-Endoglucanase-Fragment aus C. fimi im bekannten Vektor M13MP8, enthält. Es enthält relevante Restriktionsstellen für EcoRI, HindIII und BamHI, wie es gezeigt ist, sowie weitere, die nicht gezeigt sind und für das vorliegende Verfahren nicht von Bedeutung sind. Bezugszeichen 20 bezeichnet ein rekombinantes Plasmid, das p5 genannt wird, aus dem bekannten E. coli-Plasmid pBR322 konstruiert wurde und ein EcoRI-Fragment aus A. nidulans enthält, das die alcA-Promotorregion, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, zusammen mit einem kleinen Abschnitt der alcA-kodierenden Region unter Einschluß des Startcodons ATG enthält. Es weist Restriktionsstellen auf, wie sie angegeben sind, sowie weitere Restriktionsstellen, die bei dem vorliegenden Verfahren nicht genutzt werden und daher nicht erläutert werden. Das Plasmid p5 enthält eine DNA-Sequenz 22 von der Stelle EcoRI (3') bis zur Stelle HindIII (5'), die tatsächlich ein Teil der in der oberen Reihe von Fig. 1A angegebenen Sequenz von Position 15 (die Sequenz GAATTC in diesem Bereich bildet eine EcoRI-Restriktionsstelle) bis Position 17 ist. Die Sequenz 22 im Plasmid 20 weist eine Länge von ungefähr 2 kb auf.
Die Plasmide 18 und 20 werden anschließend mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII geschnitten, so daß die alcA-Promotorregion und die Endoglucanase-kodierende Region 30 ausgeschnitten werden, die in das mit Hindill geschnittene Plasmid pUC12 ligiert werden, und zwar unter Bildung eines neuen Konstrukts pDG5A, das diese Sequenzen in pucl2 enthält, wie es in Fig. 2 gezeigt ist. Das Plasmid pUC12 ist ein bekanntes, im Handel erhältliches E. coli-Plasmid, das in wirksamer Weise in E. coli repliziert wird, so daß vielfache Kopien von pDG5A hergestellt werden können, wenn dies gewünscht ist. Das neue Konstrukt pDG5A wird von den anderen Produkten der Konstruktherstellung getrennt. Sodann wird das Konstrukt pDG5A mit einem selektierbaren Marker versehen, so daß anschließend erhaltene Transformanten von Aspergillus, in die das Konstrukt erfolgreich eingetreten ist, selektiert und isoliert werden können. Im Fall von Arg W-Aspergillus- Wirten kann man zweckmäßigerweise ein Arg B-Gen aus A. nidulans für diesen Zweck verwenden. Das Arg B-Gen kodiert das Enzym Ornithintranscarbamylase, und Stämme, die dieses Gen enthalten, sind ohne weiteres gegenüber Arg B&supmin;- Stämmen durch Standardplattier- und Züchtungstechniken selektierbar und isolierbar. Arg B&supmin;-Stämme wachsen nicht auf einem Medium, dem Arginin fehlt.
Um einen selektierbaren Marker einzuverleiben, kann gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung, wie es in Fig. 2 erläutert ist, das Konstrukt pDG5A mit dem XbaI-Fragment 32 des Plasmids pDG3 ATCC 53006 (vgl. US-Patentanmeldung Seriennummer 06/678 578 von Buxton et al., eingereicht am 5. Dezember 1984), das das Arg B&spplus;-Gen aus A. nidulans enthält, ligiert werden, und zwar unter Verwendung von XbaI, um das neue Konstrukt pDG6 zu bilden, das die Endoglucanase-kodierende Region, die alcA-Promotorsequenz und das Arg B-Gen enthält. Das Plasmid pDG6 wird dann bei der Transformation zur Herstellung von neuen mutierten Aspergillus-Stämmen, die eine Endoglucanase-kodierende Region unter der Steuerung des alcA-Promotors aufweisen, verwendet, wie es ausführlicher in Beispiel 1 beschrieben wird.
Fig. 3 zeigt in linearer Form die diagrammatische Sequenz eines funktionellen Abschnitts des Konstrukts pDG6 von der Hindill-Stelle 24 bis zur HindIII-Stelle 26. Es enthält die alcA-Promotorregion 22, das ATG-Codon 12 und einen kleinen Restabschnitt der alcA-kodierenden Region stromabwärts vom ATG-Codon, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist, woran sich die Cellulase-kodierende Region 30, die aus dem Plasmid 18 stammt, anschließt.
Das plasmid pDG6 ist lediglich ein Beispiel für einen Vektor, der einen filamentösen Pilzpromotor in Verknüpfung mit einer Protein-kodierenden Region, die für den Pilz fremd ist, enthält. In einem anderen Vektor, der hier als Beispiel mit Bezug auf Fig. 16 erläutert wird und als pALCA1AMY bezeichnet wird, ist der filamentöse Pilzpromotor des alcA-Gens mit der natürlich auftretenden Sequenz, die für das α-Amylaseenzym, ein Produkt, das fremd für den transformierten Pilzwirt ist, kodiert, gekoppelt. Die Proteinprodukte der Vektoren pDG6 und pALCA1AMY werden durch die entsprechenden transformierten Wirte in beiden Fällen exprimiert. Da ferner die α-Amylase-kodierende Region natürlicherweise eine Signalpeptid-kodierende Region enthält, kann dieses Produkt durch den transformierten Wirt unter Verwendung des sekretorischen Apparats des Wirts ungeachtet seiner Fremdheit in bezug auf den Wirt sekretiert werden.
Die Identifizierung und Isolierung der Promotorregionen von filamentösen Pilzen erlaubt es also, den Wirt durch Transformation mit Vektoren, die diese Promotorregionen, gekoppelt mit einer gewünschten kodierenden Region, enthalten, zu manipulieren.
Wenn die kodierende Region des Vektors eine Signalpeptid-kodierende Region erfordert oder die existierende Signalsequenz durch eine andere, vorzugsweise wirksamere Signalpeptid-kodierende Region ersetzt werden soll, dann können derartige Signalpeptid-kodierende Regionen zwischen dem Promotor und dem Segment, das das sekretierte Protein kodiert, integriert werden. Die Plasmide pGL2 (Fig. 4) und pALCA1S (Fig. 9) stellen Zwischenprodukt-Klonierungsvektoren dar, die für diesen Zweck besonders geeignet sind. Jeder kann als eine Kassette wirken, die einen Promotor, eine Signalsequenz und eine Restriktionsstelle stromabwärts von der Signalsequenz bereitstellt, was die Insertion einer Protein-kodierenden Region im richtigen transkriptionalen Leserahmen mit der Signalsequenz erlaubt.
