CN114686547B - 一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶A的方法，具体涉及以优化的麦芽糖‑O‑酰基转移酶(MAT)为生物催化剂，以双醋瑞因为酰基供体，辅酶A为受体的酶促合成乙酰辅酶A的方法，属于生物催化领域。其酰基供体的分子结构如下所示。该方法提供了MAT及其优化的突变体MAT‑E125S，MAT‑E125A的氨基酸序列和核苷酸序列。还提供了酶促合成乙酰辅酶A的最适反应条件。本发明还提供了乙酰辅酶A合成产量的定量分析，优化的MAT‑E125S，MAT‑E125A催化合成乙酰辅酶A的产量可分别达到3329.73mg·L‑1和3159.02mg·L‑1。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)的新颖方法，特别涉及一种酶促催化的高效方法，其催化工具是来源于E.coli(Escherichia coli)BL 21(DE3)中的麦芽糖-O-酰基转移酶(Maltose-O-acetyltransferase，MAT，accession No：ACT42309.1)及其突变体MAT-E125S、MAT-E125A，底物包括酰基受体辅酶A和酰基供体双醋瑞因，属于生物催化领域。
背景技术
乙酰辅酶A是中心代谢网络的关键枢纽。它在生命体的代谢过程中连接了多个重要的碳循环过程，包括三羧酸循环、糖酵解、丙酮酸途径、乙酸途径及磷酸戊糖途径等。同时，它还是合成大量天然产物的重要前体物质，参与了长链脂肪酸及其衍生物、聚酮类和固醇类等高密度烷烃、亮氨酸和半胱氨酸等重要氨基酸以及其他类化学品的从头合成过程。此外，乙酰辅酶A在工业上具有重大的应用价值，可以作为乙酰化活性天然产物的合成原料。
迄今为止，提高乙酰辅酶A产量的研究大多基于微生物自身的代谢途径，以开源节流、通主阻旁为中心思想，以代谢工程为主要实施策略。但是依赖于乙酰辅酶A天然生物合成途径的工程化改造方式大多存在着ATP依赖、碳损失等问题。此外，在微生物自身代谢流路与人工调控的代谢通路之间进行代谢流的理想分配是相当困难的。
体外酶促合成乙酰辅酶A包括由乙酰辅酶A合酶、丙酮酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂解酶等催化的多种方法，但这些方法的辅因子依赖性限制了工业转化。目前，工业上乙酰辅酶A的合成(如Sigma公司)仍采用1989年Billhardt等人所报道的方法。该方法由磷酸转乙酰酶(Phosphotransacetylase)所介导，分别以乙酰磷酸和辅酶A为酰基供体和酰基受体。但是，其缺点在于乙酰磷酸在溶液中稳定性较差。这些不利条件限制了乙酰辅酶A的规模化生产，导致乙酰辅酶A价格昂贵，不利于乙酰辅酶A的广泛应用以及乙酰化天然产物的大规模酶法合成。因此，亟需建立一种切实可行的方法酶法合成乙酰辅酶A，其中所使用的酶和底物应具有可获得性、廉价性、稳定性等特性。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种酶促合成乙酰辅酶A的方法。
本发明的第二目的是提供该方法中所涉及的生物催化剂。
本发明的第三目的是提供该方法中所需要的底物，尤其是酰基供体。
本发明的第四目的是提供该方法的最适反应条件。
为了实现本发明之目的，采用的技术方案为：本发明提供一种酶促合成乙酰辅酶A的高效方法，
a)麦芽糖-O-酰基转移酶或其突变体为生物催化剂。
b)双醋瑞因为供体底物。
c)辅酶A为受体底物。
d)麦芽糖-O-酰基转移酶催化辅酶A和双醋瑞因合成乙酰辅酶A。
具体的，所述合成乙酰辅酶A的酶催化体系中，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为1∶4～15∶1；反应温度为30～70℃；反应pH为3.5～6.5。
作为优选，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为3∶8～5∶2；反应温度为40～60℃；反应pH为4～6。
更优选，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为1∶1～5∶2；反应温度为45～55℃；反应pH为4.5～5.5。
最优选，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为3∶4；反应温度为48～53℃；反应pH为4.6～5.2。
本发明还提供了一种所述的麦芽糖-O-酰基转移酶MAT，其氨基酸序列选自SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。
本发明还提供了麦芽糖-O-酰基转移酶MAT为生物催化剂，对辅酶A的转化率为45.47％，乙酰辅酶A产量为2761.06mg·L-1
本发明还提供了优化的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125S，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了优化的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125S为生物催化剂，对辅酶A的转化率提升至54.84％，乙酰辅酶A产量最高可达到3329.73mg·L-1。
本发明还提供了一种优化的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125A，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了优化的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125A为生物催化剂，对辅酶A的转化率提升至52.03％，乙酰辅酶A产量最高可达到3159.02mg·L-1。
本发明还提供了一种含有所述核苷酸序列的表达载体，选自pET-28a(+)。
本发明还提供了一种所述表达载体的宿主细胞。其优选的宿主细胞选自大肠杆菌BL21(DE3)。
有益技术效果：
本发明的乙酰辅酶A合成方法，以麦芽糖-O-酰基转移酶MAT或其突变体为生物催化剂，不需要辅因子，且生物催化剂MAT或其突变体源自大肠杆菌，可高效表达，大量获取；以易制备的双醋瑞因作为酰基供体，可避免供体分子不易得的问题。本发明的乙酰辅酶A合成方法操作简便、产率高、反应条件温和，环境友好，可显著降低乙酰辅酶A的制备成本，适合大规模工业化推广应用。
附图说明
图1：BL 21(DE3)基因组的琼脂糖凝胶电泳结果，其中M是DNA分子量标准；1是BL21(DE3)基因组电泳结果。
