CN114875000B - 一种使用融合蛋白体外重组多亚基scf e3连接酶的方法及应用 - Google Patents

一种使用融合蛋白体外重组多亚基scf e3连接酶的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114875000B
CN114875000B CN202210696862.7A CN202210696862A CN114875000B CN 114875000 B CN114875000 B CN 114875000B CN 202210696862 A CN202210696862 A CN 202210696862A CN 114875000 B CN114875000 B CN 114875000B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
escr
fusion protein
ligase
ubiquitin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210696862.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114875000A (zh
Inventor
李家洋
王冰
刘会会
余泓
孟祥兵
刘贵富
陈明江
荆彦辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Original Assignee
Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS filed Critical Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority to CN202210696862.7A priority Critical patent/CN114875000B/zh
Publication of CN114875000A publication Critical patent/CN114875000A/zh
Priority to GB2306713.5A priority patent/GB2620254A/en
Priority to US18/323,983 priority patent/US20230407287A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN114875000B publication Critical patent/CN114875000B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02019—Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法及应用。本发明公开的使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法，包括将设计改造的SKP1‑Cullin1‑RBX1融合蛋白质(简称为eSCR)与F‑box蛋白质在反应体系中进行反应，得到E3连接酶；eSCR融合蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第10‑1062位。实验证明，本发明在体外成功利用eSCR融合蛋白质重组了不同的多亚基SCF E3连接酶，且所得E3连接酶具有生物学活性，本发明在解析多亚基SCF E3连接酶分子作用机理的广泛潜在的应用。

Description

一种使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法及应用。
背景技术
蛋白质降解对于维持细胞及机体正常功能具有重要作用。在真核细胞中，蛋白降解的两个主要方式是溶酶体降解途径和泛素-蛋白酶体降解途径。其中，泛素-蛋白酶体降解途径是由底物蛋白的泛素化修饰和蛋白酶体降解两个过程组成，参与调控生命过程中的重要环节，包括细胞增殖、分化、凋亡、DNA复制和修复、转录、信号转导和蛋白质质量控制等过程。在植物中，许多控制重要细胞生物学过程的蛋白均被泛素-蛋白酶体途径调控，如生长素信号途径中的关键因子TIR1、茉莉酸信号途径的关键因子COI1、赤霉素信号途径中的关键因子GID2以及独脚金内酯信号途径中的关键因子D14和D53等。目标蛋白的泛素化修饰需要泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3依次协同作用。其中，SCFE3连接酶是一类多亚基RING E3连接酶，其成分包括SKP1蛋白、Cullin1蛋白、RBX1蛋白和一个可变F-box蛋白。在高等植物中，多亚基SCF E3连接酶在调控植物的生长发育和胁迫应答中发挥至关重要的作用。
体外泛素化修饰分析体系对于研究E3连接酶或者底物蛋白在植物生长发育过程中的分子作用机理具有重要的作用。目前为止，在植物中关于体外重组多亚基E3连接酶活性的研究仍旧空白，这极大地阻碍了研究多亚基E3连接酶分子作用机理的进程。为了解析多亚基SCF E3连接酶的作用机理，有必要建立并优化多亚基SCF E3连接酶体外活性重组体系。建立多亚基SCF E3连接酶体外活性重组体系最大的困难之一，是获取多个有活性的、SCF亚基组成成分。探究利用设计改造的SKP1-Cullin1-RBX1融合蛋白(简称为eSCR)建立多亚基SCF E3连接酶体外活性重组平台，将具有重要的生物学意义，同时对于推进植物多亚基E3连接酶分子作用机理的研究具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何体外制备多亚基SCF E3连接酶。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种多亚基SCF E3连接酶的制备方法，所述方法包括：将eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质在反应体系中进行反应，得到有活性的多亚基SCF E3连接酶；
所述eSCR融合蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第10-1062位的融合蛋白质；
A2)将SEQ ID No.2的第10-1062位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，SEQ ID No.2的第10-184位是SKP1蛋白的氨基酸序列，第189-932位是Cullin1蛋白的氨基酸序列，第937-1062位是RBX1蛋白的氨基酸序列，第185-188位和第933-936位分别是连接SKP1蛋白与Cullin1蛋白和连接Cullin1蛋白与RBX1蛋白的多肽linker序列。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID No.2的第10-1062位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
Flag 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的eSCR融合蛋白质，为与SEQ ID No.2的第10-1062位所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的eSCR融合蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的eSCR融合蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1的第28-3186位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.1的第28-3186位所示的DNA分子编码SEQ ID No.2的第10-1062位所示的eSCR融合蛋白质。
其中，SEQ ID No.1的第28-552位是编码SKP1蛋白的核苷酸序列，第565-2796位是编码Cullin1蛋白的核苷酸序列，第2809-3186位是编码RBX1蛋白的核苷酸序列，第553-564位和第2797-2808位分别是编码多肽linker的核苷酸序列
具体的，A3)所述融合蛋白质可为SEQ ID No.2所示的蛋白质。
上述方法中，所述反应体系还可含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、MgCl2、DTT和/或ATP。
和/或，所述反应可在22℃-37℃下进行，如28℃。
和/或，所述反应的时间可为1-2小时。
具体的，所述反应体系可为向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,ATP,DTT，eSCR融合蛋白质得到的反应体系，该体系中各物质的含量可如下：10mM MgCl2,2mMDTT，5mM ATP,0.8μg/30μLeSCR融合蛋白质。
在本发明的一个实施例中，F-box蛋白质为D3或带有标签的D3。
在本发明的一个实施例中，F-box蛋白质为GID2或带有标签的GID2。
在本发明的一个实施例中，F-box蛋白质为FBXL18或带有标签的FBXL18。
在本发明的一个实施例中，F-box蛋白质为CDC4或带有标签的CDC4。
利用所述多亚基SCF E3连接酶的制备方法得到的E3连接酶，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种制备多聚泛素链的方法，所述方法包括：将所述eSCR融合蛋白质、F-box蛋白质、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2与泛素单体在反应体系中进行反应，得到多聚泛素链。所述多聚泛素链(或泛素链)是指大于等于两个泛素所形成的泛素链。
本发明还提供了一种体外制备具有泛素化修饰目的蛋白的方法，所述方法包括：将目的蛋白、权利要求1中所述eSCR融合蛋白质、F-box蛋白质、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2与泛素单体在反应体系中进行反应，得到泛素化的目的蛋白。
上述方法中，所述反应体系还可含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、MgCl2、DTT和/或ATP。
和/或，所述反应可在22℃-37℃下进行，如28℃。
和/或，所述反应的时间可为1-2小时。
具体的，制备泛素链的反应体系可为向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,DTT，ATP,所述eSCR融合蛋白质、F-box蛋白质、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2与泛素单体得到的反应体系，该体系中各物质的含量可如下：10mM MgCl2,2mM DTT,5mM ATP,0.8μg/30μLeSCR融合蛋白质，50ng/30μL泛素活化酶E1,200ng/30μL泛素结合酶E2,5μg/30μLUbiquitin。
具体的，目的蛋白泛素化的反应体系可为向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,DTT,ATP,所述eSCR融合蛋白质、F-box蛋白质、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2与泛素单体、目的蛋白得到的反应体系，该体系中各物质的含量可如下：10mM MgCl2,2mM DTT,5mM ATP,0.8μg/30μLeSCR融合蛋白质，50ng/30μL泛素活化酶E1,200ng/30μL泛素结合酶E2,5μg/30μL Ubiquitin，100ng/30μL目的蛋白。
在本发明的一个实施例中，泛素活化酶E1为水稻E1。
在本发明的一个实施例中，泛素活化酶E1为人E1。
在本发明的一个实施例中，泛素结合酶E2为OsUBC14。
在本发明的一个实施例中，泛素结合酶E2为HsUbcH5C。
在本发明的一个实施例中，泛素结合酶E2为HsCDC34。
泛素单体可为相应物种的泛素单体。
在本发明的一个实施例中，目的蛋白为D53-HA。
在本发明的一个实施例中，目的蛋白为Sic1-HA。
本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂含有所述eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质。
所述成套试剂还可含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、MgCl2、DTT、ATP、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和/或泛素单体。
