CN102549151A - 酰胺酶及其用于产生3-氨基羧酸酯的用途 - Google Patents

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CN102549151A CN2010800424507A CN201080042450A CN102549151A CN 102549151 A CN102549151 A CN 102549151A CN 2010800424507 A CN2010800424507 A CN 2010800424507A CN 201080042450 A CN201080042450 A CN 201080042450A CN 102549151 A CN102549151 A CN 102549151A
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Abstract

用于产生通式i的旋光3-氨基羧酸酯化合物及其铵盐的方法，
Figure DDA0000146296480000011
其中r1代表烷基、烷氧基烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，并且r2代表烷基、环烷基或芳基，其中通过加入权利要求1的多肽将通式(i.b)
Figure DDA0000146296480000012
的简单n-酰基化的3-氨基羧酸酯的对映体混合物进行对映选择性脱酰基化，其中r1和r2具有上文给出的含义，并且r3代表氢、烷基、环烷基或芳基。

Description

酰胺酶及其用于产生3-氨基羧酸酯的用途
本发明涉及新的酰胺酶及其用于产生旋光3-氨基羧酸酯化合物及其衍生物的用途。
不对称合成已经在制药工业上变得非常重要，因为经常地仅特定的旋光异构体有治疗活性，所述不对称合成即为其中从前手性基团产生手性基团的反应，因此不等量地形成了立体异构体产物(对映异构体或非对映异构体)。在这方面，活性化合物的旋光中间产物也变得越来越重要。这也适用于3-氨基羧酸酯(通式I)，及其衍生物。
Figure BDA0000146296460000011
(通式I)
因此，极其需要用于产生通式I的旋光化合物的有效合成途径。
WO 97/41214描述了具有酰化氨基酸水解酶活性的生物催化剂，其不具有脂肪酶或酯酶活性。
WO 2008/003761描述了用于产生旋光3-氨基羧酸酯的方法，其中通过加入酸性成盐物质将在一个对映异构体中富集的简单N酰基化的3-氨基羧酸酯的对映体混合物进行脱酰基化，然后通过结晶进行进一步的对映异构体富集。
本发明待解决的问题因此是为产生旋光3-氨基羧酸酯及其衍生物提供简单并因而经济的方法。
令人惊奇的是，发现了通过产生通式I的旋光3-氨基羧酸酯化合物及其铵盐的方法解决了上述问题，
Figure BDA0000146296460000012
其中
R1代表烷基、烷氧基烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，并且
R2代表烷基、环烷基或芳基，
其中通过加入权利要求1或2的多肽将通式(I.b)的简单N酰基化的3-氨基羧酸酯的对映体混合物进行对映选择性脱酰基作用，
Figure BDA0000146296460000021
其中R1和R2具有上文给出的含义，并且R3代表氢、烷基、环烷基或芳基。
本发明还涉及用于产生通式I′的旋光3-氨基羧酸酯化合物及其衍生物的方法，
Figure BDA0000146296460000022
其中
R1代表烷基、烷氧基烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，并且
R2代表氢、阳离子等同物M+、烷基、环烷基或芳基，其中
a)通式I.1的β-酮酯(其中R1和R2具有上文给出的含义)与
Figure BDA0000146296460000023
a1)通式R3-C(O)NH2的至少一种羧酸酰胺在存在酰胺化催化剂的情况下反应，其中R3具有上文给出的含义，或
a2)氨反应，然后与通式R3-C(O)X的羧酸衍生物反应，其中X代表卤素或通式OC(O)R4的残基，其中R4具有上文为R3给出的含义，
获得相应的通式(I.a)的N-酰基化的α-不饱和(Z)-3-氨基羧酸酯，
Figure BDA0000146296460000024
其中，其中R1、R2和R3具有上文给出的含义，
