JP4648837B2 - アミントランスアミナーゼ、および該アミントランスアミナーゼを利用した光学活性アミンの製造方法 - Google Patents
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Description
また、天然のキラルプールから光学活性アミン類を誘導する方法も知られている(特許文献1、2、3)。L-アスパラギン酸のような光学活性アミノ酸などが、天然のキラルプールとして利用された。さらに、近年、ケトン類から対応する光学活性なアミン類を酵素触媒を用いて製造する方法が注目されている。酵素触媒としては、微生物菌体、微生物菌体から取り出した酵素、あるいはその粗生成物などが利用される。酵素触媒を利用する方法は、一般に酵素法と呼ばれている。酵素法によるアミン類の製造法としては、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属微生物を用いアンモニウム塩をアミノ源とする方法(特許文献4)、及びトランスアミナーゼ法(特許文献5〜9)などが挙げられる。
またマッカムらの文献(非特許文献3)において、1-ベンジル-3-アミノピロリジンが、ω-アミノ酸トランスアミナーゼを用いて合成できる光学活性なアミンの例として記載されている。しかしこの報告でも、酵素、反応条件、反応成績等などの情報が全く開示されていない。したがって、前述のスターリングらの報告と同様に、技術情報の開示が不十分である。
あるいは3-アミノピロリジンおよび誘導体のエナンチオマー混合物から、酵素触媒の作用によって、光学活性な3-アミノピロリジンあるいはその誘導体を得るための方法も知られていない。
本発明のアミントランスアミナーゼは、(S)-1-フェニルエチルアミンをアミノドナーとし、1-ベンジル-3-ピロリジノンにアミノ基を転移し、1-ベンジル-(S)-3-アミノピロリジンを生産する能力を有する。このアミントランスアミナーゼを用いることにより、光学活性アミノ化合物を、対応するケトン化合物およびアミノ基供与体、または対応するラセミ体およびアミノ基受容体から効率的に製造することができることを見出し本願発明を完成した。すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、それによってコードされるタンパク質、そしてそれらの応用に関する。
(a) 配列番号:5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含み、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;
(d) 配列番号:5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;および
(e) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;
(1) 作用:1級アミン若しくは2級アミンをアミノドナーとして、アルデヒド若しくはケトンにアミノ基を転移し、対応する1級若しくは2級アミンを生成する;
(2) 基質特異性:(S)-1-フェニルエチルアミンをアミノドナーとして、1-ベンジル-3-ピロリジノンにアミノ基を転移し、1-ベンジル-(S)-3-アミノピロリジンを生成する;
(3) 至適pH:6.5−9;および
(4) 至適温度:55℃〜65℃。
〔2〕シュードモナス属微生物由来である〔1〕に記載のポリヌクレオチド。
〔3〕シュードモナス属微生物が、シュードモナス コルガータ (Pseudomonas corrugata) である〔2〕に記載のポリヌクレオチド。
〔4〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔5〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔6〕〔1〕に記載のポリヌクレオチド、または〔1〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを導入された形質転換細胞。
〔7〕〔1〕に記載のポリヌクレオチド、または〔1〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを導入された形質転換細胞を培養し、その培養物から〔1〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を回収する工程を含む、〔1〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の製造方法。
〔8〕シュードモナス属微生物またはシュードモナス コルガータの細胞を培養し、その培養物から〔1〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を回収する工程を含む、〔1〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の製造方法。
〔9〕アミノ基供与体の存在下、〔4〕に記載のタンパク質、該タンパク質を生産する細胞またはその処理物を、ケトン化合物に作用させる工程、および前記ケトン化合物に対応する光学活性アミノ化合物を回収する工程を含む、光学活性アミノ化合物の製造方法。
〔10〕前記ケトン化合物が、下記一般式(1)
(式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリール基、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリールC1−6アルキル基、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよい5〜10員ヘテロアリール基又は下記B群から選ばれる置換基を有していてもよいC1−6アルキル基のいずれかを示し、R1は順位則による優先順位がR2よりも高い基である;
A群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、ハロC1−6アルキル基、−O(CH2)nO−(nは1または2);
B群:ハロゲン原子、水酸基、C1−6アルコキシ基;
または、R1とR2とは互いに結合し、隣接する炭素原子と一緒になって5〜8員ヘテロ環を形成していてもよく、該5〜8員ヘテロ環は、下記置換基C群から選ばれる置換基を有していてもよい;
C群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、C6−10アリール基、C6−10アリールC1−6アルキル基)で表される化合物であり、前記光学活性アミノ化合物として、下記一般式(2)
(式中、R1、R2は、〔7〕に記載の式(1)のR1およびR2と同じである。)で表される化合物を回収する工程を含む、〔9〕に記載の方法。
〔11〕前記ケトン化合物が、アセトフェノン、ベンジルアセトン、1-ベンジル-3-ピロリジノンおよび2−アセチルピリジンからなる群から選ばれる1種の化合物であることを特徴とする〔10〕に記載の方法。
〔12〕前記アミノ基供与体が、フェニルエチルアミン、(S)-フェニルエチルアミン、2-フェニルエチルアミン、ベンジルアミン、sec-ブチルアミン、(S)-sec-ブチルアミン、n-ブチルアミン、1-アミノインダン、L-アラニン、イソプロピルアミンおよび(R)-フェニルグリシノールからなる群から選ばれる1種の化合物である、〔9〕に記載の方法。
〔13〕アミノ基受容体の存在下、〔4〕に記載のタンパク質、該タンパク質を生産する細胞またはその処理物を、下記一般式(5)で表されるアミノ化合物のエナンチオマー混合物に作用させる工程:
(式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリール基、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリールC1−6アルキル基、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよい5〜10員ヘテロアリール基又は下記B群から選ばれる置換基を有していてもよいC1−6アルキル基のいずれかを示し、R1は順位則による優先順位がR2よりも高い基である;
A群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、ハロC1−6アルキル基、−O(CH2)nO−(nは1または2);
B群:ハロゲン原子、水酸基、C1−6アルコキシ基;
または、R1とR2とは互いに結合し、隣接する炭素原子と一緒になって5〜8員炭素環又は5〜8員ヘテロ環を形成していてもよく、該5〜8員炭素環又は5〜8員ヘテロ環は、下記置換基C群から選ばれる置換基を有していてもよい;
C群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、C6−10アリール基、C6−10アリールC1−6アルキル基);および
残存する下記一般式(6)で表される光学活性アミノ化合物を回収する工程を含む光学活性アミノ化合物の製造方法;
(式中、R1及びR2は、それぞれ前記一般式(5)と同義である。)で表される化合物。
〔14〕前記一般式(5)で表されるアミノ化合物が、1-ベンジル-3-アミノピロリジン、1−フェニルエチルアミン、4−フェニル−2−アミノブタンおよび2−(1−アミノエチル)ピリジン、フェニルグリシノールからなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物である、〔13〕に記載の方法。
〔15〕前記アミノ基受容体が、2-ケトグルタル酸、アセトフェノン、ベンジルアセトン、プロピオンアルデヒド、1-ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒドおよびフェニルアセトアルデヒドからなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする〔13〕に記載の方法。
−合成副産物が少ない
−常温、常圧で行うことができるので安全である
−原料を酵素活性物質と接触させる簡便な方法である
しかし既知のω-アミノ酸トランスアミナーゼには、特に産業的な利用に好適な性状を備えていなかった。たとえば、基質化合物を十分に溶解できる温度において、酵素活性が低下するといった課題が見出された。一方、本発明のアミントランスアミナーゼは、幅広い温度領域で高度な残存活性を有する。特に高温領域においても高い反応速度を維持するのが本発明のアミントランスアミナーゼの大きな特徴である。すなわち、本発明のアミントランスアミナーゼの酵素活性は、基質化合物の溶解性の高い温度条件においても高度に維持される。したがって、本発明のアミントランスアミナーゼは、産業的な利用において有用な酵素である。
本発明は、新規なアミントランスアミナーゼをコードする下記(a)-(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドに関する。
(a) 配列番号:5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含み、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;
(d) 配列番号:5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;および
(e) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;
(1) 作用:1級アミン若しくは2級アミンをアミノドナーとして、アルデヒド若しくはケトンにアミノ基を転移し、対応する1級若しくは2級アミンを生成する;
(2) 基質特異性:(S)-1-フェニルエチルアミンをアミノドナーとして、1-ベンジル-3-ピロリジノンにアミノ基を転移し、1-ベンジル-(S)-3-アミノピロリジンを生成する;
(3) 至適pH:6.5−9;および
(4) 至適温度:55℃〜65℃。
(5)分子量:SDS−PAGEによって測定した分子量が約51000、ゲルろ過によって測定した分子量が約150000。
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中、下記組成の反応液(0.5mL)中で、30℃で反応させる。
20mM (S)-フェニルエチルアミン、
10mM 1−ベンジル-3-ピロリジノン、
0.05mM PLP、5mM DTT及び
酵素液
酵素反応を0.1mLの1N HClで停止し、反応液に含まれる反応生成物である1−ベンジル-3-アミノピロリジンを定量する。1−ベンジル-3-アミノピロリジンは、HPLCで定量することができる。定量条件は、たとえば実施例に記載したような条件を利用することができる。この条件で、たとえば1分間に1μmolの1−ベンジル-3-アミノピロリジンの生成を触媒する酵素量を1Uとする。
本発明のアミントランスアミナーゼは、特に好ましい態様において、特に高温領域においても極めて高い残存活性を有する。前記反応条件のうち温度条件を変えることで、種々の温度条件における酵素活性の変化を確認することができる。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称:独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター(NPMD)
あて名:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8(郵便番号292-0818)
(b)寄託日:2005年9月21日
(c)受託番号:NITE P-139
コロニーハイブリダイゼーション、
プラークハイブリダイゼーション、
サザンブロット法
スクリーニングには、酵素生産株であるシュードモナス・コルガータ、あるいはその他の生物種等の染色体DNA、またはcDNAライブラリーを利用することができる。
また、酵素生産株の染色体DNAまたはcDNAライブラリーを鋳型としてPCRによって、本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。PCR用のプライマーは、配列番号:5の塩基配列を元にデザインすることができる。PCRによって得られたDNAが断片であれば、DNA断片の塩基配列に基づいて更にその全長配列を決定することができる。たとえば、逆PCR(inverse PCR; Genetics(1988)120: 621-3)を利用して、断片配列情報に基づいて、全長配列を決定することができる。逆PCRは、部分的に塩基配列が不明なDNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応により環化されたDNAを鋳型として利用するPCRである。断片配列内部にアニールするプライマーを利用して、その前後に連続する塩基配列が未知の領域を増幅することができる。
あるいはRACE法(Rapid Amplification of cDNA End;「PCR実験マニュアル」HBJ出版局,p25-33)によって本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989)、特にSection9.47-9.58)、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley&Sons(1987-1997)、特にSection6.3-6.4)、「DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.」(Oxford University(1995)、特にSection2.10)等を参照することができる。
本発明において、塩基配列、あるいはアミノ酸配列のホモロジーは、 Lipman-Pearson法(Science (1985)227:1435-41)によるプログラムを用いて計算した値を表す。タンパク質のホモロジーは、アミノ酸配列に関するデータベースを利用して検索することができる。例えばSWISS-PROT、PIR、DAD等のタンパク質のアミノ酸に配列情報を蓄積したデータベースを利用することができる。あるいはDNAのホモロジーは、塩基配列情報を蓄積したデータベースを利用して検索することができる。DDBJ、EMBLまたはGenBank等のDNAに関するデータベースが公知である。これらのデータベースにおいては、DNAの塩基配列を元に予想されたアミノ酸配列情報を利用することもできる。各種の配列情報は、これらのデータベース等を対象に、BLAST、FASTA等のプログラムを利用して検索することができる。ここに例示したデータベースは、いずれもインターネット(例えば、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)を通じて利用することができる。
(1)中性疎水性側鎖(アラニン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、ロイシン);
(2)中性極性側鎖(アスパラギン、グリシン、グルタミン、システイン、セリン、チロシン、トレオニン);
(3)塩基性側鎖(アルギニン、ヒスチジン、リシン);
(4)酸性側鎖(アスパラギン酸、グルタミン酸);
(5)脂肪族側鎖(アラニン、イソロイシン、グリシン、バリン、ロイシン);
(6)脂肪族水酸基側鎖(セリン、トレオニン);
(7)アミン含有側鎖(アスパラギン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、リシン);
(8)芳香族側鎖(チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン);および
(9)硫黄含有側鎖(システイン、メチオニン)。
本発明は、新規なアミントランスアミナーゼを提供する。本発明のアミントランスアミナーゼは、上述の本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ以下の理化学性状を有するタンパク質である。
(2) 基質特異性:(S)-1-フェニルエチルアミンをアミノドナーとして、1-ベンジル-3-ピロリジノンにアミノ基を転移し、1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンを生成する;
(3) 至適pH:6.5−9;および
(4) 至適温度:55℃〜65℃。
本発明のアミントランスアミナーゼは、好ましくは更に付加的に次の理化学性状(5)を有するタンパク質である。
(5)分子量:SDS−PAGEによって測定した分子量が約51000、ゲルろ過によって測定した分子量が約150000。
回収された本発明の酵素は、例えば、次のようにして精製することができる。まず、十分に増殖させた後に菌体を回収し、適当な緩衝液中で破砕して無細胞抽出液を得る。緩衝液には、必要に応じ、2-メルカプトエタノールまたはフェニルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤、およびプロテアーゼ阻害剤を加えることができる。該無細胞抽出液から、タンパク質の精製において慣用の方法を適宜組み合せ、本発明の酵素を精製することができる。本発明において、たとえば次のような精製方法を利用することができる。
有機溶媒による沈澱、
硫安等による塩析、
陽イオン交換クロマトグラフィイー、
陰イオン交換クロマトグラフィイー、
ゲルろ過、
疎水性クロマトグラフィー、
キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー
例えば、実施例1において示されるように、塩析、DEAEセファセルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、フェニル-セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、およびブチル-セファロースを用いた疎水クロマトグラフィーを経て、シュードモナス・コルガータ(Pseudomoans corrugata)10F6株由来の酵素を電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。本発明において、精製途中および精製後のアミントランスアミナーゼの活性は、例えば、実施例に示すような方法によって確認することができる。
アフィニティークロマトグラフィー、
アニオンまたはカチオン交換等のイオン交換クロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー、
ゲル濾過、
疎水性クロマトグラフィー、
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、
レクチンクロマトグラフィー
本発明のポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、アミントランスアミナーゼ発現ベクターが提供される。即ち本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。適当なベクターとして、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ等の種々のベクターを挙げることができる(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press(1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons(1987)参照)。本発明の好ましいベクターとしては、これに限定されるわけではないが、例えば、大腸菌における発現ベクターpSE420Dにアミントランスアミナーゼをコードする遺伝子を発現可能に挿入したpK4EC等が挙げられる。
本発明のベクターは、好ましくは、挿入された本発明のポリヌクレオチドの発現に必要とされる制御配列の全ての構成成分を含むものである。さらに、本発明のベクターは、該ベクターが導入された宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができる。
(1)宿主ベクター系の開発されている細菌
・エシェリヒア(Escherichia)属
・バチルス(Bacillus)属
・シュードモナス(Pseudomonas)属
・セラチア(Serratia)属
・ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
・コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
・ストレプトコッカス(Streptococcus)属
・ラクトバチルス(Lactobacillus)属など
(2)宿主ベクター系の開発されている放線菌
・ロドコッカス(Rhodococcus)属
・ストレプトマイセス(Streptomyces)属など
(3)宿主ベクター系の開発されている酵母
・サッカロマイセス(Saccharomyces)属
・クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
・シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
・チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
・ヤロウイア(Yarrowia)属
・トリコスポロン(Trichosporon)属
・ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
・ピキア(Pichia)属
・キャンディダ(Candida)属など
(4)宿主ベクター系の開発されているカビ
・ノイロスポラ(Neurospora)属
・アスペルギルス(Aspergillus)属
・セファロスポリウム(Cephalosporium)属
・トリコデルマ(Trichoderma)属など
本発明によって提供されたアミントランスアミナーゼ、あるいは当該酵素活性を有する形質転換体は、光学活性アミンの製造に利用することができる。本発明において、アミントランスアミナーゼ活性を有する酵素活性物質とは、たとえば次の酵素、蛋白質、それらを産生する細胞、およびそれらの処理物を含む。
i).前記理化学的性状(1)-(4)、あるいは(1)-(5)を有するアミントランスアミナーゼ;
ii).前記(a)-(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質;
iii).iのアミントランスアミナーゼ、またはiiの蛋白質を産生する細胞;
iv).iのアミントランスアミナーゼ、iiの蛋白質、またはiiiの細胞の処理物
微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
本発明に係る光学活性アミノ化合物の製造方法は、アミノ基供与体の存在下、前記タンパク質、該タンパク質を生産する細胞またはその処理物をケトン化合物に作用させる工程、および前記アミノ基供与体および前記ケトン化合物に対応する光学活性アミノ化合物を回収する工程を含む。
A群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、ハロC1−6アルキル基、−O(CH2)nO−(nは1または2);
また、R1とR2とは互いに結合し、隣接する炭素原子と一緒になって5〜8員ヘテロ環を形成していてもよい。該5〜8員ヘテロ環は、下記置換基C群から選ばれる置換基を有していてもよい。C群の置換基は、反応に不活性な置換基であれば限定されないが、好ましくは下記の置換基が挙げられる。
このうち、好ましくは、(i)R1とR2のいずれかがB群から選ばれる置換基を有していてもよいC1−6アルキル基で、いずれかがA群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリール基もしくはA群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリールC1−6アルキル基の組み合わせであるか、または、(ii)R1とR2とは互いに結合し、隣接する炭素原子と一緒になった5〜8員ヘテロ環が挙げられ、該5〜8員ヘテロ環は、下記置換基C群から選ばれる置換基を有していてもよい。
C群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、C6−10アリール基、C6−10アリールC1−6アルキル基。
前記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリール基のうち、好ましくは、無置換のC6−10アリール基が挙げられる。前記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリールC1−6アルキル基のうちでは、好ましくは、無置換のC6−10アリール基C1−6アルキル基が挙げられる。前記A群から選ばれる置換基を有していてもよい5〜10員ヘテロアリール基のうちでは、好ましくは、無置換の5〜10員ヘテロアリール基が挙げられる。
pは好ましくは2または3、qは好ましくは1である。
本明細書における「ヘテロアリール基」は、環を構成する原子中に1または複数個のヘテロ原子を含有する芳香族性の環の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、またはベンゼン環または単環へテロアリール環と縮合した2環式ヘテロアリール基であってもよい。環を構成する原子の数は好ましくは5〜10である(C5-10ヘテロアリール基)。
ヘテロアリール基としては具体的には、たとえば、ピリジル基、ピラジニル基、チエニル基、フリル基、チアゾリル基などが挙げられる。本明細書における「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。
フェニルエチルアミン、
(S)-フェニルエチルアミン、
2-フェニルエチルアミン、
ベンジルアミン、
sec-ブチルアミン、
(S)-sec-ブチルアミン、
n-ブチルアミン、
1-アミノインダン、
L-アラニン、
(R)-フェニルグリシノール、および
イソプロピルアミン
これらの化合物のうち、(S)-フェニルエチルアミンは本発明における好ましいアミノ基供与体である。
式中、R1、R2は前記一般式(1)におけるR1、R2とそれぞれ同意義である。
式中、R1、R2は前記一般式(1)におけるR1、R2とそれぞれ同意義である。
式中、YはHまたはアミノ基の保護基を示し、pは2〜3の整数、qは1〜2の整数を示し、p>qである。pは好ましくは2または3、qは好ましくは1である。
式中、R1及びR2は、それぞれ前記一般式(5)と同義である。
式中、Y、p、qは、前記式(7)のY、p、qと同意義である。
基質である一般式(1)または(3)で表されるケトン化合物または一般式(5)または(7)で表されるアミノ化合物は、タンパク質(酵素)の基質阻害が起らない濃度範囲で、一括あるいは間欠的に、あるいは連続して培地等の反応系に添加すればよく、通常0.01から20%(wt/wt)反応液の質量に対する基質の質量の割合程度添加する。
1)培地に最初から基質、アミノ基供与体またはアミノ基受容体を添加しておき、培養する方法、
2)培養液をそのまま用い、該培養液に、アミノ基供与体またはアミノ基受容体、基質となるケトン化合物あるいはアミノ化合物を添加する方法、
3)遠心分離などにより細胞を分離し、これをそのまま、あるいは洗浄した後、緩衝液、水などに再懸濁したものに、アミノ基供与体またはアミノ基受容体、基質を添加し、反応させる方法
細胞は生菌体のままでもよいし、菌体破砕物、アセトン処理、トルエン処理、凍結乾燥などの処理を施した処理物を利用することもできる。反応は静置あるいは振とう、攪拌いずれでも行うことができる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。
シュードモナス・コルガータ 10F6株を下記の組成の培地(pH7.0)で25℃、40時間振盪培養し、遠心分離により菌体を得た。
3g/Lグルコース、
1g/L KH2PO4、
3g/L K2HPO4、
0.5g/L MgSO4・7H2O、
2g/L 酵母エキス、
10mL/L ミネラル溶液(1.5g/L ニトリロ三酢酸、1.06g/L FeCl2・5H2O、0.8g/L CaCl2・2H2O、0.4g/L ZnSO4・7H2O、0.2g/L MnCl2・4H2O、0.002g/L CuSO4・5H2O、0.02g/L KI、0.02g/L Na2Mo4・2H2O、0.02g/L CoCl2・6H2O、0.04g/L H3BO3、1g/L NaCl、pH7.0(KOH))、
1g/L 1-アミノペンタン
実施例1により調製した菌体40gを、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、1mM ジチオスレイトール(DTT)、0.2mM EDTA、0.05mM ピリドキサール-5'-リン酸(PLP)を含む菌体破砕液に懸濁し、ガラスビーズにより菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清画分を無細胞抽出液とした。
無細胞抽出液を硫酸プロタミン処理によって核酸を除いた後、70%飽和まで硫安を添加し、遠心分離により上清画分を除去し、得られた沈殿画分を回収した。この沈殿画分を30%飽和硫安濃度となるように緩衝液1に懸濁した。緩衝液1の組成は次のとおりである。
緩衝液1:10mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、
1mM DTT、
0.2mM EDTA、および
0.05mM PLP
次いで、30%飽和硫安を含む緩衝液1で平衡化したPhenyl-Toyopearl 650Mカラム(5.0×23.5cm、アマシャム製)に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、緩衝液1を用いて5mL/minで30%飽和から0%硫安までグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮後、緩衝液1で透析した。
精製酵素をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果、単一バンドを示した。
精製の要約を表1に示した。各ステップにおいて得られた酵素液の(S)-フェニルエチルアミン:1−ベンジル-3-ピロリジノン トランスアミナーゼ活性は実施例3に記載の方法により行った。
(S)-トランスアミナーゼの精製
実施例2で得た酵素液を用いて本酵素の(S)-フェニルエチルアミン:1−ベンジル-3-ピロリジノン トランスアミナーゼ活性を測定した。100mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、20mM(S)-フェニルエチルアミン、10mM 1−ベンジル-3-ピロリジノン、0.05mM PLP、5mM DTT及び酵素液を合む0.5mLの反応液中30℃で反応させた後、0.1mLの1N HClで反応を停止した。得られた反応終了液に含まれる1−ベンジル-3-アミノピロリジンを以下に示す分析条件においてHPLCで定量した。この条件の下、1分間に1μmolの1−ベンジル-3-アミノピロリジンの生成を触媒する酵素量を1Uとした。
また、タンパク質は、Bovine Plasma Albuminを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により定量した。
カラム:Luna 5u C18(2)(2.0mm×150mm)(フェノメネックス(phenomenex)社)
溶離液:50mM KPB (pH 2.5)、5mM 1-hexanesulfonic acid/CH3CN=91/9
流速:0.2mL/min
カラム温度:40℃
検出:254nm
精製酵素を、SMART SystemにおいてSuperdex 200 3.2/30(アマシャム製)を用い、10mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、1mM DTT、0.05mM PLP、0.2M塩化ナトリウムを含む溶離液でゲル濾過を行った結果、分子量は約150,000であった。
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサブユニットの分子量を測定した結果、約51,000であった。
実施例2で得た(S)-トランスアミナーゼをリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)を用いて20℃から90℃で実施例3に記載の方法により活性測定を行い図1に示した。本酵素の最適温度は、60℃であり、55℃から65℃の範囲で80%以上の活性を示した。
実施例2で得た(S)-トランスアミナーゼを、酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス-塩酸緩衝液、リン酸1水素2カリウム-KOH緩衝液を用いて実施例3に記載の方法によって酵素活性を測定した。結果を図2に示した。本酵素はpH6.5からpH9.0の範囲で80%以上の活性を示した。
実施例2で得た酵素液を用い、アミノ基供与体およびアミノ基受容体の基質特異性を調べた。
アミノ基供与体に対する特異性は、実施例3に示す方法で各種のアミノ基供与体を用いて活性測定することによって行った。(S)-フェニルエチルアミンに対する活性を100とした相対活性で表し、表2に示す。
アミノ基供与体の基質特異性
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、20mM L-アラニン、10mM アミノ基受容体、0.05mM PLP、5mM DTT、0.2mM NADH、L-乳酸脱水素酵素及び酵素液を合む1.0mLの反応液中30℃で反応させ、NADHの減少にともなう340nmの吸光度の減少を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とする。
1−ベンジル-3-ピロリジノンに対する活性を100とした相対活性で表し、表3に示す。
アミノ基受容体の基質特異性
シュードモナス・コルガータ 10F6株(Pseudomonas corrugata 10F6)より、Nucleic.Acids Res.8,4321(1980)の方法に従ってゲノムDNAを精製した。
センスプライマーとしてPCAT-N(配列番号:1)、アンチセンスプライマーとしてPCAT-C3a(配列番号:2)を合成した。PCR反応は、シュードモナス・コルガータ 10F6株 (Pseudomonas corrugata 10F6)ゲノムDNA 100ng、2.0U ExTaq DNAポリメラーゼ、ExTaq用緩衝液、0.2mM dNTP、100pmolのPCAT-N、20pmolのPCAT-Tのプライマーセットを含む50μLの反応液で94℃、30秒、51℃、30秒、72℃、1分30秒、30サイクルを行った。
配列番号:1 PCAT-N
GTCGAATTCATGTAYGARCARTAYAARACNGC
配列番号:2 PCAT-C3a
GTCGAATTCTTBGCVGGRTCVARVGGYTC
形質転換株をアンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地(1%バクト-トリプトン、0.5%バクト-酵母エキス、1%塩化ナトリウム、以下、LB培地と略す)プレート上で生育させ、いくつかのコロニーをアンピシリンを含む液体LB培地で培養し、Flexi-Prep(ファルマシア製)によりプラスミドを精製し、pPCATとした。
精製したプラスミドを用いて、挿入DNAの塩基配列を解析した。DNA塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行い、DNAシーケンサーABI PRISMTM310(パーキンエルマー製)により行った。
シュードモナス・コルガータ 10F6株ゲノムDNAを制限酵素PstIで消化し、T4リガーゼを用いて16℃で終夜、自己環化反応により各断片を環化させた。次に、実施例9で明らかにした配列をもとに構築したプライマーPCSAT-231R(配列番号:3)およびPCSAT-755F(配列番号:4)を各100pmol、環化DNAを25ng、Ex-Taq用緩衝液(宝酒造製)、Ex-Taq 2U(宝酒造製)を含む50μLの反応液を用い、94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/7分を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。
配列番号:3 PCSAT-231R
GCCGTCAAAGGTCTGGTAATAG
配列番号:4 PCSAT-755F
TGATCGCCGATGAAGTGGTCA
実施例10で明らかとなった塩基配列をもとにセンスプライマーとしてPCSAT-ATG1(配列番号:7)、アンチセンスプライマーとしてPCSAT-TAA1(配列番号:8)を合成した。PCR反応は実施例8で得られたPCR産物100ngを鋳型として、2.5 U PfuTurbo DNAポリメラーゼ、PfuTurbo用緩衝液、0.2mM dNTP、20pmolのプライマーPCSAT-ATG1、PCSAT-TAA1のセットを含む50μLの反応液で94℃/30秒、64℃/30秒、72℃/1分30秒、30サイクルを行った。
配列番号:7 PCSAT-ATG1
CAAACATGTACGAGCAATACAAGACAGCACAGAA
配列番号:8 PCSAT-TAA1
GACTCTAGATTAGCGGCAATCGGCGAGCGCGCTG
実施例11で得られたプラスミドpSUPCAT1で形質転換された大腸菌JM109株の(S)-トランスアミナーゼ活性を確認した。大腸菌JM109(pSUPCAT1)をアンピシリン(50μg/mL)を含む7mLの液体LB培地に植菌した後30℃で培養した。目的遺伝子の発現誘導は0.1mM IPTGを添加することによって行った。培養後、遠心分離により集菌体を得た。得た集菌体は、0.05mM PLP、0.2mM EDTA、1mM DTTを含む50mMリン酸緩衝液(pH6.0)に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM(コスモバイオ製)を用いて4分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を無細胞抽出液として実施例3に記載の方法によって(S)-トランスアミナーゼ活性を測定した結果、0.23U/mgの比活性を有することが確認できた。
実施例12と同様の方法で得られたプラスミドpSUPCAT1を有する大腸菌JM109株の菌体を用いて(S)-フェニルエチルアミンの合成を行った。
400mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、50mM アセトフェノン、200mM sec-ブチルアミン、0.05mM PLPおよび菌体を含む1mLの反応液を、攪拌下、30℃で24時間反応させた。反応終了液を0.1N HClで希釈し、遠心分離上清をHPLCを用いて以下の条件により生成した(S)-フェニルエチルアミンの定量、及び光学純度を分析した。その結果、12.3mMの(S)-フェニルエチルアミンが100%e.e.の光学純度で得られた。
カラム:Luna 5u C18(2)(2.0mm×150mm)(フェノメネックス(phenomenex)社)
溶離液:50mM KPB(pH2.5)、5mM 1-hexanesulfonic acid/CH3CN=91/9
流速:0.2mL/min
カラム温度:40℃
検出:254nm
光学純度分析:
カラム:CROWNPAK CR(+)(4.6mm*150mm)(ダイセル化学工業(株)製)
カラム温度:30℃
検出:254nm
流速:0.6mL/min
溶離液:HClO4水溶液(pH 1.5)
実施例12で得られたプラスミドpSUPCAT1を有する大腸菌JM109株を用いて1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンの合成を行った。
400mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、50mM 1−ベンジル-3-ピロリジノン、100mM (S)-フェニルエチルアミン、0.05mM PLP、5mM DTTおよび菌体を含む1mLの反応液を、攪拌下、30℃で24時間反応させた。反応終了液を0.1N HClで希釈し、遠心分離上清をHPLCを用いて以下の条件により生成した1-ベンジル-3-アミノピロリジンを定量分析した。また、1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンの光学純度分析は次のようにGITCで誘導体化した後、HPLC分析することによって行った。
カラム:Luna 5u C18(2)(2.0mm×150mm)(フェノメネックス(phenomenex)社)
溶離液:50mM KPB(pH 2.5)、5mM 1-hexanesulfonic acid/CH3CN=91/9
流速:0.2mL/min
カラム温度:40℃
検出:254nm
光学純度分析:
カラム: Luna 5u C18(2)(2mm*150mm)
カラム温度: 40℃
検出: 254nm
流速: 0.2mL/min
溶離液: 酢酸-アンモニア緩衝液(pH 4.0)/MeOH=6/4
実施例12と同様の方法で得られた大腸菌JM109(pSUPCAT1)の無細胞抽出液を用いて1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンの合成を行った。
400mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、50mM 1−ベンジル-3-ピロリジノン、200mM sec-ブチルアミン、0.05mM PLP、5mM DTTおよび0.2Uの酵素液を含む3mLの反応液を、攪拌下、30℃で24時間反応させた。実施例15と同様の方法により、生成した1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンの定量および光学純度分析を行った。その結果、45.7mMの1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンが43.8%e.e.の光学純度で得られた。
実施例12と同様の方法で得られた大腸菌JM109(pSUPCAT1)の無細胞抽出液を用いて1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンの合成を行った。
400mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、50mM 1−ベンジル-3-ピロリジノン、100mM (S)-フェニルエチルアミン、0.05mM PLP、5mM DTTおよび0.9Uの酵素液を含む3mLの反応液を、攪拌下、30℃で24時間反応させた。実施例15と同様の方法により、生成した1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンの定量および光学純度分析を行った。その結果、47.0mMの1−ベンジル−(S)-3-アミノピロリジンが89.3%e.e.の光学純度で得られた。
Claims (15)
- 下記(a)-(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(a) 配列番号:5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含み、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;
(d) 配列番号:5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;および
(e) 配列番号:6に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ下記(1)-(4)に記載の理化学的性質を有する(S)-アミントランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド;
(1) 作用:1級アミン若しくは2級アミンをアミノドナーとして、アルデヒド若しくはケトンにアミノ基を転移し、対応する1級若しくは2級アミンを生成する;
(2) 基質特異性:(S)-1-フェニルエチルアミンをアミノドナーとして、1-ベンジル-3-ピロリジノンにアミノ基を転移し、1-ベンジル-(S)-3-アミノピロリジンを生成する;
(3) 至適pH:6.5−9;および
(4) 至適温度:55℃〜65℃。 - シュードモナス属微生物由来である請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- シュードモナス属微生物が、シュードモナス コルガータ (Pseudomonas corrugata) である請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチド、または請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを導入された形質転換細胞。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチド、または請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを導入された形質転換細胞を培養し、その培養物から請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を回収する工程を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の製造方法。
- シュードモナス属微生物またはシュードモナス コルガータの細胞を培養し、その培養物から請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を回収する工程を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の製造方法。
- アミノ基供与体の存在下、請求項4に記載のタンパク質、該タンパク質を生産する細胞またはその処理物を、ケトン化合物に作用させる工程、および前記ケトン化合物に対応する光学活性アミノ化合物を回収する工程を含む、光学活性アミノ化合物の製造方法。
- 前記ケトン化合物が、下記一般式(1)
(式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリール基、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリールC1−6アルキル基、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよい5〜10員ヘテロアリール基又は下記B群から選ばれる置換基を有していてもよいC1−6アルキル基のいずれかを示し、R1は順位則による優先順位がR2よりも高い基である;
A群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、ハロC1−6アルキル基、−O(CH2)nO−(nは1または2);
B群:ハロゲン原子、水酸基、C1−6アルコキシ基;
または、R1とR2とは互いに結合し、隣接する炭素原子と一緒になって5〜8員ヘテロ環を形成していてもよく、該5〜8員ヘテロ環は、下記置換基C群から選ばれる置換基を有していてもよい;
C群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、C6−10アリール基、C6−10アリールC1−6アルキル基)で表される化合物であり、前記光学活性アミノ化合物として、下記一般式(2)
(式中、R1、R2は、請求項7に記載の式(1)のR1およびR2と同じである。)で表される化合物を回収する工程を含む、請求項9に記載の方法。 - 前記ケトン化合物が、アセトフェノン、ベンジルアセトン、1-ベンジル-3-ピロリジノンおよび2−アセチルピリジンからなる群から選ばれる1種の化合物であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記アミノ基供与体が、フェニルエチルアミン、(S)-フェニルエチルアミン、2-フェニルエチルアミン、ベンジルアミン、sec-ブチルアミン、(S)-sec-ブチルアミン、n-ブチルアミン、1-アミノインダン、L-アラニン、イソプロピルアミンおよび(R)-フェニルグリシノールからなる群から選ばれる1種の化合物である、請求項9に記載の方法。
- アミノ基受容体の存在下、請求項4に記載のタンパク質、該タンパク質を生産する細胞またはその処理物を、下記一般式(5)で表されるアミノ化合物のエナンチオマー混合物に作用させる工程:
(式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリール基、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよいC6−10アリールC1−6アルキル基、下記A群から選ばれる置換基を有していてもよい5〜10員ヘテロアリール基又は下記B群から選ばれる置換基を有していてもよいC1−6アルキル基のいずれかを示し、R1は順位則による優先順位がR2よりも高い基である;
A群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、ハロC1−6アルキル基、−O(CH2)nO−(nは1または2);
B群:ハロゲン原子、水酸基、C1−6アルコキシ基;
または、R1とR2とは互いに結合し、隣接する炭素原子と一緒になって5〜8員炭素環又は5〜8員ヘテロ環を形成していてもよく、該5〜8員炭素環又は5〜8員ヘテロ環は、下記置換基C群から選ばれる置換基を有していてもよい;
C群:ハロゲン原子、水酸基、C1−4アルキル基、C1−6アルコキシ基、C6−10アリール基、C6−10アリールC1−6アルキル基);および
残存する下記一般式(6)で表される光学活性アミノ化合物を回収する工程を含む光学活性アミノ化合物の製造方法;
(式中、R1及びR2は、それぞれ前記一般式(5)と同義である。)で表される化合物。 - 前記一般式(5)で表されるアミノ化合物が、1-ベンジル-3-アミノピロリジン、1−フェニルエチルアミン、4−フェニル−2−アミノブタンおよび2−(1−アミノエチル)ピリジン、フェニルグリシノールからなる群から選ばれる少なくとも1種の化合物である、請求項13に記載の方法。
- 前記アミノ基受容体が、2-ケトグルタル酸、アセトフェノン、ベンジルアセトン、プロピオンアルデヒド、1-ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒドおよびフェニルアセトアルデヒドからなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項13に記載の方法。
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