JPH03187392A - 異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
異種蛋白質の製造方法Info
- Publication number
- JPH03187392A JPH03187392A JP1326473A JP32647389A JPH03187392A JP H03187392 A JPH03187392 A JP H03187392A JP 1326473 A JP1326473 A JP 1326473A JP 32647389 A JP32647389 A JP 32647389A JP H03187392 A JPH03187392 A JP H03187392A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gap
- gene
- yellow
- green
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims abstract description 38
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 abstract description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100028633 Cdc42-interacting protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000766830 Homo sapiens Cdc42-interacting protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000549556 Nanos Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006628 dp medium Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01009—Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.9)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、黄麹菌または黒麹菌を宿主として用い、遺伝
子組み換え技術による異種蛋白質を効率的に産生ずる方
法を提供するものである０本発明は、黄麹菌または黒麹
菌由来のＧＡＰ−ＤＨプロモーターを発現系に使用する
ことを特徴とする。
子組み換え技術による異種蛋白質を効率的に産生ずる方
法を提供するものである０本発明は、黄麹菌または黒麹
菌由来のＧＡＰ−ＤＨプロモーターを発現系に使用する
ことを特徴とする。
酵母プロモーターとして（１；ＡＰ−ＤＨは周知であり
、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）等の多く異
種蛋白質の産生プラスミドに利用されている（Ｂｉｔｌ
ｅｒ、Ｇ、Ａ ＆ Ｅｇｏｕ、 Ｋ、Ｍ、、Ｇｅｎｅ、
３２，２６３−２７４（１９８４））、例えば）ＩＢ
ｓＡｇ産住用プラスミドｐＧＧ５はＧＡＰ−ＤＨプロモ
ーター、ＨＢｓＡｇ遺伝子、ＧＡＰ−ＤＨターξネータ
ー、大腸菌での複製開始点、マーカー遺伝子及び酵母で
の複製開始点によって構築された（特開昭６２−１７５
１８０号）。
、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）等の多く異
種蛋白質の産生プラスミドに利用されている（Ｂｉｔｌ
ｅｒ、Ｇ、Ａ ＆ Ｅｇｏｕ、 Ｋ、Ｍ、、Ｇｅｎｅ、
３２，２６３−２７４（１９８４））、例えば）ＩＢ
ｓＡｇ産住用プラスミドｐＧＧ５はＧＡＰ−ＤＨプロモ
ーター、ＨＢｓＡｇ遺伝子、ＧＡＰ−ＤＨターξネータ
ー、大腸菌での複製開始点、マーカー遺伝子及び酵母で
の複製開始点によって構築された（特開昭６２−１７５
１８０号）。
黄麹菌および黒麹菌は遺伝子組み換え技術の新規な宿主
であり、その発現系の研究はほとんどなされていない、
そのため本菌がどのようなタイプのプロモーターを有し
ているか、本宿主系で異種蛋白質を発現するためにどの
タイプの発現系が効率的かは全く未知の分野である。
であり、その発現系の研究はほとんどなされていない、
そのため本菌がどのようなタイプのプロモーターを有し
ているか、本宿主系で異種蛋白質を発現するためにどの
タイプの発現系が効率的かは全く未知の分野である。
本発明の目的は、黄麹菌または黒麹菌より当該宿主系に
おける固有のプロモーターを得、この発現系を使って異
種蛋白質を製造する方法を提供することにある。
おける固有のプロモーターを得、この発現系を使って異
種蛋白質を製造する方法を提供することにある。
本発明は、黄麹菌または黒麹菌由来のＧＡＰ−ＤＨプロ
モーターを使用することを特徴とする黄麹菌による異種
蛋白質の製造方法である。
モーターを使用することを特徴とする黄麹菌による異種
蛋白質の製造方法である。
本発明は、宿主として黄麹菌または黒麹菌を使い、その
プロモーターとして黄麹菌由来のＧＡＰ−ＤＨプロモー
ターを使う点において新規なものである。
プロモーターとして黄麹菌由来のＧＡＰ−ＤＨプロモー
ターを使う点において新規なものである。
本発明においては、既知の酵母由来のＣＨＡＰＤ Ｈ（
ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーターをプロ
ーブとして調製し、黄麹菌または黒麹菌からの抽出染色
体ＤＮＡについて、遺伝子ライブラリーを作製し、上記
プローブによって抽出した。次に、ＧＡＰ−ＤＨプロモ
ーター領域を含むプラスミドを用いて異種蛋白構造遺伝
子及びマーカー遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し
た。このベクターを用いて黄麹菌または黒麹菌の形質転
換を行い、目的の異種蛋白質の製造方法を提供した。
ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーターをプロ
ーブとして調製し、黄麹菌または黒麹菌からの抽出染色
体ＤＮＡについて、遺伝子ライブラリーを作製し、上記
プローブによって抽出した。次に、ＧＡＰ−ＤＨプロモ
ーター領域を含むプラスミドを用いて異種蛋白構造遺伝
子及びマーカー遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し
た。このベクターを用いて黄麹菌または黒麹菌の形質転
換を行い、目的の異種蛋白質の製造方法を提供した。
本発明において、プローブに用いる酵母ＧＡＰＤＨプロ
モーターは後記参考例１に準じて調製し、また酵母ＧＡ
Ｐ−ＤＨブ０モータ ｉｌ域（ＵＡＳ。
モーターは後記参考例１に準じて調製し、また酵母ＧＡ
Ｐ−ＤＨブ０モータ ｉｌ域（ＵＡＳ。
ＣＡＡＴ ｂｏｘ、 ＴＡＴＡ ｂｏｘを含む）を有す
るプラスミドｐＹＮＯ１９の断片を利用した。黄麹菌ま
たは黒麹菌染色体ＤＮＡの抽出は、フェノールでの除蛋
白、エタノール沈澱法でおこなった。出発原料の黄麹菌
または黒麹菌は、ＡＴＣＣ４２１４９株Ωυ■ｑ」亙り
吐ｕ並〉を用いた。染色体ＤＮＡは、黄麹菌または黒麹
菌のＧＡＰ−ＤＨ翻訳頚域の一部と翻訳領域に隣接する
非翻訳領域を含む可能性ある断片を適当なプラスミドに
接続し、遺伝子ライブラリーを作製した。
るプラスミドｐＹＮＯ１９の断片を利用した。黄麹菌ま
たは黒麹菌染色体ＤＮＡの抽出は、フェノールでの除蛋
白、エタノール沈澱法でおこなった。出発原料の黄麹菌
または黒麹菌は、ＡＴＣＣ４２１４９株Ωυ■ｑ」亙り
吐ｕ並〉を用いた。染色体ＤＮＡは、黄麹菌または黒麹
菌のＧＡＰ−ＤＨ翻訳頚域の一部と翻訳領域に隣接する
非翻訳領域を含む可能性ある断片を適当なプラスミドに
接続し、遺伝子ライブラリーを作製した。
かくして得られた遺伝子ライブラリーについて、前記の
酵母ＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のプローブを使ってコロニ
ーハイブリダイゼーシゴン法により、スクリーニングし
、陽性クローンを得た。
酵母ＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のプローブを使ってコロニ