Das in Fig. 4 gezeigte Plasmid pGL2 wird aus pGL1 erzeugt, das den Promotor 40, die Signalsequenz 42 und einen Anfangsabschnitt 46 des Glucoamylasegens enthält, die alle aus einem Segment von A. niger-DNA entsprechend Verfahren, wie sie beispielhaft hier angegeben werden, abgeleitet sind. In diesem Segment ist eine BssHII-Restriktionsstelle zum Ende hin, jedoch innerhalb der Glucoamylse-Signalsequenz 42, verfügbar, deren Nucleotidsequenz im nachstehenden Diagramm 1 wiedergegeben ist. Diagramm 1
Um ein Segment stromabwärts von der Signalsequenz, d. h. einen Linker 44, der imstande ist, eine Protein-kodierende Region im Leserahmen mit der Signalsequenz 42 aufzunehmen, bereitzustellen, wird das Vorhandensein der BssHII-Stelle innerhalb der Signalsequenz und der Ssti-Stelle stromabwärts davon genutzt. Gemäß dieser speziellen Ausführungsform wird ein Segment 46 aus pGL1 ausgeschnitten und durch einen unter drei Linkem, die in Fig. 5 gezeigt sind und mit A, B oder C bezeichnet werden, gewählten Linker ersetzt. Jeder Linker ist imstande, mit dem BssHII-Ende und dem Ssti-Ende zu ligieren. Die Linker sind außerdem so ausgelegt, daß die endständigen Codons der Signalsequenz, die beim Ausschneiden von Segment 46 mit BssHII verlorengehen, wiederhergestellt werden. Ferner bildet jeder Linker eine einzige EcoRV- und BglII/XhoII-Stelle innerhalb seiner Nucleotidsequenz, so daß die Insertion der gewünschten kodierenden Region in den Vektor pGL2 ermöglicht wird.
Die Selektion des geeigneten Linkers erfolgt in Kenntnis mindestens der ersten paar Codons der Protein-kodierenden Region, die in den Linker inseriert werden soll. Damit die Protein-kodierende Region vernünftig einer Translation unterzogen werden kann, muß der Start der Protein-kodierenden Region entweder direkt mit einer speziellen Anzahl von Nucleotiden, d. h. in Tripletts, vom Start der Signalsequenz gekoppelt sein oder eine derartige spezielle Anzahl von Nucleotiden darstellen. Wenn also die Protein-kodierende Region, die inseriert werden soll, ein oder zwei nicht-essentielle Nucleotide (oder ein Nicht-Triplett-Vielfaches davon) in ihrer 5'-Region besitzt, wie es sich durch routinemäßiges Ausschneiden ergeben kann, dann kann einer der drei Linker, die in Fig. 5 gezeigt sind, das Vorhandensein der zusätzlichen überflüssigen Nucleotide kompensieren und dafür sorgen, daß der Start der Protein-kodierenden Region sich im transiationalen Leserahmen mit der Signalsequenz befindet.
Die Aminosäurereste, die von den Linkem A, B und C kodiert werden, erscheinen unter ihren Nucleotidsequenzen, wie es in Fig. 5 angegeben ist, aus der die Wirkung der Addition eines zusätzlichen Nucleotids an die Linkersequenz auf den Leserahmen des Linkers und schließlich auf die inserierte protein-kodierende Region festgestellt werden kann. Indem die Linker so ausgelegt sind, daß die Restriktionsstelle sich stets stromabwärts von der Leserahmenmodifikation befindet, d. h. ein, zwei oder drei Adeninreste in den Linkem A, B bzw. C, kann der Leserahmen der kodierenden Region, die in die Restriktionsstelle inseriert wird, durch geeignete Linkerwahl aufrechterhalten werden.
Beispielhafte Plasmide, bei denen Plasmid pGL2 und spezifische Linkersegmente A, B oder C eingesetzt werden, sind pGL2BIFN, bei dem der Linker B eingesetzt wird und das zur Interferon α-2-Sekretion führt, wenn es bei der Transformation eines filamentösen Pilzes, z. B. Aspergillus sp., verwendet wird, und pGL2CENDO, bei dem der Linker C eingesetzt wird und das zur Endoglucanasesekretion führt, wenn derartige filamentöse Pilze damit transformiert werden.
Während das Plasmid pGL2 eine natürlich auftretende Signalsequenz nutzt, gehört es zum Umfang der Erfindung, auch Vektoren zu verwenden, die synthetische Signalsequenzen enthalten. Ein Beispiel für einen derartigen Vektor ist pALCA1S, der, wie das Plasmid pGL2, einen Zwischenproduktvektor darstellt, in den eine Protein-kodierende Region unter Bildung eines Vektors, der zur Transformation von filamentösen Pilzen imstande ist, inseriert werden kann. Im Gegensatz zu pGL2 wird bei pALCA1S jedoch der alcA- Promotor verwendet, und es wird eine synthetische Signalsequenz verwendet, die mit dem Promotor gekoppelt ist. pALCA1S ist in Fig. 9 erläutert, die ein Schema zu dessen Herstellung zeigt und auf die in den Beispielen weiter Bezug genommen wird. Beispielhafte Plasmide, die aus pALCA1S erzeugt wurden, sind pALCA1SIFN, das zur Sekretion von Interferon α-2 aus einem damit transformierten filamentösen Pilz führt, und pALCA1SENDO, das zur Sekretion von Endoglucanase aus einem filamentösen Puzwirt führt. In beiden Fällen wird die Sekretion ungeachtet der fremden Natur des sekretierten Proteins in bezug auf den Wirt erzielt.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden speziellen, nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben und erläutert.
Jedes der folgenden Beispiele 1 und 2 erläutert die erfolgreiche Transformation eines filamentösen Pilzwirts unter Verwendung von Vektoren mit einem aus einem filamentösen Pilz abgeleiteten Promotor, der mit natürlich auftretenden, jedoch nicht-pilzuchen kodierenden Regionen gekoppelt ist.

