JP2995770B2 - 異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、黄麹菌または黒麹菌を宿主として用い、遺
伝子組み換え技術による異種蛋白質を効率的に産生する
方法を提供するものである。本発明は、黄麹菌または黒
麹菌由来のGAP−DHプロモーターを発現系に使用するこ
とを特徴とする。
伝子組み換え技術による異種蛋白質を効率的に産生する
方法を提供するものである。本発明は、黄麹菌または黒
麹菌由来のGAP−DHプロモーターを発現系に使用するこ
とを特徴とする。
酵母プロモーターとしてGAP−DHは周知であり、Ｂ型
肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）等の多く異種蛋白質の
産生プラスミドに利用されている（Bitler,G.A ＆ Ego
u,K.M.,Gene,32,263−274（1984））。例えばHBsAg産生
用プラスミドpGG5はGAP−DHプロモーター、HBsAg遺伝
子、GAP−DHターミネーター、大腸菌での複製開始点、
マーカー遺伝子及び酵母での複製開始点によって構築さ
れた（特開昭62−175180号）。
肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）等の多く異種蛋白質の
産生プラスミドに利用されている（Bitler,G.A ＆ Ego
u,K.M.,Gene,32,263−274（1984））。例えばHBsAg産生
用プラスミドpGG5はGAP−DHプロモーター、HBsAg遺伝
子、GAP−DHターミネーター、大腸菌での複製開始点、
マーカー遺伝子及び酵母での複製開始点によって構築さ
れた（特開昭62−175180号）。
黄麹菌および黒麹菌は遺伝子組み換え技術の新規な宿
主であり、その発現系の研究はほとんどなされていな
い。そのため本菌がどのようなタイプのプロモーターを
有しているか、本宿主系で異種蛋白質を発現するために
どのタイプの発現系が効率的かは全く未知の分野であ
る。
主であり、その発現系の研究はほとんどなされていな
い。そのため本菌がどのようなタイプのプロモーターを
有しているか、本宿主系で異種蛋白質を発現するために
どのタイプの発現系が効率的かは全く未知の分野であ
る。
本発明の目的は、黄麹菌または黒麹菌より当該宿主系
における固有のプロモーターを得、この発現系を使って
異種蛋白質を製造する方法を提供することにある。
における固有のプロモーターを得、この発現系を使って
異種蛋白質を製造する方法を提供することにある。
本発明は、黄麹菌アスペルギルス・オリゼー由来のGA
P−DHプロモーターおよび黄麹菌アスペルギルス・オリ
ゼー由来のGAP−DHターミネーターを使用することを特
徴とする黄麹菌による異種蛋白質の製造方法である。
P−DHプロモーターおよび黄麹菌アスペルギルス・オリ
ゼー由来のGAP−DHターミネーターを使用することを特
徴とする黄麹菌による異種蛋白質の製造方法である。
本発明は、宿主として黄麹菌または黒麹菌を使い、そ
のプロモーターとして黄麹菌由来のGAP−DHプロモータ
ーを使う点において新規なものである。
のプロモーターとして黄麹菌由来のGAP−DHプロモータ
ーを使う点において新規なものである。
本発明においては、既知の酵母由来のGAP−DH（glyce
raldehyde−３−phosphate dehydrogenase）プロモータ
ーをプローブとして調製し、黄麹菌または黒麹菌からの
抽出染色体DNAについて、遺伝子ライブラリーを作製
し、上記プローブによって抽出した。次に、GAP−DHプ
ロモーター領域を含むプラスミドを用いて異種蛋白構造
遺伝子及びマーカー遺伝子を挿入した発現ベクターを構
築した。このベクターを用いて黄麹菌または黒麹菌の形
質転換を行い、目的の異種蛋白質の製造方法を提供し
た。
raldehyde−３−phosphate dehydrogenase）プロモータ
ーをプローブとして調製し、黄麹菌または黒麹菌からの
抽出染色体DNAについて、遺伝子ライブラリーを作製
し、上記プローブによって抽出した。次に、GAP−DHプ
ロモーター領域を含むプラスミドを用いて異種蛋白構造
遺伝子及びマーカー遺伝子を挿入した発現ベクターを構
築した。このベクターを用いて黄麹菌または黒麹菌の形
質転換を行い、目的の異種蛋白質の製造方法を提供し
た。
本発明において、プローブに用いる酵母GAP−DHプロ
モーターは後記参考例１に準じて調製し、また酵母GAP
−DHプロモーター領域（UAS,CAAT box,TATA boxを含
む）を有するプラスミドpYN019の断片を利用した。黄麹
菌または黒麹菌染色体DNAの抽出は、フェノールでの除
蛋白、エタノール沈澱法でおこなった。出発原料の黄麹
菌または黒麹菌は、ATCC42149株（Aspergillus oryza
e）を用いた。染色体DNAは、黄麹菌または黒麹菌のGAP
−DH翻訳領域の一部と翻訳領域に隣接する非翻訳領域を
含む可能性ある断片を適当なプラスミドに接続し、遺伝
子ライブラリーを作製した。
モーターは後記参考例１に準じて調製し、また酵母GAP
−DHプロモーター領域（UAS,CAAT box,TATA boxを含
む）を有するプラスミドpYN019の断片を利用した。黄麹
菌または黒麹菌染色体DNAの抽出は、フェノールでの除
蛋白、エタノール沈澱法でおこなった。出発原料の黄麹
菌または黒麹菌は、ATCC42149株（Aspergillus oryza
e）を用いた。染色体DNAは、黄麹菌または黒麹菌のGAP
−DH翻訳領域の一部と翻訳領域に隣接する非翻訳領域を
含む可能性ある断片を適当なプラスミドに接続し、遺伝
子ライブラリーを作製した。
かくして得られた遺伝子ライブラリーについて、前記
の酵母GAP−DHの翻訳領域のプローブを使ってコロニー
ハイブリダイゼーション法により、スクリーニングし、
陽性クローンを得た。
の酵母GAP−DHの翻訳領域のプローブを使ってコロニー
ハイブリダイゼーション法により、スクリーニングし、
陽性クローンを得た。
このクローンの塩基配列の一部を決定し、A.oryzaeの
GAP−DHの５′側の非翻訳領域と翻訳領域のＮ末側を含
むプラスミドpMT011を得た。
GAP−DHの５′側の非翻訳領域と翻訳領域のＮ末側を含
むプラスミドpMT011を得た。
一方、同様に得た陽性クローンからA.nidulansのGAP