ーハイブリダイゼーシゴン法により、スクリーニングし
、陽性クローンを得た。
このクローンの塩基配列の一部を決定し、ＬｇのＧＡＰ
−ＤＨの５′側の非翻訳領域と翻訳領域のＮ東側を含む
プラスミドｐＭＴＯ１１を得た。
−ＤＨの５′側の非翻訳領域と翻訳領域のＮ東側を含む
プラスミドｐＭＴＯ１１を得た。
一方、同様に得た陽性クローンからＡ、 ｎ１ｄｕｌａ
ｎｓ（７）ＧＡＰ−ＤＨの配列と比較した結果、Ａ、ｕ
ｕｕのＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のＣ東側と３′側の非翻
訳領域を含むプラスミドｐＭＴＯ１２を得た。このプラ
スミドの黄麹菌または黒ａ菌ＧＡＰ−ＤＨプロモーター
領域を含む断片の塩基配列を決定し、紅ｎ１ｄｕｌａｎ
ｓの遺伝子（Ｐｕｎｔ、 Ｐ、Ｊ、、 Ｄｉｎｇｅｍａ
ｎｓｅ、 Ｍ。
ｎｓ（７）ＧＡＰ−ＤＨの配列と比較した結果、Ａ、ｕ
ｕｕのＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のＣ東側と３′側の非翻
訳領域を含むプラスミドｐＭＴＯ１２を得た。このプラ
スミドの黄麹菌または黒ａ菌ＧＡＰ−ＤＨプロモーター
領域を含む断片の塩基配列を決定し、紅ｎ１ｄｕｌａｎ
ｓの遺伝子（Ｐｕｎｔ、 Ｐ、Ｊ、、 Ｄｉｎｇｅｍａ
ｎｓｅ、 Ｍ。
＾、、 Ｊａｃｏｂｓ−Ｍｅｉｊｓｉｎｇ＋ Ｂ、
Ｊ、Ｍ、、Ｐｏｕｗｅｌｓ、Ｐ、Ｈ，ａｎｄｖａｎ ｄ
ｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ＋ Ｃ，＾、Ｍ、Ｊ、Ｊ、、 Ｇｅ
ｎｅ、ｌ、 ４９−５７（１９８Ｂ）と比較したとこ
ろホモロジーが極めて高いことを確認した０次いでｐＭ
ＴＯｌｌから切り出したＧＡＰ−ＤＨプロモーター領域
を含むプラスミドの下流に異種遺伝子挿入用の制限酵素
部位を設け、これにｐ門ＴＯ１２から得たＧＡＰ−ＤＨ
フタ−ネーター領域を挿入した。
Ｊ、Ｍ、、Ｐｏｕｗｅｌｓ、Ｐ、Ｈ，ａｎｄｖａｎ ｄ
ｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ＋ Ｃ，＾、Ｍ、Ｊ、Ｊ、、 Ｇｅ
ｎｅ、ｌ、 ４９−５７（１９８Ｂ）と比較したとこ
ろホモロジーが極めて高いことを確認した０次いでｐＭ
ＴＯｌｌから切り出したＧＡＰ−ＤＨプロモーター領域
を含むプラスミドの下流に異種遺伝子挿入用の制限酵素
部位を設け、これにｐ門ＴＯ１２から得たＧＡＰ−ＤＨ
フタ−ネーター領域を挿入した。
かくして得たプラスミドは遺伝子発現用のユニットとし
て用いられるものであり、適当な異種遺伝子を用時、当
該異種遺伝子挿入用の制限酵素部位に挿入することによ
って、黄麹菌または黒麹菌で発現可能なベクターを提供
するものである。
て用いられるものであり、適当な異種遺伝子を用時、当
該異種遺伝子挿入用の制限酵素部位に挿入することによ
って、黄麹菌または黒麹菌で発現可能なベクターを提供
するものである。
本発明の実施例では、異種遺伝子として黄色ブドウ球菌
（匁財り山兜謹ＩＬ姐匹歴）由来のプレオマイシン耐性
遺伝子を用いたが、この遺伝子はヒト由来のウロキナー
ゼ、ヒトＴＰＡ、ヒトアルブミン、各種インターフェロ
ン等の生理活性物質遺伝子であっても当然よい。
（匁財り山兜謹ＩＬ姐匹歴）由来のプレオマイシン耐性
遺伝子を用いたが、この遺伝子はヒト由来のウロキナー
ゼ、ヒトＴＰＡ、ヒトアルブミン、各種インターフェロ
ン等の生理活性物質遺伝子であっても当然よい。
次いで、本発明は前記ベクターによって黄！Ｉ菌または
黒麹菌を形質転換することによって、異種蛋白質の製造
方法を提供する。黄麹菌としてはＬ虹亘ａｅ、 ＬＬ鱈
１賎等が、黒麹菌としてはＡＬ坦１匹、Ａ、 ａｗａｓ
ｏｒｉ等が用いられる。
黒麹菌を形質転換することによって、異種蛋白質の製造
方法を提供する。黄麹菌としてはＬ虹亘ａｅ、 ＬＬ鱈
１賎等が、黒麹菌としてはＡＬ坦１匹、Ａ、 ａｗａｓ
ｏｒｉ等が用いられる。
〔発明の効果〕
本発明により、黄麹菌または黒麹菌において異種蛋白質
を効率的に製造する方法を提供し、新たな遺伝子工学的
手法による製造技術を可能とした。
を効率的に製造する方法を提供し、新たな遺伝子工学的
手法による製造技術を可能とした。
従って、本発明は、黄麹菌の宿主ベクター系を用いる有
用物質の生産に大いに寄与するものである。
用物質の生産に大いに寄与するものである。
以下に実施例を示すが、本発明は特にこれに限定される
ものではない。
ものではない。
実施例１
黄麹菌ＧＡＰ−ＤＨのプロモーター、ターミネータ−遺
伝子のクローニングのためのプローブの調製。
伝子のクローニングのためのプローブの調製。
酵母ＧＡＰ−ＤＨのプロモーター領域（ＵＡＳ。
ＣＡＡＴ ｂｏｘ、 ＴＡＴＡ ｂｏｘを含む）を有す
るｐＹＮＯ１９，２０μｇをＥｃｏＲＩとＢａ−旧で消
化後１％低融点ゲル電気泳動を行い、酵母ＧＡＰ−ＤＨ
プロモーター領域をコードする０、６５Ｋｂｐ断片を切
り出し、フェノール抽出、エタノール沈澱により、ＤＮ
Ａを回収した（収量２μｇ）。
るｐＹＮＯ１９，２０μｇをＥｃｏＲＩとＢａ−旧で消
化後１％低融点ゲル電気泳動を行い、酵母ＧＡＰ−ＤＨ
プロモーター領域をコードする０、６５Ｋｂｐ断片を切
り出し、フェノール抽出、エタノール沈澱により、ＤＮ
Ａを回収した（収量２μｇ）。
酵母ＧＡＰ−ＤＨの５′側非翻訳領域、翻訳領域、３′
側非翻訳領域を有するｐＧＡＰ３０１．２０μｇをＸｂ
ａｌと５ａｌｌで消化後、１％低融点ゲル電気泳動を行
い、酵母ＧＡＰ−ＤＩ−１翻訳領域をコードする０、
９ Ｋｂｐ断片を回収した（収量８００ｎｇ）、このＤ
ＮＡをＮ１ｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ （
宝酒造製）でラベルした。ラベルの方法はにｆｔのプロ
トコールに従った。 （α−”Ｐ） ｄＣＴＰは＾―
ｅｒｓｈａ−製ＰＢ１０２０５．３０００Ｃ＋／＋ｎ＋
ｏｌ を使用した。ラベルしたプローブはＮｒＣＫｃｏ
ｌｕｇ＋ｎ （Ｐｈａｒｌｌａｃｉａ製）により精製し
た。０．６５ｋｂ断片をラベルしたプローブ１の比活性
は１．６８Ｘ １０”ｃｐｍ／ ｐｇ 、０．９ ｋ
ｂ断片をラベルしたプローブ２の比活性は２．６７Ｘ１
０＠ｃｐｍ／ ｐｇであった。
側非翻訳領域を有するｐＧＡＰ３０１．２０μｇをＸｂ
ａｌと５ａｌｌで消化後、１％低融点ゲル電気泳動を行
い、酵母ＧＡＰ−ＤＩ−１翻訳領域をコードする０、
９ Ｋｂｐ断片を回収した（収量８００ｎｇ）、このＤ
ＮＡをＮ１ｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ （
宝酒造製）でラベルした。ラベルの方法はにｆｔのプロ
トコールに従った。 （α−”Ｐ） ｄＣＴＰは＾―
ｅｒｓｈａ−製ＰＢ１０２０５．３０００Ｃ＋／＋ｎ＋
ｏｌ を使用した。ラベルしたプローブはＮｒＣＫｃｏ
ｌｕｇ＋ｎ （Ｐｈａｒｌｌａｃｉａ製）により精製し
た。０．６５ｋｂ断片をラベルしたプローブ１の比活性
は１．６８Ｘ １０”ｃｐｍ／ ｐｇ 、０．９ ｋ
ｂ断片をラベルしたプローブ２の比活性は２．６７Ｘ１
０＠ｃｐｍ／ ｐｇであった。
実施例２
Ａ、牡社耗の染色体ＤＮＡの抽出
３００＋ｄ容三角フラスコに５０１ｄのＹＰＤ培地（１
％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、 ２％Ｂａｃｔｏ
Ｐｅｐｔｏｎｅ、 ２％［１ｅｘｔｒｏｓｅ）を入れ
たものにハ思ｎ出吐Ｕ少Ｕ赳ＡＴＣＣ４２１４９株を一
白金耳植菌し、−昼夜３０°Ｃで振盪培養した。この前
培養液を、３１１容三角フラスコに５０（ｌｄＹＰｓ培
地１％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ。
％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、 ２％Ｂａｃｔｏ
Ｐｅｐｔｏｎｅ、 ２％［１ｅｘｔｒｏｓｅ）を入れ
たものにハ思ｎ出吐Ｕ少Ｕ赳ＡＴＣＣ４２１４９株を一
白金耳植菌し、−昼夜３０°Ｃで振盪培養した。この前
培養液を、３１１容三角フラスコに５０（ｌｄＹＰｓ培
地１％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ。
