JP5878871B2 - 新規アミノ基転移酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用法 - Google Patents
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Description
(1)作用:アミノ基供与体と1−ベンジル−3−ピロリジノンとに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。
(a)アミノ基供与体:(S)−1−フェネチルアミン、ベンジルアミンおよび±2−ブチルアミンに対し活性を示し、β−アラニン、および4−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さない。
(b)アミノ基受容体:ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す。
(4)至適pH:6.0〜8.5、
(5)作用至適温度:60℃、
(6)熱安定性:30〜60℃で30分間熱処理したときの残存活性が、処理前の全活性の90%以上を保持する。
本発明において後述の方法により単離されたポリペプチドは、以下の理化学的性質を有するポリペプチドである。
(a)アミノ基供与体:(S)−1−フェネチルアミン、ベンジルアミンおよび±2−ブチルアミンに対して活性を示し、β−アラニン、および、4−アミノ酪酸に対して実質的に活性を示さない。
(b)アミノ基受容体:ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す。
(5)作用至適温度:60℃、
(6)熱安定性:30〜60℃で30分間熱処理したときの残存活性が、処理前の全活性の90%以上を保持する。
本発明のポリペプチドは、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上、好ましくは95%e.e.以上、さらに好ましくは97%e.e.以上、最も好ましくは98%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。
(S)−1−フェネチルアミン 85.6mM
1−ベンジル−3−ピロリジノン 57.1mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 1260mL/アセトニトリル 740mL/KH2PO4 10g/SDS 2.88g(pH3.6)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にした後、ジニトロベンゾイルクロリドで誘導体化する。その後、必要に応じてシリカゲルクロマトグラフィー等により精製して、以下の条件で分析する。
カラム:Chiralpak IA(ダイセル化学工業社製)
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
本発明のポリペプチドは、(S)−1−フェネチルアミン、ベンジルアミンおよび±2−ブチルアミンに対して活性を示し、β−アラニン、および4−アミノ酪酸に対して実質的に活性を示さない。ここで、(S)−1−フェネチルアミンに活性を示すとは、以下の方法でアミノ基転移活性を測定した場合において、1分間に生成するアセトフェノンの量が精製ポリペプチド1mgに対し0.1μmol以上、好ましくは1μmol以上、より好ましくは10μmol以上であることを意味する。
[基質溶液組成]
(S)−1−フェネチルアミン 25mM
ピルビン酸ナトリウム 25mM
ピリドキサルリン酸 2.5mM
トリス塩酸緩衝液(pH8.0) 0.1M
カラム:Wakosil−II 5C18 RS(和光純薬社製)
溶離液:10mM りん酸カリウム緩衝液 (pH5.3):アセトニトリル=3:2
流速:1mL/分
検出:241nm
[基質溶液組成]
各種アミノ化合物 14mM
ピルビン酸 14mM
ピリドキサルリン酸 0.02mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.5) 0.1M
カラム:Deverosil ODS−HG−3(NOMURA CHEMICAL製)
溶離液:アセトニトリル/0.045M酢酸緩衝液(pH4.1)=35/65(体積比)
流速:0.9mL/分
検出:254nm
本発明のポリペプチドは、ピルビン酸に代えて、グリオキシル酸をアミノ基受容体としても活性を示す。すなわち、前記活性測定法Aにおいて、ピルビン酸に代えてグリオキシル酸をアミノ基受容体として測定したアミノ基転移活性が、ピルビン酸をアミノ基受容体として測定した活性を100%とした相対活性で10%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは30%以上の活性を示す。
本発明のポリペプチドは、水溶性有機溶媒に高い耐性を示す。すなわち、終濃度80%v/vの1−プロパノール、2−プロパノール、アセトンのいずれかで2時間処理後の残存活性が、処理前の全活性の10%以上を保持する。
アミノ基転移反応の至適pHは、前述の活性測定法Aを用いて、以下に記載の緩衝液とpHの組み合わせで測定する。至適pHとは、本測定にて最も高い活性値を100としたきに、80以上の活性を示すpHとする。同一pHであっても緩衝液の種類によって活性値が異なる場合には、より高い活性値を採用する。
pH4.0、4.5、5.0、5.5の場合:0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0の場合:0.1Mリン酸カリウム緩衝液
pH7.5、8.0、8.5、9.0の場合:0.1Mトリス塩酸緩衝液
