JP3899080B2 - 新規ウレタナーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、新規ウレタナーゼおよび該ウレタナーゼを利用したプラスチック、特にポリウレタンの分解方法に関する。
ポリウレタンはその優れた性質からさまざまな分野で利用されている。しかしその一方で廃棄量も年々増加し、高い燃焼熱による焼却炉の損傷や埋立地の飽和等、深刻な環境問題を起こしている。これらの廃棄物の対策として、低コスト、かつ省エネルギー型プロセスである微生物分解・酵素分解が注目されている。ポリウレタンを酵素によってモノマーに分解できれば、これを回収、再合成することにより一次生産品と全く同等のポリウレタンを作ることができ、リサイクルへの道が開ける。
B. Jansen et al., Zentralbl Bakteriol., 276, 36(1991) R. T. Darby and A. M. Kaplan, Appl. Microbiol., 16, 900(1968) 尚、ポリエステル型のポリウレタン分解菌としては、ペニバチルスアミロリチカスTB−13株(特願平2002−334162)およびコマモナスアシドボランス(Comamonas acidovorans)TB−35株(FEMS Microbiology Letters, Vol. 129,39−42,1995、非特許文献3)が知られているが、これらの分解菌はウレタン中のエステル結合は分解するものの、ウレタン結合はほとんど分解しない。 T.Nakajima−Kambe,F.Onuma,N.Kimpara and T.Nakahara,Isolation and characterization of a bacterium which utilizes polyester polyurethane as a sole carbon and nitrogen source.FEMS Microbiology Letters, Vol. 129,39−42,1995 一方、低分子のウレタン化合物が微生物によって分解されることはすでに報告されているが、その分解はウレタナーゼによるものではなくエステラーゼによるものであることが知られている。そして、そのほとんどは酒類の品種改良やカルバメート系農薬の分解浄化に関するものであり(特開平01−300892、特開平01−240179、特開平02−128689、特開平03−175985、特開平04−104784、特開平04−325079)、ポリウレタンの分解に利用できる技術ではない。ポリウレタン原料となりうる物質の分解菌としてはカビによるものが報告されているが(特開平09−192633)、大量培養が容易な細菌によるものはなく、その分解酵素は特定されていない。
この問題を解決するため、我々はポリウレタン合成原料として用いられる芳香族・脂肪族イソシアネートと一価アルコールから合成した低分子量ウレタン結合含有化合物を用いて、各種土壌を分離源として微生物のスクリーングを行い、得られた微生物に関して既に特許出願している(特願平2003−055421)。尚、ロドコッカス属に属する微生物がウレタン化合物の分解能を有することはそれまで知られていなかった。
酵素(新規ウレタナーゼ)
本発明のウレタナーゼは、SDS−PAGEによる分子量が約55,000、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量が約55,000の単量体タンパクである。至適温度は約45℃、至適pHは約5.5である。本発明のウレタナーゼは、ウレタン化合物の他に、アミド、エステルに対しても加水分解活性が認められる。本発明のウレタナーゼは、ポリウレタンの合成に用いられている芳香族系および脂肪族系化合物に対しても、ウレタン結合切断活性を有する。本発明のウレタナーゼは、pH8〜10の範囲で安定である。
新規ウレタナーゼの供給源
新規ウレタナーゼの供給源は、ウレタン化合物分解能を有する微生物であれば、既に公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。新規ウレタナーゼの供給源の一例としては、ロドコッカス属に属する微生物であり、2004年1月24日付けでドイツの特許生物寄託機関であるDSMZに寄託されたロドコッカス エクイ TB−60株(DSMZ 16175)を挙げることができる。ロドコッカス属菌の菌学的性質は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology)(第1巻1984年、第2巻1986年、第3巻1989年、第4巻1989年)に記載されている。
液中にウレタン化合物Iのウレタン結合加水分解産物であるトルエンジアミンの生成が確
