CN116218805A - Irx10-ct蛋白在从头合成木聚糖中的应用 - Google Patents

Irx10-ct蛋白在从头合成木聚糖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了IRX10‑CT蛋白在从头合成木聚糖反应中的应用。IRX10‑CT蛋白可为氨基酸序列是序列1第25‑417位所示的蛋白质。通过实验证明：本发明的IRX10‑CT蛋白质具有催化植物细胞壁木聚糖从头合成的功能，可通过改变木聚糖含量调节植物细胞壁的可降解程度，有助于降低生物能源的生产成本，在能源的生产过程中发挥重大作用。IRX10‑CT蛋白质可以在植物细胞体外合成木聚糖，为木聚糖的工业生产提供了新的加工方式，在能源的节约利用以及可持续发展中发挥重大作用。

Description

IRX10-CT蛋白在从头合成木聚糖中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及IRX10-CT蛋白在植物体内和/或体外从头合成木聚糖中的应用。
背景技术
植物细胞壁是植物细胞的一种特有结构，在其生长发育过程中发挥着十分重要的作用，比如提供机械支撑、水分运输等。木聚糖是植物细胞壁中的重要成分，可与纤维素和木质素等多聚物交联形成复杂的网络结构，最终决定细胞壁的结构与功能。木聚糖合成缺陷会导致植株支撑力下降、生长发育缓慢甚至致死等表型。
木聚糖主链是由木糖以β-1,4-糖苷键连接而成。研究表明，拟南芥中GT47(Glycosyltransferase)和GT43家族中的IRX10(Irregular xylem)、IRX9和IRX14参与主链合成，但合成机制尚不清晰。
植物细胞壁既是植物生长发育的物质基础，又可作为食品、工业原料等影响我们生活的方方面面。因此，植物如何合成细胞壁是一个重要的科学问题，解析其合成机理和生物学功能具有重要的理论和应用价值。建立多糖的合成生物学技术是当代生物技术的重要课题之一。多糖分子设计需要透彻解析多糖生物合成机制，然而这方面的研究一直未取得突破，对多糖合成的起始机制更是知之甚少。因此，揭示植物细胞壁多糖的生物合成机理，可以为应用合成生物学技术进行人工合成提供理论依据，也可为作物抗倒伏性等重要农艺性状的分子设计改良提供靶标。
作为重要的植物交联聚糖，木聚糖具有可再生、成本低廉的优良属性，其体外合成对于人类生产和生活起到了重要作用。在工业中，木聚糖经过酵母体内发酵转化为乙醇，可用于生物燃料的生产；木聚糖脱水后可形成呋喃甲醛，作为树脂、农药等的加工原料；木聚糖具有良好的成膜性能和可降解能力，可用于制造食品包装；木聚糖在稀酸中水解生成木糖，可制备木糖醇、甜味剂等。在医药行业中，木聚糖具有抗炎、抑制肿瘤的功效；可作为抗菌剂，抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的增殖；可作为保健食品，特异地促进人体肠道内双歧杆菌的增殖、促进肠胃功能，同时还可以降低血清胆固醇、降低血压、保护肝脏。因此如何快速有效的体外合成木聚糖，具有重要的意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供IRX10蛋白质或其相关的生物材料的应用。
为实现上述目的，第一个方面，本发明提供蛋白质或其相关的生物材料在制备木聚糖中的应用，
所述蛋白质可为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1第25-417位所示的蛋白质或氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)将A1)所述蛋白质的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所述的蛋白质具有80％以上的同一性且与木聚糖合成相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
所述木聚糖可包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖、木八糖、木九糖、木十糖、木十一糖和/或木十二糖。
进一步地，上述的应用中，A2)所述蛋白质可为氨基酸序列如序列表中序列4第1-393位所示的蛋白质。
进一步地，上述的应用中，A2)或A3)所述蛋白质可为a1)或a2)
a1)氨基酸序列如序列表中序列3所示的蛋白质；
a2)氨基酸序列如序列表中序列4所示的蛋白质。
本发明中，序列表中序列1由417个氨基酸残基组成；序列3由416个氨基酸残基组成；序列4由416个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
表1：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
为实现上述目的，第二个方面，本发明提供上述的蛋白质在作为木糖糖基转移酶或制备酶制剂中的应用，所述酶制剂具有木糖糖基转移酶活性。
为实现上述目的，第三个方面，本发明提供一种制备木聚糖的方法，所述方法包括使用上述的蛋白质催化木糖合成木聚糖的步骤。
进一步地，上述方法可为植物体外制备木聚糖的方法。
上述方法中，催化木聚糖合成可以发生在无细胞体系，也可发生在非植物细胞体系。
所述的植物体外，可包括无细胞体系，或者非植物细胞体系。
所述非植物细胞体系具体可包括酵母细胞、大肠杆菌细胞等非植物细胞。
为实现上述目的，第四个方面，本发明提供上述的蛋白质或其相关生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
D1)上述蛋白质或其相关生物材料在合成木聚糖中的应用；
D2)上述蛋白质或其相关生物材料在制备合成木聚糖的产品中的应用；
D3)上述蛋白质或其相关生物材料在调控植物细胞壁中木聚糖含量中的应用；
D4)上述蛋白质或其相关生物材料在制备调控植物细胞壁中木聚糖含量的产品中的应用；
D5)上述蛋白质或其相关生物材料在调控植物细胞壁中木聚糖合成中的应用；
D6)上述蛋白质或其相关生物材料在制备调控植物细胞壁中木聚糖合成的产品中的应用。
进一步地，上述的应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)至b5)中任一项所示的DNA分子：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2第73-1254位所示的DNA分子；