−DHの配列と比較した結果、A.oryzaeのGAP−DHの翻訳
領域のＣ末側と３′側の非翻訳領域を含むプラスミドpM
T012を得た。このプラスミドの黄麹菌または黒麹菌GAP
−DHプロモーター領域を含む断片の塩基配列を決定し、
A.nidulansの遺伝子（Punt,P.J.,Dingemanse,M.A.,Jaco
bs−Meijsing,B.J.M.,Pouwels,P.H.and van den Honde
l,C.A.M.J.J.,Gene,69,49−57（1988）と比較したとこ
ろホモロジーが極めて高いことを確認した。次いでpMT0
11から切り出したGAP−DHプロモーター領域を含むプラ
スミドの下流に異種遺伝子挿入用の制限酵素部位を設
け、これにpMT012から得たGAP−DHターミネーター領域
を挿入した。
−DHの配列と比較した結果、A.oryzaeのGAP−DHの翻訳
領域のＣ末側と３′側の非翻訳領域を含むプラスミドpM
T012を得た。このプラスミドの黄麹菌または黒麹菌GAP
−DHプロモーター領域を含む断片の塩基配列を決定し、
A.nidulansの遺伝子（Punt,P.J.,Dingemanse,M.A.,Jaco
bs−Meijsing,B.J.M.,Pouwels,P.H.and van den Honde
l,C.A.M.J.J.,Gene,69,49−57（1988）と比較したとこ
ろホモロジーが極めて高いことを確認した。次いでpMT0
11から切り出したGAP−DHプロモーター領域を含むプラ
スミドの下流に異種遺伝子挿入用の制限酵素部位を設
け、これにpMT012から得たGAP−DHターミネーター領域
を挿入した。
かくして得たプラスミドは遺伝子発現用のユニットと
して用いられるものであり、適当な異種遺伝子を用時、
当該異種遺伝子挿入用の制限酵素部位に挿入することに
よって、黄麹菌または黒麹菌で発現可能なベクターを提
供するものである。
して用いられるものであり、適当な異種遺伝子を用時、
当該異種遺伝子挿入用の制限酵素部位に挿入することに
よって、黄麹菌または黒麹菌で発現可能なベクターを提
供するものである。
本発明の実施例では、異種遺伝子として黄色ブドウ球
菌（Staphylococcus aureus）由来のブレオマイシン耐
性遺伝子を用いたが、この遺伝子はヒト由来のウロキナ
ーゼ、ヒトTPA、ヒトアルブミン、各種インターフェロ
ン等の生理活性物質遺伝子であっても当然よい。
菌（Staphylococcus aureus）由来のブレオマイシン耐
性遺伝子を用いたが、この遺伝子はヒト由来のウロキナ
ーゼ、ヒトTPA、ヒトアルブミン、各種インターフェロ
ン等の生理活性物質遺伝子であっても当然よい。
次いで、本発明は前記ベクターによって黄麹菌または
黒麹菌を形質転換することによって、異種蛋白質の製造
方法を提供する。黄麹菌としてはA.orizae、A.sojae等
が、黒麹菌としてはA.niger、A.awamori等が用いられ
る。
黒麹菌を形質転換することによって、異種蛋白質の製造
方法を提供する。黄麹菌としてはA.orizae、A.sojae等
が、黒麹菌としてはA.niger、A.awamori等が用いられ
る。
本発明により、黄麹菌または黒麹菌において異種蛋白
質を効率的に製造する方法を提供し、新たな遺伝子工学
的手法による製造技術を可能とした。従って、本発明
は、黄麹菌の宿主ベクター系を用いる有用物質の生産に
大いに寄与するものである。
質を効率的に製造する方法を提供し、新たな遺伝子工学
的手法による製造技術を可能とした。従って、本発明
は、黄麹菌の宿主ベクター系を用いる有用物質の生産に
大いに寄与するものである。
以下に実施例を示すが、本発明は特にこれに限定され
るものではない。
るものではない。
実施例１ 黄麹菌GAP−DHのプロモーター、ターミネーター遺伝子
のクローニングのためのプローブの調製。
のクローニングのためのプローブの調製。
酵母GAP−DHのプロモーター領域（UAS,CAAT box,TATA
boxを含む）を有するpYN019,20μｇをEcoR IとBamH I
で消化後１％低融点ゲル電気泳動を行い、酵母GAP−DH
プロモーター領域をコードする0.65Kbp断片を切り出
し、フェノール抽出、エタノール沈澱により、DNAを回
収した（収量２μｇ）。
boxを含む）を有するpYN019,20μｇをEcoR IとBamH I
で消化後１％低融点ゲル電気泳動を行い、酵母GAP−DH
プロモーター領域をコードする0.65Kbp断片を切り出
し、フェノール抽出、エタノール沈澱により、DNAを回
収した（収量２μｇ）。
酵母GAP−DHの５′側非翻訳領域、翻訳領域、３′側
非翻訳領域を有するpGAP301,20μｇをXba IとSa IIで消
化後、１％低融点ゲル電気泳動を行い、酵母GAP−DH翻
訳領域をコードする0.9Kbp断片を回収した（収量800n
g）。このDNAをNick translation kit（宝酒造製）でラ
ベルした。ラベルの方法はKitのプロトコールに従っ
た。〔α−32P〕dCTPはAmersham製PB10205,3000Ci/mmol
を使用した。ラベルしたプローブはNICK−column（Phar
macia製）により精製した。0.65kb断片をラベルしたプ
ローブ１の比活性は1.68×108cpm/μｇ、0.9kb断片をラ
ベルしたプローブ２の比活性は2.67×108cpm/μｇであ
った。
非翻訳領域を有するpGAP301,20μｇをXba IとSa IIで消
化後、１％低融点ゲル電気泳動を行い、酵母GAP−DH翻
訳領域をコードする0.9Kbp断片を回収した（収量800n
g）。このDNAをNick translation kit（宝酒造製）でラ
ベルした。ラベルの方法はKitのプロトコールに従っ
た。〔α−32P〕dCTPはAmersham製PB10205,3000Ci/mmol
を使用した。ラベルしたプローブはNICK−column（Phar
macia製）により精製した。0.65kb断片をラベルしたプ
ローブ１の比活性は1.68×108cpm/μｇ、0.9kb断片をラ
ベルしたプローブ２の比活性は2.67×108cpm/μｇであ
った。
実施例２ A.oryzaeの染色体DNAの抽出 300ml容三角フラスコに50mlのYPD培地（１％Yeast ex