所述成套试剂可仅由所述eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质组成，还可由所述eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质与下述至少一种组成：50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、MgCl2、DTT、ATP、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素单体。
所述成套试剂可用于E3连接酶，也可用于制备泛素链或泛素化目的蛋白。
所述eSCR融合蛋白质或与所述eSCR融合蛋白质相关的生物材料，也属于本发明的保护范围，所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码所述eSCR融合蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系、或含有B3)所述重组载体的细胞系。
上文中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：
b11)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的第28-3186位的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中SEQ ID No.1的第28-3186位所示的DNA分子；
b13)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述eSCR融合蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述eSCR融合蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码eSCR融合蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的eSCR融合蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码eSCR融合蛋白质且具有eSCR融合蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码eSCR融合蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上文中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上文中，B2)所述的含有编码eSCR融合蛋白质的核酸分子的表达盒(eSCR基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达eSCR融合蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动eSCR基因转录的启动子，还可包括终止eSCR基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述eSCR基因表达盒的重组载体。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pFast Bac Dual载体。
B3)所述重组载体具体可为Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc载体。所述Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc载体为将pFast Bac Dual载体的EcoR I内切酶和Spe I内切酶识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.1的第1-3219位所示的eSCR融合基因得到的重组载体。
上文中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上文中，所述细胞系可为Sf9昆虫细胞。所述细胞系不包括繁殖材料。
下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
X1)所述多亚基SCFE3连接酶在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；
X2)所述多亚基SCFE3连接酶在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用；
X3)所述成套试剂在制备多亚基SCFE3连接酶中的应用；
X4)所述成套试剂在生产用于制备多亚基SCFE3连接酶的产品中的应用；
X5)所述成套试剂在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；
X6)所述成套试剂在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用；
X7)所述eSCR融合蛋白质或生物材料在制备多亚基SCFE3连接酶中的应用；
X8)所述eSCR融合蛋白质或生物材料在生产用于制备多亚基SCFE3连接酶的产品中的应用；
X9)所述eSCR融合蛋白质或生物材料在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；
X10)所述eSCR融合蛋白质或生物材料在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用。
本发明在体外成功利用eSCR融合蛋白质重组了不同的多亚基SCF E3连接酶，且所得E3连接酶具有活性，本发明在解析多亚基SCF E3连接酶分子作用机理的广泛潜在的应用。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为融合蛋白Flag-eSCR-myc示意图。A为Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc(Flag-eSCR-myc)融合蛋白示意图。B为Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc融合蛋白的氨基酸序列信息。其中，Flag-eSCR-myc代表的是设计改造的融合蛋白Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc。
图2为融合蛋白的纯化定量、NEDD8修饰检测及其自泛素化活性检测实验结果。A为从昆虫杆状病毒表达体系中表达纯化的融合蛋白考马斯亮蓝染色定量(左图)和蛋白印迹实验结果(右图)。B为检测融合蛋白eSCR中Cullin1蛋白上的NEDD8修饰，实验结果显示，融合蛋白eSCR具有NEDD8修饰，而eSCK688AR融合蛋白上NEDD8修饰已经缺失；该实验结果显示本研究所用的融合蛋白eSCR是有生物活性的。C为在体外活性重组体系中检测融合蛋白eSCR自泛素化活性的实验结果(anti-Ub的抗体能交叉反应识别出NEDD8的信号，而Flag-SCR-nyc蛋白中Cullin1蛋白部分有NEDD8修饰的，也会被anti-Ub抗体识别出来)。实验结果显示，融合蛋白Flag-eSCR-myc在体外活性重组体系中没有自泛素化活性。
图3为通过GST-Pulldown验证融合蛋白eSCR与D3蛋白之间的相互作用。实验结果显示，融合蛋白eSCR与D3蛋白之间有相互作用。Flag-eSCR-myc表示Flag-eSCR-myc。
图4为利用融合蛋白Flag-eSCR-myc进行多亚基SCFD3 E3连接酶体外活性重组。实验结果显示，与SKP1蛋白、Cullin1蛋白、RBX1蛋白和D3蛋白体外重组SCFD3 E3连接酶(wild-type SCFD3 E3连接酶，野生型SCFD3 E3连接酶)活性相比，在OsE1、OsUbiquitin和OsUBC14存在时，融合蛋白eSCR与D3蛋白能有效地重组SCFD3 E3连接酶(engineered SCFD3 E3连接酶，设计改造版SCFD3 E3连接酶)活性，形成多聚泛素链。
图5为融合蛋白Flag-eSCR-myc与D3蛋白重组eSCFD3 E3连接酶对D53蛋白的泛素化修饰实验。A为eSCFD3 E3连接酶对D53进行泛素化修饰的实验，实验结果显示，在OsE1、OsUbiquitin和OsUBC14存在时，融合蛋白Flag-eSCR-myc与D3蛋白重组所得的eSCFD3 E3连接酶能有效地泛素化D53蛋白。B为在加入TRX-D14蛋白和rac-GR24时，eSCFD3 E3连接酶对D53蛋白的泛素化水平增强了；以上实验结果显示，eSCFD3 E3连接酶具有与wild-typeSCFD3 E3连接酶相同的灵敏度，均能用来能检测SL信号转导的过程；这将为研究独脚金内酯信号途径提供一个强大的技术分析平台。
图6为通过GST-Pulldown验证融合蛋白Flag-eSCR-myc与GID2蛋白之间的相互作用。实验结果显示，融合蛋白Flag-eSCR-myc与GID2蛋白之间有相互作用。
图7为利用融合蛋白Flag-eSCR-myc进行多亚基eSCFGID2 E3连接酶体外活性重组。实验结果显示，在OsE1、OsUbiquitin和OsUBC18存在时，融合蛋白Flag-eSCR-myc与GID2蛋白能有效地重组eSCFGID2 E3连接酶活性，形成多聚泛素链。
图8为利用融合蛋白Flag-eSCR-myc与其他物种来源的F-box蛋白重组成有活性的eSCF E3连接酶。A为利用融合蛋白Flag-eSCR-myc与人来源的FBXL18蛋白体外重组eSCFFBXL18 E3连接酶活性。实验结果显示，在HsE1、HsUbiquitin和HsUbcH5C存在时，融合蛋白Flag-eSCR-myc与FBXL18蛋白能有效地重组eSCFFBXL18 E3连接酶活性，形成多聚泛素链。B为利用融合蛋白Flag-eSCR-myc与人来源的CDC4体外重组eSCFCDC4 E3连接酶活性。实验结果显示，在HsE1、HsUbiquitin和HsCDC34存在时，融合蛋白Flag-eSCR-myc与CDC4蛋白能高效地重组eSCFCDC4 E3连接酶活性，从而形成多聚泛素链。
图9为融合蛋白Flag-eSCR-myc与CDC4蛋白体外重组的eSCFCDC4 E3连接酶对其底物Sic1-HA蛋白进行泛素化修饰实验。实验结果显示，eSCFCDC4 E3连接酶能催化其底物Sic1-HA蛋白进行泛素化修饰。
各图中，Ub表示Ubiquitin。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)：将Tris溶于水中，并利用HCl调节pH至7.4，Tris的浓度为50mM。
实施例1、利用融合蛋白Flag-eSCR-myc体外重组水稻来源的eSCFD3 E3连接酶活性及其应用
本实施例在OsE1、OsUbiquitin和OsUBC14存在时，利用融合蛋白eSCR和D3蛋白在体外重组水稻多亚基SCF E3连接酶活性，具体步骤如下：
为了简化多亚基SCFD3 E3连接酶体外活性重组体系，本实施例将SKP1、Cullin1和RBX1三个蛋白串联融合为一个融合蛋白Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc(Flag-eSCR-myc)，其示意图和融合蛋白的氨基酸序列如图1中A和B所示；获取有活性的融合蛋白eSCR：
1.1重组载体的制备
用pFast Bac Dual载体(Thermofisher，货号:10712024)构建表达Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc载体，Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc的核苷酸序列是在北京盛元科萌基因生物科技有限公司进行基因合成的，以合成所得的Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc基因片段为模板，使用PHSCRFLAGF和PHSCRMYCR引物(表2)进行质粒构建，其对应的启动子是PH启动子，具体为将pFast Bac Dual载体的EcoR I内切酶和Spe I内切酶识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.1的第1-3219位所示的eSCR融合基因，得到Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc载体，该载体能表达SEQ ID No.2的第1-1072位所示的Flag-eSCR-myc融合蛋白；构建所得重组载体记为pFast Bac Dual-pPH:Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc。
表2：引物序列信息
