CN109402188B - 一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来自短小芽孢杆菌的ω‑转氨酶及在生物胺化中的应用，属于生物工程技术领域。本发明首次从Bacillus pumilus W3中分离、鉴定了ω‑转氨酶基因，并选用大肠杆菌重组表达系统生产密码子优化后的ω‑转氨酶能大幅提高其产量，使更易达到工业化应用要求。本发明发现该ω‑转氨酶以(R)‑α‑phenethylamine为底物时，最适作用pH为7.0，最适作用温度为45℃；同时，该R‑ω‑转氨酶pH稳定性及温度稳定性都非常好，对实验组(以(R)‑α‑phenethylamine为底物)的催化活性优于对照组(以(S)‑α‑phenethylamine为底物)，表明该重组ω‑转氨酶具有很好选择性合成R‑手性胺的功能，具有较大应用潜力。

Description

一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用

技术领域

本发明涉及一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

转氨酶(aminotransferase，transaminase)属于转移酶类，通常用于催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物。普遍存在于动物，植物组织和众多微生物中。其中，心肌、脑、肝、肾等动物组织以及绿豆芽中转氨酶含量较高。人体内转氨酶含量的提高往往导致肥胖症及代谢综合症，最终导致脂肪肝的形成。转氨酶在生物催化反应中参与氨基酸的分解和合成，它催化某一氨基酸的α-氨基转移到另一α-酮酸的酮基上，生成相应的氨基酸，同时具有一定的选择性，原来的氨基酸则转变成α-酮酸。转氨酶还参与许多代谢途径，包括维生素合成，碳氮吸收，次级代谢等。例如天冬氨酸转氨酶(AspAT)是转氨酶家族中最先被提纯出来进行科学研究的，它有被称为谷草转氨酶，用于研究V_B6在氮代谢过程中的作用。转氨酶分为R和S两种类型，因S型选择性的转氨酶远丰富于R型选择性，因此它们有更多的结构信息可供参考，研究也更广泛。

转氨酶是辅酶5-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型，其催化反应是可逆的，在反应过程中PLP和5-磷酸吡哆胺(PMP)会相互进行转换。转氨酶的底物并不专一，因此可以用一种转氨酶合成各式各样的氨基酸。转氨酶对作为氨基供体的不同氨基酸底物的催化活性相差巨大，不同底物的酶活可能相差数个数量级，其命名主要是根据其催化活力最大的氨基酸来决定，比如天冬氨酸转氨酶即对天冬氨酸的催化活力最大，苯丙氨酸转氨酶的氨基供体最适底物为苯丙氨酸。转氨酶催化的不对称反应是合成手性氨基酸的一种重要途径。根据不同可变区的差异，将文献报道的不同来源的转氨酶的蛋白质序列进行比较和聚类分析，再根据亲水位点的叠加和迭代对比，我们可以将转氨酶分为4类。其中ω-转氨酶属于第二亚族，常用于制备手性胺及非天然氨基酸，如β-氨基酸。因为ω-转氨酶的大口袋结合区域比天冬氨酸转氨酶(AspATs)和芳香族转氨酶(AroATs)稍大，所以它可能能够结合比天然氨基酸体积较大的底物。与其他转氨酶一样，ω-转氨酶能够可逆的催化氨基由供体化合物转移至受体化合物的反应。通常情况下，转氨酶被定义为一类酶，在所催化氨基转移反应中，在底物和产物中，至少有一个不是α-氨基酸或者α-酮酸。在“ω-转氨酶”这个惯用名中，希腊字母“ω”与羰基的位置没有关系，它仅仅代表不是α位。目前，已经有很多野生菌株被发现ω-转氨酶的存在，例如弧菌(Vibrio fluvialis)，色杆菌(Chromobacterium violaceum)，球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，节杆菌(Arthrobacter sp.)等。与S型ω-转氨酶相比，R型ω-转氨酶的起步较晚。随着转氨酶在合成手性胺的应用越来越多，资源相对缺乏的R型ω-转氨酶受到了越来越多的关注。目前，对于R型ω-转氨酶的研究主要有以下几个方面：寻找R型ω-转氨酶的资源；对现有R型ω-转氨酶进行结构改造；ω-转氨酶反应过程研究及条件优化；以及R型ω-转氨酶底物特异性研究。

总结最近的几年国内外转氨酶在手性化合物合成中的研究进展，发现，手性制药工业迅速发展壮大，单一对映体药物每年以大于20％的增长率突飞猛进。目前，大约超过70％的药物都是手性胺或者是手性胺的衍生物，包括神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等。例如抗痉挛药物GABA(γ-aminobutyric acid)可用其对应的GABA转氨酶制得；抗糖尿病新药Januvia的主要成分西他列汀是R-型胺。因此，对于手性胺的需求也随之增长，而可以催化合成手性胺的转氨酶则成为现在研究的热点。此外，芳香族转氨酶可用于氨基酸的酶降解，在乳酪风味生产中扮演了重要的角色；谷氨酰胺转氨酶将赖氨酸引入到蛋白质中，可用于改善蛋白质的营养特性。目前，转氨酶在不对称合成手性胺类化合物与外消旋手性胺类化合物的拆分中，均为重要的生物技术酶。第一个使用ω-转氨酶进行不对称合成，是利用移除产物的方法使反应平衡向有利的方向移动。利用ω-转氨酶进行不对称合成的技术不断进步，使得ω-转氨酶在合成手性胺的应用中占据了非常重要的位置。