b2)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b3)编码链的编码序列是SEQ ID No.5第73-1254位所示的DNA分子；
b4)编码链的编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；
b5)与b1)、b2)、b3)或b4)限定的DNA分子具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。
本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
进一步地，上述的应用中，所述调控植物细胞壁中木聚糖含量可为提高植物细胞壁中木聚糖含量。
进一步地，上述的应用中，所述植物可为下述任一种：
E1)单子叶植物；
E2)禾本目植物；
E3)禾本科植物；
E4)稻属植物
E5)水稻。
为实现上述目的，第五个方面本发明提供上述的蛋白质或其相关生物材料。
本发明取得的有益效果如下：
本发明的蛋白质IRX10-CT或蛋白质10D具有催化植物细胞壁木聚糖合成的功能，可用于调控植物细胞壁木聚糖的含量，可通过改变木聚糖含量调节植物细胞壁的可降解程度，有助于降低生物能源的生产成本，在能源的生产过程中发挥重大作用。
本发明提供的蛋白质可以在植物细胞体外合成木聚糖，为木聚糖的工业生产提供了新的加工方式，在能源的节约利用以及可持续发展中发挥重大作用。
附图说明
图1为bc18遗传材料表型图，标尺为12cm。
图2为IRX10蛋白质结构示意图。
图3为bc18遗传材料和野生型日本晴的茎秆细胞壁中木糖含量测定图。
图4为bc18遗传材料和野生型日本晴的茎秆细胞壁中木聚糖含量测定图；其中：A为凝胶电泳图，B是A图的定量结果。
图5为融合蛋白IRX10-CT-myc-His的蛋白电泳图。
图6为用PACE方法检测融合蛋白IRX10-CT-myc-His对木五糖的催化活性。10D和10R代表IRX10-CT-myc-His蛋白的两种突变形式。
图7为用MALDI-TOF方法检测融合蛋白IRX10-CT-myc-His对木五糖的催化活性。
图8为融合蛋白IRX10-CT-myc-His对木五糖的催化反应的动力学曲线。以梯度浓度的木五糖(mM)为横坐标，以UDP释放速度(pmol min-1)为纵坐标。
图9为用PACE方法检测融合蛋白IRX10-CT-myc-His对UDP-木糖的催化活性。10D和10R代表IRX10-CT-myc-His蛋白的两种突变形式。
图10为用MALDI-TOF方法检测融合蛋白IRX10-CT-myc-His对UDP-木糖的催化活性。
图11为融合蛋白IRX10-CT-myc-His对UDP-木糖的催化反应的动力学曲线。以梯度浓度的UDP-木糖(mM)为横坐标，以UDP释放速度(fmol min-1)为纵坐标。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的粳稻品种“日本晴”(WT，又称野生型植株)购买于中国水稻所。
下述实施例中的pPICZαC载体购自Invitrogen公司，该载体上具有His和myc标签的编码序列，表达具有His和myc标签的外源蛋白。
下述实施例中的酵母菌株X33购自Invitrogen公司。
实施例1、水稻脆秆突变体及IRX10-CT蛋白的获得
1.1、水稻脆秆突变体的获得及其IRX10蛋白序列分析
1.1.1、水稻脆秆突变体的表型
水稻脆秆突变体brittle culm 18(简称bc18)为粳稻品种“日本晴”的自发突变材料。突变体bc18与粳稻品种“日本晴”相比，其主要表现为：(1)茎秆变脆(茎秆机械强度显著下降，木质部导管结构异常)；(2)植株变矮。
上述遗传材料的表型见图1。
1.1.2、水稻脆秆突变体的IRX10蛋白序列分析
通过图位克隆，确定了目标基因IRX10及其点突变位置。通过测序表明：和野生型水稻植株(日本晴)相比，水稻脆秆突变体bc18 IRX10基因组序列中第2103位碱基由G突变为A。该碱基突变造成IRX10蛋白序列中第295位精氨酸突变为赖氨酸，其余氨基酸序列与野生型水稻植株全部相同。
IRX10蛋白的蛋白序列如序列表的序列1所示，IRX10基因的核苷酸序列见序列2。IRX10蛋白的结构示意图见图2。SP代表信号肽结构域，TM代表跨膜结构域，exostosindomain代表IRX10蛋白主要功能结构域。其中序列1的第1-23位为SP，第5-24位为TM，第50-345位为IRX10蛋白主要功能结构域。其中序列2的第1-69位为SP的编码基因，第13-72位为TM的编码基因，第148-1035位为IRX10蛋白主要功能结构域的编码基因。
1.2、突变体bc18和野生型植株中木聚糖含量的检测
分别取生长3个月的突变体bc18和野生型植株(粳稻品种“日本晴”)，每个材料至少取10株的主分蘖，检测细胞壁中木聚糖含量。具体操作如下：
1.2.1、乙醇不溶物的制备
选取生长3个月的水稻穗下第二节间，烘干至重量不再发生变化，用组织破碎仪打成粉末，通过200目筛得到均匀粉末。称取100mg粉末于10mL离心管中，加入6mL 70％乙醇溶液，震荡混匀，静置1h以上。3,000rpm离心10分钟，倒掉上清，重复上述步骤至上清无色。加入6mL氯仿:甲醇(1:1,v/v)溶液洗涤，震荡混匀，3,000rpm离心10min，弃上清，重复上述步骤洗至上清无色。加入1mL丙酮，震荡均匀，3,000rpm离心10min，弃上清，重复一次后置于烘箱中烘干，得到植物细胞壁的乙醇不溶性物质(Alcohol insoluble material,AIR)。向AIR粉末中加入6mL 0.1M的醋酸钠溶液(pH 5.0)，放置于80℃水浴锅中加热20分钟，冷却后加入100μL 50μg/mL淀粉酶Amylase和5μL支链淀粉酶Pullulanase，37℃摇床中震荡24小时以上，用淀粉-碘化钾试剂检测淀粉是否去除干净。将样品沸水浴10分钟以灭活淀粉酶，3,000rpm离心10分钟，弃上清。加6mL蒸馏水洗涤两次，加入1mL丙酮重悬，置于烘箱烘干。获得去除淀粉的AIR粉末。
1.2.2、单糖含量检测