Beispiel 1: Transformation von A. nidulans unter Verwendung von pDG6 ATCC 53169

Das in Fig. 2 gezeigte Vektorkonstrukt pDG6 wurde zuerst gemäß dem in Fig. 2 erläuterten Verfahrensschema unter Anwendung von Standardugationsund Restriktionstechniken hergestellt. Anschließend wurde das Konstrukt pDG6 in mutierte Arg W-Zellen von Aspergillus nidulans wie folgt eingeführt:
500 ml komplettes Medium (Cove 1966) + 0,02% Arginin + 10&supmin;&sup5;% Biotin in einem konischen 2 l-Kolben wurden mit 10&supmin;&sup5; Conidia/ml eines A. nidulans Arg B&supmin;-Stamms angeimpft und bei 30ºC unter Schütteln bei 250 U/min für 20 Stunden inkubiert. Die Myzelien wurden durch Filterpapier Whatman Nr. 54 geerntet, mit sterilem entionisiertem Wasser gewaschen und trockengesaugt. Die Myzelien wurden zu 50 ml steril futriertem 1,2 M MgSO&sub4; 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert: 5,8 in einem 250 ml-Kolben gegeben, wobei 20 mg Novozym 234 (Novo Enzyme Industries), 0,1 ml (= 15000 Einheiten) β-Glucuronidase (Sigma) und 3 ml Rinderserumalbumin pro Gramm Myzelien zugegeben wurden. Man ließ den Verdau bei 37ºC unter vorsichtigem Schütteln für 50 bis 70 Minuten ablaufen, wobei periodisch die Protoplastenbildung mittels Lichtmikroskopie überprüft wurde. 50 ml steriles entionisiertes Wasser wurden zugegeben, und die Protoplasten wurden von nicht-verdauten Fragmenten mittels Filtration durch ein 30 µm-Nylonsieb abgetrennt und mittels Zentrifugation bei 2500 g für 5 min in einem Ausschwenkrotor in 50 ml-Röhrchen mit konischem Boden bei Raumtemperatur geerntet. Die Protoplasten wurden durch zweimaliges Resuspendieren und Zentrifugieren in 10 ml 0,6 M KCl gewaschen. Die Anzahl der Protoplasten wurde unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt, und sie wurden in einer Endkonzentration von 10&sup8;/ml in 1,2 M Sorbit, 10 mM Tris/HCl, 10 mM CaCl&sub2;, pH-Wert: 7,5 resuspendiert. Anteile von 0,4 ml wurden in Kunststoffröhrchen gegeben, zu denen pDG6-DNA (Gesamtvolumen: 40 µl in 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert: 8) gegeben wurde, und es wurde bei Raumtemperatur für 25 min inkubiert. Anteile von 0,4 ml, 0,4 ml und dann 1,6 ml 60% PEG4000, 10 mM Tris/HCl, 10 mM CaCl&sub2;, pH-Wert: 7,5 wurden in die einzelnen Röhrchen nacheinander unter vorsichtigem, jedoch gründlichem Mischen zwischen den einzelnen Zugaben gegeben, woran sich eine weitere Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min anschloß. Die transformierten Protoplasten wurden dann zu geeignet angereicherten Minimalmedienüberschichtungen mit 1% Agar plus oder minus 0,6 M Kcl bei 45ºC gegeben und unmittelbar anschließend auf identische (jedoch kalte) Medien in Platten gegossen. Nach 3 bis 5 Tagen bei 37ºC wurde die Anzahl der wachsenden Kolonien gezählt (F. Buxton et al., Gene, Bd. 37 (1985), S. 207-214). Das Verfahren von Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1980), S. 1370-1374) wurde ebenfalls herangezogen.
Die Kolonien wurden in zwei Gruppen eingeteilt. Threonin (11,9 g/l) und Fructose (1 g/l) wurden zu dem Inkubationsmedium für eine Gruppe gegeben, um das darin einverleibte Cellulasegen zu induzieren. Kein Induktor wurde zu der anderen Gruppe gegeben, die durch Wachstum auf Minimalmedium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle reprimiert wurde. Beide Gruppen wurden auf die allgemeine Proteinbildung mit dem Biorad-Assay untersucht, und zwar nach Züchtung, Futration, um die Myzelien abzutrennen, Gefriertrocknung, Zerkleinern und Proteinextraktion mit 20 mM Tris/HCl bei einem pH-Wert von 7.
Um auf die Bildung von Cellulase zu untersuchen, wurden Platten mit Agarmedium mit einem Gehalt an Cellulose (9 g/l, Carboxymethylcellulose) hergestellt, und kleine Stücke von Glasfaser-Filtermaterial, die voneinander isoliert waren, und 75 µg Gesamtprotein aus einem der Transkonjugate wurden zu den einzelnen Filtern gegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden dann entfernt, und die Platten wurden mit Kongorot angefärbt, um die Orte zu bestimmen, an denen Cellulase im Gesamtprotein auf den Filtern vorhanden war, was durch den Zusammenbruch von Cellulose im darunter befindlichen Agarmedium angezeigt wurde. Die Platten wurden durch Waschen mit 5 M NaCl in Wasser entfernt, um die Unterschiede visuell festzustellen.
Von vier mit Threonin und Fructose induzierten Transformanten zeigten drei klar das Vorhandensein von Cellulase im Gesamtproteinprodukt. Die nicht-induzierten, Glucose-reprimierten Transformanten zeigten keine Anzeichen der Cellulasebildung.
Außerdem wurden drei Kontrolltransformanten aus dem gleichen Vektorsystem und den gleichen Stämmen hergestellt, wobei jedoch die Promotorsequenz weggelassen wurde. Keine davon bildete Cellulase, mit oder ohne Induktoren. Das Vorhandensein der C. fimi-Endoglucanase-kodierenden Region wurde durch die Tatsache bestätigt, daß Medium von Threonin-induzierten transformierten Stämmen Reaktivität mit einem monoklonalen Antikörper zeigte, der gegen C. fimi-Endoglucanase erzeugt wurde. Dieser monoklonale Antikörper zeigte keine Kreuzreaktivität mit endogenen A. nidulans-Proteinen in Kontrollstämmen.

Beispiel 2: Transformation von A. nidulans unter Verwendung von pALCA1AMY ATCC 53380