图2：Maa基因的PCR分析结果，其中M是DNA分子量标准；1是maa基因PCR结果。
图3：重组质粒pET28a-MAT示意图。
图4：MAT重组蛋白SDS-PAGE分析考马斯亮蓝染色结果，其中M为蛋白分子量标准；1为BL21(DE3)[pET28a(+)]的诱导结果；2为BL21(DE3)[pET28a-MAT]诱导结果，箭头表示重组的MAT蛋白。
图5：咪唑洗脱纯化后MAT蛋白SDS-PAGE分析考马斯亮蓝染色结果，其中1为目的蛋白；M为蛋白分子量标准。
图6：MAT重组酶催化辅酶A和双醋瑞因合成乙酰辅酶A的检测结果：(A)液相检测结果，其中1为底物辅酶A标准品；2为目标化产物乙酰辅酶A标准品；3为对照组(不加MAT纯酶)；4为实验组；5为实验组与乙酰辅酶A标准品共进样组。(B)辅酶A标准品，乙酰辅酶A标准品及MAT-Acetyl-CoA产物的紫外光谱对比图。
图7：(A)MAT催化合成的产物MAT-Acetyl-CoA的一级质谱图。(B)MAT催化合成的产物MAT-Acetyl-CoA可能的裂分方式。(C)MAT催化合成的产物MAT-Acetyl-CoA的二级质谱检测结果。
图8：MAT重组酶催化合成乙酰辅酶A最适反应条件的测定。(A)pH对MAT酶促合成乙酰辅酶A活性的影响。(B)温度对MAT酶促合成乙酰辅酶A活性的影响。(C)供受体浓度(比例)对MAT酶促合成乙酰辅酶A活性的影响。
图9：双醋瑞因和辅酶A与MAT蛋白结构的分子对接模拟结果：(A)拟定的活性催化位点His113与双醋瑞因和辅酶A的位置关系。(B)候选关键位点在MAT整个催化结构腔中所处的位置。(C)候选关键位点与MAT拟定活性中心His113的位置关系。
图10：GAT与MAT基于结构相似性的序列比对。
图11：双醋瑞因和辅酶A与MAT蛋白结构的对接结果分析。(A)双醋瑞因、辅酶A及其催化关键位点Glu125的相互作用分析。(B)MAT蛋白结构中双醋瑞因的结合口袋。
图12：MAT候选关键位点的丙氨酸突变体催化合成乙酰辅酶A的效率比较。
图13：MAT及其突变体合成乙酰辅酶A的液相结果对比图。
图14：MAT及其突变体合成乙酰辅酶A转化效率及产量的定量分析。
具体实施方式
本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1 MAT基因克隆
挑取大肠杆菌BL 21(DE3)单克隆接种到20mL液体LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水)中，37℃，220rpm过夜培养。吸取BL21(DE3)细菌培养物3mL置于离心管中，12000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。按照细菌基因组DNA提取试剂盒(BacteriaGen DNA Kit，CWbio公司)说明书，提取BL 21(DE3)基因组，取5μL进行电泳，结果如图1所示，获得了一条长度超过8000bp的特异性条带，表明成功提取出细菌基因组DNA。以BL21(DE3)的基因组为模板，以EACYMATF(5′-ATGAGCACAGAAAAAGAAAAGATG-3′)(SEQ IDNO.7)和EACYMATR(5′-TTACAATTTTTTAATTATTCTGGC-3′)(SEQ ID NO.8)作为扩增MAT编码基因maa的特异性引物，按照如下程序和体系通过PCR扩增maa基因，PCR产物通过电泳分析，结果表明，扩增得到一条长约为550bp的条带，与maa基因的理论大小相当(图2)。
根据pEASY@-Blunt Cloning Kit试剂盒说明书，将上述PCR产物与pEASY@-Blunt(Transgen公司)载体按照摩尔比为7∶1的比例进行连接，连接产物转化至Trans1-T1(Transgen公司)感受态中，在LB固体培养基(含50μg·mL-1卡那霉素)上倒置培养过夜(约16h)。从该平板上挑取单克隆进行菌落PCR，筛选出阳性克隆送样测序。结果表明，PCR扩增得到的产物与BL 21(DE3)基因组中注释的麦芽糖-O-酰基转移酶的核酸序列完全一致，全长共552bp，该基因命名为maa，含有该基因的载体命名为pEASY-MAT。
实施例2 MAT表达载体的构建
根据In-Fusion(Clontech)同源重组的原理，设计如下用于构建maa表达载体的特异性引物，每个引物分别包括载体同源臂和目的基因同源臂，包括Eacy28aMATF(5′-CAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAGCACAGAAAAA-3′)(SEQ ID NO.9)和Eacy28aMATR(5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACAATTTTTTAAT-3′)(SEQ ID NO.10)。以测序正确的质粒pEASY-MAT为模板，以Eacy28aMATF和Eacy28aMATR为特异性引物，通过如下程序和体系进行PCR，50μL体系中含10×KOD buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO42μL，10μM的引物FET28aMAT和RET28aMAT各1μL，KOD-Plus-Neo 1μL，模板pEASY-MAT 2μL，ddH2O补足。PCR程序：98℃预变性3min；98℃变性30s，60.3℃退火45s，68℃延伸25s，共30个循环；68℃终延伸7min，4℃保温。
将获得的PCR产物通过同源重组(In-Fusion)的方法连接到经EcoR I和Hind III双酶切处理过的线性载体pET-28a(+)中，连接产物转化到Trans1-T1感受态中，在LB固体培养基(含50μg·mL-1卡那霉素)的上倒置培养过夜(约16h)，挑取单克隆进行菌落PCR，筛选出阳性克隆进行测序。结果表明表达载体构建正确，命名为pET28a-MAT(图3)。
实施例3 MAT蛋白的诱导表达和检测
将构建好的质粒pET28a-MAT用热激法转化至表达宿主菌BL 21(DE3)感受态中，转化产物涂布于含卡那霉素(50μg·mL-1)的LB固体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水中，加入15g琼脂粉)上，37℃倒置培养过夜，直至长出单克隆。挑取单克隆转接于10mL含卡那霉素(50μg·mL-1)的LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养，按1∶100比例转接入100mL含卡那霉素(50μg·mL-1)的LB液体培养基中，至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，18℃，160rpm诱导培养18小时。