アミノ基転移反応の至適温度は、前述の活性測定法Aを用いた測定において、反応温度が10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃の中で最大の活性値を示した温度とする。
ポリペプチドの熱安定性は、精製ポリペプチドを、0.5mMのピリドキサルリン酸を含む、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃で30分間熱処理した後、前述の活性測定法Aを用いた測定において、熱処理前の活性を100%としたとき、熱処理後90%以上の残存活性を有する範囲とする。
本発明のポリペプチドの分子量はおよそ50,000であり、10% SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準蛋白質に対する相対移動度から決定しうる。
本発明のポリペプチドは、上記性質を示すポリペプチドであれば、いかなるポリペプチドであっても含まれるが、例えば、シュードモナス(Pseudomonas)属の微生物から取得できる。本発明の実施形態のポリペプチドの起源となる微生物としては、好ましくは当業者が公的保存機関(例えばNBRC等)より容易に入手可能なシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)が挙げられ、さらに好ましくは、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)MV37が挙げられる。この、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)MV37は、2010年6月11日付けで、受託番号NITE P−953として、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター(〒292−0818千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に寄託されている。
本発明のポリペプチドを有する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。
本発明のポリペプチドを生産する微生物から該ポリペプチドを精製するには、当業者に周知の蛋白質精製法が利用できる。例えば、当該微生物の培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集め、得られた菌体を、超音波破砕機あるいはグラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除いて無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液を、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等に供することにより、目的のポリペプチドを単離できる。
本発明のポリペプチドとしては以下の(a)〜(c)のポリペプチドを挙げることができる。
(b)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
(c)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド。
(第2群:中性極性アミノ酸)Ser,Thr,Gln,Asn,Trp,Tyr
(第3群:酸性アミノ酸)Glu,Asp
(第4群:塩基性アミノ酸)His,Lys,Arg。
本発明のDNAは、上記ポリペプチドをコードするDNAであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で上記ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。本発明のDNAは配列表の配列番号2に従い、当業者であれば化学的に合成することにより容易に入手できる。他の方法としては、精製された上記ポリペプチドが取得できれば、当業者であれば公知の方法により、該ポリペプチドの起源となる微生物より上記DNAを取得することができる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAとしては、例えば、以下の(A)〜(C)のDNAを挙げることができる。
(B)配列表の配列番号2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
(C)配列表の配列番号2に記載の塩基配列において、1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されたDNA。
本発明の実施形態のDNAを宿主微生物内に導入して発現させるために用いるベクターDNAとしては、適切な宿主微生物内で該DNAがコードする遺伝子を発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターDNAとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。
