WO2011036233A1 - Amidase und ihre verwendung zur herstellung von 3-aminocarbonsäureestern - Google Patents

Amidase und ihre verwendung zur herstellung von 3-aminocarbonsäureestern Download PDF

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WO2011036233A1
WO2011036233A1 PCT/EP2010/064098 EP2010064098W WO2011036233A1 WO 2011036233 A1 WO2011036233 A1 WO 2011036233A1 EP 2010064098 W EP2010064098 W EP 2010064098W WO 2011036233 A1 WO2011036233 A1 WO 2011036233A1
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alkyl
formula
aryl
acid ester
cycloalkyl
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PCT/EP2010/064098
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Bernhard Hauer
Thomas Friedrich
Rainer STÜRMER
Nina Schneider
Susanne Krauser
Wolf-Rüdiger KRAHNERT
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Basf Se
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines

Definitions

  • the present invention relates to a novel amidase and its use for the preparation of optically active 3-aminocarboxylic acid ester compounds, and their derivatives.
  • WO 97/41214 describes biocatalysts with aminacylase activity which have no lipase or esterase activity.
  • WO 2008/003761 describes a process for the preparation of optically active 3-aminocarboxylic acid esters in which an enantiomerically enriched enantiomer mixture of a singly N-acylated 3-aminocarboxylic acid ester is added by addition of an acidic salt former of a deacylation followed by further enantiomeric enrichment by crystallization subjects.
  • the present invention is therefore based on the object to provide a simple and therefore economical process for the preparation of optically active 3-aminocarboxylic acid esters and derivatives thereof.
  • R 1 is alkyl, alkoxyalkyl, alkenyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, or hetaryl, and
  • R 2 is alkyl, cycloalkyl or aryl, in which one enantiomeric mixture of a simple N-acylated 3-aminocarboxylic ester of the general wherein R 1 and R 2 have the meanings given above and R 3 is hydrogen, alkyl, cycloalkyl or aryl, by addition of a polypeptide according to claim 1 or 2 undergoes an enantioselective deacylation, is dissolved.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of optically active 3-amino carboxylic acid ester compounds of the general formula ⁇ , and their derivatives,
  • R 1 is alkyl, alkoxyalkyl, alkenyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, or hetaryl, and
  • R 2 is hydrogen, a cation equivalent M + , alkyl, cycloalkyl or aryl, in which a) a ⁇ -keto ester of the general formula 1.1 wherein R 1 and R 2 have the meanings given above, a 1) with at least one carboxylic acid amide of the formula R 3 -C (O) NH 2, in which R 3 has the abovementioned meaning, in the presence of an amidation catalyst, or
  • R 1 , R 2 and R 3 have the meanings given above, c) subjecting the enantiomeric mixture of compounds Ib obtained in the hydrogenation to an enantioselective deacylation by addition of a polypeptide having amidase activity and the ammonium salt enriched in a stereoisomer of a 3 -Aminocarboxylic acid ester is isolated, and d) optionally the isolated ammonium salt is converted into the 3-aminocarboxylic acid ester, and e) optionally the 3-aminocarboxylic acid ester in the free 3-aminocarboxylic acid or a salt thereof.
  • Another object of the invention is a polypeptide having amidase activity selected from
  • polypeptide containing an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 a) polypeptide containing an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, and b) polypeptide containing an amino acid sequence which has at least 96%, preferably 98%, particularly preferably 99% identity with SEQ ID NO: 2.
  • Another object of the invention is a polypeptide having amidase activity selected from
  • polypeptide containing an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 4 and d) polypeptide containing an amino acid sequence which is at least 80%, preferably 85, 88%, 90%, more preferably 92%, 94%, 96%, 98%, 99% % Identity with SEQ ID NO: 4.
  • Chiral compounds in the context of the present invention are compounds having at least one chiral center (that is to say at least one asymmetric atom, eg at least one asymmetric C atom or P atom), with chirality axis, chirality plane or helical turn.
  • chiral catalyst includes catalysts having at least one chiral ligand.
  • prochiral compound a compound having at least one prochiral center.
  • Asymmetric synthesis refers to a reaction in which, from a compound having at least one prochiral center, a compound having at least one chiral center, a chiral axis, a plane of chirality, or a helical coil is generated, whereby the stereoisomeric products are formed in unequal amounts.
  • Steps are compounds of the same constitution but of different atomic order in three-dimensional space.
  • Enantiomers are stereoisomers that behave as image to mirror image to each other.
  • ee [%] (RS) / (R + S) * 100.
  • R and S are the descriptors of the ClP system for the two enantiomers and represent the absolute configuration at the asymmetric atom.
  • the process according to the invention leads to products enriched in a particular stereoisomer.
  • the achieved "enantiomeric excess" (ee) is usually at least 95%, preferably at least 98%, and particularly preferably at least 99%.
  • Diastereomers are stereoisomers that are not enantiomeric to one another.
  • stereochemical terms listed herein refer to the carbon atom of the respective compounds corresponding to the asymmetric ⁇ -carbon atom in compound I or ⁇ . If further stereocenters are present, they are neglected in the context of the present invention in the designation.
  • alkyl includes straight-chain and branched alkyl groups. These are preferably straight-chain or branched C 1 -C 20 -alkyl, preferably C 1 -C 12 -alkyl, particularly preferably C 1 -C 6 -alkyl and very particularly preferably C 1 -C 6 -alkyl groups.
  • alkyl groups are, in particular, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, 2-pentyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 1, 2 Dimethylpropyl, 1, 1-dimethylpropyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 2-hexyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1, 3-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1 - Ethyl 2-methyl
  • alkyl also includes substituted alkyl groups which are generally 1, 2, 3, 4 or 5, preferably 1, 2 or 3 and particularly preferably 1 substituent selected from the groups cycloalkyl, aryl, hetaryl, halogen, COOR f , CO " M + and NE can carry 1 E 2 , wherein R f is hydrogen, alkyl, cycloalkyl or aryl, M + is a cation equivalent and E 1 and E 2 are independently hydrogen, alkyl, cycloalkyl or aryl.
  • alkoxyalkyl includes straight-chain and branched alkyl groups linked to an alkoxy group.
  • the alkoxy radical can likewise be straight-chain or branched. These are preferably straight-chain or branched C 1 -C 20 -alkyl, preferably C 1 -C 12 -alkyl, particularly preferably C 1 -C 6 -alkyl and very particularly preferably C 1 -C 6 -alkyl groups which are denoted by C 1 -C 12 Alkoxy, particularly preferably C 1 -C 6 alkoxy linked.
  • alkyl groups are mentioned above;
  • alkoxy groups are in particular methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutene toxy, sec-butoxy.
  • alkoxyalkyls are in particular methoxymethyl, ethoxymethyl, ethoxyethyl, ethoxypropyl.
  • cycloalkyl in the context of the present invention comprises both unsubstituted and substituted cycloalkyl groups, preferably C 3 -C 8 -cycloalkyl groups, such as cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl, which in the case of a substitution, generally 1, 2, 3, 4 or 5, preferably 1, 2 or 3 and particularly preferably 1 substituent, preferably selected from alkyl and the substituents mentioned for alkyl, can carry.
  • heterocycloalkyl in the context of the present invention comprises saturated, cycloaliphatic groups having generally 4 to 7, preferably 5 or 6, ring atoms in which 1 or 2 of the ring carbon atoms are replaced by heteroatoms, preferably selected from the elements oxygen, nitrogen and sulfur and which may be optionally substituted, wherein in case of substitution, these heterocycloaliphatic groups are 1, 2 or 3, preferably 1 or 2, more preferably 1 substituent selected from alkyl, cycloalkyl, aryl, COOR f , COO-M + and NE 1 E 2 , preferably alkyl, where R f is hydrogen, alkyl, cycloalkyl or aryl, M + is a cation equivalent and E 1 and E 2 are independently hydrogen, alkyl, cycloalkyl or aryl.
  • heterocycloaliphatic groups are pyrrolidinyl, piperidinyl, 2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, oxazolidinyl, morpholidinyl, thiazolidinyl, isothiazolidinyl, isoxazolidinyl, piperazinyl, tetrahydrothiophenyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, dioxanyl called.
  • aryl in the context of the present invention comprises unsubstituted and substituted aryl groups, and is preferably phenyl, tolyl, xylyl, mesityl, naphthyl, fluorenyl, anthracenyl, phenanthrenyl or naphthacenyl, particularly preferably phenyl or naphthyl, these aryl groups in the In case of a substitution in general 1, 2, 3, 4 or 5, preferably 1, 2 or 3 and particularly preferably 1 substituent selected from the groups alkyl, alkoxy, nitro, cyano or halogen, can carry.
  • heterocycloaromatic groups preferably the groups pyridyl, quinolinyl, acridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, indolyl, purinyl, indazolyl, benzotriazolyl , 1, 2,3-triazolyl, 1, 3,4-triazolyl and carbazolyl, these heterocycloaromatic groups in the case of a substitution generally 1, 2 or 3 substituents selected from the groups alkyl, alkoxy, acyl, carboxyl, carboxylate, - SO 3 H, sulfonate, NE 1 E 2 , alkylene-NE 1 E 2 or halogen, where E 1 and E 2 have the meanings given above.
  • acyl in the context of the present invention for alkanoyl or
  • Aroyl groups having generally 2 to 11, preferably 2 to 8, carbon atoms for example the acetyl, propanoyl, butanoyl, pentanoyl, hexanoyl, heptanoyl, 2-ethylhexanoyl, 2-propylheptanoyl, benzoyl, naphthoyl or trifluoroacetyl group.
  • Halogen is fluorine, chlorine, bromine and iodine, preferably fluorine, chlorine and bromine.