Das Vektorkonstrukt pALCA1AMY wurde unter Anwendung von Standardligations- und Restriktionstechniken hergestellt, wie es in Fig. 16 angegeben ist. Speziell und mit Bezug auf Fig. 16 wurde der Vektor pALCA1, der ein HindIII-EcoRI-Segment enthält, in dem sich der A. nidulans-Alkoholdehydrogenase 1-Promotor 22 befindet (wie es vorstehend beschrieben wurde), an seiner EcoRI-Stelle geschnitten, um die kodierende Region des Weizen-a-Amylasegens 72 zu inserieren, die in einem EcoRI-EcoRI-Fragment enthalten ist, das sich in einem Plasmid p501 befindet (vgl. S. J. Rothstein et al., Nature, Bd. 308 (1984), S. 662-665). Da Weizen-a-Amylase ein natürlicherweise sekretiertes Protein ist, enthält seine kodierende Region 72 eine Signalpeptid-kodierende Region 76 und ein Segment 78, die reife, sekretierte α- Amylase kodieren. Die Ligation der kodierenden Region 72, die in dem EcoRI- EcoRI-Segment von p501 enthalten ist, in die mit EcoRI geschnittene Stelle von pALCA1 stellt das Plasmid pALCA1AMY bereit, in dem der Alca-Promotor 22 funktionell mit der α-Amylase-kodierenden Region assoziiert ist. Die korrekte Orientierung der aus p501 stammenden a-Amylase-kodierenden Region in pALCA1AMY wird durch Sequenzierung über die Ligationsstelle nach Standardverfahren bestätigt. Die Nucleotidsequenz der Promotor/kodierende Region- Verbindung ist in Fig. 17 gezeigt.
A. nidulans kann nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren transformiert werden, wobei Proben des extrazellulären Mediums entnommen und auf Glasfaser-Filterpapiere auf 1% löslichem Stärkeagar aufgebracht werden. Die Filter werden dann nach 8 Stunden bei 37ºC entfernt und umgedreht auf Bechergläser gebracht, die festes bd enthalten (in einem Wasserbad bei 50ºC). Klare Flecken zeigen Stärkeabbau, während restliche Stärke nach Dunkelviolett umschlägt, wobei das Vorhandensein von sekretierter α- Amylase bestätigt wird.
In den nachstehenden Beispielen 3-12 werden Vektoren bereitgestellt, in denen eine ein Sekretionssignalpeptid kodierende Region in den Vektor eingeführt wird, um eine Sekretion eines Fremdproteins aus einem filamentösen Pilz, der mit dem gesamten Vektor transformiert ist, zu erzielen.

Beispiel 3: Herstellung von Plasmid pGL2, einem Zwischenproduktvektor A) Quelle für Promotor und Signalpeptidsequenz

Das Glucoamylasegen von A. niger wurde isoliert, indem eine Genbibliothek, die von DNA abgeleitet war, die in einem Stamm dieses Mikroorganismus verfügbar ist, der bei ATCC unter der Katalognummer 22343 hinterlegt wurde, mit einer Sonde untersucht wurde. Die Untersuchung wurde unter Verwendung von Oligonucleotidsonden durchgeführt, die mit der Biosearch-oligonucleotidsynthese-Ausrüstung und unter Kenntnis der veröffentlichten Aminosäuresequenz des Glucoamylaseproteins hergestellt wurden. Die Aminosäuresequenzdaten wurden einer "reversen Translation" zu Nucleotidsequenzdaten unterzogen, und die Sonden wurden synthetisiert. Die spezielle Genbibliothek, die mit den Sonden untersucht wurde, war ein partieller Sau3A-Verdau von A. niger-DNA, die vorstehend beschrieben wurde, kloniert in die BamHI-Stelle des im Handel erhältlichen Plasmids pUC12, das in E. coli sowohl lebensfähig als auch replizierbar ist.
Ein HindIII-BglII-Stück von DNA, das das Glucoamylasegen enthielt, wurde in pUC12 subkloniert. Anschließend wurde die Anordnung der gewünschten Promotorregion, der Signalpeptid-kodierenden Region und der Protein-kodierenden Region der Glucoamylase in pUC12, das das subkionierte Fragment enthielt, identifiziert. Bei Sequenzierung wurde gezeigt, daß das EcoRI/EcoRI-Fragment (vgl. Fig. 4) einen langen offenen Transiationsieserahmen enthielt, und die Sequenzdaten wurden unter Verwendung der University of Wisconsin-Sequenzanalyseprogramme analysiert.
Ergebnisse der Analyse der Nucleotidsequenz eines Teils der Region des Glucoamylasegens zwischen der 5'-EcoRI-Stelle und der 3'-BssHII-Stelle innerhalb des HindIII-BglII-Fragments sind in Fig. 6 angegeben. Diese Region enthält den Glucoamylsepromotor und die Signalpeptid-kodierende Region.
Innerhalb dieses Fragments, d. h. bei den Nucleotiden 97-102, befindet sich eine "TATA-Box" 48, die eine Stelle bereitstellt, die bei vielen eukaryontischen Promotorregionen für eine genaue Initiation der Transkription erforderlich ist (wahrscheinlich eine RNA-Polymerase II-Bindungsstelle). Dementsprechend wird das Vorhandensein mindestens eines Teils der Promotorregion bestätigt. Ferner ist aufgrund einer Analogie mit anderen bekannten Promotorregionen vorhersagbar, daß alle funktionell essentiellen Merkmale wahrscheinlich innerhalb einer Sequenz von etwa 1000 Basen Länge und mit großer Wahrscheinlichkeit innerhalb der ersten 200 Basen stromaufwärts vom Startcodon für die kodierende Region, d. h. der Nucleotide 206- 208 oder "ATG" 49, dem Codon für Methionin, enthalten sind. Der Promotor und die Transkriptleitersequenz enden also bei Nucleotid 205. Die Identität des Beginns der Promotorregion ist weniger entscheidend, wobei die Promotorregion jedoch die RNA Polymerase II-Bindungsstelle und alle weiteren Merkmale, die für ihre Funktion erforderlich sind, enthalten muß. Während also angenommen wird, daß die EcoRI-EcoRI-Sequenz die gesamte Promotorregion des Glucoamylasegens darstellt, enthält das Fragment, das im Plasmid pGL2 verwendet wird, dieses Fragment im wesentlich größeren Hindill- BamHI/BglII-Segment, um sicherzustellen, daß es wahrscheinlich ist, daß die gesamte Promotorregion korrekt im erhaltenen Plasmid enthalten ist.
Auf der Grundlage, daß die Aminosäuresequenz der reifen Glucoamylase bekannt ist (vgl. Svensson et al., "Characterization of two forms of glucoamylase from Aspergillus niger", Carlsberg Res. Commun., Bd. 47 (1982), S. 55-69) kann eine Nucleotidsequenz des Signalpeptids genau bestimmt werden. Es ist bekannt, daß die Signalpeptid-kodierende Region von Genen, die sekretierte Proteine kodieren, mit dem Methioninrest, den das ATG-Codon 49 kodiert, beginnt. Die Bestimmung eines ausreichenden Anfangsabschnitts der Nucleotidsequenz darüber hinaus, d. h. 3' vom ATG-Codon, stellt Informationen bereit, aus denen die Aminosäuresequenz dieses Abschnitts bestimmt werden kann. Durch Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz kann das Signalpeptid als der Abschnitt des Glucoamylasegens identifiziert werden, der kein Gegenstück in der veröffentlichten Sequenz hat, mit der der Vergleich erfolgt. Die Glucoamylase-Signalpeptid-kodierende Region, die hier definiert wird, wurde zuvor unter Anwendung dieses Verfahrens bestätigt.
Nach den vorstehenden Verfahren wurde bestätigt, daß das HindIII- BamHI/BglII-Fragment, das sich beim partiellen Sau3a-Verdau ergab und in pucl2 einverleibt wurde, die folgenden Merkmale des Glucoamylasegens enthält: einen anfänglichen, möglicherweise nicht relevanten Abschnitt, die Promotorregion, die Signalpeptid-kodierende Region und den restlichen Abschnitt der kodierenden Region. Dieses Fragment, inseriert in das Plasmid pUC12 durch Schneiden mit Hindill und BamHI/BglII sowie Ligation erscheint schematisch in Fig. 4 als Plasmid pGL1. Dieses Plasmid enthält alle Merkmale, die für die Replikation und dergl. erforderlich sind, so daß es in E. coli selektierbar und replizierbar bleibt.