本発明の実施形態のDNAを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターにより形質転換され、DNAを導入したポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、およびラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Rhodococcus)属およびストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、およびキャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、およびトリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫(Nature315,592−594(1985))や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入および発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
次に、本発明の実施形態のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生産能を持つ微生物を用いて光学活性アミノ化合物を製造する方法について説明する。
製造方法Iは、ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチド生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させ、光学活性アミノ化合物を製造する方法である。
アミノ基供与体としては、本発明のポリペプチドが作用するアミノ化合物であればいかなるものでも使用できる。具体例としては、1−フェネチルアミン、2−ブチルアミン、2−ペンチルアミン、2−ヘプチルアミン、3−ヘプチルアミン、n−エチルアミン、n−プロピルアミン、n−ブチルアミン、n−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、3−アミノ−1−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。なかでも、1−フェネチルアミン、アラニンが好ましい。
製造方法Iにおいては、前記ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、前記本発明のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生産能を有する微生物の培養物を作用させる。
アミノ基転移反応を用いたアミノ化反応は一般的に可逆反応であるため、一般的に平衡点で見かけ上反応が停止する。これらの反応平衡を解消する公知の方法を組み合わせることで、本発明のポリペプチドを用いた反応を改善することができる。例えば、WO2007/139055公報に記載のように、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を乳酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素を共役させることで乳酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。同様に、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を、ピルビン酸デカルボキシラーゼで除く方法(WO2007/093372A1公報)、アラニン脱水素酵素を用いる方法(US2009/0117627A1公報、 Evonik Degussa GmbH)、過酸化水素で除く方法(US2008/0213845A1公報)、アセト酪酸合成酵素を用いる方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.72(11),3030−3033(2008))なども有効である。
反応に用いる基質の濃度としては、ケトン化合物は、反応液組成中、0.1〜80重量%、好ましくは1〜50重量%であり、また、アミノ基供与体は、キラルアミンの場合は、ケトン化合物に対し、80〜1200モル%、好ましくは100〜600モル%の濃度になるように用いることが好ましい。なお、前記アミノ基供与体としてラセミ体のアミノ化合物の場合は、一方の立体が上記の濃度となるように使用することもできる。
本発明のポリペプチドの至適pHは、下限は、好ましくはpH5.0以上であり、より好ましくはpH6.0以上である。上限は、好ましくはpH10.0以下であり、より好ましくはpH9.0以下であることが望ましい。
複数のポリペプチドを共役させる場合には、使用する全てのポリペプチドが安定的かつ高活性に作用するpHを選択することが好ましい。
本発明のポリペプチドの反応温度は、至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは25℃以上であり、より好ましくは30℃以上であり、好ましくは60℃以下であり、より好ましくは50℃以下である。
複数のポリペプチドを共役させる場合には、使用する全てのポリペプチドが安定的かつ高活性に作用する反応温度を選択することが好ましい
反応溶媒は、通常、イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行なうことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2―プロパノール、1−ブタノール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、その他、アセトニトリル等を適宜使用できる。
必要に応じて、上記の有機溶媒を水への溶解度以上に加えて2相系で反応を行なうこともできる。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上する場合も多い。
反応は、通常、1時間〜1週間、好ましくは1〜72時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