  • M + represents a cation equivalent, ie a monovalent cation or the single positive charge fraction of a multiple cation. These include z. Li, Na, K, Ca and Mg.
  • the processes according to the invention enable the preparation of optically active compounds of the general formula I, as well as the preparation of their derivatives.
  • R 1 is preferably C 1 -C 6 -alkyl, C 1 -C 3 -alkenyl, or C 6 -C 4 -aryl, which may optionally be substituted as described above.
  • R 1 is methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tert-butyl, 1-propenyl, 1 -heptenyl, or phenyl, especially methyl and phenyl.
  • R 2 is preferably unsubstituted or substituted C 1 -C 6 -alkyl, C 3 -C 7 -cycloalkyl or C 6 -C 14 -aryl.
  • Particularly preferred radicals R 2 are methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tert-butyl, trifluoromethyl, cyclohexyl, phenyl and benzyl.
  • R 2 ' is hydrogen, M + , as well as the meanings given for R 2 .
  • R 3 is hydrogen, alkyl, cycloalkyl or aryl, in particular hydrogen
  • Methyl, ethyl, trifluoromethyl, benzyl and phenyl Methyl, ethyl, trifluoromethyl, benzyl and phenyl.
  • an enantiomeric mixture of the compounds 1b is subjected to enantioselective deacylation by addition of an amidase, and the ammonium salt of a 3-aminocarboxylic acid ester which has been enriched in respect of a stereoisomer is isolated.
  • the process according to the invention that in the isomer mixture of compounds of the general formula Ib used for the deacylation, the corresponding enantiomer or, starting from chiral ⁇ -ketoesters, also diastereomers are present in non-negligible amounts.
  • the process thus enables the preparation of optically active compounds of general formula I, starting from mixtures of isomers of compounds of general formula Ib, as obtainable for example from the precursor compounds by conventional asymmetric hydrogenation of enamides.
  • enantiomeric mixtures which contain the enantiomers in the same molar ratio or are already enriched in an enantiomer.
  • the ee value of these mixtures is preferably greater than 75% and particularly preferably greater than 90%.
  • racemates or mixtures already enriched in one enantiomer are produced.
  • enantioselective hydrogenation processes for example those as mentioned in WO 2008/003761, the description of which is hereby expressly referred to.
  • the deacylation is carried out at a temperature of 20-40 ° C, more preferably between 20 and 30 ° C.
  • the reaction is usually carried out in aqueous buffer.
  • Another object of the invention relates to a process comprising the reaction steps a) to c) described below and optionally d) and e).
  • step a) of the process according to the invention a ⁇ -keto ester of the formula I.1 having at least one carboxamide of the formula
  • step a.1 in the case of the carboxylic acid amides of the formula
  • R 3 -C (O) NH 2 to acetamide, propionamide, benzoic acid amide, formamide or trifluoroacetamide, in particular benzoic acid amide or acetamide.
  • Suitable solvents for step a.1 are those which form a low-boiling azeotrope with water, from which the water of reaction can be removed by separation methods known to those skilled in the art (such as, for example, azeotropic distillation).
  • these are aromatics, such as toluene, benzene, etc., ketones such as methyl isobutyl ketone or methyl ethyl ketone, etc., and haloalkanes such as chloroform.
  • toluene is used.
  • Suitable amidation catalysts are, for example, acids such as p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, sulfuric acid or the like. Preferably, p-toluenesulfonic acid is used.
  • the reaction in process step a.1 preferably takes place at a temperature in the range from 20 to 110 ° C., particularly preferably 60 to 90 ° C. Particularly preferably, the temperature is above the boiling point of the solvent used under normal conditions.
  • Process step a.1 is usually carried out at a pressure of 0.01 to 1.5 bar, in particular 0.1 to 0.5 bar. If appropriate, the aminocarboxylic acid ester obtained in step a.1 can be purified by customary methods known to the person skilled in the art, eg. B. be subjected to distillation.
  • a ⁇ -ketoester of the formula 1.1 is reacted with aqueous ammonia and then with a carboxylic acid derivative of the formula R 3 -C (O) X to give the N-acylated, ⁇ -unsaturated (Z) -3-aminocarboxylic acid ester (La), wherein X is halogen or a radical of the formula OC (O) R 4 , in which R 4 has the meaning given above for R 3 (step a.2).
  • the carboxylic acid derivative is preferably selected from carboxylic acid chlorides, wherein X is chlorine and R 3 has the meaning given above, or carboxylic anhydrides, wherein X is OC (O) R 4 and R 4 preferably has the same meaning as R 3 , is particularly preferred the carboxylic acid derivatives are acetyl chloride, benzoyl chloride or acetic anhydride.
  • the acylation in step a.2 is preferably carried out at a temperature in the range from 20 ° C. to 120 ° C., more preferably at a temperature in the range from 60 ° C. to 90 ° C.
  • the acylation in step a.2 is carried out in a polar solvent or a mixture of a polar solvent with a non-polar solvent, it is preferable that the polar solvent is a carboxylic acid of the formula R 3 COOH or a tertiary amine, as a non-polar solvent in particular haloalkanes and aromatics are suitable, with particular preference being given to using acetic acid or triethylamine as the solvent.
  • the polar solvent is a carboxylic acid of the formula R 3 COOH or a tertiary amine, as a non-polar solvent in particular haloalkanes and aromatics are suitable, with particular preference being given to using acetic acid or triethylamine as the solvent.
  • the acylation in step a.2 can be carried out using a catalyst, this can be used both in catalytic amounts and stoichiometrically or as a solvent, preferably non-nucleophilic bases, such as tertiary amines, more preferably these are triethylamine and / or dimethylaminopyri - din (DMAP).
  • a catalyst this can be used both in catalytic amounts and stoichiometrically or as a solvent, preferably non-nucleophilic bases, such as tertiary amines, more preferably these are triethylamine and / or dimethylaminopyri - din (DMAP).
  • the (Z) -3-aminocarboxylic acid ester is obtained as a mixture with the (E) -3-aminocarboxylic acid ester and optionally further acylation products.
  • the (Z) -3-aminocarboxylic acid ester of the formula I.a will be isolated by methods known to those skilled in the art. A preferred method is separation by distillation.
  • the ⁇ -unsaturated (Z) -3-aminocarboxylic acid ester compounds of the formula Ia obtained in stage a can subsequently undergo hydrogenation, optionally an enantioselective hydrogenation, in the presence of an optionally chiral hydrogenation catalyst to give a racemate or an enantiomeric mixture enriched in an enantiomer simply N-acylated ß-aminocarboxylic acid ester of the general formula (lb) are subjected.
  • step b) as the hydrogenation catalyst at least one complex of a transition metal of groups 8 to 1 1 of the Periodic Table of the Elements is used, which comprises as ligand at least one chiral, phosphorus atom-containing compound.
  • a transition metal of groups 8 to 1 1 of the Periodic Table of the Elements which comprises as ligand at least one chiral, phosphorus atom-containing compound.
  • a chiral hydrogenation catalyst which is capable of hydrogenating the ⁇ -unsaturated, N-acylated 3-aminocarboxylic acid ester (Ia) used with preference to the desired isomer.
  • the compound of the formula I.b obtained in step b) preferably has an ee value of at least 75%, particularly preferably at least 90%, after the asymmetric hydrogenation.
  • the ee value of the compound 1b is preferably at least 75%.
  • the process according to the invention preferably allows the enantioselective hydrogenation at substrate / catalyst ratios (s / c) of at least 1000: 1, particularly preferably at least 5000: 1 and in particular at least 15000: 1.
  • the transition metal is selected from Ru, Rh, Ir, Pd or Pt.
  • catalysts based on Rh and Ru Especially preferred are Rh catalysts.
  • the phosphorus-containing compound used as ligand is preferably selected from bidentate and polydentate phosphine, phosphinite, phosphonite, phosphoramidite and phosphite compounds.
  • catalysts which have at least one ligand selected from compounds of the following formulas,
  • TrichickenfootPhos MiniPhos or their enantiomers wherein Ar is optionally substituted phenyl, preferably tolyl or xylyl.
  • bidentate compounds of the aforementioned classes of compounds are particularly preferred.
  • P-chiral compounds such as DuanPhos, TangPhos or Binapine are preferred.
  • Suitable chiral ligands which coordinate to the transition metal via at least one phosphorus atom are known to the person skilled in the art and are commercially available, for example, from Chiral Quest ((Princeton) Inc., Monmouth Junction, NJ). The naming of the previously exemplified chiral ligands corresponds to their commercial name.
  • Chiral transition metal complexes can be prepared in a manner known to the person skilled in the art (for example Uson, Inorg. Chim. Acta 73, 275 1983, EP-A-0 158 875, EP-A-437 690) by reacting suitable ligands with complexes of Metals containing labile or hemilabile ligands obtained.
  • suitable ligands for example Uson, Inorg. Chim. Acta 73, 275 1983, EP-A-0 158 875, EP-A-437 690
  • precatalysts complexes such as
  • X can be any anion known to those skilled in the art and generally useful in asymmetric synthesis.
  • Examples of X are halogens such as Ch, Br or I, BF 4 -, CI0 4 -, SbF6 -, PF 6 -, CF 3 S0 3 -, BAr 4 -.
  • Preferred for X are BF 4 -, PF 6 -, CF 3 S0 3 -, SbF 6 -.
  • the chiral transition metal complexes can either be generated in situ before the actual hydrogenation reaction in the reaction vessel or else be generated separately, isolated and then used. It may happen that at least one solvent molecule attaches to the transition metal complex.
  • the common solutions for example, methanol, diethyl ether, tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, etc.