取1.5mL诱导后的菌液，12000rpm，离心1min收集菌体。加入100μL双蒸水重悬菌体沉淀，菌体悬浮液采用超声破碎法破碎(超声3s，停3s，总共超声破碎2min)。破碎液通过12000rpm，离心2min。而后取40μL上清，加入10μL的5×loading buffer，100℃水浴5min。取6μL处理好的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝显色(图4)，结果显示在25kDa附近有一较强的蛋白条带，该条带的大小等于MAT加上其N末端融合的一段pET-28a(+)序列表达的肽段之和。在对照组相应位置则未观察到该条带，表明MAT蛋白在大肠杆菌中成功表达。
实施例4重组MAT蛋白的纯化和定量
E.coli[pET28a-MAT]在18℃，160rpm条件下，经0.2mM IPTG诱导培养18h后，利用大型高速离心机，在6566rpm、4℃的条件下离心6min，收集菌体。用适量(1L菌液约加入30mL的buffer)的磷酸盐缓冲液(pH 8.0，20mM Na2HPO4/NaH2PO4)将低温离心后的菌体重悬，冰浴条件下超声破碎(超声5s，间歇5s，总时间40min)。大量菌体则采用高压细胞破碎仪进行破碎，在800bar压力下循环破碎3次；在10000rpm、4℃的条件下离心30min。收集破碎液上清，每升菌液破碎后的上清中加入2.5μL的重组的DNase I(RNase-free)(TaKaRa公司)，在4℃条件下过夜消化以去除核酸。而后在10000rpm，4℃的条件下再次离心30min，所得上清通过Ni胶纯化树脂柱亲和层析进行纯化。首先将处理好的蛋白上样液加入已经预平衡的Ni胶纯化树脂，使蛋白同胶结合。然后用洗脱缓冲液(pH8.0，20mM Na2HPO4/NaH2PO4，10-30mM咪唑)冲洗不能结合以及非特异性结合的蛋白。紧接着用洗脱缓冲液(pH 8.0，20mM Na2HPO4/NaH2PO4，60-300mM咪唑)将结合在Ni胶上的带有组氨酸标签的重组MAT蛋白洗脱下来，收集洗脱组分，收集的流出液即为纯化的MAT。取10μL流出液进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝显色(图5)，结果显示在25kDa附近出现单一且清晰的条带，说明纯化后蛋白样品纯度较高。
纯化后的蛋白用10kDa的超滤管进行超滤，以达到去除咪唑及浓缩蛋白的目的。超滤管首先用缓冲液平衡(pH 8.0，20mM Na2HPO4/NaH2PO4)，每次向超滤管中加入10mL纯化后的蛋白洗脱液，3800g离心15min，收集上层套管中的蛋白备用；超滤后的蛋白加入终浓度为20％的甘油，混匀后分装至EP管中，-20℃保存。通过Bradford法对纯化浓缩的MAT蛋白进行定量实验确定蛋白浓度，具体过程如下。用与待测蛋白样品一致的稀释液将标准浓度牛血清白蛋白BSA(2000μg·mL-1)用去离子水逐级稀释形成梯度浓度(1500，1000，500，250，125μg·mL-1)，取0μg·mL-1浓度为空白对照；分别取5μL稀释好的BSA标准品以及待测蛋白样品(原液或者稀释液)加入到96孔板中，再加入250μL Bradford protein Assay Peagent，每组平行重复3次，充分混匀，室温放置10min，而后用酶标仪检测595nm波长下的吸光值；以蛋白含量(μg·mL-1)为横坐标，吸光度值(A595)为纵坐标，绘制标准曲线，计算待测样品的浓度。根据获得的标准BSA蛋白的浓度方程：计算纯化后的MAT蛋白浓度为127.61mg·mL-1
实施例5 MAT催化合成乙酰辅酶A
1、液相检测
以纯化的MAT蛋白作为催化剂，建立100μL反应体系合成乙酰辅酶A。其中包括91.5μL柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0，10mM)，1.5μL的辅酶A(500mM)，5μL的双醋瑞因(100mM)和158.63μg纯化的MAT蛋白酶。反应在50℃中进行2h，而后用100μL甲醇终止反应，12000rpm离心2min，上清用0.22μL滤膜过滤，取15μL滤液进行HPLC分析。HPLC检测条件如表1所示，其中A相为95％NaH2PO4(20mM)+5％Na2HPO4(20mM)；B相为80％A相+20％乙腈，检测波长为254nm。HPLC检测结果如图6A所示，其中1为底物辅酶A标准品；2为目标化产物乙酰辅酶A标准品；3为对照组(不加MAT纯酶)；4为实验组；5为实验组与乙酰辅酶A标准品共进样组。结果表明加入MAT纯酶后，实验组中形成了和乙酰辅酶A标准品保留时间(17.516min)相同的化合物，该化合物具有和乙酰辅酶A标准品相同的紫外吸收谱(图6B)，将其命名为MAT-Acetyl-CoA。为了初步确证MAT-Acetyl-CoA是否为目标产物乙酰辅酶A，通过乙酰辅酶A标准品与实验组共进样进行检测。共进样的结果显示，实验组中的MAT-Acetyl-CoA新产物峰明显升高，表明MAT-Acetyl-CoA与乙酰辅酶A具有相同的保留时间。
表1乙酰辅酶A的HPLC检测条件
| 时间 | A相(％) | B相(％) | 流速(mL/min) |
| 0 | 97 | 3 | 1 |
| 5 | 82 | 18 | 1 |
| 7.5 | 72 | 28 | 1 |
| 12.5 | 60 | 40 | 1 |
| 18 | 58 | 42 | 1 |
| 19 | 3 | 97 | 1 |
| 20 | 97 | 3 | 1 |
| 25 | 97 | 3 | 1 |
2、液质检测
在此基础上，对实验组中的新产物MAT-Acetyl-CoA进行了制备，并通过高分辨一级液质(HPLC-HRMS)和高分辨二级质谱(HRMS-HRMS)确认该化合物的结构。HPLC-HRMS结果(图7A)显示该化合物在负模式的条件下其[M-H]-离子的质荷比m/z为808.05267，与乙酰辅酶A标准化合物相符。进一步通过HRMS-HRMS结果(图7C)对该产物的裂分方式进行推断，如图7B所示，MAT-Acetyl-CoA的裂分方式与乙酰辅酶A标准品相同，在两种可能的断裂方式下，根据其离子碎片的质荷比m/z均可推测乙酰基的修饰位点为辅酶A的巯基基团。
综合以上分析，可以确证实验组中的新产物MAT-Acetyl-CoA即为乙酰辅酶A。表明在MAT的催化下，双醋瑞因是一个有效的酰基供体，以辅酶A为酰基受体时，可成功地合成乙酰辅酶A。
实施例6 MAT酶促合成乙酰辅酶A最适反应条件测定
1、MAT酶促合成乙酰辅酶A最适温度的确定
