CN114763552B

CN114763552B - 一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法

Info

Publication number: CN114763552B
Application number: CN202110038716.0A
Authority: CN
Inventors: 刘现伟; 李子涛; 刘静; 郑照萱; 武小聪; 邢爽
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2041-01-12
Also published as: CN114763552A

Abstract

本发明涉及一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法。该重组生产方法是将成熟MTG编码基因与前导肽Pro编码基因分别构建重组质粒，将重组质粒转化入同一宿主细胞内共表达，初步纯化后获得有活性的微生物转谷氨酰胺酶。本发明将MTG前导肽Pro与Trx蛋白融合后表达为“分子伴侣”Trx‑Pro，与成熟MTG蛋白共表达时辅助MTG正确折叠，并抑制其对重组表达宿主细胞的伤害，实现了微生物转谷氨酰胺酶的有效可溶性表达及一步法简便纯化，在经一步法简单纯化后得到初步纯化蛋白，再经反应试剂进一步处理，高效剥离“分子伴侣”Trx‑Pro，得到高纯度高活性的重组转谷氨酰胺酶，具有应用于药用蛋白修饰等方面的重要价值。

Description

一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法

技术领域

本发明涉及一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法，属于蛋白质和酶工程技术领域。

背景技术

转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，简称TGase)又称谷氨酰胺转胺酶，EC编号2.3.2.13；催化蛋白或肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺(酰基供体)与赖氨酸残基的ε-氨基(酰基受体)发生酰基转移反应，释放出一分子氨分子，形成异肽键连接的蛋白聚合物。TGase广泛存在于各种生物体中，包括哺乳动物、植物和微生物，具有重要的生物功能。由于其具有蛋白交联性质，可以应用于含蛋白的食品改性；同时由于长链伯胺等与赖氨酸侧链结构相似的化学分子也可以作为TGase的酰基受体，所以其还有应用于药用蛋白修饰的价值。

1989年日本味之素公司首次在茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)中分离得到微生物来源的TGase，以下简称MTG。MTG可由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)发酵产生。相比于哺乳动物、植物来源的TGase，微生物来源的MTG易获得、易于纯化、生产成本低、易于保存，并且其活性不依赖于钙离子，底物适应好，温度及pH耐受性好。这种MTG的发现、开发和商品化促进了TGase酶的应用。除了在食品、纺织业等工业中得到广泛应用，将MTG应用于药用蛋白的修饰，比如抗体药物偶联物的合成、药用蛋白的聚乙二醇修饰等也广泛开展，显示出MTG在医药领域的巨大应用潜力。

在分泌表达过程中，微生物转谷氨酰胺酶以酶原(Pro-MTG)形式表达，N-端带有前导肽(propeptide，Pro)序列，前导肽不仅可以辅助MTG正确折叠，还可以遮蔽MTG酶活性中心抑制其活性，避免MTG在宿主细胞内催化蛋白交联对细胞产生毒性作用。Pro-MTG酶原N端的前导肽在胞外被茂原链霉菌的内源性蛋白酶逐步水解，形成具有酶活性的成熟MTG。

通过大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等表达系统重组表达MTG可以获得质量可控、易于反应后分离的MTG工具酶。目前，MTG的重组表达有三种策略：(1)直接表达成熟MTG序列，形成包涵体，体外复性获得活性酶；(2)表达含有前导肽的全长Pro-MTG酶原，在体外使用胰蛋白酶不完全裂解切割Pro；(3)在Pro和MTG序列之间添加外源性蛋白酶酶切位点或内含肽序列获得融合蛋白，在获得融合蛋白后通过外源性蛋白酶切割或pH等条件变化诱导内含肽脱落得到MTG。这些方法需要对纯化得到的蛋白(包涵体或酶原)进行后处理，步骤繁琐、不经济，同时前导肽Pro与成熟MTG蛋白间亲和力强，纯化时不易除去，降低了酶活力。虽然前导肽残留对MTG的食品工业应用影响较小，但对其应用于药用蛋白修饰影响较大。另外，针对成熟MTG中前导肽残留的问题，已经有方法通过对前导肽序列进行点突变，以期达到改进前导肽去除效果的目的(辉瑞公司，Protein Science,2016,25:442-455)。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法，采用人工“分子伴侣”策略重组生产MTG，即将成熟MTG序列与前导肽Pro序列分别构建独立的编码基因，在同一宿主中共表达，硫氧还蛋白-前导肽融合蛋白在细胞内作为MTG的“分子伴侣”，通过一步纯化可得与商品化MTG酶活相当的活性酶；同时为获得高纯度高活性MTG应用于药用蛋白修饰等，可通过在进一步处理纯化过程中控制溶液组分和处理条件高效剥离“分子伴侣”。

