CN113106078B - 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备l-叔亮氨酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备L‑叔亮氨酸中的应用，该突变体包括：以SEQ ID NO.1所示野生型的亮氨酸脱氢酶为模板，第153位氨基酸残基突变为天冬酰胺N所得突变体；第191位氨基酸残基突变为天冬酰胺N所得突变体；第153位氨基酸残基突变为天冬酰胺N，第191位氨基酸残基突变为天冬酰胺N所得突变体。本发明通过分子改造，显著提高了LaLeuDH对三甲基丙酮酸和辅酶NADH/NAD+的催化活力，解决了还原胺化法制备高浓度L‑叔亮氨酸工艺中辅酶依赖性强的问题，使用全细胞催化时无需额外添加外源辅酶即可成功转化1.5M底物，具有极大的工业应用价值。

Description

一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在 制备L-叔亮氨酸中的应用
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，更具体地涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备L-叔亮氨酸中的应用。
背景技术
光学纯非蛋白氨基酸作为重要的手性砌块在医药工业中得到了广泛的应用。L-叔亮氨酸可能是最具代表性的药物活性成分之一，是许多药物的手性中间体，如telaprevir、asunaprevir、atazanavir等。
与化学法相比，酶催化法是一种绿色、选择性较强的手性分子合成方法，具有较高的收率和较好的光学纯度。目前已开发出多种用于制备手性纯L-叔亮氨酸的酶，如腈酶、水解酶、青霉素酰化酶、脂肪酶和氨基酸氧化酶等，然而，这些拆分过程大多受到50％的最大理论产量的限制。酮酸的酶法不对称还原胺化反应对制药行业来说，是一种很有吸引力的、理想的绿色温和的反应。氨基酸脱氢酶或氨基转移酶以酮酸为底物，不对称合成了多种L-氨基酸。利用亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)不对称合成L-叔亮氨酸是一条比较理想的合成路径，该过程反应优势明显，反应过程以铵离子作为胺供体，原子经济性高，NADH辅酶再生系统成本低廉。到目前为止，文献报道能够高效合成L-叔亮氨酸的氨基酸脱氢酶包括：Bacillus cereus LeuDH、Exiguobacterium sibiricum LeuDH和Lysinibacillussphaericusis LeuDH。其中，催化水平最好的是Lysinibacillus sphaericusis LeuDH，能够通过连续流加策略，将底物终浓度提高至1.5M，但是当单批次反应体系底物浓度高于0.75M时，这些酶不能高效地进行底物催化。即使通过底物活性口袋改造，也没有达到更高的底物浓度耐受性。
底物抑制主要是由于高浓度的底物破坏了正常的酶促过程：降低酶分子附近有效水活度，会影响分子的扩散性；底物在底物结合域中聚集，破坏了酶的原始相互作用力。作为有机溶剂，高浓度的TMP可能会掠夺有效水并破坏底物结合域的稳定性，包括破坏原始氢键和疏水相互作用。同时，有研究表明酶的稳定性主要依赖结构的刚性，而结构的刚性可以通过提高水相中酶表面的带电极性氨基酸残基的数量来强化(aC.N.Pace,S.Trevio,E.Prabhakaran,J.M.Scholtz,Philosophical Transactions of The Royal SocietyBBiological ences 2004,359,1225-1234；discussion 1234-1225；bB.S.Der,C.Kluwe,A.E.Miklos,R.Jacak,S.Lyskov,J.J.Gray,G.Georgiou,A.D.Ellington,B.Kuhlman,PlosOne 2013,8,59-59；cJ.N.Pedersen,Y.Zhou,Z.Guo,B.Pérez,Biotechnology andBioengineering 2019.)。蛋白表面由α-螺旋，β-链和loop环二级结构组成。loop是最灵活，最活跃的部分，既参与底物催化口袋的形成，又维持酶在溶液中的稳定性，在存在高浓度有机溶剂的情况下，可能会首先崩溃。亮氨酸脱氢酶是八聚体，亮氨酸脱氢酶的单亚基一般由两个结构域组成：Domain I(底物结合域)和Domain II(辅酶结合域)。在这种情况下，底物结合域的loop结构可能需要更高比例的带电残基来维持其结构稳定性和催化活性。因此，具有相应的loop结构特征的亮氨酸脱氢酶可能能够耐受高浓度三甲基丙酮酸。
尽管在反应催化过程中，LaLeuDH能够高效合成高浓度L-叔亮氨酸，但是该酶对辅酶依赖性较高，需要在反应体系中额外添加辅酶。虽然可以通过再生系统降低辅酶成本，但是维持体系中较高浓度辅酶，仍然占较高的物料成本。目前由亮氨酸脱氢酶介导的该反应即使使用高效的辅酶循环系统，仍至少需要添加0.1mM的NADH，生产成本较高。虽然可以通过再生系统降低辅酶成本，但是维持体系中较高浓度辅酶，仍然占较高的物料成本。
因此，为进一步提高反应催化效率，实现无外加辅酶体系中全细胞高效合成L-叔亮氨酸，需要提高LaLeuDH对辅酶NADH的利用效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备L-叔亮氨酸中的应用，从而解决现有技术中亮氨酸脱氢酶在不对称催化三甲基丙酮酸过程中底物投料低、需要额外添加辅酶导致L-叔亮氨酸生产成本高无法满足工业需求的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种活性提高的亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体包括：以SEQ ID NO.1所示野生型的亮氨酸脱氢酶LaLeuDH(Labrenziaaggregata IAM 12614)为模板，第153位的天冬氨酸D突变为天冬酰胺N的亮氨酸脱氢酶突变体D153N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；以SEQ ID NO.1所示野生型的亮氨酸脱氢酶LaLeuDH为模板，第191位的组氨酸H突变为天冬酰胺N的亮氨酸脱氢酶突变体H191N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；以SEQ ID NO.2所示突变型的亮氨酸脱氢酶突变体D153N为模板，第191位氨基酸残基发生组氨酸H突变为天冬酰胺N后的亮氨酸脱氢酶突变体D153N/H191N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