b)将该反应中获得的烯酰胺(enamide)(I.a)进行氢化，获得通式(I.b)的简单N酰基化的β-氨基羧酸酯
Figure BDA0000146296460000031
的对映体混合物，
其中R1、R2和R3具有上文给出的含义，
c)通过加入具有酰胺酶活性的多肽将在氢化作用中获得的化合物I.b的对映体混合物进行对映选择性脱酰基化，并分离针对立体异构体富集的3-氨基羧酸酯的所得铵盐，并
d)任选地，将所分离的铵盐转化成3-氨基羧酸酯，并
e)任选地，将所述3-氨基羧酸酯转化成游离的3-氨基羧酸或其盐。
本发明还涉及具有酰胺酶活性的多肽，其选自
a)包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，和
b)包含与SEQ ID NO：2具有至少96％，优选98％，尤其优选99％同一性的氨基酸序列的多肽。
本发明还涉及具有酰胺酶活性的多肽，其选自
a)包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽，和
b)包含与SEQ ID NO：4具有至少80％，优选85％、88％、90％，尤其优选92％、94％、96％、98％、99％同一性的氨基酸序列的多肽。
在本发明的上下文中，“手性化合物”是具有至少一个手性中心(即，至少一个不对称原子，例如至少一个不对称碳原子或磷原子)、手性轴、手性平面或螺旋形状的化合物。术语“手性催化剂”包含具有至少一个手性配体的催化剂。
“非手性化合物”是没有手性的化合物。
“前手性化合物”表示具有至少一个前手性中心的化合物。“不对称合成”表示这样的反应，其中从具有至少一个前手性中心的化合物产生具有至少一个手性中心、手性轴、手性平面或螺旋形状的化合物，其中不等量地形成立体异构产物。
“立体异构体”是具有相同组成，但在三维空间上具有不同原子排列的化合物。
“对映异构体”是互为镜像的立体异构体。可从以下公式中获得不对称合成中得到的“对映体过量”(ee)：ee[％]＝(R-S)/(R+S)＊100。R和S是两种对映异构体的CIP系统的描述符，并代表了非对称原子上的绝对构型。对映纯的化合物(ee＝100％)也称为“纯手性化合物”。
本发明的方法产生针对特定立体异构体富集的产物。得到的“对映体过量”(ee)一般至少为95％，优选至少98％，并尤其优选至少99％。
“非对映异构体”是彼此非镜像的立体异构体。
尽管其他不对称原子可存在于本发明涵盖的化合物中，但除非另有明确说明，此处呈现的立体化学概念指对应于化合物I或I′中不对称β-碳原子的各化合物的碳原子。如果存在其他立体中心，它们在本发明上下文的命名中被忽略。
此后，表述“烷基”包含线性和分支烷基基团。它们优选为线性的或分支的C1-C20-烷基，优选C1-C12-烷基，尤其优选C1-C8-烷基，并尤其特别优选C1-C6-烷基基团。烷基基团的实例具体地是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、2-己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-甲基丙基、正庚基、2-庚基、3-庚基、2-乙基戊基、1-丙基丁基、正辛基、2-乙基己基、2-甲基庚基、壬基、癸基、2-丙基庚基。
表述“烷基”也包含被取代的烷基基团，其一般携带1、2、3、4或5，优选1、2或3，并尤其优选1个选自环烷基、芳基、杂芳基、卤素、COORf、COO-M+和NE1E2的取代基，其中Rf代表氢、烷基、环烷基或芳基，M+代表阳离子等同物，E1和E2各自独立地代表氢、烷基、环烷基或芳基。
表述“烷氧基烷基”包含连接烷氧基残基的线性和分支烷基基团。烷氧基残基也可以是线性的或分支的。优选地，它们是线性的或分支的C1-C20-烷基，优选C1-C12-烷基，尤其优选C1-C8-烷基，并尤其特别优选C1-C6-烷基基团，其连接C1-C12-烷氧基，尤其优选C1-C6-烷氧基残基。烷基基团的实例如上文提及；烷氧基基团的实例具体地是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲-丁氧基。烷氧基烷基的实例具体地是甲氧基甲基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、乙氧基丙基。