B) Konstruktion des Plasmids pGL2

Unter Verwendung von pGL1 als Vorstufe kann der Plasmidvektor pGL2 gebildet werden, wie es in Fig. 4 gezeigt ist. Die Restriktionsstelle BssHII nahe dem 3'-Ende der Signalsequenz 42 wird zusammen mit der einzigen stromabwärtigen SstI-Stelle genutzt, um eine synthetische Linkersequenz A, B oder C, die in der hier vorgelegten Fig. 5 definiert ist, zu inserieren. pGL1 wird also sowohl mit BssHII als auch mit Ssti geschnitten, wobei der Anfangsabschnitt der Glucoamylase-kodierenden Region 46, der darin enthalten ist, entfernt wird. Anschließend wird eine unter A bis C ausgewählte synthetische Leitersequenz, die so ausgelegt ist, daß sie von BssHII/SstI- kompatiblen Enden flankiert wird, inseriert und ligiert, wobei das Plasmid pGL2 erzeugt wird. Abhängig davon, welche der drei Linkersequenzen verwendet wird, d. h. A, B oder C, wird das erhaltene Plasmid nachstehend als pGL2A, pGL2B bzw. pGL2C bezeichnet.
Die hier identifizierten synthetischen Linkersequenzen sind jeweils mit einzigartigen EcoRV- und BglII-Restriktionsstellen ausgestattet, wie es in Fig. 5 gezeigt ist, in die eine gewünschte Protein-kodierende Region inseriert werden kann. Wenn sie inseriert ist, kann das erhaltene Plasmid verwendet werden, um einen Wirt, z. B. A. niger, A. nidulans und dergl., zu transformieren. Das Vorhandensein der Promotorregion und der Signalpeptidkodierenden Region, die beide von dem Wirt erkannt werden, sorgt für ein Mittel, mit dem die Expression der Protein-kodierenden Region und die Sekretion des auf diese Weise exprimierten Proteins ermöglicht werden.

Beispiel 4: Verwendung des Plasmids pGL2 bei der Erzeugung von pGL2BIFN

Ein Beispiel der Nützlichkeit des Plasmids pGL2 wird nachstehend mit Bezug auf Fig. 7 erläutert, die schematisch die Konstruktion des Plasmids pGL2BIFN aus pGL2B zeigt.
Das Plasmid pGL2B wird hergestellt, wie es allgemein zuvor für pGL2 beschrieben wurde, abgesehen davon, daß speziell die synthetische Linkersequenz "B", die in Fig. 5 gezeigt ist, inseriert wird. Das Bezugszeichen 44 wurde dementsprechend in Fig. 7 in "44B" geändert. Um eine Öffnung im Vektor pGL2B verfügbar zu machen, wird das Plasmid mit EcoRV an der Stelle, die in bezug auf den Linker 44B intern ist, geschnitten. Der Schnitt führt zu stumpfen Enden, die mit einem Fragment, das von stumpfen Enden flankiert wird, unter Verwendung von Ligasen, von denen bekannt ist, daß sie sich für diesen speziellen Zweck eignen, ligiert werden können.
In der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform wird ein Fragment 60, das die kodierende Region von Humaninterferon α-2 enthält, inseriert, wobei pGL2BIFN erzeugt wird. Speziell wurde ein DdeI-BamHI-Fragment 60, das die kodierende Region, die Humaninterferon α-2 kodiert, enthält, aus dem Plasmid pN5H8 (nicht gezeigt) auf der Basis der bekannten Sequenz und der Restriktionskarte dieses Gens ausgeschnitten.
Das Plasmid pN5H8 kombiniert das bekannte Plasmid pAT153 mit dem Interferongen an einer BamHI-Stelle. Das Interferongen darin wird von Slocomb et al., "High level expression of an interferon α-2 gene cloned in phage M13mp7 and subsequent purification with a monoclonal antibody", Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 79 (1982), S. 5455-5459 beschrieben.
Um die klebrigen Enden des Interferonfragments in die geschnittene EcoRV-Stelle von pGL2B zu annelieren, wurden die klebrigen DdeI- und BamHI- Enden unter Verwendung von reverser Transkriptase aufgefüllt und mit einer geeigneten Ligase gemäß Standardtechniken ligiert.
Der Vorteil der Wahl der Linkersequenz B für die Insertion in pGL2 ist aus Fig. 8 ersichtlich, die den Leserahmen der Interferon α-2-kodierenden Region und dessen Beziehung zu der wieder erzeugten Signalpeptidsequenz, ausgedückt als Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz, wie es jeweils in Betracht kommt, zeigt.
Fig. 8 zeigt einen Abschnitt der Promotorregion 40 5' von der Signalsequenz, die mit einem Abschnitt der Glucoamylase-Signalpeptidsequenz 42 beginnend mit dem Methionincodon ATG bei 49 und endend mit dem Lysincodon AAG bei 50 verknüpft ist. In der Tat ist, obwohl die Signalpeptid-kodierende Region sich einen Rest weiter, d. h. bis zum CGC-Codon für Arginin bei 52 erstreckt, dieser letztgenannte Rest in der synthetischen Linkersequenz 44B enthalten, die so ausgelegt ist, daß sie den Verlust des Argininrests während Schneiden und Ligation zur Insertion der Linkersequenz kompensiert. Auf diese Weise bleibt die genetische Sequenz des Signals ungestört.
Auf ähnliche Weise sorgt die Linkersequenz für die Insertion der Interferon α-2-kodierenden Region ohne Änderung von deren Leserahmen. Mit Bezug auf die Figg. 7 und 8 führt die Spaltung der Linkersequenz 448 durch EcoRV zu Linkerfragmenten 44B' und 44B" mit stumpfen Enden. Das Schneiden der Interferon a-2-kodierenden Region an der DdeI-Stelle führt nach Auffüllen der klebrigen Enden, die durch dieses Enzym erzeugt wurden, zu der gewünschten Nucleotidsequenz, ohne daß die Sequenz der kodierenden Region beschädigt wird. Die Ligation der Interferonsequenz, die an der Ddei-Stelle aufgefüllt wurde, in die EcoRV-geschnittene Linkersequenz erhält den natürlichen Leserahmen der Interferon-kodierenden Region, wie aus dem Triplett- Codonzustand zwischen dem Linkerabschnitt 44B' und der Interferon-kodierenden Region 60 ersichtlich ist. Wäre der in Fig. 5 gezeigte Linker A gewählt worden, der ein Nucleotid weniger als der Linker B trägt, dann wäre der gesamte Leserahmen um ein Nucleotid verschoben worden, was zu einer Nonsense- Sequenz geführt hätte. Durch Wahl des synthetischen Linkers B werden Codons zwischen der Signalpeptidsequenz und der Interferon-kodierenden Region zur Verfügung gestellt, die den Leserahmen der kodierenden Region nicht ändern, wenn das stumpfe IF α-2-Fragment korrekt orientiert ist. Die korrekte Orientierung wird durch Sequenzierung von Klonen mit Inserts über die Ligationsverknüpfung selektiert.