tract,2％Bacto Peptone,2％Dextrose）を入れたものに
Aspergillus oryzae ATCC42149株を一白金耳植菌し、一
昼夜30℃で振盪培養した。この前培養液を、３容三角
フラスコに500ml YPS培地１％Yeast extract,2％Bacto
Peptone,2％Soluble Starchを入れたもの２本にそれぞ
れ25mlずつ植菌し、一昼夜30℃で振盪培養した。この培
養液（１）を集菌し、湿重量で32.5gの菌体が得られ
た。菌体は乳鉢で破砕後、フェノールで除蛋白し、エタ
ノールで沈澱させ、染色体DNAの抽出を行った。5gの菌
体から、860μｇのDNAが得られた。
tract,2％Bacto Peptone,2％Dextrose）を入れたものに
Aspergillus oryzae ATCC42149株を一白金耳植菌し、一
昼夜30℃で振盪培養した。この前培養液を、３容三角
フラスコに500ml YPS培地１％Yeast extract,2％Bacto
Peptone,2％Soluble Starchを入れたもの２本にそれぞ
れ25mlずつ植菌し、一昼夜30℃で振盪培養した。この培
養液（１）を集菌し、湿重量で32.5gの菌体が得られ
た。菌体は乳鉢で破砕後、フェノールで除蛋白し、エタ
ノールで沈澱させ、染色体DNAの抽出を行った。5gの菌
体から、860μｇのDNAが得られた。
実施例３ （ａ）EcoR I−Hind III 4Kbp断片の遺伝子ライブラリ
ーの調製 黄麹菌の染色体DNA86μｇをHind IIIで一夜消化し、
エタノール沈澱、乾燥の後さらにEcoR Iで６時間消化
し、0.8％低融点アガロースゲル電気泳動をおこなっ
た。約3.4Kbpから4.8Kbpまでのバンドを切り取り、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱によりDNAを回収した。ま
たpUC18,5μｇをEcoR IとHind IIIで一夜消化し、エタ
ノール沈澱、乾燥後、仔ウシ小腸由来アルカリホスファ
ターゼ（CIP）４ユニットで37℃30分、56℃30分反応し
た。さらにCIP4を４ユニットを加え37℃30分、56℃30分
反応し、0.8％低融点アガロースゲル電気泳動により2.7
Kbp断片を切り取り、フェノール抽出、エタノール沈澱
によりDNAを回収した。
ーの調製 黄麹菌の染色体DNA86μｇをHind IIIで一夜消化し、
エタノール沈澱、乾燥の後さらにEcoR Iで６時間消化
し、0.8％低融点アガロースゲル電気泳動をおこなっ
た。約3.4Kbpから4.8Kbpまでのバンドを切り取り、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱によりDNAを回収した。ま
たpUC18,5μｇをEcoR IとHind IIIで一夜消化し、エタ
ノール沈澱、乾燥後、仔ウシ小腸由来アルカリホスファ
ターゼ（CIP）４ユニットで37℃30分、56℃30分反応し
た。さらにCIP4を４ユニットを加え37℃30分、56℃30分
反応し、0.8％低融点アガロースゲル電気泳動により2.7
Kbp断片を切り取り、フェノール抽出、エタノール沈澱
によりDNAを回収した。
染色体DNA3.4Kbp−4.8Kbp断片２μｇとCIP処理したpU
C18 EcoR I−Hind III断片１μｇを含む溶液７μにLi
gation Kit（宝酒造製）のＡ液56μとＢ液７μを加
え、16℃で一夜反応し、competent cells Eschericia c
oli HB101（宝酒造製）に形質転換したところ９万個の
形質転換体が得られた。このうち24個について簡易抽出
法にてプラスミドDNAを調製し、insertDNAがあるかどう
か調べた。その結果すべてinsertDNAを含んでいた。
C18 EcoR I−Hind III断片１μｇを含む溶液７μにLi
gation Kit（宝酒造製）のＡ液56μとＢ液７μを加
え、16℃で一夜反応し、competent cells Eschericia c
oli HB101（宝酒造製）に形質転換したところ９万個の
形質転換体が得られた。このうち24個について簡易抽出
法にてプラスミドDNAを調製し、insertDNAがあるかどう
か調べた。その結果すべてinsertDNAを含んでいた。
（ｂ）コロニーハイブリダイゼーション法によるスクリ
ーニング 32Pでラベルしたプローブ２を用いて、コロニーハイ
ブリダイゼーション法により15000クローンをスクリー
ニングした結果50個のシグナルが認められた。このうち
17個のシグナルから19クローンについてプラスミドDNA
を調製し、BamH I＋Hind IIIで消化したところ、13クロ
ーン（13シグナル）で予測値に近い2.5Kbpのバンドが認
められた。このうち更に４クローンをEcoR I＋Hind II
I、Hind III＋Xbal、EcoR I＋Xbalで消化し、バンドの
サイズを調べたところ予測値とほぼ一致するバンドが認
められ、これらのクローンが目的のクローンである可能
性が高いことが示された。
ーニング 32Pでラベルしたプローブ２を用いて、コロニーハイ
ブリダイゼーション法により15000クローンをスクリー
ニングした結果50個のシグナルが認められた。このうち
17個のシグナルから19クローンについてプラスミドDNA
を調製し、BamH I＋Hind IIIで消化したところ、13クロ
ーン（13シグナル）で予測値に近い2.5Kbpのバンドが認
められた。このうち更に４クローンをEcoR I＋Hind II
I、Hind III＋Xbal、EcoR I＋Xbalで消化し、バンドの
サイズを調べたところ予測値とほぼ一致するバンドが認
められ、これらのクローンが目的のクローンである可能
性が高いことが示された。
さらに、このクローンの塩基配列を、Hind IIIサイト
（酵母のGAP−DHの翻訳領域のプローブとホモロジーの
ある部分）から247bp調べた。この配列とA.nidulansのG
AP−DHの塩基配列（Punt et al.,前出）とのホモロジー
検索を行ったところ、Hind IIIサイトより165番目から2
30番目までの塩基配列と、Punt et al.,Gene（前出）に
記載のA.nidulans GAP−DH遺伝子の584番目から660番目
までの塩基配列（exon VIに相当する領域）の間で、84