表述“烯基”包含线性和分支烷基基团，其仍然携带至少一个C＝C双键。优选地，它们是线性的C1-C20-烷基基团，携带C＝C双键。烯基基团的实例具体地是1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基。
在本发明的意义上，表述“环烷基”包含未取代的和取代的环烷基基团，优选C3-C8-环烷基基团，如环戊基、环己基或环庚基，其在取代的情况下一般携带1、2、3、4或5，优选1、2或3，并尤其优选1个取代基，优选选自烷基和烷基的取代基。
在本发明的意义上，表述“杂环烷基”包含一般具有4到7，优选5或6个环原子的饱和环脂肪族基团，其中环碳原子中的1或2个被优选选自元素氧、氮和硫的杂原子取代，并且其任选地被取代，其中在取代的情况下，这些杂环脂肪族基团可以携带1、2或3，优选1或2，尤其优选1个取代基，其选自烷基、环烷基、芳基、COORf、COO-M+和NE1E2，优选烷基，其中Rf代表氢、烷基、环烷基或芳基，M+代表阳离子等同物，E1和E2各自独立地代表氢、烷基、环烷基或芳基。作为这些杂环脂肪族基团的实例，我们提及吡咯烷基、哌啶基、2，2，6，6-四甲基哌啶基、咪唑烷基、吡唑烷基、
Figure BDA0000146296460000051
唑烷基、吗啉烷基(morpholidinyl)、噻唑烷基、异噻唑烷基、异
Figure BDA0000146296460000052
唑烷基、哌嗪基、四氢苯硫基、四氢呋喃、四氢吡喃、二
Figure BDA0000146296460000053
烷基。
在本发明的意义上，表述“芳基”包含未取代的和取代的芳基基团，并优选代表苯基、甲苯基、二甲苯基、2，4，6-三甲苯基、萘基、芴基、蒽基、菲基或并四苯基，尤其优选苯基或萘基，其中这些芳基在取代的情况下一般可携带1、2、3、4或5，优选1、2或3，并尤其优选1个取代基，其选自烷基、环烷基、硝基、氰基或卤素。
在本发明的意义上，表述“杂芳基”包含未取代的或取代的杂环芳香基团，优选基团吡啶基、喹啉基、吖啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吲哚基、嘌呤基、吲唑基、苯并三唑基、1，2，3-三唑基、1，3，4-三唑基和氮芴基，其中这些杂环芳香基团在取代的情况下一般可携带1、2或3个取代基，其选自烷基、烷氧基、酰基、羧基、羧酸酯、-SO3H、磺酸酯、NE1E2、烯基-NE1E2或卤素，其中E1和E2具有上文给出的含义。
表述“烷基”、“环烷基”、“芳基”、“杂环烷基”和“杂芳基”的上述解释相应地应用于表述“烷氧基”、“环烷氧基”、“芳氧基”、“杂环烷氧基”和“杂芳氧基”。
在本发明的意义上，表述“酰基”代表烷酰基或芳酰基基团，其一般具有2到11，优选2到8个碳原子，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、2-乙基己酰基、2-丙基庚酰基、苯甲酰基、萘甲酰基或三氟乙酰基基团。
“卤素”代表氟、氯、溴和碘，优选氟、氯和溴。
M+代表阳离子等同物，即单价阳离子或多价阳离子电荷的单阳性组分。这包括例如Li、Na、K、Ca和Mg。
如早已描述，本发明的方法可以产生通式I的旋光化合物，并产生其衍生物。
R1优选代表C1-C6-烷基、1-C3-C6-烯基、或C6-C14-芳基，其可任选地被取代，如开始时所提及。具体而言R1代表甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、1-丙烯基、1-庚烯基、或苯基，尤其代表甲基和苯基。
R2优选代表未取代的或取代的C1-C6-烷基、C3-C7-环烷基或C6-C14-芳基。尤其优选的R2残基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、三氟甲基、环己基、苯基和苄基。
R2′代表氢，M+，以及为R2说明的含义。
R3代表氢、烷基、环烷基或芳基，特别代表氢、甲基、乙基、三氟甲基、苄基和苯基。
根据本发明，通过加入酰胺酶将化合物I.b的对映体混合物进行对映选择性脱酰基化，并分离针对立体异构体富集的3-氨基羧酸酯的所得铵盐。
用于脱酰基化的通式I.b的化合物的异构体混合物也包含相应的对映异构体是本发明方法的特征，或从手性β-酮酯开始非对映异构体的量也是可以忽略的。有利地是，所述方法因此可以从通式I.b的化合物的异构体混合物开始产生通式I的旋光化合物，如通过烯酰胺(enamides)的一般不对称氢化从前体化合物获得。
