CN108404123A - 降低细胞内蛋白质水平的方法 - Google Patents

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CN108404123A CN201810166124.5A CN201810166124A CN108404123A CN 108404123 A CN108404123 A CN 108404123A CN 201810166124 A CN201810166124 A CN 201810166124A CN 108404123 A CN108404123 A CN 108404123A
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Abstract

本发明提供了降低细胞内至少一种靶蛋白水平的方法。将第一试剂和第二试剂与所述细胞接触。所述第一试剂减少所述靶蛋白的合成，例如通过降低靶蛋白mRNA的水平或抑制mRNA的翻译。所述第二试剂促进所述靶蛋白的降解。所述第一试剂可以在第二试剂之前、之后或同时接触所述细胞。第一试剂和第二试剂可以在分开的递送载体中，或在同一递送载体中。第一试剂可以是RNAi分子(RNA干扰)，如小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或小分子核糖核酸(miRNA)。第二试剂可以是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。所述泛素连接酶可以是E3泛素连接酶，包括但不限于SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。在一个实施方式中，SCF多肽是F‑box多肽。

Description

降低细胞内蛋白质水平的方法
本申请是申请号为201180014213.4、申请日为2011年1月17日、发明名称为“降低细胞内蛋白质水平的方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2011/021475的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2010年1月15日，申请号为61/295,636的美国临时申请的优先权。
相关申请的交叉引用
本申请要求基于35U.S.C.§119(e)的2010年1月15日提交的美国临时申请号61/295,636的优先权。
技术领域
本发明涉及降低细胞内蛋白质水平的方法。本发明尤其涉及通过同时下调蛋白质的合成(例如，通过降低mRNA的水平或减少mRNA的翻译)和增加蛋白质的降解来降低蛋白质水平的方法。
背景技术
某些细胞内蛋白的不适当激活与多种人类疾病的发生有关，这些疾病包括癌症、心血管疾病、免疫疾病和神经系统疾病。R.J.Mayer，Protein Degradation：The Ubiquitin-Proteasome System and Disease，Volume4，Wiley-VCH，2007。例如，在很多癌症中，一种或多种癌基因的过表达在肿瘤的发生和发展过程中起到至关重要的作用。C.M.Croce，Oncogenes and Cancer，N.Engl.J.Med.2008；358：502-511。因此，使导致或促成疾病的靶蛋白有效下调的方法，将具有显著的诊断和治疗作用。另外，已使用了不同的工具用于降低靶蛋白的水平，以评估其生物学功能。
RNA干扰(RNAi)、基因敲除、核酶和反义寡核苷酸常用于不同的真核生物，以消除或降低细胞内蛋白质的水平。然而，在一些例子中，这些技术并不能有效地减少蛋白的表达。由于现有的基因产物仅以其自然的周转速率清除，靶蛋白的立即清除时常无法实现。需要考虑的另一个因素是靶蛋白的稳定性，它表示蛋白清除的速率和效率。即使完全破坏初期产生的mRNA，残留的长期存在的靶蛋白可能会混淆或掩盖对蛋白质清除表型的评价。
泛素依赖性蛋白水解是真核细胞用来降解细胞内蛋白质的一种主要的分解代谢途径。有3类酶协同催化蛋白泛素化：E1泛素活化酶、E2泛素偶合酶，以及E3泛素连接酶(见综述Hochstrasser(1996)Annu Rev.Genet 30：40539)。E1和E2主要涉及泛素的活化和转移，泛素途径的底物特异性由E3泛素连接酶完成。最近，我们证实通过一种我们命名为″蛋白质敲除″(PKO)的技术，经改造的泛素连接酶可以被用来加速特定的细胞内蛋白质的水解。Zhou等Harnessing the ubiquitination machinery to target the degradation ofspecific cellular proteins.Mol.Cell.2000；6：751-6.Zhang等Exploring thefunctional complexity of cellular proteins by protein knockout.Proc Natl Acad Sci USA 2003；100：14127-32.Zhang等Ectopic targeting of substrates to theubiquitin pathway.Methods Enzymol 2005；399：823-33.Zhou P.Targeted proteindegradation.Curr Opin Chem Biol 2005；9：51-5.
通过RNAi结合蛋白质敲除技术，申请人已进一步研究出迅速而有效地减少靶蛋白数量的方法。RNAi通过特定mRNA的降解或者对其翻译的抑制，在蛋白质的生物合成水平来控制蛋白质水平，而泛素连接酶介导的蛋白质敲除则在翻译后的水平加速目标蛋白的降解。这种组合方法一般适用于任何靶蛋白，包括不能被RNAi充分清除的蛋白质和具有相对长半衰期的蛋白质。
发明概述
本发明旨在提供一种降低细胞内至少一种靶蛋白水平的方法，所述方法包括使所述细胞接触第一试剂和第二试剂的步骤，其中所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加靶蛋白的降解。第一试剂可以在第二试剂之前、之后或同时接触细胞。第一试剂和第二试剂可以在分开的递送载体中或在同一递送载体中。
第一试剂可以降低靶蛋白mRNA的水平或者减少靶蛋白mRNA的翻译。第一试剂可以是RNAi分子，例如小干扰RNA(siRNA)，小发夹RNA(shRNA)，以及小分子核糖核酸(miRNA)。第一试剂也可以是双链RNA(dsRNA)，反义寡核苷酸或者核酶。
第二试剂可以是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。泛素连接酶多肽可以是E3泛素连接酶多肽，例如SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。SCF多肽包括，但是不限于，F-box多肽，例如Cdc4/FBW 7、HOS、βTrCP、FWD1、Poplp、Pop2p、Grrlp和Met30p。HECT多肽包括，但不限于，E6AP、Nedd4、RSP5、Smurfl、TOM1和EDD。靶蛋白相互作用结构域的非限制性例子包括乳头瘤病毒E7多肽和SV-40LTP多肽。
本发明的方法和组合物可以用于靶向任何蛋白质，包括细胞质蛋白、核内蛋白或者膜蛋白。例如，靶蛋白可以是Rb、p107、IκB、Sic1p、Cln2p、E2、c-myc和β-连环蛋白(β-catenin)。靶蛋白可以在任何类型细胞里，包括哺乳动物细胞，例如人类细胞或者小鼠细胞。
本发明可以用于在对象中治疗或预防疾病(如，癌症或心血管疾病)。本发明也可以用于在对象中诊断疾病或状态。
此外本发明还涉及一种表达载体，包括编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列。第一试剂减少靶蛋白的合成；第二试剂增加靶蛋白的降解。
本发明进一步提供一种细胞，其包括一种表达载体，其中所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列。所述细胞可以是任何类型细胞，其包括哺乳动物细胞，如人类细胞或者小鼠细胞。本发明提供包含第一表达载体和第二表达载体的细胞，其中第一表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列，第二表达载体包括编码第二试剂的第二核酸序列。
本发明涉及一种包含表达载体的制品，其中所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列。在另一个实施方式中，本发明提供包括第一表达载体和第二表达载体的制品，其中第一表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列，第二表达载体包含编码第二试剂的第二核酸序列。在另一个实施方式中，本发明提供包括第一试剂和第二试剂的制品。
附图的简要说明
图1描述了RNAi结合蛋白质敲除(PKO)能实现更有效和更快速地降低靶蛋白水平。RNAi减少初期靶蛋白的合成，而蛋白质敲除则加速靶蛋白的降解。
图2A和2B显示RNAi结合蛋白质敲除时，比任一种方法单独使用时，更有效地降低人骨肉瘤SAOS-2细胞内异位表达的Rb水平。
图2A显示杂交E3连接酶β-TrCP-E7N，其包含融合至E7N肽的β-TrCP F-box基序。B-TrCP F-box基序有助于与SCF核E3泛素连接酶复合物的相互作用，以及E7N肽与Rb(以及口袋蛋白p107和p130)的结合。
在图2B中，用编码抗-RB1 shRNA、β-TrCP-E7N的构建体或同时编码抗-RB1 shRNA和β-TrCP-E7N的构建体转染SAOS-2细胞。所有样品转染24小时后经嘌呤霉素选择，利用特异性抗体进行免疫印迹检测分析。
图3A显示RNAi结合蛋白质敲除在降低细胞内Rb水平方面的功能分析。E2F1连同其辅因子DP-1一同结合DHFR启动子。Rb能够抑制E2F1的转录活性。为研究降低Rb水平的效果，使用由E2F1敏感性DHFR启动子(DHFR-Luc)驱动的荧光素酶报告基因构建体。