  • THF tetrahydrofuran
  • dichloromethane dichloromethane
  • the hydrogenation step (step b) of the process according to the invention is generally carried out at a temperature of from -10 to 150.degree. C., preferably from 0 to 120.degree. C. and more preferably from 10 to 70.degree.
  • the hydrogen pressure can be varied within a range between 0.1 bar and 600 bar. This is preferably in a pressure range of 0.5 to 20 bar, more preferably between 1 to 10 bar.
  • Suitable solvents for the hydrogenation reaction of the enamides Ia are all solvents known to the person skilled in the art for asymmetric hydrogenation.
  • Preferred solvents are lower alkyl alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, and toluene, THF, ethyl acetate.
  • ethyl acetate or THF is particularly preferably used as the solvent.
  • the hydrogenation catalysts (or pre-catalysts) described above can also be suitably, for. B. by attachment via suitable as anchor groups functional groups, adsorption, grafting, etc. to a suitable carrier, eg. Example of glass, silica gel, resins, polymer carriers, etc., are immobilized. They are then also suitable for use as solid phase catalysts.
  • a suitable carrier eg. Example of glass, silica gel, resins, polymer carriers, etc.
  • the catalyst consumption can be further reduced by these methods.
  • the catalysts described above are also suitable for a continuous reaction, z. B. after immobilization, as described above, in the form of solid phase catalysts.
  • the hydrogenation in stage b is carried out continuously.
  • the continuous hydrogenation can be carried out in one or preferably in several reaction zones. Multiple reaction zones may be formed by multiple reactors or by spatially distinct regions within a reactor. When using multiple reactors may each be the same or different reactors. These may each have the same or different mixing characteristics and / or be subdivided by internals one or more times.
  • the reactors can be interconnected as desired, z. B. parallel or in series. Suitable pressure-resistant reactors for the hydrogenation are known to the person skilled in the art. These include the commonly used reactors for gas-liquid reactions, such. B. tubular reactors, tube bundle reactors, stirred tank, gas circulation reactors, bubble columns, etc., which may be filled or divided by internals.
  • process step c) the mixture of enantiomers of the compounds I.b obtained in the hydrogenation is subjected to an enantioselective deacylation by addition of a polypeptide having amidase activity and the resulting stereoisomer-enriched ammonium salt of a 3-aminocarboxylic acid ester is isolated.
  • the polypeptide having amidase activity can be used as a purified enzyme, as a partially purified crude extract or in the form of a living or killed microorganism containing the amidase.
  • Preferred amidases are those having the primary structure SEQ ID NO: 2 or NO: 4 or variants of SEQ ID NO: 2 or NO: 4, which by insertion, deletion or substitution of fewer amino acids, preferably 1 -20, particularly preferably 1 - 10 amino acids, can be obtained.
  • the reaction is usually carried out in aqueous buffer.
  • the resulting reaction product can be purified by conventional methods and isolated.
  • the ammonium salts isolated in the enantiomerically enriching deacylation by amidase reaction may be subjected to further work-up.
  • a suitable base preferably NaHCO 3, NaOH, KOH.
  • the product of the deacylation is dissolved or suspended in water and then the pH is adjusted by base addition to about 8 to 12, preferably about 10.
  • a suitable organic solvent e.g. Example, an ether such as methyl butyl ether, a hydrocarbon or hydrocarbon mixture, for.
  • alkane such as pentane, hexane, heptane, or an alkane mixture, ligroin or petroleum ether, or aromatics, such as toluene to extract.
  • a preferred extractant is toluene.
  • the 3-aminocarboxylic acid esters may be derivatized using methods known to those skilled in the art. Possible derivatizations include, for example, saponification of the ester or stereoselective reduction of the carboxyl carbon to an optically active alcohol.
  • Derivatives of the invention of compounds of the formula ⁇ thus include, for example, ammonium salts of the 3-aminocarboxylic acid esters, the free carboxylic acid in which R 2 'is hydrogen, salts of the free carboxylic acid in which R 2' is M + , and optically active 3-aminoalcohols.
  • a further subject of the invention are polypeptides which can catalyze an amidase reaction and have the following primary structure (amino acid sequence):
  • polypeptide sequence having at least 96%, preferably 98%, most preferably 99% identity with SEQ ID NO: 2.
  • polypeptide sequence having at least 80%, preferably at least 85%, most preferably at least 95% identity with SEQ ID NO: 4.
  • R1 and R3 are each methyl and R2 is ethyl.
  • amidase with the SEQ ID NO: 2 can be, for example, Rhodococcus eq
  • Example 1 Cloning of an amidase from Rhodococcus equi The coding region of the S-selective amidase from Rhodococcus equi was amplified by means of a PCR with the following oligonucleotide primers:
  • Rhodococcus equi is a soil isolate isolated from a 3-acetylamino-3-phenyi-propionic acid ethyl ester screening. The strain was determined at the DSMZ. Strain was deposited with the DSM under No. 19590.
  • the genomic DNA was obtained using a Qiagen kit:
  • the culture was centrifuged at 5000 xg and 22 ⁇ RNase A solution was added to an 11 ml aliquot of B1 buffer.
  • the cell pellet was resuspended with 11 ml each of RNase-containing Bl buffer.
  • 300 ml of lysozyme (100 mg / ml) and 500 ⁇ proteinase K stock solution (20 mg / ml) were added and for lysis of the cells at 37 ° C for 30 min. incubated.
  • a QIAGEN Genomic-tip 500 / G was equilibrated with 10 ml of QBT buffer. The clear lysate was added to the column and allowed to run through.
  • the column was washed twice with 15 ml of QC buffer.
  • the genomic DNA was eluted with 5 ml of QF buffer.
  • the chromosomal DNA could then be precipitated with isopropanol and transferred with a glass rod in TE buffer.
  • the amplified gene was cut with the restriction enzymes Ndel and HindIII and ligated into the multiple cloning site of the vector pDHE vector having a rhamnose-inducible promoter. This vector was expressed in TG 1 cells (DSMZ 6056).
  • This strain was fermented at 37 ° C in a minimal medium as a fed-batch.
  • the cells were used as biomass with a dry biomass of 150 g / l in the experiments.
  • the specific enzyme activity was 50 U / g dry biomass (BTM).
  • Inoculate FP medium with cells.
  • the cells are incubated at 28 ° C and 180 rpm.
  • the wild-type strain is induced with a solution of 1 g / l of 3-acetylamino-3-phenyl-propionic acid ethyl ester and incubated for a further 7 h.
  • the formation of the amine or the degradation of the amide is measured by HPLC.
  • the course samples are measured by chiral GC.
  • Fig. 1 shows the formation of 3-acetylamino-3-phenyl-propionic acid ethyl ester as a function of reaction time and temperature
  • Phase A 20 mM KH 2 P0 4 pH 2.5
  • Phase B acetonitrile
  • Rhodococcus erythropolis Rhodococcus erythropolis
  • FIG. 3 shows a comparison of the reaction with racemic or enantiomerically enriched substrate
  • SEQ ID NO: 4 This amidase can be determined by genetic engineering methods familiar to the skilled worker, for example by expression of the nucleic acid according to SEQ ID NO: 3 in a suitable host system, e.g. E. coli, manufacture.
  • Phase A 10 mM KH 2 PQ 4 pH 2.5
  • Phase B acetonitrile
  • Temp.Progr . 90 ° C, 15 ', 10 ° C, 10', 160 ° C, 15 '
  • Fig. 5 shows the course of the concentrations of 3-acetylamino-butyric acid methyl ester, 3-amino-butyric acid methyl ester, and a control without enzyme
  • LU8676 denotes the Rhodococcus erythropolls wild-type strain.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminocarbonsäureester-Verbindungen der allgemeinen Formel I, sowie deren Ammoniumsalzen, worin R1 für Alkyl, Alkoxyalkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, oder Hetaryl steht, und R2 für Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, bei dem man ein Enantiomerengemisch eines einfach N-acylierten 3- Aminocarbonsäureesters der allgemeinen Formel (l.b), worin R1 und R2 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen und R3 für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, durch Zugabe eines Polypeptids nach Anspruch 1 einer enantioselektiven Deacylierung unterzieht.

Description

AMIDASE UND 1HRE VERWENDUNG ZUR HERSTELLUNG VON 3-AMINOCARBONSÄUREESTERN
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Amidase und ihre Verwendung zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminocarbonsäureester-Verbindungen, sowie deren Derivaten.
Die asymmetrische Synthese, d. h. Reaktionen, bei denen aus einer prochiralen eine chira- le Gruppierung erzeugt wird, so dass die stereoisomeren Produkte (Enantiomere oder Di- astereomere) in ungleichen Mengen entstehen, hat vor allem im Bereich der pharmazeutischen Industrie immense Bedeutung gewonnen, da häufig nur ein bestimmtes optisch aktives Isomer therapeutisch aktiv ist. In diesem Zusammenhang gewinnen auch optisch aktive Zwischenstufen der Wirkstoffe zunehmend an Bedeutung. Dies gilt auch für 3- Aminocarbonsäureester (Formel I), sowie deren Derivate.
Figure imgf000003_0001
(Formel I)
Somit besteht ein großer Bedarf an effektiven Synthesewegen zur Herstellung optisch aktiver Verbindungen der allgemeinen Formeln I.
WO 97/41214 beschreibt Biokatalysatoren mit Aminacylase Aktivität, die keine Lipase- oder Esteraseaktivität aufweisen.
WO 2008/003761 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 3- Aminocarbonsäureestern bei dem man ein an einem Enantiomer angereichertes Enantio- merengemisch eines einfach N-acylierten 3-Aminocarbonsäureesters durch Zugabe eines sauren Salzbildners einer Deacylierung un einer anschliessenden weiteren Enantiomere- nanreicherung durch Kristallisation unterzieht.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein einfaches und damit wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminocarbon-säureestern und Derivaten davon zur Verfügung zu stellen.