一般地，在该方法步骤中，使用对映体混合物，其包含相同摩尔比例的对映异构体，或早已富含一种对映异构体。这些混合物的ee值优选高于75％，尤其优选高于90％。根据为烯酰胺(I.a)的氢化选择的条件，产生了已经富含一种对映异构体的外消旋物或混合物。为了获得已经富含一种对映异构体的混合物，一般选择对映选择性氢化方法，例如在WO2008/003761中提及的，此处明确包含其说明书作为参考。
优选在20-40℃，尤其优选20到30℃之间的温度进行脱酰基化。一般在水性缓冲液中进行反应。
本发明还涉及包括下文所述反应步骤a)到c)和任选地d)和e)的方法。
步骤a)
在本发明方法的步骤a)的一个实施方案中，通式I.1的β-酮酯与通式R3-C(O)NH2的至少一种羧酸酰胺在酰胺化催化剂存在下反应，去除反应水，生成通式I.a的3-氨基羧酸酯(步骤a.1)。
优选地，在步骤a.1中，通式R3-C(O)NH2的羧酸酰胺是乙酰胺、丙酸酰胺、苯甲酸酰胺、甲酰胺或三氟乙酰胺，特别是苯甲酸酰胺或乙酰胺。
适合于步骤a.1的溶剂是与水形成低沸点共沸物的那些溶剂，通过本领域技术人员已知的分离技术(例如，共沸蒸馏)可以从所述溶剂中去除反应水。具体而言，它们是芳族化合物，如甲苯、苯等，酮，如酮类，如甲基异丁基酮或甲基乙基酮等，和卤代烷，如氯仿。优选使用甲苯。
合适的酰胺化催化剂是例如酸，如对甲苯磺酸、甲磺酸、硫酸等。优选使用对甲苯磺酸。
优选地，方法步骤a.1中的反应在20到110℃，尤其优选60到90℃温度范围内进行。尤其优选地，温度高于在S.T.P下所用溶剂的沸点。
方法步骤a.1一般在0.01到1.5巴，特别是0.1到0.5巴的压力下进行。任选地，通过本领域技术人员已知的方法，例如通过蒸馏将步骤a.1中获得的氨基羧酸酯进行纯化。
在备选实施方案中，通式I.1的β-酮酯与氨水反应，然后与通式R3-C(O)X的羧酸衍生物反应，生成N-酰基化的β-不饱和(Z)-3-氨基羧酸酯(I.a)，其中X代表卤素或通式OC(O)R4的残基，其中R4具有上文为R3给出的含义(步骤a.2)。
羧酸衍生物优选选自羧酸氯，其中X代表氯，并且R3具有上文给出的含义，或羧酸酐，其中X代表OC(O)R4并且R4优选具有与R3相同的含义，尤其优选所述羧酸衍生物是乙酰氯、苯甲酰氯或乙酸酐。
优选地，步骤a.2中的酰基化在20℃到120℃，尤其优选60℃到90℃温度范围内进行。
步骤a.2中的酰基化在极性溶剂或极性溶剂与非极性溶剂的混合物中进行，优选地所述极性溶剂是通式R3COOH的羧酸或叔胺，卤代烷和芳族化合物特别适合用作非极性溶剂，尤其优选地乙酸或三乙胺用作溶剂。
可使用催化剂进行步骤a.2中的酰基化，这可以催化量和化学计量地使用，或用作溶剂，优选非亲核的碱，如叔胺，尤其优选这些是三乙胺和/或二甲基氨基吡啶(DMAP)。
任选地在步骤a.1和步骤a.2中，(Z)-3-氨基羧酸酯将获得为与(E)-3-氨基羧酸酯和任选地进一步酰化产物的混合物。在这种情况下，将通过本领域技术人员已知的方法分离通式I.a的(Z)-3-氨基羧酸酯。优选方法是通过蒸馏进行分离。
步骤b)
然后将步骤a)中获得的通式I.a的α-不饱和的(Z)-3-氨基羧酸酯化合物在任选地手性氢化催化剂的存在下进行氢化，任选地进行对映选择性氢化，获得外消旋物或富含一种对映异构体的通式(I.b)的简单N-酰基化的β-氨基羧酸酯的对映体混合物。
优选地，元素周期表8到11族的过渡金属的至少一种络合物用作步骤b)的氢化催化剂，所述络合物包含至少一种含手性磷原子的化合物作为配体。
对于氢化，优选使用手性氢化催化剂，其能够氢化优先用于想要的异构体的α-不饱和的N-酰基化的β-氨基羧酸酯(I.a)。不对称氢化后，步骤b)中获得的通式I.b的化合物优选具有至少75％，尤其优选至少90％的ee值，然而，这种高对映体纯度在本发明的方法中经常不是必须的，因为根据本发明的方法，在随后的脱酰基化步骤中发生进一步的对映体富集。然而优选地，化合物I.b的ee值至少为75％。
优选地，本发明的方法可能以至少1000∶1，尤其优选至少5000∶1，并特别至少15000∶1的底物/催化剂比例(s/c)发生对映体选择性氢化。
优选地，8、9或10族的金属与下文说明的至少一种配体的络合物用于不对称氢化。优选地，过渡金属选自Ru、Rh、Ir、Pd或Pt。尤其优选基于Rh和Ru的催化剂。特别优选Rh催化剂。
用作配体的含磷化合物优选选自二齿和多齿膦、次磷酸酯、亚膦酸酯、亚磷酰胺和亚磷酸酯化合物。