次に本発明の製造方法IIについて説明する。
本製造方法は、アミノ化合物のエナンチオマー混合物に、アミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチド生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させる光学活性アミノ化合物の製造方法である。
本方法においては、ケトン化合物をアミノ基受容体として用いる。
ケトン化合物としては、アミノ基受容体としての活性があればいかなるものでもよいが、好ましくは、ピルビン酸あるいはグリオキシル酸である。
また、アミノ化合物の濃度は、反応液組成中、0.1〜80重量%、好ましくは1〜50重量%である。アミノ基受容体の濃度は、アミノ化合物に対し、30〜100モル%、好ましくは50〜60モル%で用いることが好ましい。反応pH、反応温度、反応溶媒は製造方法Iと同様の条件が用いられ得る。
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、製造方法Iと同様の方法で反応混合液から単離することができる。
土壌より分離したMV37株、MV38株、MV45株、MV48株のそれぞれを、N培地(組成:50g/L ポリペプトン(日本製薬社製)、30g/L D−グルコース、20g/L NaCl、2g/L イーストエキス(Difco社製)、1g/L(RS)−1−フェネチルアミン(pH7.0))を用いて28℃で62時間通気培養した。その後、培養液2mLを遠心分離して得られた菌体に下記基質溶液400uLを添加し、30℃で2時間攪拌して反応させた。生成したベンジルアミノピロリジンは、下記条件にて定量分析、および光学純度分析を行なった。
L−アラニン 100mM
1−ベンジル−3−ピロリジノン 7.5mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.05M
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 1260mL/アセトニトリル 740mL/KH2PO4 10g/SDS 2.88g(pH3.6)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にした後、ジニトロベンゾイルクロリドで誘導体化し、以下の条件で分析した。
カラム:Chiralpak IA(ダイセル化学工業社製)
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
実施例1で解析したシュードモナス・エスピー MV37(NITE P−953)を5mLのNpre培地(組成:50g/L ポリペプトン(日本製薬社製)、30g/L D−グルコース、20g/L NaCl、2g/L イーストエキス(Difco社製)(pH7.0))を用いて30℃で1日培養し、第一種母培養液を得た。
(PCRプライマーの作成)
実施例2で得られた精製TPMのN末端アミノ酸配列を、PPSQ−33A型プロテインシーケンサー(島津製作所製)により決定した。また、精製TPMを8M尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリジルエンドペプチダーゼ(和光純薬工業株式会社製)で消化し、得られたペプチド断片のN末端アミノ酸配列も同様に決定した。このアミノ酸配列から塩基配列を予測し、TPM遺伝子の一部をPCRにより増幅するためのプライマー1(配列表の配列番号3)、および、プライマー2(配列表の配列番号4)を合成した。
シュードモナス・エスピーMV37の培養液から、Murray等の方法(Nucl. Acids Res., 8, 4321, 1980)に従って染色体DNAを抽出した。得られた染色体DNAを鋳型に、上記で合成したプライマーを用いてPCRを行った。その結果、TPM遺伝子の一部と考えられる約830bpのDNA断片を取得した。PCRは、DNAポリメラ−ゼとしてPrimeStar(タカラバイオ株式会社製)を用いて行い、反応条件はその取扱説明書に従った。このDNA断片をダイレクトシーケンスにより塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号5に示した。
シュードモナス・エスピーMV37の染色体DNAを制限酵素FbaI、PstI、XhoIまたはSphIを用いて完全消化し、得られた消化物をT4DNAリガーゼ(宝酒造株式会社製)を用いて各々分子内環化させた。これを鋳型として用い、上記で判明したTPM遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、inverse−PCR法(Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988))により、染色体DNA上のTPM遺伝子の全塩基配列を決定した。PCRは、TaKaRa LA Taq with GC buffer(宝酒造株式会社製)を用いて行い、反応条件はその取扱説明書に従った。決定した塩基配列を配列表の配列番号2に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示した。