图3B显示RNAi结合蛋白质敲除在降低细胞内Rb水平方面的双荧光素酶检测结果。用构建体与DHFR-Luc报告基因一同瞬时转染SAOS-2细胞，所述构建体编码shRb(即，针对Rb的shRNA)和/或β-TrCP-E7N。Firefly/Renilla(F/R)荧光素酶信号比率检测重复三次。测量结果利用对照进行归一化，图表表示F/R比率的平均(三次实验)倍数差异。＊表示p-值＜0.05。
图4显示利用RNAi结合蛋白质敲除清除内源性p107蛋白的动力学速率。利用抗-RBL1的siRNA寡核苷酸转染C33A细胞，然后用携带Ad1-β-TrCP-E7N构建体的腺病毒感染该细胞。“o”表示非特异性物种。在柱状图中，p107平均表达水平来自于三次独立实验，并用模拟转染和感染的C33A细胞中的p107水平进行归一化。与任一单独的方法相比，在所有时间点使用siRNA和Ad1-β-TrCP-E7N处理细胞都显示出更好的p107敲除效果。
发明详述
本发明利用翻译前和翻译后的两种方法下调靶蛋白的水平。即分别通过减少蛋白合成和提高蛋白降解，从而有效而快速地降低靶蛋白的水平。本发明能用于不同程度地减少靶蛋白的数量，并将细胞内的靶蛋白清除。本发明的方法和组合物能用于靶向基本上任何蛋白质。重要的是，第一试剂和第二试剂的联合使用能有效地产生协同效果，其比基于两种单个试剂的预计的叠加效果更好。
本发明提供了一种降低细胞内至少一种靶蛋白水平的方法。该方法包括使第一试剂和第二试剂与细胞接触的步骤：所述第一试剂减少靶蛋白的合成；而第二试剂降低靶蛋白的水平。例如，所述第一试剂能够降低靶蛋白的mRNA水平(例如，通过诱导mRNA的降解，或者通过下调靶蛋白编码基因的转录以降低靶蛋白mRNA水平)。第一试剂也可以降低或者抑制mRNA的翻译。第二试剂可以加速靶蛋白的降解。第一试剂可以在第二试剂之前、之后或同时与细胞接触。第一试剂和第二试剂可以在分开的递送载体中，也可以存在于同一递送载体中。
第一试剂可以是RNAi(RNA干扰)分子，例如小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或者小分子核糖核酸(miRNA)。所述第一试剂可以是双链RNA(dsRNA)、反义寡核苷酸、核酶或者三螺旋DNA。
第二试剂可以是包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域的嵌合多肽。所述包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域的嵌合多肽在本文中也被称为经改造的泛素连接酶。所述泛素连接酶多肽可以是E3泛素连接酶，其包括但不限于，SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。在一个实施方式中，SCF多肽是F-box多肽，其包括但不限于，哺乳动物细胞中已知的包含F-box底物识别亚单位的蛋白家族中的任何成员，例如低等真核生物中Cdc4/FBW7、HOS、pTrCP和FWD1或者Pop1p、Pop2p、Grr1p和Met30p等(见综述Cardozo等The SCFubiquitin ligase：insights into a molecular machine.Nat Rev Mol Cell Biol.20045(9)：739-51)。HECT多肽包括，但不限于，E6AP、Nedd4、RSP5、Smurfl、TOM1和EDD。泛素连接酶多肽可以与靶蛋白相互作用结构域共价或非共价连接。本文中使用第二试剂下调靶蛋白水平的技术被称为“蛋白质敲除”(“PKO”)。
本发明还包括表达载体，所述表达载体含有编码上述第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列。或者，本发明提供第一表达载体和第二表达载体，其中第一表达载体含有编码第一试剂的第一核酸序列，第二表达载体含有编码第二试剂的第二核酸序列。载体可以是病毒载体或质粒，特别地，表达载体适于在包括哺乳动物细胞在内的真核细胞中表达。
本发明可以用于不同程度地降低细胞内靶蛋白的数量，同样也可用于清除细胞内靶蛋白。本发明可以降低靶蛋白水平超过约10％、超过约20％、超过约30％、超过约40％、超过约50％、超过约60％、超过约70％、超过约80％、超过约90％或约100％。
本发明可以用于靶向任意蛋白或多肽，这些蛋白或多肽的编码基因已被克隆(或部分克隆)，或者本领域技术人员已知或能阐明与这些蛋白或多肽相互作用的多肽(或结构域)。本文中使用的术语“蛋白水平”，“蛋白数量”，“蛋白的数量”和“蛋白的水平”可以互换使用。
RNAi通过降解靶蛋白的mRNA或减少mRNA的翻译，在生物合成水平起作用。然而，靶蛋白通常被内源蛋白清除机制以常规的速度被移除。蛋白质敲除系统则通过泛素蛋白酶通路促进靶蛋白的降解，在翻译后水平起作用，但对于初期蛋白合成影响极小。在某些实施方式中，本发明同时使用RNAi和蛋白质敲除来降低细胞内目标蛋白的水平。这两种技术的联合应用比任何一种方法单独使用时，能更加有效和迅速的清除靶蛋白。更重要的是，RNAi和蛋白质敲除的联合应用产生的协同效果比基于两种技术单独应用时预计的叠加效果更好。
第一试剂：翻译前调控
第一试剂降低靶蛋白的mRNA水平或者减少mRNA的翻译。所述第一试剂可以是RNA、DNA或者核酸类似物，包括化学修饰的核苷酸(例如，糖或者骨架修饰核苷酸)和非核苷酸。其它核酸类似物，例如肽核酸(PNA)或者锁核酸(LNA)，也是合适的。美国专利号7,838,664。化学修饰可以通过在体内增加抗核酸酶降解的能力和/或通过改善细胞摄取，来改进天然核酸分子的多种属性。而且，某些化学修饰能通过靶向特定细胞或者组织和/或改进核酸分子的细胞摄取，来改善核酸分子的生物利用度。美国专利号7,858,771。
第一试剂可以是单链或者双链形式。双链核酸分子可以有两个平端、一个悬突端一个平端，或者3′和5′都为悬突端。双链核酸可以包括错配、突出端、环或者摆动碱基对。
第一试剂可以是RNAi分子，例如小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或者小分子核糖核酸(miRNA)。第一试剂可以是双链RNA(dsRNA)、反义寡核苷酸、核酶或者三螺旋DNA。
本发明的第一试剂可以包含一种或者一种以上核酸分子，所述核酸分子具有靶向蛋白的特异性。例如，仅一种siRNA可以用来下调靶蛋白的水平；两种siRNA(例如，具有不同的序列)可以联合用于调节靶蛋白的表达水平；反义寡核苷酸可以与siRNA联合降低靶蛋白水平。
本发明的第一试剂在不同水平下调靶蛋白，例如转录后水平，转录前水平，或者表观遗传水平。在非限制的例子中，通过本发明RNAi分子进行的基因表达的表观遗传调节，可源自RNAi介导的染色质结构的修饰，从而改变基因表达。(参见，例如，Verdel等，2004，Science，303，672-676；Pal-Bhadra等，2004，Science，303，669-672；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；以及Hall等，2002，Science，297，2232-2237)。
本发明的第一试剂可以被设计成靶向靶蛋白的DNA或多种RNA分子。这样的RNA的非限制性的例子包括，信使RNA(mRNA)、靶基因的可变RNA剪接变体、转录后修饰的靶基因的RNA、靶基因的mRNA前体，和/或RNA模板。如果可变剪接产生一个转录子家族，其区别在于使用适当的外显子，那么本发明可以通过所述适当的外显子来抑制或降低基因表达，从而特异性抑制或区别基因家族成员的功能。在另一个实施方式中，第一试剂用于靶向一个或多个基因家族中的保守序列。
RNAi介导的基因沉默是基因特异性的。RNAi是一个两步的过程。首先，dsRNA在细胞中被剪切成具有5’磷酸末端和3’短悬突端的siRNA。然后，产生的siRNA特异性地靶向相应的mRNA以进行破坏。Zamore P.D.Nature Structural Biology，2001，8(9)746-750。使用化学合成的siRNA双链体也可以有效诱导RNAi。Zamore等，Cell，101，25-33，(2000)。合成的siRNA双链体已显示出能特异性抑制较广范围的哺乳动物细胞系中内源和外源基因的表达。Elbashir等Nature，411，494-498，(2001).Fire(1999)Trends Genet.15：358-363.Sharp(2001)Genes Dev.15：485-490.Hammond等(2001)Nature Rev.Genes 2：1110-1119.Tuschl(2001)Chem.Biochem.2：239-245。
本发明的RNAi分子可以是双链或单链。当RNAi分子是双链时，其中一条链是正义链，另一条链是反义链；其中反义链包含的核苷酸序列互补于靶蛋白或其部分的核苷酸序列，并且正义链包含的核苷酸序列对应于靶蛋白或其部分的核苷酸序列。或者，RNAi分子可以由单个的寡核苷酸组装而成，其中RNAi分子中的自身互补的正义区和反义区可以通过核酸碱基接头或非核酸碱基接头连接。RNAi分子可以是具有双链、非对称双链、发夹或非对称发夹二级结构的多核苷酸。RNAi分子可以是环型单链多核苷酸，其具有两个或更多的环状结构，以及包含自身互补的正义区和反义区的茎状结构。环型多核苷酸能够在体内或体外被加工成活化的RNAi分子。
小干扰RNA(siRNA)是双链RNA分子，其能抑制或者降低其同源基因的表达。siRNA的每条链的长度可以是大约10个到大约50个核苷酸、大约12个到大约45个核苷酸、大约15个到大约40个核苷酸、大约20个到大约35个核苷酸、大约20个到大约30个核苷酸，或者大约20个到大约25个核苷酸。双链的siRNA可以有大约10到大约50个碱基对、大约12到大约45个碱基对、大约15到大约40个碱基对、大约20到大约35个碱基对、大约20到大约30个碱基对，或者大约20到大约25个碱基对。