催化剂优选用于氢化，其具有选自以下通式的化合物的至少一种配体，
Figure BDA0000146296460000101
或其对映异构体，其中Ar代表任选取代的苯基，优选甲苯基或二甲苯基。
尤其优选上述类型化合物的二齿化合物。特别优选P-手性化合物，如DuanPhos，TangPhos或Binapine。
通过至少一个磷原子与过渡金属配位的合适手性配体为本领域技术人员所知，并且例如可从Chiral Quest((Princeton)Inc.，MonmouthJunction，NJ)通过商业途径获得。上文给出的手性配体的实例的命名对应于它们的商业命名。
可以本领域技术人员已知的方式(例如Uson，Inorg.Chim.Acta 73，275 1983，EP-A-0 158 875，EP-A-437 690)通过合适的配体与包含不稳定或半不稳定配体的金属络合物反应获得手性过渡金属络合物。在这种情况下，络合物如Pd2(二亚苄基丙酮)3、Pd(OAc)2(Ac＝乙酰基)、RhCl3、Rh(OAc)3、[Rh(COD)Cl]2、[Rh(COD)OH]2、[Rh(COD)OMe]2(Me＝甲基)、Rh(COD)acac、Rh4(CO)12、Rh6(CO)16、[Rh(COD)2)]X、Rh(acac)(CO)2(acac＝乙酰丙酮)、RuCl3、Ru(acac)3、RuCl2(COD)、Ru(COD)(甲代烯丙基)2、Ru(Ar)I2和Ru(Ar)Cl2，Ar＝芳基(未取代的和取代的)，[Ir(COD)Cl]2、[Ir(COD)2]X、Ni(烯丙基)X可用作前催化剂(precatalysts)。除了COD(＝1，5-环辛二烯)，也可以使用NBD(＝降冰片二烯)。优选[Rh(COD)Cl]2、[Rh(COD)2)]X、Rh(acac)(CO)2、RuCl2(COD)、Ru(COD)(甲代烯丙基)2、Ru(Ar)Cl2、Ar＝芳基(未取代的和取代的)，和具有NBD而非COD的对应系统。尤其优选[Rh(COD)2)]X和[Rh(NBD)2)]X。
X可以是本领域技术人员已知的任何阴离子，一般在不对称合成中不稳定。X的实例是卤素，如Cl-、Br-或I-、BF4 -、ClO4 -、SbF6 -、PF6 -、CF3SO3 -、BAr4 -。X优选为BF4 -、PF6 -、CF3SO3 -、SbF6 -。
手性过渡金属络合物可在实际的氢化反应之前在反应器中原位产生，或可单独产生，分离，然后使用。可以出现至少一种溶剂分子加到过渡金属络合物上。用于制备络合物的常用溶剂(例如甲醇、二乙醚、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷等)为本领域技术人员所知。
膦-、次磷酸酯-、亚膦酸酯-，亚磷酰胺-和亚磷酸酯-金属或-金属-Solv-络合物(Solv＝溶剂)与至少一种不稳定或半不稳定配体是合适的前催化剂，在氢化条件下从其产生实际的催化剂。
本发明方法的氢化步骤(步骤b)一般在-10到150℃，优选0到120℃，并尤其优选10到70℃的温度下进行。
氢压可在0.1巴到600巴的范围内变化。优选地，它在0.5到20巴的压力范围内，尤其优选在1到10巴的压力范围内。
本领域技术人员已知的用于不对称氢化的所有溶剂适合用作烯酰胺I.a的氢化反应。优选的溶剂是低级烷基醇，如甲醇、乙醇、异丙醇和甲苯，THF、乙酸乙酯。尤其优选地，乙酸乙酯或THF用作本发明方法中的溶剂。
也可以合适的方式，例如通过适合作为锚定基团的官能团附着、吸附、移植等将上文描述的氢化催化剂(或氢化前催化剂)固定到例如玻璃、硅胶、合成树脂、聚合物支撑物的合适支持体上。它们然后也可适合用作固相催化剂。有利地，可通过这些方法进一步降低催化剂消耗。上文描述的催化剂例如在固定后也以固相催化剂的形式适合于连续反应，如上文所述。
在另一实施方案中，连续进行步骤b中的氢化。可在一个反应带或优选在若干反应带中进行连续氢化。可通过若干反应器或通过一个反应器内空间不同的区域形成若干反应带。当使用若干反应器时，它们可以相同或不同。它们在每一种情况下可以具有相同或不同的混合特征和/或可以被内部装置细分一次或多次。可以任何方式，例如平行或连续地将反应器连接在一起。
用于氢化的合适的耐压反应器为本领域技术人员所知。这些包括用于气-液反应的一般平常反应器，例如管状反应器、外壳-和-管反应器、搅拌反应器、气体循环反应器、泡罩塔等，其可任选地被内部装置填充或细分。