本发明的技术方案如下：

一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法，其特征在于，将成熟MTG编码基因与前导肽Pro编码基因分别构建重组质粒，将重组质粒转化入同一宿主细胞内共表达，初步纯化后获得有活性的微生物转谷氨酰胺酶。

根据本发明优选的，所述成熟MTG的C端连接His6标签，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，所述前导肽Pro的N端连接有大肠杆菌硫氧还蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述核苷酸序列均经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。

根据本发明优选的，所述成熟MTG编码基因与前导肽Pro编码基因的重组质粒的质粒载体为含有T7启动子的载体，两种重组质粒的质粒载体可以在同一宿主细胞中共存；进一步优选的，所述成熟MTG编码基因的重组质粒的质粒载体为pET15b；所述前导肽Pro编码基因的重组质粒的质粒载体为pACYCDuet-1。

根据本发明优选的，所述宿主细胞为整合有DE3片段的菌株，进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

根据本发明优选的，所述初步纯化采用固定化金属离子亲和层析色谱纯化，进一步优选为镍离子亲和层析色谱。

根据本发明优选的，所述微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法还包括二次纯化处理，是将初步纯化蛋白与反应试剂混合，所述反应试剂为异硫氰酸荧光素、或3-(4-羟苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、或乙酸-N-琥珀酰亚胺酯，或4-苯基-1,2,4-三咪唑-3,5-二酮、或4-(氨甲基)苯酚、或二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯的二甲亚砜溶液，将混合体系孵育处理后，使用固定化金属离子亲和层析色谱纯化，得到高活性转谷氨酰胺酶。

进一步优选的，所述反应试剂为乙酸-N-琥珀酰亚胺酯的二甲亚砜溶液，并采用PBS缓冲液稀释至工作浓度，所述乙酸-N-琥珀酰亚胺酯在混合体系中的工作浓度为25-150mM，优选为50mM；所述混合体系中二甲亚砜的体积百分比浓度为大于15％。

进一步优选的，所述孵育处理的温度为10-37℃，优选为30-37℃。

进一步优选的，所述孵育处理的时间为0.5-12h，优选为3h。

进一步优选的，所述初步纯化蛋白在混合体系中的浓度为1-5mg/mL。

进一步优选的，所述纯化方法为镍离子亲和磁珠纯化或镍离子亲和凝胶纯化。

本发明中，一种优选的微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法，具体步骤包括：

(1)将连接His6标签的成熟MTG的编码基因插入到pET15b中，构建MTG-His6重组质粒；将连接硫氧还蛋白的前导肽Pro的编码基因插入到pACYCDuet-1中，构建Trx-Pro重组质粒；

(2)将步骤(1)构建的MTG-His6重组质粒和Trx-Pro重组质粒共同转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎细胞后，采用镍离子亲和层析色谱纯化后得到初步纯化蛋白；

(3)将步骤(2)得到的初步纯化蛋白与乙酸-N-琥珀酰亚胺酯的二甲亚砜溶液混合，并采用PBS缓冲液稀释，使得初步纯化蛋白在混合体系中的浓度为1-5mg/mL，乙酸-N-琥珀酰亚胺酯在混合体系中的浓度为25-150mM，二甲亚砜的体积百分比浓度为15％，然后将混合体系在10-37℃孵育处理0.5-12h，经镍离子亲和磁珠或镍离子亲和凝胶二次纯化后得到高活性转谷氨酰胺酶。

上述所得初步纯化蛋白中尽管含少量硫氧还蛋白-前导肽Pro融合蛋白，但使用国家标准方法测定活性，MTG的比活力约为30U/mg，与商品化酶相当。经二次纯化后所得高纯度高活性MTG的比活力是初步纯化蛋白MTG的160％左右。