已有多种方法用于将siRNA递送至细胞。这些方法包括将合成的siRNA分子递送进细胞和基于载体的方法递送，其中基于载体的方法是利用载体在靶细胞中转录产生siRNA。某些基于载体的siRNA递送系统可以稳定和有效地抑制基因表达。在很多基于载体的方法中，通过生产小发夹RNA或者短发夹RNA(shRNA)而产生siRNA。shRNA是包含茎和发夹结构的单链RNA分子。在此系统中，RNA聚合酶III启动子，如H1启动子和U6启动子，用于启动shRNA的转录。在细胞中，通过Dicer酶家族的作用将shRNA加工成siRNA。因此，转录产物与合成的siRNA双链体相似，也可有效地抑制其相应基因的表达。U.S.专利号7,772,203。McIntyreG，Fanning G(2006).″Design and cloning strategies for constructing shRNAexpression vectors".BMC Biotechnol.6：1.Paddison P，Caudy A，Bernstein E，HannonG，Conklin D(2002).″Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specificsilencing in mammalian cells".Genes Dev.16(8)：948-58。shRNA的长度可以是大约30到大约80(例如，大约35、40、45、50或55)个核苷酸、大约35到大约70个核苷酸、大约35到大约65个核苷酸、大约35到大约60个核苷酸、大约35到大约55个核苷酸、大约35到大约50个核苷酸，或者大约38到大约44(例如，38、39、40、41、42、43或者44)个核苷酸。ShRNA的双链区可以有大约10到35个碱基对、大约12到30个碱基对、大约14到25个碱基对，或者大约16到大约22(例如，大约16、17、18、19、20、21或者22)个碱基对。
第一试剂也可以是小分子核糖核酸(miRNA)分子、其类似物、miRNA前体，例如pre-miRNA和初级miRNA(pri-miRNA)。第一试剂可以是编码miRNA或者miRNA前体的DNA分子。Barrel，DP(2009).″MicroRNAs：target recognition and regulatory functions".Cell，2004，136(2)：215-33.Barrel DP.″MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction".Cell，116(2)：281-97。miRNA通常是单链分子，而miRNA的前体通常是至少部分自身互补的分子，其能形成双链部分，例如茎状和环状结构。
本发明也涉及编码上述miRNA分子或miRNA前体分子的表达载体。所述载体可以是DNA载体，例如病毒载体或者质粒，特别是适于在真核细胞，尤其是哺乳动物细胞中表达核酸的载体。包含于上述载体中的重组核酸可以是导致miRNA分子，miRNA分子前体或初始转录物转录的序列，所述miRNA分子初始转录物可以进一步被加工为miRNA分子。
反义寡核苷酸包括DNA、RNA，或其衍生物、类似物、片段、杂合体、模拟物(mimetic)和同源物(congener)。反义寡核苷酸可以通过结合特定的信使RNA从而抑制所述信使RNA蛋白质的翻译。反义寡核苷酸的长度的范围可以为从大约5到大约10个、大约10到大约20个、大约10到大约40个、大约15到大约25个、大约20到大约50个、大约50到大约75个，或者大约75到大约100个核苷酸。靶序列可以是RNA或者DNA，并且可以是单链或者双链。靶分子包括，但不限于，mRNA前体、mRNA和DNA。
核酶是能催化RNA特异剪切的具有酶活性的RNA分子。(综述，参见Rossi，J.，1994，Current Biology 4：469-471。)核酶的作用机制涉及核酶分子对与其互补的靶RNA的特异杂交，随后对其实施核酸内切酶作用。核酶分子的组合物必须含有一个或多个与靶mRNA互补的序列，并且可以包括负责对mRNA进行剪切的已知催化序列。美国专利号5,093,246。本发明范围还包括经改造的锤头基序核酶分子，其能够特异且有效地催化编码靶蛋白的RNA序列发生核酸内切作用。美国专利号7,855,152。
第一试剂可以是任何能降低靶蛋白mRNA水平或者减少所述mRNA翻译的有机小分子。“有机小分子”指的是天然的或人工合成的有机分子，其分子量范围为从大约50道尔顿到大约5000道尔顿、从大约100道尔顿到大约4000道尔顿、从大约150道尔顿到大约3000道尔顿、从大约200道尔顿到大约2500道尔顿、从大约100道尔顿到大约2000道尔顿、从大约200道尔顿到大约1000道尔顿，或者从大约100道尔顿到大约500道尔顿的范围内。
第二试剂：翻译后调控
本发明的第二试剂通过招募靶蛋白至泛素连接酶，来诱导或促进靶蛋白的降解。
第二试剂允许靶蛋白被招募到E3泛素连接酶，所述E3泛素连接酶为，例如，SCF泛素连接酶、HECT泛素连接酶或者UBR1泛素连接酶。靶蛋白可以是上述泛素连接酶的天然底物，或者通常情况下不是通过泛素偶联或者不是通过本发明的具体的E3型泛素蛋白连接酶进行靶向降解。美国专利号7,223,556提供了通过顺式或反式连接于泛素蛋白连接酶，从而靶向水解多肽的方法。靶蛋白可以被招募到E3泛素连接酶复合物，所述招募可以通过将靶蛋白共价连接至E3泛素连接酶复合物的一部分(顺式靶向)或通过将靶蛋白非共价连接到所述复合物一部分(反式靶向)。因此本发明提供任何细胞内蛋白质的可控降解，这些蛋白质的编码基因已经被克隆，或与所述蛋白质相互作用的多肽是本领域技术人员已知或容易获得的多肽。
第二试剂可以是嵌合多肽(本文也称为“经改造的泛素连接酶”)，其包含两个功能亚单位。第一个功能亚单位称为“泛素连接酶多肽”，其允许嵌合多肽靶向至泛素依赖性的蛋白水解途径。第二个功能亚单位称为“靶蛋白相互作用结构域”，其能结合靶蛋白。靶蛋白相互作用结构域招募靶蛋白，使之通过泛素依赖性蛋白水解途径被降解。功能性亚单位可以是来自自然产生的多肽，或者是其非天然产生的同系物。
本发明的一个方面提供了蛋白的顺式靶向。在本发明的该方面，靶蛋白可以连接到SCF(Skpl/Cull 1/F-box蛋白)的组分，该组分为SCF招募结构域。SCF招募结构域可以是F-box蛋白，并且使靶蛋白形成F-box融合蛋白。在某些实施方式中，F-box多肽-靶蛋白的融合蛋白包括WD-40多肽区域，例如其可由Cdc4p的WD重复序列提供，或来源于包含WD重复序列的蛋白大家族。(参见例如van der Voorn and Ploegh(1992)FEBS Lett 307：131 4)。
第二试剂的泛素连接酶多肽
在SCF(Skp1，包含cullin和F-box的蛋白)泛素连接酶复合物的亚单位中，Skp1和cullin形成稳定的核心复合物，其可以为不同的包含F-box的蛋白所共有。SCF复合物通过cullin亚单位与E2相互作用。多种F-box蛋白可用于将多种不同的靶蛋白招募到核心SCF复合物来进行泛素化。不同的F-box蛋白可以具有相同的F-box结构域，用于结合Skp1，但为了结合不同类型的底物，其可利用其它模块的蛋白-蛋白相互作用结构域，例如，WD40或富含亮氨酸的重复序列(LRR)。Kamura等(1999)Science 284：657-61；Skowyra(1999)Science284：662-5；Ohta等(1999)Mol Cell 3：535-41；Tan等(1999)Mol Cell 3：527-33。
HECT结构域泛素连接酶包括哺乳动物E6AP和Nedd4，以及酵母RSP5(Huibegtse等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92：25637；Wang等(1999)Mol Cell Biol 19：34252)，还有近来发现的HECT结构域泛素连接酶，例如哺乳动物Smurfl(Zhu，等(1999)Nature 400：68793)，酵母TOM1(saleh等(1998)J Mol Biol 282：93346；Utsugi等(1999)Gene 234：28595)，以及人EDD(Callaghan等(1999)Oncogene 17：347991)。
UBRl N末端规则泛素连接酶参与多肽的降解，所述多肽具有特殊的N末端氨基酸残基。UBRl泛素连接酶结合至不稳定的靶蛋白N端残基，并促进被结合的靶标的泛素化。(Kwon等(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：7893903；Varshavsky(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93：121429)。
在一个实施方式中，第二试剂的第一功能单位，即，泛素连接酶多肽，源自E3连接酶的多肽组分，所述E3连接酶作用于将被降解的靶蛋白。也即是，泛素连接酶多肽是E3泛素连接酶复合物的底物识别组分的结构域，该结构域足以将底物识别组分招募至E3泛素连接酶复合物。泛素连接酶多肽的非限制性例子包括Cdc4/FBW7、HOS、βTrCP、FWD1、Pop1p、Pop2p、Grr1p、Met30p及其同系物和片段。
泛素连接酶多肽可以包含F-box或其片段，其足以与至少一种其它E3泛素连接酶组分相互作用。在一个示例性实施例中，泛素连接酶多肽至少包括来自人蛋白β-TrCP的F-box，或其同系物或部分。Margottin等(1998)Mol.Cell 1：565。泛素连接酶多肽也可以源自下述包含F-box的蛋白：Cdc4p、Grr1p、Met30p、Cyclin F、Skp2p、Pop1、C02F5.7、F48E8.7、MD6、YJL149w、N0376、9934.4、8039.5、N1161、SconB、Scon-2、fim、UFO、C02F5.7、C14B1.3、C17C3.6、C26E6.5、F43C9/1、F48E8.7、K10B2.1、T01E8.4、ZK328.7、Ro3D7、MD6、p110SIII和E3012.9K(参见例如Margottin等，(1998)Mol.Cell 1：565；Bai等(1996)Cell 86：263；Kominami等(1997)，Genes Dev.11：1548；Li等(1997)EMBO J.16：5629)。本发明中还可以使用其他F-box蛋白的部分，这包括：如上文所列的Bai等所描述的任何含有F-box的蛋白，或尚未被分离的含有F-box的蛋白。这样的蛋白可以利用本领域公知的方法，基于F-box间的序列同源性进行分离。F-box序列间的比对提示了其保守残基的位置(参见例如Bai等，见上文)。