SEQ ID No.1中，第1-27位为Flag的DNA序列，第28-552位为SKP1的DNA序列，第565-2796位为Cullin1的DNA序列，第2809-3186位为RBX1的DNA序列，第3187-3219位为myc的DNA序列；SEQ ID No.2中，第1-9位为Flag的氨基酸序列，第10-184位为SKP1的氨基酸序列，第189-932位为Cullin1的氨基酸序列，第937-1062位为RBX1的氨基酸序列，第1063-1072位为myc的氨基酸序列。此外，为了获取有功能的eSCR融合蛋白质，SKP1蛋白、Cullin1蛋白和RBX1蛋白之间加入了多肽linker序列，以保证各个蛋白之间的有效互相作用；SEQID No.1中，第553-564位和第2797-2808位为编码多肽linker的DNA序列；SEQ ID No.2中，第185-188位和第933-936位为多肽linker的氨基酸序列。
1.2融合蛋白Flag-eSCR-myc的表达
Sf9昆虫细胞(Novagen，货号：71104-1ML)贴壁生长的培养条件是26-28℃，静置培养，Sf9昆虫细胞悬浮生长的培养条件是26-28℃，低转速(一般为130-150rpm)悬浮培养；将pFast Bac Dual-pPH:Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc质粒转化大肠杆菌DH10Bac菌株，进行蓝白斑筛选后，挑取白斑单克隆进行摇菌培养,提取Bacmid DNA，使用M13F和M13R引物(表2)通过PCR鉴定后备用(主要操作步骤参阅Invitrogen公司Bac-to-Bac BaculovirusExpression System操作指南)。
按照Cellfectin II Reagent(Invitrogen，货号：10362-100)转染试剂说明书将表达Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc(简写为Flag-eSCR-myc)融合蛋白的Bacmid DNA转染贴壁生长的Sf9昆虫细胞，进行P1代昆虫杆状病毒的制取，在细胞转染72h后分别收取P1代病毒。使用P1代昆虫杆状病毒感染贴壁生长的Sf9昆虫细胞来获取P2代昆虫杆状病毒；用同样的方法获取P3代和P4代昆虫杆状病毒(主要操作步骤参阅Invitrogen公司Bac-to-BacBaculovirus Expression System操作指南)。
通过昆虫杆状病毒表达系统获取有活性的Flag-eSCR-myc融合蛋白：使用P4代昆虫杆状病毒感染悬浮生长的Sf9昆虫细胞(病毒感染细胞的生长密度一般为2×106个/mL)来进行目的蛋白表达，一般病毒感染48h后，通过离心收集昆虫细胞进行蛋白纯化。
1.3融合蛋白Flag-eSCR-myc的纯化
使用预冷的蛋白提取液I(配方：50mM Tris-HCl(pH 7.5),100mM NaCl,10mM NaF,2mM EDTA(pH 8.0),10％(v/v，体积百分比)Glycerol,0.5％(v/v，体积百分比)Nonidet P-40,使用前现加入的成分:1mM PMSF,1mM DTT)重悬步骤1.3所得感染P4代昆虫杆状病毒的Sf9昆虫细胞；经过高压细胞破碎仪(JNBIO，型号：JN-3000Plus)破碎细胞后，然后在4℃,15,000g离心20min，留取离心后的蛋白上清液。
使用Anti-Flag M2 affinity gel(Sigma，货号：A2220-5ML)按照使用说明书对Flag-eSCR-myc进行亲和纯化；然后将亲和纯化所得的Flag-eSCR-myc蛋白通过阴离子交换柱CaptoHiRes Q5/50(GE Healthcare，货号：29-2758-78)进一步纯化，将Flag-eSCR-myc蛋白纯度和浓度较高的Fraction进行合并，并使用对应规格的超滤管(Millipore，货号：UFC503096)进行缓冲液置换，使Flag-eSCR-myc处于不含Nonidet P-40的蛋白提取液I(配方：50mM Tris-HCl(pH 7.5),100mM NaCl,10mM NaF,2mM EDTA(pH 8.0),10％(v/v，体积百分比)Glycerol,使用前现加入的成分:1mM PMSF,1mM DTT)中，然后将融合蛋白Flag-eSCR-myc分装并冻存在-80℃待用。纯化的融合蛋白Flag-eSCR-myc分别通过考马斯亮蓝染色和蛋白印迹分析检测和定量(图2中A)。蛋白印迹分析所用抗体为myc抗体(Cell SignalingTechnology，货号：2276)。
1.4验证融合蛋白Flag-eSCR-myc是否有生物学活性
Cullin1蛋白上有NEDD8修饰对于Cullin1蛋白的生物学活性至关重要，且NEDD8修饰发生在Cullin1蛋白Lysine 688(K688)位点上；为了确定所得融合蛋白的生物学活性，需要检测融合蛋白中Cullin1蛋白是否有NEDD8修饰；经蛋白印迹分析发现步骤1.3所得纯化的融合蛋白Flag-eSCR-myc上有NEDD8修饰，而融合蛋白Flag-SCK688AR-myc并没有NEDD8的修饰信号(图2中B)，这说明融合蛋白Flag-eSCR-myc是具有生物学活性的。蛋白印迹分析所用抗体为Flag抗体(Sigma,货号：A8592)与NEDD8抗体(Cell signaling Technology,货号：2745)。
融合蛋白Flag-SCK688AR-myc的制备步骤如下：
以pFast Bac Dual-pPH:Flag-SKP1-Cullin1-RBX1-myc为模板，使用CUL1K688AF和CUL1K688AR引物(表2)和QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，货号：200518)对编码Lysine 688位点的核苷酸进行突变，从而得到编码Flag-SKP1-Cullin1K688A-RBX1-myc融合蛋白的重组载体pFast Bac Dual-pPH:Flag-SKP1-Cullin1K688A-RBX1-myc；然后按照1.2-1.3步骤进行Flag-SKP1-Cullin1K688A-RBX1-myc融合蛋白的表达、纯化和检测，与野生型Flag-eSCR-myc融合蛋白相比，Flag-eSCK688AR-myc中Cullin1的第688位(即SEQ ID No.2的第876位)由赖氨酸突变为了丙氨酸，Flag-SCK688AR-myc上没有NEDD8修饰(图2中B)，实验结果显示本实验所使用的Flag-eSCR-myc融合蛋白是具有生物学活性。
1.5验证融合蛋白Flag-eSCR-myc在体外泛素化修饰体系中是否有自泛素化活：
自泛素化反应体系为30μL体系，该反应体系由向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2(Sigma，货号：M2670),DTT(Sigma，货号：D0632)，ATP(Sigma，货号：A7699),His-OsE1,His-OsUBC14,His-OsUbiquitin,步骤1.3所得Flag-eSCR-myc得到，该体系中各物质的含量如下：10mM MgCl2,2mM DTT 5mM ATP,50ng His-OsE1,200ng His-OsUBC14,5μgHis-OsUbiquitin,0.8μg步骤1.3所得Flag-eSCR-myc。并利用不添加Flag-eSCR-myc的体系作为对照。
将所得反应体系在28℃下反应2h。反应结束后进行蛋白印迹分析，所用抗体为Ubiquitin抗体(Cell Signaling Technology产品)。
实验结果显示，在体外泛素化修饰体系中，融合蛋白Flag-eSCR-myc没有自泛素化活性(图2中C)。
His-OsE1蛋白、His-OsUBC14蛋白和His-OsUbiquitin蛋白的制备步骤如下：
a1)以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，分别使用GWOsE1F和GWOsE1R引物、GWOsUBC14F和GWOsUBC14R引物以及GWOSUBF和GWOSUBR引物(表2)，分别通过PCR扩增得到含有OsE1基因、OsUBC14基因和OsUb基因的DNA片段；
a2)通过GatewayBP clonase(Invitrogen，货号：P/N56481)将OsE1、OsUBC14和OsUb基因片段分别同源重组到中间载体pDNOR221载体(Invitrogen，货号：12535-019)上，获得中间载体构建质粒pDNOR221-OsE1、pDNOR221-OsUBC14和pDNOR221-OsUb；
a3)使用Gateway LR clonase(Invitrogen，货号：P/N56484)将pDNOR221-OsE1质粒上的基因片段重组至终端蛋白表达载体pET-55-DEST载体(Novagen，货号：71846，该载体的N端有His标签，C端有Strep标签)；使用同样的方法分别将pDNOR221-OsUBC14和pDNOR221-OsUb上的基因片段同源重组至终端蛋白表达载体pET-61-DEST载体(Novagen，货号：71852，该载体的N端有His标签)；经测序证实正确后得到OsE1蛋白、OsUBC14蛋白和OsUb蛋白过表达质粒pET-55-DEST-OsE1,pET-61-DEST-OsUBC14和pET-61-DEST-OsUb。其中分别编码OsE1蛋白、OsUBC14蛋白和OsUb蛋白的基因登录号是LOC_Os03g18380(更新日期2021.7.1)、LOC_Os01g46926(更新日期2021.7.1)和LOC_Os05g42424(更新日期2021.7.1)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。
a4)将质粒pET-55-DEST-OsE1、pET-61-DEST-OsUBC14和pET-61-DEST-OsUb分别转化进入大肠杆菌蛋白表达菌株BL21(DE3)中；分别挑取单克隆于10mL LB液体培养基(配方：10g/L Tryptone,5g/L yeast extract,10g/L NaCl)中，在37℃过夜培养进行菌体活化；将活化的菌体培养液按照1:100的比例进行扩大培养，在37℃培养至OD600为0.8，然后加入终浓度为0.3mM IPTG，在16℃，180rpm的培养条件下进行蛋白诱导表达，一般蛋白诱导表达的时间为16-20h；通过离心收集菌体待用，得到表达His-OsE1蛋白的菌体、表达His-OsUBC14蛋白的菌体和表达His-OsUb蛋白的菌体。
a5)使用蛋白提取液I(配方：50mM Tris-HCl(pH 7.5),100mM NaCl,10mM NaF,20mM imidazole,10％(v/v)Glycerol,0.5％(v/v)Nonidet P-40,使用前现加入的成分:1mM PMSF,1mM DTT)分别重悬表达His-OsE1蛋白的菌体、表达His-OsUBC14蛋白的菌体和表达His-OsUb蛋白的菌体；使用高压细胞破碎仪(JNBIO，型号：JN-3000Plus)破碎菌体后，在4℃,15,000g，离心20min，留取离心后的蛋白上清液；蛋白上清液按照说明书步骤使用NiSepharose 6Fast Flow树脂填料(GE Healthcare，货号：17-5318-01)进行孵育，孵育结束后，使用蛋白提取液II对结合了His-OsE1蛋白、His-OsUBC14蛋白和HisOsUb蛋白的树脂填料进行清洗后，使用50mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑、500mM咪唑4个浓度梯度分别对His-OsE1蛋白、His-OsUBC14蛋白和His-OsUb蛋白进行洗脱并收集，分别得到His-OsE1蛋白、His-OsUBC14蛋白和His-OsUbiquitin蛋白。
1.6融合蛋白Flag-eSCR-myc与D3蛋白之间互作的验证
GST-D3蛋白的制备的方法步骤如下：
b1)以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，使用GWD3F和GWD3R引物(表2)，按照1.5中a1)-a3)步骤将D3基因片段克隆到终端蛋白过表达质粒pET-60-DEST载体(Novagen,货号：71851，该载体的N端有GST标签)上，得到构建质粒pET-60-DEST-D3；其中，编码D3蛋白的基因登录号是LOC_Os06g06050(更新日期：2021.7.1)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。b2)按照1.5中a4)-a5)步骤表达纯化GST-D3蛋白，其中，纯化GST-D3蛋白使用的是GlutathioneSepharose 4Fast Flow(GE Healthcare，货号：17-5132-01)树脂填料；重悬菌体使用的蛋白提取液II(配方：50mM Tris-HCl(pH 7.5),100mMNaCl,10mM NaF,2mM EDTA(pH8.0),10％(v/v)Glycerol,0.5％(v/v)Nonidet P-40,使用前现加入的成分:1mM PMSF,1mM DTT)；得到的GST-D3琼脂糖凝胶即可用于GST-D3 pulldown实验。