称取2mg左右去除淀粉的AIR粉末，每个样品称取5个重复，各加入40μg肌醇作为内标。加入250μL 2M三氟乙酸，121℃加热反应90分钟。冰浴冷却，12,000rpm，离心10分钟，转移200μL上清至玻璃管，通风橱中吹干，用异丙醇洗涤并吹干。加入200μL硼氢化钠溶液(10mg/mL，溶于1M氨水)，反应90分钟。加入150μL冰醋酸中和，再经乙酸/甲醇(1:9,v/v)和甲醇溶液洗涤并吹干。加入乙酸酐和吡啶各50μL，震荡混匀，121℃加热20分钟，进行乙酰化反应。吹干后加入1mL乙酸乙酯和4mL蒸馏水萃取，混匀后2,000rpm离心10分钟。吸取上层乙酸乙酯相100μL置于进样管中，加入200μL丙酮。利用气相质谱仪对细胞壁单糖进行分离和含量测定。
结果见图3，WT代表野生型植株，每mg乙醇不溶性细胞壁中含有271.6μg木糖；bc18代表突变体植株，每mg乙醇不溶性细胞壁中含有190.5μg木糖，结果证明bc18突变体中细胞壁木糖含量明显降低。
1.2.3、木聚糖含量检测
称取1mg左右去除淀粉的AIR粉末，加入100μL 1M NaOH溶液，放置于37℃摇床中震荡16小时以上。加入100μL 1M HCl溶液中和至pH 6.0。12,000rpm离心10分钟。取100μL上清至1.5mL离心管中，加入140μL 50mM的乙酸钠溶液(pH 6.0)和10μL木聚糖内切酶M6(购于Megazyme公司)，37℃反应24小时。煮沸10分钟，以终止反应。12,000rpm离心10分钟，取上清，获得寡聚木糖样品。
利用凝胶电泳多糖分析技术(Polysaccharide analysis by carbohydrate gelelectrophoresis,PACE)检测寡聚木糖结构。取5μL样品，各加入5μL 8-氨基萘-1,3,6-三磺酸溶液(0.2M，溶于乙酸水溶液(乙酸：水＝3:17)和5μL氰基硼氢化钠溶液(1M，溶于DMSO)，混匀后37℃反应16小时进行荧光标记。放置于真空冷冻干燥机中冻干3小时以上。加入10μL6M的尿素溶解样品。样品用20％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，缓冲液为0.1M Tris-硼酸溶液(pH 8.2)，电泳条件为200V电泳20分钟，之后1,000V电泳90分钟。标准品的制作过程如下，取0.1M木一、二、三、四、五、六糖各5μL，加入30μL 8-氨基萘-1,3,6-三磺酸和30μL氰基硼氢化钠，标记和电泳检测方法如上。
结果见图4，泳道Marker表示标准品木一至木五糖；泳道WT表示野生型植株，和木聚糖标准品进行位置比较，可以检测到木一糖和木二糖的信号。泳道bc18表示突变体植株，同样可以检测到木一糖和木二糖的信号，经过信号定量比较，发现突变体中木聚糖信号明显低于野生型。
1.3、IRX10-CT蛋白的获得
将编码链的核苷酸序列是序列2的第73-1251位所示的DNA分子命名为IRX10-CT基因，IRX10-CT基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列1第25-417位所示，将序列1第25-417位所示蛋白质命名为IRX10-CT蛋白。
实施例2、IRX10-CT蛋白的制备
2.1、重组质粒的构建
步骤1、提取粳稻品种“日本晴”的总RNA并反转录为cDNA。
步骤2、以步骤1提取的cDNA为模板，用引物对F1和R1进行PCR扩增，对产物进行胶回收。
F1：5'-AGAGGCTGAAGCATCGATGAATTCAGAGGTGCGGCAGG-3'(下划线为限制性内切酶EcoRI的识别位点)；
R1：5'-TTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAACCAAGGCTTCAGG-3'(下划线为限制性内切酶XbaI的识别位点)。
步骤3、用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pPICZαC载体，回收约3600bp的载体骨架。
步骤4、采用一步法连接体系(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)，将步骤2的胶回收产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pPICZαC-IRX10-CT。根据测序结果，对重组质粒pPICZαC-IRX10-CT的结构进行如下描述：将pPICZαC载体的EcoRI和XbaI识别位点之间的片段(pPICZαC载体的EcoRI和XbaI识别位点之间的小片段)替换为核苷酸序列是序列表的序列2的第73-1251位的双链DNA分子(IRX10-CT基因)。重组质粒pPICZαC-IRX10-CT中，外源序列IRX10-CT与载体骨架上的部分核苷酸形成融合蛋白IRX10-CT-myc-His的编码基因，重组质粒pPICZαC-IRX10-CT表达融合蛋白IRX10-CT-myc-His。融合蛋白IRX10-CT-myc-His的氨基酸序列如序列表的序列3所示。其中序列3的第1-393位为IRX10-CT，第396-405位为myc标签，第411-416位为His标签。
将序列3的第287和288位的天门冬氨酸突变为天门冬酰胺，作为IRX10-CT-myc-His的突变蛋白，命名为10D；突变蛋白质10D的编码基因的核苷酸序列由1179个核苷酸组成，与序列表中序列2的第73-1251位的区别仅在于将序列表中序列2第931位碱基突变为A，第934位碱基突变为A。10D的编码基因是核苷酸序列如序列表中序列5第73-1254位所示的DNA分子。
将序列3的第271位的精氨酸突变为赖氨酸，作为IRX10-CT-myc-His的突变蛋白，命名为10R；突变蛋白质10R的编码基因的核苷酸序列由1179个核苷酸组成，与序列表中序列2的第73-1251位的区别仅在于将序列表中序列2第884位碱基突变为A。
将重组质粒pPICZαC-IRX10-CT中IRX10-CT的编码基因分别替换为10D或10R的编码基因，得到重组质粒pPICZαC-10D和重组质粒pPICZαC-10R。重组质粒pPICZαC-10D表达融合蛋白10D-myc-His，融合蛋白10D-myc-His的氨基酸序列如序列表中序列4所示；重组质粒pPICZαC-10R表达融合蛋白10R-myc-His。