Überraschend wurde nun gefunden, dass die gestellte Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminocarbonsäureester-Verbindungen der allgemeinen Formel I, sowie deren Ammoniumsalzen,
Figure imgf000004_0001
worin
R1 für Alkyl, Alkoxyalkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, oder Hetaryl steht, und
R2 für Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, bei dem man ein Enantiomerengemisch eines einfach N-acylierten 3-Aminocarbon- säureesters der allgemeine
Figure imgf000004_0002
worin R1 und R2 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen und R3 für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, durch Zugabe eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 einer enantioselektiven Deacylierung unterzieht, gelöst wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminocarbonsäureester-verbindungen der allgemeinen Formel Γ, sowie deren Derivate,
Figure imgf000004_0003
worin
R1 für Alkyl, Alkoxyalkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, oder Hetaryl steht, und
R2 für Wasserstoff, ein Kationäquivalent M+, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, bei dem man a) einen ß-Ketoester der allgemeinen Formel 1.1
Figure imgf000004_0004
worin R1 und R2 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen, a 1 ) mit wenigstens einem Carbonsäureamid der Formel R3-C(0)NH2, worin R3 die zuvor genannte Bedeutung besitzt, in Gegenwart eines Amidie- rungskatalysators, oder
a 2) mit Ammoniak und anschließend mit einem Carbonsäurederivat der Formel R3-C(0)X, worin X für Halogen oder einen Rest der Formel OC(0)R4 steht, worin R4 die zuvor für R3 angegebene Bedeutung besitzt, unter Erhalt des entsprechenden N-acylierten, a-ungesättigten
(Z)-3-Aminocarbonsäureesters, der allgemeinen Formel (l.a) umsetzt,
Figure imgf000005_0001
worin R1, R2 und R3 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen, b) das in dieser Reaktion erhaltene Enamid (l.a) einer Hydrierung unterzieht, unter Erhalt eines Enantiomerengemischs einfach N-acylierter ß- Aminocarbonsäureester der allgemeinen Formel (l.b),
Figure imgf000005_0002
worin R1, R2 und R3 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen, c) das bei der Hydrierung erhaltene Enantiomerengemisch der Verbindungen l.b durch Zugabe eines Polypeptids mit Amidaseaktivität einer enantioselektiven Deacylierung unterzieht und das dabei gebildete, bezüglich eines Stereoiso- mers angereicherte Ammoniumsalz eines 3-Aminocarbonsäureesters isoliert, und d) gegebenenfalls das isolierte Ammoniumsalz in den 3-Aminocarbonsäureester überführt, und e) gegebenenfalls den 3-Aminocarbonsäureester in die freie 3-Aminocarbon- säure oder ein Salz davon überführt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Polypeptid mit Amidase-Aktivität, ausgewählt aus
a) Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und b) Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 96%, bevorzugt 98 %, besonders bevorzugt 99% Identität mit SEQ ID NO:2 besitzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Polypeptid mit Amidase-Aktivität, ausgewählt aus
c) Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4, und d) Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, bevorzugt 85, 88%, 90%, besonders bevorzugt 92%,94%,96%,98%,99% Identität mit SEQ ID NO:4 besitzt.
"Chirale Verbindungen" sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verbindungen mit wenigstens einem Chiralitätszentrum (d. h. wenigstens einem asymmetrischen Atom, z. B. wenigstens einem asymmetrischen C-Atom oder P-Atom), mit Chiralitätsachse, Chiralität- sebene oder Schraubenwindung. Der Begriff "chiraler Katalysator" umfasst Katalysatoren, die wenigstens einen chiralen Liganden aufweisen.
"Achirale Verbindungen" sind Verbindungen, die nicht chiral sind.
Unter einer "prochiralen Verbindung" wird eine Verbindung mit wenigstens einem prochira- len Zentrum verstanden. "Asymmetrische Synthese" bezeichnet eine Reaktion, bei der aus einer Verbindung mit wenigstens einem prochiralen Zentrum eine Verbindung mit wenigstens einem Chiralitätszentrum, einer Chiralitätsachse, Chiralitätsebene oder Schraubenwindung erzeugt wird, wobei die stereoisomeren Produkte in ungleichen Mengen entstehen.
"Stereoisomere" sind Verbindungen gleicher Konstitution aber unterschiedlicher Atomanordnung im dreidimensionalen Raum.
"Enantiomere" sind Stereoisomere, die sich zueinander wie Bild zu Spiegelbild verhalten. Der bei einer asymmetrischen Synthese erzielte "Enantiomeren-Überschuss"
(enantiomeric excess, ee) ergibt sich dabei nach folgender Formel:
ee[%] = (R-S) / (R+S) * 100. R und S sind die Deskriptoren des ClP-Systems für die beiden Enantiomeren und geben die absolute Konfiguration am asymmetrischen Atom wieder. Die enantiomerenreine Verbindung (ee = 100 %) wird auch als "homochirale Verbindung" bezeichnet. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu Produkten, die bezüglich eines bestimmten Ste- reoisomers angereichert sind. Der erzielte "Enantiomeren-Überschuss" (ee) liegt in der Regel bei wenigstens 95%, bevorzugt wenigstens 98% und besonders bevorzugt, wenigstens 99%.
"Diastereomere" sind Stereoisomere, die nicht enantiomer zueinander sind.
Obwohl in den von der vorliegenden Erfindung erfassten Verbindungen weitere asymmetrische Atome vorhanden sein können, beziehen sich die hierin aufgeführten stereochemischen Begriffe, wenn nicht ausdrücklich anders erwähnt, auf das dem asymmetrischen ß- Kohlenstoffatom in Verbindung I oder Γ entsprechende Kohlenstoffatom der jeweiligen Verbindungen. Sind weitere Stereozentren vorhanden, so werden diese im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei der Benennung vernachlässigt.
Im Folgenden umfasst der Ausdruck "Alkyl" geradkettige und verzweigte Alkylgruppen. Vorzugsweise handelt es sich dabei um geradkettige oder verzweigte C1-C2o-Alkyl, bevorzugterweise C1-Ci2-Alkyl-, besonders bevorzugt d-Cs-Alkyl- und ganz besonders bevorzugt C1-C6-Alkylgruppen. Beispiele für Alkylgruppen sind insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, se c.-Butyl, tert.-Butyl, n-Pentyl, 2-Pentyl, 2-Methylbutyl, 3- Methylbutyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 1 ,1 -Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1 -Ethylpropyl, n- Hexyl, 2-Hexyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1 ,2-Dimethylbutyl, 1 ,3- Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 1 ,1 -Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1 ,1 ,2-Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Trimethylpropyl, 1 -Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 -Ethyl- 2- methylpropyl, n-Heptyl, 2-Heptyl, 3-Heptyl, 2-Ethylpentyl, 1 -Propylbutyl, n-Octyl, 2- Ethylhexyl, 2-Methylheptyl, Nonyl, Decyl, 2-Propylheptyl.
Der Ausdruck "Alkyl" umfasst auch substituierte Alkylgruppen, welche im Allgemeinen 1 , 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 1 , 2 oder 3 und besonders bevorzugt 1 Substituenten, ausgewählt aus den Gruppen Cycloalkyl, Aryl, Hetaryl, Halogen, COORf, COO"M+ und NE1E2 tragen können, wobei Rf für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, M+ für ein Kationäquivalent steht und E1 und E2 unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl stehen.
Der Ausdruck "Alkoxyalkyl" umfasst geradkettige und verzweigte Alkylgruppen, die mit einem Alkoxyrest verknüpft sind. Der Alkoxyrest kann ebenfalls geradkettig oder verzweigt sein. Vorzugsweise handelt es sich dabei um geradkettige oder verzweigte C1-C2o-Alkyl, bevorzugterweise C1-Ci2-Alkyl-, besonders bevorzugt d-Cs-Alkyl- und ganz besonders bevorzugt C1-C6-Alkylgruppen, die mit C1-Ci2-Alkoxy-, besonders bevorzugt C1-C6- Alkoxyresten verknüpft sind. Beispiele für Alkylgruppen sind oben erwähnt; Beispiele für Alkoxygruppen sind insbesondere Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, Isobu- toxy, sec.-Butoxy. Beispiele für Alkoxyalkyle sind insbesondere Methoxymethyl, Ethoxy- methyl, Ethoxyethyl, Ethoxypropyl.
Der Ausdruck "Alkenyl" umfasst geradkettige und verzweigte Alkylgruppen, die noch mindestens eine C=C Doppelbindung tragen. Vorzugsweise handelt es sich dabei um geradkettige C1 -C2o-Alkylgruppen, die eine C=C Doppelbindung tragen. Beispiele für Alke- nylgruppen sind insbesondere 1 -Propenyl, 1 -Butenyl, 1 -Pentenyl, 1 -Hexenyl.
Der Ausdruck "Cycloalkyl" umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl unsubstitu- ierte als auch substituierte Cycloalkylgruppen, vorzugsweise Cß-Cs-Cycloalkylgruppen, wie Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl, die im Falle einer Substitution, im Allgemeinen 1 , 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 1 , 2 oder 3 und besonders bevorzugt 1 Substituenten, vorzugsweise ausgewählt unter Alkyl und den für Alkyl genannten Substituenten, tragen können.