为了研究温度对MAT合成乙酰辅酶A功能的体外酶促反应影响，设计了6个平行反应温度梯度：20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，其中每组均设有3个平行样品。
取1.5mL EP管，建立100μL反应体系，包括91.5μL的柠檬酸盐缓冲液(pH 5，10mM)，1.5μL辅酶A(500mM)，5μL双醋瑞因(100mM)，158.63μg纯化的MAT蛋白酶，50℃中反应2h，快速加入100μL甲醇终止反应，上清用0.22μL滤膜过滤，吸取15μL的反应液进行HPLC-UV检测，HPLC条件如表1所示。结果表明(图8A)，MAT催化合成乙酰辅酶A的最适温度为50℃。相比于较低的温度(20-40℃)，适当的高温有助于MAT展现出更好的催化活性。
2、MAT酶促合成乙酰辅酶A最适温度的确定
为了研究pH对MAT合成乙酰辅酶A功能的体外酶促反应影响，设计了5个平行反应pH梯度：3、4、5、6、7，其中每组均设有3个平行样品。其中pH＝3-5为10mM的柠檬酸盐缓冲液，pH＝6-7为20mM的磷酸盐缓冲液。
取1.5mL EP管，建立100μL反应体系，包括91.5μL不同pH的反应缓冲液，1.5μL辅酶A(500mM)，5μL双醋瑞因(100mM)，158.63μg纯化的MAT蛋白酶，50℃中反应2h，快速加入100μL甲醇终止反应，上清用0.22μL滤膜过滤，吸取15μL的反应液进行HPLC-UV检测，HPLC条件如表1所示。结果表明(图8B)，MAT催化合成乙酰辅酶A的最适pH为5，且该反应具有较强的pH敏感度，在非最适pH的条件下，其反应效率降至最佳值的50％以下。此外，碱性条件不适合MAT活性发挥，当pH大于7时，其乙酰辅酶A合成效率几乎为零。在最适pH(pH 5.0)和最适温度(50℃)，对MAT催化乙酰辅酶A合成的酶促动力学参数进行了测定(表2)。从表中可以看出，MAT对酰基供体双醋瑞因的Km值明显低于辅酶A水合物的Km值，表明MAT对双醋瑞因的亲和力高于辅酶A水合物。
表2 MAT催化乙酰辅酶A合成的酶促动力学参数
| 底物 | Km(μM) | Vmax(μM/min) |
| 辅酶A | 188.80±44.33 | 2.29±0.32 |
| 双醋瑞因 | 98.78±11.16 | 7.73±0.24 |
3、MAT酶促合成乙酰辅酶A的最佳供受体浓度(比例)的确定
为提高乙酰辅酶A的合成产量，探索了供受体摩尔比对转化效率的影响。首先，配置不同浓度的双醋瑞因母液：10mM，20mM，40mM，60mM，100mM，140mM，200mM，300mM，400mM，600mM。当浓度大于等于140mM时，双醋瑞因的母液呈现混悬液的状态。在最适pH和温度下，建立100μL的反应体系，固定辅酶A水合物的终浓度为7.5mM，添加91.5μL浓度为10mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH＝5.0)，5μL的双醋瑞因(终浓度为0.5mM-30mM)，158.63μg(约2μL)纯化的MAT蛋白酶，50℃中反应2h，而后用100μL甲醇终止反应，12000rpm离心2min，上清用0.22μL滤膜过滤，取15μL滤液进行HPLC分析。如图8C所示，当双醋瑞因的终浓度为0-4mM时，乙酰辅酶A的合成效率急剧上升，随后，进入一个缓慢的增长阶段，直到双醋瑞因的终浓度达到10mM时，即辅酶A与双醋瑞因添加量的比例为3∶4，该方法的乙酰辅酶A合成效率基本达到最大值，约为46.90％，合成产量约2847.47mg·L-1。尽管双醋瑞因的母液浓度大于等于140mM时，即终浓度为7mM后，双醋瑞因出现了部分不溶解的现象，但该反应的合成效率仍有轻微的增加，这可能是由于反应的高温条件部分促进了双醋瑞因的溶解。
综上，MAT催化合成乙酰辅酶A的最适反应条件如表3所示。
表3 MAT催化乙酰辅酶A合成的最适条件
| 酶 | 酰基受体(最佳浓度) | 酰基供体(最佳浓度) | 最佳受/供体比例 | 最适温度 | 最适pH |
| MAT | 辅酶A(7.5mM) | 双醋瑞因(10不mM) | 3∶4 | 50℃ | 5.0 |
实施例7酰基供体双醋瑞因和酰基受体辅酶A与MAT蛋白结构的分子对接模拟
1.分子对接模拟
计算软件使用MOE 2015.10版本，步骤如下：
1)MAT蛋白质模型的准备
以PDB数据库中的MAT单晶结构(PDB 1OCX)为模板，删去水分子。用“Quickprep”功能完成结构修正，加氢以及加局部电荷，以Amber10∶EHT为力场，gradient为0.05 RMS，其他值为默认值进行能量最小化优化。
2)对接配体的准备
下载配体辅酶A和双醋瑞因的PDB文件，采用MOE的“structure preparation”进行结构修正，加氢以及加局部电荷，并以Amber10∶EHT为力场，gradient为0.05RMS，进行能量最小化优化。
3)对接模拟
用Site Finder寻找活性位点，选取含His113(对应GAT的催化活性中心His115)区域且评分最高的设置为Dummy Atoms。设置对接参数：Site选择Dummy Atoms；Placement选择Triangle Matcher，评分对应选择London dG，Refinement选择Induced Fit，评分选择GBVI/WSA dG。
2、对接结果分析
酰基供体双醋瑞因和酰基受体辅酶A与MAT蛋白结构的分子对接结果如图9A所示。在活性中心附近，His113可能在乙酰基转移的过程中具有相当重要的作用。其中N1原子在催化过程中充当Bronsted碱的角色，使得辅酶A中的巯基发生去质子化。而N2原子则起到了Bronsted酸的作用，从而使双醋瑞因中A环上的乙酰基发生质子化。反应发生时，辅酶A上的巯基对双醋瑞因上的乙酰基进行亲和加成、消除，得到最终产物乙酰辅酶A。此外，根据文献报道和结构相似性，对MAT及其同家族的蛋白GAT(Galactoside acetyltransferase，accession No：NP_414876.1)进行序列比对(图10)，MAT中的His113与其同家族的蛋白GAT(1KRU)中的活性催化位点His115在结构上相对应，因此将His113作为MAT的拟定催化活性中心。进一步，对以His113位为中心的范围内的氨基酸进行初步筛选，成功筛选到5个可能对MAT活性产生影响的关键氨基酸，分别为Met101(M101)，Glu125(E125)，Pro81(P81)，Asn83(N83)和Trp137(W137)。上述候选关键位点在MAT整个催化结构腔中所处的位置如图9B所示，与MAT拟定活性中心His113的位置关系如图9C所示。根据MAT和GAT的序列比对结果(图10)，可发现Asn83和Trp137均位是较为保守的氨基酸位点。