％のホモロジーがあることがわかった。これらの結果か
ら、Hind III−EcoR I 4Kbp断片はGAP−DHの翻訳領域の
Ｃ末端と３′側の非翻訳領域を含んでいるものと予想さ
れた。このクローンをpMT012（第１図参照）と命名し
た。
（酵母のGAP−DHの翻訳領域のプローブとホモロジーの
ある部分）から247bp調べた。この配列とA.nidulansのG
AP−DHの塩基配列（Punt et al.,前出）とのホモロジー
検索を行ったところ、Hind IIIサイトより165番目から2
30番目までの塩基配列と、Punt et al.,Gene（前出）に
記載のA.nidulans GAP−DH遺伝子の584番目から660番目
までの塩基配列（exon VIに相当する領域）の間で、84
％のホモロジーがあることがわかった。これらの結果か
ら、Hind III−EcoR I 4Kbp断片はGAP−DHの翻訳領域の
Ｃ末端と３′側の非翻訳領域を含んでいるものと予想さ
れた。このクローンをpMT012（第１図参照）と命名し
た。
実施例４ （ａ）Sac I−Pst I 4.1Kbp断片の遺伝子ライブラリー
の調製 黄麹菌の染色DNA86μｇをSac Iで一夜消化し、エタノ
ール沈澱、乾燥の後さらにPst Iで６時間消化し、0.8％
低融点アガロースゲル電気泳動をおこなった。約3.4Kbp
から4.8Kbpまでのバンドを切り取り、フェノール抽出、
エタノール沈澱によりDNAを回収した。またpUC18,5μｇ
をSac IとPst Iで一夜消化し、エタノール沈澱、乾燥
後、CIP4ユニットで37℃30分、56℃30分反応した。さら
にCIP4ユニットを加え、37℃30分、56℃30分反応し、0.
8％低融点アガロースゲル電気泳動により2.7Kbp断片を
切り取り、フェノール抽出、エタノール沈澱によりDNA
を回収した。
の調製 黄麹菌の染色DNA86μｇをSac Iで一夜消化し、エタノ
ール沈澱、乾燥の後さらにPst Iで６時間消化し、0.8％
低融点アガロースゲル電気泳動をおこなった。約3.4Kbp
から4.8Kbpまでのバンドを切り取り、フェノール抽出、
エタノール沈澱によりDNAを回収した。またpUC18,5μｇ
をSac IとPst Iで一夜消化し、エタノール沈澱、乾燥
後、CIP4ユニットで37℃30分、56℃30分反応した。さら
にCIP4ユニットを加え、37℃30分、56℃30分反応し、0.
8％低融点アガロースゲル電気泳動により2.7Kbp断片を
切り取り、フェノール抽出、エタノール沈澱によりDNA
を回収した。
染色体DNA3.4Kbp−4.8Kbp断片２μｇとCIP処理したpU
C18Sac I−Pst I断片１μｇを含む溶液７μにLigatio
n KitのＡ液56μとＢ液７μを加え、16℃で一夜反
応し、competent cells HB101に形質転換し、６万個の
形質転換体が得られた。このうち24個について簡易抽出
法にてプラスミドDNAを調製し、insertDNAがあるかどう
か調べた。その結果23個にinsertDNAが含まれていた。
C18Sac I−Pst I断片１μｇを含む溶液７μにLigatio
n KitのＡ液56μとＢ液７μを加え、16℃で一夜反
応し、competent cells HB101に形質転換し、６万個の
形質転換体が得られた。このうち24個について簡易抽出
法にてプラスミドDNAを調製し、insertDNAがあるかどう
か調べた。その結果23個にinsertDNAが含まれていた。
（ｂ）コロニーハイブリダイゼーション法によるスクリ
ーニング 32Pでラベルしたプローブ１を用いて、コロニーハイ
ブリダイゼーション法により3500クローンをスクリーニ
ングした結果12個のシグナルが認められた。この12個の
シグナルから、25クローンについて簡易抽出法にてプラ
スミドDNAを調製し、Hind IIIで消化したところ、２ク
ローン（２シグナル）で予測値に近い3.5Kbpのバンドが
認められた。さらに、Sph I、Sac I、Pst I、EcoR I＋H
pa I、EcoR I＋Xba Iで消化し、バンドのサイズを調べ
たところ予測値とほぼ一致するバンドが認められ、これ
らのクローンが目的のクローンである可能性が高いこと
が示された。
ーニング 32Pでラベルしたプローブ１を用いて、コロニーハイ
ブリダイゼーション法により3500クローンをスクリーニ
ングした結果12個のシグナルが認められた。この12個の
シグナルから、25クローンについて簡易抽出法にてプラ
スミドDNAを調製し、Hind IIIで消化したところ、２ク
ローン（２シグナル）で予測値に近い3.5Kbpのバンドが
認められた。さらに、Sph I、Sac I、Pst I、EcoR I＋H
pa I、EcoR I＋Xba Iで消化し、バンドのサイズを調べ
たところ予測値とほぼ一致するバンドが認められ、これ
らのクローンが目的のクローンである可能性が高いこと
が示された。
さらに、このクローンの塩基配列をSac Iサイト（酵
母のGAP−DHの翻訳領域のプローブとホモロジーのある
部分）から200bp調べた。この配列とA.nidulansのGAP−
DHの塩基配列（Punt et al.,前出）とのホモロジー検索
を行ったところ、この配列の相補鎖の塩基配列と、Punt
et al.,Gene（前出）に記載のA.nidulans GAP−DH遺伝
子の1069番目から1266番目までの塩基配列（exon VIの
Ｃ末側に相当する領域）の間で、79％のホモロジーがあ
ることがわかった。これらの結果から、Pst I−Sac I 4
Kbp断片はGAP−DHの翻訳領域のＮ末端側と５′側の非翻
訳領域を含んでいるものと予想された。このクローンを
pMT011（第１図参照）と命名した。
母のGAP−DHの翻訳領域のプローブとホモロジーのある
部分）から200bp調べた。この配列とA.nidulansのGAP−
DHの塩基配列（Punt et al.,前出）とのホモロジー検索
を行ったところ、この配列の相補鎖の塩基配列と、Punt
et al.,Gene（前出）に記載のA.nidulans GAP−DH遺伝
子の1069番目から1266番目までの塩基配列（exon VIの
Ｃ末側に相当する領域）の間で、79％のホモロジーがあ
ることがわかった。これらの結果から、Pst I−Sac I 4
Kbp断片はGAP−DHの翻訳領域のＮ末端側と５′側の非翻