泛素连接酶多肽可以包含来自E3底物结合组分的一个或一个以上WD重复序列，或者其中的至少一部分，该部分足以与至少一种其它E3组分相互作用。可以依据Skowyra等(1997)Cell 91：209中描述的方法，确定必须包括在本发明的杂交蛋白质中的WD重复序列的数量，以及必须包含该重复序列的哪一部分。WD重复序列可以来自β-TrCP、酿酒酵母Met30p、粗糙脉孢菌Scon2p和非洲爪蟾蛋白(Xenopus levi proteins)。Margollis等，如上文所述。
在某些实施方式中，泛素连接酶多肽包括F-box和至少一个WD重复序列或其部分，使得足以用于招募至E3泛素连接酶复合物。
可以通过本领域已知的多种方法而无需额外的试验，即可在E3泛素连接酶复合物的底物识别组分中，确认对于招募至E3泛素连接酶复合物是充分且必要的部分。美国专利号7,223,556。
已知的底物识别亚单位的同源物可以利用本领域已知的方法确认。例如，同源物可以在中严格度或高严格度下通过杂交被克隆。同源物也可以通过PCR克隆获得，所述PCR利用引物在低温退火下，允许引物与允许配错的核酸杂交。
第二试剂的靶蛋白相互作用结构域
本发明嵌合多肽的第二功能亚单位是靶蛋白相互作用结构域。“靶蛋白相互作用结构域”是指能够结合靶蛋白的多肽或肽模拟物。嵌合多肽的第二功能亚单位是允许将靶蛋白招募至细胞中的E3复合物的结构域，然后通过泛素蛋白水解途径降解靶蛋白。
靶蛋白相互作用结构域可以是，例如，已知与靶蛋白相互作用的多肽的部分，或通过与靶蛋白相互作用而被识别出的天然多肽或合成多肽。
可以通过筛选天然存在的多肽序列文库，例如通过酵母双杂交或“相互捕获”的方法，可以容易地获得靶蛋白相互作用结构域(Fields and Song(1989)Nature340：2456；Gyuris等(1993)Cell 75：791 803)。酵母双杂交系统可以用于筛选哺乳动物(例如，人)cDNA表达文库，其中cDNA融合至GAL4的DNA结合结构域或激活结构域，而编码目的多肽(例如靶多肽)的核酸则融合至GAL4的激活结构域或DNA结合结构域。这样的酵母双杂交系统可以筛选cDNA，所述cDNA编码能够结合目的多肽的蛋白。例如，cDNA文库可以产生自mRNA，所述mRNA来自表达靶蛋白的细胞系。在酵母双杂交表达系统中克隆的这样的cDNA文库(Chien等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)88：9578or Cell 72：233)可以用于鉴别编码蛋白的cDNA，所述蛋白与靶多肽相互作用，然后产生GAL4依赖性的报告基因表达。
或者，合成的相互作用结构域可以通过多种肽展示选择方法获得，如现有技术中已知的噬菌体展示技术。其它技术包括哺乳动物双杂交技术、Far印迹、蛋白诱捕加核酸“捕获”(“snag”)方法、基于表面等离子体共振的生物分子相互作用分析方法和多肽矩阵展示技术。美国专利号7,223,556。
与靶蛋白相互作用的多肽也可以通过靶蛋白与抗体的免疫共沉淀和共沉淀物种鉴定来鉴别。进一步的，通过在体内用双功能交联试剂进行交联，并随后分离包含靶蛋白的交联产物，可以识别结合靶蛋白的多肽。
靶蛋白相互作用结构域也可以是抗靶蛋白的抗体或所述抗体的片段。抗体可以是完整的抗体，或抗体的片段(如，Fab，纳米抗体)。抗体或其片段可以包含一个或多个多肽。抗体类型可以是IgA，、IgG、IgE、IgD或IgM(及其亚型)，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ型。抗体的互补决定区(CDR)可以是人源或非人源的。抗体的框架可以是人的，人源化的或非人的，例如经修饰以降低人体内免疫原性的鼠框架，或合成的框架，例如保守序列。
靶蛋白相互作用结构域包括，但不限于，乳头瘤病毒E7多肽和SV-40LTP多肽。
第一试剂和第二试剂的递送
本发明的第一试剂可以以DNA或RNA分子的形式导入细胞，所述DNA或RNA分子能够减少靶蛋白mRNA的翻译或降低靶蛋白mRNA的水平。第一试剂也可以被导入细胞的DNA或RNA表达载体所表达。
本发明第二试剂可以以蛋白或多肽的形式直接导入细胞。第二试剂也可以以编码第二试剂的核酸的形式导入细胞。例如，第二试剂可以被导入到细胞中的DNA或RNA表达载体表达。
为了将第一试剂和第二试剂导入细胞，这两个试剂可以同时递送，例如两个试剂在同一递送载体中。本发明的一个实施方式提供了表达载体，其包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列。例如，单个表达载体用于将蛋白质敲除试剂的编码序列(如，在Pol II启动子控制下的经改造泛素连接酶表达盒)和shRNA编码序列(由Pol III启动子控制)同时导入细胞中以表达所述两种试剂。
或者，两种试剂也可以分开递送，例如用两个分开的递送载体。例如，可以将RNAi和蛋白质敲除试剂导入相同的靶细胞，可以在两个独立的表达载体中分别单独导入，或在相同的表达载体中同时导入。第一试剂可以以shRNA的形式导入细胞，而第二试剂可以以多肽的形式导入所述相同细胞。第一试剂可以在第二试剂之前、之后或同时与所述细胞接触。
在一个实施方式中，RNAi试剂和蛋白质敲除试剂被分别单独地导入细胞。被递送的RNAi试剂可以是合成的siRNA或者是载体中由Pol III启动子(U6或H1启动子)启动表达得到的shRNA。可以用可购得的标准转染试剂，将合成的siRNA转染到靶细胞中，所述标准转染试剂包括Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)或DharmaFECT(Thermo ScientificDharmacon)。shRNA可以用标准质粒载体(例如，pSUPER)或病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒或慢病毒载体)递送。
蛋白质敲除试剂可以以表达质粒的形式转染到细胞中，或由病毒(例如，腺病毒、逆转录病毒或慢病毒)载体通过感染的方式引入细胞。另外，蛋白质敲除试剂也可以以蛋白的形式导入细胞。在这种情况下，蛋白质敲除试剂(例如，包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域的嵌合多肽)可以从细菌或昆虫(例如，杆状病毒)系统中以蛋白质的形式表达和纯化。为了递送到细胞，第二试剂可以融合至膜转导肽，例如，衍生自HIV1 TAT或脊椎动物转录因子的同源结构域。纯化的蛋白形式的第二试剂也能够利用多种递送试剂直接递送至靶细胞中，所述递送试剂包括但不限于，PROFECT蛋白递送试剂(Targeting Systems)或ProteoJuiceTM蛋白转染试剂(Novagen)。
在一个实施方式中，第一试剂，如siRNA或shRNA载体，转染到细胞中后，再用编码第二试剂(例如，含有泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域的嵌合多肽)的病毒载体转染所述相同的细胞，或直接递送纯化的第二试剂蛋白。
表达载体可以是DNA质粒或病毒载体。载体可以是真核表达载体。载体可以包含启动子、增强子或其它调控元件。启动子可以有或没有细胞类型特异性。启动子可以是组成型或可诱导型的。可诱导型启动子可用于靶蛋白以可控的方式降解的实施方式中。病毒载体的构建可以基于，但不限于，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒或甲病毒。
适宜的表达载体包括源自pBR322的质粒、源自pEMBL的质粒、源自pEX的质粒、源自pBTac的质粒和源自pUC的质粒，上述质粒用于在原核细胞如大肠杆菌中的表达。表达载体的非限制性例子为如Paul等，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi andTaira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等，2002，Nature Biotechnology，19，500；以及Novina等，2002，Nature Medicine，advance online publication doi：10.1038/nm725中所描述的。其它适于原核和真核细胞的表达系统参见Molecular Cloning ALaboratory Manual，2.sup.nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch and Maniatis(冷泉港实验室出版：1989)第16章和第17章。第一试剂和/或第二试剂可以通过化学合成的方法获得。
第一试剂和第二试剂可以靶向相同的蛋白群或相同蛋白的不同亚群。例如，蛋白质敲除可以仅诱导翻译后修饰蛋白的亚群的降解，或是定位于特定亚细胞结构中的靶蛋白亚群的降解，而RNAi一般抑制或减少靶蛋白mRNA的翻译。蛋白质敲除也能够降低具有多余功能的整个靶蛋白家族的水平，不同真核物种间进化保守的蛋白的水平。
本发明的另一实施方式提供了一种包含表达载体的细胞，所述表达载体具有编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列。本发明还提供了一种细胞，其包含编码第一试剂的第一表达载体和编码第二试剂的第二表达载体。第一试剂和第二试剂可以在细胞中有条件地表达(例如，通过可诱导系统)或组成型表达。编码第一试剂和/或第二试剂的核酸序列可以稳定或可以不稳定整合于细胞基因组。细胞可以是任何真核细胞，包括但不限于，哺乳动物细胞。细胞可以是人、小鼠、大鼠、犬、猫、牛、羊、猪、山羊、马、灵长类动物或者酵母细胞。细胞可以是分化细胞或未分化细胞，例如，干细胞，胚胎干细胞，卵母细胞或胚细胞。本发明还提供了转基因生物，其包括但不限于，转基因植物和转基因动物。转基因生物可以包括表达载体，其具有编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列。转基因生物可以包含编码第一试剂的第一表达载体和编码第二试剂的第二表达载体。