步骤c)
在方法步骤c)中，通过加入具有酰胺酶活性的多肽将在氢化中获得的化合物I.b的对映体混合物进行对映选择性脱酰基化，并且分离针对立体异构体富集的3-氨基羧酸酯的所得铵盐。具有酰胺酶活性的多肽可用作纯化的酶，作为部分纯化的粗提物或活的或杀死的微生物形式，其含有酰胺酶。优选的酰胺酶是具有一级结构SEQ ID NO：2或NO：4或SEQ IDNO：2或NO：4的变体的那些酰胺酶，通过插入、缺失或取代一些氨基酸，优选1-20，尤其优选1-10个氨基酸来获得所述酰胺酶的变体。
这些反应一般在水性缓冲液中进行。可通过常规方法纯化并分离所得反应产物。
步骤d)
需要时，通过酰胺酶反应在富集对映体的脱酰基作用中分离的铵盐可进行进一步的加工。因此，例如可以释放通式I的旋光化合物，以将结晶产物与合适的碱，优选NaHCO3、NaOH、KOH接触。在合适的方法中，在水中溶解或悬浮脱酰基的产物，然后通过加入碱将pH调整至约8到12，优选约10。为了分离游离的3-氨基羧酸酯，可以用合适的有机溶剂，例如醚，如甲基丁醚，烃或烃混合物，例如链烷，如戊烷、己烷、庚烷，或链烷混合物，石脑油或石油醚，或芳族化合物，如甲苯萃取碱性溶液或悬浮液。优选的萃取剂是甲苯。在该方法中，甚至可定量获得3-氨基酸酯，其也维持ee值。
步骤e)
任选地，可通过本领域技术人员已知的方法衍生3-氨基羧酸酯。可能的衍生作用包括例如，酯的皂化或羧基碳原子立体选择性还原成旋光醇。
本发明通式I′的化合物的衍生物因此包含例如3-氨基羧酸酯的铵盐，游离羧酸，其中R2′是氢，游离羧酸的盐，其中R2′是M+，和任选地活性3-氨基醇。
本发明还涉及可催化酰胺酶反应的多肽，并包含以下一级结构(氨基酸序列)：
SEQ ID NO：2
或与SEQ ID NO：2具有至少96％，优选98％，尤其优选99％同一性的多肽序列。
SEQ ID NO：4
或与SEQ ID NO：4具有至少80％，优选至少85％，尤其优选至少95％同一性的多肽序列。
以下模式反应在本发明意义上理解为酰胺酶反应：
Figure BDA0000146296460000141
其中R1和R3在各自情况下代表甲基，R2代表乙基。
选择以下反应条件：
对于细胞培养，参阅实施例2。
例如可通过从马红球菌(Rhodococcus equi)DSM 19590中分离具有SEQ ID NO：2的酰胺酶。
实施例1：从马红球菌中克隆酰胺酶
利用以下寡核苷酸引物通过PCR从马红球菌中扩增S-选择性酰胺酶的编码区：
Figure BDA0000146296460000143
Mke 973 GTCAGATGGATCCTCATGGCACTTCTTC
Mke 959 ATCTCCTCTGCGATCTCGTTG
Mke 972 GTTCACGATCAAGGACCTCACCGACGTC
Mke 912 GCCGTGGTAGGCCCAGTTGTTGTAGCGGCC
Mke 913 CGACGTCCTCATCTCGCCGACCCTCGC
Mke 904 CTACGCCACAGGACGACGGTCCGCCCACGG
Mke 974 CTGGTCCCCACTGCGTCGGTAGGTGATC
为了插入相应的切割位点用于克隆，利用以下引物在另一PCR中扩增以这种方式获得的序列：
5′-GGGATACTCATATGAGTACATCGGATCCGGG-3′
3′-GAGTCTCAAGCTTACGCCACCGGTCGACGATCC-5′
马红球菌是土壤分离物，其通过筛选3-乙酰氨基-3-苯基-丙酸乙酯分离得到。在DSMZ确定该菌株。所述菌株保藏在DSM中保藏号19590。
通过Qiagen试剂盒获得基因组DNA。
为了从马红球菌中分离染色体DNA，在30ml FP培养基中接种细菌培养物并在30℃下温育过夜。
在5000xg下离心培养物，并向11ml等分试样的B1缓冲液中加入22μl RNA酶A溶液。在每一种情况下利用11ml含RNA酶的B1缓冲液重悬浮细胞沉淀。然后加入300ml的溶菌酶贮存液(100mg/ml)和500μl的蛋白酶K贮存液(20mg/ml)，并且为了裂解细胞，在37℃下温育30分钟。同时，利用10ml QBT缓冲液平衡QIAGEN Genomic-tip 500/G。澄清的裂解物应用到柱子上，并允许穿过。然后利用15ml QC缓冲液洗涤柱子两次。最后利用5ml QF缓冲液洗脱基因组DNA。然后利用异丙醇沉淀染色体DNA，并利用玻璃棒将其转移到TE缓冲液中。