根据本发明的第二方面，提供一种如上面所述的亮氨酸脱氢酶突变体的编码基因。
根据本发明的第三方面，提供一种包含如上面所述的亮氨酸脱氢酶突变体的编码基因的重组载体与基因工程菌。根据本发明的一个优选方案，宿主菌可选用大肠杆菌。
根据本发明的第四方面，提供一种如上面所述的亮氨酸脱氢酶突变体在催化三甲基丙酮酸制备L-叔亮氨酸中的应用。
根据本发明，提供了一种可以耐受高浓度三甲基丙酮酸的亮氨酸脱氢酶突变体，该突变体的获取是采用结构导向的基因挖掘技术，该技术通过底物耐受性和特异性序列-结构预测实现。具体方法如下：
第一步，建立包含亮氨酸脱氢酶或Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶的蛋白序列集合，并进行多序列比对。亮氨酸脱氢酶或Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶的蛋白序列可以从Uniprot数据库获取。
第二步，对拥有晶体结构的亮氨酸脱氢酶Bacillus sphaericus(PDB:1LEH),Sporosarcina psychrophile(PDB:3VPX)和Geobacillus stearothermophilus(PDB:6ACF)进行结构序列比对，用于识别亮氨酸脱氢酶铰链区和底物结合域(Domain I)的特定loop结构。
第三步，统计第一步获得的多序列比对中所有特定loop结构上的带电极性氨基酸数量，取数量最多的几个作为能够耐受高浓度底物的候选序列。
第四步，为了确定能够高效催化TMP的底物结合口袋，将文献报道的对TMP具有高活力的亮氨酸脱氢酶进行结构和序列分析。
第五步，根据第四步获得的分析结果，从候选序列中筛出需要的能够高效催化高浓度底物的亮氨酸脱氢酶。
本发明为提高目标序列的辅酶利用效率，首先选择了来源于Labrenziaaggregate中的亮氨酸脱氢酶LaLeuDH基因为模板，该亮氨酸脱氢酶LaLeuDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明针对LaLeuDH野生型对辅酶NADH的亲和力较低，降低反应辅酶投量，引起反应时间明显延长的问题，采用理性定向进化手段，来提高LaLeuDH对辅酶NADH的亲和力。参照BsLeuDH和RsPheDH的晶体结构，确定LaLeuDH的辅酶结合域结构特点，并与具有辅酶催化结构优势的亮氨酸脱氢酶进行多序列比对，如Bacillus stearothermophilus,Thermoactinomyces intermedius,Bacillus cereus,Exiguobacterium sibiricum和Lysinibacillus sphaericus，结合分子动力学模拟，确定了对该亮氨酸脱氢酶LaLeuDH的辅酶催化效率起到关键作用的第153位的氨基酸残基和第191位的氨基酸残基。分别对它们进行定点突变，测得了各突变体催化还原胺化反应的活性。为分析它们之间的协同效应，将活性有大幅提高的突变体进行组合，确定最佳双点突变体LaLeuDH-D153N/H191N，即第153位的氨基酸残基和第191位氨基酸残基同时发生突变。通过这些蛋白质工程策略，获得了多个亮氨酸脱氢酶活性提高的突变体，这些突变体的获得对工业生产非常有利。
因此，本发明以SEQ ID NO.1所示的野生型氨基酸脱氢酶为模板，经过分析确定对活性起关键作用的氨基酸位点，获得了以下多种亮氨酸脱氢酶突变体，包括：第130位的P替换为V，形成突变体P130V；第153位的D替换为N，形成突变体D153N；第191位的H替换为N，形成突变体H191N；第153位和第91位联合突变形成突变体D153N/H191N。
进一步地，本发明将上述亮氨酸脱氢酶突变体应用于不对称还原胺化合成手性氨基酸。本发明发掘的野生型亮氨酸脱氢酶LaLeuDH能在0.1mM NADH/NAD+存在下将1.5M的三甲基丙酮酸在14h内转化成L-叔亮氨酸，而通过蛋白质工程对发掘的亮氨酸脱氢酶LaLeuDH进行改造，获得多个亮氨酸脱氢酶催化性能提高的突变体，其中活性提高幅度最大的三个突变体LaLeuDH-D153N、LaLeuDH-H191N和LaLeuDH-D153N/H191N的活性分别从野生型的LaLeuDH的556.6U/mg提高至914.2U/mg、915.7U/mg和1102.4U/mg。使用活性最高的亮氨酸脱氢酶双位点突变体LaLeuDH-D153N/H191N催化1.5M三甲基丙酮酸，当辅酶NADH的添加量为0.1mM时，能在3h完全转化生成L-叔亮氨酸；当辅酶NADH的添加量为0mM时，能在18h完全转化生成L-叔亮氨酸，ee值都达到99.9％。
在一些实施方式中，所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统选自以下系统中的至少一种：1)甲酸脱氢酶辅酶循环系统：包括甲酸脱氢酶，甲酸盐和辅酶；2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶；3)醇脱氢酶辅酶循环系统：包括醇脱氢酶，异丙醇和辅酶。
在一些优选的实施方式中，所述辅酶是NADH。
综上所述，根据本发明提供的亮氨酸脱氢酶，在高浓度三甲基丙酮酸反应体系中能保持较高的催化活力，而且对映选择性高；根据本发明提供的多个亮氨酸脱氢酶突变体，成功地解决了还原胺化反应合成高浓度的L-叔亮氨酸过程中需要额外添加昂贵的辅酶的问题，具有非常大的工业应用价值。
应当理解的是，本发明大写英文字母代表如本领域技术人员熟知的氨基酸，根据本申请，在此代表的是相应的氨基酸残基。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
对序列表的描述：
SEQ ID NO.1是来源于Labrenzia aggregate IAM 12614的注释为亮氨酸脱氢酶(LaLeuDH)的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2是LaLeuDH的突变体D153N(LaLeuDH-D153N)的氨基酸序列；
SEQ ID NO.3是LaLeuDH的突变体H191N(LaLeuDH-H191N)的氨基酸序列；
SEQ ID NO.4是LaLeuDH的突变体D153N/H191N(LaLeuDH-D153N/H191N)的氨基酸序列；
SEQ ID NO.5是来源于Bacteroidetes bacterium OLB10的注释为亮氨酸脱氢酶(BbLeuDH)的氨基酸序列；