2.2、重组菌的制备
将重组质粒pPICZαC-IRX10-CT及突变形式pPICZαC-10D和pPICZαC-10R分别电转化毕赤酵母菌株X33(Invitrogen)，得到重组菌株X33/pPICZαC-IRX10-CT、X33/pPICZαC-10D、X33/pPICZαC-10R。具体操作如下：
2.2.1、酵母感受态细胞的制备
毕赤酵母菌株X33，在YPDS平板上划线接种，30℃培养两天。挑取单克隆，用YPD培养基活化培养。转接至100mL YPD培养基中，30℃培养过夜，至菌体浓度OD600nm值为1.3-1.5。1,500rpm，4℃离心5分钟，倒掉上清，用100mL提前预冷的无菌蒸馏水清洗两次，离心并弃上清，用4mL预冷的1M山梨醇重悬菌体，离心并弃上清，最后用200μL预冷的1M山梨醇重悬。
2.2.2、酵母感受态细胞的电转
取5μg pPICZαC-IRX10-CT及突变形式pPICZαC-10D和pPICZαC-10R重组质粒，分别加入限制性内切酶Pme I，37℃反应8小时，通过乙醇沉淀分别回收质粒，用10μL超纯水溶解。然后加入80μL上述酵母感受态细胞，通过电激方法转化，加入1M山梨醇悬起菌液，30℃孵育1小时，最后涂布于博莱霉素抗性的YPD固体平板，30℃培养3天。
2.3、融合蛋白IRX10-CT-myc-His的诱导表达及纯化
2.3.1、融合蛋白IRX10-CT-myc-His的诱导表达
分别挑选上述YPD固体平板上的单克隆，于25mL BMGY培养基中进行培养，30℃摇菌过夜。待菌体浓度OD600nm值为2-6时，2,000rpm离心5分钟，弃上清，收集菌体，并用100-200mL BMMY培养基重悬菌体，调整OD600nm值为1.0。开始诱导蛋白表达，随后每隔24小时补加甲醇至终浓度0.5％，并取样1mL进行检测。将蛋白样品用甲醇/醋酸铵沉淀过夜，随后经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和蛋白印迹检测，挑选表达量最高的菌株和最适的表达时间进行大量诱导。实验中所用的培养基和详细操作流程参见EasySelectTM PichiaExpression Kit(Invitrogen)。
2.3.2、融合蛋白IRX10-CT-myc-His的纯化
用
Figure BDA0003393881970000091
Pure系统对融合蛋白IRX10-CT-myc-His进行纯化。具体步骤如下：4,000rpm，4℃离心20分钟，取上清，通过0.22μm滤膜进行过滤。将蛋白样品流过已被缓冲液(50mM磷酸钠,pH 7.0,0.5M NaCl,20mM咪唑,10％甘油)平衡的HisTrap crude FF柱子，随后以(0-0.5)M梯度浓度咪唑溶液洗脱，用HiTrap脱盐柱进行脱盐处理，超滤浓缩，得到融合蛋白IRX10-CT-myc-His。按照上述方法表达突变形式蛋白10D-myc-His和10R-myc-His。将融合蛋白以抗His标签抗体作为特异性抗体进行Western Bloting检测，结果如图5，均可检测到目标蛋白。IRX10表示上样样品为IRX10-CT-myc-His；10D表示上样样品为10D-myc-His；10R表示上样样品为10R-myc-His
实施例3、融合蛋白IRX10-CT-myc-His在体外合成木聚糖主链的反应中的应用
3.1、融合蛋白IRX10-CT-myc-His延伸木聚糖主链反应中的应用
3.1.1、融合蛋白IRX10-CT-myc-His对寡聚木糖的活性的测定
取0.1mM木五糖(购买于Megazyme公司)作为反应底物，1mM UDP-木糖为反应供体，1mM氯化镁为金属辅因子，以磷酸钠溶液(50mM，溶于水，pH 6.8)作为反应缓冲液，加入5μg实施例2中的纯化后的融合蛋白IRX10-CT-myc-His，25℃催化反应16小时。取5μL产物，按照实施例1中的1.2.3中的PACE方法分析酶活产物。
结果如图6中所示，IRX10-CT蛋白可以将底物木五糖反应成多个条带信号，推测为木六糖至木十二糖。突变形式蛋白10D的活性没有发生明显改变，10R完全丧失反应活性。将三种蛋白煮沸灭活后，产物中只能看到木五糖的信号，证明反应活性完全丧失。
用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析上述酶活产物。取1μLCMBT于点样孔上，晾干至呈白色固体状。将2μL样品与等体积的基质DHB混匀，取1μL加到点样孔上。利用ABI 4700Proteomics Analyzer进行检测，所用激光波长为355nm，频率200Hz。所得数据利用Data Explorer V4.5进行分析。
结果如图7所示，产物谱图中各离子信号峰等相距为132，证明酶活产物为木六糖至木十糖这5种寡聚木糖，其中木五糖的离子信号峰为m/z 920.2、木六糖的离子信号峰为m/z 1052.2、木七糖的离子信号峰为m/z 1184.2、木八糖的离子信号峰为m/z1316.2、木九糖的离子信号峰为m/z 1448.2、木十糖的离子信号峰为m/z 1580.2，。
以上实验证明融合蛋白IRX10-CT-myc-His具有木糖糖基转移酶的酶活性。
3.1.2、测定融合蛋白IRX10-CT-myc-His对木五糖的酶活动力学曲线
采用Glo测定试剂盒(Promega公司的产品)测定融合蛋白IRX10-CT-myc-His对木五糖的酶活动力学曲线。具体步骤如下：以木五糖为底物，底物设定一系列浓度梯度：0mM、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.0mM、2mM，酶活反应体系同上述步骤1，然后用Glo测定试剂盒测定融合蛋白IRX10-CT-myc-His催化不同浓度底物所释放的UDP含量，最后以木五糖的浓度为横坐标，以UDP的释放速度为纵坐标，得到融合蛋白IRX10-CT-myc-His对木五糖的酶活动力学曲线。用Origin v9.1软件进行数据分析，计算得到Km值为0.10±0.02mM。酶活动力学曲线见图8。
3.2、融合蛋白IRX10-CT-myc-His在起始木聚糖主链反应中的应用
3.2.1、融合蛋白IRX10-CT-myc-His对UDP-木糖的活性的测定