利用限制性酶NdeI和HindIII切割所扩增的基因，并将其连接到载体pDHE载体的多克隆位点中，所述载体具有鼠李糖可诱导的启动子。该载体在TG1细胞(DSMZ 6056)中表达。
在37℃下最小培养基中补料分批式发酵该菌株。细胞在测试中以150g/l的生物干物质用作生物湿物质。酶比活性是50U/g生物干物质(BDM)。
实施例2：利用马红球菌的野生型菌株制备3-氨基-3-苯基-丙酸乙酯
Figure BDA0000146296460000161
a)制备细胞
用细胞接种FP培养基。细胞在28℃和180rpm下培育。生长20小时后，利用1g/l 3-乙酰氨基-3-苯基-丙酸乙酯诱导野生型菌株，并进一步培育7小时。
裂解细胞并在活性测试中使用粗提物。
b)3-乙酰氨基-3-苯基-丙酸乙酯的反应
在缓冲液(100mM KH2PO4 pH 7)中，1g/l 3-乙酰氨基-3-苯基-丙酸乙酯(AAPEE)和xμl(见表1)的无细胞粗提物(见表1)在28℃或40℃下温育。
通过HPLC测量胺的形成或酰胺的降解。为了测定对映选择性，通过手性GC测量样品。
制备物：
  1   2   3
  粗提物   200   400   800
  1M KH2PO4 pH 7   200   200   200
  H2O   1380   1180   780
  酯(100g/l，丙酮)   20   20   20
  HCl   200   200   200
表1用于3-乙酰氨基-3-苯基-丙酸乙酯的反应的制备物
结果：
图1显示了3-乙酰氨基-3-苯基-丙酸乙酯的形成作为反应时间和温度的函数。
如从图2中所见，大约24小时后，3-氨基-3-苯基-丙酸乙酯的浓度达到最大值。然后，所形成的胺也被降解。40℃时的反应在开始时进行比较快，但比在28℃时崩溃更早。
Figure BDA0000146296460000171
Figure BDA0000146296460000181
比较：与外消旋物相比于富集的底物的反应
测试条件：500mM AAPPEE(外消旋物/富集的)
100mM KH2PO4 pH 7.0
从发酵罐流出的25g/l(生物干物质)细胞(来自红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)的克隆酶)
30℃
图3显示了外消旋或对映异构体富集的底物的反应比较
高达20g/l的3-乙酰氨基-3-苯基-丙酸乙酯(AAPEE)发生了反应。如果使用外消旋底物，得到S-对映异构体的富集(ee～94％)。然而，如果使用已富集的底物(ee～80％)，可达到ee＞99％。
制备性性4-I制备
4I制备物：
130mM AAPPEE
100mM KH2PO4 pH 7.0
34g/L BDM细胞(来自红串红球菌的克隆酶)
30℃，5小时
制备：
用60ml/102g H3PO4(85％)将反应器设置到pH 3.0。最终重量是4113g/4150ml。将制剂离心(5000＊g，20分钟)，并用200mL洗涤沉淀。获得清澈的轻微黄色的上清液(最终重量3804g)。
利用3x1400ml 2-丁醇提取，首先为了分离离析物和从仍然存在的来自离析物合成的副产物。然后在10℃，用20％NaOH调整到pH 10，并通过1500ml 2-丁醇提取分离氨基酸酯，随后在真空下去除溶剂。23.0g几乎对映体纯(99.3％ee)的氨基酯获得为轻微黄色的油。化学纯度为＞98％(GC)。
图4显示了富集的S-AAPEE的反应
实施例3：制备3-氨基丁酸甲酯
野生型菌株红串红球菌用作酰胺酶(SEQ ID NO：4)。可通过本领域技术人员熟悉的遗传工程方法，例如通过在合适的宿主系统，例如大肠杆菌(E.coli)中表达SEQ ID NO：3的核酸产生该酰胺酶。
Figure BDA0000146296460000191
操作与实施例2相似。
Figure BDA0000146296460000192
Figure BDA0000146296460000201
(仅离析物)
制剂：
  60g/l   空白
  酶   1000μl   0μl
  1M KH2PO4 pH 7   200μl   200μl
  底物   200μl(纯底物)   200μl(纯底物)
  VE-H2O   400μl   1400μl
  HCl   200μl   200μl
表2用于3-乙酰氨基-丁酸甲酯的反应的制剂