２％Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ＋ ２％５ｏｌｕｂ
ｌｅ ５ｔａｒｃｈを入れたもの２本にそれぞれ２５Ｍ
Ｉずつ植菌し、−昼夜３０″Ｃで振盪培養した。この培
養液（１１）を集菌し、湿重量で３２．５ ｇの菌体が
得られた。菌体は乳鉢で破砕後、フェノールで除蛋白し
、エタノールで沈澱させ、染色体ＤＮＡの抽出を行った
。
ｌｅ ５ｔａｒｃｈを入れたもの２本にそれぞれ２５Ｍ
Ｉずつ植菌し、−昼夜３０″Ｃで振盪培養した。この培
養液（１１）を集菌し、湿重量で３２．５ ｇの菌体が
得られた。菌体は乳鉢で破砕後、フェノールで除蛋白し
、エタノールで沈澱させ、染色体ＤＮＡの抽出を行った
。
５ｇの菌体から、８６０ｄｇのＤＮＡが得られた。
実施例３
（ａ）ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩ［４Ｋｂｐ断片の遺
伝子ライブラリーの調製 黄麹菌の染色体ＤＮＡ８６μｇを旧ｎｄｌ［Ｉで一夜消
化し、エタノール沈澱、乾燥の後さらにＥｃｏＲ１で６
時間消化し、０．８％低融点アガロースゲル電気泳動を
おこなった。約３．４ Ｋｂｐから４．８ Ｋｂｐまで
のバンドを切り取り、フェノール抽出、エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収した。またｐＵｃ１８５μｇをＥｃ
ｏＲＩ とＨｉｎｄ ｍで一夜消化し、エタノール沈澱
、乾燥後、仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（Ｃ
ＩＰ）４ユニツトで３７°Ｃ３０分、５６°Ｃ３０分反
応した。さらにＣＩＰ４を４ユニツトを加え３７°Ｃ３
０分、５６℃３０分反応し、０．８％低融点アガロース
ゲル電気泳動により２．７ ｘｂｐ断片を切り取り、フ
ェノール抽出、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した
。
伝子ライブラリーの調製 黄麹菌の染色体ＤＮＡ８６μｇを旧ｎｄｌ［Ｉで一夜消
化し、エタノール沈澱、乾燥の後さらにＥｃｏＲ１で６
時間消化し、０．８％低融点アガロースゲル電気泳動を
おこなった。約３．４ Ｋｂｐから４．８ Ｋｂｐまで
のバンドを切り取り、フェノール抽出、エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収した。またｐＵｃ１８５μｇをＥｃ
ｏＲＩ とＨｉｎｄ ｍで一夜消化し、エタノール沈澱
、乾燥後、仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（Ｃ
ＩＰ）４ユニツトで３７°Ｃ３０分、５６°Ｃ３０分反
応した。さらにＣＩＰ４を４ユニツトを加え３７°Ｃ３
０分、５６℃３０分反応し、０．８％低融点アガロース
ゲル電気泳動により２．７ ｘｂｐ断片を切り取り、フ
ェノール抽出、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した
。
染色体Ｄ Ｎ Ａ ３．４にｂｐ−４，８Ｋｂｐ断片２
μｇとＣＩＰ処理したｐＵｃ１８ ［！ｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄ Ｉ［［断片ｌμｇを含む溶液１ｔｉｌにＬｉｇａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ （宝酒造製）のＡ液５６μｉとＢ液
７μｌを加え、１６°Ｃで一夜反応し、ｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ ｃｅｌｌｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩ（宝酒造製）に形質転換したところ９万個の
形質転換体が得られた。このうち２４個について簡易抽
出法にてプラスミドＤＮＡを調製し、１ｎｓｅｒｔＤ
Ｎ Ａがあるかどうか調べた。その結果すべて１ｎｓｅ
ｒｔＤＮＡを含んでいた。
μｇとＣＩＰ処理したｐＵｃ１８ ［！ｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄ Ｉ［［断片ｌμｇを含む溶液１ｔｉｌにＬｉｇａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ （宝酒造製）のＡ液５６μｉとＢ液
７μｌを加え、１６°Ｃで一夜反応し、ｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ ｃｅｌｌｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩ（宝酒造製）に形質転換したところ９万個の
形質転換体が得られた。このうち２４個について簡易抽
出法にてプラスミドＤＮＡを調製し、１ｎｓｅｒｔＤ
Ｎ Ａがあるかどうか調べた。その結果すべて１ｎｓｅ
ｒｔＤＮＡを含んでいた。
（ｂ）コロニーハイブリダイゼーション法によるスクリ
ーニング ３２Ｐでラベルしたプローブ２を用いて、コロニーハイ
ブリダイゼーション法により１５０００クローンをスク
リーニングした結果５０個のシグナルが認められた。こ
のうち１７個のシグナルから１９クローンについてプラ
スミドＤＮＡを調製し、Ｂａｓ＋ＨＩ＋Ｈｉｎｄｌｌｌ
で消化したところ、１３クローン（１３シグナル）で予
測値に近い２．５ Ｋｂｐのバンドが認められた。この
うち更に４クローンをＥｃｏＲＩ＋旧ｎｄｌｌｌ、旧ｎ
ｄｌｌｌ＋Ｘｂａｌ、 ＥｃｏＲＩ ＋Ｘｂａｌで消化
し、バンドのサイズを調べたところ予測値とほぼ一致す
るバンドが認められ、これらのクローンが目的のクロー
ンである可能性が高いことが示された。
ーニング ３２Ｐでラベルしたプローブ２を用いて、コロニーハイ
ブリダイゼーション法により１５０００クローンをスク
リーニングした結果５０個のシグナルが認められた。こ
のうち１７個のシグナルから１９クローンについてプラ
スミドＤＮＡを調製し、Ｂａｓ＋ＨＩ＋Ｈｉｎｄｌｌｌ
で消化したところ、１３クローン（１３シグナル）で予
測値に近い２．５ Ｋｂｐのバンドが認められた。この
うち更に４クローンをＥｃｏＲＩ＋旧ｎｄｌｌｌ、旧ｎ
ｄｌｌｌ＋Ｘｂａｌ、 ＥｃｏＲＩ ＋Ｘｂａｌで消化
し、バンドのサイズを調べたところ予測値とほぼ一致す
るバンドが認められ、これらのクローンが目的のクロー
ンである可能性が高いことが示された。
さらに、このクローンの塩基配列を、Ｈｉｎｄｌ［Ｉサ
イト（酵母のＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のプローブとホモ
ロジーのある部分）から２４７ｂｐ調べた。
イト（酵母のＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のプローブとホモ
ロジーのある部分）から２４７ｂｐ調べた。
この配列とＡ、 ｎ１ｄｕｌａｎｓのＧＡＰ−ＤＨの塩
基配列（Ｐｕｎｔ ｅｔ ａｌ、＋前出）とのホモロジ
ー検索を行ったところ、旧ｎｄｌｌ［サイトより１６５
番目から２３０番目までの塩基配列と、Ｐｕｎｔ ｅｔ
ａｌ、、 Ｇｅｎｅ（前出）に記載のＬＬｎｉｄｕｌ
ａｎｓ Ｇ Ａ Ｐ −Ｄ Ｈ遺伝子の５８４番目から
６６０番目までの塩基配列（ｅｘｏｎ Ｖｌに相当する
領域）の間で、８４％のホモロジーがあることがわかっ
た。これらの結果から、Ｈ５ｎｄ ＩＩＩ −ＥｃｏＲ
Ｉ４Ｋｂｐ断片はＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のＣ来信と３
′側の非翻訳領域を含んでいるものと予想された。
基配列（Ｐｕｎｔ ｅｔ ａｌ、＋前出）とのホモロジ
ー検索を行ったところ、旧ｎｄｌｌ［サイトより１６５
番目から２３０番目までの塩基配列と、Ｐｕｎｔ ｅｔ
ａｌ、、 Ｇｅｎｅ（前出）に記載のＬＬｎｉｄｕｌ
ａｎｓ Ｇ Ａ Ｐ −Ｄ Ｈ遺伝子の５８４番目から
６６０番目までの塩基配列（ｅｘｏｎ Ｖｌに相当する
領域）の間で、８４％のホモロジーがあることがわかっ
た。これらの結果から、Ｈ５ｎｄ ＩＩＩ −ＥｃｏＲ
Ｉ４Ｋｂｐ断片はＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のＣ来信と３
′側の非翻訳領域を含んでいるものと予想された。