取1mM UDP-木糖为底物，1mM氯化镁为金属辅因子，10％甘油为添加剂，以50mM磷酸钠溶液(溶于水，pH 6.8)作为反应缓冲液，加入5μg纯化后的融合蛋白IRX10-CT-myc-His，25℃催化反应36小时。取5μL产物，按照实施例1中的PACE方法分析酶活产物。
结果如图9所示，根据标准品(木一至木六糖)在胶图中的位置，可以初步确定在产物中存在木寡糖，包括木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。突变形式蛋白10D的活性没有发生明显改变，10R完全丧失反应活性。将三种蛋白煮沸灭活后，产物中没有检测到木寡糖的信号，只存在本底信号，证明反应活性完全丧失。
按照3.1.1中MALDI-TOF方法检测上述酶活产物。结果如图10所示，产物谱图中各离子信号峰等相距为132，证明酶活产物为木二糖至木八糖这7种寡聚木糖。其中木二糖的离子信号峰为m/z 524.2、木三糖的离子信号峰为m/z 656.2、木四糖的离子信号峰为m/z788.2、木五糖的离子信号峰为m/z 920.2、木六糖的离子信号峰为m/z1052.2、木七糖的离子信号峰为m/z 1184.2、木八糖的离子信号峰为m/z 1316.2。
3.2.2、测定融合蛋白IRX10-CT-myc-His对UDP-木糖的酶活动力学曲线
采用Glo测定试剂盒测定融合蛋白IRX10-CT-myc-His对UDP-木糖的酶活动力学曲线。具体步骤如下：以UDP-木糖为底物，底物设定一系列浓度梯度：0mM、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.0mM、2mM、4mM，酶活反应体系同步骤一、1，然后用Glo测定试剂盒测定融合蛋白IRX10-CT-myc-His催化不同浓度底物所释放的UDP含量，最后以UDP-木糖的浓度为横坐标，以UDP的释放速度为纵坐标，得到融合蛋白IRX10-CT-myc-His对UDP-木糖的酶活动力学曲线。用Origin v9.1软件进行数据分析，计算得到Km值为1.75±0.31mM。酶活动力学曲线见图11。
结果证明，IRX10-CT蛋白对于木聚糖延伸活性较为稳定，实验重复性较好。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> IRX10-CT蛋白在从头合成木聚糖中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 417
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
Met Arg Arg Trp Val Leu Ala Ile Ala Ile Leu Ala Ala Ala Val Cys
1 5 10 15
Phe Phe Leu Gly Ala Gln Ala Gln Glu Val Arg Gln Gly His Gln Thr
20 25 30
Glu Arg Ile Ser Gly Ser Ala Gly Asp Val Leu Glu Asp Asp Pro Val
35 40 45
Gly Arg Leu Lys Val Tyr Val Tyr Asp Leu Pro Ser Lys Tyr Asn Lys
50 55 60
Lys Leu Leu Lys Lys Asp Pro Arg Cys Leu Asn His Met Phe Ala Ala
65 70 75 80
Glu Ile Phe Met His Arg Phe Leu Leu Ser Ser Ala Val Arg Thr Phe
85 90 95
Asn Pro Glu Glu Ala Asp Trp Phe Tyr Thr Pro Val Tyr Thr Thr Cys
100 105 110
Asp Leu Thr Pro Ser Gly Leu Pro Leu Pro Phe Lys Ser Pro Arg Met
115 120 125
Met Arg Ser Ala Ile Glu Leu Ile Ala Thr Asn Trp Pro Tyr Trp Asn
130 135 140
Arg Ser Glu Gly Ala Asp His Phe Phe Val Thr Pro His Asp Phe Gly
145 150 155 160
Ala Cys Phe His Tyr Gln Glu Glu Lys Ala Ile Gly Arg Gly Ile Leu
165 170 175
Pro Leu Leu Gln Arg Ala Thr Leu Val Gln Thr Phe Gly Gln Lys Asn
180 185 190
His Val Cys Leu Lys Asp Gly Ser Ile Thr Ile Pro Pro Tyr Ala Pro
195 200 205
Pro Gln Lys Met Gln Ala His Leu Ile Pro Pro Asp Thr Pro Arg Ser
210 215 220
Ile Phe Val Tyr Phe Arg Gly Leu Phe Tyr Asp Thr Ser Asn Asp Pro
225 230 235 240
Glu Gly Gly Tyr Tyr Ala Arg Gly Ala Arg Ala Ser Val Trp Glu Asn
245 250 255
Phe Lys Asn Asn Pro Leu Phe Asp Ile Ser Thr Asp His Pro Pro Thr
260 265 270
Tyr Tyr Glu Asp Met Gln Arg Ser Val Phe Cys Leu Cys Pro Leu Gly
275 280 285
Trp Ala Pro Trp Ser Pro Arg Leu Val Glu Ala Val Val Phe Gly Cys
290 295 300
Ile Pro Val Ile Ile Ala Asp Asp Ile Val Leu Pro Phe Ala Asp Ala
305 310 315 320
Ile Pro Trp Glu Glu Ile Gly Val Phe Val Ala Glu Glu Asp Val Pro