SEQ ID NO.6是来源于Labrenzia aggregate IAM 12614的注释为亮氨酸脱氢酶(LaLeuDH)的核苷酸序列；
SEQ ID NO.7是LaLeuDH的突变体D153N(LaLeuDH-D153N)的核苷酸序列；
SEQ ID NO.8是LaLeuDH的突变体H191N(LaLeuDH-H191N)的核苷酸序列；
SEQ ID NO.9是LaLeuDH的突变体D153N/H191N(LaLeuDH-D153N/H191N)的核苷酸序列；
SEQ ID NO.10是来源于Bacteroidetes bacterium OLB10的注释为亮氨酸脱氢酶(BbLeuDH)的核苷酸序列；
SEQ ID NO.11是人工序列引物P130VF的核苷酸序列；
SEQ ID NO.12是人工序列引物P130VR的核苷酸序列；
SEQ ID NO.13是人工序列引物D153NF的核苷酸序列；
SEQ ID NO.14是人工序列引物D153NR的核苷酸序列；
SEQ ID NO.15是人工序列引物H191NF的核苷酸序列；
SEQ ID NO.16是人工序列引物H191NR的核苷酸序列。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1)本发明利用结构导向的基因挖掘技术，获得了一种高效催化高浓度(1.5M)三甲基丙酮酸的亮氨酸脱氢酶，显著提高了亮氨酸脱氢酶对高浓度底物的耐受性。
2)本发明制备的亮氨酸脱氢酶突变体LaLeuDH-D153N/H191N对辅酶NADH/NAD+的催化效率较母本亮氨酸脱氢酶提升了50倍，该亮氨酸脱氢酶突变体更具工业应用前景。
3)利用该亮氨酸脱氢酶突变体生产L-叔亮氨酸，底物浓度高，反应时间短，在不额外添加辅酶条件下催化1.5M底物反应时间仅需18h，这显示该亮氨酸突变体具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1示例性显示了野生型亮氨酸脱氢酶LaLeuDH和葡萄糖脱氢酶BmGDH的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图；
图2示例性显示了用重组大肠杆菌共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LaLeuDH-BmGDH及其突变体还原胺化TMP合成L-叔亮氨酸的反应进程曲线；
图3示例性显示了不对称合成L-叔亮氨酸的反应式(葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统)。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段为本领域常规操作。
材料和方法
上游基因工程所用试剂：实施例中使用的基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；一步克隆试剂盒购自诺唯赞有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)等购自上海旭冠生物科技发展有限公司；DNA标记、低分子量标准蛋白、蛋白胶购自北京GenStar有限公司；ClonExpress II One StepCloning Kit无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Dpn I内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成，全基因合成由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。KOD-One点突变试剂盒购自日本东洋纺公司。以上试剂使用方法参考商品说明书。
下游催化工艺所用试剂三甲基丙酮酸、L-叔亮氨酸、D-叔亮氨酸来自于上海麦克林生化科技有限公司，其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例中通过高效液相色谱(HPLC)检测反应的进行，并对PPO进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱PBR；柱温/30℃；流速/0.8mL/min；检测波长/210nm；流动相：5mM NH4H2PO4。
叔亮氨酸手性分析方法的建立：采用柱前衍生法检测，以GITC(2，3，4，6-四乙酰-β-吡喃葡萄糖)为衍生化试剂，对叔亮氨酸进行衍生。衍生反应以TEA(三乙胺)为催化剂。先配制衍生反应液：30μL TEA，0.013gGITC，1：1的甲醇/水补足体系至10mL。然后取衍生反应液和酶促反应稀释液或L(D)-叔亮氨酸标准品溶液各50ul混合并稀释到500ul，漩涡振荡2min，室温放置35min后离心，取10ul上清液进样。液相条件为：SB-AQ色谱柱(4.6mm×250mm)，检测波长254nm，流动相为40％(0.1％磷酸)水：60％甲醇，流速为1ml/min，柱温25℃。ee值计算方法：
Figure BDA0003040380210000081
其中L，D代表L，D型叔亮氨酸的检测峰面积。
实施例1：基因工程菌的构建
本发明采用结构导向的基因挖掘技术，获得4个潜在具有高效催化高浓度三甲基丙酮酸的亮氨酸脱氢酶，基因序列合成、表达质粒pET-28a(+)的构建和宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的质粒转化工作均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成，基本信息如表1所示。应当理解的是，基因序列合成、表达质粒pET-28a(+)的构建和宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的质粒转化均为本领域的常规技术手段，本领域技术人员根据以下基因信息以及本领域常规技术手段即可实现基因序列的合成，表达质粒pET-28a(+)的构建，以及宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的质粒转化。通过这些操作，即可分别获得LaLeuDH、BbLeuDH、TmLeuDH、LalLeuDH的重组大肠杆菌基因工程菌。
表1
Figure BDA0003040380210000082
实施例2：工程菌菌体的培养