Flag-eSCR-myc融合蛋白来自1.1-1.3步骤所得，含有1mg GST-D3蛋白的beads与100μL Flag-eSCR-myc融合蛋白裂解液，在4℃，10rpm，孵育1-2h。孵育结束后通过低速离心，去除上清液，使用蛋白提取液I(配方：50mM Tris-HCl(pH 7.5),100mM NaCl,10mM NaF,2mM EDTA(pH 8.0),10％(v/v，体积百分比)Glycerol,0.5％(v/v，体积百分比)Nonidet P-40,使用前现加入的成分:1mM PMSF,1mM DTT)清洗beads 4-5次后，进行蛋白印迹分析，所用抗体为myc抗体(Cell Signaling Technology，货号：2276)。
通过GST-D3 Pulldown实验对融合蛋白eSCR与D3蛋白之间互作进行验证，结果显示，融合蛋白eSCR与D3蛋白之间存在相互作用(图3)。
1.7利用融合蛋白Flag-eSCR-myc体外重组eSCFD3 E3连接酶活性
利用融合蛋白Flag-eSCR-myc进行eSCFD3 E3连接酶体外活性重组的体系为30μL，其中反应体系由向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,DTT,ATP,His-OsE1,His-OsUBC14,His-OsUbiquitin,D3-Flag,步骤1.3所得Flag-eSCR-myc得到，该体系中各物质的含量如下：10mM MgCl2,2mM DTT,5mM ATP,50ngHis-OsE1,200ng His-OsUBC14,5μg His-OsUbiquitin,0.5μg D3-Flag,0.8μg Flag-eSCR-myc。为保证各平行反应开始时间一致，活性分析实验的加样顺序依次为：His-OsUBC14,His-OsUbiquitin,SCFD3复合体组分(两个组分：D3-Flag、Flag-eSCR-myc，加入时不需要严格的先后顺序)，His-OsE1,20×Reactionbuffer(配方：1M Tris(pH 7.4),200mM MgCl2,100mM ATP,40mM DTT)。利用三种蛋白Cullin1-Flag、His-SKP1和His-RBX1替换Flag-eSCR-myc作为对照。
将所得体外活性重组体系于28℃下反应时间2hr；反应结束后，加入6×SDSsample loading buffer终止反应；将活性反应样品进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting，并依次孵育Ubiquitin抗体(Cell Signaling Technology,货号：3936)和Anti-mouse-HRP抗体(GE Health,货号：NA931V)，显影。实验结果显示，与重组所得的野生型SCFD3E3连接酶(即由Cullin1-Flag、His-SKP1和His-RBX1与D3-Flag得到的连接酶)相比，利用融合蛋白Flag-eSCR-myc和D3蛋白重组的SCFD3 E3连接酶同样具有E3连接酶的活性(图4)。
D3-Flag蛋白和Cullin1-Flag蛋白的制备步骤如下：
构建共表达Cullin1-Flag蛋白和RBX1蛋白以及D3-Flag蛋白和SKP1蛋白的质粒：因为RBX1蛋白能促进Cullin1蛋白发生NEDD8修饰从而增强Cullin1蛋白的活性，于是构建了Cullin1-Flag蛋白和RBX1蛋白共表达的质粒；因为SKP1蛋白能稳定F-box蛋白，所以构建了D3-Flag蛋白和SKP1蛋白共表达的质粒。
c1)以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，分别使用P10RBX1F和P10RBX1R引物、PHCUL1FF和PHCUL1FR引物(表2)通过PCR扩增反应获得RBX1基因片段、Cullin1-Flag基因片段，将RBX1基因片段和pFast Bac Dual载体(Thermofisher，货号:10712024)使用Kpn I内切酶和Nhe I内切酶分别进行双酶切，并分别胶回收双酶切后的RBX1基因片段和pFast Bac Dual载体，然后使用Ligation High试剂盒(TOYOBO，货号：LGK-201)进行酶切连接，得到构建质粒pFast Bac Dual-pP10:RBX1；将Cullin1-Flag基因片段和pFast Bac Dual-pP10:RBX1质粒使用EcoR I内切酶和Spe I内切酶分别进行双酶切，并分别胶回收双酶切后的Cullin1-Flag基因片段和pFast Bac Dual-Pp10:RBX1质粒，然后使用Ligation High试剂盒进行酶切连接，得到共表达Cullin1-Flag蛋白和RBX1蛋白的构建质粒pFast Bac Dual-pP10:RBX1-pPH:Cullin1-Flag。以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，分别使用P10SKP1F和P10SKP1R引物以及PHD3FF和PHD3FR引物(表2)通过PCR扩增反应获得SKP1基因片段和D3-Flag基因片段，使用同样的分子克隆方法得到共表达D3-Flag蛋白和SKP1蛋白的构建质粒pFast Bac Dual-pP10:SKP1-pPH:D3-Flag,其中，SKP1基因片段和D3-Flag基因片段所用到的双酶切位点分别为Kpn I内切酶和Nhe I内切酶、BamHI内切酶和EcoR I内切酶。其中，编码Cullin1蛋白、RBX1蛋白、D3蛋白和SKP1蛋白的基因登录号分别是LOC_Os01g27150(更新日期：2021.7.1)、LOC_Os01g01700(更新日期：2021.7.1)、LOC_Os06g06050(更新日期：2021.7.1)和LOC_Os09g36830(更新日期：2021.7.1)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。
c2)Bacmid DNA的制取及鉴定：将构建质粒pFast Bac Dual-pP10:RBX1-pPH:Cullin1-Flag和pFast Bac Dual-pP10:SKP1-pPH:D3-Flag分别转化大肠杆菌菌株DH10Bac，进行蓝白斑筛选后，挑取白斑单克隆进行摇菌培养,提取Bacmid DNA，使用M13F和M13R引物通过PCR鉴定后备用(操作步骤参见Invitrogenz公司Bac-to-Bac BaculovirusExpression System操作指南)。
c3)制取表达Cullin1-Flag蛋白和D3-Flag蛋白的昆虫杆状病毒：Sf9昆虫细胞(Novagen，货号：71104-1ML)贴壁生长的培养条件是26-28℃，静置培养；Sf9昆虫细胞悬浮生长的培养条件是26-28℃，低转速(一般为130-150rpm)悬浮培养。按照Cellfectin IIReagent(Invitrogen，货号：10362-100)转染试剂说明书将(E2)步骤所得的共表达Cullin1-Flag蛋白和RBX1蛋白的Bacmid DNA和共表达D3-Flag蛋白和SKP1蛋白的BacmidDNA分别转染贴壁生长的Sf9昆虫细胞，进行P1代昆虫杆状病毒的制取，在细胞转染72h后分别收取P1代病毒。使用P1代昆虫杆状病毒感染贴壁生长的Sf9昆虫细胞来获取P2代昆虫杆状病毒；用同样的方法获取P3代和P4代昆虫杆状病毒(操作步骤参阅Invitrogenz公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作指南)。
c4)通过昆虫杆状病毒表达系统获取有活性的Cullin1-Flag蛋白和D3-Flag蛋白：使用P4代昆虫杆状病毒感染悬浮生长的Sf9昆虫细胞(病毒感染细胞的生长密度一般为2×106个/mL)来进行目的蛋白表达，一般病毒感染48h后，通过离心收集昆虫细胞进行蛋白纯化。
c5)使用预冷的蛋白提取液I重悬细胞；经过高压细胞破碎仪(JNBIO，型号：JN-3000Plus)破碎细胞后，然后在4℃,15,000g离心20min，留取离心后的蛋白上清液。
c6)蛋白上清液按照说明书步骤使用Anti-Flag M2 affinity gel(Sigma，货号：A2220-5ML)进行蛋白纯化；使用蛋白洗脱液(配方：20mM Tris-HCl(pH 7.5),500ng/mL3×Flag peptide(Sigma，货号：F4799-25MG)，10mM NaCl)分别对D3-Flag蛋白和Cullin1-Flag蛋白进行洗脱。
c7)将c3)-c6)表达纯化所得的D3-Flag蛋白和Cullin1-Flag蛋白分别通过阴离子交换柱Capto HiRes Q5/50(GE Healthcare，货号：29-2758-78)进一步纯化，通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色进行检测经离子交换柱纯化所得的Fraction成分。
c8)根据c7)中考马斯亮蓝染色结果，将纯度和浓度较高的Fraction进行合并，并使用对应规格的超滤管(Millipore，货号：UFC503096)将蛋白缓冲液置换为蛋白提取液I。
c9)将c8)中所得的蛋白通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色进行检测和定量，然后分别将纯化所得的D3-Flag蛋白和Cullin1-Flag蛋白进行分装并冻存在-80℃待用。
His-SKP1蛋白和His-RBX1蛋白的制备步骤如下：
d1)以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，分别使用GWSKP1F和GWSKP1R引物以及GWRBX1F和GWSRBX1R引物(表2)按照a1)-a3)步骤将SKP1和RBX1基因片段克隆到终端蛋白过表达质粒pET-61-DEST载体(Novagen,货号：71852，该载体的N端有His标签)上，得到构建质粒pET-61-DEST-SKP1和pET-61-DEST-RBX1。
d2)按照a4)-a5)步骤表达纯化His-SKP1蛋白和His-RBX1蛋白；将纯化所得的His-SKP1蛋白和His-RBX1蛋白进行分装并冻存在-80℃待用。
1.8D53蛋白的泛素化分析
利用多亚基SCFD3 E3连接酶体外活性重组体系分析D53蛋白的泛素化，活性分析体系为30μL，其中反应体系由向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,DTT,ATP,His-OsE1,His-OsUBC14,His-OsUbiquitin,D3-Flag,Flag-eSCR-myc,D53-HA得到，该体系中各物质的含量如下：10mM MgCl2,2mM DTT,5mM ATP,50ng His-OsE1,200ng His-OsUBC14,5μgHis-OsUbiquitin,0.5μg D3-Flag,0.8μg Flag-eSCR-myc,100ng D53-HA。为保证各平行反应开始时间一致，活性分析实验的加样顺序依次为：His-OsUBC14,His-OsUbiquitin,D53-HA,SCFD3复合体组分(D3-Flag、Cullin1-Flag、His-SKP1和His-RBX1或者Flag-eSCR-myc，加入时不需要严格的先后顺序)，His-OsE1,20×Reaction buffer(配方：1M Tris(pH 7.4),200mM MgCl2,100mM ATP,40mM DTT)。
体外活性重组的反应条件为28℃，反应时间为2hr；反应结束后，加入6×SDSsample loading buffer终止反应；将活性反应样品进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting，并依次孵育Ubiquitin抗体或Anti-HA抗体(Roche，货号：11867423001)和Anti-mouse-HRP抗体，显影。
实验结果显示，无论是体外重组的野生型SCFD3 D3连接酶还是利用融合蛋白Flag-eSCR-myc重组的SCFD3 E3连接酶，均能泛素化D53蛋白(图5中A)，且在独脚金内酯受体蛋白D14(TRX-D14蛋白在体系中的浓度为0.5μg/μL)存在时，体外重组的SCFD3 E3连接酶对D53蛋白的泛素化修饰是rac-GR24(rac-GR24在体系中的浓度为56μM，rac-GR24(Chiralix，货号：CX23880)增强的(图5中B)；以上结果显示，利用融合蛋白eSCR重组的SCFD3 E3连接酶具有与重组的野生型SCFD3 E3连接酶相同的生物学活性，能有效地催化底物蛋白D53的泛素化修饰，并且对于研究SL信号转导具有较高的灵敏度。
