CN107137418A - Let‑7c基因在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域,具体涉及一种非编码小分子RNA Let‑7c基因在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。本发明通过cDNA基因芯片和半定量RT‑PCR技术分析证实,DS细胞中以及AD小鼠大脑中的Let‑7c表达均较正常细胞显著提高,Let‑7c基因在阿尔茨海默病的临床诊断及预后判断方面具有重要的意义。此外,本发明证实Let‑7c通过增加BACE2的启动子区域活性,促进BACE2的活性,从而降低C99表达、增加C83/80表达,抑制β‑淀粉样沉淀的产生,因此Let‑7c可用于制备治疗阿尔茨海默病药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,具体涉及一种非编码小分子RNA Let-7c基因在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD),又称为老年性痴呆,是一种进行性神经系统退行性疾病,是痴呆中最常见的类型,临床上主要表现为渐进性记忆减退、认知功能障碍以及其他神经精神症状和行为障碍。阿尔茨海默病具有两个特征性的病理变化:β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)斑块形成和神经原纤维缠结。Aβ是机体的正常代谢产物,由β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)水解而来,在正常情况下它的产生和降解处于动态平衡,当某些原因导致APP代谢异常时,Aβ生成增多和(或)降解减少就会造成Aβ大量沉积。APP依次经过β-分泌酶和γ-分泌酶的切割后产生Aβ。BACE1,是体内主要的β-分泌酶,可以在β位点切割APP,促进Aβ生成。BACE2与BACE1同源,可以在θ位点切割APP,从而减少Aβ的产生。
此外,研究表明,APP、早老蛋白-1(presenilin1)和早老蛋白-2(presenilin2)基因突变以及唐氏综合征(Down syndrome,DS)都能够诱发AD,其中DS病人高表达APP、C99和Aβ,是研究AD疾病的一个很好的模型。因此,本发明以唐氏综合征细胞系(DS细胞系)对阿尔茨海默病进行相关的研究。
微小核糖核酸(microRNA或miRNAs)是一类普遍存在于真核生物中的长18-25bp长度的非编码内源性小RNA分子,它具有高度保守性不编码蛋白质或多肽,而是通过与互补或部分互补的靶基因的mRNA 3’非编码区相互作用,使mRNA降解或诱发蛋白质翻译抑制,从而抑制蛋白质合成。miRNAs在调节细胞增殖、分化和发育等生物学过程、尤其在大脑的分化与发育中发挥关键作用。miRNAs又可调节神经系统功能,例如,通过调节突触的mRNA从而调控突触的可塑性。但有报道指出,miRNAs对神经退行性疾病的发病进程有重要影响作用,特定miRNA的错误调节和丰度的改变会导致AD的发生。但是AD的发病机制仍然不清楚。有研究表明,在AD早期进程中,调控BACE1的miRNA-107表达明显下调,从而使BACE1的mRNA水平增加。有研究发现,在AD病人的海马区域,miR-9,miR-124a,miR-125b,miR-128,miR-132以及miR-219的表达明显改变。异常的miRNA的表达与AD发病的机制,仍然是未知的。
Let-7是第一个被确认的miRNA,可调控线虫发育,是目前研究最广泛的miRNA之一。Let-7通过与靶基因序列不完全互补或完全互补,调控基因表达,当其与靶基因完全互补结合时,可直接降解靶基因mRNA,当其与靶基因mRNA的3’端非编码发生不完全配对结合,则抑制靶基因的翻译。Let-7参与调控细胞生长分化、凋亡、免疫应答、肿瘤发生及转移等多种生理病理过程。研究表明,Let-7可通过抑制某些靶基因表达从而有效地抑制肿瘤转移、增殖和促进肿瘤凋亡,对肿瘤的临床诊断、治疗及预后具有巨大的潜在价值。经检索,目前未见有关Let-7基因应用于阿尔茨海默病治疗的相关报道。