转氨酶催化的反应主要有不对称合成和动力学拆分。1.不对称合成，是指在合适的氨基供体(如异丙胺，L-丙氨酸)存在下，转氨酶催化前手性酮生成相应的手性胺的过程。2.动力学拆分，是指在合适的氨基受体(如苯乙酮)存在下，转氨酶催化外消旋胺生成光学纯手性胺的过程。相比较两种方法，第一种方法优于第二种方法，显著优点在于它的理论产率为100％，而外消旋体拆分的理论产率最高只有50％。利用酶催化合成手性胺类化合物，不仅可以大大的提高产率，还可以避免原料的浪费，以制得大量的光学纯度较高的手性胺类化合物。ω-转氨酶不仅可以应用于对外消旋体的拆分，还可以催化前体酮底物不对称合成手性胺类化合物。ω-转氨酶在制备手性胺类化合物范围较广，因此更具有应用价值。

近年来，一系列ω-转氨酶的基因得到克隆并应用于手性胺的制备。目前应用最广泛的商业化ω-转氨酶来自Vibrio fluvialis。通过富集培养或同源建模得到的突变体减少了对副产物酮的敏感性，扩大了酶的底物范围。来源于Chromobacterium violaceumDSM30191的ω-转氨酶和Vibrio fluvialis的ω-转氨酶的蛋白质序列相似度为38％，并且两者都对芳香胺显示较高的活性。此外，来自C.violaceum和Pseudomonas aeruginosa的ω-转氨酶对二羟基丙酮显示一定的活性，通常其他的ω-转氨酶不能接受这样的受体。通常情况下，和来自于Bacillus megaterium和Alcaligenes denitrificans Y2k-2的ω-转氨酶一样，以上这些转氨酶主要用于消旋胺的拆分。另外，来自Arthrobacter citreus的热稳定性ω-转氨酶已经得到鉴定并得到专利保护。自然界中还有很多ω-转氨酶未被发现。然而，在已经发现的ω-转氨酶中，这些酶通常只有一个天然底物，例如以牛磺酸，2-氨基乙基磷酸酯，β-丙氨酸，赖氨酸。至今很少有在短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)中发现ω-转氨酶，并将其应用在手性胺的不对称催化合成中。

芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，是一些重要工业酶制剂(如：淀粉酶，碱性蛋白酶)的生产菌种，能形成芽孢，而子囊中只有一个芽孢。除个别种如炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)外，其它都对人畜无毒。迄今为止，国内外有关短小芽孢杆菌ω-转氨酶编码序列和制备方法的报道还未见。因此，研究新型短小芽孢杆菌ω-转氨酶基因并实现规模化生产具有重要研究意义和应用价值。

发明内容

本发明通过对已全基因组测序的短小芽孢杆菌(Genbank:CP011150.1)来源的所有转氨酶基因序列进行分析，与已经报道的来自节杆菌属Arthrobacter sp.KNK 168(Genbank:AB638718.1)中的ω-转氨酶基因相比对，从中筛选获得与其同源性最高的ω-转氨酶基因序列，并发现其与节杆菌属Arthrobacter sp.KNK 168(Genbank:AB638718.1)来源的ω-转氨酶基因序列的相似性仅为24.7％，并验证了其ω-转氨酶功能与应用价值。本发明的ω-转氨酶基是来源于Bacillus pumilus的R型ω-转氨酶，可以选择性催化并可以手性合成手性胺，比如R-苯乙胺。

本发明的第一个目的是提供一种能够催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的酶，所述酶的氨基酸序列含有：

1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或者

2)在1)限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的活性的酶的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述酶为转氨酶。

在一种实施方式中，所述转氨酶为ω-转氨酶。

在一种实施方式中，所述酶的核苷酸序列含有SEQ ID NO.2所示的序列。

在一种实施方式中，所述酶的核苷酸序列含有SEQ ID NO.3所示的序列。由于短小芽孢杆菌来源的SEQ ID NO.2所示的ω-转氨酶基因产量很低，为实现在大肠杆菌中表达及高效表达，对其原始序列进行了密码子优化，得到了如SEQ ID NO.3所示的序列。

本发明的第二个目的是提供含有所述酶的编码基因的蛋白、表达载体或克隆载体、转基因细胞系、基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供表达所述酶的表达载体或克隆载体、转基因细胞系、基因工程菌。