一种生产转谷氨酰胺酶的重组菌株，是按照上述重组生产方法中将成熟MTG编码基因与前导肽Pro编码基因分别构建重组质粒，将重组质粒转化入同一宿主细胞内构建得到的。

上述重组菌株在生产转谷氨酰胺酶中的应用。

本发明的技术特点和有益效果：

1、本发明将MTG前导肽Pro与Trx蛋白融合后表达为“分子伴侣”Trx-Pro，前导肽片段只有44个氨基酸，单独表达存在表达量小、不易检测等缺陷，将其与Trx蛋白融合表达克服了以上缺陷。“分子伴侣”Trx-Pro与成熟MTG蛋白共表达时辅助MTG正确折叠，并抑制其对重组表达宿主细胞的伤害，实现了微生物转谷氨酰胺酶的有效可溶性表达及一步法简便纯化，所得重组转谷氨酰胺酶尽管含少量硫氧还蛋白-前导肽融合蛋白，但所得初步纯化蛋白的MTG比活力约为30U/mg，与商品化转谷氨酰胺酶相当。

2、本发明在经一步简单纯化后得到初步纯化蛋白，再经反应试剂进一步处理，高效剥离“分子伴侣”Trx-Pro，得到高纯度高活性的重组转谷氨酰胺酶，而且重组酶还有亲和纯化标签有利于在酶促反应完成后去除工具酶，具有应用于药用蛋白修饰等方面的重要价值。

附图说明

图1是MTG和Trx-Pro共表达和初步纯化后的SDS-PAGE分析电泳图，其中，M为蛋白分子量标准，1为重组大肠杆菌的总蛋白，2为细胞裂解液离心后的上清液，3为细胞裂解液离心后的沉淀重悬液；4为镍离子亲和层析纯化过程中的流穿液，5为纯化过程的洗脱液，6为脱盐浓缩后的初步纯化蛋白；

图2是不同试剂与初步纯化蛋白二次纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中，M为蛋白分子量标准，对照为未处理的初步纯化蛋白；1-12为试剂处理后二次纯化蛋白，其中各个条带的处理试剂，1为异硫氰酸荧光素，2为3-(4-羟苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，3为4-苯基脲唑，4为乙酸-N-琥珀酰亚胺酯，5为4-苯基-1,2,4-三咪唑-3,5-二酮，6为4-(氨甲基)苯酚，7为N-乙酰基-L酪氨酸，8为甘氨酰-L-酪氨酸水合物，9为4-羟基苯甲醇，10为L-酪氨酸，11为3-(3,4-三羟基苯基)-L-丙氨酸，12为二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯；

图3是不同浓度的乙酸-N-琥珀酰亚胺酯与初步纯化蛋白二次纯化后的SDS-PAGE电泳图(左图)及MTG比活力、蛋白回收率图(右图)；其中，左图中M为蛋白分子量标准，1为未处理对照，2-9依次为终浓度0mM、10mM、25mM、50mM、75mM、100mM、125mM、150mM的乙酸-N-琥珀酰亚胺酯的处理组；

图4是不同浓度二甲亚砜条件下乙酸-N-琥珀酰亚胺酯与初步纯化蛋白二次纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中，M为蛋白分子量标准，1为未处理对照，2-9依次为体积百分比0％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％的二甲亚砜的处理组；

图5是不同温度条件下乙酸-N-琥珀酰亚胺酯与初步纯化蛋白二次纯化后的SDS-PAGE电泳图(左图)及MTG比活力、蛋白回收率图(右图)；其中，左图中M为蛋白分子量标准，1为未处理对照，2-9依次为10℃、20℃、30℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃下的处理组；

图6是乙酸-N-琥珀酰亚胺酯与初步纯化蛋白二次纯化不同时间后的SDS-PAGE电泳图(左图)及MTG比活力、蛋白回收率图(右图)；其中，左图中M为蛋白分子量标准，1为未处理对照，2-9依次为0.25h、0.5h、1h、3h、5h、7h、9h、12h处理组；

图7是乙酸-N-琥珀酰亚胺酯与不同浓度的初步纯化蛋白二次纯化后的SDS-PAGE电泳图(左图)及MTG比活力、蛋白回收率图(右图)；其中，左图中M为蛋白分子量标准，1为未处理对照，2-9依次为蛋白终浓度1、2、3、4、5、6、7mg/mL的处理组。

具体实施方式

为便于应用本发明，下面以实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

实施例中，限制性内切酶和T4连接酶来源于News England Biolabs，镍离子琼脂糖凝胶来源于常州天地人和生物公司，镍离子亲和磁珠(Ni-Charged MagBeads)购自苏州海狸生物医学工程有限公司，其它化学试剂为市售分析纯以上试剂。