D53-HA蛋白的制备步骤如下：
e1)以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，使用PHD53INF和PHD53INHAR引物(表2)，按照c1)步骤将带有编码HA融合蛋白标签的D53-HA基因片段克隆到pFast BacDual载体上，得到构建质粒pFast Bac Dual-pPH:D53-HA。其中，构建质粒使用的BamH I内切酶和EcoR I内切酶；其中，编码D53蛋白的基因登录号是LOC_Os11g01330(更新日期：2021.7.1)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。
e2)按照c2)-c4)步骤使用昆虫杆状病毒表达系统表达D53-HA蛋白，按照c5)-c9)步骤纯化D53-HA蛋白；其中，纯化D53-HA蛋白使用的是anti-HA agarose(Sigma，货号：A2095)，D53-HA蛋白洗脱的用的是500ng/mL 1×HA peptide(Sigma，货号：I2149)；最后将纯化的D53-HA蛋白分装并冻存在-80℃待用。
TRX-D14蛋白的制备步骤如下：
e1)以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，使用GWD14F和GWD14R引物(表2)，按照a1)-a3)步骤将D14基因片段克隆到终端蛋白过表达质粒pET-59-DEST载体(Novagen,货号：71850，该载体的N端有His和TRX标签)上，得到构建质粒pET-59-DEST-D14；其中，编码D14蛋白的基因登录号是LOC_Os03g10620(更新日期：2021.7.1)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。
e2)按照a4)-a5)步骤表达纯化His-TRX-D14蛋白(简写为TRX-D14蛋白)；将纯化所得的TRX-D14蛋白进行分装并冻存在-80℃待用。
实施例2、使用融合蛋白Flag-eSCR-myc体外重组水稻来源的SCFGID2 E3连接酶活性
2.1 GST-GID2 Pulldown验证融合蛋白Flag-eSCR-myc与F-box蛋白GID2之间的相互作用
GST-GID2蛋白的制备的方法步骤如下：
f1)以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，使用GWGID2F和GWGID2R引物(表2)，按照a1)-a3)步骤将GID2基因片段克隆到终端蛋白过表达质粒pET-60-DEST载体(Novagen,货号：71851，该载体的N端有GST标签)上，得到构建质粒pET-60-DEST-GID2；其中，编码GID2蛋白的基因登录号是AB100246.1(更新日期：2021.7.1)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。
f2)按照b2)步骤表达纯化GST-GID2蛋白；得到的GST-GID2琼脂糖凝胶即可用于GST-GID2 pulldown实验。
Flag-eSCR-myc融合蛋白来自实施例1的1.1-1.3步骤所得，含有1mg GST-GID2蛋白的琼脂糖凝胶与100μL Flag-eSCR-myc融合蛋白裂解液，在4℃，10rpm，孵育1-2h。孵育结束后通过低速离心，去除上清液，使用蛋白提取液I(配方：50mM Tris-HCl(pH 7.5),100mMNaCl,10mM NaF,2mM EDTA(pH 8.0),10％(v/v，体积百分比)Glycerol,0.5％(v/v，体积百分比)Nonidet P-40,使用前现加入的成分:1mM PMSF,1mM DTT)清洗beads 4-5次后，进行蛋白印迹分析，所用抗体为myc抗体(Cell Signaling Technology，货号：2276)。
实验结果显示，融合蛋白eSCR与GID2蛋白之间存在相互作用(图6)。
2.2利用融合蛋白Flag-eSCR-myc进行水稻来源的eSCFGID2 E3连接酶体外活性重组
利用融合蛋白Flag-eSCR-myc进行水稻来源的eSCFGID2 E3连接酶体外活性重组的体系为30μL，其中反应体系由向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,DTT,ATP,His-OsE1,His-OsUBC18,His-OsUbiquitin,GID2-Flag,实施例1的Flag-eSCR-myc得到,该体系中各物质的含量如下：10mM MgCl2,2mM DTT,5mM ATP,50ng His-OsE1,200ng His-OsUBC18,5μg His-OsUbiquitin,0.25μg GID2-Flag,0.8μg Flag-eSCR-myc。为保证各平行反应开始时间一致，活性分析实验的加样顺序依次为：His-OsUBC18,His-OsUbiquitin,SCFGID2复合体组分(两个组分：GID2-Flag、Flag-eSCR-myc，加入时不需要严格的先后顺序)，His-OsE1,20×Reaction buffer(配方：1M Tris(pH 7.4),200mM MgCl2,100mM ATP,40mM DTT)。
体外活性重组的反应条件为28℃，反应时间为2h；反应结束后，加入6×SDSsample loading buffer终止反应；将活性反应样品进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting，并依次孵育Anti-Ubiquitin抗体和Anti-mouse-HRP抗体，显影。
实验结果显示，在OsE1、OsUbiquitin和OsUBC18存在时，融合蛋白Flag-eSCR-myc与GID2蛋白能重组SCFGID2 E3连接酶活性，并形成多聚泛素链(图7)。
GID2-Flag蛋白的制备步骤如下：
g1)以水稻Nipponbare幼苗茎基部的cDNA作为模板，使用PHGID2FF和PHGID2FR引物(表2),按照c1)步骤将带有编码Flag融合蛋白标签的GID2-Flag基因片段克隆到pFastBac Dual载体上，得到构建质粒pFast Bac Dual-pPH:GID2-Flag。其中，构建质粒使用的EcoR I内切酶和Xba I内切酶。其中，编码GID2蛋白的基因登录号是AB100246.1(更新日期：2013.1)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。
g2)按照c2)-c4)步骤使用昆虫杆状病毒表达系统表达GID2-Flag蛋白，按照c5)-c9)步骤纯化GID2-Falg蛋白；最后将纯化的GID2-Flag蛋白分装并冻存在-80℃待用。
His-OsUBC18蛋白的制备步骤如下：
h1)使用引物GWOsUBC18F和GWOsUBC18R引物(表2)，按照a1)-a3)步骤将OsUBC18基因片段克隆到终端蛋白过表达质粒pET-61-DEST载体(Novagen,货号：71852，该载体的N端有His标签)上，得到构建质粒pET-61-DEST-OsUBC18；其中，编码OsUBC18蛋白的基因登录号是LOC_Os09g1223(2021.7.1)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。
h2)按照a4)-a5)步骤表达纯化His-OsUBC18蛋白；将纯化所得的His-OsUBC18蛋白进行分装并冻存在-80℃待用。
实施例3、使用融合蛋白Flag-eSCR-myc体外重组人来源的eSCFFBXL18 E3连接酶活性
利用融合蛋白Flag-eSCR-myc进行体外人来源的SCFFBXL18 E3连接酶活性重组的体系30μL，其中反应体系由向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,DTT,ATP,HsE1(BostonBiochem，货号：E-305),HsUbcH5C(BostonBiochem，货号：E2-627),HsUbiquitin(BostonBiochem，货号：U-110),HsFBXL18(Abnova，货号：H00080028-P01),实施例1的Flag-eSCR-myc得到,该体系中各物质的含量如下：10mM MgCl2,2mM DTT,5mM ATP,50ngHsE1,200ng HsUbcH5C,5μg HsUbiquitin,0.5μg FBXL18,0.8μg Flag-eSCR-myc。为保证各平行反应开始时间一致，活性分析实验的加样顺序依次为：HsUbcH5C,HsUbiquitin,SCFFBXL18复合体组分(两个组分：FBXL18、Flag-eSCR-myc，加入时不需要严格的先后顺序)，HsE1,20×Reaction buffer(配方：1M Tris(pH 7.4),200mM MgCl2,100mM ATP,40mM DTT)。
体外活性重组的反应条件为28℃，反应时间为2hr；反应结束后，加入6×SDSsample loading buffer终止反应；将活性反应样品进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting，并依次孵育Anti-Ubiquitin抗体和Anti-mouse-HRP抗体，显影。
实验结果显示，在HsE1、HsUbiquitin和HsUbcH5C存在时，融合蛋白Flag-eSCR-myc与FBXL18蛋白能重组eSCFFBXL18 E3连接酶活性，并形成多聚泛素链(图8中A)。
实施例4、使用融合蛋白Flag-eSCR-myc体外重组人来源的eSCFCDC4 E3连接酶活性
4.1利用融合蛋白Flag-eSCR-myc和人源蛋白体外重组eSCFCDC4 E3连接酶活性
利用融合蛋白Flag-eSCR-myc进行体外人来源的SCFCDC4 E3连接酶活性重组的体系30μL，其中反应体系由向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,DTT,ATP,HsE1,HsCDC34(Abnova,货号:H00000997-P01),HsUbiquitin,HsCDC4(Abnova，货号：H00055294-P01),实施例1的Flag-eSCR-myc得到，该体系中各物质的含量如下：10mM MgCl2,2mM DTT,5mM ATP,50ngHsE1,200ng HsCDC34,5μg HsUbiquitin,0.5μg CDC4,0.8μg Flag-eSCR-myc。为保证各平行反应开始时间一致，活性分析实验的加样顺序依次为：HsCDC34,HsUbiquitin,SCFCDC4复合体组分(两个组分：CDC4、Flag-eSCR-myc，加入时不需要严格的先后顺序)，HsE1,20×Reaction buffer(配方：1M Tris(pH 7.4),200mM MgCl2,100mM ATP,40mM DTT)。
体外活性重组的反应条件为28℃，反应时间为2hr；反应结束后，加入6×SDSsample loading buffer终止反应；将活性反应样品进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting，并依次孵育Anti-Ubiquitin抗体和Anti-mouse-HRP抗体，显影。
实验结果显示，在HsE1、HsUbiquitin和HsCDC34存在时，融合蛋白Flag-eSCR-myc与CDC4蛋白能重组eSCFCDC4 E3连接酶活性，并形成多聚泛素链(图8中B)。
4.2利用多亚基eSCFCDC4 E3连接酶体外活性重组体系分析Sic1蛋白的泛素化
利用多亚基eSCFCDC4 E3连接酶体外活性重组体系分析Sic1蛋白的泛素化，活性分析体系为30μL，其中反应体系由向50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中添加MgCl2,DTT,ATP,His-OsE1,His-OsUBC14,His-OsUbiquitin,D3-Flag,实施例1的Flag-eSCR-myc,HsSic1-HA,该体系中各物质的含量如下：10mM MgCl2,2mM DTT,5mM ATP,50ng His-OsE1,200ngHis-OsUBC14,5μg His-OsUbiquitin,0.5μg D3-Flag,0.8μg Flag-eSCR-myc,100ng Sic1-HA。为保证各平行反应开始时间一致，活性分析实验的加样顺序依次为：His-OsUBC14,His-OsUbiquitin,Sic1-HA,SCFCDC4复合体组分(CDC4和Flag-eSCR-myc，加入时不需要严格的先后顺序)，His-OsE1,20×Reaction buffer(配方：1M Tris(pH 7.4),200mM MgCl2,100mMATP,40mM DTT)。