在一种实施方式中，所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌基因工程菌，是以大肠杆菌BL21或Top10为宿主构建得到的，优选地，宿主为大肠杆菌BL21。

在一种实施方式中，所述表达载体pColdⅡ、pColdⅠ或pUC19。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌基因工程菌，是以pColdⅡ构建重组表达载体、以大肠杆菌BL21为宿主而构建得到的。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌基因工程菌的构建方法包括：

(1)提取短小芽孢杆菌Bacillus pumilus W3(Genbank:CP011150.1)的基因组DNA，以所获得基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增并得到ω-转氨酶基因；

(2)选取大肠杆菌表达载体pColdⅡ，将扩增得到的ω-转氨酶基因连接到表达载体上，构建重组表达载体pColdⅡ-ota3，将重组表达质粒pColdⅡ-ota3转化大肠杆菌BL21，筛选阳性转化子并测序验证。

本发明的第四个目的是提供一种利用所述重组菌生产酶的方法。

在一种实施方式中，所述方法包括：将电转化线性化重组表达质粒pColdⅡ-ota3的阳性重组大肠杆菌BL21/pColdⅡ-ota3在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.4mM isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)，诱导表达24h，转速200rpm。

本发明的第五个目的是提供一种催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，所述方法包括利用酶，或者表达所述酶的表达载体或克隆载体、或者表达所述酶的转基因细胞系、或者表达所述酶的基因工程菌；所述酶的氨基酸序列含有：

1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或者

2)在1)限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的活性的酶的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述催化是可逆催化。

在一种实施方式中，所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括动力学拆分制备或不对称合成制备α/β-非天然氨基酸的方法。

在一种实施方式中，所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括用于制备脂肪族和芳香族β-非天然氨基酸的方法。

在一种实施方式中，所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括用于制备手性胺和手性氨基酸。

本发明的第六个目的是提供一种合成/转化手性胺的方法，包括利用如下任意一种或多种：本发明的ω-转氨酶、编码本发明的ω-转氨酶的基因、含有所述ω-转氨酶的编码基因的蛋白、含有所述ω-转氨酶的编码基因的表达载体或克隆载体、含有所述ω-转氨酶的编码基因的转基因细胞系、含有所述ω-转氨酶的编码基因的基因工程菌。

在一种实施方式中，所述合成/转化手性胺的底物为(R)-α-phenethylamine。

在一种实施方式中，所述合成/转化，是在含有底物(R)-α-phenethylamine的环境下，在pH为6-8，温度为30-50℃的条件下进行合成/转化。

在一种实施方式中，所述合成/转化环境的pH为7.0，温度为45℃。

本发明的有益效果：

本发明首次从Bacillus pumilus W3中分离、鉴定了ω-转氨酶基因。进一步地，由于Bacillus pumilus W3野生菌株的ω-转氨酶表达水平一般很低，远远达不到工业化应用要求，因此选用大肠杆菌重组表达系统生产密码子优化后的ω-转氨酶能大幅提高其产量，使更易达到工业化应用要求。本发明利用大肠杆菌BL21成功高可溶性表达获得了Bacilluspumilus W3ω-转氨酶蛋白，并对表达的ω-转氨酶蛋白进行了纯化。然后对所获得的重组酶进行了手性选择性验证，发现此酶为R-ω-转氨酶。

本发明通过对纯化获得的重组ω-转氨酶进行了最适作用pH、pH稳定性、最适作用温度及温度稳定性分析，发现该ω-转氨酶以(R)-α-phenethylamine为底物时，最适作用pH为7.0，最适作用温度为45℃；结果还显示该R-ω-转氨酶pH稳定性及温度稳定性都非常好。

本发明的重组ω-转氨酶，数据表明该重组酶对实验组(以(R)-α-phenethylamine为底物)的催化活性优于对照组(以(S)-α-phenethylamine为底物)。上述数据表明该重组ω-转氨酶具有很好选择性合成R-手性胺的功能，具有较大应用潜力。

附图说明

图1为PCR扩增的Bacillus pumilus W3R-ω-转氨酶基因ota3；M:DL15,000Marker；1:R-ω-转氨酶基因ota3。

图2为本发明实施例2的利用“同源建模”法预测及其软件分析的Bacilluspumilus W3R-ω-转氨酶功能结构图示；

图3为本发明实施例3的pColdⅡ-ota3酶切鉴定图；

图4为本发明实施例3的pColdⅡ-ota3粗酶及纯酶的SDS-PAGE电泳结果图。

图5为纯化的Bacillus pumilus W3重组R-ω-转氨酶最适作用pH和pH稳定性分析。

图6为纯化的Bacillus pumilus W3重组R-ω-转氨酶最适作用温度和温度稳定性分析。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1 Bacillus pumilusω-转氨酶基因的获得