图6显示了3-乙酰氨基-丁酸甲酯、3-氨基-丁酸甲酯和无酶对照的浓度的差异，LU8676表示红串红球菌野生型菌株。
Figure IDA0000146296510000021
Figure IDA0000146296510000031
Figure IDA0000146296510000041
Figure IDA0000146296510000061
Figure IDA0000146296510000071
Figure IDA0000146296510000081
Figure IDA0000146296510000091
Figure IDA0000146296510000101
Figure IDA0000146296510000111
Figure IDA0000146296510000121

Claims (8)

1.具有酰胺酶活性的多肽，其选自
a)包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，和
b)包含与SEQ ID NO：2具有至少96％同一性的氨基酸序列的多肽。
2.具有酰胺酶活性的多肽，其选自
a)包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽，和
b)包含与SEQ ID NO：4具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽。
3.用于产生通式I的旋光3-氨基羧酸酯化合物及其铵盐的方法，
Figure FDA0000146296450000011
其中
R1代表烷基、烷氧基烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，并且
R2代表烷基、环烷基或芳基，
其中通过加入权利要求1或2的多肽将通式(I.b)
Figure FDA0000146296450000012
的简单N-酰基化的3-氨基羧酸酯的对映体混合物进行对映选择性脱酰基化，其中R1和R2具有上文给出的含义，并且R3代表氢、烷基、环烷基或芳基。
4.用于产生通式I′的旋光3-氨基羧酸酯化合物及其衍生物的方法，
Figure FDA0000146296450000013
其中
R1代表烷基、烷氧基烷基、烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，并且
R2代表氢、阳离子等同物M+、烷基、环烷基或芳基，其中
a)通式I.1的β-酮酯
Figure FDA0000146296450000021
其中R1和R2具有上文给出的含义，与
a1)通式R3-C(O)NH2的至少一种羧酸酰胺在存在酰胺催化剂的情况下反应，其中R3具有上文给出的含义，或
a2)氨反应，然后与通式R3-C(O)X的羧酸衍生物反应，其中X代表卤素或通式OC(O)R4的残基，其中R4具有上文为R3给出的含义，
获得相应的通式(I.a)的N-酰基化的α-β-不饱和(Z)-3-氨基羧酸酯
Figure FDA0000146296450000022
其中，R1、R2和R3具有上文给出的含义，
b)将该反应中获得的烯酰胺(I.a)进行氢化，获得通式(I.b)的简单N-酰基化的β-氨基羧酸酯
Figure FDA0000146296450000023
的对映体混合物，其中R1、R2和R3具有上文给出的含义，
c)通过加入权利要求1的多肽将在氢化中获得的化合物I.b的对映体混合物进行对映选择性脱酰基化，并分离针对立体异构体富集的3-氨基羧酸酯的所得铵盐，和
d)任选地，将所分离的铵盐转化成3-氨基羧酸酯，和
e)任选地，将所述3-氨基羧酸酯转化成游离的3-氨基羧酸或其盐。
5.权利要求3的方法，其中通式I.1的β-酮酯与通式R3-C(O)NH2的至少一种羧酸酰胺在酰胺化催化剂存在下反应，去除反应水，生成通式I.a的3-氨基羧酸酯。
6.前述权利要求之一的方法，其中所述脱酰基在作为反应介质的水性缓冲液中进行。
7.权利要求4的方法，其中氢化b)在存在氢化催化剂下进行，所述氢化催化剂包括元素周期表8到11族的过渡金属的至少一种络合物，并包括至少一种含手性磷原子的化合物作为配体。
8.权利要求3或4的方法，其中R1代表苯基，并且R2和R3具有权利要求2中说明的含义。
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