体外活性重组的反应条件为28℃，反应时间为2hr；反应结束后，加入6×SDSsample loading buffer终止反应；将活性反应样品进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting，并依次孵育Anti-HA抗体和Anti-mouse-HRP抗体，显影。
实验结果显示，利用融合蛋白Flag-eSCR-myc重组的eSCFCDC4 E3连接酶，能泛素化Sic1蛋白(图9)。以上结果显示，利用融合蛋白Flag-eSCR-myc重组的eSCFCCD4 E3连接酶不仅具有E3连接酶的生物学活性，且能有效地催化底物蛋白Sic1的泛素化修饰。
HsSic1-HA的制备步骤如下：
i1)以合成的HsSic1基因为模板，使用PHHsSic1F和PHHsSic1HAR引物(表2)，按照c1)步骤将带有编码HA融合蛋白标签的HsSic1-HA基因片段克隆到pFast Bac Dual载体上，得到构建质粒pFast Bac Dual-pPH:HsSic1-HA。其中，构建质粒使用的Spe I内切酶和XbaI内切酶；其中，编码HsSic1蛋白的基因登录号是AAH01670(更新日期：2013.1)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。
i2)按照c2)-c4)步骤使用昆虫杆状病毒表达系统表达HsSic1-HA蛋白，按照c5)-c9)步骤纯化HsSic1-HA蛋白；其中，纯化HsSic1-HA蛋白使用的是anti-HA agarose(Sigma，货号：A2095)，HsSic1-HA蛋白洗脱的用的是500ng/mL 1×HA peptide(Sigma，货号：I2149)；最后将纯化的HsSic1-HA蛋白分装并冻存在-80℃待用。
上述案例显示，利用融合蛋白Flag-eSCR-myc建立多亚基SCFE3连接酶体外活性重组体系，不仅简化了活性体系组成，而且还具有跨物种兼容性，这使得体系具有广泛的应用前景，为研究真核生物中多亚基SCFE3连接酶及其底物蛋白间的分子作用机理有着重要的生物学意义。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3219
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
atggactaca aagacgatga cgacaagatg gcggccgagg cggagacgaa ggcgatgatc 60
accctccgca gctgcgaggg ccaggtgttc gaggtcgcgg aggccgtggc catggagtcc 120
cagaccatcc gccacatgat cgaggacaag tgcgccgaca ccggcatccc gctccccaac 180
gtctccgcca agatcctctc caaggtaatc gagtactgca gcaagcacgt cgaggcgcgc 240
ggcggggcgg ccgccgccgc cgacggcgac gcccccgccc ccgccgccgt ggaggccaac 300
aaggccgtcg aggacgagct caagacgttc gacgccgagt tcgtcaaggt cgaccagtcc 360
accctcttcg atctcatcct ggctgcaaac tacctcaaca tcaagggact gctggatctg 420
acctgccaga ccgtggctga catgatcaag gggaagacac cagaggagat ccgcaagacc 480
ttcaacatca agaatgactt cacccccgag gaagaagagg aggtgaggag ggagaaccag 540
tgggccttcg aaggaggatc aggaatggcg acccacgagc ggaagacgat cgatctggag 600
caggggtggg agttcatgca gaagggcatc accaagctga agaacatcct cgaggggaag 660
cccgaacccc agttcagctc cgaggactac atgatgctct acacgacgat ttacaacatg 720
tgcacgcaga agccgccgca cgactactcg cagcagctct acgagaagta ccgcgagtcc 780
ttcgaggagt acatcacgtc catggtctta ccttcattaa gagagaaaca tgatgagttt 840
atgctgagag agctagtaaa acggtggtca aaccataaag tgatggttcg gtggctatca 900
cgcttcttcc attatcttga tcggtacttt atttcaagga ggtccctacc acaactaagt 960
gaagttgggc ttagctgttt ccgggatctg gtatatcaag agatcaaagg aaaagtaaaa 1020
agtgcggtga tatccttgat agatcaagaa cgtgagggtg aacaaattga tagggccctg 1080
ttaaagaatg ttctggatat atttgttgag attggcttga ctagcatgga ctactacgaa 1140
aatgattttg aagatttctt gctcaaagat actgcagact attactctat aaaagcccag 1200
acctggattc ttgaggactc ttgtccagat tacatgttaa aggcagagga gtgtctgaaa 1260
agggagaaag agcgagttgc tcattatttg cactccagta gtgaacagaa gttgttggag 1320
aaagtgcaac atgagttgct aactcaatac gcaagtcagc tcctggagaa ggagcattct 1380
ggatgccatg cattgcttcg tgatgacaag gttgatgatc tctctagaat gtacaggctc 1440
ttttccagaa taactcgtgg tttagaacct gtttctcaaa tatttaagca gcatgttact 1500
aatgagggca ctgccttagt gaagcaagcc gaagatgctg ctagtaataa gaagccagag 1560
aagaaggaga tagttggttt acaggaacag gtttttgtcc ggaaaatcat tgagcttcat 1620
gacaagtatg tagcttatgt tacggattgt tttcaggggc acactctctt ccataaggca 1680
cttaaggagg cttttgaagt tttttgcaac aaaggtgttt ctggcagttc aagtgctgaa 1740
ttactagcta ccttctgtga caatatctta aagaaaggcg gtagtgaaaa gcttagtgat 1800
gaagcaattg aagataccct tgagaaggtt gtaaggttac ttgcctacat tagtgacaag 1860
gacttgtttg ctgagttcta tagaaagaag cttgcaagga gattgctttt tgacaagagt 1920
gctaatgatg aacatgagag aagcatcctt accaagctaa agcaacaatg tggagggcag 1980
ttcacttcca aaatggaggg catggttact gatctcactg tggcaagaga tcaccaggct 2040
aaatttgaag agttcataag cacacactca gagttgaatc ctggaatagc cttagctgtt 2100
actgtcctca caacaggatt ttggccaagt tacaaatctt ttgatataaa tctacctgca 2160
gaaatggtga aatgtgtaga ggttttcaag gagttttacc aaacaagaac aaaacacagg 2220
aaacttacct ggatttattc actgggaacc tgtaatatta atgctaaatt tgaggccaaa 2280
actattgagc tcattgttac aacttatcag gctgcattgc tgctgctgtt taatggagtt 2340
gatagactca gctattctga gattgtgaca cagttaaatc tctcagatga tgatgttgtt 2400
cgattgctcc attctctatc ttgtgcaaaa tacaagattc ttagcaaaga accaaataat 2460
agatctattt caccaaatga tgtcttcgag ttcaactcaa agtttactga caagctgcga 2520
agattaaaga tacctcttcc tccagttgat gagaagaaga aagtagttga agatgttgat 2580
aaggatcgca gatacgcaat tgatgcatca attgtgcgta ttatgaagag tcgcaaagta 2640
ttgggtcatc agcaacttgt gatggaatgt gtggagcagc ttggacgcat gtttaagcct 2700
gacttcaagg caataaagaa gcgaattgag gatcttatca caagggatta cttggagagg 2760
gataaagaca acccaaatgt gtacagatac ttggctggag gatcaggaat gtcggccatg 2820
gagaccgaca tcaacgcgcc gccgcccccc gcccccgccc ccgccggcgc cggcgaggga 2880
tcctcctctg ccgccggccc ctcctcccgc aagcccaaca agcgcttcga gatcaagaag 2940
tggaacgccg tcgcgctctg ggcatgggat atcgtcgtcg acaactgcgc catctgccgc 3000
aaccacatca tggatctatg catcgagtgc caggcgaacc aggccagcgc caccagtgag 3060
gagtgcactg tcgcttgggg tgtctgtaat catgcttttc acttccattg catcagcagg 3120
tggctcaaga ctcgccaagt gtgcccgtta gataacagtg aatgggaatt tcagaaatat 3180
gggcacgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgtag 3219
<210> 2
<211> 1072
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Ala Glu Ala Glu Thr
1 5 10 15
Lys Ala Met Ile Thr Leu Arg Ser Cys Glu Gly Gln Val Phe Glu Val
20 25 30
Ala Glu Ala Val Ala Met Glu Ser Gln Thr Ile Arg His Met Ile Glu
35 40 45
Asp Lys Cys Ala Asp Thr Gly Ile Pro Leu Pro Asn Val Ser Ala Lys
50 55 60
Ile Leu Ser Lys Val Ile Glu Tyr Cys Ser Lys His Val Glu Ala Arg
65 70 75 80
Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Asp Gly Asp Ala Pro Ala Pro Ala Ala
85 90 95
Val Glu Ala Asn Lys Ala Val Glu Asp Glu Leu Lys Thr Phe Asp Ala
100 105 110
Glu Phe Val Lys Val Asp Gln Ser Thr Leu Phe Asp Leu Ile Leu Ala
115 120 125
Ala Asn Tyr Leu Asn Ile Lys Gly Leu Leu Asp Leu Thr Cys Gln Thr
130 135 140
Val Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Thr Pro Glu Glu Ile Arg Lys Thr