325 330 335
Lys Leu Asp Ser Ile Leu Thr Ser Ile Pro Thr Asp Val Ile Leu Arg
340 345 350
Lys Gln Arg Leu Leu Ala Asn Pro Ser Met Lys Gln Ala Met Leu Phe
355 360 365
Pro Gln Pro Ala Gln Ala Gly Asp Ala Phe His Gln Ile Leu Asn Gly
370 375 380
Leu Ala Arg Lys Leu Pro His Gly Glu Asn Val Phe Leu Lys Pro Gly
385 390 395 400
Glu Arg Ala Leu Asn Trp Thr Ala Gly Pro Val Gly Asp Leu Lys Pro
405 410 415
Trp
<210> 2
<211> 1254
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
atgaggaggt gggtcttggc cattgccatt cttgctgctg ctgtatgctt cttccttgga 60
gctcaggccc aggaggtgcg gcagggccac cagacagaga ggatctcagg aagtgctggt 120
gatgtgttgg aagatgaccc tgttgggagg cttaaggtct atgtctatga tctcccaagc 180
aagtacaaca agaagctgct gaagaaggat cctaggtgcc tgaaccacat gtttgccgct 240
gagattttca tgcatcggtt cctgttgtca agcgctgtcc gaacttttaa tcccgaggaa 300
gctgattggt tctacacacc ggtgtacact acatgcgacc tgactccctc cggtcttccc 360
ttgcccttca aatccccaag aatgatgcgc agcgcaattg agctgattgc aacaaattgg 420
ccttactgga atagatcaga gggggctgat catttctttg ttacaccaca tgactttggc 480
gcttgcttcc actatcagga agaaaaggca attggacgtg gaatcctccc attgcttcag 540
cgtgccaccc tggttcagac ctttggacaa aagaaccatg tctgcttgaa ggacggctcg 600
atcaccattc cgccatatgc acccccacag aaaatgcagg ctcatcttat tcccccagac 660
acccctcggt ctatctttgt atatttccgt ggtctgttct acgataccag caatgatcct 720
gagggtggat actatgcaag aggtgcccgc gcgtcggttt gggagaattt caagaacaac 780
ccgctgtttg acatctcaac cgatcaccca cccacgtact acgaagatat gcagagatct 840
gtgttctgct tgtgcccatt gggctgggct ccatggagcc ccagactggt ggaagctgtg 900
gttttcggtt gtattccggt gatcattgca gatgacattg tcctcccctt tgctgatgct 960
atcccctggg aggagattgg cgtgtttgtc gccgaggagg atgttccgaa gctggacagt 1020
atcctgacat ccataccaac agatgttatc ctgaggaagc agaggcttct cgcgaacccg 1080
tcgatgaagc aggccatgct gttcccccag cctgctcagg caggagatgc attccatcag 1140
atactgaatg gtctcgctcg caagcttcca catggcgaaa acgtcttctt gaagcccggg 1200
gagagggccc tgaactggac tgctggaccg gtgggcgacc tgaagccttg gtag 1254
<210> 3
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Arg Gln Gly His Gln Thr Glu Arg Ile Ser Gly Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Leu Glu Asp Asp Pro Val Gly Arg Leu Lys Val Tyr Val Tyr
20 25 30
Asp Leu Pro Ser Lys Tyr Asn Lys Lys Leu Leu Lys Lys Asp Pro Arg
35 40 45
Cys Leu Asn His Met Phe Ala Ala Glu Ile Phe Met His Arg Phe Leu
50 55 60
Leu Ser Ser Ala Val Arg Thr Phe Asn Pro Glu Glu Ala Asp Trp Phe
65 70 75 80
Tyr Thr Pro Val Tyr Thr Thr Cys Asp Leu Thr Pro Ser Gly Leu Pro
85 90 95
Leu Pro Phe Lys Ser Pro Arg Met Met Arg Ser Ala Ile Glu Leu Ile
100 105 110
Ala Thr Asn Trp Pro Tyr Trp Asn Arg Ser Glu Gly Ala Asp His Phe
115 120 125
Phe Val Thr Pro His Asp Phe Gly Ala Cys Phe His Tyr Gln Glu Glu
130 135 140