このクローンを、１ＭＴＯ１２（第１図参照）と命名し
た。
た。
実施例４
（ａ）Ｓａｃｌ−Ｐｓｔｌ ４．１にｂｐ断片の遺伝子
ライブラリーの調製 黄麹菌の染色ＤＮＡ８６μｇを５ａｃｌで一夜消化し、
エタノール沈澱、乾燥の後さらにＰｓｔｌで６時間消化
し、０．８％低融点アガロースゲル電気泳動をおこなっ
た。約３．４ Ｋｂｐから４．８にｂｐまでのバンドを
切り取り、フェノール抽出、エタノール沈澱によりＤＮ
Ａを回収した。またｐＵｃｌＢ、 ５ ｔｔｇを５ａ
ｃＩとＰｓｔｌで一夜消化し、エタノール沈澱、乾燥後
、ＣＩＰ ４ユニツトで３７℃３０分、５６℃３０分反
応した。さらにＣＩＰ ４ユニツトを加え、３７°Ｃ３
０分、５６°Ｃ３０分反応し、０．８％低融点アガロー
スゲル電気泳動により２．７ Ｋｂｐ断片を切り取り、
フェノール抽出、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。
ライブラリーの調製 黄麹菌の染色ＤＮＡ８６μｇを５ａｃｌで一夜消化し、
エタノール沈澱、乾燥の後さらにＰｓｔｌで６時間消化
し、０．８％低融点アガロースゲル電気泳動をおこなっ
た。約３．４ Ｋｂｐから４．８にｂｐまでのバンドを
切り取り、フェノール抽出、エタノール沈澱によりＤＮ
Ａを回収した。またｐＵｃｌＢ、 ５ ｔｔｇを５ａ
ｃＩとＰｓｔｌで一夜消化し、エタノール沈澱、乾燥後
、ＣＩＰ ４ユニツトで３７℃３０分、５６℃３０分反
応した。さらにＣＩＰ ４ユニツトを加え、３７°Ｃ３
０分、５６°Ｃ３０分反応し、０．８％低融点アガロー
スゲル電気泳動により２．７ Ｋｂｐ断片を切り取り、
フェノール抽出、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し
た。
染色体ＤＮＡ３．４Ｋｂｐ−４，８Ｋｂｐ断片２μｇと
Ｃｔｐ処理したｐＵｃｌＢ ＥｃｏＲＩ−旧ｎｄ［ｌ断
片１ａｇを含む溶液１μｍにＬｉｇａｔｉｏｎ ）ｆｉ
ｔのＡ液５６ｔｔｌとＢ液１ｕ１．を加え、１６°Ｃで
一夜反応し、ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ ＨＢＩＯ
Ｉに形質転換し、６万個の形質転換体が得られた。この
うち２４個について簡易抽出法にてプラスミドＤＮＡを
１１製し、１ｎｓｅｒｔＤＮＡがあるかどうか調べた。
Ｃｔｐ処理したｐＵｃｌＢ ＥｃｏＲＩ−旧ｎｄ［ｌ断
片１ａｇを含む溶液１μｍにＬｉｇａｔｉｏｎ ）ｆｉ
ｔのＡ液５６ｔｔｌとＢ液１ｕ１．を加え、１６°Ｃで
一夜反応し、ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ ＨＢＩＯ
Ｉに形質転換し、６万個の形質転換体が得られた。この
うち２４個について簡易抽出法にてプラスミドＤＮＡを
１１製し、１ｎｓｅｒｔＤＮＡがあるかどうか調べた。
その結果２３個にｊｎｓｅｒｔＤＮＡが含まれていた。
（ｂ）コロニーハイブリダイゼーション法によるスクリ
ーニング ３２ｐでラベルしたプローブ１を用いて、コロニーハイ
ブリダイゼーション法により３５００クローンをスクリ
ーニングした結果１２個のシグナルが認められた。この
１２個のシグナルから、２５クローンについて簡易抽出
法にてプラス果ドＤＮＡを調製し、旧ｎｄｌｆｆで消化
したところ、２クローン（２シグナル）で予測値に近い
３．５ Ｋｂｐのバンドが認められた。さらに、５ｐｈ
ｌ、 ５ａｃｌ、 Ｐｓｔｌ、 ＥｃｏＲＩ＋Ｈｐａｌ
、 ＥｃｏＲＩ ＋ＸｂａＩで消化し、バンドのサイズ
を調べたところ予測値とほぼ一致するバンドが認められ
、これらのクローンが目的のクローンである可能性が高
いことが示された。
ーニング ３２ｐでラベルしたプローブ１を用いて、コロニーハイ
ブリダイゼーション法により３５００クローンをスクリ
ーニングした結果１２個のシグナルが認められた。この
１２個のシグナルから、２５クローンについて簡易抽出
法にてプラス果ドＤＮＡを調製し、旧ｎｄｌｆｆで消化
したところ、２クローン（２シグナル）で予測値に近い
３．５ Ｋｂｐのバンドが認められた。さらに、５ｐｈ
ｌ、 ５ａｃｌ、 Ｐｓｔｌ、 ＥｃｏＲＩ＋Ｈｐａｌ
、 ＥｃｏＲＩ ＋ＸｂａＩで消化し、バンドのサイズ
を調べたところ予測値とほぼ一致するバンドが認められ
、これらのクローンが目的のクローンである可能性が高
いことが示された。
さらに、このクローンの塩基配列を５ａｃｌサイト（酵
母のＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のプローブとホモロジーの
ある部分）から２００ｂｐｆｉべた。この配列とＡ、
ｎｔｄｕｌａｎｓのＧＡＰ−ＤＨの塩基配列（Ｐｕｎｔ
ｅｔ ａｌ、、前出）とのホモロジー検索を行ったと
ころ、この配列の相補鎖の塩基配列と、Ｐｕｎｔ ｅｔ
ａｌ、、Ｇｅｎｅ （前出）に記載の ７３． ｎ１ｄ
ｕｌａｎｓ ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の１０６９０６９番
目２６６２６６番目塩基配列（ｅｘｏｎ ＶｌのＣ来信
に相当する領域）の間で、７９％のホモロジーがあるこ
とがわかった。これらの結果から、Ｐｓｔｌ−５ａｃｌ
４Ｋｂｐ断片はＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のＮ末端側と
５′側の非翻訳領域を含んでいるものと予想された。こ
のクローンをｐＭＴＯｌｌ（第１図参照）と命名した。
母のＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のプローブとホモロジーの
ある部分）から２００ｂｐｆｉべた。この配列とＡ、
ｎｔｄｕｌａｎｓのＧＡＰ−ＤＨの塩基配列（Ｐｕｎｔ
ｅｔ ａｌ、、前出）とのホモロジー検索を行ったと
ころ、この配列の相補鎖の塩基配列と、Ｐｕｎｔ ｅｔ
ａｌ、、Ｇｅｎｅ （前出）に記載の ７３． ｎ１ｄ
ｕｌａｎｓ ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の１０６９０６９番
目２６６２６６番目塩基配列（ｅｘｏｎ ＶｌのＣ来信
に相当する領域）の間で、７９％のホモロジーがあるこ
とがわかった。これらの結果から、Ｐｓｔｌ−５ａｃｌ
４Ｋｂｐ断片はＧＡＰ−ＤＨの翻訳領域のＮ末端側と
５′側の非翻訳領域を含んでいるものと予想された。こ
のクローンをｐＭＴＯｌｌ（第１図参照）と命名した。
ｐＭＴＯｌｌ、 ｐＭＴＯＩ２の１ｎｓｅｒｔ ＤＮＡ
の一部について塩基配列を決定した。その結果を第２図
に示した。
の一部について塩基配列を決定した。その結果を第２図
に示した。
５、ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子プロモーター、ターミネータ−
を用いた発現ベクターの作製 ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のプロモーター、ターミネータ−を
用いた黄麹菌発現ベクターは以下のようにして作製した
。ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のＮ末端側ｆｉｌ域がクローニン
グされたプラスミドｐＭＴＯ１１よりＨｐａｌ、５ｔｕ
ｌの制限酵素を用いてプロモーターＭ域を切り出し、ｐ
ｔｌｃ１１８ （宝酒造製）の５ｅａｌ （宝酒造製）
消化物と混合、ライゲーション後、大腸菌ＪＭ１０９株
コンピテントセル（宝酒造製〉に導入してプラスくドｐ
ＧＡＰＯＯ１を得た０次にこのプロモーター領域の下流
に異種遺伝子挿入用の制限酵素部位（本実験ではＲａｍ
旧認識部位）を設けるため第３図に示したような部位特
異的変異を行った０部位特異的変異に用いる台底オリゴ
ヌクレオチドは＾ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ−社製
”ＤＮＡ合威台底モデル３８１Ａを使って台底した。ま
た部位特異的変異はアマジャム社製″Ｏ１ｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒ。
を用いた発現ベクターの作製 ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のプロモーター、ターミネータ−を
用いた黄麹菌発現ベクターは以下のようにして作製した
。ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のＮ末端側ｆｉｌ域がクローニン
グされたプラスミドｐＭＴＯ１１よりＨｐａｌ、５ｔｕ
ｌの制限酵素を用いてプロモーターＭ域を切り出し、ｐ
ｔｌｃ１１８ （宝酒造製）の５ｅａｌ （宝酒造製）
消化物と混合、ライゲーション後、大腸菌ＪＭ１０９株
コンピテントセル（宝酒造製〉に導入してプラスくドｐ
ＧＡＰＯＯ１を得た０次にこのプロモーター領域の下流
に異種遺伝子挿入用の制限酵素部位（本実験ではＲａｍ
旧認識部位）を設けるため第３図に示したような部位特
異的変異を行った０部位特異的変異に用いる台底オリゴ
ヌクレオチドは＾ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ−社製
”ＤＮＡ合威台底モデル３８１Ａを使って台底した。ま
た部位特異的変異はアマジャム社製″Ｏ１ｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒ。
ｓｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｖｅｒｓｉｏ
ｎ ２’を用いて行う事ができる。この操作によりＧＡ
Ｐ−ＤＨ遺伝子のＡＴＧ開始コドンから５ ｂａｓｅ上
流にＢａ−旧認識部位が設定されたＤＮＡを有するプラ
スミドｐＧＡＰＯＯ２を作製できる。
ｎ ２’を用いて行う事ができる。この操作によりＧＡ
Ｐ−ＤＨ遺伝子のＡＴＧ開始コドンから５ ｂａｓｅ上
流にＢａ−旧認識部位が設定されたＤＮＡを有するプラ
スミドｐＧＡＰＯＯ２を作製できる。
一方、ターミネータ−領域はｐＭＴＯ１２をＢａ１ｌ。
５ｐｈｌ （宝酒造製）で消化することにより単離した
。
。
このターミネータ−領域を含む１１２０ｂρのＤＮＡ断
片をｐＵｃ１９の旧ｎｃ ｎ ／５ｐｈＩ５ｐｈｌ入す
ることにより、プラスミドｐＧＡＰＯＯ３を得た。この
ｐＧＡＰＯＯ３をＥｃｏＲＩ／Ｒａｍ旧で消化したベク
ターＤＮＡとｐＧＡＰＯＯ２をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ
で消化して得られたＧＡＰ−ＤＨプロモーター断片を混
合しライゲーション、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換に
よりρＧＡＰＯＯ４を得た。ｐＧＡＰ００４はＧＡＰ−
ＤＨ遺伝子プロモーター、ターミネータ−が並列したプ
ラスミドで、その間に存在するＢａｍＨｌ ！！識部位
に適当な異種遺伝子を挿入することにより黄麹菌で発現
しうるベクターである。
片をｐＵｃ１９の旧ｎｃ ｎ ／５ｐｈＩ５ｐｈｌ入す
ることにより、プラスミドｐＧＡＰＯＯ３を得た。この
ｐＧＡＰＯＯ３をＥｃｏＲＩ／Ｒａｍ旧で消化したベク
ターＤＮＡとｐＧＡＰＯＯ２をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ
で消化して得られたＧＡＰ−ＤＨプロモーター断片を混
合しライゲーション、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換に
よりρＧＡＰＯＯ４を得た。ｐＧＡＰ００４はＧＡＰ−
ＤＨ遺伝子プロモーター、ターミネータ−が並列したプ
ラスミドで、その間に存在するＢａｍＨｌ ！！識部位
に適当な異種遺伝子を挿入することにより黄麹菌で発現
しうるベクターである。
実施例６
プレオマイシン耐性遺伝子発現ベクターの作製プレオマ
イシン耐性遺伝子は、大腸菌のトランスボゾンＴｎ５お
よび（鉦聾り艮別匹用■■用）由来プラスミドｐＵＢ１
１０にコードされている（Ｓｅ−０ｎｅｔ、 ａｌ （
１９８７） ＰＩａｓ＋ｅｉｄ、ｕ、 ４６−５３）、
このうちトランスボゾンＴｎ５由来のプレオマイシン耐
性遺伝子は、大腸菌や酵母で機能し、（Ｇａｔｉｇｎｏ
ｌ ｅｔ。
イシン耐性遺伝子は、大腸菌のトランスボゾンＴｎ５お
よび（鉦聾り艮別匹用■■用）由来プラスミドｐＵＢ１
１０にコードされている（Ｓｅ−０ｎｅｔ、 ａｌ （
１９８７） ＰＩａｓ＋ｅｉｄ、ｕ、 ４６−５３）、
このうちトランスボゾンＴｎ５由来のプレオマイシン耐
性遺伝子は、大腸菌や酵母で機能し、（Ｇａｔｉｇｎｏ
ｌ ｅｔ。
ａｔ（１９８７） Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
２０７３４２−３４８） 、またｐｔｌＢ１１０由来
プレオマイシン耐性遺伝子が大腸菌で機能すること（Ｓ
ｅｍｏｎ ｅｔ、ａｌ前出）はｆＩ！認されているが、
これらの耐性遺伝子が黄麹菌で機能した例はまだない。
２０７３４２−３４８） 、またｐｔｌＢ１１０由来
プレオマイシン耐性遺伝子が大腸菌で機能すること（Ｓ
ｅｍｏｎ ｅｔ、ａｌ前出）はｆＩ！認されているが、
これらの耐性遺伝子が黄麹菌で機能した例はまだない。
本実施例ではｐＵＢ１１０由来プレオマイシン耐性遺伝
子をＧＡＰ−ＤＨ遺伝子プロモーター、ターミネータ−
を用いて発現させるベクターを作製し、そのベクターで
形質転換した株がプレオマイシン耐性を獲得したことを
明らかにした。
子をＧＡＰ−ＤＨ遺伝子プロモーター、ターミネータ−
を用いて発現させるベクターを作製し、そのベクターで
形質転換した株がプレオマイシン耐性を獲得したことを
明らかにした。
プレオマイシン耐性遺伝子発現ベクターは第４図に従っ
て行った。まずｐＵ８１１０にコードされているプレオ
マイシン耐性遺伝子はＨａｅ ＩＩ ／Ｂａ１Ｉ旧の制
限酵素消化により約１３００ｂｐのＤＮＡ断片として得
られる。この断片を大腸菌プラスミドｐＵｃ１１８ （
宝酒造製）の旧ｎｃ ＩＩ ／Ｂａ■旧部位に挿入し、
プラスミドｐＢＬＥＯＯ１を得た。 ｐＢＬＥＯＯｌに
はプレオマイシン耐性遺伝子が含まれているが、そのＡ
ＴＧ開始コドンの上流の適切な位置に制限酵素認識部位
がなく、このままではうまく発現ベクターｐＧＡＰＯＯ
４に挿入することはできない、そこで、部位特異的変異
を用いて適当な位置に制限酵素認識部位（本実施例では
ＢａｍＨＩ）を作製した０部位特異的変異の設計および
ブライマーの配列は第４図に示した。また部位特異的変
異は前述のアマジャム社製“０１１ｇ。
て行った。まずｐＵ８１１０にコードされているプレオ
マイシン耐性遺伝子はＨａｅ ＩＩ ／Ｂａ１Ｉ旧の制
限酵素消化により約１３００ｂｐのＤＮＡ断片として得
られる。この断片を大腸菌プラスミドｐＵｃ１１８ （
宝酒造製）の旧ｎｃ ＩＩ ／Ｂａ■旧部位に挿入し、
プラスミドｐＢＬＥＯＯ１を得た。 ｐＢＬＥＯＯｌに
はプレオマイシン耐性遺伝子が含まれているが、そのＡ
ＴＧ開始コドンの上流の適切な位置に制限酵素認識部位
がなく、このままではうまく発現ベクターｐＧＡＰＯＯ
４に挿入することはできない、そこで、部位特異的変異
を用いて適当な位置に制限酵素認識部位（本実施例では
ＢａｍＨＩ）を作製した０部位特異的変異の設計および
ブライマーの配列は第４図に示した。また部位特異的変
異は前述のアマジャム社製“０１１ｇ。
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍ
ｖｅｒｓｉｏｎ ２ ’を用いて行うことができる。
ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍ
ｖｅｒｓｉｏｎ ２ ’を用いて行うことができる。
このようにして作製したｐＢＬＥＯＯ２ではプレオマイ
シン耐性遺伝子のＡＴＧ開始コドンから上流６ｂｐの位
置にＲａｍ旧サイトが設定される。このｐＢＬＥＯＯ２
をＢａｍ旧で消化し、プレオマイシン耐性遺伝子を切り
出し、このＤＮＡ断片をｐＧＡＰＯＯ４のＢａｍＨＩ部
位に挿入し、ｐＧＡＰＯＯ５を得た。 ｐＧＡＰＯＯ５
は黄麹菌Ｇ Ａ Ｐ −Ｄ Ｉ（遺伝子のプロモーター
、ターミネータ−の支配下でｐＵＢ１１０由来ブレオマ
イシン耐性遺伝子を発現できるベクターである。
シン耐性遺伝子のＡＴＧ開始コドンから上流６ｂｐの位
置にＲａｍ旧サイトが設定される。このｐＢＬＥＯＯ２
をＢａｍ旧で消化し、プレオマイシン耐性遺伝子を切り
出し、このＤＮＡ断片をｐＧＡＰＯＯ４のＢａｍＨＩ部
位に挿入し、ｐＧＡＰＯＯ５を得た。 ｐＧＡＰＯＯ５
は黄麹菌Ｇ Ａ Ｐ −Ｄ Ｉ（遺伝子のプロモーター
、ターミネータ−の支配下でｐＵＢ１１０由来ブレオマ