Der Ausdruck "Heterocycloalkyl" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst gesättigte, cycloaliphatische Gruppen mit im Allgemeinen 4 bis 7, vorzugsweise 5 oder 6 Ringatomen, in denen 1 oder 2 der Ringkohlenstoffatome durch Heteroatome, vorzugsweise ausgewählt aus den Elementen Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, ersetzt sind und die gegebenenfalls substituiert sein können, wobei im Falle einer Substitution, diese heterocycloaliphatischen Gruppen 1 , 2 oder 3, vorzugsweise 1 oder 2, besonders bevorzugt 1 Substituenten, ausgewählt aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, COORf, COO-M+ und NE1E2, bevorzugt Alkyl, tragen können, wobei Rf für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, M+ für ein Kationäquivalent steht und E1 und E2 unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl stehen. Beispielhaft für solche heterocycloaliphatischen Gruppen seien Pyrrolidinyl, Piperi- dinyl, 2,2,6,6-Tetramethylpiperidinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Oxazolidinyl, Morpholidi- nyl, Thiazolidinyl, Isothiazolidinyl, Isoxazolidinyl, Piperazinyl-, Tetrahydrothiophenyl, Tetra- hydrofuranyl, Tetrahydropyranyl, Dioxanyl genannt.
Der Ausdruck "Aryl" umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung unsubstituierte als auch substituierte Arylgruppen, und steht vorzugsweise für Phenyl, Tolyl, Xylyl, Mesityl, Naphthyl, Fluorenyl, Anthracenyl, Phenanthrenyl oder Naphthacenyl, besonders bevorzugt für Phenyl oder Naphthyl, wobei diese Arylgruppen im Falle einer Substitution im Allgemeinen 1 , 2, 3, 4 oder 5, vorzugsweise 1 , 2 oder 3 und besonders bevorzugt 1 Substituenten, ausgewählt aus den Gruppen Alkyl, Alkoxy, Nitro, Cyano oder Halogen, tragen können.
Der Ausdruck "Hetaryl" umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung unsubstituierte oder substituierte, heterocycloaromatische Gruppen, vorzugsweise die Gruppen Pyridyl, Chinoli- nyl, Acridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Indolyl, Pu- rinyl, Indazolyl, Benzotriazolyl, 1 ,2,3-Triazolyl, 1 ,3,4-Triazolyl und Carbazolyl, wobei diese heterocycloaromatischen Gruppen im Falle einer Substitution im Allgemeinen 1 , 2 oder 3 Substituenten, ausgewählt aus den Gruppen Alkyl, Alkoxy, Acyl, Carboxyl, Carboxylat, - SO3H, Sulfonat, NE1E2, Alkylen-NE1E2 oder Halogen, tragen können, wobei E1 und E2 die zuvor genannten Bedeutungen aufweisen.
Die obigen Erläuterungen zu den Ausdrücken "Alkyl", "Cycloalkyl", "Aryl", "Heterocycloalkyl" und "Hetaryl" gelten entsprechend für die Ausdrücke "Alkoxy", "Cycloalkoxy", "Aryloxy", "Heterocycloalkoxy" und "Hetaryloxy".
Der Ausdruck "Acyl" steht im Sinne der vorliegenden Erfindung für Alkanoyl- oder
Aroylgruppen mit im Allgemeinen 2 bis 11 , vorzugsweise 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, beispielsweise für die Acetyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Pentanoyl-, Hexanoyl-, Heptanoyl-, 2- Ethylhexanoyl-, 2-Propylheptanoyl-, Benzoyl-, Naphthoyl- oder Trifluoracetyl-Gruppe.
„ Halogen" steht für Fluor, Chlor, Brom und lod, bevorzugt für Fluor, Chlor und Brom.
M+ steht für ein Kationäquivalent, d.h. ein einwertiges Kation oder den einfach positiven Ladungsanteil eines mehrfachen Kations. Dazu zählen z. B. Li, Na, K, Ca und Mg.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen, wie zuvor beschrieben, die Herstellung von optisch aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel I, sowie die Herstellung von deren Derivaten.
R1 steht vorzugsweise für C1-C6-Alkyl, 1 - C3-C6-Alkenyl, oder C6-Ci4-Aryl, die gegebenenfalls wie eingangs ausgeführt substituiert sein können. Insbesondere steht R1 für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert.-Butyl, 1 -Propenyl, 1 -Heptenyl, oder Phenyl, speziell für Methyl und Phenyl.
R2 steht bevorzugt für unsubstituiertes oder substituiertes C1-C6-Alkyl, C3-C7-Cycloalkyl o- der C6-Ci4-Aryl. Besonders bevorzugte Reste R2 sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n- Butyl, tert.-Butyl, Trifluormethyl, Cyclohexyl, Phenyl und Benzyl.
R2' steht für Wasserstoff, M+, sowie für die für R2 genannten Bedeutungen.
R3 steht für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl, insbesondere für Wasserstoff,
Methyl, Ethyl, Trifluormethyl, Benzyl und Phenyl.
Erfindungsgemäß wird ein Enantiomerengemisch der Verbindungen l.b durch Zugabe einer Amidase einer enantioselektiven Deacylierung unterzogen und das dabei gebildete, bezüglich eines Stereoisomers angereicherte Ammoniumsalz eines 3-Aminocarbonsäureesters isoliert. Es ist ein charakteristisches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass in dem zur Deacylierung eingesetzten Isomerengemisch von Verbindungen der allgemeinen Formel l.b auch das entsprechende Enantiomer, oder ausgehend von chiralen ß -Ketoestern auch Diastereomere in nicht vernachlässigbaren Mengen enthalten sind. Vorteilhafterweise ermöglicht das Verfahren somit die Herstellung optisch aktiver Verbindungen der allgemeinen Formel I, ausgehend von Isomerengemischen von Verbindungen der allgemeinen Formel l.b, wie sie beispielsweise aus den Vorläuferverbindungen durch übliche asymmetrische Hydrierung von Enamiden erhältlich sind.
Üblicherweise werden in diesem Verfahrensschritt Enantiomerengemische eingesetzt, die die Enantiomeren in gleichem molaren Verhältnis enthalten oder aber bereits an einem E- nantiomer angereichert sind. Bevorzugt ist der ee-Wert dieser Gemische größer 75 % und besonders bevorzugt größer 90 %. Je nach Wahl der Bedingungen der Hydrierung des Enamids (l.a) werden Racemate oder bereits an einem Enantiomer angereicherte Gemische erzeugt. Um Gemische, die bereits an einem Enantiomer angereichert sind, zu erhalten, wählt man in der Regel enantioselektive Hydrierverfahren, beispielsweise solche wie sie in WO 2008/003761 genannt werden, dessen Beschreibung hiermit ausdrücklich in Bezug genommen wird.
Bevorzugt wird die Deacylierung bei einer Temperatur von 20-40 °C, besonders bevorzugt zwischen 20 und 30°C durchgeführt. Die Umsetzung wird üblicherweise in wässrigem Puffer, durchgeführt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren, umfassend die im Folgenden beschriebenen Reaktionsstufen a) bis c) und optional d) und e).
Stufe a)
In einer Ausführungsform der Stufe a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein ß-Ketoester der Formel 1.1 mit wenigstens einem Carbonsäureamid der Formel
R3-C(0)NH2, in Gegenwart eines Amidierungskatalysators unter Entfernen des Reaktionswassers zu einem 3-Aminocarbonsäureester der Formel l.a umgesetzt (Schritt a.1 ).
Bevorzugt handelt es sich in Schritt a.1 bei den Carbonsäureamiden der Formel
R3-C(0)NH2 um Acetamid, Propionsäureamid, Benzoesäureamid, Formamid oder Trifluora- cetamid, insbesondere um Benzoesäureamid oder Acetamid.
Für Schritt a.1 geeignete Lösungsmittel sind solche, die mit Wasser ein niedrig-siedendes Azeotrop bilden, aus dem das Reaktionswasser mit dem Fachmann bekannten Trennmethoden (wie z. B. azeotrope Destillation) entfernbar ist. Insbesondere sind dies Aromaten, wie Toluol, Benzol, etc., Ketone, wie Methylisobutylketon oder Methylethylketon etc. und Halogenalkane, wie Chloroform. Bevorzugt wird Toluol eingesetzt.
Geeignete Amidierungskatalysators sind beispielsweise Säuren, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Schwefelsäure oder ähnliche. Bevorzugt wird p-Toluolsulfonsäure verwendet.
Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung in Verfahrensschritt a.1 bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 1 10 °C, besonders bevorzugt 60 bis 90 °C. Besonders bevorzugt liegt dabei die Temperatur oberhalb der Siedetemperatur des verwendeten Lösungsmittels unter Normalbedingungen.
Verfahrensschritt a.1 wird üblicherweise bei einem Druck von 0,01 bis 1 ,5 bar, insbesondere 0,1 bis 0,5 bar durchgeführt. Gegebenenfalls kann der in Schritt a.1 erhaltene Aminocar- bonsäureester einer Aufreinigung nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren, z. B. durch Destillation unterzogen werden.
In einer alternativen Ausführung wird ein ß-Ketoester der Formel 1.1 mit wässrigem Ammoniak und anschließend mit einem Carbonsäurederivat der Formel R3-C(0)X zum N- acylierten, ß-ungesättigten (Z)-3-Aminocarbonsäureester (La) umgesetzt, worin X für Halogen oder einen Rest der Formel OC(0)R4 steht, worin R4 die zuvor für R3 angegebene Bedeutung besitzt (Schritt a.2).
Das Carbonsäurederivat ist vorzugsweise ausgewählt unter Carbonsäurechloriden, wobei X für Chlor steht und R3 die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, oder Carbonsäureanhydriden, wobei X für OC(0)R4 steht und R4 bevorzugt die selbe Bedeutung wie R3 besitzt, besonders bevorzugt handelt es sich bei den Carbonsäurederivaten um Acetylchlorid, Ben- zoylchlorid oder Acetanhydrid.