公布号为CN 104962657 A的中国专利申请公开了YAP1基因在阿尔茨海默病诊治中的应用,该发明首次发现了YAP1基因表达与阿尔茨海默病相关,并证明:与正常人群相比,阿尔茨海默病患者血液中的YAP1基因表达显著升高,且经过RNA干扰实验证明YAP1能够影响Aβ介导的神经毒性作用,根据该发明的研究成果,可以研发能够抑制YAP1基因表达或者能够抑制YAP1基因表达产物功能的药物,从而实现临床上对于阿尔茨海默病的预防和治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非编码小分子RNA Let-7c基因的新用途,具体为非编码小分子RNA Let-7c基因在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明所述的非编码小分子RNA Let-7c基因在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用,通过如下技术方案得到证实:
首先,本发明通过cDNA基因芯片和半定量RT-PCR 2种技术分析DS细胞和对照细胞中miRNA的表达,其中,cDNA基因芯片分析DS细胞中miRNA的表达,结果显示,Let-7c、miR-99a、mir-155表达上调;PCR半定量结果显示,Let-7c在DS细胞的表达3倍于对照细胞。
此外,从DS细胞以及APPsw/PS1AE9双突变转基因小鼠(AD小鼠,购自南京大学模式动物中心)的大脑中提取总RNA,通过PCR半定量技术检测Let-7c基因表达水平,结果显示,DS细胞中以及AD小鼠大脑中的Let-7c表达均较正常细胞显著提高,以上结果表明,非编码小分子RNA Let-7c基因在阿尔茨海默病的临床诊断及预后判断方面,具有重要的意义。
其次,本发明通过ELISA双抗体夹心法检测APP与C99分别与Let-7c表达质粒共转染HEK293细胞和20E2细胞后Aβ的表达水平,结果发现,共转染Let-7c表达质粒后的HEK293细胞和20E2细胞,其Aβ的表达量均显著减少,表明Let-7c可减少β-淀粉样沉淀的产生。其中,所述的20E2细胞是稳定表达Swedish突变型APP蛋白(app695)的HEK细胞系。
APP的降解有两种剪切方式,分别为淀粉样剪切方式和非淀粉样剪切方式。在淀粉样剪切途径中,BACE1(β分泌酶)剪切APP后产生分别一个sAPP片段和一个C99片段,C99随后被γ分泌酶剪切产生Aβ和C末端CTF片段,从而促进Aβ形成。在非淀粉样剪切途径中,APP被α分泌酶剪切产生一个分泌型的APP和C83,C83随后被γ分泌酶剪切,从而抑制Aβ产生。
为了进一步研究Let-7c影响Aβ产生的机制,本发明通过ELISA双抗体夹心法检测Let-7c转染2EB2细胞后C99和C83/80的表达情况,所述的2EB2细胞是稳定表达APP Swedish突变型和BACE1的细胞系。结果发现,在2EB2细胞中Let-7c减少C99的表达并且增加C83/80的表达,表明Let-7c可能通过影响APP的非淀粉样剪切途径,抑制Aβ产生。
另外,本发明用siRNA干扰掉BACE2后,检测转染Let-7c表达质粒细胞中C99的表达的变化,结果发现,与对照组比较,用siRNA干扰掉BACE2后,Let-7c不影响C99的表达,而采用非特异性阴性对照siRNA进行处理后,检测转染Let-7c表达质粒细胞中C99的表达的变化,结果发现,与对照组比较,Let-7c可减少C99的表达。
同理,本发明用siRNA干扰掉BACE2后,检测转染Let-7c表达质粒细胞中C83/80的表达的变化,结果发现,与对照组比较,用siRNA干扰掉BACE2后,Let-7c不影响C83/80的表达,而采用非特异性阴性对照siRNA进行处理后,检测转染Let-7c表达质粒细胞中C83/80的表达的变化,结果发现,与对照组比较,Let-7c可增加C83/80的表达,以上结果表明,Let-7c可能通过影响BACE2,降低C99的表达,增加C83/80的表达,从而减少β-淀粉样沉淀的产生。
为了进一步研究Let-7c对BACE2活性和表达水平的影响,本发明从细胞中提取总RNA并且分析BACE2的启动子区。结果发现,Let-7c能够明显增加BACE2的启动子活性,并且BACE2的表达明显增加,但对BACE2 3’非翻译区并没有明显作用。和上述结果相一致,和对照相比,Let-7c能够上调BACE2的mRNA水平。同样地,我们检测了Let-7c对BACE1、APP的影响作用,发现Let-7c对BACE1的3’非翻译区、启动子区域及APP的启动子区域没有明显作用。以上结果表明,Let-7c可促进BACE2的活性,并增加BACE2的表达水平。