转基因生物可以用于多种目的，例如，用于研究靶蛋白的功能，确定靶蛋白的缺失是否会导致特定的表型，例如特定疾病的发生。
本发明的组合物可以通过多种本领域技术人员已知的方法导入细胞，包括但不限于，包封于脂质体中、离子电渗法、和其它载体合并导入，其它载体例如生物可降解聚合物、水凝胶、环糊精(参见例如Gonzalez等，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；WO 03/47518和WO 03/46185)、聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)和PLCA微球(参见例如美国专利号6,447,796和美国专利公开号US 2002130430)、生物可降解纳米胶囊，和生物粘附微球，或通过类蛋白质载体(WO 00/53722)。在另一个实施方式中，本发明的核酸分子也可以用聚乙烯亚胺及其衍生物制剂或复合，聚乙烯亚胺衍生物例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰氨基半乳糖(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰氨基半乳糖(PEI-PEG-triGAL)衍生物。或者，通过直接注射或使用输液泵局部递送核酸/载体的组合。
本发明还提供了通过表面修饰的脂质体递送所述组合物，所述表面修饰的脂质体包括聚(己二酸乙二醇)脂(PEG修饰或长循环脂质体或隐形脂质体)。Lasic等Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata等，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011.Lasic等，Science 1995，267，1275-1276；Oku等，1995，Biochim.Biophys.Acta，1238，86-90)。
在一个实施方式中，可以将核酸包封于表面带正电荷的脂质体(例如，lipofectins)中，并且(可选地)脂质体表面可以用针对靶组织细胞表面抗原的抗体标记(Mizuno等，(1992)No Shinkei Geka 20：547 551；WO91/06309；日本专利申请1047381；和欧洲专利公开号EP-A-43075)。例如，神经胶质瘤细胞可以用脂质体进行脂质转染，所述脂质体用针对神经胶质瘤相关抗原的单克隆抗体标记(Mizuno等，(1992)Neurol.Med.Chir.32：873876)。
在另一个例证性的实施方式中，递送系统包含一种抗体或与核酸结合试剂(如多聚赖氨酸)交联的细胞表面配体(参见，例如WO93/04701，WO92/22635，WO92/20316，WO92/19749和WO92/06180)。例如，任何核酸都可以用于在体内通过可溶性多核苷酸载体转染特异性细胞，所述载体包含偶联至多聚阳离子(如，多聚赖氨酸)的抗体(参见，美国专利号5,166,320)。
可以通过脂质体衍生系统、聚赖氨酸复合物、内化肽、人工病毒包膜、已知的穿膜蛋白载体，将第二试剂导入细胞。
靶蛋白
使用本发明的方法或者组合物可以靶向很多种蛋白质或者多肽。靶蛋白可以是膜蛋白、核内蛋白或者细胞质蛋白。靶蛋白可能参与增殖、免疫应答、炎性反应、归巢、细胞毒性、血块的凝固或者溶解、激素调节等。蛋白质可以是天然产生的蛋白，或者是天然蛋白的突变体。
膜蛋白，包括受体(如生长因子受体、细胞因子受体、白细胞介素受体、G蛋白偶联受体)、通道蛋白、载体蛋白、介导凋亡的蛋白(例如，Fas受体)、归巢受体、血液相关蛋白等。
细胞内蛋白包括代谢途径相关蛋白、调节蛋白、激素受体、转录因子等，这取决于宿主细胞的性质。上述的一些蛋白也能作为细胞内蛋白。
在一个实施方式中，靶蛋白参与细胞生长和/或分化和/或死亡的调节。例如，靶蛋白可以是癌蛋白，其存在导致细胞的无限增殖。因此，本发明为癌症和其它增殖紊乱疾病的治疗提供了方法和组合物。
在另一个实施方式中，靶蛋白是一种微生物，例如病毒、细菌和真菌。靶蛋白可以是胞内寄生物或者其它胞内病原体的蛋白质或者多肽。靶蛋白或者多肽可以是微生物生存和/或繁殖所必需的蛋白或者多肽。因此，涉及这些多肽降解的方法能够用于治疗和/或预防微生物引起的感染。
靶蛋白非限制性的例子包括Rb、p107、IκB、Sic1p、Cln2p、E2、c-myc和β-连环蛋白(β-catenin)。其它可选的靶蛋白参见PCT/US93/01617。
引入本发明组合物的细胞可以是培养细胞，也可以是组织或者器官的一部分。所述细胞可以是未分化的细胞，例如胚细胞，或者是分化的或部分分化的细胞。所述细胞可以是体细胞或者生殖细胞。所述细胞可以是正常细胞或来自肿瘤，例如恶性或者良性肿瘤的细胞。所述细胞可以是血细胞，如淋巴细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞。在其它实施方式中，所述细胞可以是肌细胞、肾细胞、肝细胞、上皮细胞、骨细胞(例如，成骨细胞或者骨细胞)、软骨细胞、间质细胞、内皮细胞、脑细胞或者任意其它类型的细胞，只要细胞中包含泛素蛋白水解途径的必要元件，或者可以经修饰后包含这些成分。
靶细胞可以是存在于对象内或者对象外的任何类型的真核细胞。例如，细胞内将被降解的靶蛋白可以是在对象中，向对象给予第一试剂和第二试剂。或者，细胞可以来自对象。将第一试剂和第二试剂引入细胞，将细胞可选地给予同一个或其它对象。所述细胞可以是来自所有已经建立的细胞系中的细胞，其可以从例如美国模式培养物保藏中心(12301Parklawn Drive，Rockville，Md.)获得。靶细胞可以是任何真核细胞，其包括但不限于哺乳动物细胞。所述细胞可以是人、小鼠、大鼠，犬、猫，牛、羊、猪、山羊、马、灵长类或者酵母细胞。
本发明的方法和组合物也可以用于无细胞体系。
药物组合物
第一试剂和第二试剂可以包含在药物组合物中。第一试剂和第二试剂的表达载体，或者携带编码第一试剂和第二试剂的核酸序列的细胞，可以包含在药物组合物中。
为了制备这样的药物组合物，可以采用常规的药物制剂技术，将本发明的分子/化合物与药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂混合。在本发明的组合物中可以使用的药学上可接受的载体包含所有标准药用载体，如磷酸盐缓冲盐溶液、水、和乳剂例如油/水或者油/水乳剂，以及各种类型的湿润剂。组合物中还可以包含固体药用赋形剂例如淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体的赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体，特别是注射用溶液，包括水、生理盐水、液体葡萄糖和乙二醇。载体、稳定剂和佐剂的例子参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，edited by E.W.Martin(MackPublishing Company，18th ed.，1990)。组合物中也可以包括稳定剂和防腐剂。
本发明的药物组合物可以制成全身给药、外用或局部给药制剂。全身给药包括肌内注射、静脉注射、腹腔注射以及皮下注射。对于注射而言，本发明的药物组合物可以制成液体溶液，例如在生理条件缓冲液如Hank′s溶液或者Ringer′s溶液中。此外，该药物组合物可以制备成固体形式，在使用前进行再溶解或者重悬。也可以包括冻干制剂。
本发明的药物组合物可以通过本领域任何一种已知的方法给药，包括但不限于，鼻内、口服、眼用、腹腔内、吸入、静脉、脑室内注射(ICV)、脑池内注射或输注、皮下、植入、阴道、舌下、尿道(例如尿道栓剂)、皮下、肌内、静脉、经皮、直肠、舌下、黏膜、眼、脊柱、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和淋巴给药。局部给药制剂可以制成凝胶、油膏、乳膏、气雾剂等；鼻内制剂可以通过喷雾或者滴剂方式递送；经皮给药制剂可以通过透皮贴剂或者离子电渗入疗法给药；吸入制剂可以通过喷雾器或者类似装置给药。组合物也可以采用片剂、丸剂、胶囊、半固体制剂、粉剂、缓释制剂、溶液剂，混悬液，酏剂、气雾剂或者任何其它合适的形式给药。
试剂盒
本发明还提供了一种包含表达载体的制品，所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列。第一试剂降低靶蛋白mRNA的水平，或者减少靶蛋白mRNA的翻译；第二试剂降低靶蛋白的水平。本制品也包含说明表达载体用于减少细胞内靶蛋白水平的印刷品。
在另一个实施方式中，本发明提供一种制品，其包含编码第一试剂的第一表达载体和编码第二试剂的第二表达载体。第一试剂降低靶蛋白mRNA的水平，或者减少靶蛋白mRNA的翻译；第二试剂降低靶蛋白的水平。本制品也包含说明表达载体用于减少细胞内靶蛋白水平的印刷品。
在又一个实施方式中，本发明提供一种制品，其包含第一试剂和第二试剂。第一试剂降低靶蛋白mRNA的水平，或者减少靶蛋白mRNA的翻译；第二试剂降低靶蛋白的水平。本制品也包含说明第一试剂和第二试剂用于减少细胞内靶蛋白水平的印刷品。
制品可以是试剂盒。该试剂盒用于下调靶蛋白在生物系统，包括例如，在细胞内、组织或生物体中的表达水平。本发明可以单独使用或者作为试剂盒的一种组分来使用，该试剂盒至少包含一种必需的试剂，其能够在体内或者体外将本发明的组合物引入待测样品和/或对象。例如，试剂盒的成分可以包括本发明的表达载体，和能够促进表达载体进入本文所述的目的细胞的载体(例如，使用脂质和其它的本领域的已知的其它转染方法，参见，例如美国专利号6,395,713)。
组合物可以储存于包装或者分装器中。包装可以例如包含金属或者塑料片，如泡罩包装。包装或者分装器可以配有使用或者给药的说明书。试剂盒可以进一步包含其它核酸如特异性载体，其包含至少一个目的基因插入的克隆位点。