首先提取Bacillus pumilus W3的全基因DNA，并根据ω-转氨酶基因序列设计特异性引物。

以Bacillus pumilus W3的全基因DNA为模板，FWD-ota和REW-ota为引物进行PCR后，得到915bp的产物片段，将产物进行测序后，在NCBI比对后，发现其与Bacillus pumilusW3ω-转氨酶基因(Sequence ID：MH196528)的序列为一致，该序列ID预计要2019年5月才会在NCBI上进行公开。

其中，设计引物FWD-ota(序列如SEQ ID NO.4所示)和REW-ota(序列如SEQ IDNO.5所示)，利用PCR向Bacillus pumilus W3ω-转氨酶的DNA编码框5’和3’两侧分别引入XhoI和PstI限制性酶切位点(不带信号肽)，下划线为酶切位点，酶切位点为保护碱基，有效序列为酶切位点后序列；

FWD-ota：5'-GCCG CTCGAGAAGGAACAGTGGATCTTTTTAAACG-3'，

REW-ota：5'-GCCG TGCAGTGCTTGCGTGAATGTTCTCATCGGTA-3'

表1 PCR反应体系

试剂	使用量
		Primer Front(10mm)	1μl
Primer Reverse(10mm)	1μl
		5×PCR buffer	10μl
dNTP(各2.5μmol)	4μl
		PrimeSTAR HS DNA Polymerase	0.5
B.pumilus W3 genome	1μl

补水至50μL。反应体系可按需求相应放大。

反应条件：95℃,3min预变性；98℃,10s，退火，53℃,15s，变性，72℃,1min，延伸，第二步到第四步进行30个循环；72℃,5min；12℃。电泳检测PCR扩增产物，获得大小为915bp的DNA片段(见图1)，利用omega公司提供的凝胶纯化试剂盒纯化目的DNA片段，即可获得带有A尾的目的DNA。

表2连接体系

成分	使用量
		带A尾的PCR产物	4.5μl
pMD-19T	0.5μl

混匀后，加入5μl solution I，16℃连接18h。

转化

取10μl连接产物加入感受态细胞DH5α中，置于冰上30min，42℃热激90s后立即放在冰上，放置2min后，加入1ml不含抗生素的LB培养基，37℃摇床培养1h，将转化的菌液涂于LB(Amp)蓝白板上，37℃培养过夜。在平板上分别挑取多个菌落做PCR鉴定。

质粒提取

用omega公司的质粒抽提试剂盒提取PCR鉴定为阳性的克隆质粒，经核酸测序获得短小芽孢杆菌ω-转氨酶蛋白编码基因的核酸序列。该蛋白的核酸序列及蛋白序列见SEQID NO.2和SEQ ID NO.1。

根据大肠杆菌表达的特点，对得到的基因序列做选择性改造，优化后的基因序列如SEQ ID NO.3所示，优化后的序列由生物公司合成。

实施例2

利用“同源模建”法获得Bacillus pumilus W3ω-转氨酶晶体预测结构及其与节杆菌属Arthrobacter sp.KNK 168ω-转氨酶的氨基酸相似性。

短小芽孢杆菌ω-转氨酶基因ota3全长为915bp，其中预测的新蛋白的开放阅读框位于30-915位核苷酸，编码304个氨基酸残基，分子量大小为33.4kDa。

将Bacillus pumilusω-转氨酶的氨基酸序列提交SWISS-MODEL蛋白质在线模建服务器(http://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模，随后利用Discovery studio软件对短小芽孢杆菌ω-转氨酶蛋白同源建模结构分析(见图2)：该蛋白同源建模的模板为5e25.1.A，和模板之间的序列同源相似性为51.21％。

从筛选获得的短小芽孢杆菌中调取获得短小芽孢杆菌ω-转氨酶基因序列与节杆菌属Arthrobacter sp.KNK 168(Genbank:AB638718.1)来源的ω-转氨酶进行基因序列同源比对，发现基因序列的同源性仅为24.7％。

实施例3短小芽孢杆菌ω-转氨酶原核表达载体的构建，重组表达及其蛋白表达

1、原核表达载体的构建

(1)引物设计：从信号肽之后的成熟肽序列开始起设计引物(如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示)

(2)PCR反应，以克隆载体pMD-19T-ota3为模板，62℃退火，35cycles。

(3)XhoI和PstI双酶切ota3的PCR产物和质粒pColdⅡ。

表3双酶切体系

成分	使用量
		纯化PCR产物/质粒	30μl
10*quitcut buffer	5μl
		QuitCut SnaBI	1μl
QuitCut NotI	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	13μl
总体积	50μl

37℃酶切2hr

(4)如常规方法连接，转化，并进行双酶切鉴定(见图3)

图中1,2号克隆为阳性pColdⅡ-ota3质粒双酶切图(XhoI，PstI)，M为10000bp的Marker；对这个克隆抽提质粒，从AOX3和AOX5两端进行全长测序，进一步验证了插入的目的基因的正确性。