Beispiel 5: Expression und Sekretion aus A. nidulans, transformiert mit pGL2BIFN ATCC 53371

Das Plasmid pGL2BIFN wurde mit einem Plasmid, das das Arg&spplus;-Gen enthielt, wie es ausführlicher in der US-Patentanmeldung Seriennummer 678 578, die am 5. Dezember 1984 eingereicht wurde, beschrieben ist, in einen Arg B&supmin;- Stamm von A. nidulans kotransformiert, wobei ein getrenntes Plasmid einen Arg B-selektierbaren Marker enthielt. Arg B&spplus;-Transformanten wurden selektiert, wobei 18 von 20 1-100 Kopien der Humaninterferon α-2-kodierenden Region enthielten (was gemäß Southern-Blot-Analyse bestimmt wurde).
Mehrere Transformanten wurden auf Stärkemedium gezüchtet, um den Glucoamylasepromotor zu induzieren, und das extrazelluläre Medium wurde auf Human-IF α-2 unter Verwendung des CellTech IF α-2-Assayreagenzsatzes untersucht.
Alle Transformanten zeigten einen gewissen Grad der Synthese und Sekretion von nachweisbarem Protein. Zwei Kontrollen, nämlich der Wirtsstamm (nicht transformiert) und eine Arg B&spplus;-Transformante ohne nachweisbare Human- IF α-2-DNA, zeigten keine nachweisbare Synthese von IF α-2-Protein. In einem getrennten Versuch zeigte die Transformation von A. niger anstelle von A. nidulans mit pGL2BIFN, wobei entsprechend das gleiche Verfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, angewandt wurde, die Fähigkeit von A. niger, IF α-2 zu sekretieren.
Der Promotor und die Signairegionen von pGL2BIFN stammen zwar aus A. niger; es wurde jedoch gezeigt, daß sie sowohl in A. nidulans als auch in A. niger ihre Funktion erfüllen.
In der vorliegenden Erfindung können Promotorregionen verwendet werden, die von der Glucoamylase-Promotorregion verschieden sind. Geeignet für die Verwendung sind die Promotorregionen des Alkoholdehydrogenase 1-Gens und des Aldehyddehydrogenasegens, die in den Figg. 1A und 1B dargestellt sind.

Beispiel 6: Konstruktion des Plasmids pALCA1s ATCC 53368 als zwischenproduktvektor

Für die Verwendung im vorliegenden Beispiel wurde der alcA-Promotor eingesetzt, wie er in einem 10,3 kb umfassenden Plasmid pDG6, das bei ATCC im Wirt E. coli JM83 unter der Zugangsnummer 53169 hinterlegt ist, enthalten ist. Eine Plasmidkarte von pDG6 ist in Fig. 2 und zur einfachen Bezugnahme in Fig. 9 gezeigt, auf die nun Bezug genommen wird, um eine weitere Ausführungsform unter Verwendung des alcA-Promotors zu erläutern.
pDG6 umfaßt in seinem HindIII-EcoRI (erstes Auftreten) -Segment die Promotorregion 22 des alcA-Gens sowie einen kleinen 5'-Abschnitt der alcA- kodierenden Region 3' vom Startcodon, und zwar ligiert mit der Endoglucanase-kodierenden Region 30. pDG6 umfaßt ferner eine mehrfache Klonierungsstelle 62 stromabwärts von der C. fimi-Endoglucanase-kodierenden Region 20.
Um die alcA-Promotorregion 22 zurückzugewinnen, wurde pDG6 mit PstI und XhoI geschnitten, wobei der größte Teil der Endoglucanase-kodierenden Region 30 entfernt wurde. In einer zweiten Stufe wurde das linearisierte Plasmid 64 in einer Richtung auf kontrollierte Weise mit Exonuclease III verdaut (die von XhoI, nicht jedoch von PstI-geschnittenen DNA-Enden verdaut), woran sich eine Behandlung mit Nuclease S1 anschloß. Der Verdau wurde zeitlich so eingestellt, daß das Enzym Nucleotide bis zu einer Position 50 Basen 5' vom alcA-ATG-Codon entfernte, wobei die TATA-Box und die Messenger-RNA-Startstelle intakt blieben.
Nach dem Verdau wurde der Vektor 66 unter Erzeugung des Vektors 68, der SalI-XbaI-Restriktionsstellen unmittelbar stromabwärts von der Promotorregion 22 trägt, religiert (wieder zum Kreis geschlossen). Das Schneiden des Vektors 68 mit SalI/XbaI erlaubt die Einführung einer Signalpeptid-kodierenden Region an einem geeigneten Ort innerhalb des Vektors.
Die spezielle Signalpeptid-kodierende Region, die im vorliegenden Beispiel eingesetzt wird, wurde synthetisiert, um eine charakteristische Signalpeptid-kodierende Region zu reproduzieren, die entsprechend Standardverfahren identifiziert wurde, wie sie von G. Von Heijne in Eur. J. Biochem., S. 17-21 (1983) beschrieben wurden. Das synthetische Signal wurde so entwickelt, daß eine 5'-flankierende Sequenz komplementär zu einer SalI- Schnittstelle und eine 3'-flankierende Sequenz, die eine Ligation mit der XbaI-Restriktionssequenz erlaubt, bereitgestellt wurden.
Die Sequenz des synthetischen Sekretionssignals 68 ist nachstehend wiedergegeben:
Das Sekretionssignal als solches beginnt mit Met und endet mit dem vierten Auftreten von Ala, wie es durch den Pfeil angegeben ist.
Sobald sie erzeugt ist, wird die synthetische Sequenz 68, die als Signal wirkt, in die SalI-XbaI-Stelle des Vektors 70 kloniert, was zum Plasmid pALCA1S führt, das die alcA-Promotorregion 22 und die synthetische Peptidsignal-kodierende Region 68 enthält. Daß die Signalpeptid-kodierende Region stromaufwärts von der mehrfachen Klonierungsstelle 62 inseriert wird, ist wesentlich, da die Stelle 62 die Klonierung einer Reihe von Protein-kodierenden Segmenten in dieses Plasmid erlaubt.
Dementsprechend stellt pALCA1S eine wertvolle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