本发明为多种治疗、诊断、靶标确认、基因组发现、遗传工程和药物基因组学应用提供了有用的组合物和方法。例如，当特定蛋白的量异常而导致或引起对象出现疾病或状况时，可以单独使用本发明的方法和组合物，或者与一种或多种其它的治疗性化合物联用，用于治疗或者预防该疾病或状况。例如，本发明能够提供用于治疗癌症或者心血管疾病的有效组合物和方法。在另一个实施方式中，本发明特别提供了一种诊断对象疾病或者状况的诊断方法，其包含向对象给予本发明的组合物，所述给予是在适宜诊断对象的疾病或者状况的条件下。
本发明的方法和组合物可以与一种或者多种已知的治疗剂联用，来治疗疾病或者状况。可与本发明的方法和组合物联用的其它治疗剂的非限制性举例为，化合物、酶、抗体如单克隆抗体、小分子，以及其它有机和/或无机化合物包括金属、盐和离子。
本发明为采用基因敲除技术来消除组织培养或者动物体内任意细胞内蛋白，提供了一种快速、简便、和经济的方法。例如，不仅第一试剂和第二试剂或者其编码核酸可以被引入胚胎干细胞或者胚泡(用于制备转基因动物)，而且其可以用于胚胎或者动物发育的任意后续阶段，甚至用于成年动物中。这样，靶蛋白可以从早期发育阶段降解，或者只在发育的特殊阶段或者成年动物中降解。这使得可以通过特异性地消除目标细胞或者动物所有细胞内的多肽，来研究特异性靶蛋白的功能。
本申请提供了以下实施方式：
实施方式1.一种降低细胞内至少一种靶蛋白水平的方法，所述方法包括使第一试剂和第二试剂与所述细胞接触的步骤，其中所述第一试剂减少所述靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解，并且其中所述第一试剂在所述第二试剂之前、之后或同时与所述细胞接触。
实施方式2.如实施方式1所述的方法，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
实施方式3.如实施方式1所述的方法，其中所述第一试剂是RNAi分子。
实施方式4.如实施方式3所述的方法，其中所述RNAi分子是小干扰RNA(siRNA)。
实施方式5.如实施方式3所述的方法，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
实施方式6.如实施方式3所述的方法，其中所述RNAi分子是小分子核糖核酸(miRNA)。
实施方式7.如实施方式1所述的方法，其中所述第一试剂是双链RNA(dsRNA)。
实施方式8.如实施方式1所述的方法，其中所述第一试剂是反义寡核苷酸。
实施方式9.如实施方式1所述的方法，其中所述第一试剂是核酶。
实施方式10.如实施方式1所述的方法，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
实施方式11.如实施方式10所述的方法，其中所述泛素连接酶多肽是E3泛素连接酶多肽。
实施方式12.如实施方式11所述的方法，其中所述E3泛素连接酶多肽选自SCF多肽、HECT多肽和UBRl多肽。
实施方式13.如实施方式12所述的方法，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
实施方式14.实施方式13所述的方法，其中所述F-box多肽选自Cdc4/FBW7、HOS、βTrCP、FWD1、Poplp、Pop2p、Grrlp和Met30p。
实施方式15.如实施方式12所述的方法，其中所述HECT多肽选自E6AP、Nedd4、RSP5、Smurfl、TOM1和EDD。
实施方式16.如实施方式10所述的方法，其中所述靶蛋白相互作用结构域选自乳头瘤病毒E7多肽和SV-40LTP多肽。
实施方式17.如实施方式1所述的方法，其中所述靶蛋白选自Rb、p107、IκB、Sic1p、Cln2p、E2、c-myc和β-连环蛋白(β-catenin)。
实施方式18.如实施方式1所述的方法，其中所述靶蛋白是细胞质蛋白、核内蛋白或者膜蛋白。
实施方式19.如实施方式1所述的方法，其中所述第一试剂和所述第二试剂在分开的递送载体中。
实施方式20.如实施方式1所述的方法，其中所述第一试剂和所述第二试剂在同一递送载体中。
实施方式21.如实施方式1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
实施方式22.如实施方式21所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞或者小鼠细胞。
实施方式23.如实施方式1所述的方法，其中所述方法用于在对象中治疗或预防疾病或状况。
实施方式24.如实施方式23所述的方法，其中所述方法用于治疗或预防癌症。
实施方式25.如实施方式23所述的方法，其中所述方法用于治疗或预防心血管疾病。
实施方式26.如实施方式1所述的方法，其中所述方法用于在对象中诊断疾病或状况。
实施方式27.一种表达载体，所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列，其中所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
实施方式28.如实施方式27所述的表达载体，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或者减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
实施方式29.如实施方式27所述的表达载体，其中所述第一试剂是RNAi分子。
实施方式30.如实施方式29所述的表达载体，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
实施方式31.如实施方式27所述的表达载体，其中所述第一试剂是反义寡核苷酸。
实施方式32.如实施方式27所述的表达载体，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
实施方式33.如实施方式32所述的表达载体，其中所述泛素连接酶多肽是E3泛素连接酶。
实施方式34.如实施方式33所述的表达载体，其中所述E3泛素连接酶选自SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。
实施方式35.如实施方式34所述的表达载体，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
实施方式36.一种细胞，所述细胞包含表达载体，其中所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列，其中所述第一试剂减少细胞内靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
实施方式37.如实施方式36所述的细胞，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或者减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
实施方式38.如实施方式36所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
实施方式39.如实施方式38所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞或小鼠细胞。
实施方式40.如实施方式36所述的细胞，其中所述第一试剂是RNAi分子。
实施方式41.如实施方式40所述的细胞，其中RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
实施方式42.如实施方式36所述的细胞，其中所述第一试剂是反义寡核苷酸。
实施方式43.如实施方式36所述的细胞，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
实施方式44.如实施方式43所述的细胞，其中所述泛素连接酶多肽是E3泛素连接酶。
实施方式45.如实施方式44所述的细胞，其中所述E3泛素连接酶选自SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。
实施方式46.如实施方式45所述的细胞，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
实施方式47.一种包含第一表达载体和第二表达载体的细胞，其中所述第一表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列，所述第二表达载体包含编码第二试剂的第二核酸序列，所述第一试剂减少细胞内靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
实施方式48.如实施方式47所述的细胞，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或者减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
实施方式49.如实施方式47所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
实施方式50.如实施方式48所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞或小鼠细胞。
实施方式51.如实施方式47所述的细胞，其中所述第一试剂是RNAi分子。
实施方式52.如实施方式51所述的细胞，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
实施方式53.如实施方式47所述的细胞，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
实施方式54.一种包含表达载体的制品，其中所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列，所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
实施方式55.如实施方式54所述的制品，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