実施例3で決定した塩基配列に基づき、TPM遺伝子の開始コドン部分にNdeI部位を付加したプライマー3(配列表の配列番号6)と、TPM遺伝子の終始コドンの直後にSacI部位を付加したプライマー4(配列表の配列番号7)とを合成した。実施例3で得たシュードモナス・エスピーMV37の染色体DNAを鋳型とし、これらのプライマーを用いてPCRを行い、TPM遺伝子の開始コドン部分にNdeI部位を付加し、かつ終始コドンの直後にSacI部位を付加した二本鎖DNAを取得した。PCRは、PrimeStar(タカラバイオ株式会社製)を用いて行い、反応条件はその取扱説明書に従った。このDNAをNdeIおよびSacIで消化し、プラスミドpUCNT(WO94/03613)のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とSacI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNTTPMを得た。
実施例4で得た組換えベクターpNTTPMを用いて大腸菌E. coli HB101(タカラバイオ株式会社製)を形質転換し、組換え大腸菌E. coli HB101(pNTTPM)を得た。
実施例5で得たE. coli HB101(pNTTPM)を200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、集菌後、N緩衝液に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液を下記組成の基質溶液に添加し、30℃で1時間反応後、反応液1mLに対し50μLの6規定塩酸を添加し、遠心分離したのち、その上清のアセトフェノン濃度をHPLCで定量することにより、アミノ基転移活性を測定した。その結果、E. coli HB101(pNTTPM)の無細胞抽出液では、ブロス1mLあたり1分間に9μmolのアセトフェノンを生成する活性が見られた。
(S)−1−フェネチルアミン 25mM
ピルビン酸ナトリウム 25mM
ピリドキサルリン酸 2.5mM
トリス塩酸緩衝液(pH8.0) 0.1M
カラム:Cosmosil 5C8−MS(ナカライテスク社製)
溶離液:30mMリン酸カリウム緩衝液(pH2.5)/アセトニトリル/メタノール=4/1/1(体積比)
流速:1mL/分
検出:254nm
実施例6と同様の方法で得られた組換え大腸菌の培養液から遠心分離により菌体を集め、標準緩衝液(0.5mMピリドキサルリン酸、0.1Mリン酸カリウム(pH7.5))に懸濁し超音波破砕を行った。次に、破砕物中の固形物を遠心分離により除去し、無細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液を30分間攪拌しながら50℃で処理し、遠心分離により上清を回収した。
実施例7で得られた精製TPMについて、1−ベンジル−3−ピロリジノンに対する活性と生成(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンの光学純度を調べた。
(S)−1−フェネチルアミン 85.6mM
1−ベンジル−3−ピロリジノン 57.1mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 1260mL/アセトニトリル 740mL/KH2PO4 10g/SDS 2.88g(pH3.6)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にした後、ジニトロベンゾイルクロリドで誘導体化し、以下の条件で分析した。
カラム:Chiralpak IA(ダイセル化学工業社製)
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
実施例7で得られた精製TPMについて、その(S)−1−フェネチルアミンに対する活性、至適pH、至適温度、熱安定性、水溶性有機溶媒耐性について調べた。
以下に示す活性測定条件にて、精製TPMのアミノ基転移活性を調べた。すなわち、精製TPMを下記組成の基質溶液に添加して総量を1mLとし、30℃で5分間反応後、6規定の塩酸を0.05mL添加して反応を停止させ、下記条件のHPLCで分析した。
(S)−1−フェネチルアミン 25mM
ピルビン酸ナトリウム 25mM
ピリドキサルリン酸 2.5mM
トリス塩酸緩衝液(pH8.0) 0.1M
カラム:Wakosil−II 5C18 RS(和光純薬社製)
溶離液:10mM りん酸カリウム緩衝液(pH5.3):アセトニトリル=3:2
流速:1mL/分
検出:241nm
上記の方法でアミノ基転移活性を測定したところ、精製TPMの活性は11.8U/mgであった。
pH4.0〜9.0の範囲で、上記と同様にしてアミノ基転移活性を測定し、TPMの至適pHを調べた。
測定するpHの応じて緩衝液は下記のものを用いた結果、0.1Mリン酸カリウム緩衝液でpH7.0が最も活性が高く、至適pHは6.0〜8.5と考えられた(pH7を100としたときの相対活性を表1に示す)。
pH4.0、4.5、5.0、5.5の場合:0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0の場合:0.1Mリン酸カリウム緩衝液
pH7.5、8.0、8.5、9.0の場合:0.1Mトリス塩酸緩衝液
上記と同じ条件で、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃のアミノ基転移活性を測定した結果、60℃がTPMの至適温度と考えられた(最も高活性であった60℃の活性を100としたときの相対活性を表2に示す)。
精製TPMを、0.5mMピリドキサルリン酸を含む、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中で、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃にて30分間反応した後、同様に活性測定を行なった。その結果、熱処理前に比べて、30℃〜60℃処理では90%以上の活性が残存していた(熱処理前の活性を100としたときの残存活性を表3に示す)。