2、重组pColdⅡ-ota3在大肠杆菌BL21中的表达

1)转化大肠杆菌及阳性转化子的筛选

据大肠杆菌表达系统操作手册，取10μl连接产物加入感受态细胞DE3中，置于冰上30min，42℃热激90s后立即放在冰上，放置2min后，加入1ml不含抗生素的LB培养基，37℃摇床培养1h，将转化的菌液涂于LB(Amp)蓝白板上，37℃培养过夜。在平板上分别挑取多个菌落做PCR鉴定。以空载体转化菌作对照，进一步验证了目的基因已经转入大肠杆菌BL21。

2)重组pColdⅡ-ota3在大肠杆菌中的诱导表达

重组大肠杆菌在25-50mL LB培养基(250mL三角瓶)中培养至OD为0.4-0.6，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.4mM isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)，诱导表达24h，转速200rpm。然后进行超声波破碎菌体并提取重组酶，同时进行培养液的SDS-PAGE和酶活测定。

3)重组酶的纯化及其SDS-PAGE凝胶电泳分析(见图4)

蛋白质纯化参考GE Healthcare指南，SDS-PAGE分析按照《分子克隆实验指南》(第三版)，使用的凝胶浓度为12.5％，上样量5-25μL。蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色。

其中native-SDS-PAGE实验步骤：

A、在5-10μl酶液中加入5-10μl样品缓冲液[0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HC1)，pH 6.8；2％SDS(重量︰体积)，10％甘油(体积︰体积)，0.01％溴酚蓝(重量︰体积)]在37℃水浴中放置5-10min，再进行上样电泳分离。注：在提取样品时，样品提取液中不加巯基乙醇是为了在电泳过程中使蛋白酶适度变性，以便在电泳结束后能恢复这些蛋白酶的活性。β-巯基乙醇：用于打开二硫键的，使蛋白质的四级或三级结构被破坏。是一种具有特殊臭味的无色透明液体，易燃、易溶于水和醇、醚等多种有机溶剂。

B、制胶与电泳：在制备分离胶的过程中加入0.2％的明胶，混合均匀后再进行灌胶，凝固后即为Gelatin-SDS-PAGE(底物胶)。“浓缩胶”的聚丙烯酰胺密度为5％，“分离胶”中聚丙烯酰胺密度为12％，厚度为1mm³。加样跑电泳。注：明胶因为是在制备凝胶时加入，所以已经交联在凝胶中，在电泳中不会在电场的作用下泳动。

C、去SDS：电泳完成后，将分离胶在复性缓冲液[2％TritonX-100，50mmol/LTris-HC1，pH 7.5]中浸洗2-3次，每次5-10min。

D、复性：将分离胶置于缓冲液[50mmol/L Tris-HC1，pH7.5]中在37℃下放置进行酶反应3h。

E、染色与脱色：用考马斯亮蓝染色30min，然后数小时换一次脱色液(5％乙酸+10％甲醇)，直至背景清晰。注：经染色和脱色处理的凝胶背景颜色为蓝黑色，蛋白酶反应部位颜色变浅。凝胶中呈现蛋白酶反应的区域大小和该部位的透光率与蛋白酶活性成正比。

图4中，泳道1为蛋白Marker；泳道2为密码子优化前的重组粗酶蛋白ota3的SDS-PAGE电泳图；泳道3为密码子优化后的重组粗酶蛋白ota3的SDS-PAGE电泳图；泳道4为密码子优化后的重组纯酶蛋白ota3的SDS-PAGE电泳图；泳道5为密码子优化前的重组纯酶蛋白ota3的SDS-PAGE电泳图。

4)酶活检测

ω-转氨酶酶活测定方法参照Gao,S.(Gao,S.,Su,Y.,Zhao,L.,Li,G.,Zheng,G.,2017.Characterization of a(R)-selective amine transaminase from Fusariumoxysporum.Process.Biochem.63,130-136.)。

取适量菌体上清液(或者纯化稀释酶液)，加入500μL磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液(100mM，pH7.0)，该缓冲液中含有20mM(R)-α-phenethylamine(or(S)-α-phenethylamine)，20mM丙酮酸钠，0.1mM pyridoxal 5’-phosphate(PLP)，混匀，45℃分别反应15min，然后加入同等量的乙酸乙酯终止反应。测定反应前后溶液在254nm处的吸光度。在上述条件下，1分钟内催化1μmol相关酮类所需要的酶量，定义为一个酶活单位(U/ml)。通过△A₂₅₄计算ω-转氨酶酶活。U/ml＝(△A/min)*(V*/rvb)；△A/min-吸光度变化；V-反应体系体积(ml)；；r-摩尔消光系数(cm²/umol)；v-样品量(ml)；b-比色杯光程(cm)，上述用量可按比例增加或减少。

经测定，重组ω-转氨酶粗酶活为1.1760U/mL，该蛋白的核酸序列及蛋白序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.1。