訳領域を含んでいるものと予想された。このクローンを
pMT011（第１図参照）と命名した。
pMT011,pMT012のinsert DNAの一部について塩基配列
を決定した。その結果を第２図に示した。
を決定した。その結果を第２図に示した。
5.GAP−DH遺伝子プロモーター、ターミネーターを用い
た発現ベクターの作製 GAP−DH遺伝子のプロモーター、ターミネーターを用
いた黄麹菌発現ベクターは以下のようにして作製した。
GAP−DH遺伝子のＮ末端側領域がクローニングされたプ
ラスミドpMT011よりHpa I、Stu Iの制限酵素を用いてプ
ロモーター領域を切り出し、pUC118（宝酒造製）のSma
I（宝酒造製）消化物と混合、ライゲーション後、大腸
菌JM109株コンピテントセル（宝酒造製）に導入してプ
ラスミドpGAP001を得た。次にこのプロモーター領域の
下流に異種遺伝子挿入用の制限酵素部位（本実験ではBa
mH I認識部位）を設けるため第３図に示したような部位
特異的変異を行った。部位特異的変異に用いる合成オリ
ゴヌクレオチドはApplied Biosystem社製“DNA合成機”
モデル381Aを使って合成した。また部位特異的変異はア
マシャム社製“Oligonucleotide−directed in vitro m
utagenesis system version2"を用いて行う事ができ
る。この操作によりGAP−DH遺伝子のATG開始コドンから
5base上流にBamH I認識部位が設定されたDNAを有するプ
ラスミドpGAP002を作製できる。
た発現ベクターの作製 GAP−DH遺伝子のプロモーター、ターミネーターを用
いた黄麹菌発現ベクターは以下のようにして作製した。
GAP−DH遺伝子のＮ末端側領域がクローニングされたプ
ラスミドpMT011よりHpa I、Stu Iの制限酵素を用いてプ
ロモーター領域を切り出し、pUC118（宝酒造製）のSma
I（宝酒造製）消化物と混合、ライゲーション後、大腸
菌JM109株コンピテントセル（宝酒造製）に導入してプ
ラスミドpGAP001を得た。次にこのプロモーター領域の
下流に異種遺伝子挿入用の制限酵素部位（本実験ではBa
mH I認識部位）を設けるため第３図に示したような部位
特異的変異を行った。部位特異的変異に用いる合成オリ
ゴヌクレオチドはApplied Biosystem社製“DNA合成機”
モデル381Aを使って合成した。また部位特異的変異はア
マシャム社製“Oligonucleotide−directed in vitro m
utagenesis system version2"を用いて行う事ができ
る。この操作によりGAP−DH遺伝子のATG開始コドンから
5base上流にBamH I認識部位が設定されたDNAを有するプ
ラスミドpGAP002を作製できる。
一方、ターミネーター領域はpMT012をBal I、Sph I
（宝酒造製）で消化することにより単離した。このター
ミネーター領域を含む1120bpのDNA断片をpUC19のHinc I
I/Sph I部位に挿入することにより、プラスミドpGAP003
を得た。このpGAP003をEcoR I/BamH Iで消化したベクタ
ーDNAとpGAP002をEcoR I/BamH Iで消化して得られたGAP
−DHプロモーター断片を混合しライゲーション、大腸菌
JM109株の形質転換によりpGAP004を得た。pGAP004はGAP
−DH遺伝子プロモーター、ターミネーターが並列したプ
ラスミドで、その間に存在するBamH I認識部位に適当な
異種遺伝子を挿入することにより黄麹菌で発現しうるベ
クターである。
（宝酒造製）で消化することにより単離した。このター
ミネーター領域を含む1120bpのDNA断片をpUC19のHinc I
I/Sph I部位に挿入することにより、プラスミドpGAP003
を得た。このpGAP003をEcoR I/BamH Iで消化したベクタ
ーDNAとpGAP002をEcoR I/BamH Iで消化して得られたGAP
−DHプロモーター断片を混合しライゲーション、大腸菌
JM109株の形質転換によりpGAP004を得た。pGAP004はGAP
−DH遺伝子プロモーター、ターミネーターが並列したプ
ラスミドで、その間に存在するBamH I認識部位に適当な
異種遺伝子を挿入することにより黄麹菌で発現しうるベ
クターである。
実施例６ ブレオマイシン耐性遺伝子発現ベクターの作製 ブレオマイシン耐性遺伝子は、大腸菌のトランスポゾ
ンTn5および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
由来のプラスミドpUB110にコードされている（Semon e
t.al（1987）Plasmid,17,46−53）。このうちトランス
ポゾンTn5由来のブレオマイシン耐性遺伝子は、大腸菌
や酵母で機能し、（Gatignol et.al（1987）Mol.Gen.Ge
net.207,342−348）、またpUB110由来ブレオマイシン耐
性遺伝子が大腸菌で機能すること（Semon et.al前出）
は確認されているが、これらの耐性遺伝子が黄麹菌で機
能した例はまだない。本実施例ではpUB110由来ブレオマ
イシン耐性遺伝子をGAP−DH遺伝子プロモーター、ター
ミネーターを用いて発現させるベクターを作製し、その
ベクターで形質転換した株がブレオマイシン耐性を獲得
したことを明らかにした。
ンTn5および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
由来のプラスミドpUB110にコードされている（Semon e
t.al（1987）Plasmid,17,46−53）。このうちトランス
ポゾンTn5由来のブレオマイシン耐性遺伝子は、大腸菌
や酵母で機能し、（Gatignol et.al（1987）Mol.Gen.Ge
net.207,342−348）、またpUB110由来ブレオマイシン耐
性遺伝子が大腸菌で機能すること（Semon et.al前出）
は確認されているが、これらの耐性遺伝子が黄麹菌で機
能した例はまだない。本実施例ではpUB110由来ブレオマ
イシン耐性遺伝子をGAP−DH遺伝子プロモーター、ター
ミネーターを用いて発現させるベクターを作製し、その
ベクターで形質転換した株がブレオマイシン耐性を獲得
したことを明らかにした。
ブレオマイシン耐性遺伝子発現ベクターは第４図に従