进一步地,为了研究Let-7c与BACE2启动子区域的相互作用,本发明通过构建BACE2启动子区不同长度截短体双荧光报告基因质粒,检测过表达Let-7c后不同截短体活性。结果发现,pB2P4的启动子区-132到+304位置为Let-7c作用位点所在区域。Let-7c与BACE2启动子区域为不完全配对结合。
进一步地,由于miRNA与靶基因结合需要Ago蛋白家族的参与,为了验证Ago蛋白对Let-7c与BACE2启动子区域结合的影响,本发明通过构建sh-ago1与sh-ago2质粒,沉默ago1、ago2蛋白表达。然后将sh-ago1、sh-ago2或Let-7c分别与sh-ago1、sh-ago2共转染入HEK细胞,检测BACE2mRNA水平,结果显示,sh-ago1、sh-gao2过表达组的BACE2mRNA水平较低,而即使同时过表达Let-7c,因为Ago蛋白家族的缺失,BACE2mRNA水平依然比Let-7c与空白对照共转染组表达低。以上结果表明,Ago蛋白家族的缺失会导致BACE2mRNA水平降低。
更进一步地,由于C99中含有BACE2切割位点,为了验证Ago蛋白是否影响Let-7c通过促进BACE2活性从而降低C99水平,本发明将Let-7c和C99分别与sh-ago1、sh-ago2共转染入HEK细胞,检测标记C99的变化。结果发现,同时过表达Let-7c、C99和sh-ago1或Let-7c、C99和sh-ago2,标记C99的水平均比Let-7c、C99与空白对照共转染组高,表明Ago蛋白家族的缺失,使BACE2mRNA水平降低,BACE2表达降低,从而减少对C99的降解,使标记C99的水平增加。以上结果表明,Let-7c与BACE2启动子区域结合进而影响BACE2活性,Let-7c通过影响BACE2活性从而降低C99水平,抑制Aβ形成,并且Ago蛋白家族影响Let-7c与BACE2启动子区域结合,Ago蛋白家族的缺失会导致BACE2mRNA水平降低,从而减少对C99的降解,使标记C99的水平增加。
由上述试验结果可知,Let-7c可抑制Aβ产生,而不可溶性Aβ有毒性,可降低细胞的存活率。因此,我们检测Let-7c是否可通过抑制Aβ产生从而影响细胞存活。结果发现,过表达Let-7c,HEK细胞存活率没有改变,而SY5Y细胞存活率则有微弱提高。KCNB1作为BACE家族的已知底物,可被BACE2切割,在过表达Let-7c后,KCNB1含量减少,进一步证明Let-7c可以增加BACE2活性。以上结果表明,Let-7c可抑制Aβ产生,但对细胞存活率影响不大。
综上所述,DS细胞中以及AD小鼠大脑中的Let-7c表达均较正常细胞显著提高,非编码小分子RNA Let-7c基因在阿尔茨海默病的临床诊断及预后判断方面,具有重要的意义。Let-7c通过与BACE2启动子区域进行不完全配对结合,促进BACE2活性,增加BACE2表达水平,进而降低C99水平、增加C83/80水平,减少Aβ的产生,抑制阿尔茨海默病的病理变化。Let-7c可作为治疗阿尔茨海默病的一个新靶点,可用于制备治疗阿尔茨海默病的药物而使用。
本发明所述的Let-7c基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,具体为:
GCAUCCGGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUUAGAGUUACACCCUGGGAGUUAACUGUACAACCUUCUAGCUUUCCUUGGAGC。
进一步地,所述的治疗阿尔茨海默病药物包括有效剂量的Let-7c基因及其药学上可接受的载体或病毒载体。
更进一步地,所述的载体为壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种;所述的病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体中的一种或多种。
进一步地,所述的治疗阿尔茨海默病药物的剂型为任何适用于miRNA药物使用的剂型。
优选地,所述的治疗阿尔茨海默病药物的剂型为注射剂。