实施例4：纯化的Bacillus pumilus重组ω-转氨酶最适作用pH和pH稳定性分析

ω-转氨酶酶活测定方法参照Gao,S.(Gao,S.,Su,Y.,Zhao,L.,Li,G.,Zheng,G.,2017.Characterization of a(R)-selective amine transaminase from Fusariumoxysporum.Process.Biochem.63,130-136.)。

在温度45℃下，对纯化获得的重组ω-转氨酶进行了最适作用pH和pH稳定性分析。如图5所示，pH 7.0时，酶活达到了最大，为1.49±0.18U/mL；在pH6.0-8.0时，酶活残留率基本保持在80％-100％。结果表明该ω-转氨酶以(R)-α-phenethylamine为底物时，最适作用pH为7.0，pH稳定性为pH6.0-8.0。

实验结果充分表明重组pColdⅡ-ota3具有ω-转氨酶活性以及作为中性酶的优点。

实施例5：纯化的Bacillus pumilus重组ω-转氨酶最适作用温度和温度稳定性分析

ω-转氨酶酶活测定方法参照Gao,S.(Gao,S.,Su,Y.,Zhao,L.,Li,G.,Zheng,G.,2017.Characterization of a(R)-selective amine transaminase from Fusariumoxysporum.Process.Biochem.63,130-136.)。

在pH 7.0下对纯化获得的重组ω-转氨酶进行了最适作用温度及温度稳定性分析。如图6所示，45℃时，酶活达到了最大，为1.19±0.18U/mL；在温度小于50℃时，酶活残留率基本保持在20％以上。结果表明该ω-转氨酶以(R)-α-phenethylamine为底物时，最适作用温度为45℃，温度在50℃以下，酶的稳定性都非常好。

实验结果充分表明重组pColdⅡ-ota3具有合适于手性胺合成工业应用所需温度的优点。

实施例6：Bacillus pumilus重组ω-转氨酶分别对(R)-α-phenethylamine和(S)-α-phenethylamine的手性催化合成

ω-转氨酶可以分为R-ω-转氨酶和S-ω-转氨酶，不同类型的ω-转氨酶可以催化的底物类型不同，因此可以产生具有不同光学特性的产物。本实验分别以(R)-α-phenethylamine和(S)-α-phenethylamine为氨基供体，丙酮酸钠为氨基受体，检测所获得的重组酶对其的催化能力，从而判断该酶是属于哪种类型的ω-转氨酶，以确定其在手性胺工业合成中的应用。

手性合成催化实验：取适量纯化稀释酶液，加入500μL磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液(100mM，pH7.0)，该缓冲液中含有20mM(R)-α-phenethylamine(or(S)-α-phenethylamine)，20mM丙酮酸钠，0.1mM pyridoxal 5’-phosphate(PLP)，混匀，45℃分别反应15min，然后加入同等量的乙酸乙酯终止反应。12,000×g离心1min，取上层有机相，0.22μm滤膜过滤，进行高效液相(HPLC)检测，检测产物为苯乙酮。

检测条件：

柱子：Agilent C18column(250*4.6mm,Agilent,USA)；流动相：乙腈/水(50/50,v/v)；流速：0.6mL/min；检测波长：254nm。

表4

	对照样	试验样
			手性催化合成	(S)-phenethylamine	(R)-phenethylamine

对照样：以(S)-phenethylamine为底物，在上述反应条件下检测ω-转氨酶对其的催化能力。

试验样：以(R)-phenethylamine为底物，在上述反应条件下检测ω-转氨酶对其的催化能力。

数据表明该重组酶对实验组(以(R)-α-phenethylamine为底物)的催化活性优于对照组(以(S)-α-phenethylamine为底物)。上述数据表明该重组ω-转氨酶具有很好选择性合成R-手性胺的功能，具有较大应用潜力(见表5)。

表5

实施例7：ω-转氨酶的应用

本发明分离、鉴定了ω-转氨酶基因，其应用包括：

(1)ω-转氨酶催化制备手性胺

可以使用ω-转氨酶通过三种反应(a.动力学拆分；b.从前体酮的不对称合成；c.外消旋胺的去消旋化)来合成光学纯的手性胺。其代表就是转化(R)-或者(S)-苯乙胺，这也是检测ω-转氨酶活性的标准底物。

(2)ω-转氨酶催化制备非天然氨基酸

由于医药、日化、食品、化工和农业的大量需求，非天然氨基酸的工业化生产变得越来越重要。氨基酸的传统生产方法是发酵，但是使用发酵的方法生产非天然氨基酸尚未有可行的报道。在众多使用生物催化剂生产非天然氨基酸的方法中，转氨酶催化法是效果最好的。ω-转氨酶已经越来越多的被用于动力学拆分制备或不对称合成制备α/β-非天然氨基酸。