実施例9(5)水溶性有機溶媒耐性と同様の方法で、市販のVibrio fluvialis由来のω−Transaminase VF(Julich−Chemicals社)の水溶性有機溶媒耐性を調べた結果、1−プロパノール、2−プロパノール、アセトンを80%v/v添加すると2時間で完全に活性を失った(表5)。
実施例7で得た精製TPMについて、アミノ基供与体の特異性について調べた。まず、精製TPM溶液20μLを下記組成の基質溶液380μLに添加し、30℃で1時間反応後、3規定の塩酸20μLを加えて反応を停止させた。次に、得られた反応液20μLに0.2M炭酸ナトリウム水溶液80μL、3.3mg/mLダブシルクロリドのアセトン溶液200μLをそれぞれ加え、70℃で10分間反応させた。これに酢酸20μLを加えて攪拌し、この反応液を下記条件のHPLCで分析し、ダブシル化したアラニンを定量した。その結果TPMは、n−ブチルアミン、ベンジルアミン、±2−ブチルアミンにも活性を示すことが判明した(n−ブチルアミンをアミノ基供与体として用いたときの活性を100%とした相対活性として表6に示す)。
各種アミノ化合物 14mM (ラセミ体の場合28mM)
ピルビン酸 14mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.5) 0.1M
カラム:Deverosil ODS−HG−3(NOMURA CHEMICAL)
溶離液:アセトニトリル/0.045M酢酸緩衝液(pH4.1)=35/65(体積比)
流速:0.9mL/分
検出:254nm
実施例7で得られた精製TPMについて、代表的なω―アミノ酸トランスアミナーゼの基質に対する反応性について調べた。まず、精製TPM溶液20μLを下記組成の基質溶液380μLに添加し、30℃で1時間反応後、3規定の塩酸20μLを加えて反応を停止させた。次に、得られた反応液20μLに0.2M炭酸ナトリウム水溶液80μL、3.3mg/mLダブシルクロリドのアセトン溶液200μLをそれぞれ加え、70℃で10分間反応させた。これに酢酸20μLを加えて攪拌し、この反応液を下記条件のHPLCで分析し、ダブシル化したアラニンを定量した。その結果、TPMはω―アミノ酸トランスアミナーゼの代表的な基質であるβ―アラニン、4−アミノ酪酸、L−オルニチン、L−リジン、プトレッシン、タウリンに対しては活性を示さないことが判明した((S)−1−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いたときの活性を100とした相対活性として表7に示す)。
各種アミノ化合物 14mM
ピルビン酸 14mM
ピリドキサルリン酸 0.02mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.5) 0.1M
カラム:Deverosil ODS−HG−3(NOMURA CHEMICAL)
溶離液:アセトニトリル/0.045M酢酸緩衝液(pH4.1)=35/65(体積比)
流速:0.9mL/分
検出:254nm
実施例7で得られた精製TPMについて、アミノ基受容体に対する基質特異性について調べた。精製TPM溶液に終濃度が下記組成となるような基質溶液を添加し、30℃で5分間反応させた後、6規定の塩酸を反応液1mLあたり50μL添加し、反応を停止させた。この反応液を下記条件のHPLCで分析した結果、TPMは広範な基質に対して活性を示すことが判明した(表8)。
(S)−1−フェネチルアミン 25mM
各アミノ基受容体 25mM あるいは 2.5mM
ピリドキサルリン酸 2.5mM
トリス塩酸緩衝液(pH7.0) 0.1M
ポリペプチド溶液
カラム:Wakosil−II 5C18 RS(和光純薬社製)
溶離液:10mM りん酸カリウム緩衝液(pH5.3):アセトニトリル=3:2
流速:1mL/分
検出:241nm
実施例6と同様の方法で得られた組換え大腸菌の培養液を遠心分離により集菌した。また、WO2007/139055公報の実施例13に記載のペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococcus acidilactici) JCM8797株由来のL−乳酸脱水素酵素PALDHとバシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030由来グルコース脱水素酵素GDHを共発現する組換え大腸菌を、200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、遠心分離により集菌した。
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 1260mL/アセトニトリル 740mL/KH2PO4 10g/SDS 2.88g(pH3.6)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。
カラム:Chiralcel IA(ダイセル化学工業社製)
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
実施例13と同様の方法で得られたTPM、PALDHおよびGDHをそれぞれTPM16.7U/mL、PALDH297U/mL、GDH30U/mLとなるように上記培養液を混合し、あらかじめ基質である2−ヘプタノン300mg、および、Lアラニン15900mg、D−グルコース710mg、NAD+ 4mg、を入れたフラスコに上記菌体懸濁液3ml、ピリドキサルリン酸1.3mg、1Mリン酸カリウム緩衝液(pH6.8)1mLを入れて、脱イオン水を加えて全体積を10mLとした。これを、30℃で、水酸化ナトリウムでpH6.8に調整しながら30時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、この反応液を下記条件のHPLCで分析した。その結果、2−アミノヘプタンが変換率99%で生成しており、立体配置は(S)体で光学純度は99.2%e.e.であった。