实施方式56.如实施方式54所述的制品，其中所述第一试剂是RNAi分子。
实施方式57.如实施方式56所述的制品，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
实施方式58.如实施方式54所述的制品，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
实施方式59.一种包含第一表达载体和第二表达载体的制品，其中所述第一表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列，所述第二表达载体包含编码第二试剂的第二核酸序列，所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
实施方式60.如实施方式59所述的制品，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
实施方式61.如实施方式59所述的制品，其中所述第一试剂是RNAi分子。
实施方式62.如实施方式61所述的制品，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
实施方式63.如实施方式59所述的制品，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
实施方式64.一种包含第一试剂和第二试剂的制品，其中所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
实施方式65.如实施方式64所述的制品，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
实施方式66.如实施方式64所述的制品，其中所述第一试剂是RNAi分子。
实施方式67.如实施方式66所述的制品，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
实施方式68.如实施方式64所述的制品，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
以下实施例仅用于说明，而非对本发明权利要求的限制。
实施例1在哺乳动物细胞内靶向降解视网膜母细胞瘤(Rb)抑制蛋白
此前，我们已证实，通过直接促进泛素介导的蛋白质水解反应，能够在翻译后水平实现Rb的敲除，所述Rb是一种半衰期长达9小时的蛋白。Gonzalez等Degradation of theretinoblastoma tumor suppressor by the human papillomavirus type16E7oncoprotein is important for functional inactivation and is separablefrom proteasomal degradation ofE7.J.Virol.2001；75：7583-91.Zhou等Harnessingthe ubiquitination machinery to target the degradation of specific cellularproteins.Mol.Cell.2000；6∶751-6.Zhang等Exploring the functional complexity ofcellular proteins by protein knockout.Proc Natl Acad Sci US A 2003；100：14127-32。简要地说，我们构建了一个杂合的E3连接酶，其能招募Rb至基于CUL1的包含Skp1、Cul1和F-box的底物受体(SCF)泛素连接酶复合物，并促进Rb的聚泛素化及其后续的水解(图2A)。在此过程中我们证明，可以改造R1NG家族泛素连接酶(例如SCF复合物)，使之能够通过被称为“蛋白质敲除”(PKO)的技术来对特定的细胞内蛋白进行招募、泛素化和诱导水解。Zhang等Ectopic targeting ofsubstrates to the ubiquitin pathway.Methods Enzymol 2005；399：823-33.Zhou P.Targeted protein degradation.Curr Opin Chem Biol 2005；9：51-5。
本发明中，我们通过将翻译后PKO系统与转录物靶向RNAi联合应用，在更短的时间内获得了更高水平的蛋白质清除(图1)。为了检测这种双交叉或双敲除方法，我们利用抗-RB1 shRNA构建体(Zagorski WA，Knudsen ES，Reed MF.Retinoblastoma deficiencyincreases chemosensitivity in lung cancer.Cancer Res 2007；67：8264-73.)和β-TrCP-E7N构建体来靶向SAOS-2细胞中异位表达的Rb蛋白。
使用pCDNA3-Rb-HA，以及编码针对Rb的shRNA的pMSCV-LMP-sh-Rb、编码β-TrCP-E7N的pCDNA3-β-TrCP-E7N中的任一个或二者，通过nucleofection (Amaxa)转染SAOS-2细胞。对照细胞用pMSCV-LMP转染。所有的样品在转染后经嘌呤霉素筛选24小时，然后利用针对Rb、标签或β-肌动蛋白的抗体进行免疫印迹分析。
如图2B所示，在转染48小时后，单独转染sh-Rb(即针对Rb的shRNA)或β-TrCP-E7N的样品中，Rb表达水平分别减少29％和19％(相对于对照样品)。在同时使用sh-Rb和PKO两种构建体的样品中，Rb的表达则几乎完全被清除(仅剩4％Rb)，超过单独使用shRNA或PKO构建体的样品中观察到的减少(图2B)。因此这些结果证实，转录后和翻译后敲除技术的联合应用较单独应用显示出协同的更加有效的效果。
Rb已被证实具有抑制E2F1转录活性的细胞内功能，我们进一步比较了单独和联合敲除技术在这方面破坏Rb的能力。在此，我们使用荧光素酶报告基因构建体，其由E2F1响应的DHFR启动子(DHFR-Luc)驱动(图3A)。Sdek等The central acidic domain of MDM2iscritical in inhibition of retinoblastoma-mediated suppression of E2F and cellgrowth.J Biol Chem2004；279：53317-22。首先对SAOS-2细胞转染pCDNA3-Rb-HAp、CDNA-E2F1、pCMV-DP1、DHFR-luc、pRL-Tk(海肾(Renilla))以及上述敲除构建体，以进行双荧光素酶检测(Promega)。裂解经嘌呤霉素选择后的细胞，检测Firefly/Renilla(F/R)荧光素酶信号的比值，检测三次。检测结果以对照数值为参照进行归一化，图表表示了F/R比率的平均倍数差异(三次结果)。
在图3B中，单独的敲除方法仅产生相当有限的增加(20-30％)，并且不具有统计学意义，而联合敲除方法则导致对DHFR启动子活性的协同的去抑制作用(约增加两倍)，且具有统计学意义(p＜0.05)。因此，联合RNAi和PKO的效果也协同性地超过任一种方法单独产生的效果。
实施例2靶向降解哺乳动物细胞的内源性p107
为了评价RNAi和PKO技术联合应用靶向清除的动力学速率，同时也为了证明该技术的通用性，我们接下来靶向内源性p107蛋白。P107是肿瘤抑制蛋白Rb家族成员，其能结合HPV 16E7。用抗-RBL1 siRNA寡核苷酸转染C33A细胞，来靶向p107转录物(ThermoScientific)，然后用携带β-TrCP-E7N构建体的腺病毒对其进行感染。通过三次独立实验获得p107蛋白表达水平的平均值，并以模拟转染和感染的C33A细胞中的p107蛋白水平为标准进行归一化处理。
在所有时间点，与siRNA或Ad1-β-TrCP-E7N单独处理相比，通过二者联合处理过的细胞具有最大的p107敲除程度。与未处理的对照相比，siRNA转染样品中p107在24小时减少了39％，在48小时减少了53％(图4)。Ad1-β-TrCP-E7N转染样品比siRNA转染样品显示出更显著的p107清除水平，在24小时和48小时分别减少了62％和94％。令人惊奇的是，转染siRNA和Ad1-β-TrCP-E7N的样品在所有时点均达到最大的p107敲除程度，p107的下降水平在24小时和48小时分别达到73％和98％(图4)。因此，RNAi和PKO联合方法在清除p107表达时比RNAi或PKO单独应用时更加迅速和高效。
本发明的范围不受上述具体展示和描述的内容的限制。本领域技术人员可以认识到可用于替换或改变上述实例中的材料，配置，结构和规模。大量的参考文献，包括专利和多种出版物在本发明的说明书中被引用和讨论。这些参考文献的引用和讨论仅用于阐明本发明的描述，而不是认为任何参考文献是本文所述发明的现有技术。在本发明的说明书中引用和讨论的所有参考文献通过整体引用并入本文。在不违背本发明的主旨和范围的情况下，本领域的普通技术人员可能对上述说明进行改变、修改或者其它的补充说明。尽管已描述和说明了本发明的某些实施方式，但是在不违背本发明的主旨和范围的情况下本领域技术人员显然可对其进行各种改变和修改。在上述说明书中的物质及其附图只用于说明并不用于限制。

Claims (68)