イシン耐性遺伝子を発現できるベクターである。
実施例７
黄麹菌Ａ、肛ｕ並のｐｃ＾Ｐ００５による形質転換現在
までＡ、肛ｕｕの形質転換に用いられてきた選択マーカ
ーとしてはａｒｇＢ、 ａｍｄｓ ［Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎｅｔ、ａｌ（１９８Ｂ） ８１０／ＴｌＩＣＨＮ
ＯＬＯＧＹ、 ｆＬＬ１４１９−１４２２］ 。
までＡ、肛ｕｕの形質転換に用いられてきた選択マーカ
ーとしてはａｒｇＢ、 ａｍｄｓ ［Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎｅｔ、ａｌ（１９８Ｂ） ８１０／ＴｌＩＣＨＮ
ＯＬＯＧＹ、 ｆＬＬ１４１９−１４２２］ 。
ｐｙｒＧ （Ｍａｔｔｅｒｎ ｅｔ、ａｌ （１９８７
） Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ。
） Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ。
２１０、 ４６０−４６１）、 ｓｅｔ （Ｉｉｍｕ
ｒａ ｅｔ、ａｌ（１９Ｂ？） Ａｇｒｉｃ。
ｒａ ｅｔ、ａｌ（１９Ｂ？） Ａｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、５１． ３２３−３２８］、
ｎ１ａＤ （Ｕｎｋｌｅｓ ｅｔ、ａｌ（１９８
９） Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ２１８ ９
９−１０４ ）等が挙げられる。ところが工業微生物と
しての！ＬＬ匹社些の形質転換を考える場合、ドミナン
トマーカーが必要とされるが、現在ではアセトアミドの
資化性をマーカーとするａｍｄｓＯ系しか開発されてお
らず、薬剤耐性等の形質転換系の開発が重要である。本
実施例では前項で作製したＧＡＰ−ＤＨ遺伝子プロモー
ター、ターミネータ−を用いたプレオマイシン耐性発現
ベクター、ｐＧＡＰＯＯ５を形質導入したｊ３．肛ｕ社
株がプレオマイシン耐性を獲得できることを明らかにし
た。
ｎ１ａＤ （Ｕｎｋｌｅｓ ｅｔ、ａｌ（１９８
９） Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ２１８ ９
９−１０４ ）等が挙げられる。ところが工業微生物と
しての！ＬＬ匹社些の形質転換を考える場合、ドミナン
トマーカーが必要とされるが、現在ではアセトアミドの
資化性をマーカーとするａｍｄｓＯ系しか開発されてお
らず、薬剤耐性等の形質転換系の開発が重要である。本
実施例では前項で作製したＧＡＰ−ＤＨ遺伝子プロモー
ター、ターミネータ−を用いたプレオマイシン耐性発現
ベクター、ｐＧＡＰＯＯ５を形質導入したｊ３．肛ｕ社
株がプレオマイシン耐性を獲得できることを明らかにし
た。
ｊ３．肛ｕ赳の形質転換はＩｉｍｕｒａらの方法（Ｉ
ｉｍｕｒａｅｔ、ａｌ前出〉を改変して行った。宿主と
してはプレオマイシン感受性であるＡ、 ｕｕ並ｒＦ０
４１７７株およびＩＰｏ ４１８１株を用いた。それぞ
れの株をスラント（ＭＤ培地；０．２％Ｍａｌｔ ｅｘ
ｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃ。
ｉｍｕｒａｅｔ、ａｌ前出〉を改変して行った。宿主と
してはプレオマイシン感受性であるＡ、 ｕｕ並ｒＦ０
４１７７株およびＩＰｏ ４１８１株を用いた。それぞ
れの株をスラント（ＭＤ培地；０．２％Ｍａｌｔ ｅｘ
ｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃ。
社製）、０．２％Ｄｅｘ ｔｒｏｓｅ （牛丼化学社製
） 、０．０１％Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ （Ｄｉ
ｆｃｏ社製）、２．０％ａｇａｒ（牛丼化学社製））で
３０°Ｃ１４〜５日培養して胞子形成させた後、滅菌水
に胞子を懸濁させ、胞子溶液を作製した。この胞子溶液
を２００ｄ容三角フラスコに３０ＩＩｌのＤＰ培地（２
，０％Ｄｅｘｔｒｉｎ（Ｄｉｆｃ。
） 、０．０１％Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ （Ｄｉ
ｆｃｏ社製）、２．０％ａｇａｒ（牛丼化学社製））で
３０°Ｃ１４〜５日培養して胞子形成させた後、滅菌水
に胞子を懸濁させ、胞子溶液を作製した。この胞子溶液
を２００ｄ容三角フラスコに３０ＩＩｌのＤＰ培地（２
，０％Ｄｅｘｔｒｉｎ（Ｄｉｆｃ。
社製）、１．０％Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｏｎｅ （大五栄養
社製）、０．５％ＫＨ，ＰＯ４（牛丼化学社製）、０．
１％ＮａＮＯｓ （牛丼化学社製）、０．０５％Ｍｇ５
Ｏ＜−７ＪＯ（牛丼化学社製））を入れたものに１０７
〜１０”の胞子を接種し、３０°Ｃで一夜振とう培養し
た。培養液を３Ｇｌガラスフイルター（岩田硝子社製）
を用いて集菌後、さらに滅菌水で２回、リン酸バッファ
ー（１０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐ
Ｈ６，０）、 ５％Ｎａｃｌ）で１回洗浄した０次に菌
体を１０−の酵素溶液（１０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６，０）、 ５％Ｎ ａ Ｃ１，、
２０ｍｇ／ｄ Ｎｏｖｏｚｙ＊ ２３４ （ＮＯＶＯ社
製）＋ ２ ｍｇ／ ｄ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ（Ｓｉｇ
ｓ＋ａ社製））に懸濁し、３０°Ｃで２時間保温した。
社製）、０．５％ＫＨ，ＰＯ４（牛丼化学社製）、０．
１％ＮａＮＯｓ （牛丼化学社製）、０．０５％Ｍｇ５
Ｏ＜−７ＪＯ（牛丼化学社製））を入れたものに１０７
〜１０”の胞子を接種し、３０°Ｃで一夜振とう培養し
た。培養液を３Ｇｌガラスフイルター（岩田硝子社製）
を用いて集菌後、さらに滅菌水で２回、リン酸バッファ
ー（１０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐ
Ｈ６，０）、 ５％Ｎａｃｌ）で１回洗浄した０次に菌
体を１０−の酵素溶液（１０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６，０）、 ５％Ｎ ａ Ｃ１，、
２０ｍｇ／ｄ Ｎｏｖｏｚｙ＊ ２３４ （ＮＯＶＯ社
製）＋ ２ ｍｇ／ ｄ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ（Ｓｉｇ
ｓ＋ａ社製））に懸濁し、３０°Ｃで２時間保温した。
プロトプラスト化を顕微鏡で確認後、３Ｇ２ガラスフイ
ルター（岩田硝子社製）を用いてプロトプラストだけを
遠心チューブに集めた。 １１００Ｏｘで５分間遠心分
離してプロトプラストをペレット化した後、再度リン酸
バッファー（前出）に１回、続いてＳＴＣバッファー（
５％ＮａＣｊ！、１０ｍＭ ＣａＣ１ｚ、 １０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−（：１ （ｐＨ７，５））に１回懸濁して
洗浄後、最終的にプロトプラスト濃度がｌＸｌ０”個／
ｄとなるようＳＴＣバッファーに懸濁した。このプロト
プラスト溶液０．２ｄ（２ｘ１０７プロトプラスト）を
１５ｄ容遠心チユーブに入れ：さらにＤＮＡ１液（ｐＧ
ＡＰＯＯ５，５〜５０μｇ）を添加して混合後、０°Ｃ
で３０分間静置した。
ルター（岩田硝子社製）を用いてプロトプラストだけを
遠心チューブに集めた。 １１００Ｏｘで５分間遠心分
離してプロトプラストをペレット化した後、再度リン酸
バッファー（前出）に１回、続いてＳＴＣバッファー（
５％ＮａＣｊ！、１０ｍＭ ＣａＣ１ｚ、 １０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−（：１ （ｐＨ７，５））に１回懸濁して
洗浄後、最終的にプロトプラスト濃度がｌＸｌ０”個／
ｄとなるようＳＴＣバッファーに懸濁した。このプロト
プラスト溶液０．２ｄ（２ｘ１０７プロトプラスト）を
１５ｄ容遠心チユーブに入れ：さらにＤＮＡ１液（ｐＧ
ＡＰＯＯ５，５〜５０μｇ）を添加して混合後、０°Ｃ
で３０分間静置した。