非天然氨基酸L-高丙氨酸就是使用ω-AT-Vf催化2-氧代丁酸和苯甲胺之间的转氨反应制备的。使用α/ω-转氨酶耦合的方法可以同时制备(S)-氨基酸和(R)-胺，已有三对耦合反应：AlaAT/ω-AT，TyrAT/ω-AT和AspAT/ω-AT用于(S)-氨基酸，如(S)-苯丙氨酸，(S)-高苯丙氨酸和(S)-天冬氨酸等的生产。

β-氨基酸主要用于合成抗生素类药物、酶制剂和其他具有药理学性质的化合物。ω-转氨酶已经成功的用于制备脂肪族和芳香族β-非天然氨基酸。来源A.denitrificansY2K-2的ω-转氨酶可用于生产D-β-氨基-正丁酸。随后发现的ω-AT-Po可用于拆分5种外消旋β-芳香族氨基酸：3-氨基-3-苯基丙酸，3-氨基-3-(4-氟苯基)丙酸，3-氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸，3-氨基-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙酸和3-氨基-3-苯丙二氧杂环戊烯-5-丙酸。

此类转氨酶成为了制备手性胺和手性氨基酸的重要酶。

ω-转氨酶的应用方向，还可以参见如下文献：

[1]Truppo M D,Rozzell J D,Moore J C,et al.Rapid screening and scale-up of transaminase catalysed reactions[J].ORGANIC&BIOMOLECULARCHEMISTRY.2009,7(2):395-398.

[2]Cho B K,Cho H J,Yun H,et al.Simultaneous synthesis ofenantiomencally pure(S)-amino acids and(R)-amines using alpha/omega-aminotransferase coupling reactions with two-liquid phase reaction system[J].JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B-ENZYMAT1C.2003,26(3-6):273-285.

[3]郭跃平，应向贤，赵冉冉，等.酶法制备手性芳香胺化合物的研究进展[J].化工进展.20l0(04):728-732.

[4]Bea H S,Park H J,Lee S H,et al.Kinetic resolution of aromaticbeta-amino acids by omega-transaminase[J].CHEMICAL COMMUNICATIONS.2011,47(20):5894-5896.

[5]Shin J S,Kim B G.Transaminase-catalyzed asymmetric synthesis of 1-2-aminobutyric acid from achiral reactants[J].BIOTECHNOLOGY LETTERS.2009,31(10):1595-1599.

[6]Leuchtenberger W,Huthmacher K,Drauz K.Biotechnological productionof amino acids and derivatives:current status and prospects[J].APPLIEDMICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY.2005,69(1):1-8.

[7]Schmid A,Dordick J S,Hauer B,et al.Industrial biocatalysis todayand tomorrow[J].NATURE.2001,409(6817):258-268.

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> Bacillus pumilus

<400> 1

Met Glu Asp Gln Lys Glu Gln Trp Ile Phe Leu Asn Asp Glu Leu Val

1 5 10 15

Lys Lys Glu Asp Ala Lys Ile Ser Val Tyr Asp His Gly Phe Leu Tyr

20 25 30

Gly Asp Gly Val Phe Glu Gly Ile Arg Val Tyr Asn Gly Asn Ile Phe

35 40 45

Arg Met Lys Glu His Leu Asp Arg Leu Tyr Asp Ser Ala Arg Ser Ile

50 55 60

Met Leu Asn Ile Pro Tyr Ser Leu Glu Glu Leu Thr Glu Lys Met Ile

65 70 75 80

His Thr Val Glu Arg Asn Gly Leu Lys Asp Ala Tyr Ile Arg Leu Val

85 90 95

Val Ser Arg Gly Ala Gly Asp Leu Gly Leu Asp Pro Asn Asn Cys Gly

100 105 110

Arg Ala Asn Thr Val Ile Ile Val Glu Pro Leu Ala Ile Phe Pro Lys

115 120 125

His Leu Tyr Glu Thr Gly Ile Asp Ile Val Thr Val Pro Thr Arg Arg

130 135 140

Asn Arg Pro Asp Val Leu Ser Pro Lys Val Lys Ser Leu Asn Tyr Leu

145 150 155 160

Asn Asn Ile Leu Val Arg Ile Glu Ala His Met Ala Gly Val Ser Glu

165 170 175

Ala Leu Met Leu Asn Asp Gln Gly Tyr Val Ala Glu Gly Ser Ala Asp

180 185 190

Asn Val Phe Ile Tyr Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Thr Pro Pro Gly Tyr