进一步地,所述的阿尔茨海默病包括由唐氏综合征发展而成的阿尔茨海默病。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:本发明提供了一种非编码小分子RNALet-7c基因的新用途,具体为非编码小分子RNA Let-7c基因在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。作为治疗阿尔茨海默病的新药物靶点,Let-7c基因不仅对阿尔茨海默病的临床诊断及预后判断方面,具有重要的意义,对其进行细胞功能学研究的结果表明,Let-7c基因可显著减少Aβ的产生,抑制阿尔茨海默病的病理变化,可用于制备治疗阿尔茨海默病基因药物和靶向药物。
附图说明
图1为DS细胞系染色体核型分析结果图。
图2为采用cDNA基因芯片和半定量RT-PCR测定DS细胞系miRNA的表达结果图,其中A为采用cDNA基因芯片分析DS细胞系miRNA的表达结果图,B和C为半定量RT-PCR测定DS细胞(1478)和对照细胞(115)中pre-Let-7c和Let-7c的含量,D和E为半定量RT-PCR测定DS细胞中和APPsw/PS1AE9双突变转基因小鼠(AD小鼠)大脑中Let-7c的含量。
图3为采用双夹心法ELISA检测HEK细胞和20E2细胞中Aβ的表达结果图,其中,A为APP与Let-7c表达质粒共转染HEK293细胞后Aβ表达结果图,B为C99与Let-7c表达质粒共转染HEK293细胞后Aβ表达结果图,C为Let-7c表达质粒转染20E2细胞后Aβ表达结果图。
图4为采用双夹心法ELISA检测Let-7c转染2EB2细胞后C99和C83/80的表达结果图,其中,A为Let-7c转染2EB2细胞后C99和C83/80的表达结果图,B为flagC99(荧光标记C99)和Let-7c共转染2EB2细胞后C99表达水平变化结果图,C为用siRNA干扰掉BACE2后,检测转染Let-7c表达质粒细胞中C99的表达变化结果图,D为用siRNA干扰掉BACE2后,检测转染Let-7c表达质粒细胞中C83/80的表达变化结果图。
图5为采用荧光素酶活性检测技术测定Let-7c对BACE1和BACE2的3’非翻译区域活性、启动子区域活性和APP的启动子区域活性的影响结果图,其中,A为Let-7c对BACE2 3’非翻译区域活性影响结果图,B为Let-7c对BACE2启动子区域活性影响结果图,C为Let-7c对BACE2表达量影响结果图,D为Let-7c对BACE2mRNA水平影响结果图,E-G分别为Let-7c对BACE1的3’非翻译区、启动子区域及APP的启动子区域活性影响结果图。
图6为Let-7c与BACE2启动子区域相互作用结果图,其中,A为构建BACE2启动子区域不同长度截短体双荧光报告基因质粒,B为不同长度截短体双荧光报告基因质粒对BACE2启动子区域活性影响结果图,C为Let-7c与BACE2启动子区域为不完全配对结合图,D为构建sh-ago1与sh-ago2质粒,沉默ago1、ago2蛋白表达结果图,E为sh-ago1、sh-ago2或Let-7c分别与sh-ago1、sh-ago2共转染入HEK细胞后BACE2mRNA表达结果图,F为Let-7c和C99分别与sh-ago1、sh-ago2共转染入HEK细胞后C99表达结果图。
图7为采用MTT法检测Let-7c对HEK细胞和SY5Y细胞存活率影响结果图,其中,A为Let-7c对HEK细胞存活率影响结果图,B为Let-7c对SY5Y细胞存活率影响结果图,C为Let-7c对BACE2活性及其底物KCNB1含量影响结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明,但本发明不仅仅限于以下实施例。
本发明中所用到的材料可通过市售得到或通过本领域的常规方法得到。如:阿尔茨海默病(AD)小鼠(APPsw/PS1AE9)购买自南京大学模式动物中心;DS细胞系UMB1478(47XX,+21),UMB907(47XY,+21)和对照细胞系UMB115(46XX),UMB350(46XY)由马里兰大学惠赠,HEK293购于ATCC,2EB2为本实验室在HEK293基础上构建的稳定表达APP、BACE1的细胞系,20E2为本实验室在HEK293基础上构建的稳定表达APP的细胞系,p-super表达载体购自oligoengine(Catalog#VEC-PBS-0002),TRI-Reat试剂购自SIGMA(T9424),TLDA HumanmiRNA Panel芯片购自Thermo公司(4470187),转染试剂Lipofectamine plus购自Invitrogen公司(11668019),双荧光素酶检测试剂购自Promega公司(E1910)。