ｌ−のポリエチレングリコール（Ｐ巳ＯＮ容液（２５％
ＰＥＧ４０００． ｌ ＯｍＭ ＣａＣ１ｇ、 １０
ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ （ｐＨ７，５））を添加して軽く
撹拌後、室温で１５分間静置した。これに５ｄのＳＴＣ
バッファー（前出）を添加した後、ｌｏｏｏＸｇで遠心
分離して上清を取り除いた。この操作をもう一度繰り返
してプロトプラストを洗浄後、最後にＩａｆのＳＴＣバ
ッファーに懸濁した。このプロトプラスト溶液２００ｐ
ｉを５ｄのＴｏｐ ａｇａｒ（Ｍ Ｄ培地＋５％ＮａＣ
１，０，５％ａｇａｒ、 ４５℃に保温〉と混合後、Ｍ
Ｄプレート（ＭＤ培地＋５％ＮａＣ１，２，０％ａｇａ
ｒ）に重層した。
ＰＥＧ４０００． ｌ ＯｍＭ ＣａＣ１ｇ、 １０
ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ （ｐＨ７，５））を添加して軽く
撹拌後、室温で１５分間静置した。これに５ｄのＳＴＣ
バッファー（前出）を添加した後、ｌｏｏｏＸｇで遠心
分離して上清を取り除いた。この操作をもう一度繰り返
してプロトプラストを洗浄後、最後にＩａｆのＳＴＣバ
ッファーに懸濁した。このプロトプラスト溶液２００ｐ
ｉを５ｄのＴｏｐ ａｇａｒ（Ｍ Ｄ培地＋５％ＮａＣ
１，０，５％ａｇａｒ、 ４５℃に保温〉と混合後、Ｍ
Ｄプレート（ＭＤ培地＋５％ＮａＣ１，２，０％ａｇａ
ｒ）に重層した。
寒天が固化後、３０℃で保温した。培養６時間後、塩酸
プレオマイシン（日本化薬社製）を最終濃度３００ ｔ
ｔｇ／ｄとなるよう添加した５−のＴｏｐ ａｇａｒ（
ＭＤ培地＋５％Ｎａｃｌ、 ０．８％ａｇａｒ、 ４
５℃に保温）を重層した後、３０°Ｃで４〜７日間培養
した。
プレオマイシン（日本化薬社製）を最終濃度３００ ｔ
ｔｇ／ｄとなるよう添加した５−のＴｏｐ ａｇａｒ（
ＭＤ培地＋５％Ｎａｃｌ、 ０．８％ａｇａｒ、 ４
５℃に保温）を重層した後、３０°Ｃで４〜７日間培養
した。
出現してきたコロニーは３〜４回３００μｇｏｄの塩酸
プレオマイシンを含むＭＯプレートで継代後、形質転換
体とした。
プレオマイシンを含むＭＯプレートで継代後、形質転換
体とした。
実施例日
プレオマイシン耐性獲得株の解析
前項で得られたプレオマイシン耐性獲得株が真のｐＧＡ
ＰＯＯ５形質転換株であるかどうかを検討するため、以
下の解析を行った。まず得られたプレオマイシン耐性獲
得株の染色体ＤＮＡを実施例２に記入した方法で抽出、
精製した０次にこれらの染色体をＢａ５ＨＩで消化後、
１％アガロース電気泳動によす分離し、ニトロセルロー
スフィルターにサザーンブロッティングした。サザーン
プロッテイングはＭａｎｉａｔｉｓ等（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ ｅｔ、ａｌ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、
（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒａｎｇ
）ｌａｒｂｏｕｒ、 ＮＹ）の方法に準じて行った。
ＰＯＯ５形質転換株であるかどうかを検討するため、以
下の解析を行った。まず得られたプレオマイシン耐性獲
得株の染色体ＤＮＡを実施例２に記入した方法で抽出、
精製した０次にこれらの染色体をＢａ５ＨＩで消化後、
１％アガロース電気泳動によす分離し、ニトロセルロー
スフィルターにサザーンブロッティングした。サザーン
プロッテイングはＭａｎｉａｔｉｓ等（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ ｅｔ、ａｌ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、
（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒａｎｇ
）ｌａｒｂｏｕｒ、 ＮＹ）の方法に準じて行った。
プローブはｐＧＡＰＯＯ５をＢａｇ旧で消化して生じる
約１２００ｂｐのＤＮＡ断片を用いた。この断片はプレ
オマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断片である。
約１２００ｂｐのＤＮＡ断片を用いた。この断片はプレ
オマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断片である。
この断片をアガロースゲルより抽出、精製し”Ｒａｎｄ
ｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉ
ｔ’（宝酒造製）を用いて〔α−”Ｐ） ｄＣＴＰでラ
ベルしプローブとして用いた。ハイブリダイゼーション
の条件はＭａｎｒａｔｉｓ等（前出）の方法に従って、
ハイブリダイゼーションは温度６５”Ｃ，塩濃度６ｘｓ
ｓｃで行い、洗浄は６５°Ｃ，０，Ｉ Ｘ５ＳＣの条件
で行った。この結果プレオマイシン耐性獲得株１０株の
うち３株について約１２００ｂｐの大きさにブローブと
ハイブリダイズするバンドが検出され、これらの株がｐ
ＧＡＰＯＯ５によって形質転換された株であることが判
明した。
ｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉ
ｔ’（宝酒造製）を用いて〔α−”Ｐ） ｄＣＴＰでラ
ベルしプローブとして用いた。ハイブリダイゼーション
の条件はＭａｎｒａｔｉｓ等（前出）の方法に従って、
ハイブリダイゼーションは温度６５”Ｃ，塩濃度６ｘｓ
ｓｃで行い、洗浄は６５°Ｃ，０，Ｉ Ｘ５ＳＣの条件
で行った。この結果プレオマイシン耐性獲得株１０株の
うち３株について約１２００ｂｐの大きさにブローブと
ハイブリダイズするバンドが検出され、これらの株がｐ
ＧＡＰＯＯ５によって形質転換された株であることが判
明した。
以上の結果から
（１）本実施例でクローニングしたＡ、 ＨｕｕＧ Ａ
Ｐ−ＤＨプロモーター、ターミネータ−が活性を有して
おり、異種遺伝子を発現させることが可能であること。
Ｐ−ＤＨプロモーター、ターミネータ−が活性を有して
おり、異種遺伝子を発現させることが可能であること。
（２）黄色ブドウ球菌（鉦妙ｈハ剋匹ｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ）由来プラスミドｐＵＢ１１０のコードするプレオマ
イシン耐性遺伝子がＡ、肛ｕ迎内で機能し、形質転換の
際のドミナントマーカーとして使用できること。
ｓ）由来プラスミドｐＵＢ１１０のコードするプレオマ
イシン耐性遺伝子がＡ、肛ｕ迎内で機能し、形質転換の
際のドミナントマーカーとして使用できること。
が判明した。
第１図はｐＭＴＯｌｌおよびｐＨＴＯ１２の１ｎｓｅｒ
ｔ ＤＮＡの制限酵素地図を、第２図（ａ）および（ｂ
）はＡ、 ｏｒｉｚａｅＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の塩基配列
およびコードされるアミノ酸配列を、第３図はｐＧＡＰ
ＯＯ４の作製工程図を、第４図はｐＧＡＰＯＯ５の作製
工程図を示す。
ｔ ＤＮＡの制限酵素地図を、第２図（ａ）および（ｂ
）はＡ、 ｏｒｉｚａｅＧＡＰ−ＤＨ遺伝子の塩基配列
およびコードされるアミノ酸配列を、第３図はｐＧＡＰ
ＯＯ４の作製工程図を、第４図はｐＧＡＰＯＯ５の作製
工程図を示す。
Claims (1)
- 黄麹菌または黒麹菌由来のＧＡＰ−ＤＨプロモーターを
使用することを特徴とする黄麹菌による異種蛋白質の製
造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1326473A JP2995770B2 (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | 異種蛋白質の製造方法 |
| EP90123877A EP0436858A1 (en) | 1989-12-15 | 1990-12-12 | Promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and its use |
| CA002031831A CA2031831A1 (en) | 1989-12-15 | 1990-12-13 | Production method for foreign protein |