Beispiel 7: Konstruktion des Plasmids pALCA1SIFN

Als ein Beispiel für die Nützlichkeit von pALCA1S wird auf Fig. 10 Bezug genommen, die die Erzeugung von pALCA1SIFN zeigt. Dieses Plasmid umfaßt die Promotorregion 22 des alcA-Gens und die synthetische Signalpeptidkodierende Region 68, die beide aus pALCA1S stammen (Fig. 9). Zusätzlich enthält es die kodierende Region 60, die Humaninterferon α-2 kodiert und aus pGL2BIFN stammt.
Um das Protein-kodierende Segment zu erhalten, wird pGL2BIFN mit EcoRI geschnitten und partiell mit BglII geschnitten (aufgrund des Vorhandenseins von inneren BglII-Stellen). Die Insertion der Protein-kodierenden Region erfolgt durch Schneiden von pALCA1S mit BamHI und EcoRI, die beide in der mehrfachen Klonierungsstelle 62 zur Verfügung stehen, und Ligation der kodierenden Region darin, wobei pALCA1SIFN erzeugt wird.
Die Nucleotidsequenz des erhaltenen Plasmids von der Stelle 1170 Nucleotide stromabwärts von HindIII bis EcoRI ist in Fig. 11 gezeigt, wobei die relevanten Stellen für den Restriktionsendonucleaseverdau angegeben sind. Aus Blatt 3 von Fig. 11 ist ersichtlich, daß die IFn α-2-kodierende Region 60 sich im richtigen Leserahmen mit der synthetischen Signalpeptidkodierenden Region 68 befindet.

Beispiel 8: Expression und Sekretion aus A. nidulans, transformiert mit dem Plasmid pALCA1SIFN

Das Plasmid pALCA1SIFN, das hergestellt wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, wurde in A. nidulans kotransformiert, wobei ein arg B-selektierbarer Marker bereitgestellt wurde. Die arg B&spplus;-Transformanten wurden selektiert und auf das Vorhandensein der Humaninterferon α-2-kodierenden Region überprüft. Anschließend wurden sie auf Threonin enthaltendem Medium gezüchtet, um den alcA-Promotor zu induzieren, wie es im vorstehenden Beispiel 3 beschrieben wurde. Das extrazelluläre Medium wurde auf Human-IF-2 unter Verwendung des Celltech IF α-2-Assayreagenzsatzes untersucht. Elf von zwanzig Transformanten zeigten die Sekretion von Interferon, die in Gegenwart von Threonin induziert und in Gegenwart von Glucose reprimiert wurde.

Beispiel 9: pGL2CENDO ATCC 53372

Entsprechend den in den vorstehenden Beispielen erläuterten Verfahren wurde ein Vektorplasmid, das als pGL2CENDO bezeichnet wird, aus dem Plasmid pGL2C ATCC 53367 analog zu pGL2BIFN, das in Fig. 7 gezeigt ist, konstruiert, wobei es jedoch die Endoglucanase-kodierende Region anstelle der Interferon 2-kodierenden Region enthielt und wobei die synthetische Linkersequenz "C" (Fig. 5) anstelle der Linkersequenz "B" verwendet wurde. Ein Barnhi-Fragment, das die C. fimi-Endoglucanase-kodierende Region 30 enthielt, wurde in die BglII-Stelle von pGL2C inseriert. A. nidulans-Transformanten wurden mit diesem Vektorplasmid hergestellt, und sie zeigten eine Stärke-regulierte Sekretion von Cellulase, die untersucht wurde, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Karte des Vektorplasmids pGL2CENDO ist in Fig. 12 der beigefügten Zeichnung gezeigt, in der 30 die Endonuclease-kodierende Region bezeichnet (die Endonuclease-kodierende Region von Cellulomonas fimi, die im Zusammenhang mit Fig. 2 und Beispiel 1 beschrieben wurde), 42 die Signalpeptid-kodierende Region des Glucoamylasegens bezeichnet und 40 die Promotorregion des Glucoamylasegens bezeichnet. Die Nucleotidsequenz ist in Fig. 13 gezeigt, und sie ist ein Beispiel dafür, daß die Verwendung der Linkersequenz C (Fig. 5) den Leserahmen der Signalpeptid-kodierenden Region 42 und der Endonuclease-kodierenden Region 30 erhält.

Beispiel 10: Konstruktion des Plasmids pALCA1SENDO ATCC 53370

Entsprechend den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren wurde ein Vektorplasmid, das als pALCA1SENDO bezeichnet wird, durch Kombination des EcoRI-linearisierten Plasmids pALCA1S, wie es in Beispiel 5 (Fig. 9) beschrieben wurde, mit einem EcoRI-Fragment, das aus dem Plasmid pDG5B (vgl. Fig. 2) (pDG5, wobei die Orientierung des HindIII-Fragments in pUC12 umgekehrt ist) stammt und die Endonuclease-kodierende Region 30 enthält, konstruiert. Die Karte von pALCA1SENDO ist in Fig. 14 gezeigt, und die Nucleotidsequenz seiner relevanten Region ist in Fig. 15 gezeigt. In diesen Figuren ist die Promotorregion, die von alcA abgeleitet ist, durch das Bezugszeichen 22 bezeichnet; die synthetische Signalpeptid-kodierende Region ist mit 68 bezeichnet, und die Endoglucanase-kodierende Region ist durch Bezugszeichen 30 bezeichnet.