此外，尽管81位的苯丙氨酸与GAT中相应位点上的氨基酸(酪氨酸)存在差异，但同属芳香族氨基酸。因此，MAT中的Pro81，Asn83和Trp137应是结构中较为保守的氨基酸，可能与维持其催化活性具有紧密联系，但Met101和Glu125所处位置相对不保守。其中，125位谷氨酸具有较为特殊的性质，可能在一定程度上影响该催化过程的性能。一方面Glu125具有较为复杂的侧链，该侧链伸向双醋瑞因的结合腔内部，可能一定程度上妨碍了双醋瑞因进一步靠近辅酶A。另一方面，Glu125与其周围的Tyr14，Arg15以及Ser16之间形成了较强的氢键相互作用(图11A)，且如图11B所示，Glu125所在的Loop121-125和Tyr14，Arg15，Ser16所在的Loop11-18构成了双醋瑞因所在的催化结合腔的腔壁，因此其氢键相互作用可能会影响酰基供体催化结合腔的大小，进而影响双醋瑞因的进入。此外，Glu125还可能在一定程度上与双醋瑞因中A环上的乙酰基存在相互作用关系。
实施例8定向进化筛选MAT高效突变体
1、MAT候选活性位点的丙氨酸突变
为进一步提高乙酰辅酶A的合成产量，通过定向进化的方法筛选具有高效合成乙酰辅酶A功能的MAT突变体。首先，对上述5个候选关键位点进行丙氨酸扫描。利用FastMutageneis System(Transgen公司)试剂盒进行定点突变。根据试剂盒中的说明进行引物设计，每条引物均包含突变位点，5’端重叠区和3’端延伸区。以质粒pET28a-MAT为模板，以丙氨酸突变引物(SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.20)为特异性引物，通过如下程序和体系进行PCR，50μL体系中含模板pET28a-MAT 1μL，10μM的引物FET28aMAT和RET28aMAT各1μL，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25μL，ddH2O补足。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性20s，55-60℃退火20s，72℃延伸3min，共20个循环；72℃终延伸10min，4℃保温。PCR产物经DMT去甲基消化酶消化。菌落PCR筛选后，进行测序验证并获得相应突变体。
2、MAT丙氨酸突变体的催化效率比较
在上述最佳反应条件下，即pH 5.0，温度50℃，利用粗酶液对M101A，E125A，P81A，N83A和W137A突变体催化乙酰辅酶A合成的效率进行了比较。结果如图12所示，与野生型MAT相比，E125A的催化效率轻微升高，可能是由于该位点突变为体积较小的丙氨酸后，立体阻碍效应下降，从而导致了催化活性的上升。而其余的丙氨酸突变体的催化效率均维持不变或者显著下降。相对保守的氨基酸(P81，N83，W137)的催化效率则呈现大幅度下降，说明这些氨基酸位点在维持MAT催化活性方面起到关键作用。
3、定向进化筛选MAT的高效突变体
根据丙氨酸扫描结果，对MAT的E125进行饱和突变，以质粒pET28a-MAT为模板，以E125饱和突变引物(SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.58)为特异性引物，参考实施例7中的程序和体系进行PCR，选取了部分侧链较小的突变体(E125S，E125C)进一步筛选更为高效的突变体，并通过侧链分支较多的突变体(E125I)以及侧链结构较为庞大的突变体(E125W)进一步验证该位点的空间位阻对催化活性的影响。分别对MAT野生型及其突变体E125S、E125A、E125W、E125C、E125I进行纯酶催化检测，上述突变体的纯化方法参考实施例5，其催化效率的结果如图13所示，突变体E125S的催化效率最高，其次为突变体E125A，突变体E125C仅略高与野生型MAT的催化效率，而当125位的谷氨酸突变为色氨酸和异亮氨酸时，反应效率则显著下降。该实验结果说明125位氨基酸体积大小可能在一定程度上对供体的进入产生影响。进一步，如图14所示，对MAT及其突变体合成乙酰辅酶A转化效率及产量进行定量分析。在最佳反应条件下，即pH 5.0，温度50℃，供受体终浓度分别为10mM和7.5mM时，野生型MAT的转化率为45.47％，产量为2761.06mg·L-1。相比于野生型MAT，突变体E125S和E125A合成乙酰辅酶A的转化率均有不同程度的提高，其转化率分别提升至54.84％和52.03％，产量可分别达到3329.73mg·L-1和3159.02mg·L-1。
序列表
<110> 中国医学科学院药物研究所
<120> 一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶A的方法
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223> 麦芽糖-O-酰基转移酶(maltose-O-acetyltransferase,MAT)氨基酸序列
<400> 1
Met Ser Thr Glu Lys Glu Lys Met Ile Ala Gly Glu Leu Tyr Arg Ser
1 5 10 15
Ala Asp Glu Thr Leu Ser Arg Asp Arg Leu Arg Ala Arg Gln Leu Ile
20 25 30
His Arg Tyr Asn His Ser Leu Ala Glu Glu His Thr Leu Arg Gln Gln
35 40 45
Ile Leu Ala Asp Leu Phe Gly Gln Val Thr Glu Ala Tyr Ile Glu Pro
50 55 60
Thr Phe Arg Cys Asp Tyr Gly Tyr Asn Ile Phe Leu Gly Asn Asn Phe
65 70 75 80
Phe Ala Asn Phe Asp Cys Val Met Leu Asp Val Cys Pro Ile Arg Ile
85 90 95
Gly Asp Asn Cys Met Leu Ala Pro Gly Val His Ile Tyr Thr Ala Thr
100 105 110
His Pro Ile Asp Pro Val Ala Arg Asn Ser Gly Ala Glu Leu Gly Lys
115 120 125
Pro Val Thr Ile Gly Asn Asn Val Trp Ile Gly Gly Arg Ala Val Ile
130 135 140
Asn Pro Gly Val Thr Ile Gly Asp Asn Val Val Val Ala Ser Gly Ala