分别将LaLeuDH、BbLeuDH、TmLeuDH、LalLeuDH的重组大肠杆菌基因工程菌和来源于Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶BmGDH(GenBank号：WP_013055759.1)经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃震荡培养10h。按2％的接种量转接至50mL同样含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃下震荡培养12h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。
实施例3：筛选耐受高浓度TMP的酶
通过比较高浓度底物下实施例2中所得各酶(LaLeuDH、BbLeuDH、TmLeuDH、LalLeuDH)的催化效率确定各自的底物耐受程度。20mL的反应体系包括：10g/L亮氨酸脱氢酶冻干细胞，10g/L葡萄糖脱氢酶冻干细胞，1M TMP，1.2M葡萄糖，0.5mM NADH，100mM磷酸铵缓冲液。30℃下机械搅拌24h，用氨水维持反应体系在pH 8.0。定时取样，将样品稀释一定浓度后利用高效液相检测其TMP的浓度，确定转化率(转化率＝过程中TMP浓度/初始TMP浓度×100％)，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003040380210000091
从结果来看，LaLeuDH、BbLeuDH相比其他酶在1M TMP下仍然保持较高的催化活力，特别是LaLeuDH在1M TMP的反应体系中表现出最高的催化效率。
实施例4：共表达基因工程菌的构建
将实施例3中使用的葡萄糖脱氢酶BmGDH的基因序列bmgdh通过一步克隆试剂盒连接到亮氨酸脱氢酶LaLeuDH载体pET-28a-laleudh上，酶切位点为Not I，构建共表达质粒pET-28a-laleudh-bmgdh，将质粒转化入菌种E.coli BL21(DE3)得到共表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a-LaLeuDH-BmGDH，按照实施例2进行菌体培养，共表达菌株蛋白表达情况如图1所示，其中，泳道M为蛋白marker，泳道1为LaLeuDH蛋白表达情况，泳道2为BmGDH蛋白表达情况，泳道3为共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-LaLeuDH-BmGDH蛋白表达情况。
实施例5：辅酶投量对共表达菌株不对称合成L-叔亮氨酸的影响
共表达菌株菌体的培养过程与实施例2相同。
比较高浓度底物下不同辅酶投量对实施例4中共表达菌体催化效率的影响。20mL的反应体系包括：10g/L共表达菌株冻干细胞，1.5M TMP，1.65M葡萄糖，不同浓度的NADH，100mM磷酸铵缓冲液。30℃下机械搅拌24h，用氨水维持反应体系在pH 8.0。定时取样，将样品稀释一定浓度后利用高效液相检测其TMP的浓度，确定转化率(转化率＝过程中TMP浓度/初始TMP浓度×100％)，结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003040380210000101
结果显示，在1.5M底物投量下，随着辅酶投量的降低，催化反应时间延长；当不再额外添加辅酶时，转化率仅有43％。
实施例6：底物与LaLeuDH的对接
为了获得亮氨酸脱氢酶LaLeuDH的结构信息，对野生型亮氨脱氢酶LaLeuDH进行建模。利用SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)进行同源建模，选择来自Rhodococcus sp.M4(PDB:1C1D，holo form)的苯丙氨酸脱氢酶的晶体结构作为模板，它与亮氨酸脱氢酶LaLeuDH的一致性为37.69％。对模型进行优化后，首先将辅因子NADH对接进模型中，接着将底物三甲基丙酮酸与酶分子和NADH的复合物进行对接。然后对对接结果进行筛查、评分，选择最佳的对接姿态，以此进行后续对酶分子辅酶活性口袋关键氨基酸残基的分析。
实施例7：LaLeuDH突变体的构建与筛选
将带有pET-28a-LaLeuDH和pET-28a-LaLeuDH-BmGDH重组质粒的大肠杆菌工程菌分别在LB培养基中培养10-12h，抽提质粒作为后续突变体构建的模板。利用日本东洋纺公司的KOD-One点突变试剂盒进行突变库构建。具体操作为：
以上述抽提质粒为模板，根据需要引入的突变残基进行引物设计如表4所示。
表4
Primer名称 序列(5'-3')
P130VF(SEQ ID NO.11) ggcttccatgtcgtccactgacacgccgacatc
P130VR(SEQ ID NO.12) gatgtcggcgtgtcagtggacgacatggaagcc
D153NF(SEQ ID NO.13) agggcgaggggttgccgaggccg
D153NR(SEQ ID NO.14) cggcctcggcaacccctcgccct
H191NF(SEQ ID NO.15) cgtcaaagccgacgttgccgaggccctgc
H191NR(SEQ ID NO.16) gcagggcctcggcaacgtcggctttgacg
采用高保真的KOD-One-酶，通过反向PCR法引入点突变，PCR反应体系为：10μLKOD-One-酶，1μL引物F，1μL引物R，1μL模板，7μLddH2O。
PCR反应条件：预变性94℃2min；变性98℃10s，退火58℃5s，延伸68℃2min，此阶段循环12次；后延伸68℃2min；4℃保存。
PCR扩增结束后用Dpn I对模板质粒DNA进行消化，37℃2h；使用试剂盒中的T4Polynucleotide Kinase和Ligation high，对PCR产物进行自环化16℃3h，自环化体系为：2μL消化产物，5μL连接液，1μL T4多聚核苷酸激酶，7μL ddH2O。
转化，将所得的环化产物导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；挑取单菌落并接种于5mL LB培养基，37℃培养过夜后将菌种测序；得到突变体P130V，D153N，H191N，D153N/H191N，确保序列正确后，将各突变体进行诱导表达，收获菌体后使用超声破碎制备粗酶液或冻干。
实施例8：野生型LaLeuDH及其突变体的纯化
将实施例7获得的野生型LaLeuDH及其突变体粗酶液的上清液加样到Ni-NTA柱上，将6x His标记的蛋白以1ml/min的流速结合到Ni-NTA柱上，然后用20mM，50mM，100mM，250mM以及500mM咪唑洗脱液，流速相同。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检查收集的蛋白质纯度。收集含有目的蛋白的流份，并用20mM PB缓冲液(pH 8.0)透析以脱盐，接着浓缩酶溶液，加入20％(v/v)甘油，在-80℃下保存以备后用。