Lys Ala Ile Gly Arg Gly Ile Leu Pro Leu Leu Gln Arg Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Gln Thr Phe Gly Gln Lys Asn His Val Cys Leu Lys Asp Gly Ser
165 170 175
Ile Thr Ile Pro Pro Tyr Ala Pro Pro Gln Lys Met Gln Ala His Leu
180 185 190
Ile Pro Pro Asp Thr Pro Arg Ser Ile Phe Val Tyr Phe Arg Gly Leu
195 200 205
Phe Tyr Asp Thr Ser Asn Asp Pro Glu Gly Gly Tyr Tyr Ala Arg Gly
210 215 220
Ala Arg Ala Ser Val Trp Glu Asn Phe Lys Asn Asn Pro Leu Phe Asp
225 230 235 240
Ile Ser Thr Asp His Pro Pro Thr Tyr Tyr Glu Asp Met Gln Arg Ser
245 250 255
Val Phe Cys Leu Cys Pro Leu Gly Trp Ala Pro Trp Ser Pro Arg Leu
260 265 270
Val Glu Ala Val Val Phe Gly Cys Ile Pro Val Ile Ile Ala Asp Asp
275 280 285
Ile Val Leu Pro Phe Ala Asp Ala Ile Pro Trp Glu Glu Ile Gly Val
290 295 300
Phe Val Ala Glu Glu Asp Val Pro Lys Leu Asp Ser Ile Leu Thr Ser
305 310 315 320
Ile Pro Thr Asp Val Ile Leu Arg Lys Gln Arg Leu Leu Ala Asn Pro
325 330 335
Ser Met Lys Gln Ala Met Leu Phe Pro Gln Pro Ala Gln Ala Gly Asp
340 345 350
Ala Phe His Gln Ile Leu Asn Gly Leu Ala Arg Lys Leu Pro His Gly
355 360 365
Glu Asn Val Phe Leu Lys Pro Gly Glu Arg Ala Leu Asn Trp Thr Ala
370 375 380
Gly Pro Val Gly Asp Leu Lys Pro Trp Ser Lys Glu Gln Lys Leu Ile
385 390 395 400
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
405 410 415
<210> 4
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Arg Gln Gly His Gln Thr Glu Arg Ile Ser Gly Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Leu Glu Asp Asp Pro Val Gly Arg Leu Lys Val Tyr Val Tyr
20 25 30
Asp Leu Pro Ser Lys Tyr Asn Lys Lys Leu Leu Lys Lys Asp Pro Arg
35 40 45
Cys Leu Asn His Met Phe Ala Ala Glu Ile Phe Met His Arg Phe Leu
50 55 60
Leu Ser Ser Ala Val Arg Thr Phe Asn Pro Glu Glu Ala Asp Trp Phe
65 70 75 80
Tyr Thr Pro Val Tyr Thr Thr Cys Asp Leu Thr Pro Ser Gly Leu Pro
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Leu Pro Phe Lys Ser Pro Arg Met Met Arg Ser Ala Ile Glu Leu Ile
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Ala Thr Asn Trp Pro Tyr Trp Asn Arg Ser Glu Gly Ala Asp His Phe
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Phe Val Thr Pro His Asp Phe Gly Ala Cys Phe His Tyr Gln Glu Glu
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Lys Ala Ile Gly Arg Gly Ile Leu Pro Leu Leu Gln Arg Ala Thr Leu
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165 170 175
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Ile Pro Pro Asp Thr Pro Arg Ser Ile Phe Val Tyr Phe Arg Gly Leu
195 200 205
Phe Tyr Asp Thr Ser Asn Asp Pro Glu Gly Gly Tyr Tyr Ala Arg Gly
210 215 220
Ala Arg Ala Ser Val Trp Glu Asn Phe Lys Asn Asn Pro Leu Phe Asp
225 230 235 240
Ile Ser Thr Asp His Pro Pro Thr Tyr Tyr Glu Asp Met Gln Arg Ser
245 250 255
Val Phe Cys Leu Cys Pro Leu Gly Trp Ala Pro Trp Ser Pro Arg Leu