实施例1 DS细胞系核型分析
使用秋水仙素(5ug/ml)处理DS细胞3小时后,收集细胞并用0.075%KCl处理细胞30分钟(使细胞膨胀),然后用固定液(甲醇:冰醋酸,3:1)固定细胞,再将固定好的细胞滴到玻片上,用0.025%的胰酶处理1分钟,最后用Giemsa染色10分钟,显微镜下进行核型分析,结果显示,DS细胞系的染色体核型是47XX,+21(1478),见图1。
实施例2采用cDNA基因芯片和半定量RT-PCR测定DS细胞系miRNA的表达
使用TRI-Reat试剂从DS细胞(UMB1478)和对照细胞(UMB115)中分离总RNA。按照说明书,使用Multiplex RT Human Pool4,V1for Taqman miRAN,以上述RNA样品为模板,合成cDNA。以上述cDNA为模板,使用商品化的TLDA Human miRNA Panel芯片,检测不同miRNA的表达,结果显示,Let-7c、miR-99a、mir-155表达上调,见图2A。
使用半定量RT-PCR技术,分别测定DS细胞(1478)和对照细胞(115)中pre-Let-7c(Let-7c前体)和Let-7c的含量,此外,从DS细胞以及APPsw/PS1AE9双突变转基因小鼠(AD小鼠)的大脑中提取总RNA,通过半定量RT-PCR技术检测Let-7c基因表达水平。结果显示:DS细胞(1478)中pre-Let-7c和Let-7c的含量较对照细胞(115)显著增加,Let-7c在DS细胞(1478)的表达3倍于对照细胞(115),见图2B和C;此外,DS细胞中以及AD小鼠大脑中的Let-7c表达均较正常细胞显著提高,见图2D和E。以上结果表明,非编码小分子RNA Let-7c基因在阿尔茨海默病的临床诊断及预后判断方面,具有重要的意义。
实施例3双夹心法ELISA检测HEK细胞和20E2细胞中Aβ的表达量
采用常规方法培养HEK细胞和20E2细胞。将miR-7C(Let-7c),has-miR-99a(C99)的基因序列克隆到p-super表达载体中,构建miR-7C,miR-99a的表达质粒,其中has-miR-99a核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,具体为:
CCAUUGGCAUAAACCCGUAGAUCCGAUCUUGUGGUGAAGUGGACCGCACAAGCUCGCUUCUAUGGGUCUGUGUCAGUGUG。按照Lipofectamine plus说明书将质粒转染入细胞,具体为:将构建好的miR-7C表达质粒与APP共转染HEK293细胞,将miR-7C,miR-99a的表达质粒共转染HEK293细胞,将miR-7C表达质粒单独转染20E2细胞,将质粒转染入细胞培养48小时后,收集细胞进一步测定细胞中Aβ的表达水平,具体为:收集细胞,用冰预冷的PBS洗2次,使用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)超声裂解细胞,离心,取上清。使用Bio-Rad Dc protein assay定量蛋白。用12%的SDS-PAGE分离蛋白,转膜,封闭,加入一抗孵育,清洗,加入二抗孵育,显色,测定Aβ的表达水平,其中Aβ(1-40)Elisa Kit购于invitrogen公司(99-0063)。
结果显示:Let-7c与APP共转染HEK293细胞,可显著减少Aβ的表达量,见图3A;Let-7c和C99共转染HEK293细胞,可显著减少Aβ的表达量,见图3B;Let-7c单独转染20E2细胞,可显著减少Aβ的表达量,见图3C;其中,所述的20E2细胞是稳定表达Swedish突变型APP蛋白(app695)的HEK细胞系。以上结果表明,Let-7c可减少β-淀粉样沉淀的产生。
实施例4检测Let-7c转染2EB2细胞后C99和C83/80的表达量