实施例9：野生型LaLeuDH及其突变体的动力学参数
动力学参数测定对象为还原胺化方向的NADH和TMP。动力学分析在30℃和pH 8.0的条件下进行。以NADH作为底物，在一定浓度TMP和铵根的前提下，底物浓度梯度设置为：0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1mM，以底物浓度为横坐标，纵坐标为比活，根据Michaelis-Menten方程进行曲线拟合，拟合方程为：y＝(Vmax×x)/(Km+x)，即可获得Vmax和Km。以TMP作为底物，在一定浓度NADH和铵根的前提下，底物浓度梯度设置为：0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、5、10、20mM，拟合方式同NADH参数实验过程。实验结果如表5所示。
表5
Figure BDA0003040380210000121
结果显示，相比野生型(556.6U/mg)，突变体P130V、D153N、H191N和D153N/H191N的酶活分别达到了989.4、914.2、915.7和1102.4U/mg，均有大幅度的提升。特别是，突变株P130V、D153N、H191N和D153N/H191N对NADH的米氏常数(Km)分别为0.05、0.038、0.072和0.017mM，明显低于野生型(0.43mM)。同时，突变体P130V、D153N、H191N和D153N/H191N对辅酶NADH的催化效率(kcat/Km)也有显著的提升，达到了12348、15013.2、7936.1和40464.6mM/s，分别是野生型(807.7mM/s)的15倍、18倍、近10倍和50倍。但就底物TMP的动力学参数结果来看，突变体P130V对TMP的Km值由0.096mM增加到0.3mM，对底物亲和力有一定程度的下降。D153N、H191N和D153N/H191N突变体，对TMP的Km值，相比野生型基本没有差别。
实施例10：野生型LaLeuDH及其突变体D153N/H191N的共表达菌株合成L-叔亮氨酸
按照实施例2、4、7的方法构建和培养能够表达LaLeuDH或其突变体D153N/H191N和BmGDH的共表达菌株，离心收集菌体细胞并冻干。
比较高浓度底物下不同辅酶投量对野生型和突变体D153N/H191N共表达菌体催化效率的影响。20mL的反应体系包括：10g/L共表达菌株冻干细胞，1.5M TMP，1.65M葡萄糖，不同浓度的NADH，100mM磷酸铵缓冲液。30℃下机械搅拌24h，用氨水维持反应体系在pH 8.0。定时取样，将样品稀释一定浓度后利用高效液相检测其TMP的浓度，确定转化率(转化率＝过程中TMP浓度/初始TMP浓度×100％)，结果如图2所示。
结果显示，在0.1mM NADH存在下，突变体D153N/H191N能够在3小时内实现>99％的转化率；在不额外添加辅酶的条件下，突变体D153N/H191N能够在18小时内将1.5M TMP转化完。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东理工大学
<120> 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备L-叔亮氨酸
中的应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 357
<212> PRT
<213> Labrenzia aggregate IAM 12614
<400> 1
Met Asn Ala Leu His Lys Ser Val His His Ser Ala Val Phe Asp His
1 5 10 15
Pro Glu Met Gly Asp His Glu Asp Ile Val Phe Val Gln Asp Lys Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Val His Asp Thr Thr Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Val Trp Pro Tyr Glu His Pro Ala Asp Ala
50 55 60
Leu Thr Asp Ala Leu Arg Leu Ser Arg Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala
65 70 75 80
Leu Ala Gly Leu Asp Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Ala Asp
85 90 95
Pro Arg Arg Asp Lys Ser Glu Ala Leu Met Glu Ala Phe Gly Arg His
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Gly Val Phe Glu Gly Ile Lys Ala Ser Ala Lys Phe Val Phe Gly Ser
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Ser Asp Leu Ser Gly Lys Thr Val Ser Val Gln Gly Leu Gly His Val
180 185 190
Gly Phe Asp Val Ala Arg Gln Leu His Gln Ala Gly Ala Arg Leu Ile
195 200 205
Val Ser Asp Ile His Ala Pro Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Ala Phe
210 215 220
Gly Ala Thr Ala Val Asp Pro Ala Glu Ala His Arg Val Glu Ala Asp
225 230 235 240
Ile Phe Val Pro Cys Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asn Ala Arg Thr Val
245 250 255
Pro Gln Ile Gln Ala Arg Ile Val Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln Leu
260 265 270