260 265 270
Val Glu Ala Val Val Phe Gly Cys Ile Pro Val Ile Ile Ala Asn Asn
275 280 285
Ile Val Leu Pro Phe Ala Asp Ala Ile Pro Trp Glu Glu Ile Gly Val
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Phe Val Ala Glu Glu Asp Val Pro Lys Leu Asp Ser Ile Leu Thr Ser
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Ser Met Lys Gln Ala Met Leu Phe Pro Gln Pro Ala Gln Ala Gly Asp
340 345 350
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370 375 380
Gly Pro Val Gly Asp Leu Lys Pro Trp Ser Lys Glu Gln Lys Leu Ile
385 390 395 400
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
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<210> 5
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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Claims (10)

1.蛋白质或其相关的生物材料在制备木聚糖中的应用，其特征在于：
所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1第25-417位所示的蛋白质或氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)将A1)所述蛋白质的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所述的蛋白质具有80％以上的同一性且与木聚糖合成相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A2)所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列4第1-393位所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A2)或A3)所述蛋白质为a1)或a2)
a1)氨基酸序列如序列表中序列3所示的蛋白质；
a2)氨基酸序列如序列表中序列4所示的蛋白质。
4.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质在作为木糖糖基转移酶或制备酶制剂中的应用，所述酶制剂具有木糖糖基转移酶活性。
5.一种制备木聚糖的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1-3中任一项所述的蛋白质催化木糖合成木聚糖的步骤。
6.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或其相关生物材料的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
D1)权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或其相关生物材料在合成木聚糖中的应用；
D2)权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或其相关生物材料在制备合成木聚糖的产品中的应用；
D3)权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或其相关生物材料在调控植物细胞壁中木聚糖含量中的应用；
D4)权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或其相关生物材料在制备调控植物细胞壁中木聚糖含量的产品中的应用；
D5)权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或其相关生物材料在调控植物细胞壁中木聚糖合成中的应用；
D6)权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或其相关生物材料在制备调控植物细胞壁中木聚糖合成的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)至b5)中任一项所示的DNA分子：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2第73-1254位所示的DNA分子；
b2)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b3)编码链的编码序列是SEQ ID No.5第73-1254位所示的DNA分子；
b4)编码链的编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；
b5)与b1)、b2)、b3)或b4)限定的DNA分子具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。
8.根据权利要求6或7中所述的应用，其特征在于：所述调控植物细胞壁中木聚糖含量为提高植物细胞壁中木聚糖含量。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：
E1)单子叶植物；
E2)禾本目植物；
E3)禾本科植物；
E4)稻属植物
E5)水稻。
10.权利要求1-3中任一项所述的蛋白质或其相关生物材料。
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