145 150 155 160
Phe Asn Ile Lys Asn Asp Phe Thr Pro Glu Glu Glu Glu Glu Val Arg
165 170 175
Arg Glu Asn Gln Trp Ala Phe Glu Gly Gly Ser Gly Met Ala Thr His
180 185 190
Glu Arg Lys Thr Ile Asp Leu Glu Gln Gly Trp Glu Phe Met Gln Lys
195 200 205
Gly Ile Thr Lys Leu Lys Asn Ile Leu Glu Gly Lys Pro Glu Pro Gln
210 215 220
Phe Ser Ser Glu Asp Tyr Met Met Leu Tyr Thr Thr Ile Tyr Asn Met
225 230 235 240
Cys Thr Gln Lys Pro Pro His Asp Tyr Ser Gln Gln Leu Tyr Glu Lys
245 250 255
Tyr Arg Glu Ser Phe Glu Glu Tyr Ile Thr Ser Met Val Leu Pro Ser
260 265 270
Leu Arg Glu Lys His Asp Glu Phe Met Leu Arg Glu Leu Val Lys Arg
275 280 285
Trp Ser Asn His Lys Val Met Val Arg Trp Leu Ser Arg Phe Phe His
290 295 300
Tyr Leu Asp Arg Tyr Phe Ile Ser Arg Arg Ser Leu Pro Gln Leu Ser
305 310 315 320
Glu Val Gly Leu Ser Cys Phe Arg Asp Leu Val Tyr Gln Glu Ile Lys
325 330 335
Gly Lys Val Lys Ser Ala Val Ile Ser Leu Ile Asp Gln Glu Arg Glu
340 345 350
Gly Glu Gln Ile Asp Arg Ala Leu Leu Lys Asn Val Leu Asp Ile Phe
355 360 365
Val Glu Ile Gly Leu Thr Ser Met Asp Tyr Tyr Glu Asn Asp Phe Glu
370 375 380
Asp Phe Leu Leu Lys Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Ser Ile Lys Ala Gln
385 390 395 400
Thr Trp Ile Leu Glu Asp Ser Cys Pro Asp Tyr Met Leu Lys Ala Glu
405 410 415
Glu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala His Tyr Leu His Ser
420 425 430
Ser Ser Glu Gln Lys Leu Leu Glu Lys Val Gln His Glu Leu Leu Thr
435 440 445
Gln Tyr Ala Ser Gln Leu Leu Glu Lys Glu His Ser Gly Cys His Ala
450 455 460
Leu Leu Arg Asp Asp Lys Val Asp Asp Leu Ser Arg Met Tyr Arg Leu
465 470 475 480
Phe Ser Arg Ile Thr Arg Gly Leu Glu Pro Val Ser Gln Ile Phe Lys
485 490 495
Gln His Val Thr Asn Glu Gly Thr Ala Leu Val Lys Gln Ala Glu Asp
500 505 510
Ala Ala Ser Asn Lys Lys Pro Glu Lys Lys Glu Ile Val Gly Leu Gln
515 520 525
Glu Gln Val Phe Val Arg Lys Ile Ile Glu Leu His Asp Lys Tyr Val
530 535 540
Ala Tyr Val Thr Asp Cys Phe Gln Gly His Thr Leu Phe His Lys Ala
545 550 555 560
Leu Lys Glu Ala Phe Glu Val Phe Cys Asn Lys Gly Val Ser Gly Ser
565 570 575
Ser Ser Ala Glu Leu Leu Ala Thr Phe Cys Asp Asn Ile Leu Lys Lys
580 585 590
Gly Gly Ser Glu Lys Leu Ser Asp Glu Ala Ile Glu Asp Thr Leu Glu
595 600 605
Lys Val Val Arg Leu Leu Ala Tyr Ile Ser Asp Lys Asp Leu Phe Ala
610 615 620
Glu Phe Tyr Arg Lys Lys Leu Ala Arg Arg Leu Leu Phe Asp Lys Ser
625 630 635 640
Ala Asn Asp Glu His Glu Arg Ser Ile Leu Thr Lys Leu Lys Gln Gln
645 650 655
Cys Gly Gly Gln Phe Thr Ser Lys Met Glu Gly Met Val Thr Asp Leu
660 665 670
Thr Val Ala Arg Asp His Gln Ala Lys Phe Glu Glu Phe Ile Ser Thr
675 680 685
His Ser Glu Leu Asn Pro Gly Ile Ala Leu Ala Val Thr Val Leu Thr
690 695 700
Thr Gly Phe Trp Pro Ser Tyr Lys Ser Phe Asp Ile Asn Leu Pro Ala
705 710 715 720
Glu Met Val Lys Cys Val Glu Val Phe Lys Glu Phe Tyr Gln Thr Arg
725 730 735
Thr Lys His Arg Lys Leu Thr Trp Ile Tyr Ser Leu Gly Thr Cys Asn
740 745 750
Ile Asn Ala Lys Phe Glu Ala Lys Thr Ile Glu Leu Ile Val Thr Thr
755 760 765
Tyr Gln Ala Ala Leu Leu Leu Leu Phe Asn Gly Val Asp Arg Leu Ser
770 775 780
Tyr Ser Glu Ile Val Thr Gln Leu Asn Leu Ser Asp Asp Asp Val Val
785 790 795 800
Arg Leu Leu His Ser Leu Ser Cys Ala Lys Tyr Lys Ile Leu Ser Lys
805 810 815
Glu Pro Asn Asn Arg Ser Ile Ser Pro Asn Asp Val Phe Glu Phe Asn
820 825 830
Ser Lys Phe Thr Asp Lys Leu Arg Arg Leu Lys Ile Pro Leu Pro Pro
835 840 845
Val Asp Glu Lys Lys Lys Val Val Glu Asp Val Asp Lys Asp Arg Arg
850 855 860
Tyr Ala Ile Asp Ala Ser Ile Val Arg Ile Met Lys Ser Arg Lys Val
865 870 875 880
Leu Gly His Gln Gln Leu Val Met Glu Cys Val Glu Gln Leu Gly Arg
885 890 895
Met Phe Lys Pro Asp Phe Lys Ala Ile Lys Lys Arg Ile Glu Asp Leu
900 905 910
Ile Thr Arg Asp Tyr Leu Glu Arg Asp Lys Asp Asn Pro Asn Val Tyr
915 920 925
Arg Tyr Leu Ala Gly Gly Ser Gly Met Ser Ala Met Glu Thr Asp Ile
930 935 940
Asn Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Ala Gly Glu Gly
945 950 955 960
Ser Ser Ser Ala Ala Gly Pro Ser Ser Arg Lys Pro Asn Lys Arg Phe
965 970 975
Glu Ile Lys Lys Trp Asn Ala Val Ala Leu Trp Ala Trp Asp Ile Val
980 985 990
Val Asp Asn Cys Ala Ile Cys Arg Asn His Ile Met Asp Leu Cys Ile
995 1000 1005
Glu Cys Gln Ala Asn Gln Ala Ser Ala Thr Ser Glu Glu Cys Thr
1010 1015 1020
Val Ala Trp Gly Val Cys Asn His Ala Phe His Phe His Cys Ile
1025 1030 1035
Ser Arg Trp Leu Lys Thr Arg Gln Val Cys Pro Leu Asp Asn Ser
1040 1045 1050
Glu Trp Glu Phe Gln Lys Tyr Gly His Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1055 1060 1065
Glu Glu Asp Leu
1070

Claims (10)

1.一种E3连接酶的体外制备方法，包括：将eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质在反应体系中进行反应，得到E3连接酶；
所述eSCR融合蛋白质为如下A1）或A2）：
A1）氨基酸序列是SEQ ID No.2的第10-1062位的融合蛋白质；
A2）在A1）的N端或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述反应体系还含有50 mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4、MgCl2、DTT、ATP。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在22℃-37℃下进行；
所述反应的时间为1-2小时。
3.利用权利要求1或2所述方法得到的E3连接酶。
4.一种体外制备泛素链的方法，包括：将权利要求1中所述eSCR融合蛋白质、F-box蛋白质、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2与泛素单体在反应体系中进行反应，得到泛素链。
5.一种体外制备具有泛素化修饰目的蛋白的方法，包括：将目的蛋白、权利要求1中所述eSCR融合蛋白质、F-box蛋白质、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2与泛素单体在反应体系中进行反应，得到泛素化的目的蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述反应体系还含有50 mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4、MgCl2、DTT、ATP；
所述反应在22℃-37℃下进行；
所述反应的时间为1-2小时。
7.成套试剂，含有权利要求1中所述eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质。
8.根据权利要求7所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还含有50 mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4、MgCl2、DTT、ATP、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素单体。
9.权利要求1中所述eSCR融合蛋白质或与权利要求1中所述eSCR融合蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1）至B5）中的任一种：