Gln Thr Pro Ala Asp Gly Ile Ala Leu Lys Lys Arg Gly Ile Leu Tyr
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Ala Pro Asp Tyr Ala Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Ser Ile Ala Leu
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Ala Thr Ala Asn Ser Gly Asp Asn Val Val Arg Asp Lys Thr Ile Ala
305 310 315 320
Ile Gly Glu Thr Leu Ala Lys Ile Phe Asp Arg Ala Ala His Glu Asp
325 330 335
Thr Thr Pro Glu His Val Ala Asp Thr Met Val Glu Glu Arg Leu Ala
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Lys Ala Lys Ala Ala
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<212> PRT
<213> Labrenzia aggregate IAM 12614
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Pro Glu Met Gly Asp His Glu Asp Ile Val Phe Val Gln Asp Lys Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Val His Asp Thr Thr Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Val Trp Pro Tyr Glu His Pro Ala Asp Ala
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Leu Ala Gly Leu Asp Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Ala Asp
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Val Glu Arg Leu Ser Gly Thr Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Val
115 120 125
Ser Pro Asp Asp Met Glu Ala Val Ala Arg Gln Thr Asp His Val Arg
130 135 140
Gly Thr Lys Ala Thr Gly Leu Gly Asn Pro Ser Pro Tyr Thr Ala Leu
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Gly Val Phe Glu Gly Ile Lys Ala Ser Ala Lys Phe Val Phe Gly Ser
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Ser Asp Leu Ser Gly Lys Thr Val Ser Val Gln Gly Leu Gly His Val
180 185 190
Gly Phe Asp Val Ala Arg Gln Leu His Gln Ala Gly Ala Arg Leu Ile
195 200 205
Val Ser Asp Ile His Ala Pro Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Ala Phe
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Gly Ala Thr Ala Val Asp Pro Ala Glu Ala His Arg Val Glu Ala Asp
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Ile Phe Val Pro Cys Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asn Ala Arg Thr Val
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Ala Pro Asp Tyr Ala Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Ser Ile Ala Leu
290 295 300
Ala Thr Ala Asn Ser Gly Asp Asn Val Val Arg Asp Lys Thr Ile Ala
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Thr Thr Pro Glu His Val Ala Asp Thr Met Val Glu Glu Arg Leu Ala
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<212> PRT
<213> Labrenzia aggregate IAM 12614
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Pro Glu Met Gly Asp His Glu Asp Ile Val Phe Val Gln Asp Lys Ala
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Leu Ala Gly Leu Asp Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Ala Asp
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Val Glu Arg Leu Ser Gly Thr Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Val