本发明中的成熟MTG和前导肽Pro蛋白序列来源于微生物Streptomycesmobaraensis(GenBank登录号AAM95951)。

实施例1：转谷氨酰胺酶重组表达宿主构建及蛋白表达和纯化

(1)MTG重组质粒的构建

在成熟MTG的C端连接6个组氨酸纯化标签，便于后续成熟MTG的分离纯化，MTG氨基酸序列与His6标签之间由G-S-L-E四肽连接，记为MEG-His6，MEG-His6的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，根据上述氨基酸序列设计编码基因，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该核苷酸序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达，人工合成MTG-His6编码基因；人工合成MTG-His6编码基因时在核苷酸序列的两端分别添加了NcoI和BglII限制性内切酶位点；

使用NcoI和BglII酶切处理人工合成的MTG-His6编码基因，使用NcoI和BamHI酶切处理带有大肠杆菌基因转录蛋白翻译元件的pET15b载体(购自默克公司)，BglII和BamHI切割产生一样的粘性末端，随后使用T4 DNA连接酶连接，得到MTG重组质粒pET15b-MTG-His6；

(2)Pro重组质粒的构建

在前导肽Pro的N端连接大肠杆菌硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)，Pro与硫氧还蛋白之间由G-S-G-S-G多肽连接，组成融合蛋白Trx-Pro作为MTG的“分子伴侣”，融合蛋白Trx-Pro的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，根据上述氨基酸序列设计编码基因，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该核苷酸序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达，人工合成Trx-Pro编码基因；人工合成Trx-Pro编码基因时在核苷酸序列的两端分别添加了NcoI和XhoI限制性内切酶位点；

将Trx-Pro编码基因和带有大肠杆菌基因转录蛋白翻译元件的pACYCDuet-1载体(购自默克公司)分别使用NcoI和XhoI酶切处理，T4 DNA连接酶连接，得到Pro重组质粒pACYCDuet-1-Trx-Pro；

(3)转化与表达

将重组质粒pET15b-MTG-His6和pACYCDuet-1-Trx-Pro共同转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含100μg/mL氨苄霉素和50μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，LB液体培养基培养过夜后保存重组表达菌株；LB液体培养基均含有100μg/mL氨苄霉素和50μg/mL氯霉素，下同；

取保存的重组表达菌株接种到50mL的LB液体培养基中，在37℃下活化过夜；取活化后的菌液按照10％比例接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀约为0.8-1.0，取出冰水浴降温；向其中加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导表达20小时；使用立式离心机收集菌体(8000rpm，10min，4℃)，将菌体重悬于缓冲液(20mM磷酸盐，pH 7.5，500mMNaCl)中，将菌体重悬液置于冰水混合物中进行超声破碎(功率40W，超声2s，间隔5s，破碎30min)；离心破碎后的菌液(4℃，12000rpm，30min)，收集上清；

(4)初步纯化

重组蛋白使用固定化金属离子亲和层析色谱进行一步纯化：将上述收集的上清采用镍离子亲和层析进行纯化，纯化步骤参照镍离子琼脂糖凝胶商品说明书进行，用含有20mM咪唑的缓冲液洗去杂蛋白，用含500mM咪唑的缓冲液洗脱得到纯化蛋白，脱盐并浓缩，使用超微量分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE验证，验证结果如图1所示，纯化后的目的蛋白样品条带明亮，MTG(理论分子量39.2kDa)和Trx-Pro(理论分子量16.6kDa)均符合理论分子量。上述SDS-PAGE分析可参照《精编分子生物学操作实验指南》(科学出版社，2005.1，ISBN：9787030147257)中的相关描述进行操作。

采用国家标准GB 34795-2017《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》测定上述纯化后的转谷氨酰胺酶比活力，约为30U/mg，与商品化酶相当。

实施例2：“分子伴侣”Trx-Pro剥离条件优化及高活性转谷氨酰胺酶的获得

使用不同处理条件对实施例1获得的初步纯化蛋白进行二次纯化处理，使用超微量分光光度计测定蛋白浓度，使用SDS-PAGE分析蛋白组成，采用国家标准GB 34795-2017《谷氨酰胺转胺酶活性检测方法》测定转谷氨酰胺酶比活力。