認された菌を取得することにより行うことができる。
新規ウレタナーゼの分離・精製
本発明のウレタナーゼの分離・精製は、通常微生物からの蛋白質の分離・精製に用いられる方法を用いることにより行うことができる。具体的には、微生物を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。微生物の破壊には、制限的でない例として、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法が挙げられる。分離精製手段は、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。
更に本発明は、ウレタン化合物をウレタナーゼの作用により分解処理する方法を提供する。該方法に用いるウレタナーゼは、精製された酵素、粗精製酵素、または微生物菌体を破砕した液であってもよい。微生物菌体の破砕は、当業者に知られた方法により行うことができる。
固体ポリウレタンの分解方法の一態様として、ポリエステル型のポリウレタンのエステル結合分解菌として知られるペニバチルスアミロリチカスTB−13株(受託番号FERM P−19104、特願平2002−334162参照)および/またはコマモナスアシドボランスTB−35株、あるいはそれらの菌株由来の酵素と、ウレタン結合分解能を有する本発明のウレタナーゼを用いることにより、ポリウレタンの完全分解を行うことができる。
本発明のウレタナーゼは、ロドコッカス属に属し、プラスチック分解能を有する微生物を培養し、該微生物中の酵素を分離・精製することにより生産することができる。
実施例
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
A.方法
1.培地および培養条件
基本培地の組成は、表1に示す通りである。炭素源としてカルバミン酸ブチルを用いた。
2.酵素活性測定法
ウレタン加水分解活性
0.1%エチルN−フェニルカルバメート0.2ml、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)0.7mlに、酵素溶液を0.1ml添加し、反応を開始させた。30℃、60min反応後、6N HCLを0.1ml添加し、反応を停止させた。生成したアニリンの量を、ジアゾカップリング法を用いて定量した。1分間に1μmolのアニリンを生成させる酵素量を1unitとした。
1mMp−ニトロアセトアニリド 0.268ml、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)1.6mlに、酵素溶液を0.132ml添加し、反応を開始させた。生成したp−ニトロアニリンの量を、405nmの吸光度を測定することによって求めた。1分間に1μmolのp−ニトロアニリンを生成させる酵素量を1unitとした。
基質にはp−ニトロフェニルアセテートを用い、上述のアミダーゼ活性と同様の方法で測定を行った。1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを生成させる酵素量を1unitとした。
3.酵素精製
酵素活性の測定には、p−ニトロアセトアニリドを基質として用いた。
4.各種ウレタン化合物の加水分解
基質には、トルエン−2,4−ジカルバミン酸ジブチルエステル(TDCB)、メチレンビスフェニルジカルバミン酸ジブチルエステル(MDCB)、ヘキサメチレンジカルバミン酸ジブチルエステル(HDCB)を用いた。0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)0.8mlに、各基質のエタノール溶液(0.1%)を0.1ml加え混合後、酵素溶液0.1mlを加えて反応を開始した。30℃で1晩反応後、反応産物を等量の酢酸エチルにて抽出し、GC−MS分析に供した。HDCBに関しては、分解産物をヘプタフルオロ酪酸無水物(HFBA)にて誘導体化した後、GC−MS分析に供した。GC−MS条件を以下に示す。
ガスクロマトグラフ:TraceGC(サーモエレクトロン株式会社)
MS検出器:PolarisQ(サーモエレクトロン株式会社)
カラム
DB−1MS 内径0.25mm,長さ30m(J&W Scientific社製)
分析条件
GC:120℃〜280℃(15℃/minの昇温分析)
MS:イオンソース温度225℃、イオン化エネルギー70eV
B.結果
1.ウレタナーゼ活性の誘導
誘導物質としてアニリンを添加したときの、ロドコッカス エクイ TB−60株の生育量、ウレタン加水分解活性、アミダーゼ活性、及びエステラーゼ活性を経時的に測定した結果を図1に示した。
2.ウレタナーゼの精製