195 200 205

Ile Gly Ala Leu Glu Gly Ile Thr Arg Asn Ala Ile Met Glu Ile Ala

210 215 220

Glu Asp Leu Gly Tyr Glu Val Lys Glu Glu Pro Phe Thr Arg His Asp

225 230 235 240

Val Tyr Thr Ala Glu Glu Val Phe Leu Thr Gly Thr Ala Ala Glu Val

245 250 255

Ile Ala Val Val Lys Val Asp Gly Arg Met Ile Gly Glu Gly Lys Pro

260 265 270

Gly Phe His Thr Asn Lys Leu Leu Glu Gln Phe Arg Lys Arg Val Val

275 280 285

Glu Glu Gly Glu Lys Val Val Phe Thr Asp Glu Asn Ile His Ala Ser

290 295 300

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> Bacillus pumilus

<400> 2

atggaagacc aaaaggaaca gtggatcttt ttaaacgatg aactcgtgaa aaaagaggat 60

gcgaaaattt cagtttatga tcatggcttc ttatatggtg acggtgtgtt cgaaggaata 120

cgtgtatata acggaaatat ctttcgaatg aaagaacatt tagaccgcct gtatgattcc 180

gctagatcca ttatgctgaa cattccatat tcacttgagg agctcactga aaaaatgatt 240

catacagttg aaaggaacgg cctaaaagat gcctatatcc gccttgttgt ctcaagagga 300

gccggtgatc ttggcttaga tccaaacaac tgcgggagag ccaacacagt gatcattgta 360

gagccgctgg ccatctttcc aaagcaccta tatgaaacag gtattgatat tgtgacagta 420

ccgacaaggc gaaatcgtcc tgacgtacta agtccaaaag tgaaatcatt aaactatttg 480

aataacattc ttgtccgaat cgaagcccat atggccggtg tcagtgaagc gctgatgctg 540

aacgatcaag ggtatgtggc tgaaggttca gcggacaacg tgtttattta taaaaaaggt 600

aagctctata caccgccagg ttatatcggc gcacttgaag gcatcacaag aaatgccatc 660

atggagattg cagaagactt aggctacgaa gtgaaagaag aacctttcac aagacatgat 720

gtgtatacgg ctgaagaagt cttcctgaca ggaaccgctg ccgaagtcat cgctgttgta 780

aaagttgacg gccgtatgat tggcgaagga aagccagggt tccacacaaa caaacttctt 840

gaacaattcc gcaagcgagt cgttgaagaa ggagaaaaag tagtctttac cgatgagaac 900

attcacgcaa gctaa 915

<210> 3

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaggatcaga aggaacagtg gatctttctg aacgatgagc tggtgaagaa ggaagacgca 60

aaaatctctg tatacgacca tgggttctta tatggcgatg gggtcttcga aggcattcgt 120

gtctacaacg gcaatatctt ccgtatgaaa gaacatttgg accgccttta cgatagcgca 180

cgtagtatta tgttgaatat cccgtattca cttgaagagc tgacagaaaa gatgattcac 240

acagttgagc gtaacggttt gaaggatgct tacatccgct tggtcgtgtc tcgcggagcg 300

ggcgacttgg gattagaccc gaacaattgt ggtcgcgcca atactgttat cattgttgaa 360

cctctggcaa ttttcccgaa acatttgtac gagaccggca tcgacattgt aacggttccc 420

acccgccgta atcgtcccga tgtcctttcg ccaaaagtaa aatctcttaa ttatctgaac 480

aacatccttg ttcgcattga ggcccacatg gcaggtgtaa gtgaagcgtt aatgcttaat 540

gatcaaggat atgtagccga agggtcggct gataatgttt ttatctataa aaaaggtaaa 600

ctgtacactc cgccaggtta tattggcgca ttagagggta ttacccgcaa cgcaattatg 660

gagattgcgg aagatcttgg gtacgaggtc aaggaagagc ctttcacgcg ccatgacgtc 720

tatacagcag aggaagtttt tcttaccggt acggctgctg aggtcatcgc agttgtaaag 780

gttgacggac gcatgattgg cgaaggaaag ccggggttcc acactaacaa attacttgaa 840

caattccgca aacgcgtagt ggaggaggga gagaaggttg tctttacgga tgaaaatatc 900

catgcgtcgt aa 912

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccgctcgag aaggaacagt ggatcttttt aaacg 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccgtgcagt gcttgcgtga atgttctcat cggta 35

Claims (6)

1.一种合成/转化手性胺或者手性氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用如下任意一种或多种：ω-转氨酶、编码ω-转氨酶的基因、含有所述ω-转氨酶的编码基因的表达载体或克隆载体、含有所述ω-转氨酶的编码基因的转基因细胞系、含有所述ω-转氨酶的编码基因的基因工程菌合成/转化手性胺或者手性氨基酸；

所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述合成/转化手性胺的底物为(R)-α-phenethylamine；在pH为6-8，温度为30-50 °C的条件下进行合成/转化。

2.一种催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，其特征在于，包括利用酶，或者表达所述酶的表达载体或克隆载体、或者表达所述酶的转基因细胞系、或者表达所述酶的基因工程菌；所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的序列或者如SEQ ID NO.3所示的序列。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括动力学拆分制备或不对称合成制备α/β-非天然氨基酸的方法。

6.根据权利要求2~5任一所述的方法，其特征在于，所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括用于制备脂肪族和芳香族β-非天然氨基酸的方法。

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