145 150 155 160
Val Val Thr Lys Asp Val Pro Asp Asn Val Val Val Gly Gly Asn Pro
165 170 175
Ala Arg Ile Ile Lys Lys Leu
180
<210> 2
<211> 552
<212> DNA
<213> 埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223> 麦芽糖-O-酰基转移酶(maltose-O-acetyltransferase,MAT)核苷酸序列
<400> 2
atgagcacag aaaaagaaaa gatgattgct ggtgagttgt atcgctcggc agatgagacg 60
ttatctcgcg atcgcctgcg cgctcgtcag cttattcacc gatacaatca ttccctggcg 120
gaagagcaca cattacgcca gcaaattctc gctgatctat tcggtcaggt gacagaggct 180
tatattgagc caacgtttcg ctgtgactat ggctataaca tttttctcgg taataatttt 240
ttcgccaact tcgattgcgt gatgcttgat gtctgcccta ttcgcatcgg tgataactgt 300
atgttggcac caggcgttca tatctacacg gcaacacatc ccatcgaccc tgtagcacgt 360
aatagcggtg ctgaactggg gaaacccgtc accatcggta ataacgtctg gattggcgga 420
cgcgcggtca ttaaccctgg tgtgaccatt ggtgataacg tcgtggtagc ctcaggtgca 480
gttgtcacaa aagatgtccc ggacaacgtt gtcgtgggcg gtaatccagc cagaataatt 540
aaaaaattgt aa 570
<210> 3
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAT-E125S氨基酸序列
<400> 3
Met Ser Thr Glu Lys Glu Lys Met Ile Ala Gly Glu Leu Tyr Arg Ser
1 5 10 15
Ala Asp Glu Thr Leu Ser Arg Asp Arg Leu Arg Ala Arg Gln Leu Ile
20 25 30
His Arg Tyr Asn His Ser Leu Ala Glu Glu His Thr Leu Arg Gln Gln
35 40 45
Ile Leu Ala Asp Leu Phe Gly Gln Val Thr Glu Ala Tyr Ile Glu Pro
50 55 60
Thr Phe Arg Cys Asp Tyr Gly Tyr Asn Ile Phe Leu Gly Asn Asn Phe
65 70 75 80
Phe Ala Asn Phe Asp Cys Val Met Leu Asp Val Cys Pro Ile Arg Ile
85 90 95
Gly Asp Asn Cys Met Leu Ala Pro Gly Val His Ile Tyr Thr Ala Thr
100 105 110
His Pro Ile Asp Pro Val Ala Arg Asn Ser Gly Ala Ser Leu Gly Lys
115 120 125
Pro Val Thr Ile Gly Asn Asn Val Trp Ile Gly Gly Arg Ala Val Ile
130 135 140
Asn Pro Gly Val Thr Ile Gly Asp Asn Val Val Val Ala Ser Gly Ala
145 150 155 160
Val Val Thr Lys Asp Val Pro Asp Asn Val Val Val Gly Gly Asn Pro
165 170 175
Ala Arg Ile Ile Lys Lys Leu
180
<210> 4
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAT-E125S核苷酸序列
<400> 4
atgagcacag aaaaagaaaa gatgattgct ggtgagttgt atcgctcggc agatgagacg 60
ttatctcgcg atcgcctgcg cgctcgtcag cttattcacc gatacaatca ttccctggcg 120
gaagagcaca cattacgcca gcaaattctc gctgatctat tcggtcaggt gacagaggct 180
tatattgagc caacgtttcg ctgtgactat ggctataaca tttttctcgg taataatttt 240
ttcgccaact tcgattgcgt gatgcttgat gtctgcccta ttcgcatcgg tgataactgt 300
atgttggcac caggcgttca tatctacacg gcaacacatc ccatcgaccc tgtagcacgt 360
aatagcggtg ctagcctggg gaaacccgtc accatcggta ataacgtctg gattggcgga 420
cgcgcggtca ttaaccctgg tgtgaccatt ggtgataacg tcgtggtagc ctcaggtgca 480
gttgtcacaa aagatgtccc ggacaacgtt gtcgtgggcg gtaatccagc cagaataatt 540
aaaaaattgt aa 570
<210> 5
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAT-E125A氨基酸序列
<400> 5
Met Ser Thr Glu Lys Glu Lys Met Ile Ala Gly Glu Leu Tyr Arg Ser
1 5 10 15
Ala Asp Glu Thr Leu Ser Arg Asp Arg Leu Arg Ala Arg Gln Leu Ile
20 25 30
His Arg Tyr Asn His Ser Leu Ala Glu Glu His Thr Leu Arg Gln Gln