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Ser Pro Asp Asp Met Glu Ala Val Ala Arg Gln Thr Asp His Val Arg
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Gly Thr Lys Ala Thr Gly Leu Gly Asp Pro Ser Pro Tyr Thr Ala Leu
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Gly Val Phe Glu Gly Ile Lys Ala Ser Ala Lys Phe Val Phe Gly Ser
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Ser Asp Leu Ser Gly Lys Thr Val Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val
180 185 190
Gly Phe Asp Val Ala Arg Gln Leu His Gln Ala Gly Ala Arg Leu Ile
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Val Ser Asp Ile His Ala Pro Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Ala Phe
210 215 220
Gly Ala Thr Ala Val Asp Pro Ala Glu Ala His Arg Val Glu Ala Asp
225 230 235 240
Ile Phe Val Pro Cys Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asn Ala Arg Thr Val
245 250 255
Pro Gln Ile Gln Ala Arg Ile Val Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln Leu
260 265 270
Gln Thr Pro Ala Asp Gly Ile Ala Leu Lys Lys Arg Gly Ile Leu Tyr
275 280 285
Ala Pro Asp Tyr Ala Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Ser Ile Ala Leu
290 295 300
Ala Thr Ala Asn Ser Gly Asp Asn Val Val Arg Asp Lys Thr Ile Ala
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<212> PRT
<213> Labrenzia aggregate IAM 12614
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Gly Val Phe Glu Gly Ile Lys Ala Ser Ala Lys Phe Val Phe Gly Ser
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Gly Phe Asp Val Ala Arg Gln Leu His Gln Ala Gly Ala Arg Leu Ile
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<213> Bacteroidetes bacterium OLB10
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<211> 1074
<212> DNA
<213> Labrenzia aggregate IAM 12614
<400> 9
atgaacgcct tgcataaatc tgttcaccac agcgccgttt tcgatcatcc ggagatgggc 60
gatcacgaag acatcgtttt cgtccaggac aaggccacgg gcctgaaggc aatcatcgcc 120
gtccacgata ccacgcttgg tccagctctt ggcggctgcc gcgtctggcc ctacgaacat 180
cctgctgacg ccttgacgga tgccctgcgc ctgtctcgag gcatgaccta caagaacgcc 240
cttgctggcc tcgatctcgg tggcggcaag gctgtcatca tcgcggaccc gcgccgtgac 300
aagtccgagg ctctgatgga agcattcggc cgtcatgtgg agcgcctgtc cggcacttac 360
atcaccgcgg aagatgtcgg cgtgtcaccg gacgacatgg aagccgtcgc ccgtcagaca 420
gaccacgtgc gcggcacaaa ggcaaccggc ctcggcaacc cctcgcccta tacggctctc 480
ggtgttttcg aaggcatcaa ggcatccgcc aaatttgtct tcggcagcag cgatctgtcc 540
ggcaagaccg tttccgtgca gggcctcggc aacgtcggct ttgacgttgc ccgccagctt 600
caccaagccg gcgcaaggct catcgtctcc gacattcacg caccggccgt gctgcgtgcc 660
attgatgcgt tcggcgccac cgcggtggat ccggccgaag cgcatagggt cgaggcagac 720
atctttgtgc cctgtgcgct tggagcaggt ctcaacgccc gcacggttcc gcaaatccag 780
gccaggatcg tggctggcgc tgccaacaac cagttgcaga ccccggcgga cggcatagcg 840
ctgaaaaagc gcggcatcct ctatgctccg gattatgcaa tcaacgccgg aggcgtgatt 900
tccatcgcgt tggcaaccgc aaacagcggc gacaacgtgg tccgggacaa aaccatcgcg 960