Bevorzugt wird die Acylierung in Schritt a.2 bei einer Temperatur im Bereich von 20 °C bis 120 °C durchgeführt, besonders bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 60 °C bis 90 °C.
Die Acylierung in Schritt a.2 wird in einem polaren Lösungsmittel oder einer Mischung eines polaren Lösungsmittels mit einem unpolaren Lösungsmittel durchgeführt, bevorzugt handelt es sich bei dem polaren Lösungsmittel um eine Carbonsäure der Formel R3COOH oder um ein tertiäres Amin, als unpolares Lösungsmittel sind insbesondere Halogenalkane und A- romaten geeignet, besonders bevorzugt wird als Lösungsmittel Essigsäure oder Triethyla- min verwendet. Die Acylierung in Schritt a.2 kann unter Verwendung eines Katalysators durchgeführt werden, dieser kann sowohl in katalytischen Mengen sowie stöchiometrisch oder als Lösungsmittel eingesetzt werden, bevorzugt werden nichtnukleophile Basen, wie tertiäre Amine, besonders bevorzugt handelt es sich hierbei um Triethylamin und/oder Dimethylaminopyri- din (DMAP).
Gegebenenfalls wird man in den Schritten a.1 und a.2 den (Z)-3-Aminocarbonsäureester als Gemisch mit dem (E)-3-Aminocarbonsäureester und gegebenenfalls weiteren Acylie- rungsprodukten erhalten. In diesem Fall wird man den (Z)-3-Aminocarbonsäureester der Formel l.a durch dem Fachmann bekannte Verfahren isolieren. Eine bevorzugte Methode ist die Abtrennung durch Destillation.
Stufe b)
Die in Stufe a erhaltenen α-ungesättigten (Z)-3-Aminocarbonsäureesterverbindungen der Formel l.a können nachfolgend einer Hydrierung, ggf. einer enantioselektiven Hydrierung, in Gegenwart eines ggf. chiralen Hydrierungskatalysators, unter Erhalt eines Racemats o- der eines an einem Enantiomeren angereicherten Enantiomerengemischs einfach N- acylierter ß-Aminocarbonsäureester der allgemeinen Formel (l.b) unterzogen werden.
Vorzugsweise wird in Stufe b) als Hydrierungskatalysator wenigstens ein Komplex eines Übergangsmetalls der Gruppen 8 bis 1 1 des Periodensystems der Elemente eingesetzt, der als Ligand wenigstens eine chirale, phosphoratomhaltige Verbindung umfasst.
Zur Hydrierung wird vorzugsweise ein chiraler Hydrierungskatalysator eingesetzt, der befähigt ist, den eingesetzten α -ungesättigten, N-acylierten 3-Aminocarbonsäureester (l.a) unter Bevorzugung des gewünschten Isomers zu hydrieren. Vorzugsweise weist die in Schritt b) erhaltene Verbindung der Formel l.b nach der asymmetrischen Hydrierung einen ee- Wert von wenigstens 75 %, besonders bevorzugt wenigstens 90 % auf. Eine solche hohe Enantiomerenreinheit ist jedoch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vielfach nicht notwendig, da nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine weitere Enantiomerenanreiche- rung im anschließenden Deacylierungsschritt erfolgt. Vorzugsweise beträgt der ee-Wert der Verbindung l.b jedoch mindestens 75 %.
Vorzugsweise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die enantioselektive Hydrierung bei Substrat/Katalysator-Verhältnissen (s/c) von wenigstens 1000 : 1 , besonders bevorzugt wenigstens 5000 : 1 und insbesondere wenigstens 15000 : 1.
Bevorzugt wird für die asymmetrische Hydrierung ein Komplex eines Metalls der Gruppe 8, 9 oder 10 mit wenigstens einem der im Folgenden genannten Liganden eingesetzt. Vorzugsweise ist das Übergangsmetall ausgewählt unter Ru, Rh, Ir, Pd oder Pt. Besonders bevorzugt sind Katalysatoren auf Basis von Rh und Ru. Insbesondere bevorzugt sind Rh- Katalysatoren.
Die als Ligand eingesetzte phosphorhaltige Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt unter zwei- und mehrzähnigen Phosphin-, Phosphinit-, Phosphonit-, Phosphoramidit- und Phos- phit-Verbindungen.
Bevorzugt werden zur Hydrierung Katalysatoren, die wenigstens einen Liganden aufweisen, der ausgewählt ist unter Verbindungen der folgenden Formeln,
TangPhos Phos PhanePhos
TrichickenfootPhos MiniPhos
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
oder deren Enantiomeren, wobei Ar für gegebenenfalls substituiertes Phenyl, bevorzugt für Tolyl oder Xylyl, steht.
Besonders bevorzugt sind bidentate Verbindungen der zuvor genannten Verbindungsklassen. Insbesondere sind P-chirale Verbindungen, wie DuanPhos, TangPhos oder Binapine bevorzugt.
Geeignete chirale, über wenigstens ein Phosphoratom an das Übergangsmetall koordinierende Liganden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise von Chiral Quest ((Prince- ton) Inc., Monmouth Junction, NJ) kommerziell erhältlich. Die Benennung der zuvor exemplarisch aufgeführten chiralen Liganden entspricht ihrer kommerziellen Bezeichnung.
Chirale Übergangsmetall-Komplexe lassen sich in dem Fachmann bekannter Weise (z. B. Uson, Inorg. Chim. Acta 73, 275 1983, EP-A-0 158 875, EP-A-437 690) durch Umsetzung geeigneter Liganden mit Komplexen der Metalle, die labile oder hemilabile Liganden enthalten, erhalten. Hierbei können als Präkatalysatoren Komplexe wie etwa
Pd2(dibenzylidenaceton)3, Pd(OAc)2 (Ac = Acetyl), RhCI3, Rh(OAc)3, [Rh(COD)CI]2,
[Rh(COD)OH]2, [Rh(COD)OMe]2 (Me = Methyl), Rh(COD)acac, Rh4(CO)i2, Rh6(CO)i6,
[Rh(COD)2)]X, Rh(acac)(CO)2 (acac = Acetylacetonato), RuCI3, Ru(acac)3, RuCI2(COD), Ru(COD)(methallyl)2, Ru(Ar)l2 und Ru(Ar)CI2, Ar = Aryl, sowohl unsubstituiert als auch substituiert, [lr(COD)CI]2, [lr(COD)2]X, Ni(allyl)X verwendet werden. Anstatt COD (= 1 ,5- Cyclooctadien) kann auch NBD (= Norbornadien) verwendet werden. Bevorzugt sind
[Rh(COD)CI]2, [Rh(COD)2)]X, Rh(acac)(CO)2, RuCI2(COD), Ru(COD)(methallyl)2, Ru(Ar)CI2, Ar = Aryl, sowohl unsubstituiert als auch substituiert, sowie die entsprechenden Systeme mit NBD anstelle von COD. Besonders bevorzugt sind [Rh(COD)2)]X und [Rh(NBD)2)]X.
X kann jedes dem Fachmann bekannte, generell in der asymmetrischen Synthese verwendbare Anion sein. Beispiele für X sind Halogene wie Ch, Br oder I-, BF4-, CI04-, SbF6-, PF6-, CF3S03-, BAr4-. Bevorzugt für X sind BF4-, PF6-, CF3S03-, SbF6-.
Die chiralen Übergangsmetall-Komplexe können entweder vor der eigentlichen Hydrierungs-Reaktion im Reaktionsgefäß in situ erzeugt werden oder aber separat erzeugt, isoliert und anschließend eingesetzt werden. Dabei kann es vorkommen, dass sich wenigstens ein Lösungsmittelmolekül an den Übergangsmetall-Komplex anlagert. Die gängigen Lö- sungsmittel (z. B. Methanol, Diethylether, Tetra h yd rofu ran (THF), Dichlormethan, etc.) für die Komplexherstellung sind dem Fachmann bekannt.
Phosphin-, Phosphinit-, Phosphonit-, Phosphoramidit- und Phosphit-Metall- bzw. -Metall- LM-Komplexe (LM = Lösungsmittel) mit noch mindestens einem labilen oder hemilabilen Liganden sind geeignete Präkatalysatoren, aus denen unter den Bedingungen der Hydrierung der eigentliche Katalysator generiert wird.
Der Hydrierungsschritt (Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in der Regel bei einer Temperatur von -10 bis 150 °C, bevorzugt bei 0 bis120 °C und besonders bevorzugt bei 10 bis 70 °C durchgeführt.
Der Wasserstoffdruck kann dabei in einem Bereich zwischen 0,1 bar und 600 bar variiert werden. Bevorzugt liegt dieser in einem Druckbereich von 0,5 bis 20 bar, besonders bevorzugt zwischen 1 bis 10 bar.
Als Lösungsmittel für die Hydrierungsreaktion der Enamide l.a sind alle dem Fachmann für asymmetrische Hydrierung bekannten Lösungsmittel geeignet. Bevorzugte Lösungsmittel sind niedrige Alkylalkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, sowie Toluol, THF, Ethyl- acetat. Besonders bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren Ethylacetat oder THF als Lösungsmittel eingesetzt.
Die zuvor beschriebenen Hydrierungskatalysatoren (bzw. -präkatalysatoren) können auch in geeigneter Weise, z. B. durch Anbindung über als Ankergruppen geeignete funktionelle Gruppen, Adsorption, Pfropfung, etc. an einen geeigneten Träger, z. B. aus Glas, Kieselgel, Kunstharzen, Polymerträger, etc., immobilisiert werden. Sie eignen sich dann auch für einen Einsatz als Festphasenkatalysatoren. Vorteilhafterweise lässt sich nach diesen Verfahren der Katalysatorverbrauch weiter senken. Die zuvor beschriebenen Katalysatoren eignen sich auch für eine kontinuierliche Reaktionsführung, z. B. nach Immobilisierung, wie zuvor beschrieben, in Form von Festphasenkatalysatoren.