硫酸アンモニウム沈殿法による分画、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーという二段階の簡便な精製法にて、ウレタナーゼを精製した。収率は58%、比活性6.0U/mgであった。精製酵素標品をSDS−PAGEに供したところ、分子量約55,000の位置に、単一のバンドとして検出された。本酵素の保存性は、0.1Mリン酸緩衝液中において極めて不安定であったが、20%グリセロールを添加することによって著しく改善され、4℃で1ヶ月以上保存後も活性の低下は認められなかった。
3.酵素の物理化学的諸性質
分子量
ゲル濾過クロマトグラフィーによって本酵素の分子量を測定したところ、55,000であった。また、SDS−PAGEにおいては分子量約55,000の位置に、単一のバンドとして検出されたことから、本酵素は分子量55,000の単量体であることが示された。
本酵素の至適反応条件を、エチルN−フェニルカルバメートを基質として決定した。その結果、至適温度45℃、至適pH5.5であった。
本酵素は、pH8〜10の範囲で安定であった。また、30分間の加温後は30℃で23%、40℃で98%の酵素が失活した。
TDCBを基質とした場合、GC−MS分析にて2種類の分解産物が検出された。保持時間3.8分のピーク1は、トルエンジアミンであると同定された(図2)。保持時間8.0分のピーク2は、マススペクトルを解析した結果、TDCBの2つのウレタン結合のうち1つが加水分解されアミンとなった化合物であると推定された(図2)。MDCBを基質とした場合、GCにて1つのピーク(ピーク3)が検出された。マススペクトルを解析した結果、この分解産物は4, 4’−ジアミノジフェニルメタンと同定された(図3
)。HDCBに関しては、HFBA誘導体化された分解産物を解析した。GCにて1つのピーク(ピーク4)が検出され、マススペクトル解析の結果、ヘキサメチレンジアミンのHFBA誘導体とスペクトルが一致した(図4)。このことから、HDCBの加水分解産物はヘキサメチレンジアミンであると考えられた。以上の結果より、精製したウレタナーゼによって、TDCB、MDCB、HDCBの3種類のウレタン化合物のウレタン結合が加水分解され、それに対応するアミンが分解産物として生成することが明らかとなった。
本発明のウレタナーゼは、ウレタン化合物、特にポリウレタンの集約的分解処理、土壌中やコンポスト中に添加することによる分解処理や肥料として再資源化等への応用が期待される。ポリウレタン中のエステル結合分解菌であるペニバチルスアミロリチカスTB−13株またはコマモナスアシドボランスTB−35株、またはそれらの酵素と本発明のウレタナーゼを共存させることにより、ポリウレタンの完全分解が可能となる。
Claims (12)
- 下記の性質を有する、ロドコッカス属に属する微生物由来ウレタナーゼ:
(a)ウレタン化合物の分解能を有し;
(b)分子量が、55,000であり;
(c)至適温度は、45℃であり;
(d)至適pHは、5.5である。 - ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス エクイである、請求項1記載の酵素。
- ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス エクイ TB−60株である、請求項1記載の酵素。
- ウレタン化合物が低分子量化合物である、請求項1〜3の何れか一項に記載の酵素。
- ウレタン化合物がポリウレタンである、請求項1〜3の何れか一項に記載の酵素。
- 請求項1〜3の何れか一項に記載の酵素をウレタン化合物と接触させる工程を含む、ウレタン化合物の分解方法。
- ウレタン化合物が低分子量化合物である、請求項6記載の方法。
- ウレタン化合物がポリウレタンである、請求項6記載の方法。
- ポリウレタンの分解方法であって、
ポリウレタンと請求項1〜3の何れか一項に記載の酵素を接触させる工程、および
ポリウレタンとポリウレタンのエステル結合分解能を有する微生物または該微生物由来酵素を接触させる工程であって、ここで前記ポリウレタンのエステル結合分解能を有する微生物はペニバチルスアミロリチカスTB−13株またはコマモナスアシドボランスTB−35株である、
を含む、前記ポリウレタンの分解方法。 - 請求項1記載の酵素を生産する方法であって、
ロドコッカス属の微生物を培養する工程:
前記微生物から前記酵素を分離・精製する工程:
からなる、前記酵素の生産方法。 - ロドコッカス属の微生物がロドコッカス エクイである、請求項10記載の方法。
- ロドコッカス属の微生物がロドコッカス エクイ TB−60株である、請求項10記載の方法。
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