atcggtgaaa ccctggcaaa gatcttcgac cgggcagcgc acgaggacac cacgccggaa 1020
catgtggcgg acacgatggt ggaagagcgt ctggcgaagg caaaggcggc ctga 1074
<210> 10
<211> 1086
<212> DNA
<213> Bacteroidetes bacterium OLB10
<400> 10
atgattgaag ttaaagagat taagaaatca gaagctacgg ctaattctat tttttcacaa 60
atcacatcca tgaagcatga gcaggtagta ttctgctacg atcatgaaac aggcttaaaa 120
gctataatcg ccattcataa caccaacctt ggaccttcac tcggaggtac acgtatgtgg 180
aagtacgaca atgaaaatga tgcacttaca gatgttttgc gtctttcacg cggtatgact 240
tacaaagcag ccatatcagg attaaattta ggtggaggaa aagcagtaat cattggcgac 300
agcagaaaag ataagaatga agcactcatc cgtagtttcg gaagatatgt aaactcactc 360
agcggcagat atatcactgc cgaagatgtg ggaacttcta ccaaggatat ggaatatatt 420
gctaaggaaa ccaagcatgt tacaggactg cctgtggcta tgggtggcag tggcgaccca 480
tcgcctgtga cagcttatgg tgtgtatatg ggcatgaaag catcagccaa agaatgttgg 540
ggaaatgaca gcatgaacgg taaaaaggtt gtggtgcagg gtgtagggca tgtaggtgaa 600
agccttgtga agtttcttac tgaagaaggt gcaaaggtat atgtaaccga tatcaatcag 660
gatgcattaa atcatgtggc ttcagaattt aaggccgaaa ttatcaatcc tgaaaaagta 720
tatgctatgg atgtggatgt gtatgctccc tgtgctcttg gagctacact caatactgcc 780
accatcaatc agcttaaatg tgcaattgtt gcagggtcgg ccaataatca attggcagat 840
gaagatgttc atggcaaaat gctgatggaa aaaggaattc tttatgcacc cgatttctta 900
atcaatgccg gtggacttat caatgtgtac agcgaattga aaggttacaa tcatgctgat 960
gcaatgaaac aaactgagca tatttatgat gtaacgcttg atatcttcaa aaaatcaaaa 1020
gctgaaaaaa taaccacaca gcaggctgca atgcagattg ctgagaagag aatctacggt 1080
aaataa 1086
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggcttccatg tcgtccactg acacgccgac atc 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatgtcggcg tgtcagtgga cgacatggaa gcc 33
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agggcgaggg gttgccgagg ccg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cggcctcggc aacccctcgc cct 23
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgtcaaagcc gacgttgccg aggccctgc 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcagggcctc ggcaacgtcg gctttgacg 29

Claims (6)

1.一种活性提高的亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶突变体包括：
以SEQ ID NO.1所示野生型的亮氨酸脱氢酶LaLeuDH为模板，第153位的天冬氨酸D突变为天冬酰胺N的亮氨酸脱氢酶突变体D153N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
以SEQ ID NO.1所示野生型的亮氨酸脱氢酶LaLeuDH为模板，第191位的组氨酸H突变为天冬酰胺N的亮氨酸脱氢酶突变体H191N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
以SEQ ID NO.2所示突变型的亮氨酸脱氢酶突变体D153N为模板，第191位氨基酸残基发生组氨酸H突变为天冬酰胺N后的亮氨酸脱氢酶突变体D153N/H191N，其氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
2.一种如权利要求1所述的活性提高的亮氨酸脱氢酶突变体的编码基因。
3.一种包含根据权利要求2所述的亮氨酸脱氢酶突变体的编码基因的重组载体与基因工程菌。
4.一种根据权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体在催化三甲基丙酮酸制备L-叔亮氨酸中的应用。
5.一种根据权利要求3所述的包含亮氨酸脱氢酶突变体的编码基因的重组载体与基因工程菌在催化三甲基丙酮酸制备L-叔亮氨酸中的应用。
6.一种制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，包括在酶催化体系的存在下使三甲基丙酮酸发生还原反应生成L-叔亮氨酸，所述酶催化体系包括用于三甲基丙酮酸转化为L-叔亮氨酸的根据权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体。
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