って行った。まずpUB110にコードされているブレオマイ
シン耐性遺伝子はHae III/BamH Iの制限酵素消化により
約1300bpのDNA断片として得られる。この断片を大腸菌
プラスミドpUC118（宝酒造製）のHinc II/BamH I部位に
挿入し、プラスミドpBLE001を得た。pBLE001にはブレオ
マイシン耐性遺伝子が含まれているが、そのATG開始コ
ドンの上流の適切な位置に制限酵素認識部位がなく、こ
のままではうまく発現ベクターpGAP004に挿入すること
はできない。そこで、部位特異的変異を用いて適当な位
置に制限酵素認識部位（本実施例ではBamH I）を作製し
た。部位特異的変異の設計およびプライマーの配列は第
４図に示した。また部位特異的変異は前述のアマシャム
社製“Oligo−nucleotide−directed in vitro mutagen
esis system version2"を用いて行うことができる。こ
のようにして作製したpBLE002ではブレオマイシン耐性
遺伝子のATG開始コドンから上流6bpの位置にBamH Iサイ
トが設定される。このpBLE002をBamH Iで消化し、ブレ
オマイシン耐性遺伝子を切り出し、このDNA断片をpGAP0
04のBamH I部位に挿入し、pGAP005を得た。pGAP005は黄
麹菌GAP−DH遺伝子のプロモーター、ターミネーターの
支配下でpUB110由来ブレオマイシン耐性遺伝子を発現で
きるベクターである。
って行った。まずpUB110にコードされているブレオマイ
シン耐性遺伝子はHae III/BamH Iの制限酵素消化により
約1300bpのDNA断片として得られる。この断片を大腸菌
プラスミドpUC118（宝酒造製）のHinc II/BamH I部位に
挿入し、プラスミドpBLE001を得た。pBLE001にはブレオ
マイシン耐性遺伝子が含まれているが、そのATG開始コ
ドンの上流の適切な位置に制限酵素認識部位がなく、こ
のままではうまく発現ベクターpGAP004に挿入すること
はできない。そこで、部位特異的変異を用いて適当な位
置に制限酵素認識部位（本実施例ではBamH I）を作製し
た。部位特異的変異の設計およびプライマーの配列は第
４図に示した。また部位特異的変異は前述のアマシャム
社製“Oligo−nucleotide−directed in vitro mutagen
esis system version2"を用いて行うことができる。こ
のようにして作製したpBLE002ではブレオマイシン耐性
遺伝子のATG開始コドンから上流6bpの位置にBamH Iサイ
トが設定される。このpBLE002をBamH Iで消化し、ブレ
オマイシン耐性遺伝子を切り出し、このDNA断片をpGAP0
04のBamH I部位に挿入し、pGAP005を得た。pGAP005は黄
麹菌GAP−DH遺伝子のプロモーター、ターミネーターの
支配下でpUB110由来ブレオマイシン耐性遺伝子を発現で
きるベクターである。
実施例７ 黄麹菌A.oryzaeのpGAP005による形質転換 現在までA.oryzaeの形質転換に用いられてきた選択マ
ーカーとしてはargB,amdS［Christensen et.al（1988）
BIO/TECHNOLOGY.６,1419−1422］、pyrG〔Mattern et.a
l（1987）Mol.Gen.Genet.210,460−461〕、met〔Iimura
et.al（1987）Agric.Biol.Chem.51,323−328］、niaD
〔Unkles et.al（1989）Mol.Gen.Genet.218,99−104〕
等が挙げられる。ところが工業微生物としてのA.oryzae
の形質転換を考える場合、ドミナントマーカーが必要と
されるが、現在ではアセトアミドの資化性をマーカーと
するamdSの系しか開発されておらず、薬剤耐性等の形質
転換系の開発が重要である。本実施例では前項で作製し
たGAP−DH遺伝子プロモーター、ターミネーターを用い
たブレオマイシン耐性発現ベクター、pGAP005を形質導
入したA.oryzae株がブレオマイシン耐性を獲得できるこ
とを明らかにした。
ーカーとしてはargB,amdS［Christensen et.al（1988）
BIO/TECHNOLOGY.６,1419−1422］、pyrG〔Mattern et.a
l（1987）Mol.Gen.Genet.210,460−461〕、met〔Iimura
et.al（1987）Agric.Biol.Chem.51,323−328］、niaD
〔Unkles et.al（1989）Mol.Gen.Genet.218,99−104〕
等が挙げられる。ところが工業微生物としてのA.oryzae
の形質転換を考える場合、ドミナントマーカーが必要と
されるが、現在ではアセトアミドの資化性をマーカーと
するamdSの系しか開発されておらず、薬剤耐性等の形質
転換系の開発が重要である。本実施例では前項で作製し
たGAP−DH遺伝子プロモーター、ターミネーターを用い
たブレオマイシン耐性発現ベクター、pGAP005を形質導
入したA.oryzae株がブレオマイシン耐性を獲得できるこ
とを明らかにした。
A.oryzaeの形質転換はIimuraらの方法（Iimura et.al
前出）を改変して行った。宿主としてはブレオマイシン
感受性であるA.oryzae IFO4177株およびIFO4181株を用
いた。それぞれの株をスラント〔MD培地;0.2％Malt ext
ract（Difco社製）、0.2％Dextrose（半井化学社製）、
0.01％Bacto Peptone（Difco社製）、2.0％agar（半井
化学社製）〕で30℃、４〜５日培養して胞子形成させた
後、滅菌水に胞子を懸濁させ、胞子溶液を作製した。こ
の胞子溶液を200ml容三角フラスコに30mlのDP培地（2.0
％Dextrin（Difco社製）、1.0％Polypeptone（大五栄養
社製）、0.5％KH2PO4（半井化学社製）、0.1％NaNO
3（半井化学社製）、0.05％MgSO4−7H2O（半井化学社
製））を入れたものに107〜108の胞子を接種し、30℃で
一夜振とう培養した。培養液を3G1ガラスフィルター
（岩田硝子社製）を用いて集菌後、さらに滅菌水で２
回、リン酸バッファー（10mM phosphate buffer（pH6.