(1)处理试剂的筛选

以二甲亚砜作为溶剂溶解小分子处理试剂，其中，小分子处理试剂包括异硫氰酸荧光素、3-(4-羟苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-苯基脲唑、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯、4-苯基-1,2,4-三咪唑-3,5-二酮、4-(氨甲基)苯酚、N-乙酰基-L酪氨酸、甘氨酰-L-酪氨酸水合物、4-羟基苯甲醇、L-酪氨酸、3-(3,4-三羟基苯基)-L-丙氨酸和二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯，配制2M的母液，再用PBS缓冲液(20mM磷酸盐，pH 7.5，500mM NaCl)稀释母液至100mM。将实施例1初步纯化后得到的MTG和少量Trx-Pro蛋白的混合溶液与不同小分子处理试剂等体积混合，37℃孵育3h，用镍离子亲和磁珠进行二次纯化，纯化步骤参照商品说明书进行；用PBS缓冲液置换小分子处理试剂溶液，用含500mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白；SDS-PAGE结果如图2所示，由图可知，异硫氰酸荧光素、3-(4-羟苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯，4-苯基-1,2,4-三咪唑-3,5-二酮、4-(氨甲基)苯酚和二(N-羟基琥珀酰亚胺)辛二酸酯可以促进“分子伴侣”Trx-Pro剥离，其中乙酸-N-琥珀酰亚胺酯效果较好，并且较为经济、在PBS中的溶解度优于其它小分子试剂。

(2)乙酸-N-琥珀酰亚胺酯处理浓度筛选

以乙酸-N-琥珀酰亚胺酯为溶质，二甲亚砜作为溶剂，配制2M的母液，再用PBS缓冲液分别稀释母液至20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM。取实施例1初步纯化后浓度约为4mg/mL的MTG和Trx-Pro的蛋白混合溶液，分别与不同浓度的乙酸-N-琥珀酰亚胺酯等体积混合，在混合体系中蛋白终浓度为2mg/mL，乙酸-N-琥珀酰亚胺酯的终浓度分别为10mM、25mM、50mM、75mM、100mM、125mM、150mM，37℃下孵育3h，对照组的处理液为含有二甲亚砜浓度的PBS缓冲液，对照组与其它实验组中二甲亚砜的含量相同，终浓度均为15％(体积百分比)。再用磁珠进行二次纯化，纯化后的SDS-PAGE和比活力数据结果如图3所示，随着试剂浓度增加，“分子伴侣”Trx-Pro在总蛋白中的占比变小，MTG的比活力增加，MTG蛋白的回收率在60％左右。其中，试剂浓度在25mM以上均有效果，50mM以上效果更佳；因此，优选的，二次纯化处理中乙酸-N-琥珀酰亚胺酯在混合体系中的浓度为25-150mM，纯化后MTG的比活力为35.8～48.4U/mg，MTG蛋白的回收率为58.6～65.2％；最优的，乙酸-N-琥珀酰亚胺酯在混合体系中的浓度为50mM，此时，纯化后MTG的比活力为48.4U/mg，MTG蛋白的回收率为65.2％。

此外，本实施例还进一步筛选了二次纯化处理中二甲亚砜的终浓度，处理中乙酸-N-琥珀酰亚胺酯在混合体系中的浓度均为50mM，二甲亚砜在混合体系中的体积百分比分别为0％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％，37℃下孵育3h，纯化后SDS-PAGE结果如图4所示，筛选到二甲亚砜的适合体积百分比浓度为大于15％。

(3)乙酸-N-琥珀酰亚胺酯处理温度筛选

取实施例1初步纯化后浓度约为4mg/mL的MTG和Trx-Pro的蛋白混合溶液，与100mM乙酸-N-琥珀酰亚胺酯溶液等体积混合后(蛋白终浓度2mg/mL，试剂浓度50mM)，分别在10℃、20℃、30℃、37℃、45℃、55℃、60℃下孵育3h，再用磁珠进行二次纯化；SDS-PAGE和比活力数据结果如图5所示，随着处理温度的提高，“分子伴侣”Trx-Pro的在总蛋白中的占比变小，MTG的比活力先增加后降低，其中10-37℃之间操作均可以明显提高纯度和比活力，而30-37℃效果更好。因此，优选的，处理温度为10-37℃，纯化后MTG的比活力为34.8～47.5U/mg，MTG蛋白的回收率为60.8～67.7％；进一步优选的，处理温度为30-37℃，纯化后MTG的比活力为46.0～47.5U/mg，MTG蛋白的回收率为60.8～64.2％。