35 40 45
Ile Leu Ala Asp Leu Phe Gly Gln Val Thr Glu Ala Tyr Ile Glu Pro
50 55 60
Thr Phe Arg Cys Asp Tyr Gly Tyr Asn Ile Phe Leu Gly Asn Asn Phe
65 70 75 80
Phe Ala Asn Phe Asp Cys Val Met Leu Asp Val Cys Pro Ile Arg Ile
85 90 95
Gly Asp Asn Cys Met Leu Ala Pro Gly Val His Ile Tyr Thr Ala Thr
100 105 110
His Pro Ile Asp Pro Val Ala Arg Asn Ser Gly Ala Ala Leu Gly Lys
115 120 125
Pro Val Thr Ile Gly Asn Asn Val Trp Ile Gly Gly Arg Ala Val Ile
130 135 140
Asn Pro Gly Val Thr Ile Gly Asp Asn Val Val Val Ala Ser Gly Ala
145 150 155 160
Val Val Thr Lys Asp Val Pro Asp Asn Val Val Val Gly Gly Asn Pro
165 170 175
Ala Arg Ile Ile Lys Lys Leu
180
<210> 6
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAT-E125A核苷酸序列
<400> 6
atgagcacag aaaaagaaaa gatgattgct ggtgagttgt atcgctcggc agatgagacg 60
ttatctcgcg atcgcctgcg cgctcgtcag cttattcacc gatacaatca ttccctggcg 120
gaagagcaca cattacgcca gcaaattctc gctgatctat tcggtcaggt gacagaggct 180
tatattgagc caacgtttcg ctgtgactat ggctataaca tttttctcgg taataatttt 240
ttcgccaact tcgattgcgt gatgcttgat gtctgcccta ttcgcatcgg tgataactgt 300
atgttggcac caggcgttca tatctacacg gcaacacatc ccatcgaccc tgtagcacgt 360
aatagcggtg ctgcgctggg gaaacccgtc accatcggta ataacgtctg gattggcgga 420
cgcgcggtca ttaaccctgg tgtgaccatt ggtgataacg tcgtggtagc ctcaggtgca 480
gttgtcacaa aagatgtccc ggacaacgtt gtcgtgggcg gtaatccagc cagaataatt 540
aaaaaattgt aa 552
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物EACYMATF
<400> 7
atgagcacag aaaaagaaaa gatg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物EACYMATR
<400> 8
ttacaatttt ttaattattc tggc 24
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物Eacy28aMATF
<400> 9
caaatgggtc gcggatccga attcatgagc acagaaaaa 39
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物Eacy28aMATR
<400> 10
ctcgagtgcg gccgcaagct tttacaattt tttaat 36
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-F81AF
<400> 11
ctcggtaata attttgcggc caacttcgat 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-F81AR
<400> 12
cgcaaaatta ttaccgagaa aaatgttata 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-N83AF
<400> 13
aataattttt tcgccgcgtt cgattgcgtg 30
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-N83AR
<400> 14
gcacagttat caccgatgcg aataggg 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-M101AF
<400> 15
atcggtgata actgtgcgtt ggcacca 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-M101AR
<400> 16
gcacagttat caccgatgcg aataggg 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT- W137AF
<400> 17
atcggtaata acgtcgcgat tggcgga 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT- W137AR
<400> 18
gcgacgttat taccgatggt gacgggt 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125AF
<400> 19
gtaatagcgg tgctgcgctg gggaaac 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125AR
<400> 20
cgcagcaccg ctattacgtg ctacagg 27
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125FF