0）,5％Nacl）で１回洗浄した。次に菌体を10mlの酵素
溶液〔10mM phosphate buffer（pH6.0）,5％NaCl,20mg/
ml Novozym234（NOVO社製）,2mg/ml Chitinase（Sigma
社製）〕に懸濁し、30℃で２時間保温した。プロトプラ
スト化を顕微鏡で確認後、3G2ガラスフイルター（岩田
硝子社製）を用いてプロトプラストだけを遠心チューブ
に集めた。1000×ｇで５分間遠心分離してプロトプラス
トをペレット化した後、再度リン酸バッファー（前出）
に１回、続いてSTCバッファー（５％NaCl,10mM CaCl2,1
0mM Tris−Cl（pH7.5））に１回懸濁して洗浄後、最終
的にプロトプラスト濃度が１×108個/mlとなるようにST
Cバッファーに懸濁した。このプロトプラスト溶液0.2ml
（２×107プロトプラスト）を15ml容遠心チューブに入
れ：さらにDNA溶液（pGAP005,5〜50μｇ）を添加して混
合後、０℃で30分間静置した。1mlのポリエチレングリ
コール（PEG）溶液（25％PEG4000,10mM CaCl2,10mM Tri
s−Cl（pH7.5））を添加して軽く撹拌後、室温で15分間
静置した。これに5mlのSTCバッファー（前出）を添加し
た後、1000×ｇで遠心分離して上清を取り除いた。この
操作をもう一度繰り返してプロトプラストを洗浄後、最
後に1mlのSTCバッファーに懸濁した。このプロトプラス
ト溶液200μを5mlのTop agar（MD培地＋５％NaCl,0.5
％agar,45℃に保温）と混合後、MDプレート（MD培地＋
５％NaCl,2.0％agar）に重層した。寒天が固化後、30℃
で保温した。培養６時間後、塩酸ブレオマイシン（日本
化薬社製）を最終濃度300μg/mlとなるよう添加した5ml
のTop agar（MD培地＋５％Nacl,0.8％agar,45℃に保
温）を重層した後、30℃で４〜７日間培養した。出現し
てきたコロニーは３〜４回300μg/mlの塩酸ブレオマイ
シンを含むMDプレートで継代後、形質転換体とした。
前出）を改変して行った。宿主としてはブレオマイシン
感受性であるA.oryzae IFO4177株およびIFO4181株を用
いた。それぞれの株をスラント〔MD培地;0.2％Malt ext
ract（Difco社製）、0.2％Dextrose（半井化学社製）、
0.01％Bacto Peptone（Difco社製）、2.0％agar（半井
化学社製）〕で30℃、４〜５日培養して胞子形成させた
後、滅菌水に胞子を懸濁させ、胞子溶液を作製した。こ
の胞子溶液を200ml容三角フラスコに30mlのDP培地（2.0
％Dextrin（Difco社製）、1.0％Polypeptone（大五栄養
社製）、0.5％KH2PO4（半井化学社製）、0.1％NaNO
3（半井化学社製）、0.05％MgSO4−7H2O（半井化学社
製））を入れたものに107〜108の胞子を接種し、30℃で
一夜振とう培養した。培養液を3G1ガラスフィルター
（岩田硝子社製）を用いて集菌後、さらに滅菌水で２
回、リン酸バッファー（10mM phosphate buffer（pH6.