(4)乙酸-N-琥珀酰亚胺酯处理时间筛选

取实施例1初步纯化后浓度约为4mg/mL的MTG和Trx-Pro的蛋白混合溶液，与100mM乙酸-N-琥珀酰亚胺酯溶液等体积混合后，分别在37℃孵育0.25h、0.5h、1h、3h、5h、7h、9h、12h，再用磁珠进行二次纯化；SDS-PAGE和比活力数据结果如图6所示，随着孵育时间的延长，“分子伴侣”Trx-Pro的量变少，MTG的比活力先增加后降低，但除3h这一条件呈现优势其它条件下变化不明显，3h为剥离“分子伴侣”Trx-Pro的最适孵育时间。因此，优选的处理时间为0.25-12h，纯化后MTG的比活力为32.5～49.6U/mg，MTG蛋白的回收率为55.5～74.6％；进一步优选的，处理时间为3h，纯化后MTG的比活力为49.6U/mg，MTG蛋白的回收率为74.6％。

(5)二次纯化处理过程蛋白浓度筛选

混合体系中终浓度为1、2、3、4、5、6、7mg/mL的MTG和Trx-Pro的蛋白，经终浓度为50mM乙酸-N-琥珀酰亚胺酯37℃处理3h，再用磁珠进行二次纯化；SDS-PAGE和比活力数据结果如图7所示，蛋白浓度在1-6mg/mL范围内，MTG比活力和蛋白回收率无明显差异，7mg/mL的情况下回收率有所下降，6和7mg/mL情况下所得酶的比活力相对较低，因此优选的二次纯化处理过程中蛋白浓度为1-5mg/mL，纯化后MTG的比活力为45.3～49.0U/mg，MTG蛋白的回收率为64.6～74.2％。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 342

<212> PRT

<400> 1

Met Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg

1 5 10 15

Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val

20 25 30

Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly

35 40 45

Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly

50 55 60

Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg

65 70 75 80

Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys

85 90 95

Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg

100 105 110

Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg

115 120 125

Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu

130 135 140

Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp

145 150 155 160

Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg

165 170 175

Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser

180 185 190

Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp

195 200 205

Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe

210 215 220

Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn

225 230 235 240

Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp

245 250 255

Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val

260 265 270

Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala

275 280 285

Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser

290 295 300

Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp

305 310 315 320

Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro Gly Ser Leu Glu

325 330 335

His His His His His His

340

<210> 2

<211> 1036

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccatggatag tgacgatcgt gttacccctc cggcagaacc gctggatcgt atgccggatc 60

cgtatcgccc gagctatggt cgtgcagaga ccgtggtgaa caactacatc cgcaaatggc 120

agcaggtgta cagccatcgt gatggccgta aacagcagat gaccgaagag cagcgtgagt 180

ggctgagcta tggttgtgtg ggcgtgacat gggtgaatag cggtcagtat ccgaccaacc 240

gtctggcctt tgccagcttt gacgaagatc gctttaaaaa cgaactgaag aatggtcgcc 300

cgcgtagcgg cgaaacacgt gcagaatttg aaggccgcgt ggccaaagaa agctttgatg 360

aagagaaagg tttccagcgc gcccgtgaag ttgccagcgt gatgaaccgc gccctggaga 420

atgcccacga tgaaagcgcc tacctggaca acctgaagaa agagctggcc aacggcaacg 480

atgcactgcg caatgaagat gcccgtagcc cgttctatag cgccctgcgc aatacaccga 540

gctttaagga gcgcaatggc ggtaatcacg atccgagccg catgaaagcc gtgatctaca 600

gcaaacactt ttggagcggt caggaccgca gtagcagcgc cgataaacgc aaatacggtg 660

atccggatgc ctttcgtcct gccccgggca ctggcctggt tgatatgagc cgcgatcgca 720

acattccgcg tagtccgacc agcccgggtg aaggctttgt gaacttcgac tacggctggt 780

tcggtgcaca gaccgaagca gatgcagaca aaaccgtgtg gactcatggt aatcactatc 840

atgccccgaa tggtagcctg ggcgccatgc atgtgtatga aagcaagttc cgtaactgga 900

gcgagggcta tagtgatttc gatcgcggcg cctacgttat taccttcatc ccgaaaagct 960

ggaataccgc cccggataaa gtgaaacaag gctggccggg cagcctcgag caccaccacc 1020

accaccactg agatct 1037

<210> 3

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工设计

<400> 3

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr

115 120 125

Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu

130 135 140

Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala

145 150 155

<210> 4

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccatggatag tgacgatcgt gttacccctc cggcagaacc gctggatcgt atgccggatc 60