<400> 21
cgtaatagcg gtgcttttct ggggaaac 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125FR
<400> 22
aaaagcaccg ctattacgtg ctacaggg 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125YF
<400> 23
cgtaatagcg gtgcttatct ggggaaac 28
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125YR
<400> 24
ataagcaccg ctattacgtg ctacaggg 28
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125WF
<400> 25
cgtaatagcg gtgcttggct ggggaaac 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125WR
<400> 26
ccaagcaccg ctattacgtg ctacaggg 28
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125SF
<400> 27
cgtaatagcg gtgctagcct ggggaaac 28
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125SR
<400> 28
gctagcaccg ctattacgtg ctacaggg 28
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125TF
<400> 29
cgtaatagcg gtgctaccct ggggaaac 28
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125TR
<400> 30
ggtagcaccg ctattacgtg ctacaggg 28
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125CF
<400> 31
cgtaatagcg gtgcttgcct ggggaaac 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125CR
<400> 32
gcaagcaccg ctattacgtg ctacaggg 28
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125MF
<400> 33
cgtaatagcg gtgctatgct ggggaaac 28
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125MR
<400> 34
catagcaccg ctattacgtg ctacaggg 28
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125NF
<400> 35
cgtaatagcg gtgctaacct ggggaaac 28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125NR
<400> 36
gttagcaccg ctattacgtg ctacaggg 28
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MAT-E125QF
<400> 37
cgtaatagcg gtgctcagct ggggaaac 28
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MAT-E125QR
<400> 38
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<213> 人工序列
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<223> 正向引物MAT-E125DF
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tagcaccgct attacgtgct acaggg 26
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<400> 56
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Claims (6)
1.一种乙酰辅酶A的合成方法，其特征在于，
a)麦芽糖-O-酰基转移酶或其突变体为生物催化剂；
b)双醋瑞因为供体底物；
c)辅酶A为受体底物；
d)麦芽糖-O-酰基转移酶催化辅酶A和双醋瑞因合成乙酰辅酶A；
所述麦芽糖-O-酰基转移酶MAT，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1，核苷酸序列选自SEQID NO.2；
所述麦芽糖-O-酰基转移酶突变体选自MAT-E125S，其氨基酸序列选自SEQ IDNO.3，核苷酸序列选自SEQ ID NO.4；
所述麦芽糖-O-酰基转移酶突变体选自MAT-E125A，其氨基酸序列选自SEQ IDNO.5，核苷酸序列选自SEQ ID NO.6；
所述双醋瑞因供体的分子结构式如下：
所述辅酶A受体的分子结构式如下：
所述乙酰辅酶A的分子结构式如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成乙酰辅酶A是在酶催化体系中进行的，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为1:4～15:1；反应温度为30～70℃；反应pH为4～6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，合成乙酰辅酶A或在体外以非细胞形式进行，或以全细胞转化的形式进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的全细胞选自大肠杆菌。
5.一种含有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的宿主细胞选自大肠杆菌。
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