0）,5％Nacl）で１回洗浄した。次に菌体を10mlの酵素
溶液〔10mM phosphate buffer（pH6.0）,5％NaCl,20mg/
ml Novozym234（NOVO社製）,2mg/ml Chitinase（Sigma
社製）〕に懸濁し、30℃で２時間保温した。プロトプラ
スト化を顕微鏡で確認後、3G2ガラスフイルター（岩田
硝子社製）を用いてプロトプラストだけを遠心チューブ
に集めた。1000×ｇで５分間遠心分離してプロトプラス
トをペレット化した後、再度リン酸バッファー（前出）
に１回、続いてSTCバッファー（５％NaCl,10mM CaCl2,1
0mM Tris−Cl（pH7.5））に１回懸濁して洗浄後、最終
的にプロトプラスト濃度が１×108個/mlとなるようにST
Cバッファーに懸濁した。このプロトプラスト溶液0.2ml
（２×107プロトプラスト）を15ml容遠心チューブに入
れ：さらにDNA溶液（pGAP005,5〜50μｇ）を添加して混
合後、０℃で30分間静置した。1mlのポリエチレングリ
コール（PEG）溶液（25％PEG4000,10mM CaCl2,10mM Tri
s−Cl（pH7.5））を添加して軽く撹拌後、室温で15分間
静置した。これに5mlのSTCバッファー（前出）を添加し
た後、1000×ｇで遠心分離して上清を取り除いた。この
操作をもう一度繰り返してプロトプラストを洗浄後、最
後に1mlのSTCバッファーに懸濁した。このプロトプラス
ト溶液200μを5mlのTop agar（MD培地＋５％NaCl,0.5
％agar,45℃に保温）と混合後、MDプレート（MD培地＋
５％NaCl,2.0％agar）に重層した。寒天が固化後、30℃
で保温した。培養６時間後、塩酸ブレオマイシン（日本
化薬社製）を最終濃度300μg/mlとなるよう添加した5ml
のTop agar（MD培地＋５％Nacl,0.8％agar,45℃に保
温）を重層した後、30℃で４〜７日間培養した。出現し
てきたコロニーは３〜４回300μg/mlの塩酸ブレオマイ
シンを含むMDプレートで継代後、形質転換体とした。
実施例８ ブレオマイシン耐性獲得株の解析 前項で得られたブレオマイシン耐性獲得株が真のpGAP
005形質転換株であるかどうかを検討するため、以下の
解析を行った。まず得られたブレオマイシン耐性獲得株
の染色体DNAを実施例２に記入した方法で抽出、精製し
た。次にこれらの染色体をBamH Iで消化後、１％アガロ
ース電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルタ
ーにサザーンブロッティングした。サザーンブロッティ
ングはManiatis等（Maniatis et.al Molecular Clonin
g,（1982）Cold Spring Harbour Laboratory,Cold Spri
ng Harbour,NY）の方法に準じて行った。プローブはpGA
P005をBamH Iで消化して生じる約1200bpのDNA断片を用
いた。この断片はブレオマイシン耐性遺伝子をコードす
るDNA断片である。この断片をアガロースゲルより抽
出、精製し“Random Primer DNA Labeling Kit"（宝酒
造製）を用いて〔α−32P〕d CTPでラベルしプローブと
して用いた。ハイブリダイゼーションの条件はManiatis
等（前出）の方法に従って、ハイブリダイゼーションは
温度65℃、塩濃度６×SSCで行い、洗浄は65℃、0.1×SS
Cの条件で行った。この結果ブレオマイシン耐性獲得株1
0株のうち３株について約1200bpの大きさにプローブと
ハイブリダイズするバンドが検出され、これらの株がpG
AP005によって形質転換された株であることが判明し
た。
005形質転換株であるかどうかを検討するため、以下の
解析を行った。まず得られたブレオマイシン耐性獲得株
の染色体DNAを実施例２に記入した方法で抽出、精製し
た。次にこれらの染色体をBamH Iで消化後、１％アガロ
ース電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルタ
ーにサザーンブロッティングした。サザーンブロッティ
ングはManiatis等（Maniatis et.al Molecular Clonin
g,（1982）Cold Spring Harbour Laboratory,Cold Spri
ng Harbour,NY）の方法に準じて行った。プローブはpGA
P005をBamH Iで消化して生じる約1200bpのDNA断片を用
いた。この断片はブレオマイシン耐性遺伝子をコードす
るDNA断片である。この断片をアガロースゲルより抽
出、精製し“Random Primer DNA Labeling Kit"（宝酒
造製）を用いて〔α−32P〕d CTPでラベルしプローブと
して用いた。ハイブリダイゼーションの条件はManiatis
等（前出）の方法に従って、ハイブリダイゼーションは
温度65℃、塩濃度６×SSCで行い、洗浄は65℃、0.1×SS
Cの条件で行った。この結果ブレオマイシン耐性獲得株1
0株のうち３株について約1200bpの大きさにプローブと
ハイブリダイズするバンドが検出され、これらの株がpG
AP005によって形質転換された株であることが判明し
た。
以上の結果から （１）本実施例でクローニングしたA.oryzaeGAP−DHプ
ロモーター、ターミネーターが活性を有しており、異種
遺伝子を発現させることが可能であること。
ロモーター、ターミネーターが活性を有しており、異種
遺伝子を発現させることが可能であること。
（２）黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来
プラスミドpUB110のコードするブレオマイシン耐性遺伝
子がA.oryzae内で機能し、形質転換の際のドミナントマ
ーカーとして使用できること。
プラスミドpUB110のコードするブレオマイシン耐性遺伝
子がA.oryzae内で機能し、形質転換の際のドミナントマ
ーカーとして使用できること。
が判明した。
第１図はpMT011およびpMT012のinsert DNAの制限酵素地
図を、第２図（ａ）および（ｂ）はA.orizae GAP−DH遺
伝子の塩基配列およびコードされるアミノ酸配列を、第
３図はpGAP004の作製工程図を、第４図はpGAP005の作製
工程図を示す。
図を、第２図（ａ）および（ｂ）はA.orizae GAP−DH遺
伝子の塩基配列およびコードされるアミノ酸配列を、第
３図はpGAP004の作製工程図を、第４図はpGAP005の作製
工程図を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 森田 将典 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 辻川 宗男 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (56)参考文献 特表 昭63−501331（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，69（１）（1988），ｐ．49 −57 Ｇｅｎｅ，84（２）（1989），ｐ. 311−318 Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，15（３) （1989），ｐ．177−180 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎｅＳｅｑ
Claims (2)
- 【請求項１】黄麹菌アスペルギルス・オリゼー由来のGA
P−DHプロモーターおよび黄麹菌アスペルギルス・オリ
ゼー由来のGAP−DHターミネーターを使用することを特
徴とし、且つ該プロモーターが第２図中の塩基番号１〜
811の塩基配列で示される領域内に存在し、該ターミネ
ーターが第２図中の塩基番号2211〜3332の塩基配列で示
される領域内に存在するものである、黄麹菌による異種
蛋白質の製造方法。 - 【請求項２】さらに選択マーカーとしてブレオマイシン
耐性遺伝子を使用する、請求項１記載の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1326473A JP2995770B2 (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | 異種蛋白質の製造方法 |
| EP90123877A EP0436858A1 (en) | 1989-12-15 | 1990-12-12 | Promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and its use |
| CA002031831A CA2031831A1 (en) | 1989-12-15 | 1990-12-13 | Production method for foreign protein |
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| Ｇｅｎｅ，８４（２）（１９８９），ｐ．３１１−３１８ |
Cited By (1)
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