| KR1019900020711A KR910012246A (ko) | 1989-12-15 | 1990-12-15 | 이종 단백질의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1326473A JP2995770B2 (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | 異種蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03187392A true JPH03187392A (ja) | 1991-08-15 |
| JP2995770B2 JP2995770B2 (ja) | 1999-12-27 |
Family
ID=18188203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1326473A Expired - Lifetime JP2995770B2 (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | 異種蛋白質の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0436858A1 (ja) |
| JP (1) | JP2995770B2 (ja) |
| KR (1) | KR910012246A (ja) |
| CA (1) | CA2031831A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0672149T3 (da) * | 1991-12-09 | 2001-11-05 | Unilever Nv | Fremgangsmåde til fremstilling/udskilning af et protein med en transformeret skimmelsvamp ved anvendelse af ekspressions/udskilningsregulerende regioner afledt af et Aspergillus-endoxylanase II-gen |
| GB0715751D0 (en) * | 2007-08-13 | 2007-09-19 | Tmo Renewables Ltd | Thermophilic micro-organisms for ethanol production |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE253119T1 (de) * | 1985-04-15 | 2003-11-15 | Dsm Ip Assets Bv | Verwendung des glucoamylasepromotors aus apergillus |
-
1989
- 1989-12-15 JP JP1326473A patent/JP2995770B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-12-12 EP EP90123877A patent/EP0436858A1/en not_active Withdrawn
- 1990-12-13 CA CA002031831A patent/CA2031831A1/en not_active Abandoned
- 1990-12-15 KR KR1019900020711A patent/KR910012246A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0436858A1 (en) | 1991-07-17 |
| JP2995770B2 (ja) | 1999-12-27 |
| KR910012246A (ko) | 1991-08-07 |
| CA2031831A1 (en) | 1991-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20040023615A (ko) | 트리펩티딜 아미노펩티다제 생산의 감소 또는 제거방법 | |
| CN113106114A (zh) | 调控里氏木霉蛋白表达效率的因子、调控方法及应用 | |
| WO1997000944A1 (fr) | Transformant produisant la substance pf1022 et procede pour transformer des micro-organismes appartenant a la classe des hyphomycetes | |
| JPH03187392A (ja) | 異種蛋白質の製造方法 | |
| JP3689920B2 (ja) | マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産 | |
| JP2776085B2 (ja) | ベクター | |
| US4853333A (en) | Production of rotavirus in yeast | |
| NZ263944A (en) | Isolating dna from animal cells or tissues using xanthate forming compounds | |
| JPH01108978A (ja) | 中性プロテアーゼ遺伝子の分子クローニングおよび発現 | |
| JP4526638B2 (ja) | タンパク質の高発現システム | |
| EP1356076B1 (en) | Methods and compositions for extracting proteins from cells | |
| CN108342400B (zh) | 重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN113699176A (zh) | 高产溶血磷脂酶黑曲霉重组表达菌株的构建及应用 | |
| Scotti et al. | Extracellular levansucrase of Bacillus subtilis produced in yeast remains in the cell in its precursor form | |
| US7662606B1 (en) | β-agarase isolated from Thalassomonas agarivorans, preparation process and uses thereof | |
| JPS6349085A (ja) | Ｂｔ殺虫性蛋白遺伝子 | |
| CN110747221A (zh) | 一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用 | |
| JPH062050B2 (ja) | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 | |
| CN117343950B (zh) | 一种提高里氏木霉表达外源蛋白表达水平的方法 | |
| Lindberg et al. | Characterization and comparison of a Neurospora crassa RNase purified from cultures undergoing each of three different states of derepression | |
| JP2000508883A (ja) | バシラス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を用いたセルラーゼ及びキシラナーゼの生成物 | |
| CN116218805A (zh) | Irx10-ct蛋白在从头合成木聚糖中的应用 | |
| JP2987943B2 (ja) | 新規ｄｎａ配列及びそれを含有する融合遺伝子 | |
| CN115820682A (zh) | 过氧化氢酶基因及其应用 | |
| JP3743803B2 (ja) | 麹菌発現遺伝子のプロモーター並びに該プロモーターを利用した外来遺伝子の発現方法 |