In einer weiteren Ausführung wird die Hydrierung in Stufe b kontinuierlich durchgeführt. Die kontinuierliche Hydrierung kann in einer oder vorzugsweise in mehreren Reaktionszonen erfolgen. Mehrere Reaktionszonen können von mehreren Reaktoren oder durch räumlich verschiedene Bereiche innerhalb eines Reaktors gebildet werden. Beim Einsatz von mehreren Reaktoren kann es sich jeweils um gleiche oder verschiedene Reaktoren handeln. Diese können jeweils gleiche oder verschiedene Vermischungscharakteristiken aufweisen und/oder durch Einbauten ein- oder mehrfach unterteilt sein. Die Reaktoren können untereinander beliebig verschaltet sein, z. B. parallel oder in Reihe. Geeignete druckfeste Reaktoren für die Hydrierung sind dem Fachmann bekannt. Dazu zählen die allgemein üblichen Reaktoren für gas-flüssig-Reaktionen, wie z. B. Rohrreaktoren, Rohrbündelreaktoren, Rührkessel, Gasumlaufreaktoren, Blasensäulen, etc., die gegebenenfalls durch Einbauten gefüllt bzw. unterteilt sein können.
Schritt c)
Im Verfahrenschritt c) wird das bei der Hydrierung erhaltene Enantiomerengemisch der Verbindungen l.b durch Zugabe eines Polypeptids mit Amidaseaktivität einer enantioselek- tiven Deacylierung unterzogen und das dabei gebildete, bezüglich eines Stereoisomers angereicherte Ammoniumsalz eines 3-Aminocarbonsäureesters isoliert. Das Polypeptid mit Amidaseaktivität kann als gereinigtes Enzym, als partiell gereinigter Rohextrakt oder in Form eines lebenden oder abgetöteten Mikroorganismus, der die Amidase beinhaltet, verwendet werden. Bevorzugte Amidasen sind solche mit der Primärstruktur SEQ ID NO:2 bzw. NO:4 oder Varianten von SEQ ID NO:2 bzw. NO:4, die durch Insertion, Deletion oder Substitution weniger Aminosäuren, bevorzugt 1 -20, besonders bevorzugt 1 -10 Aminosäuren, erhalten werden.
Die Umsetzung erfolgt üblicherweise in wässrigem Puffer. Das entstandene Reaktionsprodukt kann durch übliche Verfahren aufgereinigt und isoliert werden.
Schritt d)
Gewünschtenfalls können die bei der enantiomerenanreichernden Deacylierung durch Amidasereaktion isolierten Ammoniumsalze einer weiteren Aufarbeitung unterzogen werden. So ist es beispielsweise möglich, zur Freisetzung der optisch aktiven Verbindung der Formel I, das Produkt der Kristallisation mit einer geeigneten Base, vorzugsweise NaHC03, NaOH, KOH in Kontakt zu bringen. In einer geeigneten Vorgehensweise wird das Produkt der Deacylierung in Wasser gelöst oder suspendiert und anschließend der pH-Wert durch Basen-Zugabe auf etwa 8 bis 12, vorzugsweise etwa 10, eingestellt. Zur Isolierung des freien 3-Aminocarbonsäureesters ist es möglich, die basische Lösung oder Suspension mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. einem Ether, wie Methylbutylether, einem Kohlenwasserstoff oder Kohlenwasserstoffgemisch, z. B. einem Alkan, wie Pentan, Hexan, Heptan, oder einem Alkangemisch, Ligroin oder Petrolether, oder Aromaten, wie Toluol, zu extrahieren. Ein bevorzugtes Extraktionsmittel ist Toluol. Bei dieser Vorgehensweise kann der 3-Aminosäureester nahezu quantitativ erhalten werden, wobei auch der ee- Wert erhalten bleibt.
Schritt e) Gegebenenfalls können die 3-Aminocarbonsäureester unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Methoden derivatisiert werden. Mögliche Derivatisierungen umfassen beispielsweise Verseifung des Esters oder stereoselektives Reduzieren des Carboxyl- Kohlenstoffatoms zu einem optisch aktiven Alkohol.
Erfindungsgemäße Derivate von Verbindungen der Formel Γ umfassen somit beispielsweise Ammoniumsalze der 3-Aminocarbonsäureester, die freie Carbonsäure worin R2' Wasserstoff ist, Salze der freien Carbonsäure, worin R2' M+ ist, sowie optisch aktive 3- Aminoalkohole.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide, die eine Amidasereaktion katalysieren können, und die folgende Primärstruktur (Aminosäuresequenz) umfassen:
SEQ ID NO:2
oder eine Polypeptidsequenz, die mindestens 96%, bevorzugt 98 %, besonders bevorzugt 99 % Identität mit SEQ ID NO:2 besitzt.
SEQ ID NO:4
oder eine Polypeptidsequenz, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85 %, besonders bevorzugt mindestens 95% Identität mit SEQ ID NO:4 besitzt.
Als Amidasereaktion im Sinne dieser Erfindung wird folgende Modellreaktion verstanden:
Figure imgf000017_0001
wobei R1 und R3 jeweils für Methyl und R2 für Ethyl steht.
Folgende Reaktionsbedingungen wurden gewählt:
200 μΙ Zellen
50 μΙ 1 M KH2P04-Puffer pH 7,0
1 -10 g/L Substrat racemisch oder S-Enantiomeren- angereichert
740 μΙ H20.
Anzucht der Zellen siehe Beispiel 2.
Die Amidase mit der SEQ ID NO:2 lässt sich beispielsweise aus Rhodococcus eq
19590 durch Klonierung isolieren.
Beispiel 1 : Klonierung einer Amidase aus Rhodococcus equi Der kodierende Bereich der S-selektiven Amidase aus Rhodococcus equi wurde mit Hilfe einer PCR mit folgenden Oligonukleotid-Primern amplifiziert:
Figure imgf000018_0001
Die auf diesem Wege erhaltene Sequenz wurde, um die entsprechenden Schnittstellen für die Klonierung einzuführen, in einer weiteren PCR mit folgenden Primern amplifiziert: 5' -GGGATACTCATATGAGTACATCGGATCCGGG-3'
3' -GAGTCTCAAGCTTACGCCACCGGTCGACGATCC-5'
Beim Rhodococcus equi handelt es sich um ein Bodenisolat, welches aus einem Screening auf 3-Acetylamino-3-phenyi-propionic-acid-ethylester isoliert wurde. Der Stamm wurde bei der DSMZ bestimmt. Stamm wurde bei der DSM unter Nr. 19590 hinterlegt.
Die genomische DNA wurde mit Hilfe eines Qiagen Kits gewonnen:
Zur Isolierung von chromosomaler DNA aus Rhodococcus equi wurde eine Bakterienkultur in 30 ml FP-Medium beeimpft und ü.N. bei 30 *C inkubiert.
Die Kultur wurde bei 5000 x g zentrifugiert und 22 μΙ RNase A-Lösung in ein 11 ml Aliquot B1-Puffer gegeben. Das Zellpellet wurde mit je 11 ml RNase-haltigen Bl-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden 300 ml Lysozym- (100 mg/ml) und 500 μΙ Proteinase-K- Stammlösung (20 mg/ml) zugegeben und zur Lyse der Zellen bei 37 °C 30 min. inkubiert. Während dessen wurde ein QIAGEN Genomic-tip 500/G mit 10 ml QBT-Puffer equilibriert. Das klare Lysat wurde auf die Säule gegeben und durchlaufen gelassen. Anschließend wurde die Säule 2 x mit 15 ml QC-Puffer gewaschen. Schließlich wurde die genomische DNA mit 5 ml QF-Puffer eluiert. Die chromosomale DNA konnte dann mit Isopropanol gefällt und mit einem Glasstab in TE-Puffer überführt werden. Das amplifizierte Gen wurde mit den Restriktionsenzymen Ndel und Hindill geschnitten und in die Multiple Cloning Site des Vektors pDHE-Vektor, der einen Rhamnose-induzierbaren Promoter besitzt, ligiert. Dieser Vektor wurde in TG 1 -Zellen (DSMZ 6056) exprimiert.
Dieser Stamm wurde bei 37 °C in einem Minimalmedium als Fed-batch fermentiert. Die Zellen wurden als Biofeuchtmasse mit einer Biotrockenmasse von 150 g/l in den Versuchen eingesetzt. Die spezifische Enzymaktivität betrug 50 U/g Biotrockenmasse (BTM).
Beispiel 2: Herstellung von 3-Amino-3-phenyl-propionsäure-ethylester mit einem Wildtypstamm Rhodococcus equi
Figure imgf000019_0001
a) Zubereitung der Zellen:
FP-Medium mit Zellen beimpfen. Die Zellen werden bei 28°C und 180 UpM inkubiert. Nach 20 h Wachstum wird der Wildtyp-Stamm mit einer Lösung aus 1 g/l 3-Acetylamino-3-phenyl-propionic-acid-ethylester induziert und für weitere 7 h inkubiert.
Die Zellen werden aufgeschlossen und der Rohextrakt im Aktivitätstest eingesetzt. b) Umsetzung von 3-Acetylamino-3-phenyl-propionsäure-ethylester:
Zu einem Puffer (100 mM KH2P04 pH 7) werden 1 g/l 3-Acetylamino-3-phenyl- propionsäure-ethylester (AAPEE) und x μΙ (siehe Tabellel ) zellfreier Rohextrakt (siehe Tabelle 1) über Nacht bei 28°C bzw. 40°C inkubiert.