Beispiel 11: Expression und Sekretion von A. nidulans, transformiert mit pALCA1SENDO und pGL2CENDO

A. nidulans wurde mit einem argB&spplus;-selektierbaren Marker und dem Plasmid pALCA1SENDO oder pGL2CENDO, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, kotransformiert. Von den erhaltenen Kotransformanten zeigten mehrere variierende Grade der Sekretion von Cellulase (d. h. Endoglucanase), die auf carboxymethylcelluloseplatten und mit monoklonalen Antikörpertestsystemen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurden, untersucht wurde. Beide Plasmidtransformanten zeigten Sekretion, die durch den verknüpften Promotor gesteuert wurde. Das Plasmid pGL2DENDO wurde durch Stärke induziert, und pALCA1SENDO wurde mit Threonin induziert.

Beispiel 12: Expression und Sekretion aus A. niger, transformiert mit pGL2CENDO

A. niger wurde mit einem argB&spplus;-selektierbaren Marker und dem Plasmid pGL2CENDO kotransformiert. Mehrere der Kotransformanten zeigten variierende Grade der Sekretion von Endoglucanase, die untersucht wurden, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde. Diese Sekretion wurde durch das Vorhandensein von Stärke im Medium induziert.

Beispiel 13: Erhöhte Kopienzahl von regulatorischen Genen

In Aspergillus nidulans wird der alcA-Promotor in Gegenwart eines geeigneten Induktors, wie Ethanol, durch Einwirkung des Genprodukts von alcR, dem positiven regulatorischen Gen für alcA, angeschaltet.
Ergebnisse mit Mehrfachkopietransformanten (die mehrere alcR-Promotoren enthielten) deuten darauf hin, daß das alcR-Genprodukt die Promotorfunktion der mehreren alcA-Promotoren, die eine Stimulation erfordern, begrenzt.
Die Erhöhung der Kopienzahl des alcR-Gens erhöht die Expression von alcR und entspannt diese Situation. Dies kann wie folgt belegt werden: Transformanten mit mehrfachen Kopien des alcA-Promotors in Fusion mit seiner eigenen kodierenden Region (ADH I) vor einem Mehrfach-alcR-Hintergrund (von dem gezeigt wurde, daß er zur Uberproduktion von alcR-Messenger- RNA führt) wachsen nicht gut auf Ethanol. Dies hat seinen Grund wahrscheinlich in der raschen Anreicherung von Aldehyden, dem Produkt des ADH-Abbaus von Ethanol. Die ADH-Aktivität in diesen Stämmen ist hoch. Die erhöhte Aktivität von ADH aufgrund der erhöhten Kopienzahl ist wahrscheinlich für diese Beobachtungen verantwortlich.
Transformanten mit mehrfachen Kopien des alcA-Promotors in Fusion mit Interferon a-2 vor einem Mehrfach-alcR-Hintergrund führen zu erheblich höheren Graden an sekretiertem Interferon. In diesen Stämmen haben im Gegensatz zu denen mit einer einzigen Kopie von alcR viele zusätzliche alcA-Promotoren Zugang zu dem regulatorischen alcR-Protein.
Gemäß bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird also ein Mittel zur Einführung einer kodierenden Region in einen filamentösen Puzwirt bereitgestellt, der bei Transformation das gewünschte Protein sekretiert. Besonders nützliche Zwischenproduktplasmide für diesen Zweck sind pALCA1S und pGL2 (A, B oder C).
Nützliche Transformationsvektoren, die aus diesen Plasmiden erzeugt wurden, umfassen pALCA1SIFN, pGL2BIFN, pALCA1SENDO und pGL2CENDO. Kulturen jedes dieser Plasmide und weiterer Plasmide werden gegenwärtig in einem permanent lebensfähigen Zustand in den Laboratorien von Allelix Inc., 6850 Goreway Drive, Mississauga, Ontario, Kanada gehalten. Die Plasmide werden in diesem Zustand während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung gehalten und während dieser Zeit autorisierten Personen zugänglich gemacht. Nach Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung werden diese Plasmide von der ATCC-Hinterlegungsstelle, die entsprechend dem Budapester Vertrag anerkannt ist, ohne Beschränkung verfügbar sein. Die Zugangsnummern der entsprechenden Hinterlegungen sind in der nachstehenden Tabelle angegeben:

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend:

(i) das Züchten eines filamentösen Pilzes, der durch ein rekombinantes DNA-Konstrukt transformiert ist, wobei in dem Konstrukt eine regulierbare Promotorregion eines filamentösen Pilzgens funktionell mit einem für das Polypeptid kodierenden DNA-Fragment verknüpft ist, wobei:

(a) das DNA-Fragment für die Promotorregion fremd ist; und

(b) die regulierbare Promotorregion durch Ethanol induzierbar ist, wobei die Ethanol-Induzierbarkeit durch das alcR-Genprodukt vermittelt wird;

(ii) unter Bedingungen, bei denen die regulierte Expression des Polypeptids erfolgt; und

(iii) das Gewinnen des Polypeptids.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Promotorregion durch Glucose reprimierbar ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, umfassend das Züchten des filamentösen Pilzes in Gegenwart von Glucose während der Zellwachstumsphase und das Zusetzen eines Inducers in Abwesenheit von Glucose, um die Aktivität der Promotorregion zu verstärken.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Promotorregion von einem Alkohol-dehydrogenase-Gen oder einem Aldehyddehydrogenase-Gen eines filamentösen Pilzes abgeleitet ist.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das DNA- Konstrukt, das die regulierbare Promotorregion enthält, in mehrfachen Kopien vorhanden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der filamentöse Pilzstamm das alcR über das normale Niveau hinaus exprimiert, wodurch das Expressionsniveau der mehrfachen Kopien des DNA-Konstrukts, das die regulierbare Promotorregion enthält, erhöht wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die regulierbare Promotorregion von einem Aspergillus-Gen abgeleitet ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die regulierbare Promotorregion von einem Aspergillus nidulans-Gen abgeleitet ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die regulierbare Promotorregion von einem Aspergillus niger-Gen abgeleitet ist.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich beim filamentösen Pilz um einen Aspergillus-Pilz handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich beim Aspergillus-Pilz um A. nidulans handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich beim Aspergillus-Pilz um A. niger handelt.

13. Filamentöser Pilz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 12.

14. Rekombinantes DNA-Konstrukt, umfassend eine regulierbare Promotorregion eines filamentösen Pilzgens, die operativ mit einem für das Polypeptid kodierenden DNA-Fragment verknüpft ist, wobei:

(a) das DNA-Fragment für die Promotorregion fremd ist; und

15. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 14, das zusätzlich der Definition in einem der Ansprüche 2 oder 4 bis 12 entspricht.