采用常规方法培养2EB2细胞,按照Lipofectamine plus说明书将miR-7C表达质粒单独转染2EB2细胞,观察C99和C83/80表达水平变化;将flagC99(荧光标记C99)和miR-7C表达质粒共转染2EB2细胞,观察观察C99表达水平变化;使用siRNA干扰掉BACE2,观察C99和miR-7C表达质粒共转染2EB2细胞后C99表达水平变化;使用siRNA干扰掉BACE2,观察C83/80和miR-7C表达质粒共转染2EB2细胞后C83/80表达水平变化。具体为:将质粒转染入细胞培养48小时后,收集细胞进一步测定细胞中C99和C83/80的表达水平,具体为:收集细胞,用冰预冷的PBS洗2次,使用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)超声裂解细胞,离心,取上清。使用Bio-Rad Dc protein assay定量蛋白。用12%的SDS-PAGE分离蛋白,转膜,封闭,加入一抗孵育,清洗,加入二抗孵育,显色,测定C99和C83/80的表达水平,其中C99和C83/80抗体购自于abcam公司(NBP1-05103)。
结果显示:Let-7c转染2EB2细胞后C99的表达减少,C83/80的表达增加,见图4A;flagC99和Let-7c共转染2EB2细胞后C99的表达减少,见图4B;使用siRNA干扰掉BACE2后,Let-7c不影响C99的表达,而使用非特异性阴性对照siRNA进行处理,Let-7c可减少C99的表达,见图4C;使用siRNA干扰掉BACE2后,Let-7c不影响C83/80的表达,而使用非特异性阴性对照siRNA进行处理后,Let-7c可增加C83/80的表达,见图4D。以上结果表明,Let-7c可能通过影响APP的非淀粉样剪切途径,减少C99的表达并且增加C83/80的表达,抑制Aβ产生,并且Let-7c可能通过影响BACE2,减少C99的表达,增加C83/80的表达,从而减少β-淀粉样沉淀的产生。
实施例5利用荧光素酶活性检测技术测定Let-7c对BACE1和BACE2的3’非翻译区域活性、启动子区域活性和APP的启动子区域活性的影响
采用常规方法培养HEK293细胞,按照Lipofectamine plus说明书将BACE1和BACE2的3’非翻译区域基因/启动子区域基因-荧光素酶报告基因载体以及APP的启动子区域基因-荧光素酶报告基因载体分别与Let-7c共转染HEK293细胞,并使其在细胞内表达荧光素酶,采用双荧光素酶检测试剂测定细胞裂解液中荧光素酶的活性并用内参照载体的活性进行校准,最终活性比值反映BACE1和BACE2的3’非翻译区域/启动子区域活性和APP的启动子区域活性。同时测定将Let-7c转染HEK293细胞后,BACE2蛋白表达水平变化以及BACE2mRNA水平变化,其中BACE2抗体购自abcam公司(货号:ab5670)。
结果显示,Let-7c能够明显增加BACE2的启动子区域活性,见图5B,增加BACE2的表达,见图5C和D,但对BACE2 3’非翻译区域活性并没有明显作用,见图5A;Let-7c对BACE1的3’非翻译区、启动子区域活性及APP的启动子区域活性没有明显作用,见图5E-G。以上结果表明,Let-7c可促进BACE2的活性,并增加BACE2的表达水平。
实施例6 BACE2启动子截短载体的构建与双荧光素酶活性的检测
为了研究Let-7c与BACE2启动子区域的相互作用,本发明通过构建BACE2启动子区不同长度截短体双荧光报告基因质粒,并将上述报告基因质粒转染HEK293细胞,采用双荧光素酶活性检测技术测定不同启动子截短载体的启动子活性。结果发现,pB2P4的启动子区的活性最高,见图6B;pB2P4的启动子区-132到+304位置为Let-7c作用位点所在区域,见图6A;Let-7c与BACE2启动子区域为不完全配对结合,见图6C。
实施例7 Ago蛋白家族对Let-7c与BACE2启动子区域结合的影响
由于miRNA与靶基因结合需要Ago蛋白家族的参与,为了验证Ago蛋白对Let-7c与BACE2启动子区域结合的影响,本发明通过构建sh-ago1与sh-ago2质粒,沉默ago1、ago2蛋白表达,见图6D。然后将sh-ago1、sh-ago2或Let-7c分别与sh-ago1、sh-ago2共转染入HEK细胞,检测BACE2mRNA水平,结果显示,sh-ago1、sh-gao2过表达组的BACE2mRNA水平较低,而即使同时过表达Let-7c,因为Ago蛋白家族的缺失,BACE2mRNA水平依然比Let-7c与空白对照共转染组表达低,见图6E。以上结果表明,Ago蛋白家族的缺失会导致BACE2mRNA水平降低。