Die Entstehung des Amins bzw. der Abbau des Amids wird mittels HPLC gemessen. Zur Bestimmung der Enantioselektivität werden die Verlaufsproben mittels chiraler GC gemessen.
Ansatz:
Figure imgf000019_0002
Tab. 1 Ansätze für die Umsetzung von 3-Acetylamino-3-phenyl-propionsäure-ethylester Ergebnisse:
Abb. 1 zeigt die Bildung von 3-Acetylamino-3-phenyl-propionsäure-ethylester in Abhängigkeit von Reaktionszeit und Temperatur
Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, erreicht die Konzentration von 3-Amino-3-phenyl- propionsäure-ethylester nach etwa 24 Stunden ein Maximum. Danach wird das entstandene Amin ebenfalls abgebaut. Die Umsetzungen bei 40°C verlaufen zu Beginn schneller, knicken jedoch früher ein als bei 28°C.
Analytik: achirale HPLC
Säule: Onyx Monolith C18, 50*4,6 mm, Fa. Phenomenex
Mob. Phase A: 20 mM KH2P04 pH2,5
Mob. Phase B: Acetonitril
Flow: 1 ,5ml/min
Ofentemp.: 45°C
Inj. vol.: 2μΙ
Gradient: 0,0 min 20%B
0,5 min 20%B
0,6 min 80%B
1.2 min 80%B
1.3 min 20%B
2,0 min 20%B
Detektion: UV 210 nm
Retentionszeit: Edukt 1 ,49 min
Produkt 0,74 min
Chirale GC:
Lösungsmittel: Acetonitril
Derivatisierung ~100μΙ Lösung
+300μΙ TFAA (Trifluoressigsäureanhydrid)
~30Minuten bei 100°C stehen lassen GC-Bedingungen
Säule 25m Lipodex G 0,25mm Innen 0,25μιη FD
Ofenprogramm 80 / 10 / 2 / 180 / 10 / 700
Injektion 1 -5 μΙ je nach Konzentration bei 250°C
Detektor FID bei 250°C
Trägergas Helium 16,7 PSI, Fluss 1 ,6 ml/min, Split 100:1
Vergleich: Umsetzung mit racemischem vs. angereichertem Substrat
Testbed.: 500 mM AAPPEE (rac. / angereichertes)
100 mM KH2P04 pH 7.0
25 g/l (Biotrockenmasse) Zellen aus Fermenteraustrag (kloniertes Enzym aus
Rhodococcus erythropolis)
30°C
Abb. 3 zeigt einen Vergleich der Umsetzung mit racemischem bzw. enantiomeren- angereichertem Substrat
Es wurden bis zu 20 g/l 3-Acetylamino-3-phenyl-propionsäure-methylester (AAPEE) umgesetzt. Setzt man racemisches Substrat ein so erhält man eine Anreicherung des S- Enatiomers (ee~94%). Setzt man hingegen schon angereichertes Substrat (ee~80%) ein so kann man einen ee>99% erzielen.
Präparativer 4-l-Ansatz
4I-Ansatz:
130 mM AAPPEE
100 mM KH2P04 pH 7.0
34 g/L BTM Zellen (kloniertes Enzym aus Rhododcoccus erythropolis)
30°C, 5 h
Aufarbeitung:
Reaktor mit 60 ml/102g H3P0 (85%) auf pH 3.0 stellen. Die Auswaage betrug 4113 g /4150 ml. Der Ansatz wurde abzentrifugieren (5000*g, 20 min) und das Pellet mit 200 mL gewaschen. Man erhielt einen klaren, leicht gelben
Überstand (Auswaage 3804 g).
Dieser wurde mit 3 x 1400 ml 2-Butanol extrahiert, um zunächst noch vorhandenes Edukt und Nebenprodukte aus der Eduktsynthese abzutrennen. Anschließend wurde bei 10 °C mit 20 % NaOH auf pH 10 gestellt und der Aminosäureester durch Extraktion mit 1500 ml 2- Butanol und nachfolgende Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum isoliert. Erhalten wurden 23.0 g nahezu enantiomerenreiner (99.3 % ee) Aminoester als schwach-gelbes Öl. Die chemische Reinheit liegt bei >98 % (GC). Abb. 4 zeigt die Umsetzung von angereichertem S-AAPEE
Beispiel 3: Herstellung von 3-Aminobuttersäure-methylester
Als Amidase wurde der Wildtypstamm Rhodococcus erythropolis verwendet
(SEQ ID NO:4). Diese Amidase lässt sich durch dem Fachmann geläufige gentechnische Methoden, beispielsweise durch Expression der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO:3 in einem geeigneten Wirtssystem, z.B. E.coli, herstellen.
Figure imgf000022_0001
Durchführung analog zu Beispiel 2.
Analytik: achirale HPLC
Säule: Luna C8(2), 150*3,0 mm, Fa. Phenomenex
Mob. Phase A: 10 mM KH2PQ4 pH2,5
Mob. Phase B: Acetonitril
Flow: 1 ,0 ml/min
Ofentemp.: 40°C
Inj. vol.:
Gradient: 0 %B
7,0 min 30%B
10 min 30%B
1.2 min 80%B
1.3 min 20%B
2,0 min 20%B
Detektion: UV 200 nm
Retentionszeit: Edukt 4,35 min
Produkt 1 ,13 min chirale GC
Säule: Hydrodex-ß-6-TBDM, 25*0,25 mm, Filmdicke 16pm M&N
Temp.Progr.: 90°C, 15' , 10°C, 10' , 160°C, 15'
Detektor: FID
Retentionszeit: Edukt Enant. 1 21 ,46 min
(nur Edukt) Ansatz:
Figure imgf000023_0001
Tab. 2 Ansätze für die Umsetzung von 3-Acetylamino-Buttersäurernethylester
Abb. 5 zeigt den Verlauf der Konzentrationen von 3-Acetylamino-Buttersäuremethylester, 3- Amino-Buttersäuremethylester , und eine Kontrolle ohne Enzym, LU8676 bezeichnet den Rhodococcus erythropolls Wildtypstamm.

Claims

Patentansprüche 1. Polypeptid mit Amidase-Aktivität, ausgewählt aus
a) Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, und b) Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 96 % Identität mit SEQ ID NO:2 besitzt.
2. Polypeptid mit Amidase-Aktivität, ausgewählt aus
a) Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4, und b) Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 % Identität mit SEQ ID NO:4 besitzt.
3. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminocarbonsäureester- Verbindungen der allgemeinen Formel I, sowie deren Ammoniumsalzen,
Figure imgf000024_0001
worin
R1 für Alkyl, Alkoxyalkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, oder Hetaryl steht, und
R2 für Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, bei dem man ein Enantiomerengemisch eines einfach N-acylierten 3- Aminocarbonsäureesters der allgemeinen Formel (I.b),
Figure imgf000024_0002
worin R1 und R2 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen und R3 für Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, durch Zugabe eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 einer enantioselektiven Deacylierung unterzieht.
4. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 3-Aminocarbonsäureester- verbindungen der allgemeinen Formel I', sowie deren Derivate,
Figure imgf000025_0001
worin
R1 für Alkyl, Alkoxyalkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, oder Hetaryl steht, und
R2 für Wasserstoff, ein Kationäquivalent M+, Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht, bei dem man a) einen ß -Ketoester der allgemeinen Formel 1.1
Figure imgf000025_0002
worin R1 und R2 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen, a 1 ) mit wenigstens einem Carbonsäureamid der Formel R3-C(0)NH2, worin R3 die zuvor genannte Bedeutung besitzt, in Gegenwart eines Amidie- rungskatalysators, oder
a 2) mit Ammoniak und anschließend mit einem Carbonsäurederivat der Formel R3-C(0)X, worin X für Halogen oder einen Rest der Formel OC(0)R4 steht, worin R4 die zuvor für R3 angegebene Bedeutung besitzt, unter Erhalt des entsprechenden N-acylierten, α - ß -ungesättigten
(Z)-3-Aminocarbonsäureesters, der allgemeinen Formel (l.a) umsetzt,
Figure imgf000025_0003
worin R1, R2 und R3 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen, b) das in dieser Reaktion erhaltene Enamid (l.a) einer Hydrierung unterzieht, unter Erhalt eines Enantiomerengemischs einfach N-acylierter ß - Aminocarbonsäureester der allgemeinen Formel (l.b),
Figure imgf000026_0001
worin R1, R2 und R3 die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen, c) das bei der Hydrierung erhaltene Enantiomerengemisch der Verbindungen l.b durch Zugabe eines Polypeptids nach Anspruch 1 einer enantioselektiven Deacylierung unterzieht und das dabei gebildete, bezüglich eines Stereoiso- mers angereicherte Ammoniumsalz eines 3-Aminocarbonsäureesters isoliert, und d) gegebenenfalls das isolierte Ammoniumsalz in den 3-Aminocarbonsäureester überführt, und e) gegebenenfalls den 3-Aminocarbonsäureester in die freie
3-Aminocarbonsäure oder ein Salz davon überführt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein ß -Ketoester der Formel 1.1 mit wenigstens einem Carbonsäureamid der Formel R3-C(0)NH2, in Gegenwart eines Amidierungska- talysators unter Entfernen des Reaktionswassers zu einem 3-Aminocarbonsäureester der Formel l.a umgesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Deacylierung in wässrigem Puffer ais Reaktionsmedium durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Hydrierung b) in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators durchgeführt wird, der wenigstens einen Komplex eines Übergangsmetalls der Gruppen 8 bis 1 1 des Periodensystems der Elemente umfasst und als Ligand wenigstens eine chirale, phosphoratomhaltige Verbindung umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei R1 für Phenyl steht und R2 und R3 die in Anspruch 2 genannten Bedeutungen besitzen.
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