1.一种降低细胞内至少一种靶蛋白水平的方法，所述方法包括使第一试剂和第二试剂与所述细胞接触的步骤，其中所述第一试剂减少所述靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解，并且其中所述第一试剂在所述第二试剂之前、之后或同时与所述细胞接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂是RNAi分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述RNAi分子是小干扰RNA(siRNA)。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述RNAi分子是小分子核糖核酸(miRNA)。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂是双链RNA(dsRNA)。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂是反义寡核苷酸。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂是核酶。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述泛素连接酶多肽是E3泛素连接酶多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述E3泛素连接酶多肽选自SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述F-box多肽选自Cdc4/FBW 7、HOS、βTrCP、FWD1、Poplp、Pop2p、Grrlp和Met30p。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述HECT多肽选自E6AP、Nedd4、RSP5、Smurf1、TOM1和EDD。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述靶蛋白相互作用结构域选自乳头瘤病毒E7多肽和SV-40LTP多肽。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述靶蛋白选自Rb、p107、IκB、Sic1p、Cln2p、E2、c-myc和β-连环蛋白(β-catenin)。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述靶蛋白是细胞质蛋白、核内蛋白或者膜蛋白。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂和所述第二试剂在分开的递送载体中。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂和所述第二试剂在同一递送载体中。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞或者小鼠细胞。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述方法用于在对象中治疗或预防疾病或状况。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述方法用于治疗或预防癌症。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述方法用于治疗或预防心血管疾病。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述方法用于在对象中诊断疾病或状况。
27.一种表达载体，所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列，其中所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
28.如权利要求27所述的表达载体，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或者减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
29.如权利要求27所述的表达载体，其中所述第一试剂是RNAi分子。
30.如权利要求29所述的表达载体，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
31.如权利要求27所述的表达载体，其中所述第一试剂是反义寡核苷酸。
32.如权利要求27所述的表达载体，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
33.如权利要求32所述的表达载体，其中所述泛素连接酶多肽是E3泛素连接酶。
34.如权利要求33所述的表达载体，其中所述E3泛素连接酶选自SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。
35.如权利要求34所述的表达载体，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
36.一种细胞，所述细胞包含表达载体，其中所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列，其中所述第一试剂减少细胞内靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
37.如权利要求36所述的细胞，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或者减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
38.如权利要求36所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
39.如权利要求38所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞或小鼠细胞。
40.如权利要求36所述的细胞，其中所述第一试剂是RNAi分子。
41.如权利要求40所述的细胞，其中RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
42.如权利要求36所述的细胞，其中所述第一试剂是反义寡核苷酸。
43.如权利要求36所述的细胞，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
44.如权利要求43所述的细胞，其中所述泛素连接酶多肽是E3泛素连接酶。
45.如权利要求44所述的细胞，其中所述E3泛素连接酶选自SCF多肽、HECT多肽和UBR1多肽。
46.如权利要求45所述的细胞，其中所述SCF多肽是F-box多肽。
47.一种包含第一表达载体和第二表达载体的细胞，其中所述第一表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列，所述第二表达载体包含编码第二试剂的第二核酸序列，所述第一试剂减少细胞内靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
48.如权利要求47所述的细胞，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或者减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
49.如权利要求47所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
50.如权利要求48所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞或小鼠细胞。
51.如权利要求47所述的细胞，其中所述第一试剂是RNAi分子。
52.如权利要求51所述的细胞，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
53.如权利要求47所述的细胞，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
54.一种包含表达载体的制品，其中所述表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列和编码第二试剂的第二核酸序列，所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
55.如权利要求54所述的制品，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
56.如权利要求54所述的制品，其中所述第一试剂是RNAi分子。
57.如权利要求56所述的制品，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
58.如权利要求54所述的制品，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
59.一种包含第一表达载体和第二表达载体的制品，其中所述第一表达载体包含编码第一试剂的第一核酸序列，所述第二表达载体包含编码第二试剂的第二核酸序列，所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
60.如权利要求59所述的制品，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
61.如权利要求59所述的制品，其中所述第一试剂是RNAi分子。
62.如权利要求61所述的制品，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
63.如权利要求59所述的制品，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
64.一种包含第一试剂和第二试剂的制品，其中所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加所述靶蛋白的降解。
65.如权利要求64所述的制品，其中所述第一试剂降低所述靶蛋白mRNA的水平或减少所述靶蛋白mRNA的翻译。
66.如权利要求64所述的制品，其中所述第一试剂是RNAi分子。
67.如权利要求66所述的制品，其中所述RNAi分子是小发夹RNA(shRNA)。
68.如权利要求64所述的制品，其中所述第二试剂是嵌合多肽，所述嵌合多肽包含泛素连接酶多肽和靶蛋白相互作用结构域。
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