カラム:Rtx−5 Amine(30m,0.25mmID)(RESTEK社製)
カラム温度:50℃
注入口温度:250℃
検出器温度:220℃
検出:FID
キャリアーガス:He、150kPa
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。
カラム:Chiralpak AD−H(ダイセル化学工業社製)
溶離液:n−ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン=90/10/0.1(体積比)
流速:1.0mL/分
検出:240nm
カラム温度:35℃
本明細書で引用した全ての刊行物、特許、及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
Claims (13)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
(c)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
(d)配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有し、かつ、下記(1)および/または(2)の性質を有するポリペプチド:
(1)基質特異性:
(a)アミノ基供与体:(S)−1−フェネチルアミン、ベンジルアミンおよび±2−ブチルアミンに対して活性を示し、β−アラニン、および4−アミノ酪酸に対して実質的に活性を示さない、
(b)アミノ基受容体:ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す、
(2)水溶性有機溶媒耐性:終濃度80%v/vの1−プロパノール、2−プロパノール、アセトンのいずれかで2時間処理後の残存活性が処理前の全活性の10%以上を保持する。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるDNA。
- 下記(A)〜(C)のいずれかに記載の請求項2に記載のDNA:
(A)配列表の配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA、
(B)配列表の配列番号2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
(C)配列表の配列番号2に記載の塩基配列において、1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなるDNA。 - 請求項2または3に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項4に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、請求項1に記載のポリペプチド、あるいは請求項5に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
- アミノ化合物のエナンチオマー混合物にアミノ基受容体の存在下、請求項1に記載のポリペプチド、または請求項5に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする光学活性アミノ化合物の製造方法。
- 前記式(1)で表されるケトン化合物が、1−テトラロン、2−テトラロン、5−メトキシ−2−テトラロン、6−メトキシ−2−テトラロン、7−メトキシ−2−テトラロン、8−メトキシ−2−テトラロン、1−ベンジル−3−ピロリジノン、1−Boc−3−ピロリジノン、1−Cbz−3−ピロリジノン、1−ベンジル−3−ピペリジノン、1−Boc−3−ピペリジノン、1−Cbz−3−ピペリジノン、アセトフェノン、3,4−ジメトキシフェニルアセトン、からなる群から選ばれる1以上のケトン化合物である請求項7に記載の製造方法。
- 前記式(3)で表されるアミノ化合物が、1−アミノテトラリン、2−アミノテトラリン、5−メトキシ−2−アミノテトラリン、6−メトキシ−2−アミノテトラリン、7−メトキシ−2−アミノテトラリン、8−メトキシ−2−アミノテトラリン、1−ベンジル−3−アミノピロリジン、1−Boc−3−アミノピロリジン、1−Cbz−3−アミノピロリジン、1−ベンジル−3−アミノピペリジン、1−Boc−3−アミノピペリジン、1−Cbz−3−アミノピペリジン、1−フェネチルアミン、3,4−ジメトキシアンフェタミン、からなる群から選ばれる1以上のアミノ化合物である請求項9に記載の製造方法。
- アミノ基供与体が、1−フェネチルアミン、2−ブチルアミン、2−ペンチルアミン、2−ヘプチルアミン、3−ヘプチルアミン、n−エチルアミン、n−プロピルアミン、n−ブチルアミン、n−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、3−アミノ−1−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体からなる群より選ばれる1以上の化合物である請求項6または7に記載の製造方法。
- アミノ基受容体が、ピルビン酸またはグリオキシル酸である請求項8または9に記載の製造方法。
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