由于C99中含有BACE2切割位点,为了验证Ago蛋白是否影响Let-7c通过促进BACE2活性从而降低C99水平,本发明将Let-7c和C99分别与sh-ago1、sh-ago2共转染入HEK细胞,检测标记C99的变化。结果发现,同时过表达Let-7c、C99和sh-ago1或Let-7c、C99和sh-ago2,标记C99的水平均比Let-7c、C99与空白对照共转染组高,表明Ago蛋白家族的缺失,使BACE2mRNA水平降低,BACE2表达降低,从而减少对C99的降解,使标记C99的水平增加,见图6F。以上结果表明,Let-7c与BACE2启动子区域结合进而影响BACE2活性,Let-7c通过影响BACE2活性从而降低C99水平,抑制Aβ形成,并且Ago蛋白家族影响Let-7c与BACE2启动子区域结合,Ago蛋白家族的缺失会导致BACE2mRNA水平降低,从而减少对C99的降解,使标记C99的水平增加。
实施例8 Let-7c对HEK细胞和SY5Y细胞存活率影响
Let-7c可抑制Aβ产生,而不可溶性Aβ有毒性,可降低细胞的存活率。因此,我们检测Let-7c是否可通过抑制Aβ产生从而影响细胞存活。采用MTT比色法检测过表达Let-7c后HEK细胞和SY5Y细胞存活率变化。结果发现,过表达Let-7c,HEK细胞存活率没有改变,而SY5Y细胞存活率则有微弱提高,见图7A和B。KCNB1作为BACE家族的已知底物,可被BACE2切割,在过表达Let-7c后,KCNB1含量减少,见图7C,进一步证明Let-7c可以增加BACE2活性。以上结果表明,Let-7c可抑制Aβ产生,但对细胞存活率影响不大。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> Let-7c基因在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用
<130> 1231
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 84
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcauccgggu ugagguagua gguuguaugg uuuagaguua cacccuggga guuaacugua 60
caaccuucua gcuuuccuug gagc 84
<210> 2
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccauuggcau aaacccguag auccgaucuu guggugaagu ggaccgcaca agcucgcuuc 60
uaugggucug ugucagugug 80
Claims (7)
1.非编码小分子RNA Let-7c基因在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的Let-7c基因如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的治疗阿尔茨海默病药物包括有效剂量的Let-7c基因及其药学上可接受的载体或病毒载体。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的载体为壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种;
所述的病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的治疗阿尔茨海默病药物的剂型为任何适用于miRNA药物使用的剂型。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的治疗阿尔茨海默病药物的剂型为注射剂。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的阿尔茨海默病包括由唐氏综合征发展而成的阿尔茨海默病。
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- 2017-04-18 CN CN201710255995.XA patent/CN107137418B/zh active Active
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