B1）编码权利要求1中所述eSCR融合蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的细胞系、或含有B2）所述表达盒的细胞系、或含有B3）所述重组载体的细胞系。
10.下述任一应用：
X1）权利要求3所述的E3连接酶在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；
X2）权利要求3所述的E3连接酶在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用；
X3）权利要求7或8所述成套试剂在制备E3连接酶中的应用；
X4）权利要求7或8所述成套试剂在生产用于制备E3连接酶的产品中的应用；
X5）权利要求7或8所述成套试剂在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；
X6）权利要求7或8所述成套试剂在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用；
X7）权利要求9所述eSCR融合蛋白质或生物材料在制备E3连接酶中的应用；
X8）权利要求9所述eSCR融合蛋白质或生物材料在生产用于制备E3连接酶的产品中的应用；
X9）权利要求9所述eSCR融合蛋白质或生物材料在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；
X10）权利要求9所述eSCR融合蛋白质或生物材料在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用。
CN202210696862.7A 2022-06-20 2022-06-20 一种使用融合蛋白体外重组多亚基scf e3连接酶的方法及应用 Active CN114875000B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210696862.7A CN114875000B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 一种使用融合蛋白体外重组多亚基scf e3连接酶的方法及应用
GB2306713.5A GB2620254A (en) 2022-06-20 2023-05-05 Method for preparing multisubunit SCF E3 ligase with fusion protein through in vitro reconstitution, and use of multisubunit SCF E3 ligase
US18/323,983 US20230407287A1 (en) 2022-06-20 2023-05-25 Method for preparing multisubunit scf e3 ligase with fusion protein through in vitro reconstitution, and use of multisubunit scf e3 ligase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210696862.7A CN114875000B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 一种使用融合蛋白体外重组多亚基scf e3连接酶的方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114875000A CN114875000A (zh) 2022-08-09
CN114875000B true CN114875000B (zh) 2024-02-23

Family

ID=82680679

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210696862.7A Active CN114875000B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 一种使用融合蛋白体外重组多亚基scf e3连接酶的方法及应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230407287A1 (zh)
CN (1) CN114875000B (zh)
GB (1) GB2620254A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007135535A (ja) * 2005-11-22 2007-06-07 Nippon Flour Mills Co Ltd 組換えプラスミド及びこれにより形質転換された大腸菌並びにこれを使用したｎｅｄｄ化蛋白質の製造方法
CN1995065A (zh) * 2006-12-27 2007-07-11 清华大学深圳研究生院 具有抑制pttg表达作用的融合蛋白及其编码基因与应用
CN105147667A (zh) * 2015-07-27 2015-12-16 中国科学院动物研究所 Skp1癌蛋白及其靶向药物在肿瘤治疗中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108404123A (zh) * 2010-01-15 2018-08-17 康奈尔大学 降低细胞内蛋白质水平的方法
US10618942B2 (en) * 2016-02-17 2020-04-14 Sachdev Sidhu Ubiquitin variant modulators of SCF E3 ligases and their uses

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007135535A (ja) * 2005-11-22 2007-06-07 Nippon Flour Mills Co Ltd 組換えプラスミド及びこれにより形質転換された大腸菌並びにこれを使用したｎｅｄｄ化蛋白質の製造方法
CN1995065A (zh) * 2006-12-27 2007-07-11 清华大学深圳研究生院 具有抑制pttg表达作用的融合蛋白及其编码基因与应用
CN105147667A (zh) * 2015-07-27 2015-12-16 中国科学院动物研究所 Skp1癌蛋白及其靶向药物在肿瘤治疗中的应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An engineered platform for reconstituting functional multisubunit SCF E3 ligase in vitro;Huihui Liu et al.;《Molecular Plant》;第15卷(第8期);1285-1299 *
cullin-1 [Oryza sativa Japonica Group];None;《NCBI Reference Sequence: XP_015619069.1》;1-2 *
Expression Patterns and Functional Analysis of 11 E3 Ubiquitin Ligase Genes in Rice;Huijuan Zhang et al.;《Frontiers in Plant Science | 》;第13卷;1-14 *
In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones;Louis Masclef et al.;《Journal of Visualized Experiments》(第149期);摘要，第2页Protocol1 *
RING-box protein 1a [Oryza sativa Japonica Group];None;《NCBI Reference Sequence: XP_015618780.1》;1-2 *
SKP1-like protein 1 [Oryza sativa Japonica Group];None;《NCBI Reference Sequence: XP_015651187.1》;1-2 *
水稻组蛋白单泛素化连接酶基因OsHUB1的克隆及其在抗病性中的功能分析;向鹏;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;第2014卷(第5期);A006-17 *

Also Published As

Publication number Publication date
GB2620254A (en) 2024-01-03
GB202306713D0 (en) 2023-06-21
US20230407287A1 (en) 2023-12-21
CN114875000A (zh) 2022-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7292442B2 (ja) 改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素およびその用途
US8119369B2 (en) Human SUMO-3 for enhancing protein expression
US8945876B2 (en) Auto-processing domains for polypeptide expression
CN114875001B (zh) 一种体外重组水稻scf(d3)e3连接酶的方法及其应用
EP1470236A2 (en) Methods and compositions for protein expression and purification
CN113061591B (zh) 一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用
CN113195521A (zh) Mtu ΔI-CM内含肽变体和其应用
CN113061171B (zh) 抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用
KR20050074313A (ko) 세팔로스포린 ｃ 아실라제
CN112961853A (zh) 基于C2c1核酸酶的基因组编辑系统和方法
CN113354745B (zh) 一种组合物及规模化生产成纤维细胞生长因子的方法
JP2024138381A (ja) 凝集の少ないｐｐｒタンパク質及びその利用
CN114875000B (zh) 一种使用融合蛋白体外重组多亚基scf e3连接酶的方法及应用
Kim et al. UBP43, an ISG15‐Specific Deconjugating Enzyme: Expression, Purification, and Enzymatic Assays
CN115197327A (zh) Rna修饰嵌合蛋白及其应用
CN111363709B (zh) 一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用
JPH0638771A (ja) ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現方法および該遺伝子との共発現によるポリペプチドの製造方法
JP7289836B2 (ja) プロリンヒドロキシラーゼ、ならびにそれに伴う使用、方法および生成物
CN114763552B (zh) 一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法
WO2024170051A1 (en) Fusion polypeptides for manufacturing of cyclic peptides
KR101505697B1 (ko) 시스토바이러스 파이12의 외피막 단백질 피9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질 제조 방법
WO2024218401A1 (en) Poly-glutamate specific proteases
WO2024178215A2 (en) Chimeric biosensor for the detection 2&#39;3&#39;-cyclic gmp-amp (cgamp) and methods of use thereof
CN114703215A (zh) 使用真核细胞发酵表达血管紧张素转化酶2的方法
CN114908138A (zh) 一种筛选鉴定与植物多亚基scf e3连接酶协同工作e2的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant