JP4984925B2 - アミノアシラーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、アミノアシラーゼをコードする遺伝子、及び該酵素に関する。
光学活性な医農薬中間体の製造に関してこれまでにアミノアシラーゼを含む菌体を用いる幾つかの方法（特許文献１及び４〜６）が知られていた。またＤＬ−アミノ酸の光学分割やポリウレタンの分解に適した酵素については、幾つかの遺伝子が知られていた（特許文献２および３）。
特開２００１−１４９０８９
特開２００２−３２０４９１
特開２００６−５５００５
特許２６９８６２７
特許２９２８６１３
特許３６０８７９８
光学活性なアミン化合物を製造するのに適したアミノアシラーゼをコードする遺伝子及び当該遺伝子を用いた組換体を用いる光学分割方法を提供する。
本発明は、式（１）：
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアリール基を表し、Ｒ２は、Ｃ１−３のアルキル基を表し、Ｒ３はＣ1-６のアルキル基を表し、＊のついた炭素原子は不斉炭素原子を表す。）
で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、式（２）：
（式中、Ｒ１、Ｒ２および＊は、前記定義のとおり。）
で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、該酵素、および該酵素の産生に適した形質転換体、当該光学活性アミン化合物の製造方法を提供する。
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアリール基を表し、Ｒ２は、Ｃ１−３のアルキル基を表し、Ｒ３はＣ1-６のアルキル基を表し、＊のついた炭素原子は不斉炭素原子を表す。）
で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、式（２）：
（式中、Ｒ１、Ｒ２および＊は、前記定義のとおり。）
で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、該酵素、および該酵素の産生に適した形質転換体、当該光学活性アミン化合物の製造方法を提供する。
即ち、本発明は、
１．下記a)からｅ）のいずれかの塩基配列を有する遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも９０％のＤＮＡの塩基配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表されるアミン化合物に変換する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列、
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミドを立体選択的に加水分解できるアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
ｄ）配列番号２で示される塩基配列、
ｅ）配列番号９で示される塩基配列；
２．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とする遺伝子；
３．前項１又は２記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある）；
４.前項２記載の遺伝子又は前項３記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
５．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
６．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
７．前項１記載の遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある）；
８．前項３記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
９．下記のアミノ酸配列のいずれかの特徴を有するタンパク質（以下、本発明タンパク質と記すこともある）；
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも９０％のＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｅ)配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも９０％のアミノ酸配列であって、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
１０.前項４〜７記載の形質転換体を培養して，前項９記載のアミノアシラーゼ生産させることを特徴とするアミノアシラーゼの生産方法；
１１.前項１０記載の生産方法で生産されたアミノアシラーゼ、または前項９記載のタンパク質を式（１）のアシルアミド化合物に作用させ、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物へ加水分解することを特徴とする、式（１）で示されるアシルアミド化合物の加水分解方法；等を提供するものである。
１．下記a)からｅ）のいずれかの塩基配列を有する遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも９０％のＤＮＡの塩基配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表されるアミン化合物に変換する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列、
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミドを立体選択的に加水分解できるアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
ｄ）配列番号２で示される塩基配列、
ｅ）配列番号９で示される塩基配列；
２．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とする遺伝子；
３．前項１又は２記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある）；
４.前項２記載の遺伝子又は前項３記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
５．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
６．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
７．前項１記載の遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある）；
８．前項３記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
９．下記のアミノ酸配列のいずれかの特徴を有するタンパク質（以下、本発明タンパク質と記すこともある）；
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも９０％のＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｅ)配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも９０％のアミノ酸配列であって、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列；
１０.前項４〜７記載の形質転換体を培養して，前項９記載のアミノアシラーゼ生産させることを特徴とするアミノアシラーゼの生産方法；
１１.前項１０記載の生産方法で生産されたアミノアシラーゼ、または前項９記載のタンパク質を式（１）のアシルアミド化合物に作用させ、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物へ加水分解することを特徴とする、式（１）で示されるアシルアミド化合物の加水分解方法；等を提供するものである。
本発明によれば、光学活性なアミン化合物を工業的に製造するのに適したアミノアシラーゼをコードする遺伝子、該酵素、および該酵素を用いた立体選択的加水分解反応に好適な酵素を産生する形質転換体が得られる。
Ｒ１で表される、置換されていてもよいアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、ビフェニル基等のＣ５−１２のアリール基および当該アリール基の置換基としては、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素）、Ｃ１−４のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基またはブチル基）、Ｃ１−４のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基）が例示される。
Ｒ２で表されるＣ１−３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基およびイソプロピル基が例示される。
Ｒ３で表されるＣ1-６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基およびヘキシル基が例示される。
式（１）のアシルアミド化合物の具体例としては、例えば、Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミン、Ｎ−アセチル−１−エチルベンジルアミン等が例示される。
本発明の方法においては、通常、ラセミの式（１）のアシルアミド化合物が使用されるが、式（１）の化合物のエナンチオマーの混合物であっても選択的加水分解に用いることができる。本発明において式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解するとは、式（１）のアシルアミド化合物の一方のエナンチオマー（＊印のついた不斉炭素原子に関する一方の光学活性体）を選択的に加水分解することを意味する。
Ｒ２で表されるＣ１−３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基およびイソプロピル基が例示される。
Ｒ３で表されるＣ1-６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基およびヘキシル基が例示される。
式（１）のアシルアミド化合物の具体例としては、例えば、Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミン、Ｎ−アセチル−１−エチルベンジルアミン等が例示される。
本発明の方法においては、通常、ラセミの式（１）のアシルアミド化合物が使用されるが、式（１）の化合物のエナンチオマーの混合物であっても選択的加水分解に用いることができる。本発明において式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解するとは、式（１）のアシルアミド化合物の一方のエナンチオマー（＊印のついた不斉炭素原子に関する一方の光学活性体）を選択的に加水分解することを意味する。
本発明遺伝子は、天然の遺伝子であってもよく、又は天然の遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された遺伝子であってもよい。天然の遺伝子を検索する場合には、式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解できる能力を有する微生物を対象にすればよく、例えば、アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株等の微生物がその対象として例示される。
本発明遺伝子において「配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下（例えば、6XSSC（900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム））に、65℃でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下（例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム））に、65℃で30分間保温した後でも該ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをいう。
具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、もっとも好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するＤＮＡ等があげられる。
かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。配列相同性は、例えば、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）などの配列分析用ツールを用いて算出し得る。
かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。配列相同性は、例えば、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）などの配列分析用ツールを用いて算出し得る。
本発明遺伝子の塩基配列は、例えばインバースＰＣＲ法（Ochman, H. Gerber, A. S. and Hartl, D. L., Genetic application of an inverse polymerase chain reaction, Genetics 120,p621-p625(1988) 記載）により得ることができる。インバースＰＣＲ法は、既知の配列に基づくプライマーを作製、既知配列に隣接する未知の上流域および下流域の配列を増幅する方法である。即ち、該酵素タンパクの部分アミノ酸配列をコードする部分塩基配列の５’側相補鎖の一部塩基配列および３’側正鎖の一部塩基配列からプライマーを作製し、微生物等のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で断片化した後、セルフライゲーションして作製した環状化ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を解析する方法である。なお、同種酵素で共通によく保存されている塩基配列もプライマーの設計に利用することができる。
また、本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、以下のようにして調製することができる。
アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株等の微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてｃDNAライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株等の微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてｃDNAライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
また、前記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号１０に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)‐50℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(2.5分間)のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持する条件が挙げられる。
なお、該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側、及び／又は３’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
また、前記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする５’末端側の約１４塩基程度以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とｃＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、pKK223-3（Pharmacia社製）などが挙げられる。
また、本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたｃＤＮＡライブラリーに配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
上記のようにして調製されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、pKK223-3（Pharmacia社製）等が挙げられる。
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
上述のようにして得られるＤＮＡが、前記式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで該形質転換体の培養物を式（１）で示されるアシルアミドを立体選択的に加水分解に作用させる。反応生成物中の光学活性アシルアミド化合物および対応する光学活性アミンの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
本発明遺伝子を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子を宿主細胞に導入する。
ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができ、アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株において本発明遺伝子の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
一般的には、宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる遺伝子を前述のようなベクターに組み込んでなる組換ベクターを宿主細胞に導入する。尚、ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、バシラス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、ピキュア（Pichia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属及びアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物等があげられる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
該形質転換体が本発明遺伝子を保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
該形質転換体が本発明遺伝子を保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
次に本発明タンパク質について説明する。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、活性が性質的に同質なタンパク質をコードしており、配列番号１で示される全アミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、活性が性質的に同質なタンパク質をコードしており、配列番号１で示される全アミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９５％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
本発明タンパク質は、例えば、本発明遺伝子を保有する形質転換体を培養することにより製造することができる。
該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明タンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常、約１５〜４０℃である。培地のｐHは、約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常、約１５〜４０℃である。培地のｐHは、約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養物から本発明タンパク質を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明タンパク質を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明タンパク質を含む画分を選抜するには、例えば、ラセミＮ−アセチル−１メチルベンジルアミンを不斉加水分解して（Ｓ）−１メチルベンジルアミンを優先的に生産する能力を指標にして選抜すればよい。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明タンパク質を含む画分を選抜するには、例えば、ラセミＮ−アセチル−１メチルベンジルアミンを不斉加水分解して（Ｓ）−１メチルベンジルアミンを優先的に生産する能力を指標にして選抜すればよい。
次に、本発明タンパクによる上記式（１）で示されるアシルアミド化合物の不斉加水分解反応は、通常、水の存在下に行われる。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
上記方法における反応は、例えば、水、本発明タンパク質あるいはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、通常０〜６０℃の範囲である。
本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
具体的な形態としては、例えば、本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明タンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明タンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。
尚、本発明遺伝子を保有する形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明タンパク質の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
反応終了後は、加水分解されて生じた光学活性アミン化合物と、加水分解されずに残存した光学活性なアミド化合物を分離すればよい。分離は、酸を用いて光学活性アミン化合物を抽出するか、アミド化合物を有機溶媒で抽出するなどの方法で行っても良いし、カラムクロマトグラフィー等で行っても良い。得られた光学活性な化合物は、必要により、さらに、酸もしくはアルカリを用いた分配・抽出や再結晶等により精製してもよい。
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１ （アミノアシラーゼ活性とその立体選択性）
５００ｍｌフラスコに培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、肉エキス３ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌとなるように水に溶解し、２ＮのＮａＯＨでｐＨを７に調整）１００ｍｌを分注し、１２１℃で１５分間滅菌し放冷した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したアルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株前培養液を２ｍｌずつ植菌し３０℃で振盪培養を始めた。２４時間後、（Ｒ／Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミンを０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌになるように添加しさらに２４時間培養した。その後、得られた培養液を遠心し（１００００rpm、１５分）、菌体を集めた。この菌体を０．８５％食塩水１／２容に懸濁し−遠心分離を２回行い、洗浄菌体を得た。
５００ｍｌフラスコに培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、肉エキス３ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌとなるように水に溶解し、２ＮのＮａＯＨでｐＨを７に調整）１００ｍｌを分注し、１２１℃で１５分間滅菌し放冷した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したアルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株前培養液を２ｍｌずつ植菌し３０℃で振盪培養を始めた。２４時間後、（Ｒ／Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミンを０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌになるように添加しさらに２４時間培養した。その後、得られた培養液を遠心し（１００００rpm、１５分）、菌体を集めた。この菌体を０．８５％食塩水１／２容に懸濁し−遠心分離を２回行い、洗浄菌体を得た。
この洗浄菌体０．３０ｇを５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁した３本の試験管を用意し、各々０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌとなるようにＮ−アセチル−１−メチルベンジルアミン、（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミン、および（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミンを加え、３０℃で振とう、反応した。また、同時に洗浄菌体を含まないブランクも同様に振とうした。２４時間後に各反応液をサンプリングし、５倍容量のエタノールと混合、遠心分離上清をろ過後、ＧＣ分析を行い１−メチルベンジルアミンの生成量を測定し、変換率を求め、表１に示した。（ＧＣ；ＦＩＤ、ＤＢ−１カラム（０．５３ｍｍφ、３０ｍ、１．５μｍ；Ｊ＆Ｗ製）
その結果、アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株菌体は（Ｓ）体のＮ−アセチル−１−メチルベンジルアミンを選択的に加水分解し、式（１）で示されるアシルアミドを立体選択的に加水分解できるアミノアシラーゼ活性を有する酵素を保有することが確認された。
その結果、アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株菌体は（Ｓ）体のＮ−アセチル−１−メチルベンジルアミンを選択的に加水分解し、式（１）で示されるアシルアミドを立体選択的に加水分解できるアミノアシラーゼ活性を有する酵素を保有することが確認された。
表１加水分解反応（ＡＴＣＣ２１１６株菌体０．３０ｇ、２４時間）
参考例２ （細胞内ＤＮＡの調製）
滅菌ＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）５ｍｌの入った試験管５本にアルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株を植菌し３０℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から参考例１と同様にして、洗浄菌体０．２４ｇを得た。
得られた菌体から、QIAprep Genomic-tip System (Qiagen社製)を用いて細胞内ＤＮＡ溶液０．５ｍｌを得た。
滅菌ＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）５ｍｌの入った試験管５本にアルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株を植菌し３０℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から参考例１と同様にして、洗浄菌体０．２４ｇを得た。
得られた菌体から、QIAprep Genomic-tip System (Qiagen社製)を用いて細胞内ＤＮＡ溶液０．５ｍｌを得た。
実施例１ （本発明遺伝子の取得及びその解析）
（１）本発明タンパク質の調製
アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株を参考例１と同様に培養して得た洗浄菌体１９．４ｇを５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）１００ｍｌに懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製、ガラスビーズ０．１ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、２０分）で破砕した。処理液を遠心分離（１００００ｘｇ、１０分間）、同バッファーで洗浄して破砕液を回収、さらに超遠心分離（１０００００ｘｇ、６０分間）して、粗酵素溶液２００ｍｌを得た。
粗酵素溶液に粉状の硫酸アンモニウムを攪拌しながら加え４５％飽和として生成した沈澱を遠心除去後、上清に粉状の硫酸アンモニウムを攪拌しながら加え７５％飽和として生成した沈澱画分を遠心分離回収した。
（１）本発明タンパク質の調製
アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株を参考例１と同様に培養して得た洗浄菌体１９．４ｇを５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）１００ｍｌに懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製、ガラスビーズ０．１ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、２０分）で破砕した。処理液を遠心分離（１００００ｘｇ、１０分間）、同バッファーで洗浄して破砕液を回収、さらに超遠心分離（１０００００ｘｇ、６０分間）して、粗酵素溶液２００ｍｌを得た。
粗酵素溶液に粉状の硫酸アンモニウムを攪拌しながら加え４５％飽和として生成した沈澱を遠心除去後、上清に粉状の硫酸アンモニウムを攪拌しながら加え７５％飽和として生成した沈澱画分を遠心分離回収した。
この硫安沈澱画分溶液（硫酸アンモニウム含５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０）を１Ｍ硫酸アンモニウム含５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラム［Ｈｉｔｒａｐ ＢＵｔｙｌ ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したリン酸カリウムバッファー（硫酸アンモニウム濃度１Ｍ→０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、アミノアシラーゼ活性を有する溶出活性画分を得た。
（アミノアシラーゼ活性の測定）
ラセミ−アセチル−１−メチルベンジルアミン０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に被検液を加え４０℃で振とう、１時間後にサンプリングし、５倍容量のエタノールと混合、遠心分離上清をろ過後、ＧＣ分析を行い１−メチルベンジルアミンの生成量を測定）
（ＧＣ；ＦＩＤ、ＤＢ−１カラム（０．５３ｍｍφ、３０ｍ、１．５μｍ；Ｊ＆Ｗ製）
ラセミ−アセチル−１−メチルベンジルアミン０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に被検液を加え４０℃で振とう、１時間後にサンプリングし、５倍容量のエタノールと混合、遠心分離上清をろ過後、ＧＣ分析を行い１−メチルベンジルアミンの生成量を測定）
（ＧＣ；ＦＩＤ、ＤＢ−１カラム（０．５３ｍｍφ、３０ｍ、１．５μｍ；Ｊ＆Ｗ製）
この溶出活性画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、脱塩、および、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に、バッファー交換した。これをイオン交換クロマトグラフィーカラム［ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解した同バッファー（塩化ナトリウム濃度０→０．７Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出し、アミノアシラーゼ活性を有する溶出活性画分を得た。
この溶出活性画分をＡｍｉｃｏｎ ＵｌｔｒａＦｒｅｅ−０．５Ｂｉｏｍａｘ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて濃縮、脱塩、および、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にバッファー交換し、アミノアシラーゼ溶液５０μｌを得た。この溶液のタンパク量は８０μｇであった（アミノアシラーゼ溶液を希釈し、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク）を使用して測定）。
（２）本発明タンパク質由来の部分ペプチドが有するアミノ酸配列の解析
上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された該酵素５０ｋＤのシングルバンド部分のゲルを切り取った。このゲルを洗浄後、トリプシンを処理し、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペプチドをＨＰＬＣ（カラム：TSK gel ODS-80Ts、2.0mm×250mm（東ソー株式会社）、移動層：Ａ液（０．１％トリフルオロ酢酸水）、Ｂ液（０．０９％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液）、Ａ／Ｂ＝１００／０→０／１００の濃度勾配）により分取した。分取した各画分の中から１個の画分につきアミノ酸配列をプロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）により決定した。決定したアミノ酸配列を配列番号３に示す。
上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された該酵素５０ｋＤのシングルバンド部分のゲルを切り取った。このゲルを洗浄後、トリプシンを処理し、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペプチドをＨＰＬＣ（カラム：TSK gel ODS-80Ts、2.0mm×250mm（東ソー株式会社）、移動層：Ａ液（０．１％トリフルオロ酢酸水）、Ｂ液（０．０９％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液）、Ａ／Ｂ＝１００／０→０／１００の濃度勾配）により分取した。分取した各画分の中から１個の画分につきアミノ酸配列をプロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）により決定した。決定したアミノ酸配列を配列番号３に示す。
（３）本発明遺伝子由来の部分塩基配列の解析
配列番号３で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号３で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
また、配列番号３で示されるアミノ酸配列をもとに配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号４、および、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、参考例２の細胞内ＤＮＡを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- 東洋紡社製を使用した。)
[反応液組成]
10x PCR buffer for KOD-Plus 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 2μl
プライマー(10μM) 各1.5μl
細胞内DNA（49ng/μl） 2μl
KOD-Plus-（1U/μl） 1μl
滅菌水 32μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(15秒間)、50℃(30秒間)、68℃（30秒間）のサイクルを３５回行い、さらに68℃で2分間保持した。
10x PCR buffer for KOD-Plus 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 2μl
プライマー(10μM) 各1.5μl
細胞内DNA（49ng/μl） 2μl
KOD-Plus-（1U/μl） 1μl
滅菌水 32μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(15秒間)、50℃(30秒間)、68℃（30秒間）のサイクルを３５回行い、さらに68℃で2分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約２００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
上記の約２００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐCR（登録商標）-BluntII-TOPOベクターの既存「Blunt PCR Product挿入サイト」にライゲーションし（Invitrogen社製Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）PCR ｃｌｏｎｉｎｇキット使用）、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）寒天培地に得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２．５ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）寒天培地に得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２．５ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、配列番号６に示す塩基配列を決定した。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Big Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit（Applied Bio systems）を用いてプラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析した。
なお、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Big Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit（Applied Bio systems）を用いてプラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析した。
（４）インバースＰＣＲ法による本発明遺伝子由来の塩基配列の解析
参考例２の細胞内ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲIで消化し、エタノール沈澱によってＤＮＡ断片を回収した。この制限酵素消化したＤＮＡ３００ｎｇをＤＮＡライゲーションキットＶ２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１６℃でライゲーション反応を行い、環状化ＤＮＡを得た。
参考例２の細胞内ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲIで消化し、エタノール沈澱によってＤＮＡ断片を回収した。この制限酵素消化したＤＮＡ３００ｎｇをＤＮＡライゲーションキットＶ２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１６℃でライゲーション反応を行い、環状化ＤＮＡを得た。
配列番号６で示される塩基配列を基に配列番号７および８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号７、および配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記環状化ＤＮＡを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- 東洋紡を使用した。)
[反応液組成]
10x PCR buffer for KOD-Plus 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 2μl
プライマー(10μM) 各1.5μl
環状化DNA 1μl
KOD-Plus-（1U/μl） 1μl
滅菌水 33μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(15秒間)、63℃(30秒間)、68℃（10分間）のサイクルを３５回行い、さらに68℃で10分間保持した。
10x PCR buffer for KOD-Plus 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 2μl
プライマー(10μM) 各1.5μl
環状化DNA 1μl
KOD-Plus-（1U/μl） 1μl
滅菌水 33μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(15秒間)、63℃(30秒間)、68℃（10分間）のサイクルを３５回行い、さらに68℃で10分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液の一部をとり、アガロースゲル電気泳動を行った結果、約５kｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
上記の約５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐCR（登録商標-BluntII-TOPOベクターの既存「Blunt PCR Product挿入サイト」にライゲーションし（Invitrogen社製Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標） PCR ｃｌｏｎｉｎｇキット使用）、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２．５ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に得られた形質転換体を接種し培養した。形成したコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２．５ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
得られたプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、配列番号６を結合した配列番号９に示す塩基配列を決定した。
配列番号９で示される塩基配列を基にＯＲＦ検索を行い、アルスロバクター・パラフィネス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ２１１６７株が有する式（１）で示されるアシルアミド化合物を立体選択的に加水分解できるアミノアシラーゼのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）を決定した。さらに配列番号２をもとに該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を決定した。
なお、配列番号１と配列番号３を比較したところ、配列番号３で示されるアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部分と一致した。
また、アミノ酸配列（配列番号１）から当該酵素タンパクは分子量５０，９４１、ｐＫａ４．４７となる。
なお、配列番号１と配列番号３を比較したところ、配列番号３で示されるアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部分と一致した。
また、アミノ酸配列（配列番号１）から当該酵素タンパクは分子量５０，９４１、ｐＫａ４．４７となる。
実施例２ （本発明形質転換体の製造及びアシルアミド加水分解反応例（その１））
（１）本発明ベクターの調製
配列番号９に示される塩基配列を基に配列番号１０および配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
（１）本発明ベクターの調製
配列番号９に示される塩基配列を基に配列番号１０および配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、前記細胞内ＤＮＡを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- 東洋紡を使用した。)
[反応液組成]
10x PCR buffer for KOD-Plus 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 2μl
プライマー(10μM) 各1.5μl
細胞内DNA（108ng/μl） 2μl
KOD-Plus-（1U/μl） 1μl
滅菌水 32μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(15秒間)、63℃(30秒間)、68℃（2分間）のサイクルを３５回行い、さらに68℃で5分間保持した。
10x PCR buffer for KOD-Plus 5μl
2mM dNTPs 5μl
25mM MgSO4 2μl
プライマー(10μM) 各1.5μl
細胞内DNA（108ng/μl） 2μl
KOD-Plus-（1U/μl） 1μl
滅菌水 32μl
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System 9700にセットし、94℃（2分間）に加熱した後、94℃(15秒間)、63℃(30秒間)、68℃（2分間）のサイクルを３５回行い、さらに68℃で5分間保持した。
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）を加え、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）を加え、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びBamHI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、ＤＮＡライゲーションキットＶ２．１（ＴＡＫＡＲＡ）でライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からＱＩAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をNcoIとBamHIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミドに前記約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＴＡＰ０１と記す。）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から８コロニーを無作為に選抜した。この選抜したコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。それぞれの培養菌体からＱＩAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出したプラスミドのそれぞれの一部をNcoIとBamHIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、電気泳動して、取り出したプラスミドに前記約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドをプラスミドｐＴＡＰ０１と記す。）
（２）本発明形質転換体の培養菌体の調製
プラスミドｐＴＡＰ０１を用いてE．coli HB101を形質転換した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ２培地（１．５％バクト−トリプトン、０．７５％バクト−酵母エキス、１．５％塩化ナトリウム）１００ｍｌに、ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含）中で培養（３０℃、１８時間、振盪培養）した同形質転換体前培養液を１ｍｌ植菌し、振盪培養を開始した（３０℃）、８時間後に０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに１２時間培養した。）。その後、得られた培養液を遠心し（１００００rpm、１５分）、菌体を集めた。この菌体を０．８５％食塩水１／２容に懸濁し−遠心分離を２回行い、形質転換体菌体（ＩＰＴＧ添加培養菌体）０．８０ｇを得た。
同様に、ＩＰＴＧを添加しなかった培養を行い形質転換体菌体（ＩＰＴＧ無添加培養菌体）０．８２ｇを得た。
プラスミドｐＴＡＰ０１を用いてE．coli HB101を形質転換した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ２培地（１．５％バクト−トリプトン、０．７５％バクト−酵母エキス、１．５％塩化ナトリウム）１００ｍｌに、ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含）中で培養（３０℃、１８時間、振盪培養）した同形質転換体前培養液を１ｍｌ植菌し、振盪培養を開始した（３０℃）、８時間後に０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに１２時間培養した。）。その後、得られた培養液を遠心し（１００００rpm、１５分）、菌体を集めた。この菌体を０．８５％食塩水１／２容に懸濁し−遠心分離を２回行い、形質転換体菌体（ＩＰＴＧ添加培養菌体）０．８０ｇを得た。
同様に、ＩＰＴＧを添加しなかった培養を行い形質転換体菌体（ＩＰＴＧ無添加培養菌体）０．８２ｇを得た。
（３）本発明形質転換体によるアシルアミド加水分解反応例１
上記（２）の２種の形質転換体菌体の各０．２０ｇを５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁した３本の試験管を用意し、各々０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌとなるようにＮ−アセチル−１−メチルベンジルアミン、（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミン、および（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミンを加え、３０℃で振とう、反応した。１８時間後に各反応液をサンプリングし、５倍容量のエタノールと混合、遠心分離上清をろ過後、ＧＣ分析を行い１−メチルベンジルアミンの生成量を測定し、変換率を求め、表２に示した。
上記（２）の２種の形質転換体菌体の各０．２０ｇを５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁した３本の試験管を用意し、各々０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌとなるようにＮ−アセチル−１−メチルベンジルアミン、（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミン、および（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミンを加え、３０℃で振とう、反応した。１８時間後に各反応液をサンプリングし、５倍容量のエタノールと混合、遠心分離上清をろ過後、ＧＣ分析を行い１−メチルベンジルアミンの生成量を測定し、変換率を求め、表２に示した。
表２ 加水分解反応 形質転換体菌体０．２０ｇ、 １８時間
反応１８時間後の生成（Ｓ）−１−メチルベンジルアミンはキラルＬＣ分析条件（イ）で分析でき、残存（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−メチルベンジルアミンはキラルＬＣ分析条件（ロ）で１００％ｅ．ｅ．である。
（ＧＣ分析条件）
カラム：ＤＢ−１（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１．５μｍ）（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
カラム温度：５０℃（１０分）→１０℃／分→２００℃（１０分）
キャリアーガス：ヘリウム（カラム流量：１０ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
カラム：ＤＢ−１（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１．５μｍ）（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
カラム温度：５０℃（１０分）→１０℃／分→２００℃（１０分）
キャリアーガス：ヘリウム（カラム流量：１０ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
キラルＬＣ分析条件：（イ）
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−８０００（４．６ｍｍφｘ２５０ｍｍ）（住化分析センター（株）製）
移動相：過塩素酸水（ｐＨ＝２）：アセトニトリル＝７０：３０、流量：０．８ｍｌ／ｍｉｎ．キャリアー
検出器：ＵＶ２５４ｎｍ
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−８０００（４．６ｍｍφｘ２５０ｍｍ）（住化分析センター（株）製）
移動相：過塩素酸水（ｐＨ＝２）：アセトニトリル＝７０：３０、流量：０．８ｍｌ／ｍｉｎ．キャリアー
検出器：ＵＶ２５４ｎｍ
キラルＬＣ分析条件：（ロ）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標） ＯＤＨ（４．６ｍｍφｘ２５０ｍｍ）（ダイセル化学工業（株）製）
移動相：ｎ−ヘキサン：エタノール＝９９０：１０、流量：１ｍｌ／ｍｉｎ．キャリアー
検出器：ＵＶ２３０ｎｍ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標） ＯＤＨ（４．６ｍｍφｘ２５０ｍｍ）（ダイセル化学工業（株）製）
移動相：ｎ−ヘキサン：エタノール＝９９０：１０、流量：１ｍｌ／ｍｉｎ．キャリアー
検出器：ＵＶ２３０ｎｍ
（４）本発明形質転換体によるアシルアミド加水分解反応例２
上記（２）形質転換体のＩＰＴＧ添加培養菌体の各０．２０ｇを５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁し、０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌとなるようにラセミＮ−アセチル−１−メチルベンジルアミン（５０％エタノール溶液）を加え、３０℃で振とう、反応した。（Ｓ）−１−メチルベンジルアミンへの変換率は、２６時間後に３０％、５０時間後に４３％、６５時間後に４６％であった。
上記（２）形質転換体のＩＰＴＧ添加培養菌体の各０．２０ｇを５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁し、０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌとなるようにラセミＮ−アセチル−１−メチルベンジルアミン（５０％エタノール溶液）を加え、３０℃で振とう、反応した。（Ｓ）−１−メチルベンジルアミンへの変換率は、２６時間後に３０％、５０時間後に４３％、６５時間後に４６％であった。
Claims (13)
- 下記a)からｅ）のいずれかの塩基配列を有する遺伝子。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも９０％のＤＮＡの塩基配列であって、かつ、
式（１）：
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいフェニル基、ナフチル基又はピリジル基を表し、Ｒ２は、Ｃ１−３のアルキル基を表し、Ｒ３はＣ1-６のアルキル基を表し、＊のついた炭素原子は不斉炭素原子を表す。）で示される（Ｓ）−アシルアミドを立体選択的に加水分解し、式（２）：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３および＊は、前記定義のとおり。）
で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列。
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ、前記式（１）で示される（Ｓ）−アシルアミドを立体選択的に加水分解できるアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
ｄ）配列番号２で示される塩基配列。
ｅ）配列番号９で示される塩基配列。 - 式（１）におけるＲ １ が、置換されてもよいフェニル基であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
- 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１又は２記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とする遺伝子。
- 請求項１〜３いずれか記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター。
- 請求項３記載の遺伝子又は請求項４記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項５記載の形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項５記載の形質転換体。
- 請求項１又は２記載の遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体。
- 請求項４記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
- 下記のアミノ酸配列のいずれかの特徴を有するタンパク質。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が少なくとも９０％のＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、式（１）：
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよいフェニル基、ナフチル基又はピリジル基を表し、Ｒ２は、Ｃ１−３のアルキル基を表し、Ｒ３はＣ1-６のアルキル基を表し、＊のついた炭素原子は不斉炭素原子を表す。）で示される（Ｓ）−アシルアミドを立体選択的に加水分解し、式（２）：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３および＊は、前記定義のとおり。）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質、
ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、前記式（１）で示される（Ｓ）−アシルアミドを立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列、ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、前記式（１）で示される（Ｓ）−アシルアミドを立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。
ｅ)配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも９０％のアミノ酸配列であって、前記式（１）で示される（Ｓ）−アシルアミドを立体選択的に加水分解し、光学活性な前記式（２）で表される光学活性アミン化合物に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。 - 式（１）におけるＲ １ が、置換されてもよいフェニル基であることを特徴とする請求項１０記載のタンパク質。
- 請求項５〜８いずれか記載の形質転換体を培養することを特徴とするアミノアシラーゼの生産方法。
- 請求項１２記載の生産方法で生産されたアミノアシラーゼ、または請求項１０若しくは１１記載のタンパク質を式（１）で示される（Ｓ）−アシルアミドに作用させ、立体選択的に加水分解させることを特徴とする、式（２）の光学活性アミン化合物を製造方法。
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