cgtatcgccc gagctatggt cgtgcagaga ccgtggtgaa caactacatc cgcaaatggc 120

agcaggtgta cagccatcgt gatggccgta aacagcagat gaccgaagag cagcgtgagt 180

ggctgagcta tggttgtgtg ggcgtgacat gggtgaatag cggtcagtat ccgaccaacc 240

gtctggcctt tgccagcttt gacgaagatc gctttaaaaa cgaactgaag aatggtcgcc 300

catatgagcg ataaaattat tcacctgact gacgacagtt ttgacacgga tgtactcaaa 360

gcggacgggg cgatcctcgt cgatttctgg gcagagtggt gcggtccgtg caaaatgatc 420

gccccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgt tgcaaaactg 480

aacatcgatc aaaaccctgg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtat cccgactctg 540

ctgctgttca aaaacggtga agtggcggca accaaagtgg gtgcactgtc taaaggtcag 600

ttgaaagagt tcctcgacgc taacctggcc ggttctggtt ctggcgacaa tggtgcaggt 660

gaggaaacca agagctatgc cgaaacatac cgtctgaccg cagatgatgt ggccaatatt 720

aacgcactga acgagagtgc ccctgccgca agtagcgcag gtccgagctt ccgtgcatga 780

ctcgag 786

Claims

1.一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法，其特征在于，将成熟MTG编码基因与前导肽Pro编码基因分别构建重组质粒，所述成熟MTG编码基因与前导肽Pro编码基因的重组质粒的质粒载体为含有T7启动子的载体，两种重组质粒的质粒载体可以在同一宿主细胞中共存，将重组质粒转化入同一宿主细胞内共表达，初步纯化后获得有活性的微生物转谷氨酰胺酶；

所述成熟MTG的C端连接His6标签，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述前导肽Pro的N端连接有大肠杆菌硫氧还蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的重组生产方法，其特征在于，所述成熟MTG编码基因的重组质粒的质粒载体为pET15b；所述前导肽Pro编码基因的重组质粒的质粒载体为pACYCDuet-1。

3.如权利要求1所述的重组生产方法，其特征在于，所述宿主细胞为整合有DE3片段的菌株。

4.如权利要求1或3所述的重组生产方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

5.如权利要求1所述的重组生产方法，其特征在于，所述初步纯化采用固定化金属离子亲和层析色谱纯化。

6.如权利要求1或5所述的重组生产方法，其特征在于，所述初步纯化采用镍离子亲和层析色谱。

7.如权利要求1所述的重组生产方法，其特征在于，所述微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法还包括二次纯化处理，是将初步纯化蛋白与反应试剂混合，所述反应试剂为异硫氰酸荧光素、或3-（4-羟苯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、或乙酸-N-琥珀酰亚胺酯，或4-苯基-1,2,4-三咪唑-3,5-二酮、或4-（氨甲基）苯酚、或二（N-羟基琥珀酰亚胺）辛二酸酯的二甲亚砜溶液，将混合体系孵育处理后，使用固定化金属离子亲和层析色谱纯化，得到高活性转谷氨酰胺酶。

8.如权利要求7所述的重组生产方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：

a. 所述反应试剂为乙酸-N-琥珀酰亚胺酯的二甲亚砜溶液，并采用PBS缓冲液稀释至工作浓度，所述乙酸-N-琥珀酰亚胺酯在混合体系中的工作浓度为25-150 mM，所述混合体系中二甲亚砜的体积百分比浓度为大于15%；

b. 所述孵育处理的温度为10-37℃；

c. 所述孵育处理的时间为0.5-12 h；

d. 所述初步纯化蛋白在混合体系中的浓度为1-5 mg/mL；

e. 所述纯化方法为镍离子亲和磁珠纯化或镍离子亲和凝胶纯化。

9.一种生产转谷氨酰胺酶的重组菌株，其特征在于，是按照权利要求1所述的重组生产方法中将成熟MTG编码基因与前导肽Pro编码基因分别构建重组质粒，将重组质粒转化入同一宿主细胞内构建得到的。

10.权利要求9所述的重组菌株在生产转谷氨酰胺酶中的应用。